DE69534992T2

DE69534992T2 - Mutierendes enterotoxin als nichttoxisches orales adjuvans

Info

Publication number: DE69534992T2
Application number: DE69534992T
Authority: DE
Inventors: John D. New Orleans CLEMENTS; Bonny L. New Orleans DICKINSON
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2015-07-19
Also published as: HU222985B1; NO970993D0; RU2160606C2; ES2265148T3; US6440423B1; CZ298131B6; NZ291262A; NO970993L; ATE326231T1; JPH10505059A; HUT77869A; CN1182868C; CN1164191A; FI970799L; AU3233795A; JP3860208B2; AU709779B2; DE69534992D1; ZA956412B; KR100399258B1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisch ausgeprägtes mutiertes E. coli Hitze-labiles Enterotoxin (LT) und seine Verwendung als orales Adjuvans zur Erzeugung mukosaler Antikörper und Serumantikörper. Das mutierte LT wird insbesondere durch eine einzige Aminosäuresubstitution modifiziert, die seine inhärente Toxizität beseitigt, die aber die Eigenschaften des Moleküls als Adjuvans intakt lässt.
2. Hintergrund der Erfindung
Mikrobielle Pathogene können einen Wirt durch einen oder mehrere Mechanismen infizieren. Sie können durch einen Riss der Haut, der durch ein Trauma erzeugt wurde, in diese eindringen, sie können durch einen Transmissionsvektor eingeführt werden, oder sie können mit einer mukosalen Oberfläche wechselwirken. Die Mehrzahl menschlicher Pathogene löst eine Krankheit durch den letzteren Mechanismus aus, d.h. durch Wechselwirkung mit mukosalen Oberflächen. Bakterielle und virale Pathogene, die über diesen Mechanismus wirken, treten zuerst in Kontakt mit der mukosalen Oberfläche, an der sie sich festsetzen, und welche sie dann besiedeln, oder können durch spezialisierte absorptive Zellen (M-Zellen) im Epitel aufgenommen werden, welche Peyer's Patches und andere lymphoide Follikel überziehen [Bockman and Cooper, 1973, Am. J. Anat. 136: 455–477; Owen et al., 1986, J. Infect. Dis. 153: 1108–1118]. Organismen, welche in Lymphgewebe eindringen, können leicht in den Lymphfollikeln abgetötet werden, wodurch eine potenziell schützende Immunantwort hervorgerufen wird, da Antigene abgegeben werden um die Zellen innerhalb der Follikel zu immunisieren (beispielsweise Vibrio cholerae). Alternativ dazu können pathogene Organismen, die in der Lage sind, örtliche Abwehrmechanismen zu überleben, sich aus den Follikeln verbreiten und anschließend örtliche oder systemische Krankheiten erzeugen (z. B. Salmonella ssp., Poliovirus, Rotavirus in immunsupprimierten Wirten).
Sekretorische IgA (sIgA)-Antikörper, die gegen spezifische virulente Determinanten infizierender Organismen gerichtet sind, spielen eine wichtige Rolle bei der gesamten mukosalen Immunität [Cebra et al., 1986, in: Vaccines 86, Brown et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 129–133]. In vielen Fällen ist es möglich, die anfängliche Infektion der mukosalen Oberflächen dadurch zu verhindern, dass die Erzeugung mukosaler sIgA-Pegel stimuliert wird, die gegen die relevanten virulenten Determinanten eines infizierenden Organismus gerichtet sind. Sekretorisches IgA kann die anfängliche Wechselwirkung des Pathogens mit der mukosalen Oberfläche durch Blockieren der Anhaftung und/oder der Besiedelung, durch Neutralisation von Toxinen, die auf die Oberfläche wirken oder durch Verhütung des Eindringens der Wirtszellen verhindern. Während bereits eine ausführliche Forschung durchgeführt wurde, um die Rolle der durch Zellen vermittelten Immunität und der Serumantikörper beim Schutz gegen infektiöse Wirkstoffe zu bestimmen, ist wenig bekannt über die Steuerung, die Auslösung und die Sekretion von sIgA. Parenteral verabreichte Präparationen von inaktivierten ganzen Zellen und ganzen Viren sind wirksam beim Hervorrufen des Schutzserums IgG und verzögerter Reaktionen vom Typ überempfindlicher Reaktionen gegen Organismen, die eine signifikante Serumphase in ihrer Pathogenese aufweisen (z. B. Salmonella typhi, Hepatitis B). Jedoch sind parenterale Vakzine nicht wirksam beim Hervorrufen der mukosalen sIgA-Antworten und sind nicht gegen Bakterien wirksam, welche mit den mukosalen Oberflächen wechselwirken und in diese nicht eindringen (beispielsweise Vibrio cholerae). Es gibt jedoch einen neuen Hinweis darauf, dass parenteral verabreichte Vakzine gegen mindestens einen Virus, Rotavirus, wirksam sein können, welcher zunächst mit mukosalen Oberflächen wechselwirkt [Conner et al., 1993, J. Virol. 67: 6633–6641]. Es wird angenommen, dass der Schutz ein Resultat der Transudation von antigenspezifischer IgG auf mukosale Oberflächen zur Virusneutralisation ist. Daher sind Mechanismen, die sowohl Serumantikörper wie auch mukosale Antikörper stimulieren, für wirksame Vakzine wichtig.
Die orale Immunisierung kann für die Einleitung der spezifischen sIgA-Antwort wirksam sein, falls die Antigene den T- und B-Lymphozyten und den Nebenzellen, welche in Peyer's Patches enthalten sind, dargereicht werden, wobei vorzugsweise IgA B-Zellentwicklungen initiiert wird. Peyer's Patches enthalten Hilfs-T (TH)-Zellen, welche B-Zellen vom gleichen Typ durch direktes Umschalten von IgM-Zellen auf IgA B-Zellen vermitteln. Die Patches enthalten auch T-Zellen, welche die terminale Differenzierung der B-Zellen initiieren. Die so vorbereiteten B-Zellen migrieren dann zu den mesenterischen Lymphknoten und gehen dort Differenzierung ein, dringen in den Thoraxduktus und dann in den allgemeinen Kreislauf ein und besiedeln anschließend alle Sekretgewebe des Körpers, einschließlich der Lamina propria des Darmes und der Atmungswege. IgA wird dann durch die reifen Plasmazellen erzeugt, mit der membrangebundenen Sekretkomponente komplexiert und auf die mukosale Oberfläche transportiert, wo es in der Lage ist, mit eindringenden Pathogenen zu wechselwirken [Strober und Jacobs, 1985, in: Advances in host defense mechanisms, Bd. 4, Mucosal Immunity, Gallin und Fauci (Hrsg.), Raven Press, New York, Seiten 1–30; Tomasi und Plaut, 1985, in: Advances in host defense mechanisms, Bd. 4, Mucosal Immunity, Gallin und Fauci (Hrsg.), Raven Press, New York, Seiten 31–61]. Die Existenz dieses üblichen mukosalen Immunsystems erklärt teilweise das Potenzial lebendiger oraler Vakzine und der oralen Immunisierung zum Schutz gegen pathogene Organismen, welche eine Infektion zuerst durch Wechselwirkung mit mukosalen Oberflächen auslösen.
Es ist bereits eine Anzahl von Strategien für die orale Immunisierung entwickelt worden, einschließlich der Verwendung abgeschwächter Mutanten von Bakterien (z. B. Salmonella spp.) als Träger heterologer Antigene [Cárdenas und Clements, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5: 328–342; Clements et al., 1992, in: Recombinant DNA Vaccines: Rationale and Strategy, Isaacson (Hrsg.), Marcel Decker, New York, Seiten 293–321; Clements und Cárdenas, 1990, Res. Microbiol. 141: 981–993; Clements und El-Morshidy, 1984, Infect. Immun. 46: 564–569], der Verkapselung von Antigenen in Mikrokapseln, welche aus Poly-DL-Lactidglycoliden (PGL) oder aus proteinähnlichen Polymer-Proteinoiden bestehen [Sanitago et al., 1993, Pharmaceutical Research 10: 1243–1247], Gelatinekapseln, verschiedene Formulierungen von Liposomen [Alving et al., 1986, Vakzine 4: 166–172; Garcon und Six, 1993, J. Immunol. 146: 3697–3702; Gould-Fogerite und Mannino, 1993, in: Liposome Technology, 2. Aufl., Bd. III, Gregoriadis (Hrsg.)], Adsorption auf Nanopartikeln, Verwendung lipophiler immunstimulierender Komplexe (ISCOMS) [Mowat und Donachie, 1991, Immunology Today 12: 383–385], und durch Zugabe bakterieller Produkte mit bekannten adjuvanten Eigenschaften [Clements et al., 1988, Vakzine 6: 269–277; Elson, 1989, Immunology Today 146: 29–33; Lycke und Holmgren, 1986, Immunology 59: 301–308; Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277–2281]. Die zwei bakteriellen Produkte mit dem größten Potenzial, um als orale Adjuvantien wirken zu können, sind das Choleratoxin (CT), das durch verschiedene Stämme von V. cholerae erzeugt wird, und das hitzelabile Enterotoxin (LT), welches durch einige enterotoxigene Stämme von Escherichia coli erzeugt wird. Obwohl LT und CT viele Merkmale gemeinsam haben, sind dies klar unterschiedliche Moleküle mit biochemischen und immunologischen Unterschieden, welche sie einzigartig machen.
Die extensive Diarrhö durch Cholera ist das Ergebnis eines potenten Exo-Enterotoxins, welches die Aktivierung von Adenylat-Cyclase hervorruft und eine nachfolgende Zunahme der intrazellulären Pegel des zyklischen 3'-,5'-Adenosinmonophosphats (cAMP). Das Cholera-Enterotoxin (CT) ist ein polymeres Protein mit einem Molekulargewicht von 84.000 Dalton, das aus zwei Hauptbereichen oder Domänen zusammengesetzt ist, die nicht kovalent verknüpft und immunologisch unterschiedlich sind („Cholera-A" und „Cholera-B") [Finkelstein und LoSpalluto, 1969, J. Exp. Med. 130: 185–202]. Von diesen ist der 56.000 Dalton-Bereich, der choleragenoide Bereich, verantwortlich für die Bindung des Toxins an den Rezeptor der Membran der Wirtszelle, G_MI (Galactosyl-N-acetylgalactosaminyl-(sialyl)-galactosyl-glucosyl-ceramid), welches auf der Oberfläche im Wesentlichen aller eukaryotischen Zellen gefunden wird. Der choleragenoide Bereich ist aus fünf nicht-kovalent miteinander verknüpften Untereinheiten zusammengesetzt, während der A-Bereich (27.000 Dalton) für diverse biologische Effekte des Toxins verantwortlich ist.
