DE69735591T2

DE69735591T2 - Impfstoff auf einem plasmid beruhend zur behandlung von atherosclerosis

Info

Publication number: DE69735591T2
Application number: DE69735591T
Authority: DE
Inventors: J. Lawrence Worcester THOMAS
Original assignee: Avant Immunotherapeutics Inc
Current assignee: Celldex Therapeutics Inc
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: EP0914427B1; DE69735591D1; ES2262179T3; EP0914427A1; AU2994697A; ATE321559T1; JP2001508760A; AU721729B2; CA2250428A1; WO1997041227A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunbiologie und speziell einen DNA-Plasmid-Impfstoff zur Kontrolle der Aktivität oder Wirkung des Cholesterylester-Transferproteins oder CETP im Körper.
Hintergrund der Erfindung
Cholesterin zirkuliert durch den Körper überwiegend als Komponente von Lipoproteinteilchen (Lipoproteinen), welche sich aus einem Proteinanteil zusammensetzen, der aus einem oder mehreren Apolipoproteinen (Apo) und verschiedenen Lipiden, einschließlich Phospholipiden, Triacylglycerinen (Triglyceriden), Cholesterin und Cholesterylestern bestehen. Es gibt zehn Hauptklassen von Apolipoproteinen: Apo A-I, Apo A-II, Apo IV, Apo B-48, Apo B-100, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D und Apo E.
Lipoproteine werden durch ihre Dichte und Zusammensetzung klassifiziert. High Density Lipoproteine (HDL), von denen eine Funktion darin besteht, den Transport von Cholesterin aus peripheren Geweben zur Leber zu vermitteln, weisen gewöhnlich eine Dichte im Bereich von etwa 1,036–1,21 g/ml auf. HDL enthalten verschiedene Mengen an Apo A-I, Apo A-II, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D, Apo E sowie verschiedene Mengen an Lipiden, wie z.B. Cholesterin, Cholesterylester, Phospholipide und Tiglyceride.
Im Gegensatz zu HDL enthalten Low Density Lipoproteine (LDL), die im Allgemeinen eine Dichte von etwa 1,019–1,063 g/ml aufweisen, Apo B-100 zusammen mit verschiedenen Lipiden. Insbesondere sind bei LDL die Mengen an Lipiden, Cholesterin und Cholesterylestern beträchtlich größer als bei HDL, wenn sie als Prozent der Trockenmasse gemessen werden. LDL ist beim Transport des Cholesterins zu peripheren Geweben besonders wichtig.
Very Low Density Lipoproteine (VLDL) weisen eine Dichte von etwa 0,95–1,006 g/ml auf und unterscheiden sich auch in der Zusammensetzung sowohl in ihrem Protein- als auch Lipidgehalt von anderen Klassen von Lipoproteinen. VLDL weisen im Allgemeinen eine viel größere Menge an Triglyceriden auf als HDL oder LDL und sind besonders wichtig beim Transport von endogen synthetisierten Triglyceriden aus der Leber zu Fett- und anderen Geweben.
Von noch geringerer Dichte als LDL enthalten Chylomikronen (Dichte gewöhnlich unter 0,95 g/ml) Apo A-I, Apo A-II, Apo B, Apo C-I, Apo C-II und Apo C-III und vermitteln den Transport von Nahrungstriglyceriden und Cholesterylestern vom Darm zum Fettgewebe und der Leber.
Die Eigenschaften und Funktionen der verschiedenen Lipoproteine sind ausführlich untersucht worden. (Siehe z.B. Mathews, C K. und van Holde, K.E., Biochemistry, SS. 574–576, 626–630 (The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City, California, 1990); Havel R.J., p et al., "Introduction: Structure and metabolism of plasma lipoproteins", in The Metabolic Basis of Inherited Disease. 6. Ausgabe SS. 1129–1138 (Scriver, C.R. et al., Hrg.) (McGraw-Hill, Inc., New York, 1989); Zannis, V.I, et al., "Genetic mutations affecting human lipoproteins, their receptors, and their enzymes", in Advances in, Human Genetics. Bd. 21. SS. 145–319 (Plenum Press, New York, 1993)).
Eine geringere Anfälligkeit für Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie z.B. die Arteriosklerose ist im Allgemeinen mit höheren absoluten Konzentrationen zirkulierernder HDL und auch mit höheren Konzentrationen von HDL relativ zu den zirkulierenden Konzentrationen der Lipoproteine mit niedrigerer Dichte wie VLDL und LDL in Zusammenhang gebracht worden (siehe z.B., Gordon, D.J., et al., N. Engl. J. Med., 321:1311–1316 (1989); Castelli, W.P., et aL, J. Am. Med. Assoc., 256:2835–2838 (1986); Miller, N.E., et al., Am. Heart J., 113:589–597 (1987); Tall, A.R., J. Clin. Invest., 89:379–384 (1990); Tall, A.R., J. Internal Med., 237:5–12 (1995)).
Das Cholesterylester-Transferprotein (CETP) vermittelt den Transfer des Cholesterylesters von HDL zu triglyceridreichen Lipoproteinen wie VLDL und LDL und auch den umgekehrten Austausch von Triglyceriden von VLDL zu HDL, (Tall, A.R., J. Internal Med 237:5–12 (1995); Tall, A.R., J. Lipid Res., 34:1255–1274 (1993); Hesler, C.B., et al., J. Biol. Chem., 262:2275–2282 (1987); Quig, D.W. et al., Am. Rev. Nutr., 10:169–193 (1990)). CETP kann bei der Modulation der Konzentrationen des Cholesterylesters und der Triglyceride, die mit verschiedenen Klassen von Lipoproteinen assoziiert sind, eine Rolle spielen. Eine hohe Aktivität des CETP-Cholesterylester-Tranfers ist mit höheren Konzentrationen von LDL-assoziiertem Cholesterin und VLDL-assoziiertem Cholesterin in Zusammenhang gebracht worden, welche ihrerseits mit einem höheren Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen korreliert werden (siehe z.B. Tato, F., et al., Arterioscler. Thromb. Vascular Biol., 15:112–120 (1995)).
Im Folgenden wird die Bezeichnung LDL-C verwendet, wenn auf das Gesamtcholesterin Bezug genommen wird, das die Cholesterinester und/oder das nicht veresterte mit Low Density Lipoprotein assoziierte Cholesterin enthält. Die Bezeichnung VLDL-C wird verwendet, wenn auf das Gesamtcholesterin Bezug genommen wird, das die Cholesterinester und/oder das nicht veresterte mit Very Low Density Lipoprotein assoziierte Cholesterin enthält. Die Bezeichnung HDL-C wird verwendet, wenn auf das Gesamtcholesterin Bezug genommen wird, das die Cholesterinester und/oder das nicht veresterte mit High Density Lipoproteinen assoziierte Cholesterin enthält.
Alle Lipoproteine enthalten Apolipoproteine, die dazu dienen, die strukturelle Integrität aufrecht zu erhalten und den Transport und den Stoffwechsel von Lipiden zu vermitteln, indem sie für spezifische Rezeptoren oder Cofaktoren bestimmter Enzyme als Liganden fungieren. Zusätzlich zu CETP sind andere Proteine wie die Leber-Lipase, die Lipoprotein-Lipase, die Lecithin: Cholesterin-Acyltransferase (LCAT), der LDL-Rezeptor, der HDL-Rezeptor (SR-B1) und der Rezeptor für Chylomikronen-Reste für den Transport von Lipiden und im Stoffwechsel wichtig. Eine Unterbrechung der Funktion dieser Komponenten kann zu einer Dyslipidämie führen, dem anomalen Stoffwechsel von Plasmalipiden, die ihrerseits zur Entwicklung einer Arteriosklerose beitragen kann
Die oben beschriebenen Proteine, Apolipoproteine und Lipoproteine nehmen an drei Wegen des Lipid-Transports und -stoffwechsels teil: (1) dem Chylomikronen-Weg, (2) dem VLDL-LDL-Weg und (3) dem reversen Cholesterin-Weg. Chylomikronen und Chylomikronen-Reste transportieren Lipide aus der Nahrung vom Darm zu peripheren Geweben wie z.B. Fettgewebe und zu der Leber. Auf dem VLDL-LDL-Weg werden Lipide vom Darm zu peripheren Geweben transportiert. Im reversen Cholesterin-Weg wird überschüssiges Cholesterin, das von den meisten Geweben nicht abgebaut werden kann, verestert und entweder direkt an HDL abgegeben oder indirekt von peripheren Geweben nach Austausch in andere Lipidfraktionen zur Leber transportiert, um ausgeschieden zu werden. Speziell vergrößert sich wachsendes HDL, das von der Leber und dem Darm synthetisiert wird, und wird, sobald das Cholesterin zu Cholesterylester verestert worden ist, in HDL3 und dann in HDL2 überführt. Cholesterylester (CE) können zum Transport und zur Aufnahme durch die Leber bei HDL2 bleiben oder sie können im Austausch gegen Triglyceride durch CETP zu Lipoproteinen niedriger Dichte wie VLDL und LDL umgewandelt werden. In der Leber wird HDL2 durch die Leber-Lipase von Triglyceriden befreit, welche HDL2 zur Wiederverwendung in HDL3 zurückverwandelt. Während dieses Prozesses können die CE auch zu Hepatozyten transportiert werden. Zusätzlich können einige HDL direkt von Hepatozyten aufgenommen werden (siehe z.B. Havel, R.J. et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6. Ausgabe, Seiten 1129–1138 (Scriver, C.R. et al., Hrg.) (McGraw-Hill, Inc., New York, 1989); Fielding, C.J. et al, J. Lipid Res., 36:211–228 (1995)).
Somit folgt der Transfer von CE einem von zwei Wegen. Erstens können Lipoproteine Cholesterylester zur Ausscheidung an die Leber liefern, wobei sie am reversen Transportweg des Cholesterins teilnehmen. Zweitens können die Cholesterylester zurück zu den peripheren Geweben recycelt werden.
Wenn alle Komponenten dieses Stoffwechselweges richtig arbeiten, werden Nahrungslipide rasch absorbiert, transportiert und gespeichert oder verwendet. Im Fastenzustand werden die Lipide wirksam zu Geweben transportiert und Cholesterin recycelt oder ausgeschieden. Natürlich vorkommende Dyslipidämien, vielleicht als Ergebnis der Mutationen von Apolipoproteinen, sind oft auf eine Fehlfunktion von einer oder verschiedenen der oben beschriebenen Komponenten in den Stoffwechselwegen zurückzuführen (siehe z.B. Farmer, J.A. et al., Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine- 4. Ausgabe SS. 1125–1160 (Braunwald, E„ Hrg.) (W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1992); Havel, R.J. et al., 1992; Zannis, V.I. et al., 1993). Ein chronischer Nahrungsüberschuss von Cholesterin kann die normalen Mechanismen der Entfernung von Cholesterin aus peripheren Geweben überdecken und es kann zu einer Arteriosklerose kommen, wie dies durch die Ausbildung von Läsionen und einer Blockierung des Blutflusses in Geweben des Herz-Kreislauf-Systems zum Ausdruck kommt.
In einer Anzahl von in vivo-Untersuchungen unter Einsatz von Tier- oder Humanmodellen ist darauf hingewiesen worden, dass die CETP-Aktivität die Konzentration von zirkulierendem, Cholesterin enthaltendem HDL beeinträchtigen kann. Eine erhöhte Transferaktivität von CETP-vermitteltem Cholestrylester kann einen Anstieg der HDL-C-Konzentrationen im Vergleich zu den LDL-C- und/oder VLDL-C-Konzentrationen hervorrufen, welche ihrerseits mit einer erhöhten Anfälligkeit für Arteriosklerose in Zusammenhang stehen. Es ist gezeigt worden, dass die Injektion von teilweise gereinigtem humanem CETP in Ratten (die normalerweise keine CTP-Aktivität aufweisen) zu einer Verschiebung der Cholesterylester von HDL zu VLDL führt, was mit dem CETP-begünstigten Transfer von CE aus HDL zu VLDL in Einklang steht (siehe Ha, Y.C. et al., Biochem. Biophys. Acta, 833: 203–211 (1985); Ha, Y.C. et al., Comp. Biochem. Physiol., 83B: 463–466 (1986); Gavish, D, et al., J. Lipid Res., 28: 257–267 (1987)). Darüber hinaus wurde berichtet, dass transgene Mäuse, die humanes CETP exprimieren, eine signifikante Abnahme der Konzentration des mit HDL assoziierten Cholesterins zeigten (siehe z.B. Hayek, T. et al., J. Clin. Invest., 90: 505–510 (1992); Breslow, J.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314–8318 (1993)). Ferner wurde berichtet, dass während Wildtyp-Mäuse normalerweise äußerst resistent gegen Arteriosklerose sind ((Breslow, J.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314–8318 (1993)), transgene Mäuse, die ein CETP von Affen exprimieren, eine veränderte Verteilung des mit Lipioproteinen assoziierten Cholesterins aufweisen, nämlich höhere Konzentrationen von LDL-C und VLDL-C und niedrigere Konzentrationen von HDL-C (Marotti, K.R. et al., Nature, 364: 73–75 (1993)). Solche transgenen Mäuse, die ein CETP von Affen exprimieren, waren auch im Vergleich mit nicht exprimierenden Kontrollmäusen anfälliger für eine durch die Nahring induzierte ernste Arteriosklerose und bildeten Läsionen in ihren Aorten, die eine signifikant größere Ausdehnung einnahmen als die in Kontrolltieren gefundene und die typischer für solche waren, die bei Arteriosklerose gefunden wurden; (Marotti et al., 1993). Eine intravenöse Infusion von Anti-Human-CETP monoklonalen Antikörpern (Mab) in Hamster und Kaninchen hemmte die CETP-Aktivität in vivo und führte zu signifikant höheren Niveaus in den HDL-C-Konzentrationen, zu niedrigeren Konzentrationen der HDL-Triglyceride und zu einer höheren HDL-Größe, was erneut darauf hinweist, dass CETP eine kritische Rolle bei der Verteilung von Cholesterin bei den zirkulierenden Lipoproteinen spielt (siehe Gaynor, B.J. et al., Atherosclerosis, 110: 101–109 (1994) (Hamster); Whitlock, M.E. et al., J. Clin. Invest., 84:129–137 (1989) (Kaninchen)).
