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DE69534374T2 - Methoden und zubehör zur immunisierung von wirtsorganismen durch verabreichung nackter polynucleotide , welche für antigene peptide codieren - Google Patents

Methoden und zubehör zur immunisierung von wirtsorganismen durch verabreichung nackter polynucleotide , welche für antigene peptide codieren Download PDF

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DE69534374T2
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naked
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mice
antigen
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DE69534374T
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A. Dennis CARSON
Eyal Raz
L. Meredith HOWELL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
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University of California Berkeley
Original Assignee
University of California
University of California Berkeley
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Publication date
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Description

  • VERWANDTE PATENTANMELDUNG
  • Dies ist eine Continuation-in-Part der PCT-Anmeldung Nr. US94/09661, eingereicht am 27. September 1994 ( worin die USA ein benannter Staat sind), die wiederum eine Continuation-in-Part der US-Seriennummer 08/112.440, eingereicht beim United States Patent and Trademark Office am 26. August 1993, ist.
  • STELLUNGNAHME ZU STAATSRECHTEN
  • Diese Erfindung konnte mit Unterstützung der Regierung unter den Vergabenummern AR07567 und AR25443, zuerkannt durch die National Institutes of Health, entstehen. Die Regierung behält bestimmte Rechte im Rahmen dieser Erfindung bei.
  • Hintergrund der Erfindung
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Verabreichung von biologisch aktiven Peptiden an einen Säugetierwirt durch Einführen von einem oder mehreren Polynucleotiden, die operativ für die Peptide kodieren sollen, vorzugsweise durch nicht-invasive Mittel. Sie betrifft auch die Verabreichung dieser Polynucleotide zur Immunisierung eines Wirts gegenein oder mehrere Antigene. Insbesondere betrifft die Erfindung die Immunisierung eines Wirts gegen ein oder mehrere Allergene zur Behandlung von Allergien.
  • 2. Beschreibung verwandter Gebiete
  • Das direkte Einführen eines biologisch aktiven Peptids oder Proteins in die Zellen eines Patienten kann signifikanten therapeutischen Wert haben. Dieser Ansatz hat jedoch auch mehrere Nachteile. Ein primärer Nachteil ist das Risiko potenzieller Toxizitäten, insbesondere bei Dosierungen, die ausreichen sind, um eine biologische Reaktion auf das Peptid zu produzieren. In Verbindung mit der praktischen Ausführung besteht auch das Problem der Kosten, die mit dem Isolieren und der Reinigung oder Synthese der Peptide verbunden sind. Darüber hinaus ist die klinische Auswirkung der Peptide auch durch ihre relativ kurze Halbwertszeit in vivo eingeschränkt, die üblicherweise aus ihrem Abbau durch eine beliebige der im Zielgewebe vorhandenen Proteasen resultiert.
  • Aus diesen Gründen ist das Einführen eines Proteins in einen Patienten durch die Zufuhr eines Gens, das das Protein im Patienten/Wirt exprimiert, eine faszinierende Alternative zur Verabreichung des Proteins. Im Jahr 1984 wurde von Arbeiten am NIH berichtet, die zeigten, dass intrahepatische Injektion von nackter klonierter Plasmid-DNA für Eichhörnchen-Hepatitis in Eichhörnchen sowohl virale Infektion als auch die Bildung von antiviralen Antikörpern in den Eichhörnchen hervorrief (Seeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5849–5852 (1984)). Mehrere Jahre später berichteten Felgner et al., dass sie Expression von Protein aus "nackten" Polynucleotiden (d.h. DNA oder RNA, die nicht mit Liposomen oder einem viralen Expressionsvektor assoziiert ist), die in Skelettmuskelgewebe injiziert worden waren, erreicht hatten (Felgner et al., Science 247, 1465 (1990); siehe auch die PCT-Anmeldung WO 90/11092). Felgner et al. vermuteten, dass Muskelzellen aufgrund der einzigartigen Struktur von Muskelgewebe, das aus vielkernigen Zellen, sarkoplasmatischem Retikulum und einem Transversalsystem, das tief in die Muskelzelle hineinreicht, besteht, Polynucleotide effizient aufnehmen und exprimieren.
  • Obwohl angenommen wurde, dass Zellen von anderen Geweben auch in der Lage sein können, nackte Polynucleotide aufzunehmen, wurde die Expression in anderen Geweben bis heute nur dann identifiziert, wenn die Freisetzung des exprimierten Gens über ein Freisetzungssystem, z.B. über liposomale Transformation der Zellen, erfolgte. Tatsächlich schlugen andere Forscher vor, dass die Aufnahme und Expression von nackten Polynucleotiden in Geweben, die nicht Skelettmuskeln sind, nicht auf detektierbaren oder biologisch aktiven Niveaus auftritt (siehe z.B. Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11277–11281 (1992) (Expression nach Aerosol-Zufuhr eines Gens trat bei Verwendung eines liposomalen Freisetzungssystem auf, jedoch nicht, wenn DNA alleine eingeführt wurde] und Tang et al., Nature 356, 152–154 (1992) [Injektion mit einer Vakzine-"Pistole" eines hGH-Plasmids, das an kolloidale Goldkügelchen gebunden war]).
  • Obwohl sie im Allgemeinen für Genexpression innerhalb von Muskelzellen wirksam ist, erfordert Injektion von DNA oder RNA in Muskelgewebe für langfristige Therapien die Verwendung von wiederholten Injektionen, um den Verlust von Expression durch Genabbau auszugleichen. Dieser Ansatz kann nicht nur zeitaufwendig und teuer sein, sondern aufgrund von Entzündungen, die an der Injektionsstelle und in der Nähe dieser auftreten können, auch unpraktisch. Solch eine Entzündung kann verursachen, dass gegen Muskel- oder andere somatische Zellen, in die Nucleotide eingeführt werden, selbst eine Immunantwort ausgelöst wird (siehe z.B. Beispiel I), und kann somit zu schwerer Myonekrose führen. Darüber hinaus besteht durch intramuskuläre Injektion von DNA nicht nur das Risiko, das Muskelgewebe zu verletzen, sondern dass die Verletzung offensichtlich auch die Wirksamkeit der Therapie einschränkt. Forscher, die mit der Universität von Ottawa zusammenarbeiten, beobachteten beispielsweise, dass "Skelettmuskel das einzige Gewebe darstellt, das in der Lage ist, Reportergene aufzunehmen und zu exprimieren, die in Form von Plasmid-DNA transferiert werden [...], dass jedoch Fasern, die durch das Injektionsverfahren verletzt wurden, Plasmid-DNA nicht aufnahmen und exprimierten" (Davis et al., Human Gene Therapy 4, 151–159 (1993)).
  • Während die Verwendung von intramuskulären Injektionen zumindest kurzfristig in Therapien wirksam sein können, mittels derer Erkrankungen im Muskelgewebe selbst behandelt werden sollen, ist sie weiters wahrscheinlich weniger wirksam für die Stimulierung einer gewebespezifischen Immun- oder anderen biologischen Antwort auf das exprimierte Peptid an einer anderen Stelle im Körper des Patienten. Folglich ist intramuskuläre Injektion keine besonders gut geeignete Lösung zur Erreichung von Peptidexpression an den primären Eintrittspunkten zahlreicher Infektionen, d.h. Haut und Schleimhaut.
  • Weiters scheint es, dass intramuskuläre Injektionen von Polynucleotiden aufgrund der Freisetzung von jedem beliebigen kodierten Protein durch Ziel-Muskelzellen zur Bildung sowohl von Antikörpern als auch von zytotoxischen T-Zellen im Gewebe führen. Dahingegen führt Injektion von Protein (z.B. in einem Impfschema) üblicherweise nicht zu zytotoxischer T-Zellbildung, da exogene Proteine in den Klasse-I-Verarbeitungsweg nicht wirksam eintreten.
  • In der PCT-Anmeldung WO 90/11092 (s.o.) schlagen die Erfinder vor, dass die Injektion von nackter DNA in Skelettmuskel oder andere somatische Gewebe zu direkter Genexpression im Zytoplasma der injizierten Zellen führt. Die Erfinder schlagen weiters vor, dass das kodierte Protein dann in den Klasse-I-Verarbeitungsweg eintritt, um zytotoxische T-Zellbildung zu induzieren (die zur Kontrolle von bereits eingetretenen Virusinfektionen und Krebserkrankungen erforderlich ist). Wie jedoch bereits zuvor erläutert scheint es, dass anstelle dessen jegliche somatische Zelle, die Antigen exprimiert, zuerst das Antigen in den extrazellulären Raum zur Aufnahme durch Antigen-aufweisende Zellen freisetzen muss, bevor eine eingeschränkte zytotoxische Klasse-I-T-Zellantwort gegenüber dem Antigen induziert werden kann. Diese Schlussfolgerung wird von jüngsten Forschungsarbeiten bezüglich Antigenpräsentation unterstützt, wobei die Beobachtung gemacht wurde, dass "das Primen einer Immunantwort gegen [...] eingeschränktes Klasse-I-Antigen, das ausschließlich in nicht-blutbildenden Zellen exprimiert wird, den Transfer dieses Antigens zu einer aus Wirts-Knochenmark gewonnenen Zelle vor seiner Präsentation einbindet" (Huang et al., Science 264, 961–965 (1994)). Somit kann zumindest eine Voraussetzung, auf der das Verfahren zum Einführen von genetischem Material in Muskelzellen zur Proteinexpression und Immunisierung aus der PCT-Anmeldung WO 90/11092 basiert, nicht zutreffend sein.
  • Die Verwendung von intramuskulären Injektionen kann jedoch relativ hohe Niveaus an Proteinexpression systematisch vor Abbau des injizierten Gens produzieren. Während diese Reaktion in Therapien wünschenswert ist, in denen Proteinersetzung das Ziel ist, kann sie zu unbeabsichtigten Toxizitäten in Immunisierungs-Arbeitsvorschriften führen, in denen relativ rasche Clearance oder geringe Expressionsniveaus optimal sind. Folglich stellt die Einführung des Gens in Gewebe, die regelmäßig abgestoßen oder neu aufgebaut werden (wie beispielsweise Haut), und/oder in Zellen mit einer relativ hohen Abnutzungsrate in vivo (wie Zellen, die Antigen aufweisen) einen nützlicheren Weg zur Genimmunisierung dar.
  • Hinsichtlich des Freisetzungssystems für Gene stellen Mittel wie beispielsweise virale Vektoren, die das Gen in das Genom des Wirts einführen, ein potenzielles Gesundheitsrisiko in Verbindung mit Schädigung des genetischen Materials in der Wirtszelle dar. Die Verwendung von kationischen Liposomen oder einer biolistischen Vorrichtung (d.h, einer Vakzinen-"Pistole", die Polynucleotide, gebunden an Kügelchen, in das Gewebe "schießt") zur Zufuhr von Genen in vivo ist aufwendig in der Herstellung und erfordert gewisses Experimentieren zur Auswahl geeigneter Partikelgrößen zur Übertragung in Zielzellen. Weiters bringt jegliches invasive Mittel zur Einführung von Nucleotiden (z.B. Injektion) Probleme von Gewebetraumata (insbesondere bei langfristigen Therapien) mit sich und geht mit eingeschränktem Zugang zu bestimmten Zielgeweben, wie beispielsweise Organen, einher.
  • Mittel zur nicht-invasiven Zufuhr von pharmazeutischen Zusammensetzungen von Peptiden, wie z.B. Iontophorese und andere Mittel zur transdermalen Übertragung, haben zumindest den Vorteil, Gewebetraumata zu minimieren. Dennoch wird angenommen, dass die Bioverfügbarkeit von Peptiden nach Übertragung über Haut oder Schleimhaut durch die relativ hohe Konzentration an Proteasen in diesen Geweben eingeschränkt ist. Leider waren bis heute verlässliche Mittel zur Zufuhr von Peptiden (wie beispielsweise allergenen Antigenen) mittels Übertragung über Haut oder Schleimhaut von Genen, die für diese kodieren, nicht verfügbar.
  • Die möglichen Vorteile von erfolgreicher Verabreichung von Peptiden über In-vivo-Expression von nackten Polynucleotiden kann in einem Vergleich mit dem aktuellen Entwicklungsstand von Allergen-Immuntherapie veranschaulicht werden, worin allergene Extrakte oder gereinigte Allergene einem Patienten verabreicht werden, um das Auftreten einer allergischen Reaktion auf das Allergen im Patienten zu behandeln oder zu unterbinden.
  • Herkömmliche Immuntherapie von allergischen Leiden versucht, den Patienten gegenüber einem Allergen zu desensibilisieren, und wird am häufigsten zur Behandlung und Kontrolle von IgE-Antikörper-vermittelter Erkrankung verwendet. Typischerweise erhält der Patient einmal oder zweimal wöchentlich subkutane Injektionen von sterilen Allergenextrakten (normalerweise rohe oder teilweise gereinigte wässrige Extrakte von üblichen Allergenen), bis eine Dosis erreicht ist, die einen Entzündungs-Übergangsbereich an der Injektionsstelle produziert, woraufhin Allergendosen zur Aufrechterhaltung regelmäßig verabreicht werden.
  • Der Mechanismus, durch den Allergenimmuntherapie den Patienten gegenüber einem Allergen desensibilisiert, ist nicht gänzlich bekannt; es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Therapie die Produktionsmengen von IL-4 (das sonst Produktion von IgE-Antikörper stimulieren könnte) durch CD4+-T-Zellen reduziert (siehe Secrist et al., J. Exp. Med. 178, 2123–2129 (1993)). Es ist auch möglich, dass Allergenimmuntherapie Allergen-spezifische, IgG-blockierende Antikörper induziert, die mit IgE-Antikörpern konkurrieren und hierdurch die Freisetzung von Mediatoren aus Mastzellen unterbinden können (siehe Nakagawa et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 102, 117–120 (1993)). Forscher haben auch berichtet, dass Allergenimmuntherapie die Aktivierung von Antigen-spezifischen Suppressor-T-Zellen fördert, was wiederum Anergie von TH2-Lymphozyten (die T-Zellen, die für IgE-Antikörperbildung verantwortlich sind) induzieren kann (siehe Tamir et al., J. Allergy Clin. Immunol. 79, 591–598 (1987)).
  • Wenn sie auch sehr wirksam ist, so ist Allergenimmuntherapie nicht unumstritten, prinzipiell aufgrund des Risikos, Anaphylaxie und weniger verwandten Leiden wie beispielsweise Angioödem und Asthma auszulösen. Das Risiko von negativen Reaktionen ist am größten bei Personen, die auf bestimmte Allergene hypersensibel reagieren, ist jedoch aufgrund der Steigerung von IgE-Antikörperproduktion, die während der frühen Behandlungsphasen häufig auftritt, bei allen Allergenimmuntherapie-Patienten vorhanden.
  • Bei einem Versuchsansatz zur Minimierung des Risikos von Anaphylaxie werden Peptidfragmente von Allergenen (insbesondere des Katzenallergens Fel dl) verwen det und nicht ganze Allergene. Die Theorie hinter diesem Ansatz ist, dass die Fragmente mit T-Zell-Epitopen wechselwirken und so das Risiko von anaphylaktischen Reaktionen minimieren (siehe z.B. Romagnani, Int. Arch. Allergy Immunol. 98, 279-285 (1992)). Ein Nachteil von Peptidimmuntherapie jedoch ist der Bedarf, Peptide zu identifizieren und zu isolieren oder zu synthetisieren, die sich spezifisch an T-Zell-Epitope binden. Es besteht daher ein Bedarf an einer relativ risikofreien Allergiebehandlung, die IgE-Produktion vollständig unterdrückt, jedoch ohne spezialisierte Handhabung von proteinhältigen Allergenen zu erfordern.
  • Allgemeiner veranschaulicht die obige Diskussion auch den Bedarf an wirksamen Mitteln zum Einführen von nackten Nucleotiden, die in vivo ein Peptid exprimieren, das lokale Immunität in Haut und Schleimhaut induzieren kann, um einen Wirt gegen beispielsweise sexuell übertragbare Krankheiten und Erkrankungen der Atemwege zu impfen. Sie verweist auch auf den Bedarf an einem Mittel zum Einführen eines Gens, das für ein biologisch aktives Peptid kodiert, in einen Wirt auf gewebespezifische Weise, ohne signifikantes Gewebetrauma auszulösen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit die Verwendung eines nackten Polynucleotids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem Allergen oder einem Allergen-Epitop bereit, wobei das Polynucleotid der Haut des Wirts zu verabreichen ist, worin die Haut im Vergleich mit anderen Wirtsgeweben eine hohe Konzentration an Antigen aufweisenden Zellen hat; worin das nackte Polynucleotid operativ für das Allergen oder Allergenepitop kodiert; und worin das Allergen in den Antigen aufweisenden Zellen ohne wesentliche Sekretion hieraus exprimiert wird und vorzugsweise Th1-Lymphozyten aktiviert, während es Allergen-stimulierte IgE-Produktion im Wirt reduziert.
  • Das nackte Polynucleotid kann auf verschiedene Typen einer Mehrfachzinken-Vorrichtung beschichtet und durch Penetrieren der Haut des Wirts mittels der Zinken verabreicht werden. Das nackte Polynucleotid kann unter der Kontrolle eines Nuklearrezeptorpromotors stehen, wie beispielsweise eines Promotors, der durch Auftragung eines aktivierenden Liganden, der für den Nuklearrezeptor spezifisch ist, auf die Haut des Wirts zum Zeitpunkt des Eintritts des Polynucleotids aktiviert wird. Solche Liganden umfassen 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D3, Steroidhormone, Schilddrüsenhormon und Retinoide.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines nackten Polypeptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem Allergen oder Allergenepitop bereit, wobei das Polynucleotid einem Schleimhautgewebe des Wirts zu verabreichen ist, worin das Schleimhautgewebe im Vergleich zu anderen Wirtsgeweben eine hohe Konzentration von Antigen aufweisenden Zellen hat; worin das nackte Polynucleotid operativ für das Allergen oder Allergenepitop kodiert; und worin das Allergen in den Antigen aufweisenden Zellen ohne wesentliche Sekretion hieraus exprimiert wird und vorzugsweise Th1-Lymphozyten aktiviert, während es Allergen-stimulierte IgE-Produktion im Wirt reduziert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Details der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in den beiliegenden Zeichnungen und der nachstehenden Beschreibung erläutert. Sind die Details der Erfindung erst einmal bekannt, so können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung zahlreiche zusätzliche Neuerungen und Änderungen daran vornehmen.