Die Beziehung der zwei Untereinheiten von CT bezüglich der immunologischen Eigenschaften des Moleküls war bereits die Ursache ausführlicher Debatten. Einerseits ist CT ein ausgezeichnetes Immunogen, das sowohl die Entwicklung von Antikörper-Antworten auf Serum-Antikörper und mukosalem Antitoxin-Antikörpern hervorruft, wenn es oral zugegeben wird. Dieser Befund ist nicht neu, da Cholerapatienten bekannt sind, bei denen sich die Titerzunahme der Antitoxin-Antikörper während der Konvaleszenz aus klinischer Cholera entwickelt [Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 69: 137–196]. Ein Schlüsselbefund dieser Untersuchung der Natur dieses Ansprechverhaltens war die Beobachtung, dass CT im Gegensatz zu den meisten anderen Protein-Antigenen keine orale Verträglichkeit gegen sich selbst auslöst [Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892–2897; Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 132: 2736–2741]. Dies wurde gleichfalls als wahr befunden, wenn gerade die B-Untereinheit an Mäuse verfüttert wurde, eine Beobachtung, die durch Feldversuche mit Choleravakzinen in Bangladesh substantiiert wurde, bei welchen die orale Immunisierung mit der B-Untereinheit kombiniert mit abgetöteten ganzen Zellen eine Zunahme des Ansprechverhaltens auf mukosale wie auch systemische Antitoxin-Antikörper ergab [Svennerholm et al., 1984, J. Infect. Dis. 149: 884–893].
In der internationalen Veröffentlichung WO 93/13202 werden genetische Mutanten des Choleratoxins oder des E. choli hitze-labilen Toxins und Vakzinezusammensetzungen, welche diese Mutanten umfassen, offenbart. Die Internationale Veröffentlichung WO 92/19625 offenbart die analogen Untereinheiten A und A₁ des mutanten Choleratoxins, welche ihre antigene Aktivität erhalten, und welche keine Toxizität aufweisen, Vakzinezusammensetzungen, welche diese Mutanten umfassen, und die orale Verabreichung dieser Vakzinezusammensetzungen. Loosmore et al. [Infection and Immunity, Bd. 58 (11), 1990, Seiten 3653–3662] offenbaren genetisch detoxifizierte Pertussis-Toxinanaloge zur Verwendung in Formulierungen für Keuchhustenvakzine. In jeder dieser Referenzen wird das mutierte Toxin als ein Antigen verwendet, um eine Immunantwort auszulösen, die wirksam gegen ein bakterielles Pathogen oder dessen Toxin sein soll.
GB 2,217,600 offenbart Vakzinezusammensetzungen, die als Adjuvans ADP-ribosylierte Toxine vom Wildtyp aufweisen.
Zusätzlich zu seiner Wirkung als potentes orales Immunogen hat CT eine Anzahl weiterer berichteter immunologischer Eigenschaften. Wie oben ausgeführt, beobachteten Elson und Ealding [Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892–2897], dass oral verabreichtes CT gegen sich selbst keine Verträglichkeit auslöst. Darüber hinaus resultierte die gleichzeitige orale Verabreichung von CT mit einem löslichen Proteinantigen, Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH), in der Entwicklung von Sekret-IgA-Ansprechverhalten sowohl gegen CT und KLH, und setzte auch die Induktion einer oralen Verträglichkeit gegen KLH außer Kraft. Diese Befunde wurden anschließend bestätigt und durch Lycke und Holmgren erweitert (Lycke und Holmgren, 1986, Immunology 59: 301–308). Verwirrung tritt ein, wenn man versucht, die Rolle der A- und B-Untereinheiten von CT bezüglich der adjuvanten Eigenschaften des Moleküls zu definieren. Die folgenden Beobachtungen, wie sie von Elson zusammengefasst wurden [Elson, 1989, Immunology Today 146: 20–33], sind die Grundlage für diese Verwirrung:

• CT induziert keine orale Verträglichkeit gegen sich selbst [Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892–2897].
• CT-B induziert keine orale Verträglichkeit gegen sich selbst [Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892–2897].
• CT kann die Induktion von Verträglichkeit gegen andere Antigene verhüten, mit denen es gleichzeitig zugeführt wird und dient auch als ein Adjuvans für diese Antigene [Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892–2897; Lycke und Holmgren, 1986, Immunology 59: 301–308].
• CT kann als ein Adjuvans für CT-B wirken [Elson und Ealding, 1984, J. Immunol. 133: 2892–2897].
• Hitze-aggregiertes CT besitzt nur eine geringe Toxizität, ist aber ein potentes orales Immunogen [Pierce et al., 1983, Infect. Immun. 40: 1112–1118].
• CT-B kann als ein immunologischer „Träger" in einer herkömmlichen Hapten-Träger-Konfiguration dienen [Cebra et al., 1986, in: Vaccines 86, Brown et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 129–133; McKenzie und Halsey, 1984, J. Immunol. 133: 1818–1824).

Eine Anzahl von Forschern hat aus diesen Befunden geschlossen, dass die B-Untereinheit eine inhärente adjuvante Wirkung besitzen muss. Die Befunde von Cebra et al. [Cebra et al., 1986, in: Vaccines 86, Brown et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 129–133], Lycke und Holmgren [Lycke und Holmgren, 1986, Immunology 59: 301–308], und Liang et al. [Liang et al., 1988, J. Immunol. 141: 1495–1501] würden gegen diese Schlussfolgerung sprechen. Cebra et al. [Cebra et al., 1986, in: Vaccines 86, Brown et al. (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Seiten 129–133] zeigten, dass gereinigte CT-B wirksam war die Häufigkeit spezifischer Anti-Cholera-Toxin-B-Zellen in Peyer's Patches zu erhöhen, wenn intraduodenal gegeben, was aber im Gegensatz zu CT in keiner signifikanten Anzahl von IgA-besetzten 8-Zellen resultierte. Lycke und Holmgren [Lycke und Holmgren, 1986, Immunology 59: 301–308] verglichen CT und CT-B auf die Fähigkeit, die mukosale Immunantwort des Darmes auf KLH durch Messung der Zellen in der Lamina propria von oral immunisierten Mäusen, welche Immunoglobulin sekretieren, zu verbessern. Sie fanden keine Zunahme der Zellen, welche Anti-KLH als Antwort auf irgendeine Dosis der B-Untereinheit erzeugen, die in ihrem System getestet wurden. Schließlich fanden Liang et al. [Liang et al., 1988, J. Immunol. 141: 1495–1501] keine adjuvante Wirkung, wenn CT-B in Verbindung mit inaktiviertem Sendai-Virus oral verabreicht wurde.
Wo eine adjuvante Wirkung für die isolierte B-Untereinheit beobachtet wurde, wurde dies typischer Weise aus einem der zwei Gründe gemacht. Zunächst war es zur Herstellung der B-Untereinheit ein herkömmliches Verfahren, Holotoxin der Dissoziationschromatographie durch Gelfiltration in Anwesenheit eines dissoziierend wirkenden Wirkstoffes auszusetzen (z. B. Guanidin-HCl oder Ameisensäure). Die isolierten Untereinheiten werden dann zusammengefasst und der dissoziierend wirkende Wirkstoff wird entfernt. Die B-Untereinheit, welche nach dieser Technik hergestellt wird, ist immer mit Spurenmengen der A-Untereinheit verunreinigt, so dass bei der Renaturierung eine kleine Menge des Holotoxins wieder entsteht. Der zweite Grund hat mit der Definition eines immunologischen Trägers zu tun. Wie viele andere lösliche Proteine kann die B-Untereinheit als ein immunologisches Vehikel zur Darreichung der Antigene an das Immunsystem dienen. Wenn diese Antigene genügend klein sind, so dass sie ein schwaches Immunogen darstellen, können sie in einer herkömmlichen Hapten-Träger-Konfiguration zu einem Immunogen gemacht werden. In gleicher Weise gibt es eine „theoretische" Immunverbesserung, die mit der B-Untereinheit verknüpft ist, insbesondere bei der oralen Darreichung, dadurch, dass sich die B-Untereinheit an die Oberfläche von Epitelzellen bindet und ein angeheftetes Antigen zum Verarbeitung durch den Darm in Verbindung mit Lymphgeweben immobilisieren kann. Jedoch kann jeglicher potenzieller Vorteil dieses Mechanismus der Antigenstabilisierung durch die Verteilung des Antigens über nicht-immunologisch relevante Gewebe aufgewogen werden, d.h. durch die Oberfläche der intestinalen Epitelzellen. In Zusammenhang mit mukosaler Ansprechempfindlichkeit sind die immunologisch relevanten Plätze die Peyer's Patches, insbesondere für antigenspezifische T-Zellen-abhängige B-Zellaktivierung [Strober und Jacobs, 1985, in: Advances in host defense mechanisms, Bd. 4, Mucosal Immunity, Gallin und Fauci (Hrsg.), Raven Press, New York, Seiten 1–30; Tomasi und Plaut, 1985, in: Advances in host defense mechanisms, Bd. 4, Mucosal Immunity, Gallin und Fauci (Hrsg.), Raven Press, New York, Seiten 31–61; Brandtzaeg, 1989, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146: 13–25]. Daher treten die Ereignisse bis zum isotypischen Umschalten von IgM-Zellen auf IgA-B-Zellen in den Peyer's Patches ein. Antigene, die sich auf der epitelischen Zelloberfläche befinden, können zur Vermehrung der B-Zellen, die durch Antigene ausgelöst wird, beitragen, dadurch, dass die Klasse II der positiven zottigen Epitelzellen als ein Antigen wirken kann, welches Zellen für die T-Zellen-Aktivierung am Sekretort präsentiert, wobei die Cytokinerzeugung, die Differenzierung der terminalen B-Zellen, die erhöhte Expression der Sekretkomponente und der erhöhte externe Transport von antigenspezifischer IgA erhöht wird [Tomasi, T.B., und A.G. Plaut, 1985, in: Advances in host defense mechanisms, Bd. 4, Mucosal Immunity, Gallin und Fauci (Hrsg.), Raven Press, New York, Seiten 31–61]. Diese Beziehungen dieser Vorgänge wurden nicht klar für die B-Untereinheit als Träger anderer Antigene definiert, und die Verwendung des Begriffs „Adjuvans" würde anscheinend für solch eine Wirkung ungeeignet sein.
Es ist klar, dass die adjuvante Eigenschaft des Moleküls im Holotoxin beruht, in welchem die B-Untereinheit für die Rezeptorerkennung erforderlich ist, und um die Penetration der A-Untereinheit in die Zelle zu erleichtern. Die A-Untereinheit ist gleichfalls erforderlich für die adjuvante Wirkung, vermutlich als eine Funktion ihrer ADP-ribosylierenden enzymatischen Aktivität und ihrer Fähigkeit, die intrazellulären Pegel von cAMP zu erhöhen (siehe unten). Die B-Untereinheit alleine kann als ein Träger anderer Antigene wirken dadurch, dass, wenn sie mit jenen Antigenen konjugiert wird, sie für die Verarbeitung durch Lymphgewebe, die mit dem Darm verknüpft sind, immobilisiert werden können.