Die Rolle der CETP-Aktivität ist auch beim Menschen untersucht worden. Beispielsweise wiesen in einigen Studien von Familien in Japan Individuen, die für nicht funktionelle Allele des CETP-Gens homozygot waren, keine nachweisbare CETP-Aktivität auf. Diese Individuen zeigten praktisch keine arteriosklerotischen Plaques, welche in ihren Familien auch eine Neigung zur Langlebigkeit zeigten (siehe z.B., Brown, M.L. et al., Nature, 342: 448–451 (1989); Inazu, A. et al., New Engl. J. Med., 323: 1234–1238 (1990); Bisgaier, C.L. et al., J. Lipid Res., 32: 21–23 (1991)). Es wurde auch gezeigt, dass solche homozygoten Individuen mit CETP-Mangel ein antiatherogenes Lipoprotein-Profil aufweisen, was durch erhöhte Konzentrationen an zirkulierendem HDL, das reich an Cholesterylestern ist, sowie durch insgesamt erhöhte Konzentrationen an HDL und außerordentlich große HDL, d.h. bis zu vier bis sechs Mal der Größe von normalem HDL (Brown, ML. et al., 1989, supra auf S. 451) angezeigt wird.
Die obigen Untersuchungen weisen darauf hin, dass CETP eine Hauptrolle bei der Überführung von Cholesterinestern aus HDL zu VLDL und LDL spielt, wobei sich das relative Profil zirkulierender Lipoproteine hin zu einem Profil verändert, das mit einem höheren Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbunden ist (d.h. niedrigere Konzentrationen an HDL-C und höhere Konzentrationen an VLDL-C und LDL-C). Marotti et al. (Nature, 364: 73–75 (1993)) interpretierten ihre Daten so als zeigten sie, dass eine CETP-induzierte Veränderung in der Cholesterinverteilung der Hauptgrund dafür war, dass sich Arterien-Läsionen bei transgenen, CETP exprimierenden Mäusen schneller entwickelten als bei nicht transgenen Kontrollmäusen, wenn beide Gruppen mit atherogener Nahrung gefüttert wurden.
Aus Humanplasma isoliertes CETP ist ein hydrophobes Glykoprotein mit 476 Aminosäuren und einem relativen Molekulargewicht von 66.000 bis 74.000 Dalton auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamid-Gelen (Albers, J.J. et al., Arteriosclerosis, 4: 49–58 (1984); Hester, C.B. et al., J. Biol. Chem., 262: 2275–2282 (1987); Jamagin, S.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:1854–1857 (1987)). Eine cDNA, die humanes CETP codiert ist geklont und sequenziert worden (Drayna, D. et al., Nature, 327: 632–634 (1987)). Es ist gezeigt worden, dass CETP Cholesterylester (CE), Triglyceride (TG), Phospholipide 5 (Barter, P.J. et al., J. Lipid Res., 27: 238–249 (1980)) und Lipoproteine (siehe z.B., Swenson, T.L. et al., J. Biol. Chem., 264: 14318–14326 (1989)) bindet. Vor kurzem ist gezeigt worden, das der durch die Carboxyl-terminalen 26 Aminosäuren und insbesondere die Aminosäuren 470 bis 475 definierte Abschnitt des CETP besonders wichtig für die Bindung neutraler Lipide ist, die beim Transfer neutraler Lipide eine Rolle spielen (Hesler, C.B. et al., J. Biol Chem., 263: 5020–5023 (1988)), jedoch nicht für die Bindung der Phospholipide (siehe Wang, S. et al., J. Biol. Chem., 267: 17487–17490 (1992); Wang, S. et al., J. Biol. Chem., 270: 612–618 (1995)).
Aus der laufenden Forschung folgt, dass sich bei höheren Niveaus der CETP-Aktivität ein höheres Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen vorhersagen lasst. Die endogene CETP-Aktivität stellt somit ein vielversprechendes therapeutisches Ziel zur Regulierung der relativen Konzentrationen von Lipoproteinen dar, um die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie der Arteriosklerose zu verhindern oder zu hemmen oder deren Rückentwicklung zu unterstützen.
Es wäre daher von Nutzen, Mittel und Verfahren zur Kontrolle und Regulierung der endogenen CETP-Aktivität zu entwickeln, um eine Herz-Kreislauf-Erkrankung zu verhindern oder zu behandeln. Vorzugsweise würde die Regulierung der endogenen CETP-Aktivität bei Mensch oder Tier erreicht, indem dem Subjekt eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, die für CETP spezifisch ist, keine großen Mengen erfordert, keine andauernde oder häufig wiederholte Dosierung erfordert und auch keine nachteiligen Nebenwirkungen hervorruft.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff beschrieben, der ein Plasmid-DNA-Molekül umfasst, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein immunogenes Fusions-Polypeptid codiert, welcher Impfstoff bei Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier die Produktion von spezifisch mit einem endogenen CETP des Subjekts reagierenden Autoantikörper induziert. Derartige Antikörper hemmen die endogene CETP-Aktivität oder entfernen das CETP aus dem Kreislauf (Clearance), fördern die Bildung und Beibehaltung eines antiatherogenen Profils von Lipoproteinen im Serum (beispielsweise höhere HDL-Konzentrationen und niedrigere LDL-Konzentrationen) und/oder hemmen die Ausbildung arteriosklerotischer Läsionen.
Das wie hier beschrieben auf einem Plasmid codierte immunogene Fusions-Polypeptid umfasst einen Abschnitt mit einem T-Zell-Epitop und einen Abschnitt mit einem B-Zell-Epitop. Ein auf dem erfindungsgemäßen Plasmid codierter Abschnitt mit einem T-Zell-Epitop umfasst ein nicht endogenes CETP-Protein oder Fragment desselben, welches ein breitbandiges oder "universelles" Helfer-T-Zell-Epitop enthält, das den Antigen präsentierenden Ort von multiplen (d.h. 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr) Haupt-Histokompatibilitäts (MHC)-Molekülen der Klasse II bindet und mit einem T-Zell-Antigen-Rezeptor einen Tertiärkomplex bilden kann, d.h. einen MHC:Antigen:T-Zell-Antigen-Rezeptor. Mit einem "nicht endogenen CETP-Protein" ist ein Protein gemeint, das das endogene CETP des Individuums ist, dem ein erfindungsgemäßes Plasmid verabreicht werden soll. Solche nicht endogenen CETP-Proteine oder Fragmente derselben, die als T-Zell-Epitop-Abschnitte des von dem erfindungsgemäßen Plasmid codierten immunogenen Fusions-Polypeptids von Nutzen sind, umfassen das Tetanus-Toxoid (insbesondere Peptide des Tetanus-Toxoids mit der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 2–15 der SEQ ID NO: 7 und der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10); das Diphtherie-Toxin insbesondere Peptide mit den Aminosäuresequenzen der Aminosäuren 271–290, 321–340, 331–350, 351–370, 411–430 und 431–450 der SEQ ID NO: 9); eine mit dem MHC der Klasse II assoziierte invariante Kette; das T-Zell-Epitop des Influenza-Hämagglutinins; das Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH); ein Protein aus bekannten Impfstoffen wie z.B. den Pertussisimpfstoff den Tuberkulose-Impfstoff des Bacillus Calmette-Guérin (BCG), den Polioimpfstoff den Impfstoff gegen Masern, den Impfstoff gegen Mumps, den Impfstoff gegen Röteln sowie gereinigte Proteinderivate des Tuberculin; und auch synthetische Peptide, welche den Antigen präsentierenden Ort von multiplen Haupt-Histokompatibilitäts-Molekülen der Klasse II binden, so wie solche, welche die von Alexander et al. (Immunity. 1: 751–761 (1994)) beschriebenen natürlichen Aminosäuren enthalten. Wird der T-Zell-Epitopabschnitt an einen CETP-B-Zellabschnitt angeheftet, setzt er das immunogene Fusions-Polypeptid in die Lage, die Toleranz zu durchbrechen, damit Antikörper produziert werden können, welche mit dem endogenen CETP reagieren. Mit "Durchbrechen der Toleranz" ist gemeint, dass ein Organismus dazu veranlasst wird, eine Immunantwort gegen ein Protein wie z.B. das endogene CETP aufzubauen, welches der Organismus normalerweise nicht für immunogen hält.
Der B-Zell-Epitop-Abschnitt eines immunogenen auf einem erfindungsgemäßen Plasmid codierten Fusions-Polypeptids umfasst die Aminosäuresequenz des endogenen CETP oder eines Fragments desselben von der gleichen Spezies wie das Individuum, dem das Plasmid verabreicht wird; das CETP oder ein Fragment desselben von einer sich von dem Individuum unterscheidenden Spezies, an welches das Plasmid verabreicht wird; oder eine synthetische Aminosäuresequenz, welche Antikörper hervorruft, die sich an das endogene CETP binden. Ein derartiger B-Zell-Epitop-Abschnitt, der in dem auf einem Plasmid basierenden Impfstoff der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, wird von einer DNA-Sequenz von mindestens 15 Nucleotiden Länge codiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthält ein DNA-Plasmid eine strukturelle codierende Sequenz für ein immunogenes Fusions-Polypeptid, wobei die strukturelle codierende Sequenz eine DNA-Sequenz umfasst, welche ein Tetanus-Toxoid-Polypeptid (wie z.B. die Nucleotide 13–54 der SEQ ID NO: 5) als den T-Zell-Epitop-Abschnitt codiert, der im gleichen Leseraster an DNA-Sequenzen (wie z.B. die Nucleotide 55–159 der SEQ ID NO: 5) gebunden ist, welche die Aminosäuren 350–368 und 481–496 der Aminosäuresequenz des CETP von reifen Kaninchen (SEQ ID NO: 2) als den B-Zell-Epitop-Abschnitt codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert ein erfindungsgemäßes DNA-Plasmid eine strukturelle codierende Sequenz für ein immunogenes Fusions-Polypeptid, wobei die strukturelle codierende Sequenz eine DNA-Sequenz umfasst, welche ein Tetanus-Toxoid-Polypeptid (wie z.B. in den Nucleotiden 13–54 der SEQ ID NO: 5) als den T-Zell-Epitop-Abschnitt des immunogenen Fusions-Polypeptids codiert, der im gleichen Leseraster an DNA-Sequenzen (wie z.B. die Nucleotide 1045–1101 und 1381–1428 der SEQ ID NO: 3) gebunden ist, welche die Aminosäuren 349–367 bzw. 461–476 der Aminosäuresequenz des CETP eines erwachsenen Menschen (SEQ ID NO: 4) als den B-Zell-Epitop-Abschnitt des immunogenen Fusions-Polypeptids codiert.
Die immunogenen Fusions-Polypeptide der Erfindung werden von den erfindungsgemäßen Plasmiden mit ausreichender Konzentration und über einen ausreichenden Zeitraum exprimiert, um die Produktion von Autoantikörpern anzuregen, die spezifisch mit dem endogenen CETP reagieren und dazu dienen, die CETP-vermittelte Atherogenese zu reduzieren oder zu hemmen, wie sich dies durch ein antiatherogenes Profil der Lipoproteine im Serum und/oder eine Hemmung bei der Ausbildung von arteriosklerotischen Läsionen zu erkennen gibt.
Die Expression des immunogenen Fusionsproteins wird von einer Promotor- oder Promotor/Enhancer-Sequenz gesteuert, welche die Transkription in Säugerzellen, insbesondere in den Zellen des Skelettmuskels wirksam steuern kann. Solche Promotor/Enhancer-Sequenzen sind, jedoch nicht ausschließlich, die Promotor/Enhancer-Sequenz des humanen Cytomegalovirus (CMV), die Promotor/Enhancer-Sequenz des Adenovirus und die Promotor/Enhancer-Sequenz des β-Actins.
Zusätzlich kann ein Plasmid dieser Erfindung eine Amino-terminale Signalsequenz für die Sekretion codieren oder nicht codieren, die mit dem immunogenen Fusionsprotein verbunden ist. Ein Plasmid dieser Erfindung codiert vorzugsweise ein immunogenes Fusions-Polypeptid, das keine Amino-terminale Signalsequenz für die Sekretion enthält.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Plasmid dieser Erfindung auch eine 3' zu der strukturellen codierenden Sequenz des immunogenen Fusions-Polypeptids gelegene Poly-A-Signalsequenz.
Somit besteht ein bevorzugtes Plasmid dieser Erfindung im Wesentlichen aus einer Promotor/Enhancer-Sequenz, die funktionsfähig mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, welche ein immunogenes Fusions. Polypeptid mit einem T-Zell-Epitop-Abschnitt und einem B-Zell-Epitop-Abschnitt codiert, welches ein Individuum, welches das Plasmid empfängt, dazu veranlasst, eine Immunantwort aufzubauen, die zur Hemmung der Aktivität von endogenem CETP führt.
Die DNA-Plasmide der Erfindung können mit jedem Mittel verabreicht werden, das normalerweise bei der Verabreichung von auf einem Plasmid basierenden Impfstoffen an Mensch oder Tier Verwendung findet, vorausgesetzt, die Verabreichungsart führt zur Expression des immunogenen Fusions-Polypeptids und zur Produktion von Antikörpern, die spezifisch mit dem endogenen CETP reagieren (d.h. sich daran binden). Vorzugsweise werden die DNA-Plasmide intramuskulär oder intrakutan verabreicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Konstruktion des Plasmids pCMV-LUC zeigt, das ein Luciferase-Gen enthält, dessen Transkription unter Kontrolle eines CMV-Promotors und -Enhancers steht.