  • 1. DEFINITIONEN
  • Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um die Erläuterung der Erfindung zu vereinfachen. Fachleute werden jedoch erkennen, dass diese Definitionen erweitert werden können, um Äquivalente einzubinden, ohne vom legitimierten Schutzumfang oder der grundlegenden Idee der Erfindung abzuweichen. Aus diesem Grund gilt es diese Definitionen nicht als Einschränkung der Erfindung zu verstehen.
    • a. "Nackte(s) Polynucleotid(e)" bezieht sich auf DNA oder RNA und kann, je nach Eignung für die Ziele der Therapie, die gemäß der Erfindung praktiziert wird, Sense- oder Antisense-Stränge einbinden. Polynucleotid in diesem Kontext kann Oligonucleotide einbinden. Nackt in diesem Kontext bezeichnet Polynucleotide, die nicht mit kolloidalen Materialien (einschließlich liposomaler Präparate) Komplexe bilden oder innerhalb eines Vektors enthalten sind, der die Integration des Polynucleotoids in das Wirtsgenom verursachen würde.
    • b. "Operativ kodieren" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das so modifiziert wurde, dass es Promotor- und andere Sequenzen einbindet, die für Expression und, sofern erwünscht, für Sekretion des erwünschten Translationsprodukts, z.B. eines Peptids oder Proteins, erforderlich sind. All die Ausführungsformen der Erfindung können unter Verwendung von bekannten Plasmid-Expressionsvektoren praktiziert werden. Vorzugsweise umfassen diese Vektoren cDNA(s), die für das erwünschte Produkt kodiert/kodieren. Daher wird angenommen, außer der Kontext erfordert es anders, dass sich "Polynucleotid" oder "nacktes Polynucleotid" auf operativ kodierende Sequenzen bezieht, die in einem geeigneten Plasmid-Expressionsvektor enthalten sind, wofür Beispiele hierin bereitgestellt werden.
    • c. "Gemisch aus Polynucleotiden" soll sich auf mehr als eine und bis zu 200 Polynucleotidspezies beziehen, die unter der Kontrolle desselben Promotors stehen.
    • d. "Synthese" bezieht sich auf allgemein bekannte Mittel zum Synthetisieren von Polynucleotidsequenzen und kann Isolation und Reinigung von nativen Polynucleotiden einbinden.
    • e. "Peptid" bezieht sich auf kleine Peptide, Polypeptide, Oligopeptide und Proteine, die eine erwünschte biologische Wirkung in vivo haben.
    • f. "Iontophorese" bezieht sich auf ein bekanntes Mittel von transdermaler Übertragung, das zur Zeit verwendet wird, um Peptide kontinuierlich einem Wirt zuzuführen. Insbesondere ist es ein Verfahren, das den Transport von ionischen Spezies durch das Anlegen von physiologisch annehmbarem elektrischem Strom erleichtert. Dieses Verfahren und andere Mittel zur transdermalen Übertragung werden in Chien et al., Transdermal Drug Delivery, "Novel Drug Delivery Systems", Kapitel 7, Teil C, Marcel Dekker (1992), beschrieben, wobei derer relevanten Offenbarungen den Stand der Technik auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich Verfahren zur Wirkstoffzufuhr veranschaulichen.
    • g. "Detergens/Absorptionspromotoren" bezieht sich auf chemische Mittel, die zur Zeit auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, um Absorption und Transfektion bestimmter kleiner Moleküle sowie von Peptiden erleichtern.
    • h. "Antigen aufweisende Zellen" oder "APCs" umfassen bekannte APCs wie beispielsweise Langerhans-Zellen, verhüllte Zellen von afferenten Lymphgefäßen, dendritische Zelle und ineinandergreifende Zellen von Lymphorganen. Die Definition umfasst auch einkernige Zellen wie beispielsweise (1) Lymphozyten und Makrophagen, die Polynucleotide gemäß der Erfindung in Haut aufnehmen und exprimieren, und (2) einkernige Zellen, die in den hierin enthaltenen histologischen Photographien dargestellt sind. Diese Zellen sind keine Gewebezellen, sind jedoch wahrscheinlich Antigen aufweisende Zellen. Die wichtigsten von diesen in Bezug auf die vorliegende Erfindung sind jene APCs, die dafür bekannt sind, in großer Anzahl in Epithel- und Thymus-abhängigen Zonen des Lymphgewebes vorhanden zu sein, einschließlich Epidermis und Schleimhaut-Plattenepithel der Mundschleimhaut, der Vagina, der Zervix oder der Speiseröhre (Zonen mit "relativ hohen" Konzentrationen an APCs). Zusätzlich zu ihren nachstehend erläuterten Definitionen hierfür bezieht sich "Haut" und "Schleimhaut" wie hierin verwendet insbesondere auf diese Stellen mit hoher APCs-Konzentration.
    • i. "Wirt" bezieht sich auf den Rezipienten der Therapie, die gemäß der Erfindung auszuführen ist. Der Wirt kann ein beliebiges Wirbeltier sein, ist jedoch vorzugsweise ein Säugetier. Ist er ein Säugetier, so vorzugsweise ein Mensch, kann jedoch auch ein Nutz- oder Haustier sein.
    • j. "Zielgewebe" bezieht sich auf das Gewebe des Wirts, in dem Expression des nackten Polynucleotids beabsichtigt wird.
    • k. "Haut" wie hierin verwendet bezieht sich auf die epidermalen, dermalen und subkutanen Gewebe eines Wirts.
    • l. "Schleimhaut" bezieht sich auf mukosale Gewebe eines Wirts unabhängig von ihrer Anordnung im Körper, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Atemwege (einschließlich Bronchialwege, Lungenepithel und Nasenepithel), Genitalwege (einschließlich vaginaler, peniler und analer Schleimhaut), Harnwege (z.B. Harnröhre, Blase), Mund, Augen und Stimmbänder.
    • m. "Eintrittspunkt" bezieht sich auf die Stelle der Einführung des nackten Polynucleotids in einen Wirt, einschließlich unmittelbar benachbartes Gewebe.
    • n. "Dermale" und "Epidermale Verabreichung" bezeichnet Arten der Verabreichung, die das/die nackte(n) Polynucleotid(e) auf die Haut auftragen oder durch die Haut zuführen. Dermale Wege umfassen intradermale und subkutane Injektionen sowie transdermale Übertragung. Epidermale Wege umfassen jedes beliebige Mittel zur ausreichenden Reizung der äußersten Hautschicht, um eine Immunantwort auf den Reizstoff zu provozieren. Der Reizstoff kann ein mechanisches oder chemisches (vorzugsweise topisches) Mittel sein.
    • o. "Epitheliale Verabreichung" bindet im Wesentlichen dieselben Verfahren wie chemische epidermale Verabreichung ein, mit der Ausnahme, dass der chemische Reizstoff auf Schleimhautepithel aufgetragen wird.
    • p. "IL" bezeichnet Interleukin.
    • q. "TH1-Reaktion(en)" bezieht sich auf eine zelluläre Immunantwort, die vorzugsweise durch Antigene induziert wird, die sich an bestimmte APCs, d.h. Makrophagen und dendritische Zellen, binden und diese aktivieren.
    • r. "Biologisch aktive(s) Peptid(e)" bezieht sich auf ein Peptid, das, sofern es einem Wirt verabreicht wird, eine positive therapeutische Wirkung ausübt oder eine Immunantwort im Wirt hervorruft.
    • s. "Aktivierender Ligand" bezieht sich auf einen Liganden, der, sofern er an einen Nuklearrezeptor gebunden ist, Aktivität am Teil des Rezeptors induziert.
  • 2. DISKUSSION
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung Mittel zur Induktion von lokaler Immunität gegenüber einem Allergen oder Allergenepitop durch Zuführen eines nackten Polynucleotids zu einer Wirtszelle, die operativ für das Allergen oder Allergenepitop kodiert. Insbesondere wird das nackte Polypeptid vorzugsweise einem Gewebe zugeführt, das im Vergleich zu anderen Geweben im Körper eine relativ hohe Konzentration an Antigen aufweisenden Zellen hat. Wenn auch nicht beabsichtigt ist, dass die Erfindung hinsichtlich der eingebundenen Expressionsmechanismen zur Gänze durch eine bestimmte Theorie eingeschränkt ist, wird angenommen, dass eine biologische Reaktion in diesen Geweben nach Verabreichung des nackten Polynucleotids erreicht wird, da das Polynucleotid intrazellulär im Zytoplasma von einkernigen Zellen, am wahrscheinlichsten in den Antigen aufweisenden Zellen des Wirts, exprimiert wird. Auch wird angenommen, dass die einkernigen Zellen in eine Entzündungsimmunantwort auf das nackte Polynucleotid eingebunden sein können, sobald die Zellen in das Lymphsystem gewandert sind und das exprimierte Peptid als Antigen vorweisen.
  • Auf Grundlage von histologischen Studien scheinen nackte Polynucleotide nicht direkt von Fibroblasten oder anderen Geweben in signifikanten Mengen aufgenommen zu werden (siehe Beispiel IV und 6). Diese Schlussfolgerung beruht auf Studien, die zeigen, dass (1) intradermale Verabreichung von sogar nur minimalen Mengen nackter Polynucleotide an Mäuse eine maßgebliche T1-Reaktion induzierte (was auf Antigenpräsentation durch Makrophagen und dendritische Zellen hinweist; siehe die Beispiele XI und XII sowie die 15–19); (2) intradermale Verabreichung von nack tem Polynucleotid an Mäuse die Bildung von zytotoxischen T-Zellen ohne Stimulation der Produktion von nachweisbaren Mengen an Antikörper induzierte (siehe Beispiel IX und die 11–12); und (3) verlängertes immunologisches Gedächtnis hinsichtlich des Polynucleotid-Expressionsprodukts in Form eines Antigens induzierte (Beispiel X und 13–14). Es scheint daher, dass die Immunogenität von nackten Polynucleotiden nicht von der Menge an Protein abhängt, die von diesen exprimiert werden, sondern von der Art der transfizierten Zellen (z.B. Antigen aufweisende Zellen gegenüber Gewebezellen).
  • Angesichts der eindeutigen Rolle, die Entzündungserscheinungen in diesem Verfahren der Erfindung spielen, wird Fachleuten verständlich sein, dass gesteigerte Durchlässigkeit von Zellmembranen des Zielgewebes in Verbindung mit Entzündung die Aufnahme von nackten Polynucleotiden steigern kann (insbesondere über Barrieren wie z.B. Haut und Schleimhaut).
  • Das Zielgewebe ist Haut oder Schleimhaut, wobei etwa 1 % bis 2 % der Zellpopulation aus Antigen aufweisenden Zellen bestehen. Immunantwort auf Antigene in infizierten Geweben. Ein nasaler Verabreichungsweg (über Einatmen oder Hineinblasen) wäre auch besonders nützlich bei Therapien, die auf die Behandlung von Atemwegserkrankungen und damit verwandten Erkrankungen abzielen. Darüber hinaus wäre eine Verabreichung über die Schleimhaut oder Haut auch zur Immunisierung gegen Allergene nützlich. Diese Gewebe werden auch aufgrund ihrer Regenerationsfähigkeit bevorzugt, was die Zeitspanne einschränkt, die eingeführte Materialien am Eintrittspunkt verweilen.
  • Da die Antigen aufweisenden Zellen, die im Zielgewebe vorhanden sind, dazu dienen können, die Expression des nackten Polynucleotids zu vermitteln, kann das Verfahren der Erfindung zur Induktion von systemischen Reaktionen auf das exprimierte Peptid nicht so nützlich sein wie zur Induktion einer örtlichen Reaktion. Bei ausreichenden Dosierungskonzentrationen jedoch kann eine vorübergehende systemische Wirkung induziert werden. Eine nützliche Anwendung dieses Aspekts der Erfindung zur Induktion von systemischen Reaktionen auf das exprimierte Peptid kann daher die Anwendung als ein Adjuvans für andere systemische Therapien darstellen.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung dienen die APCs als Vehikel zur Zufuhr des nackten Polynucleotids zu lymphatischen Organen und zu Schleimhautgeweben, die nicht jene am Eintrittspunkt sind. Diese Ausführungsform wird unter Verweis auf die folgenden Annahmen veranschaulicht; der beschriebene Mechanismus sollte jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung verstanden werden.
  • In dieser Ausführungsform wird angenommen, dass die APCs das nackte Polynucleotid bei oder nahe einem Eintrittspunkt aufnehmen und sie dann in den lymphatischen Kreislauf hineintragen. Einmal an einem Lymphknoten angelangt, weist die APC das intrazellulär exprimierte Protein als ein Antigen auf, wodurch eine Immunantwort stimuliert wird. Von hier ausgehend können jene APCs, die "homing"-Rezeptoren für z.B. Schleimhaut tragen, neuerlich in den lymphatischen Kreislauf eintreten, bis sie sich in einem Zielgewebe niederlassen, das nicht das Gewebe am Eintrittspunkt ist.
  • Zusätzlich könnten Gene für IL-2, γ-Interferon und/oder transformierenden Wachstumsfaktor (TGFβ) verabreicht werden, um Produktion von IgE-Molekülen zu unterdrücken. Dieser Ansatz ist von besonderem Interesse, da sich in jüngsten klinischen Versuchen IL-2 und γ-Interferon bei Dosierungen, die ausreichend sind, um die Produktion von IgE zu stören, als toxisch gezeigt haben. Darüber hinaus kann, da IgE-Moleküle vorrangig in Haut und Schleimhaut vorhanden sind, erwartet werden, dass die Verwendung dieser Verabreichungswege als Eintrittspunkte gemäß der Erfindung besonders wirksam zur Mäßigung von allergischen Reaktionen in diesen Geweben ist.
  • Darüber hinaus ist eine unerwartete Entdeckung, die der Erfindung zugrunde liegt, dass Immunisierung eines Wirts gegen ein Allergen mit einem für Allergen kodierenden Polynucleotid die IgE-Antikörperreaktion unterdrückt, die typischerweise bei der Immunisierung eines Wirts mit dem Allergen selbst produziert wird. Weiters treten Allergen-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten in Wirten auf, die mit für Allergen kodierenden Polynucleotiden in wesentlich größerem Volumen, als bei Immunisierung mit dem Allergen produziert wird, immunisiert sind. Somit stellt die Erfindung ein wirksameres und weniger risikoreiches Mittel zur Allergen-Immuntherapie bereit als zur Zeit erhältlich ist.
  • Ein anderer besonderer Vorteil der Erfindung ist, dass sie die Verabreichung relativ kleiner Dosen von Antigen einbindet. Insbesondere die Menge an fremdem Material, das in den Wirt eingeführt wird, ist relativ gering, da ein Polynucleotid, das operativ für ein Antigen kodiert, anstelle des Antigens selbst verabreicht wird. Darüber hinaus erfordern Wege zur Verabreichung von nackten Polynucleotiden durch Haut oder Schleimhaut eine niedrigere Konzentration an DNA, um dasselbe Ausmaß an Immunantwort zu produzieren wie durch intramuskuläre Verabreichung (z.B. etwa 10- bis 50fach niedriger; siehe z.B. Beispiel XI und die 13–14). Demzufolge eignet sich die Erfindung gut für die Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die für bis zu mehreren hundert verschiedenen Antigenen zur Verwendung als beispielsweise eine polyvalente Vakzine kodieren.
  • Die bevorzugten Arten der Verabreichung zur Induktion von lokaler Immunität in oder nahe der Haut sind transdermale Übertragung, intradermale Injektion oder oberflächliches Kratzen oder Reizen der äußersten Schicht epidermaler Zellen (d.h. epidermale Verabreichung), wobei subkutane Injektion in bestimmten Anwendungen auch nützlich sein kann. Die bevorzugten Arten der Verabreichung zur Induktion von lokaler Immunität in den Atemwegen sind Einatmen oder Hineinblasen; Arten der Verabreichung an andere Schleimhautgewebe variieren je nach deren Anordnung im Körper.
  • Müssen die nackten Polynucleotide in Haut oder Schleimhaut eingeführt werden, so wird die Zufuhr des Polynucleotids vorzugsweise ohne Bedarf an Injektion durch die Verwendung von Detergenzien, Absorptionspromotoren, chemischen Reizstoffen (wie beispielsweise keratinolytischen Mitteln) oder mechanischen Reizstoffen erleich tert. Detergenzien und Absorptionspromotoren, die die Aufnahme von kleinen Molekülen, die keine Gene sind, erleichtern, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können, ohne übermäßiges Experimentieren, für die Verwendung zur Erleichterung der Aufnahme von Genen angepasst werden. Ein anderer, im Wesentlichen nicht-invasiver Ansatz zur Einführung der nackten Polynucleotide arbeitet mit transdermaler Übertragung (vorzugsweise Iontophorese), die zur transdermalen Übertragung von Peptiden bereits erfolgreich verwendet wurde.
  • Im Allgemeinen ist die Verwendung von jeder beliebigen parenteralen Art der Verabreichung möglich, obwohl die Verwendung von Wegen, die kaum oder kein Eindringen in Wirtsgewebe einbinden, stark bevorzugt werden. Aufgrund des Bedarfs an wiederholter Verabreichung des/der nackten Polynucleotide) jedoch werden intramuskuläre Injektionen nicht bevorzugt. Anstelle dessen wird die Einführung des/der nackten Polynucleotide) in einen Bereich des Körpers, der regenerativ ist, wie beispielsweise Haut oder Schleimhaut, aufgrund der Fähigkeit, Zellen zu ersetzen, die direkt durch das mit jeder Dosierung assoziierte Trauma beeinträchtigt wurden, bevorzugt.