Obwohl LT und CT viele Merkmale gemeinsam haben, stellen sie klar unterschiedliche Moleküle mit biochemischen und immunologischen Unterschieden dar, welche sie einzigartig machen, umfassend einen 20 %-igen Unterschied in der Nukleotid- und Aminosäuresequenzhomologie [Dallas und Falkow, 1980, Nature 288: 499–501 ]. Die zwei Toxine haben in vielen in vitro-Assays die gleiche Anzahl von Untereinheiten und die gleiche Anordnung, den gleichen biologischen Wirkungsmechanismus und die gleiche spezifische Wirkung [Clements und Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24: 760–769; Clements et al., 1980, Infect. Immun. 24: 91–97].
Es gibt jedoch signifikante Unterschiede zwischen diesen Molekülen, welche nicht nur ihre enterotoxischen Eigenschaften beeinflussen, aber auch ihre Fähigkeit als Adjuvans wirken zu können. Um damit zu beginnen bleibt LT im Gegensatz zu CT, das durch V. cholerae erzeugt wird, zellverknüpft und wird nur aus E. coli während der Zelllysis freigesetzt [Clements und Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24: 760–769). CT wird aus dem Vibrio als Sekret ausgeschieden, sobald es erzeugt wurde, und kann leicht in flüssigen Überständen von Kulturen identifiziert und daraus gereinigt werden. Folglich ist im Gegensatz zu CT LT nicht völlig biologisch wirksam, wenn es zunächst aus der Zelle isoliert wurde. In Übereinstimmung mit dem A-B-Modell für bakterielle Toxine erfordert LT die Proteolyse und die Disulfidreduktion, um vollständig wirksam zu sein. In Abwesenheit der proteolytischen Weiterverarbeitung ist die enzymatisch aktive A₁-Einheit ungeeignet von der A₂-Komponente zu dissoziieren, und kann ihr Zielsubstrat (Adenylat-Cyclase) auf der basolateralen Oberfläche der intestinalen Epitelzelle nicht erreichen. Dies stimmt auch für CT, aber die Proteasen im Überstand der Kultur, welcher das Toxin während der Herstellung ausgesetzt ist, führen die Proteolyse durch. Da LT nicht vollständig biologisch wirksam ist, ist es schwierig, es während der Reinigung unter Verwendung von in vitro-biologischen Assays, wie beispielsweise dem Y-1-Nebennierenzellassay oder dem Durchlässigkeitsfaktorassay, zu identifizieren.
Dieser Unterschied bei der Aktivierung des isolierten Materials resultiert in Unterschieden bei Schwellenwerten im Ansprechverhalten für LT und CT in biologischen Systemen. Beispielsweise induziert CT detektierbare Sekretion von reinem Fluid im Gedärm von Mäusen bei einer Dosis von 5–10 μg. LT induziert eine detektierbares reines Fluid im Gedärm von Mäusen bei Pegeln über 100 μg. In abgebundenen Schlaufen des Iliums in Kaninchen ist der Unterschied dramatisch und eindeutig. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass LT bei Primaten die Fluidsekretion bei einer beliebigen Dosis, die bis zu 1 mg getestet wurde, induziert. Dies ist die 200fache Menge an CT von der berichtet wurde, dass sie eine positive Fluidbewegung bei Menschen induziert. Wenn LT den proteolytischen Enzymen mit trypsinähnlicher Spezifität ausgesetzt wird, werden die Moleküle von CT in beliebigen biologischen Assaysystemen ununterscheidbar. Dies wurde klar durch Clements und Finkelstein gezeigt [Clements und Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24: 760–769].
Zusätzlich zu den oben berichteten Unterschieden hat LT eine ungewöhnliche Affinität für Matrices, welche Kohlenhydrate enthalten. LT mit einem Molekulargewicht von 90.000 eluiert spezifisch von Sephadex-Säulen (Glucose) mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 45.000, und von Agarose-Säulen (Galactose) mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 0. Das heißt, dass es sich an Matrices, welche Galactose enthalten, bindet, und von jenen Matrices in reiner Form durch Anwendung von Galactose eluiert werden kann. LT bindet sich nicht nur in Säulen an Agarose, die zur Reinigung verwendet werden, sondern, noch wichtiger, an andere biologische Moleküle, welche Galactose enthalten, einschließlich Glycoproteine und Lipopolysaccharide. Diese lektinähnlichen Bindungseigenschaften von LT resultieren für LT in einer breiteren Rezeptorverteilung in Säugerzellen im Vergleich zu CT, welches sich nur an G_MI bindet. Dies kann teilweise zu den berichteten Unterschieden in den Fähigkeiten dieser zwei Moleküle beitragen unterschiedliches Ansprechverhalten der Hilfs-T-Lymphozyten zu induzieren [McGhee et al., 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, Seite 21].
In diesen Studien, die von McGhee et al. berichtet wurden [McGhee et al., 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, Seite 21 ], wurde gezeigt, dass die orale Immunisierung von Mäusen mit Vakzinen wie beispielsweise Tetanus-Toxoid (TT) mit CT als einem mukosalen Adjuvans selektiv Zellen vom T_H2-Typ in den Peyer's Patches und in der Milz induziert, wie es durch TH-Zellen manifestiert wurde, welche IL-4 und IL-5 aber kein IL-2 oder INF-gamma erzeugen. [Ein vollständigerer Überblick des Cytokin-Netzwerks findet sich bei Arai et al., 1990, Ann. Rev. Biochem. 59: 783–836]. Es ist wichtig, dass CT, wenn es als mukosales Adjuvans verwendet wird, auch die antigenspezifischen IgE-Antworten zusätzlich zur IgA-Antwort verbessert. Eine solche Verbesserung des IgE-Ansprechverhaltens gefährdet ernsthaft die Gefahrlosigkeit von CT als ein mukosales Adjuvans gemäß der Aussicht, unmittelbar Überempfindlichkeitsreaktionen auszulösen. Im Gegensatz dazu induziert LT sowohl T_H1- wie auch T_H2-Zellen und vorwiegend antigenspezifische IgA-Anworten ohne IgE-Antworten, wenn es als ein oral verabreichtes mukosales Adjuvans verwendet wird.
Die zwei Moleküle können auch viele immunologische Unterschiede aufweisen, wie es durch Immundiffusionsstudien [Clements und Finkelstein, 1978, Infect. Immun. 21: 1036–1039; Clements und Finkelstein, 1978, Infect. Immun. 22: 709–713], in vitro-Neutralisationsstudien und durch den teilweisen Schutz gegen E. coli-Diarrhö, die mit LT verknüpft ist, bei Freiwilligen, welche Choleravakzine mit ganzen Zellen der B-Untereinheit erhielten [Clements et al., 1988, J. Infect. Dis. 158: 372–377] gezeigt wurde.
Zusammen genommen zeigen diese Befunde, dass LT und CT einzigartige Moleküle sind, trotz ihrer scheinbaren Ähnlichkeiten, und dass LT ein praktisches orales Adjuvans ist, wohingegen CT dieses nicht ist.
Das Aufzeigen der adjuvanten Eigenschaften von LT erwuchs aus einer Untersuchung des Einflusses von LT auf die Verträglichkeitsentwicklung oral verabreichter Antigene durch einen der gegenwärtigen Erfinder. Es war nicht klar, ob LT oder ob LT nicht auch die Induktion der oralen Verträglichkeit beeinflussen würde oder die adjuvanten Effekte zeigen würde, wie sie für CT bei den gegebenen beobachteten Unterschieden zwischen den zwei Molekülen gezeigt wurden. Folglich überprüften die vorliegenden Erfinder eine Anzahl von Parametern umfassend den Effekt von LT auf die orale Verträglichkeit auf OVA und die Rolle der zwei Untereinheiten von LT beim beobachteten Ansprechverhalten, die Wirkung beim Verändern der zeitlichen Zugabe und des Zugabewegs von LT, die Wirkung der vorherigen Exposition bezüglich OVA auf die Fähigkeit von LT, die Verträglichkeit bezüglich OVA beeinflussen zu können, die Verwendung von LT als ein Adjuvans mit zwei unverbundenen Antigenen und die Wirkung des Immunisierungswegs auf das Anti-OVA-Ansprechverhalten. Die Ergebnisse, welche aus diesen Untersuchungen erhalten wurden [Clements et al., 1988, Vaccine 6: 269–277; Clements et al., 1988, Abstract Nr. B91, 88. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol.] werden unten zusammengefasst:

1. Es wurde gezeigt, dass die gleichzeitige Verabreichung von LT mit OVA jeweils die Auslösung der Verträglichkeit auf OVA verhütet und das Ansprechverhalten des Serum-Anti-OVA-IgG um das 30- bis 90fache bei OVA- und PBS-primierten Tieren erhöht. Für diese Wirkung wurde ermittelt, dass sie eine Funktion der enzymatisch wirksamen A-Untereinheit des Toxins ist, da die B-Untereinheit alleine ungeeignet war, die Verträglichkeitsauslösung zu beeinflussen.
2. Tiere, welche mit LT gefüttert wurden, entwickelten mit OVA nach einer anfänglichen OVA-Primierung ein signifikant niedrigeres Serum-IgG-Ansprechverhalten und mukosales IgA-Anti-OVA-Ansprechverhalten im Vergleich zu jenen mit LT gefütterten Tieren mit OVA bei der anfänglichen Immunisierung, was anzeigte, dass die vorhergehende Exposition bezüglich des Antigens die Wirksamkeit von LT, die Verträglichkeit zu beeinflussen und seine Fähigkeit als ein Adjuvans zu wirken, vermindert. LT war nicht in der Lage, die Verträglichkeit aufzuheben, sobald es einmal eingeführt wurde. Es wurde gefunden, dass dies auch für CT zutrifft, wenn Tiere mit OVA vor der oralen Gabe von Ovalbumin plus CT prä-immunisiert wurden, und dies einigen Einblick in die günstige Beobachtung anbietet, dass das Ansprechverhalten von Antikörpern auf nicht gezielte dietätische Antigene nicht erhöht wird, wenn diese Adjuvantien verwendet werden.
3. Das Ansprechverhalten von Serum-IgA und mukosaler IgA in Tieren, welche LT bei einer einzigen Gelegenheit erhielten, nämlich bei der ersten Exposition zum Antigen, waren äquivalent zum Ansprechverhalten nach drei OVA-LT-Primierungen, was anzeigte, dass die Festlegung auf die Ansprechempfindlichkeit früh und bei der ersten Exposition zum Antigen geschieht. Es wurde auch gezeigt, dass die Richtung des Ansprechverhaltens auf entweder vorwiegend Serum-IgG oder mukosale IgA dadurch kontrolliert werden kann, dass man eine parenterale zusätzliche Dosis verabreicht oder diese nicht verabreicht.
