DE69735191T2

DE69735191T2 - Verfahren zur Herstellung multivalenter Impfstoffe

Info

Publication number: DE69735191T2
Application number: DE69735191T
Authority: DE
Inventors: Franυois ARMINJON; Jean-Renω CARTIER; Sandrine Lentsch-Graf; Laurent Marchal
Original assignee: Sanofi Pasteur MSD SNC
Current assignee: MSD Vaccins SAS
Priority date: 1997-09-15
Filing date: 1997-09-15
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2017-09-16
Also published as: DK1028750T3; PT1028750E; AU4707097A; EP1028750A1; EP1028750B1; ES2257769T3; WO1999013906A1; ATE316797T1; CA2303105A1; DE69735191D1; BR9714980A

Description

Hintergrund der Erfindung
Trotz der jahrzehntelangen Impfstoffforschung stellen Infektionskrankheiten weiterhin eine Gefahr für die menschliche Gesundheit dar. Kombinationsimpfstoffe, die einen Schutz gegen eine Vielzahl von Pathogenen vorsehen, sind sehr wünschenswert, um die Zahl der Immunisierungen, welche erforderlich sind, um einen Schutz gegen mehrere Pathogene zu übertragen, auf ein Minimum zu verringern. Das gut dokumentierte Phänomen einer Antigenkompetition erschwert die Entwicklung von Mehrkomponentenimpfstoffen. Der Ausdruck 'Antigenkompetition' verweist auf die Beobachtung, daß die Verabreichung von mehreren Antigenen oftmals eine verminderte Antwort auf bestimmte Antigene im Verhältnis zu der beobachteten Immunantwort, wenn solche Antigene einzeln verabreicht werden, zur Folge hat.
Die mehreren Pathogene, gegen welche die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung einen Schutz vorsehen, werden im Zusammenhang mit den dadurch hervorgerufenen Krankheiten und den Antigenen der Pathogene, welche in der Zubereitung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, besprochen.
Keuchhusten oder Pertussis ist eine schwere, hochansteckende Infektion der oberen Atemwege, welche durch Bordetella pertussis hervorgerufen wird. Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, daß pro Jahr 60 Millionen Fälle von Pertussis auftreten und daß 0,5 bis 1 Million davon mit Todesfällen in Zusammenhang stehen (Ref. 1. In dieser Beschreibung wird in Klammern auf verschiedene Referenzen verwiesen, um den Stand der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, ausführlicher zu beschreiben. Die vollständige bibliographische Information für jede Belegstelle ist am Ende der Beschreibung, unmittelbar gefolgt von den Ansprüchen, zu finden. Die Offenbarungen dieser Referenzen sind hierdurch unter Bezugnahme in der vorliegenden Offenbarung eingeschlossen). In ungeimpften Populationen ist bei Kindern unter 5 Jahren eine Pertussis-Häufigkeitsrate von bis zu 80% beobachtet worden (Ref. 2). Obwohl Pertussis im allgemeinen als eine Kinderkrankheit angesehen wird, gibt es zunehmende Beweise für eine klinische und asymptomatische Erkrankung bei Jugendlichen und Erwachsenen (Ref. 3, 4 und 5).
Die Einführung von Ganzzellimpfstoffen, bestehend aus chemisch und mittels Hitze inaktivierten B. pertussis-Organismen, in den 1940ern war für eine drastische Verringerung der Häufigkeit der durch B. pertussis hervorgerufenen Keuchhustenerkrankung verantwortlich. Es ist geschätzt worden, daß die Effektivitätsraten von Ganzzellimpfstoffen, abhängig von der Falldefinition, bis zu 95% betragen (Ref. 6). Obwohl eine Infektion mit B. pertussis eine lebenslange Immunität verleiht, gibt es zunehmende Beweise für einen nachlassenden Schutz nach einer Immunisierung mit Ganzzellimpfstoffen (Ref. 3). Mehrere Berichte, welche eine Verbindung zwischen Pertussis-Ganzzellimpfung, Reaktogenizität und schweren Nebenwirkungen erwähnen, hatten ein Nachlassen der Impfstoff-Akzeptanz und daraus folgend erneute Epidemien zur Folge (Ref. 7). Unlängst sind definierte Pertussis-Komponentenimpfstoffe entwickelt worden.
Antigene für definierte Pertussis-Impfstoffe
Verschiedene azelluläre Pertussis-Impfstoffe sind entwickelt worden, welche die Bordetella-Pertussis-Antigene, und zwar das Pertussistoxin (PT), das filamentöse Hämagglutinin (FHA), das 69 kDa große, äußere Membranprotein (Pertactin) und die Fimbrien-Agglutinogene, einschließen. PT und FHA sind in den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen und werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Pertussistoxin
Das Pertussistoxin ist ein Exotoxin, welches ein Vertreter der A/B-Familie von Bakterientoxinen mit einer ADP-Ribosyltransferase-Aktivität ist (Ref. 8). Die A-Einheit dieser Toxine zeigt die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität, und die B-Einheit vermittelt die Bindung des Toxins an die Wirtszellrezeptoren und die Translokation von A zu dessen Wirkort. PT erleichtert auch die Anheftung von B. pertussis an Flimmerepithelzellen (Ref. 9) und spielt auch ein Rolle bei der Invasion von Makrophagen durch B. pertussis (Ref. 10).
Alle azellulären Pertussis-Impfstoffe beinhalteten PT, von dem angenommen wird, daß es ein wichtiger Virulenzfaktor und ein protektives Antigen ist. (Ref. 11 und 12). Eine natürliche Infektion mit B. pertussis ruft sowohl eine humorale als auch eine zellvermittelte Antwort auf PT hervor (Ref. 13 bis 17). Kleinkinder besitzen anti-PT-Antikörper, welche über die Plazenta aufgenommen werden (Ref. 16 und 18), und menschliche Vormilch, welche anti-PT-Antikörper enthält, war in dem passiven Schutz von Mäusen gegen eine Aerosolinfektion wirksam (Ref. 19). Nach der Immunisierung mit einem azellulären Impfstoff ist eine zellvermittelte Immunantwort (CMI) auf PT-Untereinheiten nachgewiesen worden (Ref. 20), und nach einer Ganzzellimpfung wurde eine CMI-Antwort auf PT hervorgerufen (Ref. 13). Chemisch inaktiviertes PT in Ganzzell- oder Komponentenimpfstoffen ist in Tiermodellen und in Menschen protektiv (Ref. 21). Ferner schützen monoclonale Antikörper, welche für die Untereinheit S1 spezifisch sind, gegen eine Infektion durch B. pertussis (Ref. 22 und 23).