  • Sofern erwünscht, werden, um Sekretion der in diesen Ausführungsformen der Erfindung zu exprimierenden Proteine sicherzustellen, Sequenzen, die Sekretion kontrollieren und Fachleuten bekannt sind, in das verabreichte nackte Polynucleotid eingebunden, sofern sie nicht schon im Gen voller Länge vorhanden sind. Bei der Verwendung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem Antigen jedoch wird für das Antigen bevorzugt, dass es nicht durch APCs sekretiert wird, in denen es exprimiert wird, sondern dass es an der Zelloberfläche vorhanden ist. So stehen bei der Verwendung in Ausführungsformen der Erfindung, deren Ziel es ist, den Wirt gegenüber einem Antigen zu immunisieren, die nackten Polynucleotide vorzugsweise unter der Kontrolle von Sequenzen, die Sekretion von exprimiertem Protein unterbinden, wobei diese Sequenzen Fachleuten bekannt sind.
  • Die Verwendung von Liposomen bei der Zufuhr der nackten Polynucleotide der Erfindung ist nicht bevorzugt. Solch eine Verwendung neigt dazu, zu reduzierten Ex pressionsniveaus zu führen. Dieses Phänomen ist wahrscheinlich das Resultat von beeinträchtiger Erkennung eines Liposoms als ein antigenes Material durch APCs.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt Schnitte von Muskelgewebe, das chronische Entzündung (Bild A) und Myonekrose (Bild B) nach intramuskulären Injektionen von pREVk3 und pRSVIL-2 aufweist. Bild C zeigt Schnitte von ähnlichem Muskelgewebe nach subkutanen Injektionen von pREVK3 oder pRSVIL-2.
  • 2A zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in Serum nach intradermaler Injektion von nacktem pCMVRNP; 2B zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in Serum nach intramuskulärer Injektion von nacktem pCMVRNP.
  • 3 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG vor intranasaler Einführung von nacktem pCMVRNP in Balb/c-Mäuse.
  • 4 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in einer nicht anästhesierten Gruppe von Balb/c-Mäusen.
  • 5 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG in einer anästhesierten Gruppe von Balb/c-Mäusen.
  • 6 ist eine Photographie der Resultate histologischer Studien an Haut am Eintrittspunkt für pCMVRNP in Balb/c-Mäusen, die Aufnahme des Plasmids durch mononukleare Zellen (APCs) zeigt. Eine APC wird durch einen Pfeil bezeichnet; eine Gewebezelle (die kein Plasmid enthält) wird durch eine gestrichelte Linie bezeichnet.
  • 7 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG nach mechanischer epidermaler Verabreichung von nacktem pCMVRNP an Balb/c-Mäuse.
  • 8 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-NP-IgG nach chemischer epidermaler Verabreichung von nacktem pCMVRNP an Balb/c-Mäuse.
  • 9 enthält eine Kaplan-Meyer-Kurve zu Überlebensraten, die die Zeitspanne darstellt, die Balb/c-Mäuse, denen intradermal nacktes pCMVRNP verabreicht wurde, nach viraler Provokation überlebten.
  • 10 vergleicht in einem Diagramm NP-Genexpression nach separaten intradermalen Injektionen von nackten Plasmiden, die entweder eine CMV- oder eine RSV-Promotorsequenz enthielten.
  • 11 zeigt die Mengen an zytotoxischen T-Zellen, die in Mäusen nach Injektion von für Ovalbumin kodierenden nackten Plasmiden, verabreicht mittels intradermaler Injektion, nachgewiesen wurden.
  • 12 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-Ovalbumin-Antikörper in den in Verbindung mit 11 beschriebenen Mäusen.
  • 13 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-β-Galactosidase-Antikörper nach Verabreichung von (1) einem Polynucleotid, das für das Enzym kodiert, durch intramuskuläre oder intradermale Injektion und (2) dem Enzym durch intradermale Injektion.
  • 14 zeigt die Resultate eines ELISA für Anti-β-Galactosidase-Antikörper in Seren von den in Verbindung mit 22 beschriebenen Mäusen nach einer Boosterinjektion von Antigen.
  • 15 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in Seren von Mäusen, denen (1) intradermal oder intramuskulär ein Polynucleotid, das für β-Galactosidase kodiert, oder (2) das Enzym durch intradermale Injektion verabreicht wurde.
  • 16 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in Seren von Mäusen, denen (1) intradermal oder intramuskulär ein Polynucleotid, das für β-Galactosidase kodiert, oder (2) das Enzym durch intradermale Injektion verabreicht wurde.
  • 17 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in Seren von den in Verbindung mit 25 beschriebenen Mäusen nach einer Boosterinjektion von Antigen.
  • 18. zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in Seren von den in Verbindung mit 24 beschriebenen Mäusen nach einer Boosterinjektion von Antigen.
  • 19 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-2A-Typ-Antikörper in Seren von Mäusen, denen (1) durch Kratzen der Haut mit mit für β-Galactosidase kodierendem Polynucleotid beschichteten Zinken oder (2) durch intradermale Injektion das Enzym verabreicht wurde.
  • 20 zeigt die Resultate eines ELISA für IgG-1-Typ-Antikörper in Seren von Mäusen, denen (1) durch Kratzen der Haut mit mit für β-Galactosidase kodierendem Polynucleotid beschichteten Zinken oder (2) durch intradermale Injektion das Enzym verabreicht wurde.
  • 21 ist eine Karte des eukaryotischen pGREtk-Expressionsvektors.
  • 22 ist eine Karte des eukaryotischen pVDRtk-Expressionsvektors.
  • 23 zeigt die Resultate eines ELISA für insgesamte IgE-Antikörpermengen in Mäusen nach Immunisierung mit einem für Antigen kodierenden Plasmid (pCMV-Lac-Z), dem Antigen selbst (β-Galactosidase) oder einem Kontrollplasmid (nicht kodierend) (pCMV-BL; "Kont.").
  • 24 zeigt die Resultate eines ELISA für Allergen-spezifische IgE-Antikörpermengen in Mäusen nach Immunisierung mit einem für Antigen kodierenden Plasmid (pCMV-Lac-Z), dem Antigen selbst (β-Galactosidase) oder einem Kontrollplasmid (nicht kodierend) (pCMV-BL; "Kont.").
  • 25 zeigt die Resultate eines ELISA für Mengen an IL-2 und INFγ nach Immunisierung von Mäusen mit einem für Antigen kodierenden Plasmid (pCMV-Lac-Z) oder dem Antigen selbst (β-Galactosidase).
  • 26 zeigt die Resultate eines Tests zur Detektion von Antigen-spezifischer Zelllyse durch T-Lymphozyten von Mäusen, die durch epidermale Verabreichung von pCMV-NP-Plasmid immunisiert wurden.
  • 27 zeigt die Resultate eines Tests zur Detektion von Antigen-spezifischer Zelllyse durch T-Lymphozyten von den in 26 beschriebenen Mäusen ohne Pulsieren der Zellen mit dem Antigen.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bezüglich dieser Beschreibung gilt es, die bevorzugte Ausführungsform und die gezeigten Beispiele als typische Beispiele und nicht als Einschränkungen der Erfindung zu verstehen.
  • 1. EINFÜHREN VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN IN ZIELGEWEBE MIT WESENTLICHEN KONZENTRATIONEN AN ANTIGEN AUFWEISENDEN ZELLEN
  • A. Herstellung von nackten Polynucleotiden.
  • Die in der Erfindung zu verwendenden Polynucleotide können DNA oder RNA sein, sind jedoch vorzugsweise eine komplementäre DNA- (cDNA-) Sequenz. Die in der Erfindung verwendeten Polynucleotidsequenzen müssen (a) exprimierbar und (b) entweder nicht-replizierend oder durch Mittel bearbeitet sein, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, um nicht in das Wirtsgenom zu replizieren. Veranschaulichungen der Herstellung von Polynucleotiden, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind, werden im Folgenden bereitgestellt, und spezifische Beispiele, die zeigen, wie besondere Polynucleotid-Zusammensetzungen hergestellt wurden, sind nachstehend angeführt. Fachleuten wird ohnedies bekannt sein, dass andere bekannte Mittel zur Herstellung von nicht-replizierenden Polynucleotiden auch geeignet sein können.
  • Polynucleotide zur Verwendung in der Erfindung können unter Einsatz von Hybridisierungsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, gewonnen werden. DNA und RNA können auch unter Verwendung von automatisierter Nucleinsäuresynthese-Ausstattung, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, synthetisiert werden. Die Verwendung von durchwegs bekannter Polymerasekettenreaktion (PCR) ist besonders zur Herstellung von Polynucleotidgemischen bevorzugt. Genomische Nucleinsäuren können durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel hergestellt werden, wie beispielsweise die von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 und 4, Wiley Interscience (1989), beschriebenen Arbeitsvorschriften. cDNA kann gemäß den auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Mitteln synthetisiert werden (siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Lab, New York (1982)). Eine cDNA-Expressionsbibliothek, die Polynucleotide von Interesse enthält, kann auch durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Mittel gescreent werden. Beispiele für solche Mittel werden in der nachstehenden Erläuterung veranschaulicht.
  • Bevorzugte Polynucleotide zur Verwendung in spezifischen Anwendungen werden in der vorangehenden Zusammenfassung der Erfindung erwähnt. Beispielsweise können nackte Polynucleotide operativ für therapeutische Peptide kodieren, kodieren jedoch vorzugsweise für immunogene Peptide, die als Antigene wirken können, um eine humorale und/oder zelluläre Antwort hervorzurufen. Die nackten Polynucleotide können auch operativ für einen Antikörper kodieren. In dieser Hinsicht umfasst die Bezeichnung "Antikörper" ganzes Immunglobulin einer beliebigen Klasse, Chimäre Antikörper, Hybridantikörper mit dualen oder vielfachen Antigen-Spezifitäten und Fragmente einschließlich Hybridfragmente. Auch im Begriff "Antikörper" eingebunden sind Konjugate von solchen Fragmenten und so genannte Antigen-Bindungsproteine (einkettige Antikörper), wie beispielsweise im US-Patent Nr. 4.704.692 beschrieben. Alternativ dazu können die kodierten Antikörper auch anti-idiotypische Antikörper (Antikörper, die andere Antikörper binden) sein, wie beispielsweise im US-Patent Nr. 4.699.880 beschrieben.
  • Fachleuten wird jedoch bekannt sein, dass die Verfahren der Erfindung für die Verwendung bei der Verabreichung eines beliebigen Polynucleotids oder Gemisches davon, die operativ für therapeutische und/oder immunogene Peptide von Interesse kodieren, angepasst werden können. Die Erfindung ist daher nicht auf die Verwendung mit (irgendeinem) bestimmten Polynucleotid(en) eingeschränkt.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich "Polynucleotid" auf ein Polymer von Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden in Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren Konstrukts. DNA, die für ein therapeutisches und/oder immunogenes Peptid der Erfindung kodiert, kann aus cDNA-Fragmenten oder aus Oligonucleotiden zusammengefügt werden, die ein synthetisches Gen liefern, das in der Lage ist, in einer rekombinanten Transkriptionseinheit exprimiert zu werden. Polynucleotidsequenzen der Erfindung umfassen DNA-, RNA- und cDNA-Sequenzen. Eine Polynucleotidsequenz kann aus dem genetischen Code abgeleitet werden, wobei jedoch die Degeneration des Codes berücksichtigt werden muss. Polynucleotide der Erfindung umfassen Sequenzen, die als ein Resultat des genetischen Codes degeneriert sind, wobei diese Sequenzen von Fachleuten leicht bestimmt werden können.
  • Polynucleotidsequenzen, die für ein erwünschtes therapeutisches und/oder immunogenes Peptid kodieren, können entweder in Eukaryoten oder in Prokaryoten exprimiert werden. Wirte können mikrobielle, Hefe-, Insekten- und Säugetierorganismen umfassen. Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen mit eukaryotischen oder viralen Sequenzen in Prokaryoten sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Biolo gisch funktionelle virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die zu Expression und Replikation in einem Wirt in der Lage sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung auch bekannt. Solche Vektoren werden verwendet, um DNA der Erfindung zu inkorporieren.
  • DNA-Sequenzen zur Verwendung bei der Herstellung von therapeutischen und/oder immunogenen Peptiden der Erfindung können auch mittels mehrerer verschiedener Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise kann die DNA unter Verwendung von Hybridisierungsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, isoliert werden. Diese schließen, jedoch nicht ausschließlich, folgende Verfahren ein: 1) Hybridisierung von Sonden an genomische oder cDNA-Bibliotheken, um gemeinsame Nucleotidsequenzen nachzuweisen; 2) Antikörper-Screenen von Expressionsbibliotheken, um gemeinsame strukturelle Eigenschaften nachzuweisen; und 3) Synthese durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Entwicklung von spezifischen DNA-Sequenzen, die kodieren, oder von Fragmenten davon kann auch durch folgende Vorgehensweisen erreicht werden: 1) Isolation von doppelsträngigen DNA-Sequenzen aus der genomischen DNA; 2) chemische Herstellung einer DNA-Sequenz, um die notwendigen Codons für das Polypeptid von Interesse bereitzustellen; und 3) In-vitro-Synthese einer doppelsträngigen DNA-Sequenz durch Umkehrtranskription von mRNA, die aus einer eukaryotischen Donorzelle isoliert wurde. Im letztgenannten Fall wird schließlich ein doppelsträngiges DNA-Komplement von mRNA gebildet, das im Allgemeinen als cDNA bezeichnet wird.
  • Hybridisierungsverfahren sind zum Screenen von rekombinanten Klonen unter Verwendung von markierten gemischten synthetischen Oligonucleotidsonden nützlich, wobei jede Sonde möglicherweise das komplette Komplement einer spezifischen DNA-Sequenz in der Hybridisierungsprobe ist, was ein heterogenes Gemisch aus denaturierter doppelsträngiger DNA umfasst. Für solches Screenen erfolgt Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA oder an denaturierter doppelsträngiger DNA. Hybridisierung ist besonders nützlich zur Detektion von cDNA-Klonen, die aus Quellen stammen, in denen eine äußerst geringe Menge an mRNA-Sequenzen in Bezug auf das Polypeptid von Interesse vorhanden sind. In anderen Worten ist es durch Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen, die darauf abzielen, nicht-spezifische Bindung zu vermeiden, möglich, beispielsweise einen spezifischen cDNA-Klon durch die Hybridisierung der Target-DNA an diese einzelne Sonde im Gemisch autoradiographisch sichtbar zu machen.
  • Eine cDNA-Bibliothek, von der angenommen wird, dass sie ein Polynucleotid von Interesse enthält, kann durch Injektion verschiedener mRNA, die aus cDNAs stammen, in Oozyten, wodurch ausreichend Zeit vorhanden ist, um Expression der cDNA-Genprodukte eintreten zu lassen, und Testen auf die Gegenwart des erwünschten cDNA-Expressionsprodukts gescreent werden, beispielsweise unter Verwendung von Antikörper, der für ein Peptid, für das das Polynucleotid von Interesse kodiert, spezifisch ist, oder unter Verwendung von Sonden für die Wiederholungsmotive und einem Gewebeexpressionsmuster, das für ein Peptid, für das das Polynucleotid von Interesse kodiert, charakteristisch ist, zu ermöglichen. Alternativ dazu kann eine cDNA-Bibliothek indirekt auf Expression von therapeutischen und/oder immunogenen Peptiden mit zumindest einem Epitop unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für die Peptide sind, gescreent werden. Solche Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal abgeleitet werden und verwendet werden, um Expressionsprodukt zu detektieren, das ein Hinweis auf die Gegenwart von cDNA von Interesse ist.
  • Screening-Verfahren, die auf Nucleinsäurehybridisierung aufbauen, machen es möglich, jede beliebige Gensequenz aus jedem beliebigen Organismus zu isolieren, vorausgesetzt, die geeignete Sonde ist erhältlich. Oligonucleotidsonden, die einem Teil der Sequenz entsprechen, die für das betreffende Protein kodieren, können chemisch synthetisiert werden. Dies erfordert, dass kurze Oligopeptidabschnitte der Aminosäurennosäuresequenz bekannt sind. Die für das Protein kodierende DNA-Sequenz kann vom genetischen Code abgeleitet werden, wobei jedoch die Degeneration des Codes berücksichtigt werden muss. Es ist möglich, eine gemischte Additionsreaktion durchzuführen, wenn die Sequenz degeneriert ist. Dies bindet ein heterogenes Gemisch von denaturierter doppelsträngiger DNA ein. Für solches Screenen erfolgt Hybridisierung vorzugsweise entweder an einzelsträngiger DNA oder denaturierter doppelsträngiger DNA.
  • Die nackten Polynucleotide können an andere Polynucleotide, die operativ für Regulationsproteine kodieren, die die Expression dieser Polypeptide kontrollieren, konjugiert sein oder können in Verbindung mit diesen verwendet werden oder können Erkennungs-, Promotor- und Sekretionssequenzen enthalten. Fachleute werden ohne übermäßiges Experimentieren in der Lage sein, Regulationspolynucleotide auszuwählen und sie in die nackten Polynucleotide der Erfindung einzubinden (sofern sie darin nicht schon vorhanden sind). Beispielsweise werden geeignete Promotoren zur Verwendung in Maus- oder menschlichen Systemen und ihre Verwendung in Current Protocols in Molecular Biology, s.o., in Kapitel 1 beschrieben.
  • Eine besonders bevorzugte Form eines nackten Polynucleotids zur Verwendung in der Erfindung ist eines, das in einen Plasmidvektor inkorporiert wurde. Die Verwendung eines Plasmidvektors, insbesondere eines, der einen Replikator umfasst, verlängert die Expression des Gens in Zielgeweben. Bestimmte Plasmidvektoren sind auch gute Mediatoren von Immunantworten auf immunogene Peptide, da hohe Expressionsniveaus erreicht werden, wenn das für die Peptide kodierende Gen in den Vektor eingebunden wird.