2 ist ein Balkendiagramm, das die Luciferase-Aktivität zeigt, die zu verschiedenen Zeitpunkten in Quadrizeps-Homogenaten aus Mäusen gemessen wurden, denen Plasmid-Konstrukte mit dem Luciferase-Gen unter der Transkriptionskontrolle der drei unterschiedlichen Promotoren CMV, β-Actin und Adenovirus intramuskulär injiziert worden waren. Die Homogenate wurden aus dem Quadrizeps von Mäusen an den Tagen 2, 32 oder 132 nach der Injektion der Plasmidkonstrukte gewonnen. Die "PBS-Kontrolle" bezieht sich auf Homogenate, die aus Kontrollmäusen an den Tagen 2, 32 oder 132 nach der Injektion mit steriler phosphatgepufferter Saline (PBS) gewonnen wurden.
3 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Produktion des Anti-Luciferase-Antikörpers in intramuskulär mit dem Plasmid pCMV-LUC injizierten Mäusen in Blutplasmaproben, die aus Mäusen 31 und 45 Tage nach der Immunisierung erhalten wurden.
4 ist ein Diagramm, das den Aufbau des auf einem Plamid basierenden Impfstoffs pCMV-CETP/TT zeigt.
5 zeigt die Nucleotidsequenz eines DNA-Inserts, das ein Tetanus-Toxoid-Fragment und zwei CETP B-Zell-Isotope als Fusions-Polypeptid codiert, das unter der Kontrolle des CMV-Promotor/Enhancers in das Plasmid pCMV-CETP/TT insertiert wurde. Die entsprechende Einzelbuchstaben-Abkürzung der Aminosäuresequenz für das codierte immunogene Fusions-Polypeptid sowie die Lage der Spaltstellen mit der NotI-Restriktionsendonuclease in dem DNA-Insert sind ebenfalls angegeben.
6 zeigt einen Auszug des Tagesablaufs, der für die Untersuchung des auf einem Plasmid basierenden Impfstoffs pCMV-CETP/TT in den Kaninchen #1–#8 und #10–#14 (angegeben als Zahlen am Kopf der Tabellenspalten) unter unterschiedlichen Ernährungsbedingungen verwendet wurde. Der Tag, an dem ein besonderer Schritt (Zeile) des Ablaufs an einem besonderen Kaninchen (Spalte) durchgeführt wurde ist in jedem Kästchen angegeben. Die Kaninchen #1–#8 wurden mit 50 μg pCMV-CETP/TT als auf einem Plasmid basierender CETP-Impfstoff und mit 50 μg pCMV-LUC als innere Kontrolle uns als Referenz an den angegebenen Tagen injiziert (siehe Zeilen mit dem Vermerk "CETP-Impfstoff'). Die erste Injektion des Plasmids bei den Kaninchen #1–#8 fand am Tag 0 statt. Die Kaninchen #10–#14 waren Kontrollkaninchen, die keines der Plasmide erhielten (Tiere für negative Kontrolle). Die Kästchen in den Zeilen mit der Bezeichnung "Pre 1 ", "Pre 2" oder "Pre 3" geben die Tage an (bezeichnet als fette negative Zahlen in Klammern), an denen die Blutproben ("Prebleeds") aus den Kaninchen vor der ersten Verabreichung des Plasmids erhalten wurden. "Pre 3" gibt auch an, dass die Blutproben am selben Tag wie die erste Injektion und vor der ersten Injektion der Plasmide pCMV-CETP/TT und pCMV-CETP/TT-DNA in die Kaninchen #1–#8 entnommen wurden. Die Kästchen in den Zeilen mit der Bezeichnung "BLEED 1"–"BLEED 12" geben die Tage (fett) an, an denen die Blutproben aus den Kaninchen nach der ersten Injektion der Plasmid-DNA in die Kaninchen #1–#8 am Tag 0 erhalten wurden. Die Kästchen in den Zeilen mit der Bezeichnung "Tetanus" geben den Tag an, an welchem ein Kaninchen eine intramuskuläre Injektion eines Depot-Impfstoffpräparats des Tetanus-Toxoids erhielt. Die Kästchen in den Zeilen mit der Bezeichnung "0,25% Chol." und "0,5% Chol." geben den Tag an, an welchem ein besonderes Kaninchen auf Kaninchendiät gesetzt wurde, die mit 0,25% (w/w) Cholesterin bzw. mit 0,5% (w/w) Cholesterin supplemetiert worden war. Die Kästchen mit einem "X" geben an, dass ein besonderes Kaninchen entweder nicht in dem durch die Zeile bezeichneten besonderen Ablaufschritt vorkam oder dass da Tier getötet worden war. Die Kästchen in der Zeile mit der Bezeichnung "Termination" geben den Tag an, an welchem das jeweilige Kaninchen getötet worden ist.
7 ist ein Histogramm, welches die Expression der Luciferase in den Gewebshomogenaten zeigt, die aus den ungefähren Bereichen von jeder der drei Stellen im Quadrizeps des Kaninchens entnommen wurden, die sowohl mit pCMV-LUC- als auch pCMV-CETP/TT-Plasmiden injiziert worden waren. Die Luciferase-Aktivität ist in Counts pro Sekunde angegeben. "Normal-Kaninchen" bezieht sich auf die Luciferase-Aktivität in einem Gewebshomogenat, das aus einem normalen Kontrollkaninchen entnommen worden war, das keines der Plasmide erhielt. "Kaninchen 8" bezieht sich auf Gewebshomogenate, die aus den ungefähren Injektionsstellen der Plasmide pCMV-LUC und pCMV-CETP/TT in den Quadrizeps des Kaninchens #8 gewonnen wurden, das 48 Stunden nach der Injektion mit den Plasmiden am Tag 0 getötet wurde. "Kaninchen 7" bezieht sich auf Gewebshomogenate, die aus den ungefähren Injektionsstellen der Plasmide pCMV-LUC und pCMV-CETP/TT in den Quadrizeps des Kaninchens #7 gewonnen wurden, das 48 Stunden nach Erhalt einer zweiten Injektion (Boost) der Plasmide pCMV-LUC und pCMV-CETP/TT am Tag 28 getötet wurde.
8 ist eine graphische Darstellung, die den ELISA-Nachweis von Anti-Kaninchen-CETP_477-496-Antikörpern in Plasma zeigt, welches am Tag 57 aus 6 Kaninchen (Kaninchen #1–#6) entnommen wurde, die mit dem Plasmid pMCV-CETP/TT geimpft worden waren. Es wurde das Plasma von Kaninchen #1 (gefülltes Quadrat), Kaninchen #2 (gefüllter Kreis), Kaninchen #3 (gefülltes Dreieck), Kaninchen #4 (leeres Dreieck), Kaninchen #5 (leerer Kreis) und Kaninchen #6 (Kreuz) untersucht. "NRP" betrifft ein Plasma, das einem Kontrollkaninchen entnommen wurde, welches weder mit dem Plasmid pMCV-LUC noch mit dem Plasmid pMCV-CETP/TT injiziert worden war (leeres Quadrat).
9 ist eine graphische Darstellung, welche den Nachweis von Anti-Kaninchen-CETP_477-496-Antikörpern in Plasma zeigt, welches am Tag 220 aus 4 Kaninchen entnommen wurde, die mit dem Plasmid pMCV-CETP/TT geimpft worden waren. Es wurde das Plasma aus Kaninchen #2 (gefüllter Kreis), Kaninchen #3 (gefülltes Dreieck), Kaninchen #5 (leerer Kreis) und Kaninchen #6 (Kreuz) untersucht. "NRP" betrifft ein Plasma, das einem Kontrollkaninchen entnommen wurde, welches nicht mit dem Plasmid pMCV-LUC und dem Plasmid pMCV-CETP/TT injiziert worden war (leeres Quadrat).
10 ist eine graphische Darstellung, welche die Konzentration (μg/ml) von Anti-CETP477-496-Antikörpern in Proben von Kaninchenplasma zeigt, die wie in 6 beschrieben entnommen wurden. Es wurde das Plasma von Kaninchen #1 (gefülltes Quadrat), Kaninchen #2 (gefüllter Kreis), Kaninchen #3 (gefülltes Dreieck), Kaninchen #4 (leeres Dreieck), Kaninchen #5 (leerer Kreis) und Kaninchen #6 (Kreuz) untersucht.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Strategie zur Hemmung oder Verhinderung einer Herz-Kreislauf-Erkrankung wie Arteriosklerose zur Verfügung, indem die CETP-Aktivität entweder durch Hemmung der CETP-Aktivität durch Bindung von Antikörpern oder durch Entfernen der CETP-Aktivität aus Kreislaufsystem (oder beiden) moduliert wird. Die Modulation der endogenen CETP-Aktivität erfolgt durch Einsatz eines auf einem Plasmid basierenden Impfstoffs. Die hier beschriebenen DNA-Plasmide codieren immunogene Fusions-Polypeptide, welche bei einer in vivo-Expression die Produktion von Autoantikörpern anregen, um die zirkulierende endogene CETP-Aktivität zu hemmen und/oder zu beseitigen. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Immunisierung eines Vertebraten wie z.B. eines Menschen zur Verfügung, um eine Antikörperreaktion gegen dessen Endogene CETP auszulösen und dadurch die CETP-Aktivität zu modulieren.
Die verschiedenen Bezeichnungen für Lipide, Lipoproteine und Apolipoproteine, auf die weiter unten Bezug genommen wird, sind die gleichen wie oben im "Hintergrund" beschrieben. Wie oben angegeben, spielt CETP beim Transport und der Verteilung von CE und TG zwischen den Lipoproteinen HDL und LDL eine bedeutende Rolle. Eine gesenkte CETP-Aktivität ruft ein nicht atherogenes Lipoprotein-Profil hervor oder verringert die Entstehung einer Arteriosklerose (siehe z.B.;, Mabuchi et al., Acad. Sci., 748: 333–341 (1995); Inazu et al., New Eng. J. Med., 323: 1234–1238 (1990); Gaynor et al., Artherosclerosis, 220: 101–109 (1994); Whitlock et al., J. Clin. Invest., 84: 129–137 (1989)). Umgekehrt ruft eine erhöhte CETP-Aktivität ein atherogenes Lipoprotein-Profil hervor und induziert Arteriosklerose. Die Überexpression von CETP in transgenen Mäusen senkt die HDL-Konzentrationen und beschleunigt die Arteriosklerose (Agellon et al., J. Biol. Chem., 266: 10796–10801 (1991); Marotti et al., Nature, 364: 73–75 (1993)) und die Verabreichung von CETP an Versuchstiere kann zu erhöhten Konzentrationen von VLDL-C und LDL-C und einer relativen Abnahme der Konzentration von HDL-C führen (Groener et al., Biochim. Biophys. Acta, 1002: 93–100 (1989); Ha et al., Biochim. Biophys. Acta, 833: 203–210 (1985)). Somit stellt die Hemmung der CETP-Aktivität ein erwünschtes klinisches Ergebnis dar, das bei der Verhinderung einer Arteriosklerose hilfreich ist und die Hemmung der CETP-Aktivität ist eine passende Strategie, um einen mit der Verhinderung und Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen einhergehenden physiologischen Zustand zu begünstigen.
In der hier beschriebenen Erfindung werden auf einem Plasmid basierende Impfstoffe zur Verfügung gestellt, um gegen endogene CETP gerichtete Autoantikörper zu produzieren. Speziell werden DNA-Plasmide beschrieben, die an ein Individuum verabreicht werden (z.B. durch intramuskuläre Injektion oder intradermale ballistische Verabreichung). Die verabreichten DNA-Plasmide codieren und lenken die Produktion von immunogenen Fusions- Polypeptiden, die ein oder mehrere Breitband oder "Universal"-Helfer-T-Zell-Epitope und auch eines oder mehrere B-Zell-Epitope des CETP aufweisen. Solche immunogenen Polypeptide lösen die Produktion von Autoantikörpern aus, die spezifisch mit dem CETP im Individuum (endogenes CETP) reagieren (d.h. sich daran binden). Die Produktion von Anti-CETP-Antikörpern begünstigt einen mit einem abnehmenden Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen einhergehenden physiologischen Zustand. Die durch die DNA-Impfstoffe hervorgerufene günstige Modulation von CETP wird durch eine bedeutend verminderte oder eliminierte CETP-Aktivität, durch ein antiatherogenes Lipoproteinprofil (z.B. eine erhöhte Konzentration von HDL oder HDL-C im Vergleich mit LDL, LDL-C, VLDL oder VLDL-C) oder durch eine Hemmung (einschließlich Verhinderung) oder Abnahme beim Entstehen von artriosklerotischen Läsionen im cardiovaskulären Gewebe wie der Aorta unter Beweis gestellt.