Die wichtigsten pathophysiologischen Wirkungen von PT sind auf dessen ADP-Ribosyltransferase-Aktivität zurückzuführen. PT katalysiert den Transfer von ADP-Ribose durch NAD auf das G_i-Guanidinnucleotid-Bindungsprotein, wodurch das zelluläre Adenylatcyclase-Regulationssystem zerstört wird (Ref. 24). PT verhindert auch die Migration von Makrophagen und Lymphocyten zu den Entzündungsstellen und behindert die durch Neutrophile vermittelte Phagocytose und die Abtötung von Bakterien (Ref. 25). Eine Reihe von in vitro- und in vivo-Tests, einschließlich die ADP-Ribosylierung von Rinder-Transducin (Ref. 26), der Clustering-Assay mit Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (Ref. 27), Histamin-Sensibilisierung (Ref. 28), Leukocytose und NAD-Glycohydrolase, ist verwendet worden, um die enzymatische Aktivität von S1 und/oder PT zu untersuchen. CHO-Zellen entwickeln bei der Exposition mit PT eine charakteristische geclusterte Morphologie. Dieses Phänomen beruht auf der Bindung von PT und der anschließenden Translokation sowie der ADP-Ribosyltransferase-Aktivität von S1, und daher wird der Clustering-Assay mit CHO-Zellen häufig dazu verwendet, die Integrität und Toxizität von PT-Holotoxinen zu testen.
Das PT muß vor dem Einbringen in eine Impfstoffzubereitung entgiftet werden. Mehrere Techniken der chemischen Entgiftung, einschließlich die Inaktivierung mit Formalin (Ref. 46), Glutaraldehyd (Ref. 52), Wasserstoffperoxid (Ref. 53) und Tetranitromethan (Ref. 54), sind beschrieben worden. Alternativ können mutierte Stämme von B. pertussis oder rekombinante Wirtszellen, welche ein genetisch entgiftetes PT exprimieren, verwendet werden, um ein enzymatisch inaktives PT herzustellen, welches seine immunologische Aktivität beibehält.
Filamentöses Hämagglutinin
Das filamentöse Hämagglutinin ist ein großes (220 kDa), nicht-toxisches Polypeptid, welches die Anheftung von B. pertussis an Flimmerzellen der oberen Atemwege während einer Bakterienkolonisation vermittelt (Ref. 9 und 29). Eine natürliche Infektion ruft anti-FHA-Antikörper und eine zellvermittelte Immunität hervor (Ref. 13, 15, 17, 30 und 31). Anti-FHA-Antikörper sind in menschlicher Vormilch zu finden und werden auch über die Plazenta übertragen (Ref. 17, 18 und 19). Eine Impfung mit Ganzzell- oder azellulären Pertussis-Impfstoffen induziert anti-FHA-Antikörper, wobei azelluläre Impfstoffe, welche FHA enthalten, auch eine CMI-Antwort auf FHA hervorrufen (Ref. 20 und 32). FHA ist in einem Maus-Atemtrakt-Expositionsmodell nach einer aktiven oder passiven Immunisierung als ein protektives Antigen wirksam (Ref. 33 und 34). Jedoch wird durch FHA allein in dem Maus-Intracerebralexpositions-Wirksamkeitstest kein Schutz vorgesehen (Ref. 28).
Azelluläre Pertussis-Impfstoffe
Der erste azelluläre Pertussis-Impfstoff, welcher entwickelt wurde, war der Zweikomponenten-PT+FHA-Impfstoff (JNIH-6) von Sato et al. (Ref. 46). Dieser Impfstoff wurde durch die gemeinsame Aufreinigung von PT- und FHA-Antigenen aus dem Kulturüberstand des B. pertussis-Stammes Tohama, gefolgt von einer Formalin-Toxinentgiftung ('toxoiding'), hergestellt. Azelluläre Impfstoffe von verschiedenen Herstellern und mit unterschiedlichen Zusammensetzungen sind erfolgreich verwendet worden, um japanische Kinder gegen Keuchhusten zu immunisieren, was seit 1981 eine drastische Verringerung der Krankheitshäufigkeit zur Folge hatte (Ref. 47). Der JNIH-6-Impfstoff und ein Einkomponenten-PT-Toxoid-Impfstoff (JNIH-7) wurden 1986 in einer groß angelegten klinischen Studie in Schweden getestet. Erste Ergebnisse deuteten auf eine geringere Wirksamkeit als die beschriebene Wirksamkeit eines Ganzzellimpfstoffes hin, aber nachfolgende Studien haben gezeigt, daß er gegen eine leichtere Erkrankung, diagnostiziert durch serologische Methoden, wirksamer ist (Ref. 48, 49, 50 und 51). Jedoch gab es Hinweise auf eine Reversion der Toxizität eines Formalin-inaktivierten PT in diesen Impfstoffen. Es wurde auch gezeigt, daß diese Impfstoffe gegen eine Erkrankung anstatt eine Infektion schützen.
Eine Reihe von neuen azellulären Pertussis-Impfstoffen, welche Kombinationen von PT, FHA und/oder dem 69 kDa großen, äußeren Membranprotein (Pertactin) und/oder den Fimbrien-Agglutinogenen einschließen, wird gegenwärtig untersucht.
Tetanus
Tetanus ist eine akute Infektion, welche durch Clostridium tetani hervorgerufen wird. Die Erkrankung ist gekennzeichnet durch schwere, schmerzhafte Muskelkontraktionen, begleitet von Hypersensibilität, Hyperreflexie und einer verstärkten autonomen Stimulation des bzw. der betroffenen Körperteils(e). Schwache Reize können schwere, reflektorische Muskelkrämpfe hervorrufen. Aufgrund des extremen Muskelkrampfes kann Fieber vorhanden sein. Tetanus kann eine generalisierte Erkrankung unter Beteiligung von Gesicht, Nacken, Unterleib und Rumpf sein oder auf einen bestimmten Körperteil (Verletzungsstelle) begrenzt sein. Die Beteiligung des Kaumuskels des Gesichtes resultiert in einem Trismus oder einer Kiefersperre, welche den klassischen Gesichtsausdruck "Risus sardonicus (hämisches Grinsen)" hervorruft (Ref. 78).
C. tetani lebt als ein nicht-pathogener Organismus im Darm von Menschen und Tieren. Der Organismus kommt auch in mit Fäkalien kontaminierten Böden vor und kann in Form von infektiösen Sporen jahrelang im Boden überleben.
Die Tetanuserkrankung resultiert aus dem anaeroben Wachstum von C. tetani und einer Neurotoxin-Produktion in den verunreinigten Wunden. Die Infektion wird durch die Einschleppung von Materialien, welche mit Organismen oder Sporen verunreinigt sind, in das Gewebe hervorgerufen. Das am weitesten verbreitete Szenarium ist eine Infektion durch eine penetrierende Verletzung. Jedoch ist in vielen Fällen keine Verletzungsvorgeschichte verfügbar. Das Vorhandensein von nekrotischen oder ischämischen Geweben begünstigt das Wachstum des Bacillus (Ref. 78).
Die Verhinderung einer Infektion wird durch eine Impfung und durch eine gute Wundversorgung einschließlich einer sorgfältigen Reinigung und Wundtoilette von abgestorbenen Geweben erreicht. Individuen mit verunreinigten Wunden und solchen mit einer unvollständigen Reihe von Auffrischimpfungen sollte sowohl ein Tetanus-Impfstoff als auch ein Tetanus-Immunglobulin verabreicht werden.