  • Geeignete Plasmidvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die in Current Protocols in Molecular Biology, s.o., in Kapitel 1 beschriebenen Vektoren. Zwei besonders bevorzugte Plasmidvektoren sind die pRSV- (Rous-Sarkomavirus-) und pCMV- (Zytomegalievirus-) Promotorvektoren. Von diesen Promotoren wird CMV für Polynucleotide, die in Gewebe, die keine Muskeln sind, eingeführt werden sollen, bevorzugt. Diese Bevorzugung basiert auf Beobachtungen, dass höhere Expressionsniveaus in diesem Zusammenhang erreicht werden, wenn der CMV-Promotor verwendet wird.
  • Eine geeignete Arbeitsvorschrift zur Isolierung des RSV-Promotors und für seine Verwendung im Aufbau eines Plasmidvektors wird in Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777 (1982), beschrieben. Andere bevorzugte Plasmidvektoren sind pREP7 und pREV, die im Handel bei Invitrogen in San Diego, Kalifornien, erhältlich sind. Zum Klonieren von Polynucleotiden ist ein besonders geeignetes Plasmid zur Herstellung von mRNA der pSP64T-Kloniervektor, der von Kreig et al., Nucleic Acids Res. 12, 7057–7070 (1984), beschrieben wird. Jede beliebige cDNA, die ein Startcodon enthält, kann in dieses Plasmid und in mRNA, die aus den exprimierten DNA-Matrizen unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren hergestellt wird, eingeführt werden.
  • Verschiedene virale Vektoren, die in der Erfindung verwendet werden können (jedoch nicht bevorzugt oder erwünscht werden), umfassen Adenovirus, Herpesvirus, Vakzinia oder, vorzugsweise, ein RNA-Virus wie beispielsweise ein Retrovirus. Vorzugsweise ist der retrovirale Vektor ein Derivat eines Maus- oder Vogel-Retrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in denen ein einzelnes fremdes Gen insertiert werden kann, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: Moloney-Maus-Leukämie-Virus (MoMuLV), Harvey-Maus-Sarkoma-Virus (HaMuSV), Maus-Brusttumor-Virus (MuMTV) und Rous-Sarkoma-Virus (RSV). Zahlreiche zusätzliche retrovirale Vektoren können zahlreiche Gene inkorporieren. Alle diese Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Macker transferieren oder inkorporieren, sodass transduzierte Zellen identifiziert und gebildet werden können.
  • Zur Überwachung von Expression können diese Vektoren so modifiziert werden; dass sie bekannte Reportergene umfassen. Beispielsweise kann der pRSV-Iac-Z-DNA-Vektor, der in Norton et al., Mol. Cell. Biol. 5, 281 (1985), beschrieben wird, β-Galactosidase mit Proteinexpression produzieren. Luciferase und Chloramphenicolacetyltransferase ("CAT"; siehe z.B. Gorman et al., s.o., Konstruktion eines pRSV-CAT-Plasmids) können auch verwendet werden. Geeignete Plasmidvermehrung kann in E. coli erreicht werden (siehe z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, s.o.).
  • Zur Verwendung als eine Toleranz verleihende Vakzine kann ein Gemisch von Polynucleotiden oder eine getrennt zusammen verabreichte Gruppe an Polynucleotiden ein Gen, das operativ für ein immunosuppressives Cytokin (wie z.B. TGFβ) kodiert, und ein separates Gen, das operativ für ein relevantes Histokompatibilitätsprotein kodiert, umfassen. Dieser Ansatz könnte für die Verwendung zur Induktion von Toleranz gegenüber fremden Antigenen (einschließlich Alloantigenen) sowie Selbst-Antigenen angepasst werden.
  • B. Pharmazeutische Präparate von nackten Polynucleotiden
  • Zusammensetzungen von nackten Polynucleotiden und Polynucleotid-Gemische können in eine pharmazeutisch annehmbare Suspension, Lösung oder Emulsion gegeben werden. Geeignete Medien umfassen Salzlösung und können für jene Ausführungsformen, die nicht auf Antigen aufweisenden Zellen zur Zufuhr der Polynucleotide in Zielgewebe basieren, liposomale Präparate sein.
  • Insbesondere können pharmazeutisch annehmbare Träger sterile wässrige und nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen umfassen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl und injizierbare organische Ester wie z.B. Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepuffertes Medium. Parenterale Träger umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, laktierte Ringer-Lösung oder fixierte Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoff-Auffüller, Elektrolyt-Auffüller (wie jene, die auf Ringer-Dextrose aufbauen) und dergleichen. Konservierungsmittel und andere Additive können auch vorhanden sein, wie beispielsweise antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, Chelatbildner und Inertgase und dergleichen. Weiters kann eine Zusammensetzung von nackten Polynucleotiden unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannter Mittel zur darauf folgenden neuerlichen Wiederherstellung und Verwendung gemäß der Erfindung lyophilisiert werden.
  • Für jene Ausführungsformen der Erfindung, die nicht auf APC-Erkennung von nackten Polynucleotiden als Antigen aufbauen, kann zusätzlich zum zuvor erläuterten, gerichteten Vektor-Zufuhrsystem auch ein kolloidales Dispersionssystem für gerichtete Zufuhr verwendet werden. Fachleuten wird jedoch verständlich sein, dass die Vortei le der Verwendung des Verfahrens der Erfindung zur Verabreichung von nackten Nucleotiden und zur Verabreichung jener Nucleotide an Gewebe, die relativ hohe Konzentrationen von Antigen aufweisenden Zellen haben, so beschaffen sind, dass die Verwendung von kolloidalen Dispersionssystemen zur Zufuhr von Polynucleotiden nicht das bevorzugte Verfahren darstellt. Die nachstehende Erläuterung bezüglich solcher Systeme ist daher prinzipiell als ein Beispiel bereitgestellt, für den Fall, dass das bevorzugte Verfahren der Erfindung unter Berücksichtigung einer bestimmten Indikation als zur Verwendung nicht geeignet erkannt wird.
  • Kolloidale Dispersionssysteme umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Kügelchen und lipidbasierte Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System dieser Erfindung ist ein Liposom.
  • Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als Zufuhrvehikel in vitro und in vivo nützlich sind. Es wurde bereits gezeigt, dass große, einschichtige Vesikel (LUV), die eine Größe im Bereich von 0,2–4,0 μm aufweisen, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers, der große Makromoleküle enthält, einkapseln kann. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Inneren eingekapselt und den Zellen in einer biologisch aktiven Form zugeführt werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6, 77 (1981)). Zusätzlich zu Säugetierzellen wurden Liposomen für die Zufuhr von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein wirksames Gentransfervehikel ist, sollten die folgenden Eigenschaften gewährleistet sein: (1) Einkapselung der Gene, die für die Antisense-Polynucleotide kodieren, mit hoher Wirksamkeit, während ihre biologische Aktivität nicht beeinträchtigt wird; (2) präferenzielle und wesentliche Bindung an eine Targetzelle im Vergleich zu Nicht-Targetzellen; (3) Zufuhr der wässrigen Inhalte des Vesikels zum Zytoplasma der Targetzellen mit hoher Wirksamkeit; und (4) exakte und wirksame Expression von genetischer Information (Mannino et al., Biotechniques 6, 662 (1988)).
  • Die Zusammensetzung des Liposoms ist üblicherweise eine Kombination aus Phospholipiden, insbesondere aus Phospholipiden mit hoher Phasenübergangstemperatur, üblicherweise in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können auch verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen hängen von pH, Ionenstärke und der Gegenwart von zweiwertigen Kationen ab.
  • Beispiele für Lipide, die zur Liposomenproduktion nützlich sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, wie z.B. Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine, worin die Lipidgruppierung 14 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere 16 bis 18 Kohlenstoffatome, enthält und gesättigt ist. Veranschaulichende Phospholipide umfassen Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.
  • Das Targeting von Liposomen kann basierend auf anatomischen und mechanistischen Faktoren klassifiziert werden. Anatomische Klassifikation basiert auf dem Niveau der Selektivität, beispielsweise organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Mechanistisches Targeting kann auf Grundlage dessen differenziert werden, ob es passiv oder aktiv erfolgt. Passives Targeting arbeitet mit der natürlichen Neigung von Liposomen, sich an Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen, die sinusförmige Kapillaren aufweisen, zu verteilen. Aktives Targeting andererseits bindet die Änderung des Liposoms durch Binden des Liposoms an einen spezifischen Liganden wie beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, Zucker, Glykolipid oder Protein oder durch Ändern der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms ein, um Targeting auf Organe und Zelltypen zu erreichen, die nicht die natürlich vorkommenden Lokalisierungsstellen sind.
  • Die Oberfläche des gerichteten Zufuhrsystem kann auf zahlreiche verschiedene Weisen modifiziert werden. Im Fall eines liposomalen gerichteten Zufuhrsystems können Lipidgruppen in die Lipiddoppelschicht des Liposoms eingebunden werden, um den Targeting-Liganden in stabiler Verbindung mit der liposomalen Doppelschicht zu halten. Verschiedene Bindungsgruppen können zur Bindung der Lipidketten an den Targeting-Liganden verwendet werden.
  • Für jene Ausführungsformen der Erfindung, die auf APC-Expression aufbauen, schränken liposomale Präparate die Aufnahme der nackten Polynucleotide in vivo wesentlich ein und sollten nicht verwendet werden. Anstelle dessen ist isotonische gepufferte Lösung das bevorzugte Medium für maximale Aufnahme der nackten Polynucleotide in solchen Ausführungsformen. Weiters wird auch die Verwendung von Absorptionspromotoren, Detergenzien, chemischen Reizstoffen oder mechanischen Reizstoffen bevorzugt, um Transmission des nackten Polynucleotidzusammensetzung durch den Eintrittspunkt zu fördern. Als Literaturverweis hinsichtlich allgemeiner Prinzipien in Bezug auf Promotoren und Detergenzien, die bereits erfolgreich zur Zufuhr von organischen und peptidbasierten Wirkstoffen über die Schleimhaut verwendet wurden, siehe Chien, Novel Drug Delivery Systems, Kapitel 4, Marcel Dekker (1992). Spezifische Informationen in Bezug auf bekannte Mittel und Grundlagen für nasale Wirkstoffzufuhr werden in Chien, s.o., Kapitel 5, angeführt. Beispiele für geeignete Absorptionspromotoren bei nasaler Verabreichung werden in Kapitel 5, Tabelle 2 und 3, beschrieben; mildere Mittel werden bevorzugt. Weiters werden auch bekannte Mittel und Grundlagen für transdermale Wirkstoffzufuhr in Chien, s.o., Kapitel 7, diskutiert. Geeignete Mittel zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung für die Zufuhr über Schleimhaut/Nase werden auch in Chang et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on Controlled Drug Delivery", Kapitel 9 und Tabelle 3–4B davon, Marcel Dekker (1992), beschrieben. Geeignete Mittel, die bekannt sind, um Absorption von Wirkstoffen durch die Haut zu fördern, werden in Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Kapitel 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery", Marcel Dekker (1992), sowie an anderen Stellen im Text beschrieben.
  • Es wird erwartet, dass diese Verfahren (und andere, die üblicherweise verwendet werden, um Wirkstoffzufuhr zu erleichtern) von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren an die Herstellung von nackten Polynucleotiden zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung angepasst werden können. Obwohl die in den vorangehen den Absätzen erläuterten Ansätze, zumindest des Wissens der Erfinder nach, bisher nicht zur Polynucleotidzufuhr verwendet wurden, wird insbesondere angenommen, dass sie für diesen Zweck geeignet sind. Aus diesem Grund sind die zuvor genannten Verweise hierin durch diesen Verweis eingebunden, wenn auch sie für die Verfahren der Erfindung nicht wesentlich sind. Spezifische Beispiele, die diese Eignung veranschaulichen, sind nachstehend beschrieben.
  • C. Mittel und Wege für die Verabreichung von nackten Polynucleotiden
  • Für die dermale Verabreichung kann das Mittel zur Einführung epidermale Verabreichung, subkutane oder intradermale Injektion sein. Von diesen Mitteln wird epidermale Verabreichung für die größeren Konzentrationen an APCs, deren Anwesenheit im intradermalen Gewebe angenommen wird, bevorzugt.
  • Die am meisten bevorzugten Mittel zur Einführung auf dermalem Verabreichungsweg sind jene, die am wenigsten invasiv sind. Bevorzugt unter diesen Mitteln sind transdermale Übertragung und epidermale Verabreichung.
  • Zur transdermalen Übertragung ist Iontophorese ein geeignetes Verfahren. Übertragung mittels Iontophorese kann unter Verwendung von im Handel erhältlichen "Pflastern" durchgeführt werden, die ihr Produkt kontinuierlich über die heile Haut über eine Zeitspanne von mehreren Tagen oder mehr hinweg zuführen. Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht kontrollierte Übertragung von pharmazeutischen Zusammensetzungen in relativ hohen Konzentrationen, ermöglicht die Infusion von Kombinationswirkstoffen und ermöglicht gleichzeitige Verwendung eines Absorptionspromotors.
  • Ein Beispiel für ein Pflasterprodukt zur Verwendung in diesem Verfahren ist das Produkt LECTRO PATCHTM von General Medical Company, Los Angeles, CA. Dieses Produkt hält elektronisch Speicherelektroden auf einem neutralen pH und kann angepasst werden, um Dosierungen unterschiedlicher Konzentrationen bereitzustellen, um kontinuierlich und/oder periodisch Dosen abzugeben. Herstellung und Verwen dung des Pflasters sollten laut Anweisungen des Herstellers erfolgen, die dem Produkt LECTRO PATCH beigelegt sind.
  • Epidermale Verabreichung bindet im Wesentlichen mechanische oder chemische Reizung der äußersten Schicht der Epidermis ein, die ausreichend ist, um eine Immunantwort auf den Reizstoff hervorzurufen. Insbesondere sollte die Reizung ausreichend sein, um APCs zur Stelle der Reizung hin anzuziehen. Wie bereits zuvor erläutert, wird angenommen, dass die APCs dann das verabreichte nackte Polynucleotid aufnehmen und exprimieren.
  • Ein Beispiel für ein mechanisches Reizmittel setzt zahlreiche kurze Zinken mit sehr schmalem Durchmesser ein, die verwendet werden können, um die Haut zu reizen und APCs zur Stelle der Reizung hin anzuziehen, um die nackten Polynucleotide aus dem Ende der Zinken aufzunehmen. Zum Beispiel der MONO-VACC-Old-Tuberculin-Test, hergestellt von Pasteur Merieux aus Lyon, Frankreich, enthält eine Vorrichtung, die zur Einführung von nackten Polynucleotiden geeignet ist.
  • Die Vorrichtung (die in den Vereinigten Staaten bei Connaught Laboratories, Inc., von Swiftwater, PA, erhältlich. ist) besteht aus einem Kunststoffbehälter mit einem Spritzenkolben an einem Ende und einer Zinkenscheibe am anderen. Die Zinkenscheibe trägt zahlreiche Zinken mit schmalem Durchmesser mit einer Länge, die die äußerste Schicht an epidermalen Zellen gerade ankratzen. Jede der Zinken im MONO-VACC-Set ist mit Kochschem Tuberculin beschichtet; in der vorliegenden Erfindung ist jede Nadel mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung von nacktem Polynucleotid oder einem Gemisch davon beschichtet. Die Verwendung der Vorrichtung erfolgt gemäß den schriftlichen Anweisungen des Herstellers, die mit dem Vorrichtungsprodukt mitgeliefert werden; diese Anweisungen hinsichtlich der Verwendung und Verabreichung sind durch diesen Verweis hierin eingebunden, um die herkömmliche Verwendung der Vorrichtung zu veranschaulichen. Ähnliche Vorrichtungen, die auch in dieser Ausführungsform verwendet werden können, sind jene, die zur Zeit verwendet werden, um Allergietests durchzuführen.
  • Ein anderer geeigneter Ansatz zur epidermalen Verabreichung von nackten Polynucleotiden arbeitet mit der Verwendung eines chemischen Stoffes, der die äußersten Zellen der Epidermis reizt und dadurch eine ausreichende Immunantwort hervorruft, um APC in diesen Bereich zu locken. Ein Beispiel ist ein keratinolytisches Mittel wie beispielsweise die Salicylsäure, die in im Handel erhältlicher topischer Enthaarungscreme, vertrieben von Noxema Corporation unter dem Handelsnamen NAIR, verwendet wird. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um epitheliale Verabreichung in die Schleimhaut zu erreichen. Der chemische Reizstoff kann auch in Verbindung mit dem mechanischen Reizstoff angewandt werden (was zum Beispiel eintreten würde, wenn die Zinken vom MONO-VACC-Typ auch mit dem chemischen Reizstoff beschichtet wären). Das nackte Polynucleotid kann in einem Träger suspendiert werden, der auch den chemischen Reizstoff enthält, oder kann damit zusammen verabreicht werden.
  • Zur Verabreichung über die Schleimhaut variiert das Mittel zur Einführung je nach Anordnung des Eintrittspunktes. Insbesondere zur Immunisierung gegen und zur Behandlung von Atemwegsinfektionen werden intranasale Verabreichungsmittel am meisten bevorzugt. Diese Mittel umfassen Einatmen von Aerosolsuspensionen oder Hineinblasen des nackten Polynucleotids oder von Gemischen davon. Zäpfchen und topische Präparate sind zur Einführung in bestimmte Schleimhautbereiche, wie beispielsweise an genitalen und Okularen Stellen, auch geeignet. Auch von besonderem Interesse hinsichtlich der Zufuhr von nackten Polynucleotiden über die Vagina sind Vaginalringe vom Sandwich-Typ und Pessarien. Beispiele für diese Vorrichtungen und ihre Verwendung werden in Chien, s.o., in Kapitel 9 beschrieben.