4. Die gleichzeitige Verabreichung von LT mit zwei löslichen Proteinantigenen führt zur Entwicklung von Serumantikörpern und mukosalen Antikörpern gegen beide Antigene, sofern das Tier keine vorherige immunologische Erfahrung mit diesen Antigenen aufweist. Dies war ein wichtiger Befund, da eine mögliche Anwendung von LT als Adjuvans die Entwicklung von mukosalen Antikörpern gegen komplexe Antigene wäre, beispielsweise abgetötete Bakterien oder Viren, wobei die Fähigkeit sehr wichtig sein würde, auf mehrere Antigene zu reagieren.

Studien von Tamura et al. [Tamura et al., US 5,182,109 ] zeigten, dass intranasal verabreichtes LT und/oder CT den Antikörpertiter gegen ein mit verabreichtes Antigen verbesserten. Jedoch wird nirgendwo bei Tamura et al. gelehrt, dass diese Toxine eine Schutzantwort des Immunsystems bei oraler Verabreichung auslösen.
Offensichtlich hat LT ein signifikantes regelndes Potenzial für das Immunsystem, sowohl als ein Mittel zur Vermeidung der Verträglichkeitsauslösung auf spezifische Antigene und als ein Adjuvans für oral verabreichte Antigene, und es löst die Erzeugung sowohl von Serum-IgG und mukosaler IgA gegen Antigene aus, mit denen es zugeführt wird. Daraus ergibt sich die Möglichkeit eines wirksamen Immunisierungsprogramms gegen eine Vielzahl von Pathogenen, umfassend die orale Verabreichung von abgetöteten oder abgeschwächten Wirkstoffen oder relevanten virulenten Determinanten spezifischer Wirkstoffe. Jedoch kann die Tatsache, dass dieses „Toxin" ein rein luminales sekretorisches Ansprechverhalten auslösen kann, bei proteolytischer Spaltung, beispielsweise durch Darmproteasen, oder bei oraler Verabreichung in Konzentrationen, die hoch genug sind, die Erforschung seines Potenzials behindern oder kann seine Verwendung unter geeigneten Bedingungen verhüten. Dieses Problem könnte gelöst werden, wenn LT „detoxifiziert" werden könnte, ohne die adjuvanten Eigenschaften der Moleküle zu vermindern. Um abzuschätzen, wie dies bewerkstelligt werden könnte, ist es notwendig, den Wirkmechanismus von LT und CT und die strukturellen und funktionellen Beziehungen dieser Moleküle weiter zu analysieren. Wie vorstehend gezeigt, werden LT und CT hergestellt als Toxine mit Multiuntereinheiten, die A- und B-Komponenten aufweisen. Nach der anfänglichen Wechselwirkung des Toxins mit dem Rezeptor der Membran der Wirtszelle erleichtert der B-Bereich die Penetration der A-Untereinheit durch die Zellmembran. Bei der Thiolreduktion dissoziiert diese A-Komponente in zwei kleinere Polypeptidketten. Eine von diesen, das A₁-Stück, katalysiert die ADP- Ribosylierung des stimulierenden GTP-bindenden Proteins (G_S) im Adenylat-Cyclase-Enzymkomplex auf der basolateralen Oberfläche der Epitelzelle, und dies führt zu einer Zunahme der intrazellulären Pegel von cAMP. Die resultierende Zunahme im cAMP verursacht die Sekretion von Wasser und von Elektrolyten in den Dünndarm durch Wechselwirkung mit zwei cAMP-empfindlichen Ionentransportmechanismen, welche umfassen: 1) den gleichzeitigen Transport von NaCl über den Bürstensaum der zottigen Epitelzellen und 2) die elektrogene Na⁺-abhängige Cl^–-Sekretion durch Cryptzellen [Field, 1980, in: Secretory diarrhea, Field et al. (Hrsg.), Waverly Press, Baltimore, Seiten 21–30]. Die A-Untereinheit ist ebenfalls die Haupteinheit, die mit der Immunverbesserung durch diese Toxine verknüpft ist. Diese Untereinheit wird dann ein wahrscheinliches Ziel für Manipulation, um die toxischen und immunologischen Funktionen der Moleküle aufzutrennen. Ein kürzlicher Bericht von Lycke et al. [Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277–2281] macht es klar, dass Veränderungen, welche die ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität des Toxins beeinträchtigen und seine Fähigkeit verändern, intrazelluläre Pegel von cAMP zu erhöhen, auch das Molekül daran hindern, als ein Adjuvans zu funktionieren. Folglich musste ein weiterer Ansatz für die Detoxifizierung erforscht werden.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Unter einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein mutiertes E. coli Hitze-labiles Enterotoxin-Holotoxin zur Verfügung gestellt, bei welchem Arginin an der Aminosäureposition 192 der A-Untereinheit des Holotoxins durch Glycin ersetzt ist, wobei das Holotoxin im Wesentlichen weniger toxisch als natives E. coli Hitze-labiles Enterotoxin-Holotoxin ist, gemessen im Y-1-Nebennierenzellassay, und welches immunologische Adjuvans-Aktivität aufweist, aber welchem ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität, gemessen im NAD-Agmatin-ADP-Ribosyltransferaseassay fehlt.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Beobachtung, dass eine mutierte Form von LT, die ihre toxische Wirkung verloren hat, und die keine ADP-Ribosyltransferaseaktivität besitzt, immer noch ihre Aktivität als ein immunologisches Adjuvans erhält. Die mutierte Form von LT unterscheidet sich vom Wildtyp durch eine einzige Aminosäuresubstitution, Arg₁₉₂-Gly₁₉₂, wodurch ein trypsinempfindlicher Mutationsort unempfindlich gemacht wird. Der Verlust des proteolytischen Mutationsorts verhindert die proteolytische Verarbeitung der A-Untereinheit zu ihrer toxischen Form. Natives LT ist nicht-toxisch, wenn es zunächst aus dem Bakterium isoliert wird, hat jedoch das Potenzial völlig toxisch zu werden, wenn es den Proteasen ausgesetzt ist, beispielsweise jenen, die im Darm von Säugern gefunden werden. Die mutierte Form von LT weist nicht länger das Potenzial auf infolge der proteolytischen Aktivierung toxisch zu werden. Dieses mutierte LT (hier als mLT bezeichnet) erhält die Fähigkeit der Verbesserung der Immunantwort eines Lebewesens (beispielsweise IgG, IgA) auf ein Antigen, das zu LT oder mLT nicht in Beziehung steht, ohne dass toxische Nebenwirkungen auftreten. Der experimentelle Beweis zeigt, dass mLT die Eignung als Adjuvans für oral verabreichte Antigene aufweist; eine solche Verabreichung führt zur Erzeugung von Serum-IgG und/oder mukosalem sIgA gegen das Antigen, mit dem mLT zugeführt wird.
Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verwendungen ermöglichen einen verbesserten Modus der oralen Immunisierung zur Entwicklung von Serum und mukosalen Antikörpern gegen pathogene Mikroorganismen. Die Erzeugung des IgA-Antikörper-Ansprechverhaltens gegen pathogene Mikroorganismen, welche durch mukosale Oberflächen penetrieren oder in diese eindringen, kann auf besagte Oberflächen gerichtet werden, während ein signifikantes Serum-Antikörper-Ansprechverhalten entwickelt werden kann, um die Infektion durch pathogene Mikroorganismen zu verhüten, gegen die Serumantikörper schützend wirken. Die vorliegende Erfindung kann für jedes spezifische Antigen verwendet werden, bei dem ein spezifisches neutralisierendes Antikörper-Ansprechverhalten nützlich sein würde, um den physiologischen Zustand oder den Krankheitszustand abzutrennen, der mit diesem Antigen verknüpft ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur Verfügung, die als eine Komponente einer Vakzine gegen enterotoxische bakterielle Organismen verwendbar ist, welche choleraähnliche Enterotoxine exprimieren, und seine Verwendung. Die Zusammensetzung umfasst eine wirksame Menge von mLT in Kombination mit einer wirksamen Menge des Antigens.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung, auf die Beispiele der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung und durch die angefügten Figuren.
1: ist ein schematisches Diagramm des Plasmids pBD94, welches sowohl für die Untereinheit A wie auch B unter Kontrolle des lac-Promotors kodiert. Plasmid pBD95 enthält die einzige grundlegende Substitution am Aminosäurerest 192 der Untereinheit A, und kodiert für Gly statt für Arg, was den Leserahmen erhält aber den proteolytischen Spaltungssort eliminiert. Die Aminosäuresequenz entspricht dem Bereich der Trypsinempfindlichkeit, wobei der Ort der Aminosäuresubstitution Arg₁₉₂-Gly₁₉₂ gezeigt wird.
2: ist eine graphische Darstellung der dosisabhängigen Zunahme in den Pegeln von ADP-Ribosylagmatin als Funktion zunehmender Mengen CT.
3: zeigt die fluide Akkumulation nach Zugabe von 125 μg nativem LT, aber nicht nach Zugabe von 125 μg mLT an Mäuse. Das Darm-Körper-Verhältnis wird definiert als das intestinale Gewicht dividiert durch das verbleibende Körpergewicht.
4: zeigt die Fähigkeit von mLT, als ein immunologisches Adjuvans zu wirken. 4A zeigt die Fähigkeit von mLT, eine Serum-IgG-Antwort auf OVA zu induzieren. 4B zeigt die Fähigkeit von mLT, eine mukosale sIgA-Antwort auf OVA zu induzieren.
5: ist eine experimentelle Darstellung, dass mLT die Fähigkeit erhält, die Auslösung oraler Verträglichkeit auf LT zu verhüten. 5A zeigt die Fähigkeit von mLT, eine Serum-IgG-Antwort auf LT zu induzieren. 5B zeigt die Fähigkeit von mLT, eine mukosale sIgA-Antwort auf LT zu induzieren.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst eine Zusammensetzung und deren Verwendung, um die Erzeugung von mukosalen Antikörpern und Serum-Antikörpern gegen Antigene zu fördern, welche gleichzeitig mit einem genetisch modifiziertem bakteriellen Toxin oral verabreicht werden. Das modifizierte Toxin ist eine Form des Hitze-labilen Enterotoxin (LT) von E. coli, welches durch Genmanipulation seinen trypsinempfindlichen Ort verloren hat, was das Molekül nicht-toxisch macht, was aber in unerwarteter Weise seine Fähigkeit erhält, als ein immunologisches Adjuvans zu wirken. Das mutierte LT wird hier als „mLT" bezeichnet. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass mLT als ein immunologisches Adjuvans genauso wirksam ist wie LT, was ein unerwartetes und überraschendes Ergebnis ist. mLT weist nicht länger die enzymatische Aktivität der ADP-Ribosylierung auf, da die A-Untereinheit nicht länger proteolytisch verarbeitet werden kann. Im Gegensatz zu veröffentlichten Studien von Lycke und Kollegen, welche klarmachten, dass Änderungen, welche die ADP-ribosylierende Aktivität von LT bewirken, auch das Molekül daran hindern, als ein immunologisches Adjuvans zu wirken [Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277–2281], das vorliegend beschriebene mLT erhält seine Aktivität als ein immunologisches Adjuvans, obwohl es keine ADP-ribosylierene Aktivität besitzt, wie es in den Beispielen gezeigt wird.