Die Behandlung des Syndroms ist vorwiegend unterstützend und kann eine Atemunterstützung, die Verabreichung von Tetanus-Antitoxin und eine sorgfältige Reinigung der infizierten Wunden einschließen. Trotz der modernen medizinischen Versorgung beträgt die Fallletalität immer noch 30 bis 90% (Ref. 79). Dies trifft insbesondere auf ältere Individuen zu. Eine natürliche Infektion ruft nicht immer eine Immunität gegen eine weitere Infektion hervor.
Die Verhinderung einer Infektion durch eine Impfung ist die wirksamste Methode, um die Krankheit zu kontrollieren. Seit der Einführung einer Universalimpfung ist die Tetanuserkrankung in entwickelten Ländern außerordentlich selten geworden. Fälle von Tetanus treten ausschließlich bei Individuen auf, welche versäumt haben, ihre Impfungsreihe zu vervollständigen, oder welche keine ausreichenden Auffrischdosen erhalten haben. Individuen sollten einmal alle zehn Jahre eine Auffrischdosis erhalten.
Diphtherie
Diphtherie ist eine akute Infektion, welche durch das Bakterium Corynebacterium diphtheriae hervorgerufen wird. Die überwiegenden Infektionsstellen sind die oberen Atemwege (Nase, Rachen, Kehlkopf und Luftröhre) (Ref. 80). Die charakteristische Läsion, welche auf das bakterielle Cytotoxin zurückzuführen ist, ist ein weißlich-grauer Belag, bezeichnet als Pseudomembran, welcher von einer Entzündung umgeben ist. Dieses Symptom wird von einer zervikalen Lymphadenopathie, einer Schwellung und einem Ödem des Rachens begleitet. In schweren Fällen kann die Schwellung bis zu dem Zeitpunkt einer Obstruktion (Kehlkopfdiphtherie) fortschreiten. Andere Komplikationen schließen eine Myokarditis, Auswirkungen auf das Zentralnervensystem (kraniale, motorische und sensorische Neuropathien, wie eine aufsteigende Paralyse) und eine Thrombocytopenie ein. Andere Schleimhautmembranen können weniger häufig befallen sein. Die klinische Darstellung kann von einer asymptomatischen Infektion bis zu einer fulminanten Multisystemerkrankung mit Todesfolge variieren (Ref. 79). Haut- und Wundinfektionen mit einer Diphtherie sind in den Tropen weit verbreitet und sind für die amerikanischen Ureinwohner häufig beschrieben worden. Das einzige Reservoir für C. diphtheriae ist der Mensch (Ref. 79).
Bei der klinischen Beobachtung der charakteristischen Läsionen kann eine präsumptive Diagnose gestellt werden, welche aber durch eine bakterielle Untersuchung der Läsionen bestätigt werden sollte. Falls ein starker klinischer Verdacht auf Diphtherie besteht, sollte die Behandlung unmittelbar mit Antibiotika (Penicillin oder Erythromycin) und Diphtherie-Antitoxin begonnen werden, selbst wenn die Diagnose nicht bestätigt ist, wobei sich die Mortalität erhöht, je länger man nach dem Auftreten der klinischen Symptome mit der Behandlung wartet (Ref. 80). Trotz der modernen klinischen Ver sorgung liegt die Fallletalität im Bereich von 5 bis 10% (Ref. 79), wobei die Krankheit vorwiegend sehr junge und ältere Individuen befällt. Eine natürliche Infektion ruft nicht immer eine Immunität gegen eine weitere Infektion hervor (Ref. 80).
Die Übertragung erfolgt durch den direkten Kontakt mit Sekreten oder Ausscheidungen eines infizierten Individuums. Individuen sind ansteckend, solange Bakterien in den Sekreten beobachtet werden. Dies kann bis zu vier Wochen nach der Infektion andauern. Die Übertragung kann auch durch Ansteckungsträger erfolgen (Ref. 79). Es wird eine strikte Isolierung von Fällen empfohlen.
Selten können Individuen zu Trägern werden und bis zu sechs Monate nach der Infektion Organismen ausscheiden. Nicht immunisierte Träger sollten unverzüglich einer vollständigen Impfungsreihe unterzogen werden. Die Behandlung mit Antibiotika eliminiert eine Trägerschaft und Infektiösität der Fälle innerhalb von 4 Tagen (Ref. 80).
Poliomyelitis
Bei der weltweiten Kontrolle von Poliomyelitis sind sowohl inaktivierte (IPV) als auch lebende, attenuierte (OPV) Poliovirus-Impfstoffe wirksam gewesen. Gegenwärtig wird in Europa und Kanada ein kombinierter DPT-IPV-Impfstoff zugelassen, für welchen bei Millionen von Kindern weltweit gezeigt worden ist, daß er sicher und wirksam ist.
Haemophilus influenzae-Typ-B
Vor der Verfügbarkeit von wirksamen Impfstoffen galt Haemophilus influenzae-Typ-B (Hib) als eine Hauptursache für invasive, über den Blutweg übertragene Meningitis-Infektionen bei Kleinkindern und als die wichtigste Ursache für Meningitis in den ersten zwei Lebensjahren (Ref. 81). Ungefähr 10% der an einer Haemophilus influenzae-Meningitis leidenden Opfer sterben trotz einer medizinischen Versorgung. Bleibende Folgeerkrankungen sind bei den überlebenden Individuen weit verbreitet. Die Immunisierung gegen Haemophilus influenzae begann in Kanada im Jahr 1987 mit einem Polysaccharid-Impfstoff (Polyribose-Ribitolphosphat [PRP]). Durch die Einführung eines Impfstoffes, bestehend aus PRP konjugiert an ein Diphtherietoxoid (PRP-D), im Jahre 1988 wurde bei Kindern im Alter von 18 Monaten und darüber eine verbesserte Immunogenität erzielt. Seit 1992 besteht durch die Zulassung von PRP-Konjugatimpfstoffen, welche in Kleinkindern unter einem Jahr immunogen sind (PRP konjugiert an ein Tetanustoxoid oder PRP-T), die Möglichkeit, Kleinkinder zu immunisieren. Die Anwendung dieser Haemophilus influenzae-Konjugatimpfstoffe war mit einer drastischen Verringerung der Häufigkeit von invasiven Haemophilus-Infektionen in Kanada und anderswo verbunden (Ref. 82). Zwei klinische Studien aus Kanada unter Beteiligung von beinahe 900 Kindern in British Columbia und Alberta zeigten, daß gefriergetrocknetes PRP-T zusätzlich zu dem üblichen Kochsalzverdünnungsmittel mit DPT (COMBIPACK) (Ref. 83) oder mit DPT-Polio in adsorbierter Form (PENTA^TM) (Ref. 84) rekonstituiert werden kann. Klinische Studien unter Beteiligung von mehr als 100.000 Kindern weltweit haben die Wirksamkeit von gefriergetrocknetem PRP-T (ActHib^TM) bewiesen. Bei über 90% der Individuen wurden nach drei PRP-T-Dosen, beginnend im Alter von 2 Monaten, oder nach einer einzigen PRP-T-Dosis, verabreicht im Alter von 12 Monaten, anti-PRP-T-Spiegel erreicht, welche als protektiv angesehen werden (≥ 0,15 μg/ml). Der Anteil der Individuen, welche Spiegel erreichten, die auf einen Langzeitschutz hindeuten, variiert abhängig von der Studie von 70 bis 100%. Seit 1992 sind in den Vereinigten Staaten, Europa und Kanada Millionen von PRP-T-Dosen verkauft worden. Die nach einer Impfung mit PRP-T auftretenden Fälle einer invasiven Haemophilus-Infektion sind selten und können mit Erkrankungen wie einer Immunschwäche in Zusammenhang stehen (Ref. 85).