  • Die Dosierung von jedem nackten Polynucleotid oder Gemisch davon, die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung zugeführt wird, hängt von der erwünschten Reaktion durch den Wirt und vom verwendeten Polynucleotid ab. Im Allgemeinen wird angenommen, dass bis zu 100–200 μg DNA in einer einzelnen Dosis verabreicht werden können, obwohl auch nur etwa 0,3 μg von durch die Haut oder Schleimhaut verabreichter DNA langanhaltende Immunantworten induzieren können.
  • Für die Zwecke der Erfindung ist es jedoch ausreichend, dass die nackten Polynucleotide in einer ausreichend Dosierung zugeführt werden, um Expression des biologisch aktiven Peptids zu verursachen, für das das Polynucleotid kodiert. Dosierungen, die für bestimmte Indikationen geeignet sind, werden anhand der nachstehenden Erläuterungen und Beispiele veranschaulicht.
  • Diese Dosierungen können modifiziert werden, um therapeutische, subtherapeutische oder immunogene Expressionsniveaus zu erreichen. Mittel zur Bestätigung der Gegenwart und Menge an exprimierten Peptiden sind Fachleuten bekannt und werden daher nicht im Detail beschrieben. Bestimmte solche Mittel werden in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht; im Allgemeinen umfassen sie Immuntests (wie z.B. ELISA), PCR-Verfahren und immunhistologische Analysen, die gemäß den Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt sind. Dosierungen der verabreichten Polynucleotide können eingestellt werden, um das erwünschte Expressionsniveau basierend auf Informationen, die durch diese Detektions- und Quantifizierungsmittel sowie durch klinische Zeichen in vivo, die Fachärzten im klinischen Bereich bekannt sind, bereitgestellt werden, zu erreichen.
  • II. VERABREICHUNG VON MISCHUNGEN NACKTER POLYNUCLEOTIDE
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verabreichung einer Peptidmischung (d.h. Gemisch von Polynucleotiden) mittels der Expression von Genkonstrukten, die beispielsweise bis zu 200 Polynucleotidsequenzen unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors enthalten.
  • Die Verabreichung von Polynucleotidgemischen kann auch dazu dienen, Peptide mit mehr als einer biologischen Aktivität bereitzustellen. Beispielsweise kann ein nacktes Polynucleotid, das operativ für ein immunogenes Peptid kodiert, an ein nacktes Polynucleotid, das operativ für einen Antikörper kodiert, auf solche Weise gebunden werden oder mit diesem zusammen verabreicht werden, dass sowohl Peptid als auch Antikörper exprimiert werden. Um dies zu veranschaulichen, kann die Verabreichung von Genen, die zusammen IL-2 und Anti-gp71 exprimieren (basierend auf Resulta ten, die mit dem IL-2-Protein erhalten wurden), zur Lokalisierung des Antikörpers im Tumorgewebe führen, das sich als Reaktion auf Maus-Leukämie-Virus (MuLV) in Mäusen entwickelt hat (siehe die Resultate, die mittels gleichzeitiger Verabreichung von IL-2/Anti-gp71-mAbs erreicht wurden; Schultz et al., Cancer Res. 50, 5421–5425 (1990)).
  • III. VERWENDUNG DES VERFAHRENS DER ERFINDUNG ZUR BEHANDLUNG VON ALLERGIEN
  • Die Erfindung betrifft die Verabreichung von nackten Polynucleotiden, die operativ für proteinhältige Allergene oder Peptidfragmente davon kodieren, um Immunität gegenüber dem Allergen ohne Induktion von IgE-Antikörperproduktion zu induzieren. Insbesondere zielt das Verfahren darauf ab, die Produktion von TH1-(Helfer-T-Zell-) Lymphozyten gegenüber allergener Stimulation von TH2-Lymphozyten-vermittelter Produktion von IgE-Antikörper bevorzugt selektiv zu boosten.
  • In Mäusen sind IgG-2A-Antikörper serologische Marker für eine TH1-Typ-Immunantwort, während IgG-1-Antikörper ein Hinweis auf TH2-Typ-Immunantwort sind. TH2-Reaktionen umfassen die mit Allergie assoziierte IgE-Antikörper-Klasse; lösliche Protein-Antigene neigen dazu, relativ starke TH2-Reaktionen zu stimulieren. Im Gegensatz dazu werden TH1-Reaktionen durch Antigenbindung an Makrophagen und dendritische Zellen induziert. Wie die in den Beispielen 12 und 13 dargestellten Daten zeigen, produzierten Mäuse, denen intradermal für Antigen kodierende Polynucleotide injiziert wurden, vorzugsweise IgG2A-Antikörper, die ein Hinweis auf TH1-Reaktionen sind, die wiederum ein Hinweis darauf sind, dass das Antigen intrazellulär in APCs exprimiert wird und dann von diesen APCs aufgewiesen werden. Im Gegensatz dazu produzierten Mäuse, denen Antigen intradermal injiziert wurde, vorzugsweise IgG1-Antikörper, was ein Hinweis auf eine vorherrschende TH2-Zellantwort ist.
  • Diese Ausführungsform der Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung, dass im Gegensatz zu Allergie-Immuntherapie mit funktionsfähigen Allergenen die Verab reichung von nackten Polynucleotiden, die für die Allergene (oder Fragmente davon) kodieren, nicht nur IgE-Antikörperproduktion unterdrückt, sondern dies auch gleich von Anfang der Therapie an tut, wodurch das Risiko von Anaphylaxie, das in herkömmlichen Allergen-Immuntherapie vorhanden ist, vermieden wird. Insbesondere stimuliert die Verabreichung von für Allergen kodierenden nackten Polynucleotiden (insbesondere auf dermalem und epidermalem Weg) selektiv die Produktion von CD4+-TH1- und CD8+-Lymphozyten gegenüber CD4+-TH2-Lymphozten sowie stimuliert INFγ-Sekretion (die IgE-Antikörperaktivität unterdrückt).
  • Im Laufe der letzten Jahre wurde gezeigt, dass CD4+-Zellen im Allgemeinen in eine der zwei unterschiedlichen Untergruppen, den TH1- und TH2-Zellen, fallen. TH1-Zellen sekretieren prinzipiell IL-2, IFNγ und TNFβ (wobei die letzten zwei Makrophagen-Aktivierung und verzögerte Hypersensibilität vermitteln), während TH2-Zellen prinzipiell IL-4 (das Produktion von IgE-Antikörpern stimuliert), IL-5, IL-6 und IL-10 sekretieren. Diese CD4+-Untergruppen üben einen negativen Einfluss aufeinander aus, d.h. Sekretion von TH1-Lymphokinen hemmt Sekretion von TH2-Lymphokinen und umgekehrt. Darüber hinaus wird angenommen, dass Aussetzung von TH2-Zellen gegenüber zytotoxischen T-Lymphozyten ("CTLs") auch TH2-Zellaktivität unterdrückt.
  • Wie die Untergruppen von Helfer-T-Zellen unterschiedlich reguliert sind, ist nicht vollständig klar. Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie TH1-Aktivierung begünstigen, ähneln jenen, die durch virale Infektion induziert werden, und umfassen intrazelluläre Pathogene, Aussetzung gegenüber IFNγ und IL-2, die Gegenwart von APCs und Aussetzung gegenüber geringen Dosen an Antigen. Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie TH2-Aktivierung begünstigen, umfassen Aussetzung gegenüber IL-4 und IL-10, APC-Aktivität auf der Seite der B-Lymphozyten und hohe Dosen an Antigen. Aktive TH1-(IFNγ-) Zellen steigern zelluläre Immunität und sind daher von besonderem Wert bezüglich ihrer Reaktion auf intrazelluläre Infektionen, während aktive TH2-Zellen Antikörperproduktion steigern und daher wertvoll in der Reaktion auf extrazelluläre Infektionen sind. Im Zusammenhang mit Allergien indu ziert TH2-Zellaktivität auch IgE-Produktion durch die Freisetzung von IL-4, wodurch die Bildung von IgE-Allergen-Komplexen und Stimulation von allergischen Reaktionen gefördert wird.
  • Wie die Daten in den Beispielen XI und XII zeigen, induziert intradermale Provokation mit einem Proteinallergen (β-Galactosidase) selektiv TH2-Reaktionen in Mäusen, die in Übereinstimmung mit der Theorie bezüglich Allergen-Immuntherapie schrittweise durch eine TH1-Reaktion in gegenüber Allergen desensibilisierten Mäusen ersetzt werden. Wie in Beispiel XIII gezeigt wird, waren jedoch IgE-Antikörper-Mengen, die in Protein-injizierten Mäusen produziert wurden, wesentlich höher während der Anfangsphase der Behandlung als in allen anderen Behandlungsstadien von Mäusen, denen ein Polynucleotid injiziert wurde, das operativ für dasselbe Allergen kodierte.
  • Weiters überstiegen bei Mäusen, die mit einer intradermalen Dosis eines für Allergen kodierenden Plasmids (pCMV-Lac Z; siehe die Beispiele XI und XII) provoziert wurden, die TH1-Zellreaktionen jene von TH2-Zellen bei weitem. Noch überraschender war, dass IgE- und IL-4-Konzentrationen in den mit pCMV-Lac-Z provozierten Mäusen sehr niedrig waren (Beispiele XIII und XIV), während Allergen-spezifische CTL-Konzentrationen (Beispiel XV) und TH1-Zellsekretion von INFγ (Beispiel XIV) im Vergleich zu Mäusen, die mit Protein provoziert wurden, und zu Kontrollmäusen erhöht waren. Darüber hinaus wurde der Schutz gegen IgE-Produktion, der den mit pCMV-Lac-Z provozierten Mäusen geboten wurde, trotz darauf folgender Provokation mit dem Plasmid oder Protein aufrechterhalten, und dies sogar in Kombination mit Adjuvans (Beispiel XIII). Somit unterbindet im Gegensatz zu herkömmlicher Allergen-Immuntherapie die Immuntherapie der Erfindung mit für Allergen kodierenden Genen sowohl Allergen-spezifische als auch nicht-spezifische IgE-Produktion und schützt den Wirt vor weiterer Produktion von IgE sogar bei nachfolgender Allergenprovokation.
  • Die Erklärung, warum das Einführen eines Allergens über Expression als ein Genprodukt Desensibilisierung gegenüber dem Allergen ohne Induktion desselben Ausmaßes an Antikörperreaktion, die bei Einführung des Allergens selbst induziert wird, induziert, ist nicht eindeutig klar. Ohne die Erfindung auf einen bestimmten Wirkungsmechanismus einzuschränken, ist es jedoch wahrscheinlich, dass das Einführen von geringen Dosen an für Allergen kodierendem Polynucleotid in APCs unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung dazu führt, dass das Allergen exprimiert und intrazellulär zurückgehalten wird, wodurch die extrazelluläre Verfügbarkeit des Allergens zur Stimulation von IgE-Antikörperproduktion und Bildung von Allergen/IgE-Antikörperkomplexen eingeschränkt wird. Umgekehrt scheint es, dass das Einführen von relativ "hohen" Dosen von für Allergen kodierenden Polynucleotiden (z.B: wesentlich mehr als etwa 50 μg bei Mäusen) Produktion von IgE-Antikörper auf Niveaus stimulieren kann, die eher vergleichbar sind mit jenen, die in Mäusen produziert werden, denen subkutan ein Allergen injiziert wurde, möglicherweise aufgrund von extrazellulärer Freisetzung von überschüssigem Antigen.
  • Somit ist die bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Behandlung von Allergien der Erfindung eine, in der das für Allergen kodierende Polynucleotid in "geringen" Dosen (z.B. vorzugsweise weniger als etwa 50 μg bei Mäusen) verabreicht wird. Durchschnittliche Fachleute werden natürlich in der Lage sein, eine äquivalente Dosierungskonzentration zur Verwendung in Menschen zu bestimmen. Durchschnittliche Fachleute wird der Dosierungsablauf, der in Allergen-Immuntherapie verwendet wird (d.h. Priming-, Booster- und Erhaltungsdosis), bekannt sein, wobei dieser Ablauf zum Einsatz im Verfahren der Erfindung geeignet ist. Im Allgemeinen kann erwartet werden, dass Dosen von weniger als etwa 50 μg, und von sogar weniger als etwa 10 μg, als Priming-, Booster- und Erhaltungsdosen bei Menschen geeignet sind. Alternativ dazu können der Primingdosis von für Allergen kodierendem Polynucleotid Booster- und/oder Erhaltungsdosen von Allergen folgen. Wie in den Beispielen VII, X, XIII und XV gezeigt wird, wird die Toleranz gegenüber Allergen, wenn sie erst einmal durch Einführung eines für Allergen kodierendes Polynucleotids induziert wurde, trotz darauf folgender Provokation mit Allergen aufrechterhalten.
  • Auf dem Gebiet der Erfindung ist allgemein bekannt, dass Toleranz durch Allergen-Immuntherapie nur dann auf einem therapeutisch annehmbaren Niveau erreicht wurde (wobei z.B. die Allergiesymptome des Patienten merklich reduziert sind), wenn das Allergen intradermal (typischerweise durch subkutane Injektion) eingeführt wurde. Bemühungen, Toleranz gegenüber einem Allergen unter Verwendung von oraler oder sublingualer Verabreichung, von Inhalation und lokaler Verabreichung über die Nase zu induzieren, waren zur Unterdrückung von IgE-Antikörperreaktion auf Allergen-Provokation nicht sehr erfolgreich. So wurden Mittel zur intradermalen Einführung von Allergenen zur Verwendung in Allergen-Immuntherapie entwickelt, mit deren Verwendung Ärzte, die auf dem Gebiet der Behandlung von Allergien Erfahrung haben, vertraut sind, wie z.B. die MONOVACC®-Zinkenvorrichtung, die an anderer Stelle oben beschrieben wird.
  • Wie auch an anderer Stelle hierin beschrieben wird, können die nackten Polynucleotide der Erfindung durch mechanische Reizung der Epidermis und Dermis unter Verwendung von Vorrichtung wie der MONOVACC®-Zinkenvorrichtung wirksam verabreicht werden. Da Verabreichung von nackten Polynucleotiden auf dermalem und epidermalem Weg ihre Einführung in APCs steigert und da angenommen wird, dass intradermale Verabreichung von Allergenen die wirksamste Weise zur Verwendung in Allergen-Immuntherapie ist, ist die am meisten bevorzugte Art der Verabreichung von für Allergen kodierenden Polynucleotiden zur Behandlung von Allergien die Penetration oder die mechanische Reizung der Dermis und Epidermis.
  • Ein besonders wirksames Verfahren zur Einführung von für Allergen kodierenden Polynucleotiden zur Behandlung von Allergie ist mechanische oder chemische Reizung der Dermis und Epidermis. Ein besonders geeignetes Mittel zur Verabreichung solcher Polynucleotide ist die Verwendung einer Mehrfachzinkenvorrichtung, deren Zinken mit mehr als einem für Allergen kodierenden Polynucleotid beschichtet wurden. Ein Beispiel für eine Zinkenvorrichtung, die für diese Verwendung geeignet ist, ist der Mehrfachhauttestapplikator MULTITEST®, hergestellt von Lincoln Diagnostics of Decatur, IL. Zur Verwendung in herkömmlicher Allergen-Immuntherapie wird die Zin kenvorrichtung typischerweise auf eine Fläche mit mehreren Kammern platziert, deren Kammern jeweils Allergenextrakte enthalten, sodass die Spitzen von jeder Zinke in Extrakt getaucht werden. Nach dem Eintauchen wird die Vorrichtung auf die Haut des Patienten gegeben, vorzugsweise an einer Stelle, an der ausreichend Gewebe vorhanden ist, um gleichzeitiges subkutanes Eindringen von allen Zinken zu gewährleisten. Die Reaktion des Patienten auf jedes Allergen wird visuell basierend auf der Bildung und relativen Größe von Quaddeln an der Haut an der Eintrittsstelle jeder Zinke bewertet. Am meisten bevorzugt wird das Erscheinungsbild von jeder Injektionsstelle mit positiven und negativen Kontrollinjektionen verglichen (beispielsweise mit Histamin oder Glycerin).
  • Derselbe Ansatz kann im immunotherapeutischen Ansatz der Erfindung mit für Allergen kodierendem Polynucleotid verwendet werden. Wie in den Beispielen V, XII und XIII gezeigt wird, können die Zinken einer Zinkenvorrichtung wie beispielsweise der MULTITEST®-Vorrichtung mit für Allergen kodierenden Polynucleotiden durch Eintauchen der Spitzen der Zinken in eine wässrige Lösung der Polynucleotide beschichtet werden. Aus praktischen Gründen kann die Zinkenvorrichtung dann tiefgefroren werden, sodass die Polynucleotide an den Zinken getrocknet und ohne Vorbereitung der Vorrichtung für die Verwendung zum Zeitpunkt der Behandlung verabreicht werden.
  • Die Polynucleotide können für mehr als ein Allergen, für verschiedene Peptide eines Allergens oder für eine Kombination dieser zwei kodieren. Die Polynucleotide können für intaktes Allergen, T-Zell-Epitop(e) eines Allergens kodieren und/oder durch Mittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bearbeitet sein, um nicht sekretierend zu sein. Zahlreiche für Allergen kodierende Polynucleotide sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt; andere können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie beispielsweise jenen, die an anderer Stelle zuvor beschrieben wurden (siehe Abschnitt I(A)), identifiziert werden. Beispiele für bekannte für Allergen kodierende Polynucleotide umfassen cDNAs, die für reaktive IgE-Haupt-Hausstaubmilben-Allergene Der pI und Der pII kodieren (siehe Chua et al., J. Exp. Med. 167, 175–182 (1988); und Chua et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91, 124–129 (1990)), T-Zell- Epitoppeptide des Der-pII-Allergens (siehe Joost van Neerven et al., J. Immunol. 151, 2326–2335 (1993)), das sehr häufig vorkommende Antigen-E-(Amb-al-) Ambrosiapollenallergen (siehe Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266, 1229–1236 (1991)), Phospholipase-A2-(Bienengift-) Allergen und T-Zellepitopen darin (siehe Dhillon et al., J. Allergy Clin. Immunol. 90, 42–51 (1992)), Weißbirkenpollen (Betvl) (siehe Breiteneder et al., EMBO 8, 1935–1938 (1989)) und das Haupt-Hauskatzenallergen Fel dl (siehe Rogers et al., Mol. Immunol. 30, 559–568 (1993)). Die veröffentlichen Sequenzen und Verfahren zu ihrer Isolierung und Synthese, die in diesen Artikeln beschrieben werden, veranschaulichen das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf für Allergen kodierende Polynucleotide.