Entwurf eines DNA-Plasmid-Impfstoffs zur Modulation des endogenen CETP
Viele kleine Peptide werden nur antigen, wenn sie an größere immunogene Trägerproteine gekoppelt sind (siehe, Etlinger, Immunol. Today, 13, 52–55 (1992)). Das Trägerprotein stellt von den Helfer-T-Zellen erkannte Epitope zur Verfügung. Obwohl körpereigene Antigene wie z.B. B-Zell-Epitope von endogenen Proteinen im Allgemeinen nicht immunogen sind, gab es neue Hinweise, dass körpereigene Antigene immunogener gemacht werden können, indem sie an eines oder mehrere von Helfer-T-Zellen erkannte Epitope des Immunsystems des Wirts gebunden werden. Solche immunogenen Polypeptide, die ein oder mehrere Helfer-T-Zell-Epitope und B-Zell-Epitope eines besonderen endogenen Proteins enthalten, können die Produktion von Autoantikörpern auslösen, die spezifisch mit dem besonderen endogenen Protein reagieren. Beispielsweise ist ein Fragment des humanen Choriongonatropins (hCG) an Trägerproteine konjugiert worden, um einen Peptidimpfstoff zu produzieren, der mit hCG reaktive Autoantikörper hervorruft (siehe Ada, G.L., in Fundamental Immunology, 3. Ausgabe, W.E. Paul, Hrg. (Raven Press, Ltd, New York, 1993) SS. 1309–1352; Aitken et al., Brit. Med. Bull., 49: 88–99 (1993)). Dieser Peptidimpfstoff bestand aus einem Heterospezies-Dimeren der Alpha-Untereinheit des luteinisierenden Hormons des Schafes und der Beta-Untereinheit des hCG, das mit einem von zwei Trägerproteinen konjugiert war, dem Tetanus-Toxoid (TT) oder dem Diphterie-Toxoid (DT) (Talwar et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 8532–8536 (1994)). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ein Peptidimpfstoff mit dem C-terminalen Abschnitt des humanen CETP und einem T-Zell-Epitop aus dem Tetanus- Toxoid eine Anti-CETP-Antikörperantwort auslöst und die CETP-Aktivität in Kaninchen ändert, wie dies in der gemeinsamen, anhängigen, am 1. Mai 1995 eingereichten US-Anmeldung 08/432,483 beschrieben ist.
Breitband-T-Zell-Epitope
Die hier beschriebenen DNA-Plamide umfassen eine DNA-Sequenz, die ein immunogenes Fusions-Polypeptid mit einem T-Zell-Epitop-Abschnitt und einem B-Zell-Epitop-Abschnitt umfasst. Der auf einem Plasmid dieser Erfindung codierte Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt (oder einfach "T-Zell-Epitop-Abschnitt") umfasst ein nicht endogenes CETP-Protein oder ein Fragment davon, das ein "universelles" oder "Breitband"-T-Zell-Epitop enthält, welches sich an Antigen präsentierende Stellen von multiplen (zwei oder mehr) Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Molekülen der Klasse II bindet und mit einem T-Zell-Antigen-Rezeptor einen tertiären Komplex bilden kann, d.h. MHC:Antigen:T-Zell-Antigen-Rezeptor, welcher die funktionelle Einheit der T-Zell-Epitop-Erkennung darstellt. Somit binden sich die "universellen" oder Breitband-T-Zell-Epitope, die in dieser Erfindung von Nutzen sind, an die Antigen präsentierende Stelle der multiplen MHC-Moleküle der Klasse II und dienen dazu, Helfer-T-Zellen zu aktivieren, die ihrerseits das B-Zell-Wachstum und die Differenzierung stimulieren, was zur Ausscheidung spezifischer Antikörper führt. Ein von einem Plasmid dieser Erfindung codiertes universelles oder Breitband-T-Zell-Epitop bindet sich vorzugsweise an die Antigen präsentierende Stelle von drei oder mehr unterschiedlichen MHC-Molekülen der Klasse II, wie z.B. die drei in der menschlichen Bevölkerung gefundenen allelischen MHC-Moleküle der Klasse II. Mehr bevorzugt bindet sich ein von einem Plasmid dieser Erfindung codiertes universelles oder Breitband-T-Zell-Epitop an die Antigen präsentierende Stelle von vier oder mehr unterschiedlichen MHC-Molekülen der Klasse II. Am meisten bevorzugt bindet sich ein von einem Plasmid dieser Erfindung codiertes universelles oder Breitband-T-Zell-Epitop an sechs unterschiedliche MHC-Moleküle der Klasse II.
Antigene Breitband-Helfer-T-Zell-Epitope sind im Stand der Technik bekannt. Diese umfassen z.B. die Epitope des Tetanus-Toxoids (TT) oder Diphtherie-Toxoids (DT) (siehe z.B. Panina-Bordignon, P., et al., Eur. J. Immunol., 19: 2237–2242 (1989) (Charakterisierung von universellen Tetanus-Toxoid-Helfer-T-Zell-Epitop-Peptiden); Etlinger, H., Immunol. Today, 13: 52–55 (1992); Valmori, D., et al., J. Immunol., 149: 717– 721 (1992) (Verwendung von universellen TT-Epitopen in in engerer Wahl stehenden Antimalaria-Impfstoffen); Raju et al., Eur. J. Immunol. 25: 3207–3214 0995) (Breitband-T-Zell-Epitope des DT); Talwar, G.P. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.. USA, 91: 8532–8536 (1994) (Verwendung von TT und TT als universelle Epitope in einem Anti-human-Choriongonadotropin-Impfstoff); Talwar, G.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532–8536 (1994)).
Zusätzlich zu TT und GT umfassen andere in dieser Erfindung nützliche Breitband- oder universelle Helfer-T-Zell-Epitope die universellen sich an MHC der Klasse II bindenden T-Zell-Epitope: HA des Influenza-Hämagglutinins, HBVnc und MT wie bei Alexander et al. (Immunity, 1: 751–761 (1994)) beschrieben. Noch andere T-Zell-Epitope, die von den Plasmiden dieser Erfindung codiert werden können sind solche Polypeptide, die von antigenen Protein herrühren, welche vom Pertussisimpfstoff, dem Bacillus Calmette-Guérin (BCG), dem Polioimpfstoff, dem Impfstoff gegen Masern, dem Impfstoff gegen Mumps, dem Impfstoff gegen Röteln sowie von gereinigten Proteinderivaten des Tuberculins stammen (siehe z.B. Etlinger, Immunol. Today, 13, 52–55 (1992)). Es können auch synthetische Sequenzen, d.h. solche, die nicht von einem natürlich vorkommenden Organismus stammen, verwendet werden. Beispiele für synthetische Breitband-T-Zell-Epitope werden in Alexander et al. (Immunity, 1: 751–761 (1994)) beschrieben.
Plasmide dieser Erfindung können verschiedene nicht endogene CETP-Proteine oder Fragmente derselben codieren, wie z.B. das Tetanus-Toxoid, insbesondere die Peptide des Tetanus-Toxoids mit den Aminosäuresequenzen der Aminosäuren 2–15 der SEQ ID NO: 7 (eine entsprechende Nucleotid codierende Sequenz stellen die Aminosäuren 13–54 der SEQ ID NO: 5 dar) und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10. Eine andere Quelle für universelle oder Breitband-T-Zell-Epitope, die in den Plasmiden dieser Erfindung von Nutzen sind, ist das Diphtherie-Toxin, insbesondere die Peptide mit den Aminosäuresequenzen der Aminosäuren 271–290, 321–340, 331–350, 351–370, 411–430 und 431–450 der SEQ ID NO: 9. Ein Beispiel für entsprechende Nucleotidsequenzen, welche diese Breitband-T-Zell-Epitope aus dem Diphtherie-Toxin codieren, sind die Nucleotide 811–870, 961–1020, 991–1050, 1051–1110, 1231–1290 bzw. 1291–1350 der SEQ ID NO: 8. Andere Quellen für universelle oder Breitband-T-Zell-Epitope, die auf Plasmiden dieser Erfindung codiert werden können sind, jedoch nicht ausschließlich, eine mit dem MHC der Klasse II assoziierte Invariante Kette; Hämagglutinin; das Hämocyanin der Schlüssellochschnecke (KLH); ein Protein aus bekannten Impfstoffen wie z.B. dem Pertussisimpfstoff, dem Tuberkulose-Impfstoff des Bacillus Calmette-Guérin (BCG), dem Polioimpfstoff, dem Impfstoff gegen Masern, dem Impfstoff gegen Mumps, dem Impfstoff gegen Röteln sowie gereinigte Proteinderivate (PPD) des Tuberculins; und auch synthetische Peptide, welche von Alexander et al. (Immunity. 1: 751–761 (1994)) beschriebenen werden.
Ferner lassen sich zwei oder mehrere Kopien einer DNA, die das gleiche oder verschiedene unterschiedliche Universal-Helfer-T-Zell-Epitope codieren, miteinander verbinden, um multiple oder multivalente Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitte der Impfstoffpeptide dieser Erfindung zu bilden. Ein Plasmid dieser Erfindung kann beispielsweise DNA-Segmente enthalten, die einen multiplen oder multivalenten Helfer-T-Zell-Epitop-Abschnitt mit einer Aminosäuresequenz eines TT-Helfer-T-Zell-Epitops und eines DT-Helfer-T-Zell-Epitops codieren. Der T-Zell-Epitop-Abschnitt des DNA-Impfstoffs kann zusammenhängend sein oder unterbrochene, im richtigen Leseraster angeordnete Segmente aufweisen, die den B-Zell-Epitop-Abschnitt oder (vorzugsweise nicht antigene) Segmente codieren, welche die T- und/oder B-Zell-Epitope miteinander verbinden.
Eine große Zahl möglicher T-Zell-Epitope könnte als T-Zell-Epitop-Abschnitt eines auf einem Plasmid dieser Erfindung codierten immunogenen Fusions-Polypeptids verwendet werden. Es kann eine Routinemethodik eingesetzt werden, um solche zusätzlichen Breitband-T-Zell-Epitope zu identifizieren, die sich an die Antigen präsentierenden Zellen vom multiplen MHC-Molekülen der Klasse II binden (z.B. Raju et al., Eur. J. Immunol 25: 3207–3214 (1995)). Mit dieser Methodik werden Breitband-T-Zell-Epitope identifiziert, indem zuerst peripheres Blut von Individuen erhalten wird, die vor kurzem mit einem in Frage kommenden Protein immunisiert worden sind, d.h. dem Protein, aus welchem das 7-Zell-Epitop stammt. Alternativ lässt sich Blut von Individuen einsetzen, die vor kurzem nicht immunisiert wurden. T-Zellen aus solchen Individuen müssen jedoch mit dem in Frage kommenden Protein in vitro stimuliert werden, um die Zahl der für das in Frage kommende Protein spezifischen T-Zellen zu erhöhen. Es ist nicht nötig, dass man die Identität eines solchen in Frage kommenden Proteins kennt, um ein T-Zell-Epitop zu erhalten, das in dieser Erfindung von Nutzen ist. Es genügt, dass man ein Protein isolieren und reinigen kann, z.B. mittels Extraktion einer Bande des Proteins aus einem Polyacrylamid-Gel nach einer Elektrophorese. Die Peptide eines in Frage kommenden Proteins werden z.B. durch begrenzte Proteolyse gewonnen oder falls die Aminosäuresequenz des Proteins bekannt ist, durch mit Standardverfahren durchgeführte Synthese von überlappenden Polypeptiden mit einer Länge von mindestens fünf und vorzugsweise etwa 20 Aminosäuren. Eine bevorzugte Gruppe von Individuen, die für diese Methodik als Quelle für peripheres Blut herangezogen wird, ist eine Gruppe von Individuen, die vor kurzem mit einem prophylaktischen Impfstoff, wie z.B. einem Tetanus-, Diphtherie- oder Influenzaimpfstoff immunisiert worden war, welche eines oder mehrere Proteine enthalten, die als das in Frage kommende Protein ausgewählt werden können, um ein nützliches T-Zell-Epitop zu erhalten. Jedes Peptid aus dem in Frage kommenden Protein wird einzeln zusammen mit Lymphocyten aus peripherem Blut kultiviert, die aus dem peripheren Blut von jedem Individuum aus dieser Gruppe isoliert wurden. Die Antigen präsentierenden Zellen in jeder Kultur binden bestimmte Peptide an ihre MHC-Moleküle der Klasse II und zeigen diese auf ihrer Zelloberfläche. Die CD4+-Zellen in der Kultur binden eine Teilmenge dieser an MHC der Klasse Π gebundenen Peptide und bilden folglich den tertiären Komplex MHC:T-Zell-Epitop:T-Zell-Antigen-Rezeptor, der notwendig ist, um die T-Zellen zu aktivieren und die Proliferation zu induzieren. Die Proliferation wird durch Standardeinbau von ³H-Thymidin in die DNA nachgewiesen. Kulturen, die in diesem Assay eine Proliferation zeigen, weisen darauf hin, dass das zusammen mit den Zellen kultivierte Peptid ein Helfer-T-Zell-Epitop enthielt. Ein Peptid, das die Proliferation von Lymphocyten aus peripherem Blut von multiplen Individuen stimuliert ist ein in Frage kommendes Breitband-T-Zell-Epitop, das in dieser Erfindung von Nutzen ist. Die Aminosäuresequenz eines solchen Peptids lässt sich mit Hilfe einer Standard-Aminosäuresequenzanalyse ermitteln. Es wird das das Peptid codierende DNA-Molekül hergestellt, welches das Peptid codiert. Falls ein das Peptid codierendes DNA-Molekül nicht bereits verfügbar ist, kann eine DNA-Sequenz unter Verwendung des genetischen Codes abgeleitet werden und ein DNA-Molekül mit einer das Peptid codierenden Nucleotidsequenz lässt sich mit Standard-DNA-Syntheseverfahren synthetisieren oder von einem kommerziellen Anbieter erwerben. Das DNA-Molekül wird sodann im gleichen Leseraster wie die den B-Zell-Epitop-Abschnitt des immunogenen Fusions-Proteins codierende Sequenz auf einem Plasmid dieser Erfindung insertiert (siehe unten).
B-Zell-Epitope des CETP
Der B-Zell-Epitop-Abschnitt des von den DNA-Plasmiden dieser Erfindung codierten immunogenen Fusionspeptids umfasst mindestens ein B-Zell-Epitop des CETP, vorzugsweise das endogene CETP des zu immunisierenden Vertebraten. Der Einsatz von mindestens zwei B-Zell-Epitopen ist erwünscht und bevorzugt, weil er die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die verschiedenen in Reaktion auf die Expression des DNA-Impfstoffs in vivo produzierten Autoantikörper in der Lage sind, sich mindestens an zwei verschiedene Epitope auf jedem CETP-Molekül zu binden und dadurch die Bildung eines Immunkomplexes begünstigen, welcher zu einer wirksamen Beseitigung der CETP-Proteinmoleküle aus dem Kreislauf führt.