Kombinationsimpfstoffe
Obwohl die wirklichen und potentiellen Vorteile von Impfstoffen, welche Antigene kombinieren, um einen Schutz gegen mehrere Pathogene zu übertragen, vielfältig sind, können diese Kombinationen eine nachteilige Wirkung auf die Immunogenität der einzelnen Komponenten haben. Seit mehr als 50 Jahren sind Kombinationen von Diphtherie- und Tetanustoxoiden mit einem Pertussis-Ganzzellimpfstoff (DTP) verfügbar, wobei die Antikörperantwort auf die Kombination derjenigen der einzelnen Komponenten überlegen ist, was möglicherweise auf den Adjuvanseffekt des Pertussis-Ganzzellimpfstoffes zurückzuführen ist. DTP-Kombinationen, welche auch einen inaktivierten Poliovirusimpfstoff einschließen, sind durch viele Aufsichtsinstanzen zugelassen worden, obwohl die Antikörperantwort auf die Pertussis-Antigene durch diese Kombination vermindert werden kann (Ref. 69 bis 71). Bei der Kombination von DTP-Impfstoffen mit einem Hib-Konjugatimpfstoff wurden unterschiedliche Effekte beobachtet. Studien mit einem französischen Impfstoff aus DTP und PRP-T ergaben eine vergleichbare Sicherheit, aber eine verminderte Antikörperantwort auf PRP (Ref. 72 bis 73), während in Studien mit einem kanadischen Impfstoff aus DTP und PRP-T in der Gruppe mit einer kombinierten Immunisierung keine Auswirkung auf die PRP-Antwort, aber ein geringerer Spiegel von Pertussis-Agglutinogenen und eine erhöhte Empfindlichkeit an der Injektionsstelle beobachtet wurden (Ref. 74 und 75).
Inzwischen sind Daten über den Effekt einer Kombination von azellulären Pertussis/Diphtherie/Tetanus (APDT)-Impfstoffen mit einem Hib-Konjugatimpfstoff verfügbar. Bei 2 Monate alten Kleinkindern, welche drei Dosen eines azellulären Pertussis-Diphtherie-Tetanus-Impfstoffes in Kombination mit einem Hib-Konjugatimpfstoff erhielten, war die Antikörperantwort auf PRP wesentlich geringer ausgeprägt als in der Gruppe, welche am gleichen Tag verschiedene Injektionen erhalten hatte (Ref. 76). Ähnliche Ergebnisse wurden für einen anderen azellulären Pertussis-Diphtherie-Tetanus-Impfstoff in Kombination mit PRP-T beschrieben, welcher während den ersten drei Dosen verabreicht wurde (Ref. 77).
Im Gegensatz zu anderen beschriebenen Studien zeigten Kinder, die mit dem kombinierten Impfstoff immunisiert wurden, eine stärkere Antikörperantwort auf PRP, Diphtherie und mehrere der Pertussis-Antigene, verglichen mit Kindern, welchen PRP bei einem einzigen Arztbesuch verabreicht wurde. Eine flüssige Kombination von Diphtherie, Tetanus und Pertussis (DTP) sowie Haemophilus influenzae-Typ-B (PRP-T) war sicher und mindestens so immunogen wie die gefriergetrocknete Zubereitung, welche der Rekonstitution von Hib mit DTP entspricht (Ref. 86). Es kann mehrere Gründe für die entsprechende oder bessere Immunogenität dieser Impfstoffe bei der Verabreichung in Form einer kombinierten Injektion im Gegensatz zu der verminderten Immunogenität, welche für andere Produkten beschrieben wurde, geben. Sämtliche azelluläre Pertussis-Impfstoffe unterscheiden sich im Hinblick auf ihren Antigengehalt, das Verfahren zur Toxinentgiftung und die darin enthaltenen Adjuvanzien oder Konservierungsmittel. Dennoch ist über eine erhöhte Immunogenität in Verbindung mit azellulären Pertussis-Impfstoffen, welche entweder PT, FHA und das 69 K-Protein (Ref. 77) oder PT, FHA, das 69 K-Protein und Fimbrien-Agglutinogene (Ref. 76) enthalten, berichtet worden.
In einer klinischen Prüfung der Phase III, die vor kurzem in Schweden unter der Schirmherrschaft der National Institutes of Health abgeschlossen wurde, wurde für einen Fünfkomponenten-APDT-Impfstoff eine Schutzwirkung von 85% (95% CI 81/89) nachgewiesen (Ref. 78).
Die vor kurzem veröffentlichte WO 98/00167 beschreibt eine multivalente, immunogene Zusammensetzung, welche azelluläre Pertussis/Diphtherie/Tetanus (APDT)-Impfstoffe mit einem Hib-Konjugatimpfstoff und einem Polioimpfstoff kombiniert. Diese multivalente, immunogene Zusammensetzung kann weiterhin ein Aluminiumsalz als ein Adjuvans enthalten. Die multivalenten, immunogenen Zusammensetzungen werden einfach durch Mischen der einzelnen Antigenzubereitungen in Anwesenheit eines Adjuvans hergestellt. WO 98/00167 sollte gemäß A.54(3) EPC berücksichtigt werden.
WO 93/24148 beschreibt multivalente, immunogene Zusammensetzungen, welche alle die Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg)-Komponente enthalten. Diese multivalenten Zusammensetzungen werden durch Mischen von HBsAg, das an Aluminiumphosphat adsorbiert wurde, mit einem oder mehreren Antigenen, welche an Aluminiumhydroxid (oder -phosphat) adsorbiert wurden, hergestellt.
Die gegenwärtig im Handel erhältlichen Kombinationsimpfstoffe können keine angemessenen Zubereitungen von passenden Antigenen in geeigneten immunogenen Formen enthalten, um einen erwünschten Wirksamkeitsgrad in einer anfälligen menschlichen Population zu erzielen.