  • Um extrazelluläre Stimulation von IgE-Antikörperbildung gegen exprimiertes Allergen zu minimieren, wenn nicht sogar zu vermeiden, werden die für Allergen kodierenden Polynucleotide, die gemäß der Erfindung verabreicht werden, vorzugsweise als Teil eines nicht-sekretierenden rekombinanten Expressionsvektors verabreicht. Ein anderer, besonders nützlicher Vektor zur Verabreichung von beliebigen nackten Polynucleotiden gemäß der Erfindung ist jener, der einen Promotor enthält, der "an-" oder "ab-"geschaltet werden kann, nachdem der Vektor dem Patienten verabreicht worden ist.
  • Besonders wirksame Beispiele für solche Promotoren sind die Liganden-induzierbaren Nuklearrezeptorpromotoren. Nuklearrezeptoren stellen eine Familie von Transkriptionsenhancerfaktoren dar, die durch Bindung an spezifische DNA-Sequenzen, die in als Reaktionselemente bekannte Target-Promotoren zu finden sind, wirken. Spezifische Mitglieder der Nuklearrezeptorfamilie umfassen die primären intrazellulären Targets von kleinen, lipidlöslichen Liganden, wie beispielsweise Vitamin D3 und Retinoide, sowie Steroid- und Schilddrüsenhormone ("aktivierende Liganden").
  • Nuklearrezeptoren, die durch spezifische Aktivierungsliganden aktiviert werden, sind zur Verwendung als Promotoren in eukaryotischen Expressionsvektoren gut geeignet, da Expression von Genen einfach durch Kontrollieren der Konzentration von Li ganden, der für den Rezeptor zugänglich ist, reguliert werden kann. Glucocorticoidinduzierbare Promotoren wie z.B. jene der langen terminalen Wiederholung des Maus-Brusttumor-Virus (MMTV) wurden beispielsweise in dieser Hinsicht umfassend verwendet, da die Glucocorticoid-Reaktionselemente in zahlreichen verschiedenen Zelltypen exprimiert werden. Ein Expressionssystem, das mit Glucocorticoid-Reaktionselementen arbeitete, die auf zahlreiche verschiedene Steroisdhormone reagieren (z.B. Dexamethason und Progesteron), ist ein pGREtk-Plasmid (das ein oder mehrere Rattentyrosin-Aminotransferase-Glucocoiticoid-Reaktionselemente stromauf des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase- (tk) Promotors in pBLCAT8+ enthält), transfiziert in HeLa-Zellen (siehe Mader & White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5603–5607 (1993) [pGRE2tk]; und Klein-Hitpass et al., Cell 46, 1053–1061 (1986) [pBLCAT8+]; deren Offenbarungen das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich der Konstruktion von geeigneten Promotoren, abgeleitet von Nuklearrezeptor-Reaktionselementen ["NRRE-Promotoren"], veranschaulichen). Der pGREtk-Promotor (siehe die Karte in 21) ist besonders wirksam zur Stimulierung kontrollierter Überexpression von klonierten Genen in eukaryotischen Zellen (Mader & White, s.o. auf S. 5607).
  • Ein anderer, besonders geeigneter NRRE-Promotor zur Verwendung in der Erfindung ist einer, der durch die Vitamin-D3-Verbindung 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und nicht-hyperkalzämische Analoga davon (zusammengefasst unter der Bezeichnung "Vitamin-D3-aktivierende Liganden") induzierbar ist. NRRE-Promotoren, die durch Vitamin-D3-aktivierende Liganden induzierbar sind, enthalten das Vitamin-D3-Rezeptor-(VDR-) Reaktionselement PurG(G/T)TCA, das direkte Wiederholungen, die durch 3 Basenpaare getrennt sind, erkennt. Vitamin-D3-Reaktionselemente sind stromauf von menschlichen Osteocalcin- und Maus-Osteopontin-Genen zu finden; Transkription von diesen Genen wird bei Bindung des VDR aktiviert (siehe z.B. Morrison & Eisman, J. Bone Miner. Res. 6, 893–899 (1991), und Ferrara et al., J. Biol. Chem. 269, 2971-2981 (1994), deren Offenbarungen das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung bezüglich auf auf Vitamin-D3 reaktive, induzierbare Promotoren veranschaulichen). Jüngste Versuchsergebnisse aus dem Testen eines rekombinanten Expressionsvektors, der den Maus-Osteapontin-VDR stromauf eines trunkierten Herpes-Simplex-Virus- Thymidinkinase-(tk-) Promotors enthält, ließen darauf schließen, dass 9-cis-Retinsäure die Reaktion von VDR auf 1,25-Hydroxyvitamin-D3 steigern kann (siehe Carlberg et al., Nature 361, 657–660 (1993)).
  • Ferrara et al. beschrieben auch Vitamin-D3-induzierbare Promotoren in rekombinanten Expressionsvektoren, die unter Verwendung von Mehrfachkopien eines starken VDR, insbesondere des Maus-Osteopontin-VDR (zusammengesetzt aus einer direkten Wiederholung von PurGTTCA-Motiven, getrennt durch 3 Basenpaare), konstruiert wurden. Dieser VDR stimmt mit den PurGG/TTCA-Consensusmotiven überein, für die bereits gezeigt wurde, dass sie nicht nur auf Vitamin D3 reagieren, sondern auch auf Schilddrüsenhormon und/oder Retinsäure. Drei Kopien des Maus-VDR wurden in pBLCAT8+, unmittelbar stromauf des Herpes-Simplex-Virus-tk-Promotors, insertiert (siehe z.B. 22 [Karte von pVDREtk]). Transfektion des resultierenden VDREtk-Vektors in COS-Zellen (was zur Produktion eines "VDR-Expressionssystems" führte) erwies sich darin als besonders nützlich, dass COS-Zellen den nuklearen Retinoid-X-Rezeptor (RXR) enthalten, für den gezeigt wurde, dass er als ein Hilfsfaktor zur Bindung von VDR an sein Reaktionselement wirkt.
  • Das VDR-Expressionssystem (und funktionell äquivalente Expressionssysteme unter der Kontrolle von beispielsweise menschlichem Osteocalcin-Genpromotor) ist einmalig für die Verwendung in der Erfindung geeignet. Insbesondere Expression eines nackten Polynucleotids, das einem Säugetier gemäß der Erfindung auf epidermalem oder dermalem Weg (insbesondere ersterem) in einem Vitamin-D3-reaktiven Expressionssystem verabreicht wird, kann durch topische Verabreichung eines 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-Präparats am Eintrittspunkt angeschaltet werden (und durch Entziehen des Vitamin-D3-Präparats abgeschaltet und/oder durch Anlegen oder Entziehen einer Quelle von Retinsäure an den oder vom Einrittspunkt moduliert werden). Günstigerweise wurden 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und nicht-hyperkalzämische Analoga davon für die Verwendung in topischen Präparaten durch die amerikanische FDA-Behörde zur Behandlung von Psoriasis zugelassen und sind im Handel erhältlich.
  • In-vivo-Tests der NRRE-Promotoren in menschlicher Haut weisen darauf hin, dass sie bei systemischer Aussetzung gegenüber ihren entsprechenden Reaktionselementen induzierbar sind (siehe Tsou et al., Exp. Cell Res. 214, 27–34 (1994) [Retinsäureaktivierung von Retinsäure-Reaktionselementen, gebunden an ein Lac-Z-Reportermolekül, in der Epidermis von transgenen Mäusen]). In Anbetracht der erwarteten Retention von Polynucleotiden, die dermal oder epidermal am Eintrittspunkt verabreicht werden (wodurch sie für Aussetzung gegenüber topisch absorbierten Reaktionselementen zugänglich gemacht werden; siehe z.B. die Erläuterung auf den Seiten 15–16 des englischen Originals und die Daten aus Beispiel IV}, kann berechtigt vorhergesagt werden, dass die Verwendung von NRRE-Promotoren zur Expression solcher Polynucleotide auch ihre In-vivo-Kontrolle durch topische Verabreichung von geeigneten NRRE-Promotor-aktivierenden Liganden ermöglichen (z.B. 1,25-Dihydroxyvitamin-D3-Transkriptionsaktivatoren mit einem VDR-Expressionsvektor zur Expression des Polynucleotids von Interesse).
  • Somit ermöglicht die Verwendung eines NRRE-Promotor-Rekombinationsexpressionsvektors zur Verabreichung und Expression von nackten Polynucleotiden gemäß der Erfindung die Kontrolle von Expression, beispielsweise um Expression zu aktivieren, wenn die Zufuhr einer Dosis erforderlich ist, oder im Fall einer negativen Reaktion auf das exprimierte Protein oder Peptid Expression zu deaktivieren.
  • Beispiele, die Aspekte jeder Ausführungsform der Erfindung veranschaulichen, werden nachstehend bereitgestellt. Sie sollten als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung der Erfindung betrachtet werden.
  • BEISPIEL I
  • LOKALISIERTE VERZÖGERTE HYPERSENSIBILITÄTSREAKTIONEN BEI MÄUSEN TRETEN NACH INTRAMUSKULÄREN INJEKTIONEN VON NACKTEM POLYNUCLEOTID AUF
  • Obwohl (in Übereinstimmung mit bereits zuvor veröffentlichten Resultaten) intramuskuläre Injektion von nackter Plasmid-cDNA zu Expression von Peptiden, für die Poly nucleotide kodieren, führt, ruft sie auch (im Gegensatz zu bereits zuvor veröffentlichten Resultaten) eine Immunantwort auf das Gen im Muskelgewebe hervor. Bei gleichzeitiger Injektion von 2 Plasmiden wird diese Entzündungsreaktion chronisch, wobei Myonekrose auftritt. Beide Reaktionen stimmen mit einer Diagnose einer lokalisierten verzögerten Hypersensibilitätsreaktion auf das Gen an der Eintrittsstelle, d.h. im Muskelgewebe, überein. Im Gegensatz zu älteren Annahmen ist es diese Entzündungsreaktion und nicht die Aufnahme durch Muskelzellen, die wahrscheinlich (wenn nicht sogar alleine) für Expression von nackten Polynucleotiden nach intramuskulären Injektionen davon verantwortlich ist.
  • Um die Immunantwort, die durch intramuskuläre Injektion von nackter cDNA verursacht wird, zu veranschaulichen, wurden pREVk3 und pRSVIL2 wie folgt hergestellt.
  • Herstellung von Plasmiden. Ein neu angeordnetes κ-Leichtgen von einem menschlichen Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie wurde isoliert, das ein Humkv 325 enthält (das für den kreuzreaktiven 17.109-Idiotyp kodiert, der durch IgM-Autoantikörper und chronische lymphozytische Leukämiezellen exprimiert wird). Dieses Gen ist auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und wird beispielsweise in Martin et al., J. Exp. Med. 175, 983 (1992), beschrieben.
  • Ein 1040-bp-Hindlll-Xhol-Fragment, das die V-J-Region dieses Gens enthält, wurde ausgeschnitten und in die Polyklonierungsstelle des Säugetier-Expressionsvektors pREP7 (Invitrogen, San Diego, CA) stromab der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous-Sarkoma-Virus (RSV) insertiert, um einen Vektor herzustellen, der als pREVk3 bezeichnet wird. Stromab des neu angeordneten JK1-Segments gibt es ein natürliches Stoppcodon, das Translation beendet.
  • Um einen IL-2-Expressionsvektor zu produzieren, der als pRSVIL-2 bezeichnet wird, wurde die Luciferase-cDNA im Vektor pRSVL (Wolff et al., Science 247, 1465 (1990)) mit einem 680-bp-Hindlll-BamHl-Fragment von pBC12/HIV/IL-2 (Amercian Type Culture Collection Nr. 67618) gemäß dem in Cullen, Cell. 46, 937 (1986), beschriebenen Verfahren ersetzt. In den Verweisen von Wolff et al. und Cullen wird das Wissen auf dem Gebiet der Erfindung in Bezug auf die Konstruktion dieser Expressionsvektoren veranschaulicht.
  • Intramuskuläre Injektion von Plasmid-cDNA in Mäuse. Acht Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden mit Methoxyfluran anästhesiert. Plasmid-cDNA (100 μg pro Injektion) wurde in 100 μl Salzlösung suspendiert, und dann wurde sie in Wochenabständen viermal in die Quadrizepsmuskeln mittels einer 28-Gauge-Nadel injiziert. Eine Gruppe von sechs Mäusen erhielt 100 μg von pREVk3. Eine andere Gruppe von sechs Mäusen erhielt 100 μg jeweils von pREVk3 und pRSVIL-2, während eine dritte Gruppe 100 μg Salzlösung alleine erhielt. Kurz vor jeder Injektion wurden Blutproben aus den Orbitalarterien entnommen.
  • ELISA zur Überprüfung von In-vivo-Genexpression durch die Plasmide. Antikörper gegen Humkv325-Produkte wurden durch ELISA (enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung) gemessen. Der IgM-Rheumatismusfaktor Glo wird durch das Humkv325-Gen kodiert und weist positive 17.109-Idiotyp-κ-Leichtketten auf. Das gereinigte Protein wurde bei 10 μg/ml in 0,1 M Borat, 0,2 M NaCl, pH 8,2 (d.h. gepufferte Boratsalzlösung oder BBS) aufgelöst, und dann wurden 100-μl-Aliquoten zu den Wells von Kunststoff-Mikrotiterplatten zugesetzt. Nach Übernacht-Inkubation bei 4 °C wurden die Platten zweimal mit BBS, die 0,5 % Tween-20 enthielt (BBS/Tween), gewaschen und wurden mit BBS, ergänzt mit 1 % Rinderserumalbumin (BBS/BSA), vier Stunden lang bei Raumtemperatur gequencht. Nach zweimaligem Waschen mit BBS/Tween wurden Proben seriell in BBS/BSA verdünnt und auf die Wells in zweifacher Ausführung aufgeteilt. Nach dreistündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten viermal mit BBS/Tween gewaschen und wurden dann mit biotinyliertem Ziege-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD), verdünnt auf 1:2.000 in BBS/BSA, inkubiert. Eine Stunde später wurden die Platten viermal mit BBS/Tween gewaschen und mit 25 μl von TMB-Peroxidasesubstrat (Kirkegaard & Perry) inkubiert. Dreißig Minuten später wurde Absorption bei 450 nm in einem Mikroplattenleser (Molecular Devices, Menlo Park, CA) gemessen. Um den Antikörpergehalt im Immunserum zu schätzen, wurden die Resultate mit einer Standardkurve verglichen, die mit monoklonalem Antikörper 17.109 erstellt wurde (siehe z.B. die Beschreibung dieses mAb in Carson et al., Mol. Immunol. 20, 1081–1087 (1983)).
  • Diese Tests zeigten, dass Produktion der Antikörper von Interesse gesteigert wurde, wodurch Expression der Gene durch die Plasmide bestätigt wurde.
  • Histologische Auswertung. An Tag 49 wurden die mit intramuskulärer Injektion versehenen Mäuse getötet. Muskeln, in die die Gene injiziert worden waren, wurden in 10 % Formalin fixiert und zur histologischen Auswertung verarbeitet.
  • Schnitte aus Muskeln, denen zusammen pREVk3 und pRSVIL2 injiziert wurde, wiesen chronische Entzündung und Myonekrose auf, was mit einer lokalisierten verzögerten Hypersensibilitätsreaktion (1A und B) übereinstimmt. Im Gegensatz dazu wiesen Muskel, denen pREVK3 oder pRSVIL2 alleine injiziert wurde, ein lymphoides Infiltrat auf, das an der Stelle der subkutanen Injektion lokalisiert war (1C).
  • BEISPIEL II
  • GENEXPRESSION NACH INTRADERMALER INJEKTION EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS
  • Um Alternativen zu intramuskulären Injektionen von nackten Polynucleotiden zu untersuchen, wurde Mäusen ein nacktes cDNA-Plamsid intradermal injiziert. Genexpression wurde beobachtet und gemessen.
  • Das Gen für Influenza-Ribonucleoprotein (RNP) wurde in ein pCMV-Plasmid wie zuvor beschrieben subkloniert. RNP-Gene aus zahlreichen Influenza-Stämmen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind in Sequenz unter verschiedenen Stämmen hoch konserviert (siehe z.B. Gorman et al., J. Virol. 65, 3704 (1991)).
  • Vier Wochen alten Balb/c-Mäusen wurden dreimal 15 μg pCMV-RNP, suspendiert in 100 μl HBSS, injiziert. Injektionen wurden intradermal am Ansatz des Schwanzes in zweiwöchigen Intervallen verabreicht. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) erkennen Antigene, die von Klasse-I-MHC-Moleküle aufgewiesen werden, und spielen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von viral infizierten Zellen. Intramuskuläre (i.m.) Immunisierung mittels cDNA-Expressionsvektoren sollte ein wirksames Verfahren zur Einführung von Antigen in Klasse-I-MHC-Moleküle sein und somit CTL-Reaktionen stimulieren. In dieser Studie induzierte intradermale (i.d.) Injektion eines Plasmids, das das Influenza-Nucleoprotein-(NP-) Antigen-Gen enthielt, sowohl NP-spezifische CTL als auch hohe Titer von Anti-NP-Antikörpern. Diese Antikörper erreichten ein Maximum 6 Wochen nach Injektion und blieben zumindest 28 Wochen lang in Abwesenheit lokaler Entzündung unverändert.
  • Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Banding in Gegenwart von Ethidiumbromid gereinigt und wurde gefroren in 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0, gelagert. Vor der Injektion wurde das Plasmid in Ethanol gefällt und in normaler Salzlösung, die 0,1 mM EDTA enthielt, aufgelöst.
  • Die Gegenwart von Anti-NP-IgG in Serum wurde durch ELISA, im Wesentlichen wie in Viera et al., Int. Immunol. 2, 487 (1990), beschrieben, gemessen. Die Resultate von diesem Test sind in 2A gezeigt; alle Tiere entwickelten einen hohen Titer von Anti-NP-Antikörper, der länger als 20 Wochen anhielt. Wie in 2B gezeigt schienen die intradermalen Injektionen mit gleichen Mengen an Plasmid-DNA etwa um das Vierfache höhere Antikörpertiter zu ergeben als intramuskuläre Injektionen (die wie in Beispiel I verabreicht wurden).
  • Die Achsen von 2 stellen jeweils den ELISA-Titer (Mittelwert, 1 Unze) über Zeit dar. Serumverdünnung für alle Graphikpunkte beträgt 2560.
  • BEISPIEL III
  • GENEXPRESSION NACH INTRANASALER EINFÜHRUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS
  • Unter Verwendung desselben Plasmids (pCMV-RNP) in derselben HBSS-Suspension wie in Beispiel II beschrieben wurde nacktes Polynucleotid, das für In fluenza-Ribonucleoprotein kodiert, in Balb/c-Mäuse in 3 Gruppen von 6 intranasal eingeführt. Konzentrationen von Anti-NP-IgG in peripherem Blut vor und nach der Einführung des Plasmids bei unterschiedlichen Serumverdünnungen wurden durch ELISA wie in Beispiel II beschrieben gemessen. Blut wurde jeder Maus nach intranasaler Einführung nach 6 Wochen entnommen.
  • 3 stellt in einem Diagramm die Resultate des ELISA-Tests vor und nach intranasaler Einführung des Plasmids dar. Das Diagramm stellt ELISA-Titer gegenüber Serumverdünnung dar. In 3 sind Werte für jede einzelne Maus aus jeder Gruppe (Nr. 1–3) und ein Mittelwert für alle Mäuse in jeder Gruppe (Nr. G1–G3) gezeigt.
  • Ohne Anästhesie zeigten Mäuse in einer zweiten Gruppe, die 3 × 7,5 μg Plasmid erhielten, gesteigerte Antikörpertiter im Vergleich zum Hintergrund (3). Diese Daten sind in 4 gezeigt.
  • Eine dritte Gruppe von Mäusen erhielt dieselbe Dichte an Plasmid unter Anästhesie. Expression von RNP wie durch die Titer von Anti-NP-IgG angegeben in diesen Mäusen war im Wesentlichen der Expression ähnlich, die in den nicht anästhesierten Mäusen erreicht wurde. Die Daten für die anästhesierten Mäuse sind in 5 gezeigt.
  • Expression kann durch zusätzliche Verwendung von Absorptionspromotoren gesteigert und durch über Zeit freigesetzte Promotoren, deren Identität und Verwendung auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise jene, die von Chien, s.o., in Kapitel 5 vorgeschlagen werden, verlängert werden.
  • BEISPIEL IV
  • HISTOLOGISCHE STUDIEN ZEIGEN ZELLAUFNAHME VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN DURCH MONONUKLEARE ZELLEN AM EINTRITTSPUNKT IN DER HAUT
  • Drei Tage nach intradermaler Injektion von nacktem pCMV/lacz in die Schwänze von Balb/c-Mäusen wurden die Mäuse getötet. Gewebekulturen wurden am Eintrittspunkt für das Plasmid gewonnen und auf E.-coli-β-Galactosidase-Aktivität gefärbt. Eine Photographie (40fache Vergrößerung) eines Objektträgers aus der histologischen Untersuchung dieser Kulturen ist in 6 abgebildet.
  • Wie in 6 gezeigt erfolgt die Aufnahme des Plasmids (in Blau) durch mononukleare Zellen. Die Fibroblasten in den Gewebeproben sind nicht gefärbt, wodurch sie anzeigen, dass das Plasmid durch diese Zellen nicht aufgenommen wurde. Die abgerundeten, mononuklearen Zellen, die das Plasmid aufnahmen, schienen Makrophagen und/oder andere Antigen aufweisende Zellen zu sein, die anzeigen würden, dass Aufnahme des Plasmids durch Phagozytose erfolgt.
  • BEISPIEL V
  • EPIDERMALE VERABREICHUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS UNTER VERWENDUNG EINES MECHANISCHEN REIZSTOFFES, UM EINE IMMUNANTWORT HERVORZURUFEN
  • 7 zeigt die Resultate eines ELISA, der wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt wurde, für Serumkonzentrationen von Anti-NP-IgG nach epidermaler Verabreichung von pCMVRNP über mechanische Mittel.
  • Das Plasmid wurde auf die Zinken einer nicht beschichteten MONO-VACC®-Vorrichtung wie zuvor beschrieben beschichtet. (Es gilt anzumerken, dass es alternativ dazu für die nackten Polynucleotide möglich ist, auf die Zinken der Vorrichtung lyophilisiert zu werden, um längere Lagerfähigkeit zu gewähren.) Die Gesamtplas midkonzentration an allen der Vorrichtungszinken betrug etwa 50 μg in einem isotonischen normalen Salzlösungsträger (etwa 150 μg Plasmid pro Milliliter). Der Rücken einer Balb/c-Maus wurde geschoren, und die geschorene Haut wurde sanft mit der Zinkenvorrichtung angekratzt. Wie in 7 gezeigt, wurde Anti-NP-IgG danach im Serum nachgewiesen (z.B. an Tag 42 enthielt das Serum aus dieser Maus Antikörper mit einem Titer von 1:10240).
  • BEISPIEL VI
  • EPIDERMALE VERABREICHUNG EINES NACKTEN POLYNUCLEOTIDS UNTER VERWENDUNG EINES CHEMISCHEN MITTELS UM EINE IMMUNANTWORT HERVORZURUFEN
  • 8 zeigt die Resultate eines ELISA, der wie in Beispiel I beschrieben zur Untersuchung der Serumkonzentrationen von Anti-NP-IgG nach epidermaler Verabreichung von pCMVRNP in Verbindung mit der Anwendung eines chemischen Mittels durchgeführt wurde.
  • Das Plasmid wurde in 40 μg einer isotonischen normalen Salzlösung, die etwa 150 μg Plasmid pro Milliliter enthielt, suspendiert. Diese Lösung wurde an dem nicht-adhäsiven Bausch eines Verbands der Marke BAND-AID (Johnson & Johnson) absorbiert.
  • Eine Balb/c-Maus wurde wie in Beispiel V beschrieben geschoren, und ein im Handel erhältliches keratinolytisches Mittel (hier die zuvor beschriebene Enthaarungscreme, die unter dem Handelsnamen NAIR vertrieben wird) wurde auf die geschorene Haut aufgetragen. Nach mehreren Minuten wurde das keratinolytische Mittel von der Haut abgewaschen und der plasmidhältige Verband auf die Haut aufgebracht. Wie in 8 gezeigt entwickelten die behandelten Tiere Serum-Anti-NP-IgG mit einem Titer von 1:640.
  • BEISPIEL VII
  • IMMUNANTWORT AUF VIRALE PROVOKATION IN MÄUSEN DENEN INTRADERMAL NACKTER pCMVRNP INJIZIERT WURDE
  • Um zu testen, ob die durch Impfung mit geeigneten nackten Polynucleotiden gebildete Immunität Tiere vor einer tödlichen viralen Provokation schützen könnte, wurden Gruppen von 10 Balb/c-Mäusen dreimal intradermal 15 μg pCMVRNP-Plasmid injiziert, das das NP-Gen aus einem H1N1-Stamm von Influenzavirus (A/PR/8/34; bereitgestellt von Dr. Inocent N. Mbawuike vom Baylor College of Medicine, USA) enthielt. Zu den Kontrollgruppen gehörten Tiere, denen nichts injiziert wurde, wie auch Tiere, denen ein irrelevantes Plasmid (pnBL3) injiziert wurde.
  • Sechs Wochen nach den ersten Plasmidinjektionen wurden die Tiere mit einer LD90-Dosis eines H3N2-Influenzastamms (A/HK/68; auch von Dr. Mbawuike bereitgestellt) provoziert. Intradermal geimpfte Mäuse waren im Vergleich zu nicht geimpften Kontrollmäusen vor der Provokation signifikant geschützt (P<0,01); siehe 9 (eine Kaplan-Meyer-Kurve zur Überlebensrate).
  • BEISPIEL VIII
  • RELATIVE NIVEAUS VON GENEXPRESSION NACH INTRADERMALEN INJEKTIONEN VON NACKTEN PLASMIDEN DIE NACKTEN ZYTOMEGALIEVIRUS- ODER ROUS-SARKOMA-VIRUS-PROMOTOR ENTHIELTEN
  • Die mögliche Wirkung der Promotorregion, die in einem Expressionsvektor verwendet wurde, wurde durch Testen von zwei Plasmiden, die das in Beispiel II beschriebene RNP-Gen enthielten, bewertet. Ein Plasmid, pCMVRNP, enthielt die unmittelbar frühe Zytomegalieviruspromotor-, -enhancer- und -intronregion. Das andere Plasmid enthielt den Promotor aus der Rous-Sarkoma-Virus-LTR-Region (pRSVRNP). Wie in 10 gezeigt waren Antikörperreaktionen auf das NP-Protein, das durch die Plasmide exprimiert wurde, im Fall des CMV-Promotors nach intradermalen Injektionen konsequent höher. Dies steht im Gegensatz zu den Reaktionen, die nach intramus kulärer Injektion des NP-Gens beobachtet wurden, worin Antikörperkonzentrationen, die durch die zwei Plasmide produziert wurden, im Wesentlichen gleich sind (Daten nicht dargestellt).
  • BEISPIEL IX
  • SELEKTIVE INDUKTION VON ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTREAKTIONEN NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN
  • Mäusen des C57/B6-Stamms wurden intradermal in den Schwanz in zweiwöchigen Intervallen 100 μg nackte DNA, gereinigt aus einem CDM8-ova-Plasmid (im Detail in Shastri et al., J. Immunol. 150, 2724–2736 (1993), beschrieben), injiziert. Das CDM8-ova-Plasmid enthält die Volllängen-cDNA (1,8 kb) für Ovalbumin.
  • Zwei Wochen nach der zweiten Genverabreichung wurde die Milz der Mäuse entfernt und in vivo mit tödlich bestrahlten (3.000 Rad) syngenetischen Splenozyten kultiviert, die mit einem synthetischen Ovalbuminpeptid gepulst worden waren. Dieses Peptid ist ein eingeschränktes Klasse-I-Target für zytotoxische T-Zellen in Mäusen mit dem von Shastri et al. beschriebenen Histokompatibilitäts-Haplotyp Kb.
  • Nach fünf Tagen in Kultur wurden die Zellen mit Targets von 2 Typen inkubiert, um auf die Bildung von zytotoxischen Zellen durch die Mäuse zu testen, die das für Ovalbumin kodierende Gen erhalten hatten. Die Targets waren Maus-EL-4-Lymphozyten, gepulst mit dem synthetischen Ovalbuminpeptid, oder EL-4-Zellen, die mit der cDNA für Ovalbumin stabil transfiziert worden waren (siehe 11; die cDNA für Ovalbumin ist in der Fig. als "EG7" bezeichnet). Die Lyse in Prozent der 2 Targets wurde für verschiedene Effektor-Target-Verhältnisse (bezeichnet als "E:T-Verhältnis" in 11) bestimmt. Wie in 11 gezeigt, hatten die Tiere, die das nackte CDM8-ova-Plasmid erhalten hatten, zytotoxische T-Zellen produziert, die für die Ovalbumin-Targets (d.h. für EL-4 mit dem Ovalbuminpeptid und für EG7) spezifisch waren, jedoch für die Kontroll-EL-4-Zellen (d.h. für jene ohne das Ovalbuminpeptid) nicht spezifisch waren.
  • C57/B6-Mäuse, die intradermal mit CDM8-Ovaplasmiden geimpft worden waren, wurden auch auf Antikörper gegen Ovalbumin gescreent. Seren, die 6 Wochen nach Verabreichung der CDM8-Ovaplasmide gesammelt wurden, enthielten keine nachweisbaren Konzentrationen von Antikörper (gemessen unter Verwendung eines enzymgekoppelten Immunadsorptionstests auf Mikrotiterplatten, die mit Ovalbumin beschichtet waren; siehe 12). Kollektiv gesehen weisen diese Daten darauf hin, dass die Verfahren zur Verabreichung von nackten Polynucleotiden der Erfindung eingeschränkte zyototoxische MHC-Klasse-I-T-Zellen (hierin gegenüber Ovalbumin) ohne Induktion von Antikörperproduktion induzieren.
  • BEISPIEL X
  • VERLÄNGERTES IMMUNOLOGISCHES GEDÄCHTNIS NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN INDUZIERT DURCH ANTIGENSTIMULATION VON T-ZELLEN
  • 0,1, 1, 10 und 100 μg nackte Polynucleotide in Plasmidform (0,5–5 ng/1 mg DNA-Endotoxingehalt), die unter der Kontrolle des CMV-Promotors ("pCMV Lac-Z") für das E.-coli-Enzym β-Galactosidase kodieren, wurden an Gruppen von 4 Mäusen/Dosierung/Weg entweder intramuskulär ("IM") oder intradermal ("ID") verabreicht. Zu Vergleichszwecken erhielt eine andere Gruppe von 4 Mäusen/Dosierung 100 μg β-Galactosidaseprotein ("PR") intradermal. Alle Injektionen wurden unter Verwendung von 50 μl normaler Salzlösung als Träger getätigt. IM- und ID-Injektionen wurden mit einer 0,5-ml-Spritze und einer 28,5-Gauge-Nadel durchgeführt. Antikörper wurden hiernach durch enzymgekoppelten Immunadsorptionstest in zweiwöchigen Intervallen gemessen.
  • Kurz zusammengefasst wurden alle Antikörper unter Verwendung von β-Galactosidase (Calbiochem, CA) als das Festphasenantigen gemessen. Mikrotiterplatten (Costar, Cambridge, MA) wurden mit 5 μg Antigen, aufgelöst in 90 mM Borat (pH 8,3) und 89 mM NaCl (d.h. gepufferte Boratsalzlösung; BBS), über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet und über Nacht mit 10 mg/ml Rinderserumalbumin in BBS blockiert.
  • Serumproben wurden seriell in BBS verdünnt, beginnend bei einer 1:40-Verdünnung für die ersten 8 Wochen und dann eine 1:320-Verdünnung hiernach. Diese Proben wurden zu den Platten zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gelagert. Platten wurden in BBS + 0,05 % Polysorbat 20 gewaschen, dann mit einer 1:2.000-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Jackson Immunoresearch Labs., West Grove, PA) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur umgesetzt oder mit einer 1:2.000-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-Anti-Maus-IgG-1-Antikörper (Southern Biotech, AL) umgesetzt oder mit einer 1:500-Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Ratten-Anti-Maus-IgG-2A-Antikörper (Pharmingen, CA) unter denselben Bedingungen umgesetzt. Die Platten wurden wiederum gewaschen, dann wurde eine Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophenolphosphat (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) in 0,05 M Carbonatpuffer (pH 9,8), der 1 mM MgCl2 enthielt, zugesetzt. Absorption bei 405 nm wurde 1 Stunde nach Zusatz von Substrat zu den Platten gelesen.
  • Wie in 13 gezeigt wurden Antikörperreaktionen in den Tieren, die die pCMV-Lac-Z-Plasmide durch ID-Injektion erhalten hatten, und in den Tieren, die das PR erhalten hatten, im gleichen Ausmaß induziert, während weniger Antikörperreaktionen in den Tieren gemessen wurden, die die pCMV-Lac-Z-Plasmide durch IM-Injektion erhalten hatten.
  • Um auf T-Zell-Gedächtnis zu testen, wurden die Tiere dann mit 0,5 μg PR an einer anderen Stelle durch ID-Injektion geboostet. Sofern diese Tiere Gedächtnis-T-Zellen entwickelt hatten, um die Produktion der Antikörper gegen β-Galactosidase zu kontrollieren, würde erwartet werden, dass sie eine heftigere Immunantwort nach der Boosterimpfung gegenüber löslichem Proteinantigen hervorbringen als dies in Reaktion auf die Primingdosis von Antigen gezeigt wurde.
  • Wie in 14 gezeigt, ist es eindeutig, dass die Tiere, die ID-Injektionen von pCMV-Lac-Z-Plasmid erhalten hatten, ein wesentlich besseres immunologisches Gedächtnis entwickelt hatten als jene Tiere, die IM-Injektionen entweder von Plasmid oder von PR erhalten hatten. Weiters dauerte das Gedächtnis, das von den ID-injizierten Tieren entwickelt wurde, mindestens etwa 12 Wochen an.
  • BEISPIEL XI
  • SELEKTIVE INDUKTION EINER TH1-ANTWORT NACH INTRADERMALER VERABREICHUNG VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN
  • In Mäusen sind IgG-2A-Antikörper serologische Marker für eine TH1-Typ-Immunantwort, während IgG-1-Antikörper auf eine TH2-Typ-Immunantwort hinweisen. TH2-Antworten umfassen die Allergie-assoziierte IgE-Antikörper-Klasse; lösliche Proteinantigene neigen dazu, relativ starke TH2-Antworten zu stimulieren. Im Gegensatz dazu werden TH1-Antworten durch Antigen-Bindung an Makrophagen und dendritische Zellen induziert. TH1-Antworten sind von besonderer Bedeutung für die Behandlung von Allergien und AIDS.