B-Zell-Epitope, die in dieser Erfindung von Nutzen sind, können 5 bis 8 aufeinander folgende Aminsosäurereste aus der gesamten Aminosäuresequenz des CETP sein. Die hier beschriebenen DNA-Plasmide enthalten eine DNA-Sequenz, welche einen CETP-B-Zell-Epitop-Abschnitt von einer Länge von mindestens 15 und vorzugsweise von 30–48 Nucleotiden codiert. Bevorzugte B-Zell-Epitope des CETP für die Verwendung in Impfstoffen für den Menschen werden einzeln von einer Sequenz von mindestens 15 Nucleotiden der CETP codierenden Sequenz codiert (siehe z.B. SEQ ID NO: 1, welche reifes CETP (Kaninchen) codiert; SEQ ID NO: 3, welche reifes CETP (Menschen) codiert) oder von degenerierten Sequenzen derselben, die das gleiche Epitop codieren. Es ist anzumerken, dass Allele des CETP-Gens von Kaninchen entdeckt worden sind und folglich auch für das menschliche Gen zu erwarten sind (sec, Nagashima et al, J. Lipid Res., 29: 1643–1649 (1988); Kotake et al., J. Lipid Res. 37: 599–605 (1996)). Die B-Zell-Epitope können sequentiell vorliegen oder in voneinander getrennten im Leseraster angeordneten Segmenten, die das oder die T-Zell-Epitop(e) oder (vorzugsweise nicht antigenen) Verbindungspeptide aus einer oder mehreren Aminosäuren codieren. Natürlich hängt die aktuelle Länge für die den B-Zell-Epitop-Abschnitt codierende DNA-Sequenz von der Länge der aus dem CETP ausgesuchten besonderen B-Zell-Epitope ab.
Obwohl die den B-Zell-Epitop-Abschnitt des immunogenen Fusions-Polypeptids codierende DNA-Sequenz zwei oder mehr B-Zell-Epitope des CETP codieren kann, gibt es einige Gründe, warum die DNA-Sequenz nicht die gesamte Aminosäuresequenz des reifen zirkulierenden CETP codieren sollte. Indem z.B. eine weniger als die CETP-Gesamtstruktur codierende Sequenz verwendet wird, wird die Wahrscheinlichkeit dafür eingeschränkt, dass Antikörper produziert werden, die mit anderen körpereigenen Proteinen eine Kreuzreaktion eingehen könnten. Darüber hinaus stellt der Einsatz einer weniger als die CETP-Gesamtstruktur codierenden Sequenz einen Weg dar, die Produktion potentiell funktioneller Proteine oder Fragmente zu vermeiden, d.h., welche über eine CE- und/oder TG-Aktivität verfügen würden und dadurch die gesamte CETP-Aktivität im geimpften Individuum erhöhen würden. Der Einsatz von weniger als der das Gesamt-CETP codierenden Sequenz vermindert auch die Chance, dass zellvermittelte Autoimmunreaktionen ausgelöst werden. Ob ein Abschnitt einer CETP oder selbst ein besonderes CETP-B-Zell-Epitop auch ein T-Zell-Epitop enthält lässt sich leicht ermitteln, indem das B-Zell-Epitop oder der CETP-Abschnitt in einem cytotoxischen T-Zell- oder Proliferationsassay untersucht wird (siehe z.B. Current Protocols in Immunology, (Coligan et al., Hrg.) (John Wiley & Sons, New York, 1994) SS. 3.11.4–3.11.7 und 3.12.9–3.12.14).
Die Carboxyl-terminalen 26 Aminosäuren des humanen CETP spielen bei der Transfer-Aktivität von neutralen Lipiden eine Rolle (Swenson et al., J. Biol. Chem., 264: 14318–14326 (1989)). Insbesondere ist eine Sequenz von 13 Aminosäuren (Phe-463 bis Leu-475 in humanem CETP, SEQ ID NO: 4; die Aminosäuren Phe-483 bis Leu-495 in Kaninchen-CETP, SEQ ID NO: 2) und auch möglicherweise Asp-460 (Mensch) (Asp-480, Kaninchen) besonders wichtig für die Bindungs- und Transfer-Aktivität (Wang et al., J. Biol. Chem., 268: 1955–1959 (268); Wang et al., J. Biol Chem., 267: 17487–17490 (1992)). Es ist bereits gezeigt worden, dass dieser Abschnitt als B-Zell-Epitop des CETP immunogen ist, und von einem gegen diesen Abschnitt gerichteten monoklonalen Antikörper (TP2) ist gezeigt worden, dass er den Transfer neutraler Lipide hemmt. Demgemäß umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform ein als ein für den Menschen nützlicher DNA-Impfstoff verwendetes Plasmid eine DNA-Sequenz, welche das durch die Aminosäuresequenz von Phe-561 bis Ser-476 oder Phe-463 bis Leu-475 des reifen humanen CETP (siehe SEQ ID NO: 4) definierte CETP-B-Zell-Epitop codiert.
Eine ein zweites B-Zell-Epitop des CETP codierende DNA-Sequenz wird durch die Aminosäuresequenz Leu-349 bis Ile-367 des menschlichen CETP (SEQ ID NO: 4) definiert (entsprechend der Aminosäuresequenz Arg-350 bis Ile-368 der SEQ ID NO: 2 beim Kaninchen). In bevorzugten Ausführungsformen ist diese dieses Epitop codierende DNA in der strukturellen codierenden Sequenz des immunogenen Polypeptids enthalten, um eine zweite Antikörper-Spezies zu produzieren, die in vivo für ein zweites CETP-Epitop spezifisch ist. Mit Antikörpern gegen ein zweites Epitop ließen sich Immunkomplexe bilden, bei denen das CETP eine Rolle spielt, und folglich die Beseitigung (Clearance) des komplexierten CETP günstig beeinflussen. Dieses Peptid wurde für seine potentielle Antigenizität und die große Möglichkeit für eine Oberflächenexpression von nativem CETP ausgewählt.
Andere geeignete B-Zell-Epitope könnten z.B. auf Grundlage zuvor definierter Bindungsstellen für Antikörper ausgewählt werden (siehe z.B. Roy et al., Lipid Res., 37: 22–34 (1996)) oder durch Analyse der Aminosäuresequenz für Strukturen mit einer Neigung für eine Antikörper-Erkennung.
Kontrollsequenzen der Replikation und Transkription
Die DNA-Plasmide dieser Erfindung müssen die DNA-Sequenzen enthalten, die dafür notwendig sind, damit ein ausreichendes Ausmaß für die in vivo-Expression des codierten immunogenen Fusions-Polypeptids erzielt wird, um die Produktion von gegen endogenes CETP reagierenden Autoantikörpern auszulösen. Somit umfasst das erfindungsgemäße DNA-Plasmid die strukturelle codierende Sequenz für ein immunogenes Fusions-Polypeptid mit einer DNA-Sequenz für mindestens ein T-Zell-Epitop und eine DNA-Sequenz, die wie oben beschrieben, mindestens ein B-Zell-Epitop des CETP codiert, sowie eine Promotor-Sequenz oder eine Promotor/Enhancer-Sequenz, um die Transkription der strukturellen codierenden Sequenz für das immunogene Fusions-Polypeptid zu lenken. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, dass wie oben beschrieben, codierende Sequenzen für eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren enthalten sind, um z.B. die Epitop-Abschnitte voneinander zu beabstanden, um unbeabsichtigt erzeugte Neo-Epitope auseinander zu reißen, die durch die Nebeneinanderstellung der T- und/oder B-Zell-Epitope gebildet wurden, um Stellen für eine proteolytische Spaltung einzubauen, usw. Es kann auch erwünscht sein, einen bakteriellen Replikationsursprung und (einen) selektierbare(n) Marker einzubauen, um z.B. bei der Produktion großer Mengen des Plasmid-Impfstoffs in Bakterienkulturen zu helfen.
Die Transkription der strukturellen Codierungssequenz für das immunogene Fusionsprotein befindet sich unter Kontrolle einer Promotorsequenz und einer Enhancersequenz, Es sind verschiedene Promotor- und Enhancersequenzen bekannt und können für diesen Zweck gemäß dem Beispiel 1 unten bestimmt werden. Promotor-/Enhancersequenzen, die sich in die Plasmide dieser Erfindung einsetzen lassen sind, jedoch nicht ausschließlich, die Promotor-/Enhancersequenz des CMV, die Promotor-/Enhancersequenz von Adenoviren und die Promotor-/Enhancersequenz des β-Actins. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Promotor-/Enhancersequenzen die CMV-Immidiate early-Promotor-/Enhancersequenz. Ob eine besondere Promotor-/Enhancersequenz in den Plasmiden der vorliegenden Erfindung mehr oder wenige von Nutzen ist als eine andere Promotor-/Enhancersequenz lässt sich ermitteln, indem die durch Tests bestimmte Fähigkeit der Promotor-/Enhancersequenzen verglichen wird, ob mit dem Promotor/Enhancer die Expression eines Standard-Reportergens wie z.B. Luciferase oder β-Galactosidase erfolgen kann und die Produktion eines Antikörpers möglich ist, der mit dem exprimierten Reporter in einem Tiermodell für die Genexpression, wie z.B. in Kaninchen oder Mäusen, reagiert. Im Allgemeinen ist ein besonderer Promotor/Enhancer bei der Lenkung der Transkription der strukturellen codierenden Sequenz für das immunogene Fusions-Protein in den als DNA-Impfstoffen verwendeten Plasmiden von umso größerem Nutzen, je größer das Maß für die Expression des Reportergen-Produkts ist und/oder je größer das Ausmaß der Produktion von Antikörpern ist, die mit dem exprimierten Reportegen-Produkt reagieren.
Verfahren zur Verabreichung des DNA-Impfstoffs
Die erfindungsgemäßen auf einem Plasmid basierenden Impfstoffe können auf jede herkömmliche Weise verabreicht werden. Geeignete Verfahren sind z.B. die direkte Verabreichung der Plasmid-DNA über eine intramuskuläre Injektion, eine intradermale Injektion oder mittels DNA-beschichteter Mikroprojektile. Die Menge des verabreichten Impfstoffs variiert in breitem Umfang je nach der Verabreichungsart, dem Gewebe (z.B. Skelettmuskel, Haut), in welches der Impfstoff verabreicht wird, dem gewünschten Titer der Anti-CETP-Antikörper, den besonderen therapeutischen Anforderungen des zu immunisierenden Subjekts, usw. Sehr große Mengen an DNA-Impfstoff in der Größenordnung von 10 mg/kg Körpergewicht können mit einer Injektion in Muskelgewebe verabreicht werden, während für beschichtete Mikroprojektile möglicherweise sehr viel weniger Impfstoff eingesetzt werden kann. Die Dosierung des Impfstoffs und der Ablauf der Immunisierung sollten kalibriert werden, um eine günstige Antwort zu erhalten, die je nach der klinischen Verordnung auf verschiedenen Wegen gemessen werden kann, z.B. indem eine Änderung im Profil der Lipoproteine (z.B. ein höheres HDL/LDL-Verhältnis), der Anti-CETP-Antikörper-Titer, die CETP-Konzentration im Serum, die Änderung der CETP-Aktivität usw. gemessen werden.
Die folgenden Beispiele sollen die hier beschriebene Erfindung veranschaulichen. Diese Beispiele sollen nicht dazu dienen, den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel I
Auswahl des optimalen Promotor/Enhancers und Herkunft des pCMV-LUC-Plasmids
Dieses Experiment wurde ausgedacht, um die Wirksamkeit von einigen Promotoren/Enhancern zur Expression eines Reportergens (Luciferase) und zur Auslösung einer Immunantwort zu bewerten, um den besten Kandidaten für weitere Impfungsexperimente auszuwählen.
Es wurden drei unterschiedliche Plasmide mit dem unter der Kontrolle des β-Actin-, des Adenovirus- oder des humanen Cytomegalus (CMV)-Immediate-early-Promotor/Enhancers exprimierten Luciferase-Gens des Glühwürmchens konstruiert. Da das CMV-Konstrukt (pCMV-LUC) in weiteren Experimenten Verwendung fand, waren die genauen Einzelheiten seiner Konstruktion wie folgt:
Der CMV-Promotor/Enhancer mit dem das Ampicillin-Resistenzgen (amp^r) enthaltenden pUC19-Plasmid-Vektor wurde durch Verdau mit BamHI aus dem Plasmid pCMVβ (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) herausgeschnitten. Das Luciferase-Gen (LUC) mit angrenzenden Spleiß-Donor/Akzeptor-Stellen und dem aus SV40 stammenden Polyadenylierungs-Signal wurde aus dem pGL2-Promotor-Vektor (Promega Corp., Madison, WI) auf einem BamHI-Gragment wie folgt erzeugt: pGL2 wurde mit HindIII verdaut und die Enden mit Klenow-Polymerase ausgefüllt. Es wurden BamHI-Linker angeheftet und mit BamHI verdaut. Dieses LUC-Fragment wurde über ein Gel gereinigt und in das CMV+-Vektorfragment caus pCMVβ ligiert. Die Struktur des erhaltenen Plasmids wurde über eine Restriktionskartierung bestätigt. Siehe 1.
Die Expression der Luciferase wurde bestätigt, indem die Luciferase-Aktivität in Lysaten von mit allen drei Konstrukten transfizierten COS-Zellen untersucht wurde.