Es wäre wünschenswert, wirksame Kombinationsimpfstoffe bereitzustellen, welche azelluläre Pertussis-Komponenten zusammen mit ausgewählten relativen Mengen von ausgesuchten Antigenen wie Tetanustoxoid, Diphtherietoxoid, Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugat, Poliovirus und/oder Hepatitis-B-Oberflächen-Ag um fassen. Es wäre besonders wünschenswert, einen multivalenten Impfstoff gegen Krankheiten zu entwickeln, welche durch eine Infektion mit Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Poliovirus und Hepatitis-B-Virus hervorgerufen werden. Damit solche Kombinationsimpfstoffe jedoch wirksam sind, um das Kriterium eines serologischen Schutzes für jede einzelne antigene Komponente zu erfüllen, müssen wesentliche Herausforderungen in Form der Antigenkompetition und des Phänomens einer gegenseitigen Beeinflussung bewältigt werden. Die vorliegende Erfindung überwindet die Begrenzungen gemäß dem Stand der Technik und löst die Probleme der Antigenkompetition und der gegenseitigen Beeinflussung, indem sie Zubereitungen von bis zu neun verschiedenen Antigenen bereitstellt, welche derart ausgelegt sind, daß sie einen serologischen Schutz gegen bis zu sechs verschiedene Infektionskrankheiten hervorrufen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Kombinations- oder multivalente Impfstoffe, welche eine Vielzahl von Impfstoffkomponenten enthalten, die zur Verhinderung, Linderung oder Behandlung von mehreren Krankheitszuständen geeignet sind, wobei diese Impfstoffe das Kriterium für einen serologischen Schutz für jede der Impfstoffkomponenten erfüllen, und Verfahren zu deren Anwendung. Im Einklang mit der Erfindung wird eine multivalente, immunogene Zusammensetzung bereitgestellt, welche in einem Wirt einen Schutz gegen eine Krankheit überträgt, die durch eine Infektion mit Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Poliovirus, Hepatitis-B-Virus und Haemophilus influenzae hervorgerufen wird.
Gemäß einer Ausführungsform der Aufgabe der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, umfassend:

(a) Pertussistoxoid und filamentöses Hämagglutinin in gereinigter Form,
(b) Tetanustoxoid,
(c) Diphtherietoxoid,
(d) inaktiviertes Poliovirus,
(e) ein Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugat,
(f) ein Hepatitis-B-Oberflächenartigen und
(g) ein Aluminiumsalz,

(1) Herstellen einer angesäuerten Suspension von Aluminiumhydroxidgel bei Raumtemperatur;
(2) stufenweise Hinzugabe von Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid zu der Gelsuspension;
(3) Hinzugabe von Pertussistoxoid und filamentösem Hämagglutinin, wobei jedes getrennt voneinander auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, zu der in (2) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren und einem weiteren Stehenlassen über Nacht;
(4) Hinzugabe von Carbonatpuffern in Medium 199 zu der in (3) erhaltenen Mischung und Einstellen des pH-Wertes auf etwa 7,0 bis 7,2;
(5) Einbringen des inaktivierten Poliovirus in die in (4) erhaltene Mischung und dann Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 6,8 und 7,0;
(6) Hinzugabe des Hepatitis-B-Oberflächenantigens, welches vorher auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, zu der in (5) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren; und
(7) Hinzugabe einer Lösung eines Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugates, welche vorher in einem Phosphatpuffer und einem Tris-Saccharosepuffer hergestellt wurde, zu der in (6) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Aufgabe der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, umfassend:

(a) Pertussistoxoid und filamentöses Hämagglutinin in gereinigter Form,
(b) Tetanustoxoid,
(c) Diphtherietoxoid,
(d) inaktiviertes Poliovirus,
(e) ein Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugat,
(f) ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen und
(g) ein Aluminiumsalz,

(1) Herstellen einer angesäuerten Suspension von Aluminiumhydroxidgel bei Raumtemperatur;
(2) Hinzugabe von Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid zu der Gelsuspension;
(3) Hinzugabe von Pertussistoxoid und filamentösem Hämagglutinin, wobei jedes getrennt voneinander auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, zu der in (2) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren und einem weiteren Stehenlassen über Nacht;
(4) Hinzugabe von Carbonatpuffern in Medium 199 zu der in (3) erhaltenen Mischung und Einstellen des pH-Wertes auf etwa 7,0 bis 7,2;
(5) Einbringen des inaktivierten Poliovirus in die in (4) erhaltene Mischung und dann Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 6,8 und 7,0;
(6) Hinzugabe einer Lösung eines Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugates, welche vorher in einem Phosphatpuffer und einem Tris-Saccharosepuffer hergestellt wurde, zu der in (5) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren.

Die durch diese Verfahren erhaltenen Impfstoffzusammensetzungen können etwa 5 bis etwa 30 μg Pertussistoxoid, etwa 5 bis etwa 30 μg filamentöses Hämagglutinin, etwa 5 bis etwa 50 LF Diphtherietoxoid, etwa 5 bis etwa 50 LF Tetanustoxoid, etwa 5 bis etwa 20 μg Hib-Konjugat und etwa 1 bis etwa 10 μg HBsAg, jeweils in Kombination mit IPV, enthalten.
Das inaktivierte Poliovirus, welches in der immunogen Zusammensetzung der Erfindung verwendet wird, umfaßt im allgemeinen eine Mischung aus inaktivierten Poliovirus-Typen 1, 2 und 3. In einer Zubereitung können solche Mischungen aus inaktivierten Poliovirus-Typen in einer Einzeldosis für den Menschen
etwa 20 bis etwa 50 Antigeneinheiten von Poliovirus-Typ 1;
etwa 4 bis etwa 10 Antigeneinheiten von Poliovirus-Typ 2; und
etwa 8 bis etwa 40 Antigeneinheiten von Poliovirus-Typ 3; umfassen.
Das Konjugatmolekül kann ein Konjugat aus einem geeigneten Trägerprotein, zum Beispiel Tetanustoxoid oder Diphtherietoxoid, und Polyribose-Ribitolphosphat (PRP) von Haemophilus influenzae-Typ-B umfassen. In einer bevorzugten Zubereitung wird das Konjugat in einer Form verwendet, worin etwa 10 μg PRP an etwa 20 μg Tetanustoxoid konjugiert sind.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen einen multivalenten Impfstoff ein, welcher in einer sicheren und wirksamen Weise einen Schutz gegen eine Reihe von weitverbreiteten Krankheiten übertragen kann. Die Möglichkeit, einen einzigen Impfstoff gegen mehrere Krankheiten bereitzustellen, ohne daß sich die Immunantworten auf die verschiedenen Immunogene gegenseitig beeinflussen, ist nützlich.
Durch die Verwendung des multivalenten Impfstoffes der vorliegenden Erfindung wird die für eine Immunisierung notwendige Zahl von Injektionen und Arztbesuchen für eine Impfung verringert. Dies ist für eine Immunisierung im Kindesalter besonders nützlich und vorteilhaft.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das Pertussistoxoid (PT) (einschließlich genetisch entgiftete Analoga hiervon, wie zum Beispiel bei Klein et al., US-Patent Nr. 5,085,862, beschrieben) kann durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann das PT mittels herkömmlicher Methoden, wie den durch Sakura (Ref. 55) beschriebenen, aus dem Kulturüberstand eines B. pertussis-Stammes isoliert werden. Das PT wird isoliert, indem zuerst der Kulturüberstand an eine Säule, enthaltend die Farbstoff-Liganden-Gelmatrix Affi-Gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), adsorbiert wird. Das PT wird durch eine hohe Salzkonzentration, so wie 0,75 M Magnesiumchlorid, aus dieser Säule eluiert und nach dem Entfernen des Salzes über eine Säule aus einer Fetuin-Sepharose-Affinitätsmatrix, bestehend aus Fetuin, gebunden an Cyanbromid-aktivierte Sepharose, geleitet. Das PT wird unter Verwendung von 4 M Magnesiumsalz aus der Fetuin-Säule eluiert.