Die neue mutiere Form des Hitze-labilen Enterotoxins von E. coli, mLT, wie hier beschrieben, benimmt sich als ein Adjuvans und löst die Erzeugung sowohl von Serum-IgG und mukosaler sIgA gegen Antigene aus, mit denen es zugeführt wird. Die Verwendbarkeit dieser überraschenden Entdeckung ist die, dass eine wirksame adjuvante Menge an mLT in einem wirksamen Immunisierungsprogramm gegen eine Vielzahl von Pathogenen verwendet werden kann, umfassend die orale Verabreichung einer wirksamen Menge des mLT-Adjuvans in Mischung mit abgetöteten oder abgeschwächten Pathogenen oder relevanten virulenten Determinanten spezifischer Pathogene, ohne dass befürchtet werden muss, dass reale oder potenzielle toxische Nebenwirkungen auftreten, welche mit der oralen Verabreichung von CT oder LT verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung ersetzt den Stand der Technik dadurch, dass die vorliegende Erfindung in einer Vielzahl von Immunanwendungen eingesetzt werden kann, bei denen bereits CT, LT oder Untereinheiten von CT oder LT verwendet werden konnten, wohingegen es jetzt mit mLT keine realistischen oder potenziellen Nebenwirkungen gibt, wie beispielsweise Diarrhö, die mit dieser Anwendung verbunden sind. Im Gegensatz zu LT, welches, obwohl es nicht toxisch ist wenn es zunächst aus dem Bakterium isoliert wird, das Potenzial hat, vollständig toxisch zu werden, wenn es den Proteasen ausgesetzt wird, beispielsweise jenen, die in den Därmen von Säugern gefunden werden, hat mLT nicht das Potenzial infolge der proteolytischen Aktivierung toxisch zu werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die einer Komponente einer Vakzine gegen enterotoxische Organismen, welche choleraähnliche Toxine exprimieren. Die vorliegenden Erfinder haben gezeigt, dass mLT bei Verabreichung nicht der oral induzierten Immunverträglichkeit ausgesetzt ist (siehe unten), daher kann mLT wirken, wobei es als eine Komponente von Vakzinen hoch erwünscht ist, die gegen enterotoxische Organismen gerichtet sind. Die gängige Technologie ermöglicht Vakzine gegen choleraähnliche toxinexprimierende Organismen enthaltend abgetötete ganze Zellen und die B-Untereinheit des Toxins. Durch Ersatz der B-Untereinheit durch mLT in der Vakzine wird die Vakzine auf zwei verschiedenen Wegen verbessert. Zuerst wird mLT, welches sowohl die A- und die B-Untereinheiten aufweist, nun eine Immunantwort nicht nur bezüglich der B-Untereinheit auslösen, sondern auch bezüglich der A-Untereinheit. Dies ermöglicht mehr Epitope für die wirksame Neutralisation. Zweitens wird die adjuvante Aktivität, welche inhärent in mLT vorliegt, die Immunantwort gegen die abgetötete ganze Zellkomponente der Vakzine verbessern.
Weiter haben andere Forscher [Häse et al., 1994, Infect. Immun. 62: 3051–3057] gezeigt, dass die A-Untereinheit, die so modifiziert wurde, dass sie durch Veränderung des aktiven Bindungsorts der ADP-ribosylierenden Enzymaktivität nicht länger toxisch ist (der gegenüber dem proteolytischen Spaltungsort liegt, der der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist), eine Immunantwort gegen den Wildtyp der A-Untereinheit auslösen kann. Jedoch fehlt der so modifizierten A-Untereinheit die immunologische adjuvante Aktivität, so dass diese im Vergleich zu mLT als Vakzinekomponente weniger erwünscht ist.
Darüber hinaus kann, da Antikörper gegen mLT mit LT und CT über Kreuz reagieren, mLT in Vakzinen verwendet werden, die gegen viele Typen enterotoxischer bakterieller Organismen gerichtet sind, welche choleraähnliche Toxine exprimieren, beispielsweise Escherichia spp. und Vibrio spp.
5.1 Erzeugung von mLT
Das Wildtyp-LT-Toxin ist auf einem natürlich auftretenden Plasmid kodiert, welches in Stämmen von enterotoxigenen E. coli gefunden wird, die in der Lage sind, dieses Toxin zu erzeugen. Die gegenwärtigen Erfinder hatten früher das LT-Gen aus einer menschlichen Abtrennung von E. coli kloniert, welches als H10407 bezeichnet wurde. Dieser Subklon besteht aus einem 5,1 kb DNA-Fragment aus dem Enterotoxinplasmid von H10407, welches in den PstI-Ort des Plasmids pBR322 eingefügt wurde [Clements et al., 1983, Infect. Immun. 40: 653]. Dieses rekombinante Plasmid, welches als pDF82 bezeichnet wurde, ist bereits ausführlich charakterisiert worden, und exprimiert LT unter Kontrolle des nativen LT-Promotors. Der nächste Schritt in diesem Verfahren war, das LT-Gen unter Kontrolle eines starken Promotors zu ersetzen, in diesen Fall durch den lac-Promotor auf Plasmid pUC18. Dies wurde für LT-A und LT-B getrennt durch Isolieren der Gene und durch Rekombination in einer Kassette im Vektorplasmid bewerkstelligt. Dies war ein wichtiger Schritt, da das Verfahren die Reinigung vernünftiger Mengen von LT und davon abgeleiteter Mutanten für die nachfolgende Analyse erlaubte. Dieses Plasmid, welches als pBD94 bezeichnet ist, ist diagrammatisch in 1 gezeigt.
Sowohl CT als auch LT werden mit einer trypsinempfindlichen Peptidbindung erzeugt, welche die A₁- und A₂-Stücke verbindet. Diese Peptidbindung muss eingeschnitten werden, damit das Molekül „toxisch" ist. Dies stimmt auch für das Diphterietoxin, dem prototypischen A-B-Toxin, und für eine Vielfalt anderer bakterieller Toxine. Falls die A₁-A₂-Bindung nicht entfernt wird, entweder durch bakterielle Proteasen oder durch intestinale Proteasen im Lumen der Gedärme, kann das A₁-Stück nicht sein Ziel auf der basolateralen Oberfläche der intestinalen Epitelzelle erreichen. Im Gegensatz zu CT ist LT nicht völlig biologisch aktiv, wenn es zunächst aus der Zelle isoliert wird. LT erfordert gleichfalls die Proteolyse, damit es voll aktiv wird, und die proteolytische Aktivierung findet nicht innerhalb des Bakteriums statt. Daher ist es ein Mittel zur Veränderung der Toxizität des Moleküls ohne die ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen, die trypsinempfindlichen Aminosäuren durch Genmanipulation zu entfernen, welche die A₁- und A₂-Komponenten der A-Untereinheit verbinden. Wenn das Molekül nicht proteolytisch gespaltet werden kann, wird es auch nicht toxisch sein. Der Fachmann würde voraussagen, dass das Molekül jedoch seine ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität und folglich seine adjuvante Funktion erhalten sollte.
1 zeigt die Sequenz des dem Disulfid entgegengesetzten Bereichs, der die A₁- und A₂-Stücke trennt. Innerhalb dieses Bereichs gibt es einen einzigen Argininrest, von dem geglaubt wird, dass er der Ort der Spaltung ist, die notwendig ist, um die toxischen Eigenschaften des Moleküls zu aktivieren. Dieser Bereich wurde durch Mutagenese verändert, die auf diesen Ort gerichtet ist, in einer solchen Weise, dass das Molekül bezüglich der proteolytischen Verdauung unempfindlich gemacht und daher nicht toxisch wird.
Die Mutagenese, die auf den Mutationsort gerichtet ist, wird bewerkstelligt durch Hybridisierung eines einzigen DNA-Strangs eines synthetischen Oligonukleotids, das komplementär zum einsträngigen Templat ist, mit der Ausnahme eines Bereichs der Fehlanpassung in der Nähe des Zentrums. Es ist der Bereich, der den gewünschten Nukleotidwechsel oder die Wechsel enthält. Im Anschluss an die Hybridisierung mit der einsträngigen Ziel-DNA wird das Oligonukleotid mit DNA-Polymerase verlängert, um eine doppelsträngige Struktur zu erzeugen. Die Einkerbung wird dann mit DNA-Ligase versiegelt und die Duplexstruktur wird in einen E. coli-Wirt transformiert. Die theoretische Ausbeute an Mutanten unter Verwendung dieses Verfahrens liegt bei 50 % infolge des halbkonservativen Modus der DNA-Replikation. In der Praxis ist die Ausbeute viel niedriger. Es gibt jedoch eine Anzahl von verfügbaren Verfahren, um die Ausbeute zu verbessern, und um Mutanten, die auf das Oligonukleotid gerichtet sind, zu selektieren. Das eingesetzte System verwendete ein zweites mutagenes Oligonukleotid, um veränderte Restriktionsorte in einer Doppel-Mutationsstrategie zu erzeugen.
Der nächste Schritt bestand darin, eine weitere Aminosäure durch Arg zu ersetzen (d.h. GGA = Gly ersetzt AGA = Arg), wobei der Leserahmen beibehalten wird, wohingegen der proteolytische Spaltungsort eliminiert wird. mLT wurde dann durch Affinitätschromatographie an Agarose vom einen Mutanten (pBD95) gereinigt, der bereits durch Sequenzierung bestätigt wurde. Alternative Verfahren zur Reinigung sind dem Fachmann ersichtlich. Dieses mutierte LT, bezeichnet als LT₍ _R1 ₉ _2G ₎ wurde dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf Modifizierung der trypsinempfindlichen Bindung überprüft. Es wurden Beispiele mit und ohne Exposition zum Trypsin überprüft und mit nativer (unmodifizierter) LT verglichen. mLT dissoziiert nicht in A₁ und A₂, wenn es mit Trypsin inkubiert wird, wobei angezeigt wird, dass die Empfindlichkeit gegenüber Protease entfernt worden ist.