Es wurden jeweils 9 Mäuse in eine von vier Gruppen eingeteilt. Drei dieser Gruppen wurden 50 μg/Quadrizeps von einem der drei (obigen) Konstrukte in 25 μl phosphatgepufferter Saline (PBS) intramuskulär in beide Quadrizeps injiziert. Die vierte Mausgruppe diente als Kontrolle und erhielten zwei 25 μl Injektionen nur aus PBS. Die Tiere erhielten nach 4 Wochen einen gleichen Boost desselben Plasmids (oder der PBS-Kontrolle) und ihnen wurden in Intervallen von etwa 2 Wochen Blut entnommen. Jeweils eine Maus aus einer Gruppe wurde am Tag 2 bzw. am Tag 32 (48 Stunden nach den Injektionen) getötet um das Gewebe auf Luciferase-Produktion hin zu untersuchen. Am Schluss des Experiments wurden die Tiere mit CO₂ getötet und das injizierte Muskelgewebe auf Luciferase-Produktion hin zu untersucht.
Proben aus Quadrizepsgewebe wurden durch mechanisches Homogenisieren des Muskels mit 400 μl Peporter-Lysepuffer (Promega Corp., Madison, WI) gewonnen. Das Homogenat wurde gevortext und bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand entnommen. Zu 20 μl des Überstands wurden 100 μl Käferluciferin (Promega Corp.) gegeben. Das in Folge der Enzym-Substrat-Wechselwirkung ausgesandte Licht wurde 5 Sekunden lang in einem Packard-Top-Count-Scintillation-Counter gemessen. In den Gewebeproben von Tieren, denen alle drei Plasmide injiziert worden waren, wurde das aktive Luciferase-Enzym nachgewiesen. Die mit pMCV-LUC injizierten Tiere wiesen jedoch die höchste Konzentration an aktivem Enzym auf (siehe 2) und dieser Promotor/Enhancer wurde für die Verwendung in weiteren Versuchen ausgewählt. Die Werte für die Tage 2 und 32 betrafen nur ein Tier. Am Tag 132, wenn die restlichen Tiere getötet und die Quadrizepsmuskeln untersucht wurden, wurde in der CMV-Gruppe eine beträchtliche Menge an aktiver Luciferase nachgewiesen mit Konzentrationen, die so hoch waren oder höher als die an den Tagen 2 und 32 gemessenen. Es ist besonders bemerkenswert, dass 132 Tage nach der letzten Injektion von pCMV-LUC aktive Luciferase in Muskelgewebe gefunden wurde. Die Langlebigkeit der Expression von Proteinen mit dem pCMV-LUC-Konstrukt war folglich der Grund dafür, dass der CMV-Promotor/Enhancer für den unten beschriebenen CETP-Impfstoff eingesetzt wurde.
Antikörper gegen Luciferase wurden in Blutproben nachgewiesen, die an den Tagen 31 und 45 entnommen wurden. Der ELISA wurde wie folgt durchgeführt: Biotinylierte Luciferase wurde 1 Stunde lang an eine mit Streptavidin beschichtete Platte angeheftet und dann mit PBS enthaltendem 0,05% Tween 20 gewaschen. Mausplasma wurde in PBS mit 1% BSA in PBS verdünnt, in der Platte annähernd 2 Stunden lang inkubiert und dann gewaschen. Es wurde Ziegen-Anti.Maus-HRP (ein an Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-Anti.Maus-Antikörper) zugesetzt und 45 Minuten lang inkubiert. Nach 2-stündiger Inkubation bei 20°C auf einem Drehschüttler und Waschen wurde die Reaktion mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersberg, MD) entwickelt, mit 2N H₂SO₄ gestoppt und bei 450 nm gemessen. Antikörper gegen Luciferase wurden in Blutproben nachgewiesen, die an den Tagen 31 und 45 entnommen wurden. Die Ergebnisse sind in 3 graphisch dargestellt.
Nach der zweiten Injektion von Plasmid war ein signifikanter Anstieg der Produktion von Antikörpern zu beobachten. Dieser Versuch zeigt, dass eine von einem auf einem Plasmid basierenden Impfstoff produzierte Luciferase Antigen-spezifische Antikörper hervorrufen kann. Diese Versuche zeigten, dass der CMV-Promotor/Enhancer die Expression eines immunogenen Proteins in vivo wirksam antreibt.
Beispiel II
Entwurf und Konstruktion eines pCMV-CETP/TT-Plasmid-Impfstoffs
Es ist herausgefunden worden, dass das den C-terminalen Aminosäuren 481–496 (siehe SEQ ID NO: 2) entsprechende CETP-Fragment von Kaninchen die Bindungsstelle von funktionellen neutralen Lipiden des Kaninchen-CETP enthält. Dieses Fragment umfasst das von TP2, einem die CETP-Aktivität hemmenden monoklonalen Anti-CETP-Antikörper, erkannte Epitop (Swenson, T.L. et al., J. Biol. Chem., 264: 14318–14326 (1989)). Ein zweites Epitop des Kaninchen-CETP (Aminosäuren 350–368 der SEQ ID NO: 2) wurde für den auf einem Plasmid basierenden Impfstoff ausgesucht, um die Bildung von Antikörpern gegen ein zweites Epitop auszulösen, mit welchen sich Immunkomplexe mit CETP bilden und folglich die Beseitigung von immunkomplexiertem CETP günstig beeinflussen ließen. Dieses Epitop wurde wegen seiner potentiellen Antigenizität und der großen Aussicht auf eine Expression von nativem CETP auf der Oberfläche ausgewählt.
Die Sequenz eines Tetanus-Toxoids, welche als fast umfassend antigen erkannt wurde (Panina-Bordignon, P., et al., Eur. J. Immunol., 1989: 2237–2242 (1989)) wurde als der T-Zell-Epitop-Abschnitt ausgewählt. Dieses TT-Epitop ist erfolgreich bei der Erzeugung einer Autoimmun-Antikörper-Antwort gegen hCG eingesetzt worden (Talwar, G.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 8532–8536 (1994)). Bei ihm wäre zu erwarten, dass es auch in Impfstoffen besonders wirksam ist, die an zuvor mit dem Tetanus-Toxoid geimpfte Subjekte verabreicht wurden.
Es wurde ein Satz von 4 Oligonucleotiden synthetisiert, welche sowohl die TT- und CETP-Epitope als auch einen Methionin-Initiationsrest, eine 5' Kozak-Sequenz (für eine wirksame Transklation), ein Stop-Codon und flankierende NotI-Stellen für das Klonen codieren. Die Oligonucleotide wurden hybridisiert und mit DNA-Polymerase erweitert. Siehe 4. Das doppelsträngige Produkt wurde mit NotI verdaut und über ein Gel gereinigt, um das folgende CETP/TT-Insert zu isolieren:
In dem obigen Insert sind der codierende Strang die SEQ ID NO: 2, der Antisense-Strang die SEQ ID NO: 6 und die Aminosäuresequenz die SEQ ID NO: 7. Das Insert wird auch in 5 gezeigt.
Das Plasmid pCMVβ (Clontech Laboratories) wurde mit NotI verdaut, um ein Fragment mit dem CMV-Promotor/Enhancer auf einem pUC19-Grundgerüst mit dem Resistenzgen für Ampicillin (amp^r) zu erzeugen. Dieses Fragment enthält auch Spleiß-Donor/Akzeptor-Stellen und ein von SV40 stammendes Polyadenylierungs-Signal, das die NotI-Insertionsstelle flankiert. Das synthetisierte CETP/TT-Insert wurde mit dem CMV+-Vektorfragment aus pCMVβ ligiert. Die Plasmide wurden durch Transformation in Bakterien gewonnen und die Inserts mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
Beispiel III
Impfung von Kaninchen mit den Plasmiden pCMV-LUC und pCMV-CETP/TT
Es wurde ein Versuch entworfen, in welchem ein Kaninchen-Modell für Arteriosklerose (Daley et al., Arterioscl. Thromb., 14: 95–104 (1994)) zum Einsatz kam, um zu untersuchen, ob ein erfindungsgemäßer Impfstoff auf Basis eines DNA-Plasmids die Toleranz gegenüber einem endogenen CETP durchbrechen würde, was zu einer Produktion von Antikörpern führte, welche mit endogenem CETP reagierten und/uder zu einer Hemmung bei der Ausbildung von arteriosklerotischen Läsionen in der Aorta von Kaninchen. Weiße Neuseeland-Kaninchen (n = 8) wurden sowohl mit dem Plasmid pCMV-LUC als auch dem Plasmid pCMV-CETP/TT immunisiert und auf die Produktion von Anti-Luciferase-Antikörpern und Anti-CETP-Antikörpern sowie auf ihre Fähigkeit hin überwacht, das Fortschreiten der Arteriosklerose zu hemmen, wenn sie auf atherogene Diäten gesetzt wurden, d.h. Diäten die mit einem Gehalt an Cholesterin supplementiert waren, von dem bekannt ist, dass es in Kontrollratten bestimmte und ausgeprägte arteriosklerotische Läsionen hervorruft (Daley et al., ib.). der tägliche Ablauf dieses Versuches mit 13 Kaninchen wird in 6 gezeigt.
Acht Kaninchen (Kaninchen #1–#8) wurden am Tag 0 intramuskulär an drei Stellen von jedem Quadrizeps mit einem Impfstoffpräparat geimpft, das aus gleichen Mischungsanteilen des Plasmids pCMV-CETP/TT und des Plasmids pCMV-LUC bestand. pCMV-LUC diente als Reporter-Plasmid, um eine zusätzliche Stufe von experimenteller Quantifizierung der Plasmid-abhängigen Proteinexpression und der Antikörperproduktion gegen das Plasmidcodierte exprimierte Protein vornehmen zu können. Speziell wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen den Kaninchen einmal pro Woche Blutproben entnommen (z.B. 3–5 ml aus einer Vene des Ohres), um verschiedene Werte für die Vorimpfung zu erhalten ("prebleeds" die in 6 als PRE 1, PRE 2 und PRE 3 bezeichnet wurden). Die Blutproben, die nach einem über Nacht dauernden (ca. 16 Stunden) Fasten entnommen wurden, wurden in einem EDTA-Antikoagulans gesammelt. Nach dem letzten Prebleed (PRE 3) wurde jedes Tier mit drei Injektionen in jeden Quadrizeps geimpft. Jede dieser 6 Injektionen bestand aus 50 μg pCMV-LUC-Plasmid und 50 μg pCMV-CETP/TT-Plasmid in 100 μl PBS, der eine kleine Menge Kohlepulver enthielt (um beim Herausschneiden der Injektionsstelle zu helfen). 48 Stunden nach der Impfung wurde ein Kaninchen (Kaninchen #8) getötet und sein Blut und sein Quadrizeps für die Analyse entnommen. Allen Tieren wurde 4 Wochen (Tag 28) nach der Hauptimpfung Blut entnommen und geboostet (wie oben, mit der Ausnahme, dass blauer Farbstoff an Stelle von Kohle verwendet wurde). Weitere 48 Stunden nach der Boostimpfung wurde ein Kaninchen (Kaninchen #7) getötet und sein Blut und sein Quadrizeps entnommen.
Die Gewebsproben um die Bereiche mit den Kohlemarkierungen im Quadrizeps des Kaninchens #8 bzw. #7 wurden entnommen und Gewebshomogenate hergestellt. Unter Einsatz des oben beschriebenen Luciferase-Assays wurde, wie in 7 gezeigt, in dem aus den Stellen der Hauptinjektion (Tag 0) entnommenen Gewebe die enzymatische Aktivität der Luciferase nachgewiesen. Beispielsweise lieferte das nicht geimpfte Muskelgewebe in dem Versuch ein Hintergrundsignal von etwa 5,33 Counts pro Sekunde (cps) (Normal-Kaninchen in 7). Das 2 Tage nach der Impfung entfernte Muskelgewebe aus einer geimpften Stelle des Kaninchens #8 (Stelle 3 für Kaninchen 8 in 7) lieferte ein Luciferase-Signal von 125 cps (das 23,5-fache des Hintergrundsignals) und das 30 Tage nach der Impfung entfernte Muskelgewebe aus Kaninchen #7 zeigte ein Luciferase-Signal von 26,7 cps (Stelle 1 für Kaninchen 7 in 7, das 5-fache des Hintergrundsignals) und von 168 cps (Stelle 3 für Kaninchen 7 in 7, das 31,5-fache des Hintergrundsignals). Die Tatsache, dass nicht alle Gewebsproben eine Luciferase-Aktivität zeigten ist wahrscheinlich auf die Schwierigkeit zurückzuführen, trotz der Verwendung von Kohle zur Markierung der Impfstellen genau die Stellen der Ablagerung des Plasmids auszumachen. Jedoch zeigen die Daten aus den Proben von Stelle 3 der Kaninchen #8 und #7 in Figur klar, dass dieses Plasmid-Konstrukt (ungeachtet des Inserts) als Impfstoff-Vektor in Kaninchen wirksam ist.
In einem Abstand von zwei Wochen wurden zwei zusätzliche Blutproben (BLEEDS 3 und 4 an den Tagen 44 bzw. 57 in 6) entnommen. Die Tiere wurden dann dreimal mit 0,5 ml eines alum-adorbed-Präparats des Tetanus-Toxoids (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) an den Tagen 66, 91 und 128 intramuskulär geimpft (siehe 6). Dies geschah, um zu ermitteln, ob eine Tetanus-Impfung die Wirksamkeit des CETP-Impfstoffs steigern würde und um die Situation beim Menschen nachzuahmen.
Anfangs wurden alle Kaninchen in diesem Versuch mit Standardnahrung für Kaninchen gefüttert. Um die Bildung von Arteriosklerose-ähnlichen Läsionen zu induzieren wurden die Kaninchen auf Diät gesetzt, die, wie in 6 gezeigt, an den Tagen 99, 112 und 154 entweder 0,25% (w/w) Cholesterin oder 0,5% (w/w) Cholesterin erhielen. Es wurden zusätzliche Blutproben (BLEEDS 8–12) entnommen und der gesamte Versuch am Tag 220 beendet.