Alternativ kann das Verfahren von Irons et al. (Ref. 56) angewendet werden. Der Kulturüberstand wird an eine CNBr-aktivierte Sepharose 4B-Säule adsorbiert, an welche zuvor Haptoglobin kovalent gebunden worden ist. Das PT bindet bei pH 6,5 an das Adsorptionsmittel und wird unter Verwendung von 0,1 M Tris/0,5 M NaCl-Puffer durch eine schrittweise Veränderung des pH-Wertes auf einen Wert von 10,0 eluiert.
Alternativ kann das in US-Patent Nr. 4,705,686, erteilt an Scott et al. am 10. November 1987 und hierin unter Bezugnahme eingeschlossen, beschriebene Verfahren angewendet werden. Bei diesem Verfahren werden Kulturüberstände oder Zellextrakte von B. pertussis über eine Säule aus einem Anionenaustauscherharz, welches eine ausreichende Kapazität aufweist, um das Endotoxin zu adsorbieren, aber ermöglicht, daß die Bordetella-Antigene hindurchfließen oder auf andere Weise von dem Endotoxin getrennt werden, geleitet.
Alternativ kann das PT mittels einer Perlit-Chromatographie, so wie in EP-Patent Nr. 336 736 beschrieben, gereinigt werden.
Entgiftung von PT
Das PT wird entgiftet, um unerwünschte Aktivitäten zu eliminieren, welche Nebenwirkungen des fertigen Impfstoffes hervorrufen könnten. Es kann irgendeines einer Vielzahl von herkömmlichen chemischen Entgiftungsverfahren, wie die Behandlung mit Formaldehyd, Wasserstoffperoxid, Tetranitromethan oder Glutaraldehyd, angewendet werden.
Zum Beispiel kann das PT mittels einer Modifikation des bei Munoz et al. (Ref. 57) beschriebenen Verfahrens mit Glutaraldehyd entgiftet werden. Bei diesem Entgiftungsverfahren wird gereinigtes PT in einer Lösung, enthaltend 0,01 M phosphatgepufferte Salzlösung, inkubiert. Die Lösung wird auf 0,05 M Glutaraldehyd eingestellt, und die Mischung wird bei Raumtemperatur für zwei Stunden inkubiert und anschließend auf 0,02 M L-Lysin eingestellt. Die Mischung wird weitere zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und dann während zwei Tagen gegen 0,01 M PBS dialysiert.
In einer besonderen Ausführungsform kann das Entgiftungsverfahren von EP-Patent Nr. 336 736 angewendet werden. Kurz zusammengefaßt kann das PT wie folgt mit Glutaraldehyd entgiftet werden. Gereinigtes PT in 75 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0, enthaltend 0,22 M Natriumchlorid, wird mit einem gleichen Volumen von Glycerin bis zu Proteinkonzentrationen von etwa 50 bis 400 μg/ml verdünnt. Die Lösung wird auf 37°C erwärmt und durch die Zugabe von Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (Gew./Vol.) entgiftet. Die Mischung wird für 4 h bei 37°C gehalten, und anschließend wird Asparaginsäure (1,5 M) bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugegeben. Die Mischung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit 10 Volumina von 10 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0, enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und St Glycerin, diafiltriert, um den Glyceringehalt zu verringern und das Glutaraldehyd zu entfernen. Das PT-Toxoid wird durch eine 0,2 μM-Membran sterilfiltriert.
Falls Rekombinationstechniken angewendet werden, um ein mutiertes PT-Mole-kül, welches keine oder nur eine geringe Toxizität zeigt, zur Verwendung als das entgiftete Molekül herzustellen, ist keine chemische Entgiftung erforderlich.
Reinigung von FHA
FHA kann aus dem Kulturüberstand gereinigt werden, so wie im wesentlichen durch Cowell et al. (Ref. 58) beschrieben wurde. Wachstumspromotoren wie methylierte beta-Cyclodextrine können verwendet werden, um die Ausbeute von FHA in den Kulturüberständen zu erhöhen. Der Kulturüberstand wird auf eine Hydroxyapatit-Säule geladen. Das FHA wird an die Säule adsorbiert, aber das PT nicht. Die Säule wird mit Triton X-100 gründlich gewaschen, um das Endotoxin zu entfernen. Das FHA wird dann unter Verwendung von 0,5 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat eluiert und gegebenenfalls über eine Fetuin-Sepharose-Säule geleitet, um restliches PT zu entfernen. Die weitere Aufreinigung kann einen Durchgang über eine Sepharose CL-6B-Säule beinhalten.
Alternativ kann das FHA unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gegen das Antigen, wobei die Antikörper an eine CNBr-aktivierte Affinitätssäule gebunden sind, gereinigt werden (Ref. 59).
Alternativ kann das FHA mittels einer Perlit-Chromatographie, so wie im oben erwähnten EP 336 736 beschrieben, gereinigt werden.
PT+FHA-Impfstoffe
Ein solcher Impfstoff könnte, wie in EP 242 301 und in EP 242 302 beschrieben, hergestellt werden.
Hib-Antigene
Solche Antigene können auf dem Kapselpolysaccharid (PRP), konjugiert an ein Trägerprotein, basieren. Das Polymer ist ein Polymer aus Ribose, Ribitol und Phosphat. Typischerweise ist das Trägerprotein ein Diphtherie- oder Tetanustoxoid oder ein äußeres Membranprotein von N. meningitidis. Solche Konjugate sind zum Beispiel in EP 161,188 , EP 208,375 , EP 477,508 , US 4,365,170 oder US 4,673,574 offenbart.
Solche Polysaccharidkonjugate können mittels einer bekannten Kopplungstechnik, wie zum Beispiel in WO 93/15760 oder in den im vorhergehenden Satz erwähnten Patenten beschrieben, hergestellt werden.
Falls eines der für die Zusammensetzung ausgewählten Hib-Antigene ein Kapselpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugat ist (PRP-T ist ein Beispiel hierfür), und falls ein Aluminiumsalz (Aluminiumhydroxid ist ein Beispiel hierfür) in der Zusammensetzung verwendet wird, ist das Kapselpolysaccharid-Tetanustoxoid-Konjugat weniger stabil und weniger immunogen als ohne das Aluminiumsalz. In solchen Fällen, können diese Stabilitäts- und Immunogenitätsprobleme durch die in WO 96/37222 beschriebene Technik gelöst werden. Kurz zusammengefaßt besteht diese Technik in der Zugabe von Anionen zu den Aluminiumsalzen. Diese Anionen können Phosphate oder Citrate sein. Phosphate können durch eine Monokaliumphosphat- oder Dikaliumphosphatlösung bereitgestellt werden. Eine Kombination von Phosphaten und Carbonaten (Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat) kann ebenfalls als Quelle für die Anionen verwendet werden.
Poliovirusimpfstoff
Die Polioviruskomponente der Kombination kann der nach Salk inaktivierte Polioimpfstoff sein.