5.2 Verabreichungsart des mLT und damit nicht verbundener Antigene
mLT kann in Verbindung mit jedem biologisch relevanten Antigen und/oder Vakzin verabreicht werden, so dass eine verstärkte Immunantwort auf besagtes Antigen und/oder Vakzin erreicht wird. Das mLT und das Antigen werden gleichzeitig in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, welche eine wirksame Menge an mLT und eine wirksame Menge des Antigens enthält. Die Verabreichungsart ist oral. Die jeweiligen Mengen an mLT und Antigen variieren in Abhängigkeit der Identität des eingesetzten Antigens und der Spezies des Lebewesens, das immunisiert werden soll. In einer Ausführungsform folgt der ersten Verabreichung des mLT und des Antigens eine zusätzliche Dosis des relevanten Antigens. Alternativ dazu wird keine zusätzliche Dosis verabreicht. Der Zeitpunkt der zusätzlichen Dosis kann in Abhängigkeit vom Antigen und der Spezies variieren, die behandelt wird. Die Modifikationen in der Dosierung und dem Zeitpunkt der zusätzlichen Dosis sind für jede gegebene Spezies und für jedes Antigen durch Routineexperimente leicht bestimmbar. Die zusätzliche Dosis kann aus dem Antigen alleine oder in einer Kombination mit mLT bestehen. Die Art der Verabreichung der zusätzlichen Dosis kann entweder oral, nasal oder parenteral sein; wenn mLT in der zusätzlichen Dosis verwendet wird, erfolgt die Verabreichung vorzugsweise jedoch oral.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind sowohl für noch nicht voll entwickelte wie auch voll entwickelte Wirbeltiere bestimmt, besonders für Vögel, Säugetiere und Menschen. Verwendbare Antigene umfassen beispielsweise, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Antigene aus pathogenen Stämmen von Bakterien (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Versinia enterocolitica, Versinia pestis, Versinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); pathogene Pilze (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); Protozoen (Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); oder Helminthen (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Chistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, und Hakenwürmer); die entweder dem Immunsystem in Form einer ganzen Zelle oder in Form von Teilen isoliert aus Mediumkulturen dargereicht werden, die so aufgebaut sind, dass darauf besagte Organismen wachsen, und die im Stand der Technik bekannt sind, oder Schutzantigene aus besagten Organismen, die durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten werden.
Andere relevante Antigene sind pathogene Viren (beispielsweise, aber nicht beschränkt auf: Poxviridae, Herpesviridae, Herpes Simplex Virus 1, Herpes Simplex Virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, Influenzaviren, Parainfluenzaviren, Mumps, Masern, Respiratory-Syncytial Viren, Rubella, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, Hepatitis A Virus, Hepatitis B Virus, Hepatitis C Virus, Hepatitis E Virus, Nicht-A/Nicht-B Hepatitis Virus, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae und HIV), die entweder dem Immunsystem in ganzer Form oder in Teilform isoliert aus Medienkulturen dargereicht werden, die so aufgebaut sind, dass darauf solche Viren wachsen, und die im Stand der Technik bekannt sind, oder Schutzantigene, die daraus durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten werden.
Weitere Beispiele relevanter Antigene umfassen Vakzine, sind aber nicht begrenzt darauf. Beispiele für solche Vakzine umfassen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Influenza-Vakzin, Pertussis-Vakzin, Diphterie- und Tetanus-Toxoid kombiniert mit Pertussis-Vakzin, Hepatitis A-Vakzin, Hepatitis B-Vakzin, Hepatitis C-Vakzin, Hepatitis E-Vakzin, Japanische Encephalitis-Vakzin, Herpes-Vakzin, Masern-Vakzin, Rubella-Vakzin, Mumps-Vakzin, gemischte Vakzine von Masern, Mumps und Rubella, Papillomavirus-Vakzin, Parvovirus-Vakzin, Respiratory-Syncytial-Virus-Vakzin, Lyme-Erkrankung-Vakzin, Polio-Vakzin, Malaria-Vakzin, Varicella-Vakzin, Gonorrhö-Vakzin, HIV-Vakzin, Schistosomiasis-Vakzin, Rota-Vakzin, Mycoplasma-Vakzin, Pneumokokken-Vakzin, Meningokokken-Vakzin und andere. Diese können durch allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden. Im Allgemeinen umfassen solche Vakzine entweder den gesamten Organismus oder den Virus, der durch Techniken gezüchtet und isoliert wurde, die dem Fachmann bekannt sind, oder umfassen relevante Antigene dieser Organismen oder Viren, welche durch Techniken der genetischen Manipulation oder durch chemische Synthese erzeugt werden können. Ihre Herstellung wird durch das Folgende gezeigt, ist aber nicht darauf begrenzt:
Influenza-Vakzin:
Ein Vakzin, das das gesamte oder einen Teil von Hemagglutinin, Neuraminidase, Nukleoprotein und ein Matrixprotein umfasst, welches durch Reinigen eines Virus erhältlich ist, der in Eiembryos wächst, mit Ether und Detergenzien, oder durch Techniken der Genmanipulation oder der chemischen Synthese.
Pertussis-Vakzin:
Ein Vakzin, umfassend das ganze oder einen Teil des Pertussis-Toxins, Hemagglutinins und K-Agglutins, welche aus einem K-virulenten Toxin mit Formalin erhalten wurden, welches durch Aussalzen oder durch Ultrazentrifugieren aus der Kulturbrühe oder den bakteriellen Zellen von Bordetella pertussis erhalten wurde, oder durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese.
Diphtherie- und Tetanus-Toxoid kombiniert mit Pertussis-Vakzin:
Ein Vakzin-Gemisch mit Pertussis-Vakzin, Diphterie- und Tetanus-Toxoid.
Japanische-Encephalitis-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend das ganze oder einen Teil eines antigenen Proteins, welches durch intracerebrales Kultivieren eines Virus in Mäusen und durch Reinigen der Virusteile durch Zentrifugieren oder durch Ethylalkohol und durch Inaktivierung desselben erhalten wird, oder durch Techniken der genetischen Manipulation oder durch chemische Synthese.
Hepatitis B-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend das ganze oder einen Teil eines Antigenproteins, welches durch Isolieren und Reinigen der HBs des Antigens durch Aussalzen oder Ultrazentrifugation, erhalten aus mit Hepatitis infiziertem Blut, erhalten wird, oder durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese.
Masern-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend den ganzen oder einen Teil eines Virus, der in kultivierten Zellen von Hühnerembryos oder Eiembryos wächst, oder ein Schutzantigen, das durch Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Rubella-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend den ganzen oder einen Teil eines Virus, der in Zellkulturen von Hühnerembryos oder in Eiembryos wächst, oder ein Schutzantigen, das durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Mumps-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend den ganzen oder einen Teil eines Virus, der in Kulturen von Kaninchenzellen oder Eiembryos wächst, oder ein Schutzantigen, das durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Gemischte Vakzine von Masern, Rubella und Mumps:
Ein Vakzin hergestellt durch Mischen von Masern-, Rubella- und Mumps-Vakzinen.
Rota-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend den ganzen oder einen Teil eines Virus, der in Zellkulturen von MA 104 wächst oder aus den Fäkalien von Patienten isoliert wird, oder ein Schutzantigen, das durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Mycoplasma-Vakzin:
Ein Vakzin umfassend die ganzen oder Teile von Mycoplasma-Zellen, die in einem flüssigen Kulturmedium für Mycoplasma aufwachsen, oder ein Schutz-Antigen, das durch Techniken der Genmanipulation oder durch chemische Synthese erhalten wurde.
Diese Bedingungen, unter denen ein wirksamer Schutz durch das vorliegende Verfahren erreicht werden kann, sind dem Fachmann offensichtlich.
Die Zusammensetzungen der Vakzinpräparation der vorliegenden Erfindung können durch Mischen der oben dargestellten Antigene und/oder Vakzine mit mLT in einem gewünschten Verhältnis durchgeführt werden. Die Herstellung sollte streng aseptisch durchgeführt werden, und jede Komponente sollte auch aseptisch sein. Pyrogene oder Allergene sollten natürlich so vollständig wie möglich entfernt werden. Die Antigenpräparation der vorliegenden Erfindung kann durch getrenntes Herstellen des Antigens per se und des mLT verwendet werden.
Weiter umfasst die vorliegende Erfindung ein Kit umfassend eine wirksame Menge eines Antigens und einer als Adjuvans wirksamen Menge des mLT. Bei Verwendung können die Komponenten des Kits entweder zuerst zusammengemischt und dann oral verabreicht werden, oder die Komponenten können getrennt innerhalb einer kurzen Zeitspanne oral verabreicht werden.
Die Zusammensetzungen der Vakzinpräparation der vorliegenden Erfindung können entweder mit einem flüssigen oder festen pharmazeutischen Träger kombiniert werden, und die Zusammensetzungen können in Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granulaten, Suspensionen oder Lösungen vorliegen. Die Zusammensetzungen können auch geeignete Konservierungsmittel, färbende Mittel und Geschmacksmittel oder Wirkstoffe enthalten, welche eine langsame Freisetzung hervorrufen. Potenzielle Träger, die in der Präparation der pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Gelatinekapseln, Zucker, Cellulosederivate, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Gelatine, Talk, Magnesiumstearat, vegetabile Öle wie beispielsweise Erdnussöl, etc., Glycerin, Sorbit, Agar und Wasser. Die Träger können auch als Bindemittel dienen, um die Tablettierung der Zusammensetzungen für eine bequeme orale Verabreichung zu erleichtern.
Die Zusammensetzung der Vakzinpräparation der Erfindung kann in einer stabilen Lagerform gebrauchsfertig durch Lyophilisierung oder durch andere Mittel erhalten werden, die dem Fachmann bekannt sind. Für die orale Verabreichung kann die Vakzinpräparation als Suspension in einer gepufferten Salzlösung, in Milch oder in anderen physiologisch verträglichen flüssigen Medien hergestellt werden. Das Medium kann durch Zusatz geeigneter färbender Stoffe oder Geschmacksstoffe schmackhafter gemacht werden, so wie es gewünscht wird.
Der Verabreichung der Zusammensetzungen der Vakzinpräparation kann eine orale Dosis einer wirksamen Menge eines Wirkstoffes vorausgehen, der die Magensäure neutralisiert. Obwohl viele Verbindungen für diesen Zweck verwendet werden können, ist die Verwendung von Natriumbicarbonat bevorzugt. Alternativ dazu können die Vakzinzusammensetzungen in enterisch beschichteten Kapseln zugeführt werden (d.h. Kapseln, die sich nur auflösen, wenn sie den Magen durchlaufen).
6. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind nur zum Zwecke der Beschreibung dargestellt und sollen den Umfang der Erfindung keineswegs begrenzen.
6.1 Herstellung von mLT
Das Wildtyp-LT-Toxin ist auf einem natürlich auftretenden Plasmid kodiert, welches in Stämmen von enterotoxigenen E. coli gefunden wird, die in der Lage sind, dieses Toxin zu erzeugen. Die gegenwärtigen Erfinder hatten früher das LT-Gen aus einer menschlichen Abtrennung von E. coli kloniert, welches als H10407 bezeichnet wurde. Dieser Subklon besteht aus einem 5,1 kb-DNA-Fragment aus dem Enterotoxinplasmid von H 10407, welches in den PstI-Ort des Plasmids pBR322 eingefügt wurde [Clements et al., 1983, Infect. Immun. 40: 653]. Dieses rekombinante Plasmid, welches als pDF82 bezeichnet wurde, ist bereits ausführlich charakterisiert worden, und exprimiert LT unter Kontrolle des nativen LT-Promotors. Der nächste Schritt in diesem Verfahren war, das LT-Gen unter Kontrolle eines starken Promotors zu ersetzen, in diesem Fall durch den lac-Promotor auf Plasmid pUC18. Dies wurde für LT-A und LT-B getrennt durch Isolieren der Gene und durch Rekombination in einer Kassette im Vektorplasmid bewerkstelligt. Dies war ein wichtiger Schritt, da das Verfahren die Reinigung vernünftiger Mengen von LT und davon abgeleiteter Mutanten für die nachfolgende Analyse erlaubte. Dieses Plasmid, welches als pBD94 bezeichnet ist, ist diagrammatisch in 1 gezeigt.
Sowohl CT als auch LT werden mit einer trypsinempfindlichen Peptidbindung erzeugt, welche die A₁- und A₂-Stücke verbindet. Diese Peptidbindung muss eingeschnitten werden, damit das Molekül „toxisch" ist. Dies stimmt auch für das Diphterietoxin, dem prototypischen A-B-Toxin, und für eine Vielfalt anderer bakterieller Toxine. Falls die A₁–A₂-Bindung nicht entfernt wird, entweder durch bakterielle Proteasen oder durch intestinale Proteasen im Lumen der Gedärme, kann das A₁-Stück nicht sein Ziel auf der basolateralen Oberfläche der intestinalen Epitelzelle erreichen. Im Gegensatz zu CT ist LT nicht völlig biologisch aktiv, wenn es zunächst aus der Zelle isoliert wird. LT erfordert gleichfalls die Proteolyse, damit es voll aktiv wird, und die proteolytische Aktivierung findet nicht innerhalb des Bakteriums statt. Daher ist es ein Mittel zur Veränderung der Toxizität des Moleküls ohne die ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen, die trypsinempfindlichen Aminosäuren durch Genmanipulation zu entfernen, welche die A₁- und A₂-Komponenten der A-Untereinheit verbinden. Wenn das Molekül nicht proteolytisch gespaltet werden kann, wird es auch nicht toxisch sein. Der Fachmann würde voraussagen, dass das Molekül jedoch seine ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität und folglich seine adjuvante Funktion erhalten sollte.
1 zeigt die Sequenz des dem Disulfid entgegengesetzten Bereichs, der die A₁- und A₂-Stücke trennt. Innerhalb dieses Bereichs gibt es einen einzigen Argininrest, von dem geglaubt wird, dass er der Ort der Spaltung ist, die notwendig ist, um die toxischen Eigenschaften des Moleküls zu aktivieren. Dieser Bereich wurde durch Mutagenese verändert, die auf diesen Ort gerichtet ist, in einer solchen Weise, dass das Molekül bezüglich der proteolytischen Verdauung unempfindlich gemacht und daher nicht toxisch wird.
Die Mutagenese, die auf den Mutationsort gerichtet ist, wird bewerkstelligt durch Hybridisierung eines einzigen DNA-Strangs eines synthetischen Oligonukleotids, das komplementär zum einsträngigen Templat ist, mit der Ausnahme eines Bereichs der Fehlanpassung in der Nähe des Zentrums. Es ist der Bereich, der den gewünschten Nukleotidwechsel oder die Wechsel enthält. Im Anschluss an die Hybridisierung mit der einsträngigen Ziel-DNA wird das Oligonukleotid mit DNA-Polymerase verlängert, um eine doppelsträngige Struktur zu erzeugen. Die Einkerbung wird dann mit DNA-Ligase versiegelt und die Duplexstruktur wird in einen E. coli-Wirt transformiert. Die theoretische Ausbeute an Mutanten unter Verwendung dieses Verfahrens liegt bei 50 % infolge des halbkonservativen Modus der DNA-Replikation. In der Praxis ist die Ausbeute viel niedriger. Es gibt jedoch eine Anzahl von verfügbaren Verfahren, um die Ausbeute zu verbessern, und um Mutanten, die auf das Oligonukleotid gerichtet sind, zu selektieren. Das eingesetzte System verwendete ein zweites mutagenes Oligonukleotid, um veränderte Restriktionsorte in einer Doppel-Mutationsstrategie zu erzeugen.
Der nächste Schritt bestand darin, eine weitere Aminosäure durch Arg zu ersetzen (d.h. GGA = Gly ersetzt AGA = Arg), wobei der Leserahmen beibehalten wird, wohingegen der proteolytische Spaltungsort eliminiert wird. mLT wurde dann durch Affinitätschromatographie an Agarose vom einen Mutanten (pBD95) gereinigt, der bereits durch Sequenzierung bestätigt wurde. Alternative Verfahren zur Reinigung sind dem Fachmann ersichtlich. Dieses mutierte LT, bezeichnet als LT_(R192G) wurde dann durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf Modifizierung der trypsinempfindlichen Bindung überprüft. Es wurden Beispiele mit und ohne Exposition zum Trypsin überprüft und mit nativer (unmodifizierter) LT verglichen. mLT dissoziiert nicht in A₁ und A₂, wenn es mit Trypsin inkubiert wird, wobei angezeigt wird, dass die Empfindlichkeit gegenüber Protease entfernt worden ist.
6.2 Wirkung von mLT auf Y-1-Nebennierenzellen
Der Fachmann würde voraussagen, dass mLT im Y-1-Nebennierenzellassay nicht aktiv sein würde. Diese Voraussage würde auf vorherige Befunde begründet sein [Clements und Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24: 760–769], dass ungekerbtes LT in diesem Assaysystem mehr als tausendfach geringer aktiv war im Vergleich zu CT, und dass in diesem Assay die Behandlung mit Trypsin LT im Vergleich zu CT auf das gleiche Niveau der biologischen Aktivität aktivierte. Es wurde angenommen, dass die beobachtete restliche Aktivität von LT in diesem Assay in Abwesenheit der Trypsinaktivierung eine Funktion einer geringen restlichen Proteaseaktivität war, die nicht zugeordnet werden konnte. Beispielsweise wird Trypsin im Verfahren zur Subkultivierung von Y-1-Nebennierenzellen verwendet. Es wurde daher vermutet, dass LT, das nicht eingeschnitten werden konnte, im Y-1-Nebennierenzellassay völlig inaktiv sein würde. Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt. Tabelle I
Tabelle I zeigt den unerwarteten Befund, dass mLT ein Grundniveau an Aktivität im Y-1-Nebennierenzellassay beibehielt, obwohl es nicht proteolytisch verarbeitet werden konnte. Wie in der Tabelle I gezeigt, haben CT und natives LT, das mit Trypsin behandelt wurde, das gleiche Aktivitätsniveau (15 pg) in Y-1-Nebennierenzellen. Im Gegensatz dazu war mLT (48.000 pg mehr als 1000fach weniger aktiv als CT oder natives LT und konnte durch Trypsin nicht aktiviert werden. Die restliche Grundaktivität reflektiert unzweifelhaft einen unterschiedlichen und bislang unbekannten Weg der Nebennierenzellaktivierung, im Vergleich zu demjenigen, der die Trennung der A₁-A₂-Bindung erfordert.
6.3 ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität von mLT
Da die Mutation, welche Arg₁₉₂ durch Gly₁₉₂ ersetzt, den Enzymort der A₁-Einheit nicht verändert, würde der Fachmann voraussagen, dass mLT seine ADP-ribosylierende Enzymaktivität beibehält. Um diese Eigenschaft zu überprüfen, wurde der NAD-Agmatin-ADP-Ribosyltransferaseassay verwendet (Moss et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 6383–6387]. Wie in 2 gezeigt, ruft CT eine dosisabhängige Zunahme im ADP-Ribosylagmatin-Pegel hervor, was eine Funktion der ADP-Ribosyltransferaseaktivität dieses Moleküls darstellt. TABELLE II
Tabelle II zeigt in tabellarischer Form den unerwarteten Befund, dass mLT eine detektierbare ADP-ribosylierende Enzymaktivität fehlte, mit oder ohne Trypsinaktivierung, obgleich der enzymatische Bindungsort nicht verändert worden war, und im Y-1-Nebennierenzellassay ein vorzeigbares Grundniveau an Aktivität existierte.
6.4 Enterotoxische Aktivität von mLT
Aufgrund des unerwarteten Befunds, dass mLT mit oder ohne Trypsinaktivierung jegliche detektierbare ADP-ribosylierende Enzymaktivität fehlt, obwohl der enzymatische Bindungsort nicht geändert worden war, und aufgrund des zusätzlichen Befunds, dass es ein Grundniveau an Aktivität im Y-1-Nebennierenzellassay gibt, war es nicht klar, ob mLT irgendeine seiner enterotoxischen Eigenschaften erhalten würde. Eine ideale Formulierung eines Adjuvans von mLT würde die Fähigkeit erhalten als immunologisches Adjuvans zu wirken, es würden aber die wirklichen oder potenziellen Nebeneffekte wie beispielsweise Diarrhö fehlen, die mit der Verwendung von LT oder CT verbunden sind. 3 zeigt, dass mLT nicht die reine Fluidsekretion im patentierten Mäusemodell induziert, sogar bei einer Dosis von 125 μg. Diese Dosis ist in diesem Modell mehr als fünfmal höher als die adjuvante wirksame Dosis für LT. Es ist wichtig, dass die potenzielle Toxizität von nativem LT bei diesem Pegel gesehen werden kann.
6.5 Adjuvans-Aktivität von mLT
Der Fachmann würde voraussagen, dass, da mLT keine vorzeigbare ADP-Ribosyltransferaseaktivität aufwies und nicht enterotoxisch ist, es an adjuvanter Aktivität fehlen würde. Diese Voraussage würde auf den Bericht von Lycke et al. begründet sein [Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277–2281), in welchem klargemacht wird, dass Veränderungen, welche die ADP-ribosylierende Enzymaktivität des Toxins beeinträchtigen und die Fähigkeit verändern, die intrazellulären Pegel an cAMP zu erhöhen, das Molekül daran hindern als Adjuvans zu wirken. Wie oben gezeigt, weist mLT keine ADP-ribosylierende Enzymaktivität und nur eine geringe undefinierte Grundaktivität in Y-1-Nebennierenzellen auf und induziert keine reine Fluidsekretion im offenliegenden Mäusemodell.