Zum Nachweis freier Antikörper im Serum, die ein Kaninchen-CETP-Peptid mit einer den Aminosäuren 477–496 des Kaninchen-CETP (Aminosäuren 477–496 der SEQ ID NO: 2) entsprechenden Aminosäuresequenz erkennen, wurde ein ELISA im Wesentlichen wie folgt durchgeführt: Die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten 96-Loch-Platte wurden mit dem biotinylierten Peptid CETP 477–496 beschichtet, indem 100 μl einer Lösung des Peptids (1,0 μg/ml PBS) 30 Minuten bis 1 Stunde lang inkubiert und dann mit 2 × PBS, die 0,1 % Tween 20 enthielt, gewaschen wurden. Immunisiertes Kaninchen-Plasma (oder normales Kaninchen-Plasma; NRP) wurde in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt, in der Platte etwa 2 Stunden lang inkubiert und dann gewaschen. Es wurde Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP (ein an Meerrettich konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper) zugesetzt und ca. 45 Minuten lang auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Reaktion mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersberg, MD) in Gang gesetzt, mit 2N H₂SO₄ gestoppt und bei 450 nm unter Einsatz eines ELISA-Plate-Readers spektrophotometrisch ausgewertet.
Die 57 Tage nach der Hauptimpfung aus den sechs Kaninchen (Kaninchen #1 bis #6) entnommenen Plasmaproben wurden verdünnt und auf ihre Produktion von mit dem Kaninchen-CETP_477-496-Peptid reagierenden Antikörpern hin untersucht. Das Plasma von einem nicht injizierten Kaninchen (NRP) wurde ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse sind in 8 wiedergegeben und zeigen einen Ausschnitt für die Ausmaße der Produktion von Anti-Kaninchen-CETP_477-496-Peptid-Antikörpern in geimpften Tieren am Tag 57.
Auch am Tag 220 wurden Plasmaproben aus den Kaninchen #2, #3, #5 und #6 entnommen und untersucht, um zu ermitteln, ob mit pCMV-CETP/TT geimpfte Kaninchen weiterhin nachweisbare Konzentrationen an Antikörpern gegen CETP produzieren, was mit einem ELISA unter Einsatz des Kaninchen-CETP_477-496-Peptids gemessen wurde.
Die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten 96-Loch-Platte wurden mit dem biotinylierten Peptid CETP_477-496 beschichtet, indem 100 μl einer Lösung des Peptids (200 ng/ml in PBS) 1 Stunde lang inkubiert wurden. Durch Inkubation mit einem Blockierungspuffer (PBS mit 1% (w/w) BSA, 1% (w/v) fettarmer Drinkmilch, 0,5% (w/v) Gelatine, 0,9% (v/v) Triton X-100 und 0,6% (v/v) NP-40) über Nacht bei 4°C auf einem Drehschüttler bei 150 Upm wurde eine nicht spezifische Bindung verhindert, dann wurde 3 Mal mit Waschpuffer (2 × PBS mit 0,05% (v/v) Tween 20) gewaschen. Das immunisierte Plasma der Kaninchen (oder normales Kaninchen-Plasma, NRP) wurde mit Blockierungspuffer verdünnt, in der Platte etwa zwei Stunden lang inkubiert und dann gewaschen. Es wurde Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP zugesetzt und etwa eine Stund lang auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Reaktion mit TMB in Gang gesetzt, mit 2N H₂SO₄ gestoppt und bei 450 nm auf einem ELISA-Plate-Reader ausgewertet. Die Daten von dem am Tag 220 entnommenen Plasma der vier geimpften Kaninchen sowie von dem normalen Kaninchen-Plasma (NRP) sind in 9 wiedergegeben.
Die Daten in 9 zeigen, dass gemäß dem ELISA das Plasma aus Kaninchen #3 ganz klar nachweisbare Antikörper gegen das Kaninchen-CETP_477-496-Peptid enthielt. Bei Einsatz dieses ELISA schien es ebenfalls so, dass das Plasma aus Kaninchen #6 einige nachweisbare Anti-CETP-Antikörper enthielt. Während jedoch das Signal aus dem Plasma von Kaninchen #3 kräftig war, bewegte sich das Signal aus dem Plasma von Kaninchen #6 in der Nähe der Basislinie (siehe z.B. 9). Dieses Signal wird so interpretiert, dass es in Kaninchen #3 und wahrscheinlich auch in Kaninchen #6 die Gegenwart von Antikörpern anzeigt, welche dieses Epitop des CETP erkennen.
Die Plasmaproben wurden in einem anderen ELISA untersucht, der so konzipiert war, dass er die Antikörper gegen das CETP_477-496-Peptid quantitativ wiedergab. Die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten 96-Loch-Platte wurden mit biotinyliertem CETP_477-496-Peptid beschichtet, indem 100 μl einer Lösung des Peptids (1 μg/ml in PBS) 30 Minuten bis über Nacht inkubiert und dann mit PBS, die 0,05% (v/v) Tween 20 enthielt, gewaschen wurden. Durch Inkubation mit dem (oben beschriebenen) Blockierungspuffer über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler bei 150 Upm wurde eine nicht spezifische Bindung verhindert, dann wurde 4 Mal mit (dem oben beschriebenen) Waschpuffer gewaschen. Das immunisierte Kaninchen-Plasma wurde mit Blockierungspuffer verdünnt, in der Platte 1,5 Stunden lang inkubiert und dann gewaschen. Es wurde Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP zugesetzt und etwa 1 Stunde lang auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Reaktion mit 100 μl TMB in Gang gesetzt, mit 50 μl 2N H₂SO₄ gestoppt und bei 450 nm in einem ELISA-Plate-Reader ausgewertet. Die Konzentration der spezifischen Antikörper wurde unter Einsatz einer Standardkurve bewertet, die mit biotinyliertem Immunoglobin von Kaninchen bei 15 bis 250 ng/ml erstellt wurde.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in 10 wiedergegeben. Die Plasmaprobe von Kaninchen #3 enthielt wieder klar nachweisbare Antikörper, die mit dem CETP_477-496-Peptid von Kaninchen reagierten. Diese Untersuchung wies jedoch keine Antikörper nach, die mit dem Peptid in Plasmaproben der Kaninchen #2, #5 und #6 reagierten. Die nicht immunisierten Kaninchen #10, #12 und #13 zeigten in diesem Versuch ein Hintergrundsignal, das ähnlich dem des Kaninchens #2 war. Die Plasmaprobe des Kaninchens #4 schien gemäß diesem Versuch auch nachweisbare Antikörper gegen das CETP zu enthalten. Kaninchen #4 wurde jedoch gemäß dem Protokoll bereits am Tag 148 getötet (siehe 6), während die Kaninchen #2, #3, #5 und #6 über die gesamten 220 Tage des Experiments hinweg am Leben blieben.
Die Beobachtung, dass es unter den Tieren bei der Reaktion gegen den Impfstoff Unterschiede gab, steht in Übereinstimmung mit der Literatur über auf einem Plasmid basierende Impfstoffe. Es lässt sich folglich ableiten, dass der auf einem Plasmid basierende Impfstoff das gewünschte Protein in humoraler immunogener Form produzierte. Es ist wichtig, dass man zur Kenntnis nimmt, dass in diesem Versuch nur freie Antikörper in den Plasmaproben nachgewiesen werden. An endogenes CETP gebundene Anti-CETP-Antikörper (vermutlich die meisten) würden nicht nachgewiesen werden. Auch sind diese Kaninchen zuvor nicht mit einem Tetanus-Impfstoff geimpft worden. Es ist wahrscheinlich, dass in einem Subjekt, das einen Tetanus-Impfstoff erhält oder zuvor erhalten hat, der Titer höher wäre, wie dies bei vielen erwachsenen Menschen der Fall ist, die gegen Tetanus geimpft worden waren.
Wie im täglichen Versuchsablauf in 6 angegeben, wechselten die Kaninchen #2, #3, #5 und #6 in diesem Versuch von einer Grundnahrung für Kaninchen über zu einer Nahrung, die mit verschiedenen Mengen an Cholesterin supplementiert worden war, von dem bekannt ist, dass es in Kaninchen an den Tagen 99, 112 und 154 Arteriosklerose-ähnliche Läsionen hervorruft (Daley et al., Arterioscler. Thromb., 14: 95–104 (1994)). Um zu ermitteln, ob die auf einem Plasmid basierenden Impfstoffe die Entwicklung von Arteriosklerose beeinflussen können, wurden die Aorten dieser Kaninchen auf die Entwicklung von arteriosklerotischen Läsionen hin untersucht. Nach Entnahme der Blutproben am Tag 220 wurden die Kaninchen #2, #3, #5 und #6 getötet. Die ganzen Aorten von jedem dieser 4 Kaninchen wurden entnommen und in eine Fixierlösung (3,7% (v/v) Formaldehyd) gelegt. Loses Gewebe, anhängendes Fett und die Adventitia wurden von den Arterien abgetrennt. Jede Arterie wurde sodann der Länge nach aufgeschnitten, flach befestigt, um die innere Oberfläche (des Lumens) darzubieten, mit Sudan IV gefärbt und dann fotografiert. Sudan IV ist ein fettlöslicher roter Farbstoff, der arteriosklrotische Plaques auf der inneren Oberfläche der Arterien färbt. Die gefärbten Aorten der Kaninchen #2 und #5 zeigten ein Vorherrschen von arteriosklerotischen Läsionen entlang der Länge der Aorten und insbesondere in dem Aortenbereich der Thorax-Region. Die Aorten der Kaninchen #2 und #5 sahen ähnlich aus wie die von ungeimpften Kaninchen mit Cholesterin-supplementierter atherogener Ernährung (wie die Kaninchen #10, #12 und #13). Im Gegensatz dazu wiesen die Aorten der Kaninchen #3 und #6 auf ihrer inneren Oberfläche einschließlich dem Aortenabschnitt in der Thorax-Region wegen des geringeren Auftretens von Läsionen ein viel glatteres und einheitlicheres Erscheinungsbild auf.
Um den deutlichen Unterschied im Auftreten von arteriosklerotischen Läsionen in den Aorten der Kaninchen #2 und #5 und das Fehlen derselben in den Aorten der Kaninchen #3 und #6 quantitativ einzuordnen, wurde die Fläche der Oberfläche der angehefteten Aorten und die Fläche der Aorta-Läsionen aus Photographien mit Hilfe der Planar-Morphometrie ermittelt (Daley et al., 1994), indem ein Digitalisiertablett mit zugehöriger Software (THE MORPHOMETER^TM, Woods Hole Educational Associates, Woods Hole, Massachusetts) eingesetzt wurde. Der Prozentsatz der auf der Aortenoberfläche mit Läsionen bedeckten Fläche wurde für das Kaninchen #2 zu 44,8%, für das Kaninchen #5 zu 50,9%, für das Kaninchen #3 zu 14,2% und für das Kaninchen #6 zu 14,4% ermittelt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kaninchen #2 und #5 nach 220 Tagen gemäß dem oben beschriebenen und in 6 gezeigten Impfprotokoll keine nachweisbaren Anti-Kaninchen-CETP-Antikörper produzierten, ermittelt mit Hilfe eines ELISA unter Einsatz des Kaninchen-CETP_477-496, und diese Kaninchen zogen sich signifikante arteriosklerotische Läsionen auf der inneren Oberfläche ihrer Aorten zu (44,8% bzw. 50,9%), nachdem sie über einen Zeitraum von ca. 17 Wochen eine mit Cholesterin supplementierte Nahrung zu sich genommen hatten. Im Gegensatz dazu wiesen die Kaninchen #3 und #6, die wahrscheinlich Anti-Kaninchen-CETP-Antikörper produzierten, nach etwa 17 Wochen mit einer Ernährung mit erhöhtem Cholesteringehalt auf der Oberfläche ihrer Aorten eine beachtlich kleinere mit arteriosklerotischen Läsionen bedeckte Fläche auf (14,2% bzw. 14,4%).
Beispiel IV
Die Ergebnisse des obigen Versuchs unter Einsatz eines Kaninchen-Modells für Arteriosklerose zeigen, dass die auf einem Plasmid basierenden Impfstoffe dieser Erfindung eingesetzt werden können, um eine Arteriosklerose bei anderen Vertebraten zu verhindern oder zu behandeln. Analog zu der in Beispiel III veranschaulichten Behandlung zur Hemmung einer Arteriosklerose bei Kaninchen lassen sich für andere Vertebraten, einschließlich dem Menschen, ähnliche Konstrukte von Plasmiden herstellen Derartige Plasmide codieren ein immunogenes Fusions-Polypeptid mit einem universellen oder Breitband-T-Zell-Epitop, wie z.B. aus dem Tetanus-Toxoid oder dem Diphterie-Toxoid, das im gleichen Leseraster mit mindestens einem, mehr bevorzugt zwei B-Zell-Epitope des endogenen CETP des Individuums verbunden ist. Ein Beispiel für einen auf einem Plasmid basierenden Impfstoff für endogenes humanes CETP enthält eine DNA-Sequenz, die einen an ein TT-Polypeptid gebundenen Methioninrest zur Initiation der Translation codiert, wie z.B. in den Nucleotiden 10–54 der SEQ ID NO: 5, der im gleichen Leseraster (mit oder ohne dazwischen liegende Linker) an eine DNA-Sequenz gebunden ist, welche Abschnitte des humanen CETP codiert, die denen analog sind, welche in dem auf einem Kaninchen-CETP-Plasmid basierenden Impfstoff verwendet werden, wie z.B. die Nucleotide 1045–1101 und 1381–1428 der SEQ ID NO: 3, welche die Aminsäuren 349–367 bzw. 461–476 der SEQ ID NO: 4 codieren. Die DNA-Sequenz in dem Plasmid zur Verwendung als Impfstoff gegen humanes endogenes CETP umfasst auch vorzugsweise Abschnitte, wie sie in 5 gezeigt werden, wie z.B. Codons für den Start und Stop der Translation sowie flankierende Stellen für Restriktionsendonucleasen, die allgemein für die Konstruktion von Plasmiden und die Expression von Genen verwendet werden.