  • Um zu bestimmen, welche Antwort, sofern eine vorhanden ist, von Mäusen entwickelt werden würde, die nackte Polynucleotide gemäß der Erfindung erhielten, wurden Mäuse mit pCMV Lac-Z oder Protein wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben geimpft. In zweiwöchigen Intervallen wurde jedes IgG 2A und IgG 1 gegen β-Galactosidase durch enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (unter Verwendung von Antikörper, die spezifisch für die IgG-1- und IgG-2A-Untergruppen waren) auf Mikrotiterplatten, die mit dem Enzym beschichtet waren, gemessen.
  • Wie in 15 gezeigt produzierten nur die Mäuse, die das Plasmid durch ID-Injektion erhalten hatten, hohe Titer von IgG-2A-Antikörpern. Wie in 16 gezeigt induzierte Immunisierung der Mäuse mit dem Enzym selbst ("PR") Produktion von relativ hohen Titern von IgG-1-Antikörpern. In den IM-injizierten Mäusen wurden geringe Titer sowohl von IgG-2A- als auch von IgG-1-Antikörpern ohne augenscheinliche Selektivität produziert. Die in den Figuren gezeigten Daten umfassen Mittelwerte der Werte, die in jeder Gruppe von 4 Mäusen erhalten wurden.
  • Um die Stabilität der Antikörperreaktion über die Zeit hinweg zu bestimmen, wurde dieselbe Gruppe von Tieren mit 0,5 μg Enzym, das intradermal injiziert wurde, geboostet. Wie in den 17 und 18 gezeigt induzierte das Boosten von Tieren, die mittels ID-Injektion mit dem Enzym geprimt wurden, fast eine Verzehnfachung der IgG-2A-Antikörperreaktionen (d.h. der Antikörpertiter stieg von 1:640 auf 1:5120), stimulierte jedoch keine IgG-1-Reaktion. Diese Daten weisen darauf hin, dass die selektive TH1-Antwort, induziert durch ID-Verabreichung von nackten Polynucleotiden, trotz darauf folgender Aussetzung gegenüber Antigen im Wirt aufrechterhalten wird.
  • BEISPIEL XII
  • TH1-ANTWORTEN IN MÄUSEN NACH VERABREICHUNG VON NACKTEN POLYNUCLEOTIDEN MIT EINEM MECHANISCHEN REIZSTOFF
  • Die in Beispiel XI beschriebenen Versuche wurden in getrennten Gruppen von Mäusen wiederholt, mit der Ausnahme, dass (1) nur eine Priming-Dosis getestet wurde und (2) das pCMV-Lac-Z-Plasmid einer Gruppe von 4 Mäusen unter Verwendung der Zinkenvorrichtung, die in Beispiel V beschrieben wurde, verabreicht wurde, während β-Galactosidase-Protein (10 μg) einer anderen Gruppe von 4 Mäusen durch intradermale (ID-) Injektion verabreicht wurde.
  • Wie in 19 gezeigt produzierten die Mäuse, die Plasmid erhielten, im Vergleich zu den Mäusen, die das Protein erhielten, relativ geringe Titer von IgG-1-Antikörper. Dahingegen, und wie in 20 gezeigt, produzierten die Mäuse, die Plasmid erhielten, im Vergleich zu den Mäusen, die Protein enthielten, wesentlich höhere Titer von IgG-2A-Antikörper.
  • Diese Resultate sind jenen ähnlich, die in Beispiel XI erhalten wurden, unter der Ausnahme, dass interessanterweise die Mäuse, die das Plasmid über Ankratzen ihrer Haut mit der Zinkenvorrichtung erhielten, sogar höhere Titer von IgG-2A- Antikörper produzierten als die Mäuse, die dasselbe Plasmid über ID-Injektion erhielten (wobei beide Gruppen höhere Titer von IgG-2A-Antikörper produzierten als die Mäuse, die das Plasmid über IM-Injektion erhielten). Diese Resultate weisen darauf hin, dass das Ankratzen der Haut mit der Zinkenvorrichtung eine größere Anzahl an APCs zu dem "verletzten" Eintrittspunkt für die nackten Polynucleotide hin anzieht, und stimmen mit der Theorie überein, dass APCs wirksamere Targets für Genverabreichung und -expression darstellen als Muskel oder andere Somazellen.
  • Die in den Figuren gezeigten Daten umfassen Mittelwerte der Werte, die aus jeder Gruppe von 4 Mäusen erhalten wurden.
  • BEISPIEL XIII
  • SUPPRESSION VON IgE-ANTIKÖRPERREAKTION AUF ANTIGEN DURCH IMMUNISIERUNG MIT FÜR ANTIGEN KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
  • Unter Verwendung des in Beispiel XI beschriebenen Versuchsprotokolls wurden fünf bis acht Wochen alte Balb/c-Mäuse mit einem von zwei rekombinanten Expressionsvektoren immunisiert: pCMV-Lac-Z (beschrieben in Beispiel X) oder ein Kontrollplasmid, pCMV-BL (das für kein Insertpeptid kodiert). Eine dritte Gruppe der Mäuse erhielt Injektionen von Antigen (β-Galactosidase). Plasmid-DNA wurde gereinigt und ihr Endotoxingehalt auf 0,5–5 ng/1 mg DNA durch Extraktion mit TRITON X-114 (Sigma, St. Louis, MI) reduziert. Vor der Inokulation wurde pDNA in Ethanol ausgefällt, mit 70 % Ethanol gewaschen und in pyrogenfreier normaler Salzlösung aufgelöst.
  • Immunisierung erfolgte durch intradermale Injektion von Plasmid-DNA, die auf getrennte Zinken einer MONOVACC®-Mehrfachzinkenvorrichtung (Connaught Lab, Inc., Swiftwater, PA) geladen wurde. Kurz zusammengefasst wurden die Zinkenvorrichtungen nach ausführlichem Waschen in DDW und Einweichen über Nacht in 0,5 % SDS (sulfatierte Dodecylsalzlösung) hergestellt, wieder in DDW gewaschen, über Nacht in 0,1 N NaOH eingeweicht, wiederum in DDW gewaschen und bei 37 °C 8 Stunden lang getrocknet. 6 μl von Plasmid-DNA, aufgelöst in normaler Salzlösung, wurden auf die Zinken der Zinkenvorrichtung knapp vor jeder nachstehend beschriebenen Inokulation pipettiert. Die Gesamtmenge von pDNA, die auf die Vorrichtung pro Inokulation geladen wurde, betrug 25 μg jeweils von pCMV-Lac-Z und pCMV-BL. Um die tatsächlichen Dosen zu schätzen, wurde angenommen, dass weniger als 10 % der pDNA-Lösung, die auf die Zinkenvorrichtung geladen wurde, tatsächlich bei der Injektion der Zinken in intradermales Gewebe eingeführt werden.
  • Jeder Maus wurden dreimal 2 Inokulationen von jedem Plasmid in einwöchigen Intervallen intradermal am Schwanzansatz injiziert. Eine andere Gruppe von Mäusen erhielt eine einzelne intradermale Injektion am Schwanzansatz von 10 μg β-Galactosidase-Protein (aufgelöst in 50 μl normaler Salzlösung) anstelle von pDNA.
  • Um eine IgE-Antikörperreaktion auf darauf folgende Allergen-Provokation zu induzieren, wurde jeder Gruppe von Mäusen einmal intraperitoneal 0,1 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), die 1 μg Antigen (β-Galactosidase; Calbiochem, San Diego, CA) und 3 mg Alaun-Aluminiumhydroxid als Adjuvans (Pierce Chemical, Rockford, IL) enthielt, 14 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung injiziert. Gesamt-IgE wurde in Seren aus den Mäusen viermal im Laufe der 4 folgenden Wochen getestet.
  • IgE wurde unter Verwendung eines Festphasen-Radioimmuntests (RAST) in einer 96-Well-Polyvinylplatte (eine radioisotopische Modifikation des ELISA-Verfahrens, beschrieben in Coligan, "Current Protocols in Immunology", Einheit 7.12.4, Bd. 1, Wiley & Sons (1994)) nachgewiesen, mit der Ausnahme, dass gereinigte polyklonale Ziegen-Antikörper, die für Maus-ε-Ketten spezifisch sind, anstelle von Antikörpern, die für menschliches Fab spezifisch sind, verwendet wurden. Um Anti-Lac-Z-IgE nachzuweisen, wurden die Platten mit β-Galactosidase (10 μg/ml) beschichtet. Die niedrigste, durch den verwendeten Test messbare IgE-Konzentration betrug 0,4 ng IgE/ml.
  • Wie in 23 gezeigt produzierten Mäuse, denen pCMV-Lac-Z injiziert wurde, nur geringe Konzentrationen an Gesamt-IgE-Antikörper (bei einem Mittelwert von etwa 250 CPM in RAST) im Vergleich zu Mäusen, denen β-Galactosidase injiziert wurde (Mittelwert von etwa 1.000 CPM in RAST). Darüber hinaus blieben IgE-Konzentrationen in den Mäusen, denen Plasmid injiziert wurde, trotz Booster-Injektion mit Protein konsequent niedrig (Mittelwert von etwa 25050 CPM) (was darauf hinweist, dass bei diesen Mäusen bereits nach anfänglicher Injektion Toleranz erreicht wurde), während IgE-Konzentrationen bei den Mäusen, denen Protein injiziert worden war, nach der Booster-Impfung wesentlich stiegen (Mittelwert von etwa 1.500 bis 2.000 CPM) und schließlich auf Kontrollkonzentrationen in der Woche 4 zurückfielen, da Toleranz von den Mäusen, denen Protein injiziert wurde, durch wiederholte Aussetzung gegenüber dem Proteinantigen erreicht wurde.
  • Bei spezifischen Messungen der Anti-Antigen-Reaktion in jeder Gruppe der Mäuse, wie in 24 gezeigt, zeigten sich Anti-Lac-Z-IgE-Konzentrationen bei den Mäusen, denen Plasmid injiziert worden war, wiederum konsequent niedrig, und dies sowohl vor als auch nach der Booster-Injektion (Mittelwert von etwa 250 CPM in RAST), während die Mäuse, denen Protein injiziert worden war, hohe Konzentrationen an Anti-Lac-Z entwickelten, insbesondere nach der ersten Antigen-Booster-Injektion, nach der Anti-Lac-Z-Konzentrationen bei den Mäusen auf einen Mittelwert von etwa 3.000 CPM stiegen. Übereinstimmend mit der Erreichung von Toleranz gingen die Anit-Lac-Z-IgE-Konzentrationen bei den Mäusen, denen Protein injiziert worden war, im Laufe der Zeit zurück, stiegen jedoch in der Gruppe der Kontrollmäuse, die keinerlei Immunisierung gegenüber b-Galactosidase erhalten hatten, weiterhin an.
  • Diese Daten zeigen, dass die mit Plasmid geimpften Mäuse eine Antigen-spezifische TH1-Antwort gegenüber dem Plasmidexpressionsprodukt (übereinstimmend mit den Daten zu TH1/TH2-Antworten, die in den Beispielen XI und XII gezeigt sind) bei gleichzeitiger Unterdrückung von IgE-Produktion entwickelten, während bei den Mäusen, denen Protein injiziert wurde, Toleranz nur nach Entwicklung von wesent lich höheren Konzentrationen von Gesamt- und Antigen-spezifischen IgE-Antikörpern erreicht wurde.
  • BEISPIEL XIV
  • IL-4 UND INFγ-KONZENTRATIONEN IN MÄUSEN NACH IMMUNISIERUNG MIT ANTIGEN ODER FÜR ANTIGEN KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
  • Um zu bestätigen, dass die durch die in den Beispielen XI bis XIII dargestellten Daten gezeigten Resultate der selektiven Induktion von TH1-Antworten (z.B. INFγ-Sekretion) in Mäusen, denen Plasmid injiziert wurde (von deren Antworten angenommen wird, dass sie negative Wirkung auf IgE-stimulierende TH2-Antworten ausüben; z.B. Sekretion von IL-2), zugeschrieben werden können, wurden Konzentrationen von IL-2 und INFγ in den Seren der Mäuse aus Beispiel XIII, denen Plasmid und Protein injiziert worden war, in Woche 1 nach einer Booster-Injektion von Antigen untersucht. IL-2-Konzentrationen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben getestet; INFγ-Konzentrationen wurden mit einem Anti-INFγ-Maus-Antikörpertest getestet (siehe z.B. Coligan, "Current Protocols in Immunology, Einheit 6.9.5., Bd. 1, Wiley & Sons (1994)).
  • Wie in 25 gezeigt, waren Konzentrationen von IgE-stimulierendem IL-4 bei Mäusen, denen Protein injiziert worden war, wesentlich höher als bei Mäusen, denen Plasmid injiziert worden war (um etwa ein Verhältnis von 9:1). Umgekehrt waren Konzentrationen von INFγ bei Mäusen, denen Plasmid injiziert worden war, wesentlich höher als bei Mäusen, denen Protein injiziert worden war (um ein Verhältnis von etwa 11:1).
  • BEISPIEL XV
  • HERSTELLUNG UND AUFRECHTERHALTUNG VON ZYTOTOXISCHEN T-LYMPHOZYTEN NACH IMMUNISIERUNG MIT ANTIGEN ODER FÜR ANTIGEN KODIERENDEN POLYNUCLEOTIDEN
  • Wie bereits an anderer Stelle erläutert, wird angenommen, dass zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) TH2-Zellaktivität unterdrücken, die ihrerseits die Fähigkeit solcher Zellen unterdrücken würde, die Entwicklung von IgE-Antikörpern zu stimulieren. Um zu bestätigen, ob die Mäuse, denen Plasmid injiziert worden war, CTLs entwickelten und die Anti-Antigen-Produktion, die dadurch gewährt wird, aufrechterhielten, wurden CTL-Konzentrationen bei Mäusen der Plasmidgruppe und der Kontrollgruppe gemessen.
  • Die Mäuse, denen Plasmid injiziert worden war, wurden wie in Beispiel XIV immunisiert, mit der Ausnahme, dass sie pCMV-NP (in Beispiel I beschrieben) und nicht pCMV-Lac-Z erhielten. Kontrollmäuse erhielten pCMV-BL wie in Beispiel XIX. Die Gesamtmenge von pDNA, die auf die Zinkenvorrichtung pro Inokulation geladen wurde, betrug 50 μg pCMV-NP und 25 μg pCMV-BL.
  • 36 Wochen nach der Immunisierung wurden die Mäuse getötet, und Splenozyten wurden zur Verwendung in gemischten Standard-Lymphozytenkulturen entnommen. Die Kulturen wurden in Gegenwart eines bekannten synthetischen Peptids, das das H-2d-eingeschränkte Haupt-CTL-Epitop des NP-Proteins enthielt, wachsen gelassen. Die Kulturen wurden auf Anti-NP-CTL-Aktivität 5–6 Tage später unter Verwendung von mit NP-Peptid gepulsten syngenetischen P815-Tumorzellen (ATCC Nr. TIB64, Rockville, MD) als Targets getestet.
  • Wie in 26 gezeigt wiesen gemischte Lymphozytenkulturen, die von den Tieren, denen pCMV-NP injiziert worden war, hergestellt wurden, hohe Konzentrationen an spezifischer zytolytischer Anti-NP-Aktivität auf und erreichten 10 %, 30 % und 80 spezifische Lyse bei einem Verhältnis von Effektor zu Target (E/T) von 5:1, 15:1 bzw. 45:1. Kontrollmäuse wiesen nur 1 %, 1 % und 9 % unter denselben Bedingungen auf. Weiters gab es in Abwesenheit von Aussetzung gegenüber dem H-2d-Epitoppeptid zwischen den Mäusen, denen pCMV-NP injiziert worden war, und den Kontrollmäusen keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf CTL-Aktivität (27). Diese Daten weisen auf selektive Aktivierung von TH1-Zellen bei den mit pCMV-NP geimpften Mäusen hin.

Claims (6)

  1. Verwendung eines nackten Polynucleotids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem Allergen oder Allergenepitop, wodurch das Polynucleotid der Haut des Wirts zu verabreichen ist, worin die Haut in Bezug auf andere Wirtsgewebe eine hohe Konzentration an Antigen-präsentierenden Zellen aufweist; worin das nackte Polynecleotid operativ für das Allergen oder Allergenepitop kodiert; und worin das Allergen in den Antigen-präsentierenden Zellen ohne nennenswerte Sekretion daraus exprimiert wird und vorzugsweise Th 1-Lymphozyten aktiviert, während Allergen-stimulierte IgE-Produktion im Wirt reduziert wird.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin verschiedene Typen einer Vorrichtung mit mehreren Zinken mit dem nackten Polynucleotid beschichtet werden, das mittels Durchdringung der Haut des Wirts mit den Zinken zu verabreichen ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das nackte Polynucleotid unter der Kontrolle eines Kernrezeptorpromotors steht.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Promoter durch Auftragen eines für den Kernrezeptor spezifischen aktivierenden Liganden auf die Haut des Wirts am Eintrittspunkt der Polynucleotids aktiviert wird
  5. Verwendung nach Anspruch 4, worin der Ligand aus der aus 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3, Steroidhormonen, Schilddrüsenhormonen und Retinoiden bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  6. Verwendung eines nackten Polynucelotids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunisierung eines Wirts gegenüber einem Allergen oder Allergenepitop, wodurch das Polynucleotid einem Schleimhautgewebe des Wirts zu verabreichen ist, worin das Schleimhautgewebe im Vergleich zu anderen Wirtsgeweben eine hohe Konzentration an Antigen-präsentierenden Zellen aufweist; worin das nackte Polynucleotid operativ für das Allergen oder Allergenepitop kodiert; und worin das Allergen in den Antigen-präsentierenden Zellen ohne nennenswerte Sekretion daraus exprimiert wird und vorzugsweise Th1-Lymphozyten aktiviert, während Allergen-stimulierende IgE-Produktion im Wirt reduziert wird.
DE69534374T 1994-11-01 1995-10-31 Methoden und zubehör zur immunisierung von wirtsorganismen durch verabreichung nackter polynucleotide , welche für antigene peptide codieren Revoked DE69534374T2 (de)

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