Ausgewählte multivalente Impfstoffzubereitungen
In ausgewählten Ausführungsformen stellt die Erfindung Impfstoffe mit den folgenden Eigenschaften bereit, wobei alle durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden können:
Eine Zubereitung umfaßt eine Kombination aus einem Pertussis-Komponentenimpfstoff kombiniert mit einem Diphtherie- und einem Tetanustoxoid, einem inaktivierten Poliovirus, einem Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugat und einem Hepatitis-B-Oberflächen-Ag, die als "vollständiges flüssiges DTacP-IPV-PRP-T-HBsAg" bezeichnet wird.

Jede 0,5 ml-Dosis des vollständigen flüssigen DTacP-IPV-PRP-T-HBsAg für die Anwendung beim Menschen wurde derart zubereitet, daß sie annähernd enthält:

25 μg	Pertussistoxoid (PT)
25 μg	Filamentöses Hämagglutinin (FHA)
30 LF	Diphtherietoxoid
10 LF	Tetanustoxoid
40 D-Antigeneinheiten	Poliovirus-Typ 1
8 D-Antigeneinheiten	Poliovirus-Typ 2
32 D-Antigeneinheiten	Poliovirus-Typ 3
10 μg	Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharid, kovalent gebunden an
20 μg	Tetanusprotein
5 μg	Hepatitis-B-Oberflächen-Ag
20 μMol	Phosphate
5 μMol	Carbonate
0,125 ml	50 mM Tris-Puffer, umfassend 42,5% Saccharose
0,306 mg	Aluminiumsalze

Eine andere Zubereitung, welche hierin als" DTaP-IPV-PRP-T/HBsAg" oder als die "Zweikammer-Anordnung" bezeichnet wird, besteht aus ein Mischung von Antigenen in einer Lösung in der proximalen Kammer einer Bypass-Spritze, wobei die restlichen Komponenten in der distalen Kammer der Bypass-Spritze bereitgestellt werden. Die erhal tene Zusammensetzung entspricht der vorstehend bereitgestellten, mit dem Unterschied, daß die Aluminiumsalze in einer Menge von 0,356 mg vorhanden sind.
Impfstoffanwendung
Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können durch subkutane oder intramuskuläre Injektion parenteral verabreicht werden. Die immunogenen Zubereitungen und Impfstoffe werden in einer Art und Weise, welche mit der Dosiszubereitung vereinbar ist, und in einer solchen Menge, welche therapeutisch wirksam, immunogen und protektiv ist, verabreicht. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Individuum, einschließlich zum Beispiel der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren und gegebenenfalls eine zellvermittelte Immunantwort hervorzurufen, ab.
Geeignete Schemata für die erste Verabreichung und Auffrischdosen sind ebenfalls variabel, aber können eine erste Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verabreichungen, einschließen. Die Dosierung kann auch von dem Verabreichungsweg abhängen und variiert mit der Körpergröße des Wirtes. Die Immunogenität kann wesentlich verbessert werden, falls die Antigene zusammen mit Adjuvanzien, welche üblicherweise als 0,005 bis 0,5%ige Lösung verwendet werden, verabreicht werden. Adjuvanzien erhöhen die Immunogenität eines Antigens, aber sind nicht notwendigerweise selbst immunogen.
Adjuvanzien können dadurch wirksam sein, daß sie das Antigen in unmittelbarer Nähe der Verabreichungsstelle zurückhalten, um einen Depoteffekt hervorzurufen, der eine langsame, anhaltende Freisetzung des Antigens an Zellen des Immunsystems ermöglicht. Adjuvanzien können auch Zellen des Immunsystems an ein Antigendepot anlocken und solche Zellen dazu stimulieren, Immunantworten hervorzurufen. Immunsystemstimulierende Substanzen oder Adjuvanzien sind seit vielen Jahren verwendet worden, um die Immunantworten des Wirtes auf zum Beispiel Impfstoffe zu verstärken. Endogene Adjuvanzien wie Lipopolysaccharide sind normalerweise Komponenten der abgetöteten oder attenuierten Bakterien, welche als Impfstoffe verwendet werden. Exogene Adjuvanzien sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent an Antigene gebunden sind und derart zubereitet werden, daß sie die Immunantworten des Wirtes verstärken. So sind Adjuvanzien identifiziert worden, welche die Immunantwort gegen parenteral verabreichte Antigene verstärken.
Einige dieser Adjuvanzien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, was sie für die Anwendung bei Menschen und vielen Tieren ungeeignet macht. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (zusammen gewöhnlich als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvanzien in Human- und Veterinärimpfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alaun bei der Verstärkung von Antikörperantworten auf das Diphtherie- und das Tetanustoxoid ist hinreichend bewiesen.
Beispiele
Beispiel 1:
Herstellung der vollständigen flüssigen Zubereitung DTacP-IPV-PRP-T-HBsAg
Eine bevorzugte Zubereitung einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung umfaßt eine flüssige Suspension einer immunologisch wirksamen Menge von bis zu neun verschiedenen Antigenen, welche ausgewählt werden, um einen Schutz gegen nicht weniger als sechs infektiöse Agenzien hervorzurufen. Diese Zubereitung, worin alle Antigene in Form einer Lösung vorliegen, um für die Verabreichung an einen menschlichen Wirt geeignet zu sein, wird als "vollständiges flüssiges DTacP-IPV-PRP-T-HBsAg" oder kurz "vollständig flüssig" bezeichnet. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der vollständigen flüssigen Zubereitung der vorliegenden Erfindung ist wie folgt.
Durch Mischen von Aluminiumhydroxidgel mit Wasser in pharmazeutischer Qualität bei Raumtemperatur wird eine angesäuerte Suspension hergestellt. Dann werden nacheinander das Diphtherietoxoid (DT) und das Tetanustoxoid (TT) zu der Gelsuspension zugegeben. Die Reihenfolge der Zugabe dieser Komponenten ist nicht entscheidend, aber die Lösung wird vorzugsweise nach der Zugabe jeder einzelnen Antigenkomponente während mindestens 30 Minuten gerührt und dann während mindestens 30 Minuten stehengelassen. Das Pertussistoxoid (PT) und das filamentöse Hämagglutinin (FHA) werden jeweils getrennt voneinander auf Aluminiumsalzen adsorbiert und gegebenenfalls konzentriert. Diese Komponenten werden zu der vorstehenden Mischung zugegeben, welche während mindestens 30 Minuten gerührt und dann über Nacht stehengelassen wird.
Zu diesem Zeitpunkt werden Carbonatpuffer in Medium 199 zugegeben, was vorzugsweise über einen 0,2 μm-Filter erfolgt, und gegebenenfalls wird entweder NaOH (2,5 M) oder Essigsäure (10%) zugegeben, um den pH-Wert auf etwa 7 bis 7,2 einzustellen.
Anschließend wird das IPV in einer geeigneten Konzentration in Wasser von pharmazeutischer Qualität eingebracht und vorzugsweise über einen 0,2 μm-Filter zu der Mischung zugegeben. Der pH-Wert wird dann auf einen Wert zwischen 6,8 und 7 eingestellt.