Beispiel V
In einem andere Aspekt dieser Erfindung können auf einem Plasmid basierende Impfstoffe hergestellt werden, in welchen ein Plasmid einen universellen oder Breitband-T-Zell-Epitop- Abschnitt codiert, der im richtigen Lesraster an einen B-Zell-Epitop-Abschnitt mit einem oder mehreren B-Zell-Epitopen eines nicht endogenen CETP gebunden ist. Solche nicht endogenen von Plasmiden dieser Erfindung codierten Impfstoff-B-Zell-Epitope können von einer anderen Spezies oder einem anderen Allel abstammen oder sie können von nicht natürlichem Ursprung (d.h. eine synthetische Sequenz) sein; in solchen Fällen unterscheidet sich die Aminosäuresequenz des (der) nicht endogenen Impfstoff-B-Zell-Epitops (Epitope) geringfügig von dem endogenen CETP des zu impfenden Individuums. Beispielsweise weist ein nicht endogenes Impfstoff-B-Zell-Epitop, das sich geringfügig von dem B-Zell-Epitop des endogenen CETP-Proteins unterscheidet eine Aminosäuresequenz auf, die sich von dem entsprechenden B-Zell-Epitop des endogenen CETP durch wenige, z.B. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Reste, unterscheidet.
Ein anderes Beispiel für ein nicht endogenes Impfstoff-B-Zell-Epitop, das sich geringfügig von einem B-Zell-Epitop eines endogenen CETP unterscheidet, enthält eine oder mehrere konservative Änderungen in der Aminosäuresequenz an einem oder mehreren Resten, von denen bekannt ist, dass sie für die CETP-Aktivität und/oder Bindung von Antikörpern wichtig sind (siehe z.B. Hesler et al., J. Biol. Chem., 263: 5020–5023 (1988); Wang et al., J. Biol. Chem., 267: 17487–17490 (1992); Wang et al., J. Biol. Chem., 268: 1955–1959 (1993)) oder an einem oder mehreren Resten, von denen bekannt ist, dass sie sich an analogen Positionen in der Aminosäuresequenz des von anderen Allelen oder Genen einer anderen Spezies codierten CETP unterscheiden (siehe z.B. Nagashima et al., J. Lipid Res., 29:1643–1649 (1988); Kotake et al., J. Lipid Res., 37: 599–605 (1996); Drayna et al., Nature, 327: 632–634 (1987)).
Ein Beispiel für einen auf einem Plasmid basierenden Impfstoff für den Menschen, der nicht endogene Impfstoff-B-Zell-Epitope enthält, ist das oben beschriebene Plasmid pCMV-CETP/TT, in welchem DNA-Sequenzen eingesetzt werden, welche B-Zell-Epitope aus dem CETP von Kaninchen codieren. Ein anderes Beispiel für eine Verwendung beim Menschen ist ein ähnliches Plasmid, wo die codierten B-Zell-Epitope nicht von einer besonderen Spezies abstammen, sondern synthetische Versionen darstellen, die sich geringfügig von den von den entsprechenden CETP-DNA-Sequenzen des Menschen codierten unterscheiden.
Ohne sich auf eine besondere Theorie festlegen zu wollen kann die Verwendung von einem oder mehreren nicht endogenen Impfstoff-B-Zell-Epitopen, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die sich geringfügig von der eines B-Zell-Epitops des endogenen Proteins (d.h. des endogenen CETP) unterscheidet, wirksamer die Bildung von Antikörpern auslösen als wenn endogene B-Zell-Epitope eingesetzt werden. Derartige nicht endogene Impfstoff-B-Zell-Epitope (1) lösen in dem geimpften Individuum die Produktion von Antikörpern aus und (2) diese ausgelösten Antikörper oder eine Untergruppe davon binden sich an endogenes CETP. Um beispielsweise zu testen, ob ein auf einem Plasmid basierender Impfstoff dieser Erfindung beim Menschen die Bildung von Autoantikörpern gegen CETP auslöst, werden transgene Mäuse mit humanem CETP (beispielsweise im Handel erhältliche BIODIGM^TM-CETP-Mäuse, Pharmakon USA, Waverly, PA) mit einem erfindungsgemäßen Plasmid-Konstrukt geimpft und die Produktion von menschliches CETP erkennenden Antikörpern quantitativ erfasst. Die quantitative Erfassung von Anti-human-CETP-Antikörpern lässt sich mit verschiedenen Verfahren leicht durchführen, wie z.B. dem Western-Blotting von Seren aus einem geimpften Tier zu elektophoretisiertem Human-CETP; dem ELISA, wo Seren aus dem geimpften Tier auf die Fähigkeit hin untersucht werden, Human-CETP oder (ein) Fragment(e) davon zu binden; oder der Isolierung von CETP aus dem Blut geimpfter Tiere und Prüfung auf an das CETP genundene Antikörper.
Bakterielle Zellkulturen mit den Plasmiden pCMV-LUC und pCMV-CETP/TT, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden am 26. April 1996 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD hinterlegt. Sie erhielten die Hinterlegungsnummern 98037 bzw. 98038.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert, der, wenn er einem humanem oder tierischen Subjekt verabreicht wird, die Produktion von Autoantikörpern induziert, die spezifisch reaktiv mit dem endogenen Cholesterylester-Transferprotein (CETP) des Subjekts sind, wobei diese Nukleotidsequenz wenigstens ein für ein B-Zell-Epitop von CETP kodierendes Segment umfasst, das im richtigen Leserahmen mit wenigstens einem Segment verbunden ist, das für ein universelles Helfer-T-Zell-Epitop kodiert, wobei die Nukleotidsequenz funktionsfähig mit einer Promotorsequenz verbunden ist, die geeignet ist, um die Transkription der Nukleotidsequenz in einer humanen oder tierischen Zelle zu steuern.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei dieses B-Zell-Epitop einen Teil von humanem CETP umfasst, der aus 5–8 aufeinander folgenden Aminosäuren von SEQ ID NO: 4 besteht.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei dieses B-Zell-Epitop eine carboxyterminale Region von CETP umfasst, die an der Bindung von neutralen Lipiden oder am Transfer von neutralen Lipiden beteiligt ist.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Helfer-T-Zell-Epitop ein Helfer-T-Zell-Epitop umfasst, das sich von einem antigenen Peptid ableitet, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Tetanustoxoid, Diphterietoxin, Keuchhusten-Impfstoff, Bacile Calmette-Guerin (BCG), Polio-Impfstoff Masern-Impfstoff, Mumps-Impfstoff, Rubella-Impfstoff, gereinigtes Proteinderivat von Tuberculin, Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke, und Kombinationen davon besteht.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das immunogene Polypeptid zwei B-Zell-Epitope von CETP enthält.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei dieses wenigstens eine Segment, das für ein B-Zell-Epitop von CETP kodiert, aus einem oder mehreren Bestandteilen der Gruppe ausgewählt wird, die aus: (a) einem DNA-Segment, das für die Aminosäuren 463 bis 475 von SEQ ID NO: 4 kodiert, (b) einem DNA-Segment, das für die Aminosäuren 461 bis 476 von SEQ ID NO: 4 kodiert, und (c) einem DNA-Segment, das für die Aminosäuren 349 bis 367 von SEQ ID NO: 4 kodiert, besteht.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 5, der ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 461 bis 476 von SEQ ID NO: 4 kodiert, und ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 349 bis 367 von SEQ ID NO: 4 kodiert, enthält.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, der ein DNA-Segment enthält, das für die Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO: 7 kodiert.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, der die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Promotor der Cytomegalovirus „immediate early" Promotor/Enhancer ist.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei diese Nukleotidsequenz umfasst: (a) die „immediate early" Promotor/Enhancer-Region des Cytomegalovirus (CMV), die funktionsfähig verbunden ist mit (b) einem strukturellen DNA-Segment, das für ein immunogenes Polypeptid kodiert, und (i) ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO: 7 kodiert, (ii) ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 463 bis 475 von SEQ ID NO: 4 kodiert, und (iii) ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 349 bis 367 von SEQ ID NO: 4 kodiert, umfasst, wobei die DNA-Segmente (i), (ii) und (iii) im richtigen Leserahmen verbunden sind.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei diese Nukleotidsequenz umfasst: (a) die „immediate early" Promotor/Enhancer-Region des Cytomegalovirus (CMV), die funktionsfähig verbunden ist mit (b) einem strukturellen DNA-Segment, das für ein immunogenes Polypeptid kodiert, und (i) ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 2 bis 15 von SEQ ID NO: 7 kodiert, (ii) ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 461 bis 476 von SEQ ID NO: 4 kodiert, und (iii) ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 349 bis 367 von SEQ ID NO: 4 kodiert, umfasst, wobei die DNA-Segmente (i), (ii) und (iii) im richtigen Leserahmen verbunden sind.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei diese Nukleotidsequenz, im richtigen Leserahmen verbunden, eine Nukleotidsequenz, die für ein universelles Helfer-T-Zell-Epitop kodiert, die Sequenz der Nukleotide 55 bis 111 von SEQ ID NO: 5 und die Sequenz der Nukleotide 112 bis 159 von SEQ ID NO: 5 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 13, wobei die Nukleotidsequenz die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei diese Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz, die für ein universelles Helfer-T-Zell-Epitop kodiert, die Sequenz der Nukleotide 1045 bis 1101 von SEQ ID NO: 3 und die Nukleotide 1387 bis 1425 von SEQ ID NO: 3 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei diese Nukleotidsequenz eine Nukleotidsequenz, die für ein universelles Helfer-T-Zell-Epitop kodiert, die Sequenz der Nukleotide 1045 bis 1101 von SEQ ID NO: 3 und die Nukleotide 1381 bis 1428 von SEQ ID NO: 3 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das immunogene Polypeptid ein B-Zell-Epitop der C-terminalen 26 Aminosäuren von humanem CETP und ein Helfer-T-Zell-Epitop vom Tetanustoxoid umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Medikament.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach einem der Ansprüche 2–17 zur Verwendung als ein Medikament.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung als ein Medikament zur Erhöhung des Verhältnisses von zirkulierendem HDL zu zirkulierendem LDL, VLDL oder Gesamtcholesterin in einem Menschen oder einem anderen Tier.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung als ein Medikament zur Senkung des Levels an endogener CETP-Aktivität in einem Menschen oder einem anderen Tier.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung als ein Medikament zum Auslösen der Produktion von anti-CETP-Antikörpern in einem Menschen oder Tier.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung als ein Medikament zur Erhöhung des Levels von zirkulierendem HDL in einem Menschen oder Tier.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff nach Anspruch 18 oder 19 zur Verwendung als ein Medikament zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer kardiovaskulären Krankheit in einem Menschen oder einem anderen Tier.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff zur Verwendung als ein Medikament nach Anspruch 24, wobei die Nukleotidsequenz, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert, eine DNA-Sequenz der Nukleotide 55 bis 111 von SEQ ID NO: 5 und die Nukleotide 112 bis 159 von SEQ ID NO: 5 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff zur Verwendung als ein Medikament nach Anspruch 24, wobei das DNA-Segment die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff zur Verwendung als ein Medikament nach Anspruch 24, wobei die Nukleotidsequenz, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert, die DNA-Sequenz der Nukleotide 1045 bis 1101 von SEQ ID NO: 3 und die Nukleotide 1387 bis 1425 von SEQ ID NO: 3 umfasst.
Auf einem DNA-Plasmid basierender Impfstoff zur Verwendung als ein Medikament nach Anspruch 24, wobei die Nukleotidsequenz, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert, die DNA-Sequenz der Nukleotide 1045 bis 1101 von SEQ ID NO: 3 und die Nukleotide 1381 bis 1428 von SEQ ID NO: 3 umfasst.
Verwendung eines auf einem DNA-Plasmid basierenden Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Produktion von Autoantikörpern, die spezifisch reaktiv mit dem endogenen CETP eines Menschen oder Tieres sind, in diesem Menschen oder Tier, und zur Erhöhung des Verhältnisses von zirkulierendem HDL zu zirkulierendem LDL, VLDL, oder Gesamtcholesterin in diesem Menschen oder Tier.
Verwendung eines auf einem DNA-Plasmid basierenden Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Produktion von Autoantikörpern, die spezifisch reaktiv mit dem endogenen CETP eines Menschen oder Tieres sind, in diesem Menschen oder Tier, und zur Senkung des Levels von endogener CETP-Aktivität in diesem Menschen oder Tier.
Verwendung eines auf einem DNA-Plasmid basierenden Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Produktion von Antikörpern, die spezifisch reaktiv mit dem endogenen CETP eines Menschen oder Tieres sind, in diesem Menschen oder Tier.
Verwendung eines auf einem DNA-Plasmid basierenden Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Produktion von Autoantikörpern, die spezifisch reaktiv mit dem endogenen CETP eines Menschen oder Tieres sind, in diesem Menschen oder Tier, und zur Erhöhung der Menge von zirkulierendem HDL in diesem Menschen oder Tier.
Verwendung eines auf einem DNA-Plasmid basierenden Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Produktion von Autoantikörpern, die spezifisch reaktiv mit dem endogenen CETP eines Menschen oder Tieres sind, in diesem Menschen oder Tier, und zur therapeutischen der prophylaktischen Behandlung einer kardiovaskulären Krankheit in diesem Mensch oder Tier.