Um die adjuvante Aktivität von mLT zu überprüfen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Es wurden drei Gruppen von BALB/c-Mäusen immunisiert. Die Tiere wurden intragastrikal mit einer Fütterungsnadel inokuliert, deren Spitze stumpf war (Popper & Sons, Inc., New Hyde Park, New York). Am Tag 0 wurde jede Gruppe oral immunisiert wie folgt: Gruppe A erhielt 0,5 ml PBS enthaltend 5 mg OVA, Gruppe B erhielt 0,5 ml PBS enthaltend 5 mg OVA und 25 μg natives LT, und Gruppe C erhielt 0,5 ml PBS enthaltend 5 mg OVA und 25 μg mLT. Jede Kur wurde erneut an den Tagen 7 und 14 verabreicht. Am 21. Tag erhielten alle Tiere i.p. als zusätzliche Dosis 1 μg OVA in 20 % Maalox. Eine Woche nach der i.p.-Inokulation wurden die Tiere getötet und durch ELISA auf Serum-IgG-Antikörper und mukosale IgA-Antikörper überprüft, die gegen OVA und LT gerichtet waren.
Die Reagenzien und Gegenseren für ELISA wurden von Sigma Chemical Co. erhalten. Die Proben wurden für die Untersuchung mit ELISA fortlaufend in Salzlösung verdünnt, die mit Phosphatpuffer gepuffert war (pH 7,2 – 0,05 % Tween 20 (PBS-TWEEN)). Für die Anti-LT-Bestimmungen wurden Mikrotiterplatten mit 1,5 μg gemischten Gangliosiden (Type III) pro Napf vorbeschichtet, dann mit 1 μg gereinigtem LT pro Napf. Anti-OVA wurde auf Mikrotiterplatten bestimmt, die mit 10 μg OVA pro Napf vorbeschichtet waren. Serum-Anti-LT und Anti-OVA wurde mit Kaninchen-Antiserum gegen Mäuse-IgG, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, bestimmt. Mukosale Anti-LT und Anti-OVA-IgA wurden mit Ziegenantiserum gegen Mäuse-IgA [spezifisch für die Alpha-Kette] bestimmt, gefolgt von Kaninchen-Antiserum gegen Ziegen-IgG, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert war. Die Reaktionen wurden mit 3N NaOH unterbrochen. Die Werte für IgG und IgA wurden aus einer Standardkurve mit gereinigten Mäusemyelomproteinen bestimmt (MOPC 315, gA (IgA12); MOPC 21, gG1: Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC).
6.5.1 Serum-IgG Anti-OVA
Wie in der 4A gezeigt, entwickelten Tiere, die oral mit OVA und LT primiert worden waren, ein signifikant höheres Serum-IgG-Anti-OVA-Ansprechverhalten nach der sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (4.058 μg/ml) im Vergleich zu solchen Tieren, die mit OVA alleine behandelt und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-OVA-Antwort) (T-Verteilung: p = 0,031). Tiere, welche oral mit OVA und mLT primiert worden waren, entwickelten in signifikanter Weise eine signifikant höhere Serum-IgG-Anti-OVA-Antwort nach einer sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (1.338 μg/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, die mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-OVA-Antwort) (T-Verteilung: p = 0,0007).
6.5.2 Mukosales sIgA-Anti-OVA
Wie in der 4B gezeigt, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn innerhalb dieser gleichen Gruppen von Tieren das Ansprechverhalten von Anti-OVA-IgA verglichen wurde. Tiere, die oral mit OVA und LT primiert wurden, entwickelten eine signifikant höhere mukosale IgA-Anti-OVA-Antwort nach der sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (869 ng/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, die mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-OVA-Antwort) (T-Verteilung: p = 0,0131). Wie oben, entwickelten Tiere, die oral mit OVA und mLT primiert wurden, eine signifikant höhere mukosale IgA-Anti-OVA-Antwort nach der sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (230 ng/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, welche mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-OVA-Antwort) (T-Verteilung: p = 0,0189).
6.5.3 Serum-IgG-Anti-LT
Die Fähigkeit von LT und mLT, eine Anti-LT-Antikörper-Antwort in diesen gleichen Tieren auszulösen, wurde ebenfalls überprüft. Dies war deshalb wichtig, weil dies ein Anzeichen liefern würde, ob das mutierte LT in der Lage ist, die Auslösung der Verträglichkeit gegen sich selbst zusätzlich zu seiner Funktionsweise als Adjuvans für andere Proteine zu verhüten. Wie in der 5A gezeigt, entwickelten Tiere, die oral mit OVA und LT primiert wurden, eine signifikant höhere Serum-IgG-Anti-LT-Antwort nach einer sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (342 μg/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, die mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-LT-Antwort (T-Verteilung: p = 0,0005). Tiere, die oral mit OVA und mLT primiert wurden, entwickelten auch eine signifikant höhere Serum-IgG-Anti-LT-Antwort nach einer sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (552 μg/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, die mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-LT-Antwort) (T-Verteilung: p = 0,0026).
6.5.4 Mukosales sIgA-Anti-LT
Wie in der 5B gezeigt, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn Anti-LT-IgA-Antworten innerhalb dieser gleichen Gruppen von Tieren verglichen wurden. Tiere, die oral mit OVA und LT primiert wurden, entwickelten eine signifikant höhere mukosale IgA-Anti-LT-Antwort nach einer sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (4.328 ng/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, die mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-LT-Antwort) (T-Verteilung: p = 0,0047). Wie oben entwickelten Tiere, die oral mit OVA und mLT primiert wurden, eine signifikant höhere mukosale IgA-Anti-LT-Antwort nach einer sich anschließenden parenteralen Immunisierung mit OVA (1.463 ng/ml) im Vergleich zu jenen Tieren, die mit OVA alleine primiert und anschließend parenteral mit OVA immunisiert wurden (keine detektierbare Anti-LT-Antwort (T-Verteilung: p = 0,0323).
7. Hinterlegung von Mikroorganismen
Das folgende Plasmid wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, am 18. August 1994 hinterlegt, wobei diesem Plasmid die angegebene Zugangsnummer zugeteilt wurde:

Plasmid Zugangsnummer

pBD95 in E. coli LTR 192G ATCC 69683

Claims

Mutiertes E. coli Hitze-labiles Enterotoxin-Holotoxin, bei welchem Arginin an Aminosäureposition 192 der A-Untereinheit des Holotoxins durch Glycin ersetzt ist, wobei das Holotoxin im Wesentlichen weniger toxisch als natives E. coli Hitze-labiles Enterotoxin-Holotoxin ist, gemessen im Y-1-Nebennierenzellassay, und welches immunologische Adjuvans-Aktivität aufweist, aber welchem ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität, gemessen im NAD-Agmatin-ADP-Ribosyltransferaseassay, fehlt.
Das mutierte Holotoxin nach Anspruch 1, welches durch das Plasmid pBD95 codiert wird, das aus E. coli LTR192G mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 69683 erhältlich ist, welches sowohl Untereinheit A als auch Untereinheit B des E. coli Hitze-labilen Enterotoxins exprimiert.
Vakzinzusammensetzung enthaltend ein Antigen in Kombination mit dem mutierten Holotoxin nach Anspruch 1.
Ein Vakzin nach Anspruch 3, das außerdem eine geeignete Trägersubstanz, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff umfaßt.
Die Vakzinzusammensetzung nach Anspruch 3, bei welcher das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Influenza-Vakzin; Varizellen- Vakzin; Diphterie-Toxoid; Tetanus-Toxoid, Pertussis-Vakzin; Japanische Enzephalitis-Vakzin; gemischtes Vakzin aus Pertussis-; Diphterie- und Tetanus-Toxoid; Lyme-Erkrankung-Vakzin; Polio-Vakzin; Herpes-Vakzin; Papillomavirus-Vakzin; Hepatitis-B-Vakzin; Rota-Vakzin; humanem Immunschwächevirus; Campylobakter-Vakzin; Cholera-Vakzin; Vakzin gegen enteropathogenen E. coli; Vakzin gegen enterotoxischen E. coli; Schistosomiasis-Vakzin; Masern-Vakzin; Rubella-Vakzin; Mumps-Vakzin; kombiniertem Masern-, Rubella- und Mumps-Vakzin; und Mykoplasma-Vakzin.
Zusammensetzung zur Verwendung beim Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Pathogen in einem Wirt, umfassend ein Gemisch aus einer wirksamen Menge eines Antigens und einer als Adjuvans wirksamen Menge des mutierten Holotoxins nach Anspruch 1.
Kit zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein Pathogen in einem Wirt, umfassend zwei Komponenten: (a) eine wirksame Menge eines Antigens und (b) eine als Adjuvans wirksame Menge eines mutiereen E. coli Hitze-labilen Enterotoxin-Holotoxins, bei welchem Arginin an Aminosäureposition 192 der A-Untereinheit des Holotoxins durch Glycin ersetzt ist, wobei das Holotoxin im Wesentlichen weniger toxisch als natives E. coli Hitze-labiles Enterotoxin-Holotoxin ist, gemessen im Y-1-Nebennierenzellassay, und welches immunologische Adjuvans-Aktivität aufweist, aber welchem ADP-ribosylierende enzymatische Aktivität, gemessen im NAD-Agmatin-ADP-Ribosyltransferaseassay, fehlt, wobei beide Komponenten in einer oral annehmbaren Trägersubstanz vorliegen und die Komponenten entweder nachdem sie zusammengemischt wurden, oder getrennt voneinander innerhalb einer kurzen Zeit, verabreicht werden.
Mutiertes Enterotoxin-Holotoxin wie in Anspruch 1 beansprucht zur Verwendung in der Medizin.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder der Kit nach Anspruch 7, wobei das Antigen aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Viren, Protozoen, Pilzen, Helminthen und anderen mikrobiologischen Pathogenen abgeleitet ist.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder der Kit nach Anspruch 7, wobei das Antigen von einem enterotoxischen bakteriellen Organismus abgeleitet ist.
Die Zusammensetzung oder der Kit nach Anspruch 10, wobei der enterotoxische bakterielle Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus enterotoxischen bakteriellen Organismen, welche ein Cholera-ähnliches Toxin exprimieren.
Die Zusammensetzung oder der Kit nach Anspruch 11, wobei der enterotoxische bakterielle Organismus E. coli oder Vibrio Cholera ist.