Im Anschluß daran wird das HBsAg, welches vorher auf Aluminiumsalzen adsorbiert worden ist, zugegeben und während mindestens 30 Minuten eingerührt.
Phosphatpuffer, Tris-Saccharosepuffer und Wasser zur Injektion werden zu einer konzentrierten Lösung des Haemophilus influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugates (Hib) zugegeben.
Schließlich wird die gepufferte Hib-Lösung zu den anderen Impfstoffkomponenten zugegeben, was vorzugsweise über einen 0,2 μm-Filter erfolgt, und mindestens 30 Minuten eingerührt.
Die resultierende Lösung, welche im allgemeinen durch das vorstehend dargelegte Verfahren erhalten wird, wird als das vollständige flüssige Massenprodukt bezeich net. Diese Hauptmasse wird dann dazu verwendet, die einzelnen 0,5 ml-Dosen zur Verwendung in klinischen Studien und Impfprozeduren herzustellen. Für die Fachleute ist erkennbar, daß die Reihenfolge der Zugabe der einzelnen Komponenten, die zum Verdünnen der einzelnen Komponenten verwendeten Puffer, die Zugabe- und Mischverfahren, die zum Einstellen des pH-Wertes verwendeten Säuren und Basen sowie die Mischbedingungen modifiziert werden können, ohne vom dem Geist der hierin beanspruchten Erfindung abzuweichen.
Beispiel 2:
Herstellung der Zweikammer-Zubereitung DTacP-IPV-PRP-T/HBsAg
Eine andere Zubereitung einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung umfaßt eine flüssige Suspension einer immunologisch wirksamen Menge von bis zu acht verschiedenen Antigenen, die ausgewählt werden, um einen Schutz gegen nicht weniger als fünf infektiöse Agenzien hervorzurufen, welche in einer ersten Kammer, der proximalen Kammer einer 1 ml-Bypass-Spritze, vorhanden ist, und eine immunologisch wirksame Menge eines anderen Antigens, welches ausgewählt wird, um einen Schutz gegen ein weiteres infektiöses Agens hervorzurufen, welche in einer zweiten Kammer, der distalen Kammer der Bypass-Spritze, vorhanden ist. Diese Zubereitung, worin sämtliche Antigene in Lösung vorliegen und wobei bestimmte Antigene in die distale Kammer einer Bypass-Spritze eingebracht werden und das (die) verbleibende(n) Antigene) in die proximale Kammer einer Bypass-Spritze eingebracht werden, wird als "Zweikammer-DTacP-IPV-PRP-T/HBsAg" oder kurz "Zweikammer" bezeichnet.
Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zweikammer-Zubereitung macht erforderlich, daß das in Beispiel 1 angegebene Herstellungsverfahren für die vollständige flüssige Hauptmasse geringiügig modifiziert wird. Sämtliche der für die Herstellung der vollständigen flüssigen Hauptmasse angegebenen Schritte stimmen überein, außer daß der Schritt, bei welchem das HBsAg zu der Mischung zugegeben wird, ausgelassen wird. Die erhaltene Lösung wird als DTacP-IPV-PRP-T-Hauptmasse bezeichnet. 0,5 ml der DTacP-IPV-PRP-T-Hauptmasse werden in die distale Kammer einer 1,0 cm³-Bypass-Spritze eingebracht. 0,5 ml einer immunologisch wirksamen Dosis von HBsAg, welches vorher auf Aluminiumsalzen adsorbiert worden ist, wird in die proximale Kammer der Bypass-Spritze eingebracht.
Beispiel 3:
Klinische Prüfungen
Die klinische Prüfungen wurden an Menschen durchgeführt, wie hierin beschrieben, um die Sicherheit, Nicht-Reaktogenizität und Nützlichkeit der multivalenten Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu belegen. Insbesondere wurden unerwünschte Nebenwirkungen erfaßt (wie zum Beispiel nachstehend in den Tabellen 1 und 2 gezeigt ist) und wurden die Immunantworten auf jedes der in den Impfstoffen enthaltenen Antigene bestimmt (wie zum Beispiel nachstehend in den Tabellen 3–5 gezeigt ist). Die vollständige flüssige Zubereitung und die Zweikammer-Zubereitung wurden in einer offenen, nicht vergleichenden, randomerisierten Studie untersucht.
350 Kleinkinder, welche an einer zweiarmigen, randomerisierten Studie teilnahmen, erhielten insgesamt vier (4) Impfstoffinjektionen. Die Kleinkinder wurden in zwei gleiche Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe (Gruppe 1) erhielt den multivalenten Impfstoff in der vollständigen flüssigen Anordnung. Die zweite Gruppe (Gruppe 2) erhielt den multivalenten Impfstoff in einer Zweikammer-Anordnung. (Wie hierin beschrieben, beinhaltet die "Zweikammer"-Zubereitung die Verwendung eines auf einem Aluminiumsalz adsorbierten Hepatitis-B-Oberflächen-Ag (HBsAg) in der proximalen Kammer der Spritze, wobei die restlichen Komponenten des Impfstoffes in einer gepufferten Lösung in der distalen Kammer der Spritze vorliegen).
Das Impfschema bestand aus einer intramuskulären Injektion, welche in einem Alter von zwei (2), drei (3) und vier (4) Monaten verabreicht wurde, und einer letzten Injektion, welche zum gleichen Zeitpunkt in einem Alter zwischen 12 und 14 Monaten verabreicht wurde. Die Impfstoffe wurden durch intramuskuläre Injektion vertikal in die Hautoberfläche in die anterolaterale Seite des Oberschenkels verabreicht. Unmittelbar vor der Impfung und einen Monat nach Dosis 3 wurden Blutproben für eine Antikörpertitration entnommen.
Unerwünschte Vorkommnisse wurden während eines Monats nach jeder Immunisierung überwacht, und lokale Reaktionen an der Injektionsstelle wurden innerhalb von drei (3) Tagen nach jeder Injektion erfaßt. Während des gesamten Zeitraums der Studie wurden keine schweren, unerwünschten Vorkommnisse erfaßt, welche mit dem Impfstoff in Beziehung standen.
Lokale Reaktionen traten nur vereinzelt und vorübergehend auf, und die Impfstoffe wurden gut toleriert.
Die IgG-Antworten auf jede Komponente der multivalenten Impfstoffe wurden mittels einer herkömmlichen serologischen Analyse, bei welcher die Antikörpertiter im Anschluß an die Dosis 3 mit den Titern vor der Immunisierung verglichen wurden, miteinander verglichen. Es wurde weitgehend kein signifikanter Unterschied im Hinblick auf die Ergebnisse, welche durch die Immunisierung mit der vollständigen flüssigen Zubereitung erhalten wurden, im Vergleich zu der Zweikammer-Zubereitung beobachtet. Beide Impfstoffe sehen einen sehr gute und seroprotektive Immunantwort gegen jedes Antigen in deren Zusammensetzung vor. Diese Ergebnisse sind in ihrer Gesamtheit, bezogen auf einer Komponente-zu-Komponente-Basis, nachstehend in den Tabellen 3(a)–(e) aufgeführt, und die Endergebnisse im Hinblick auf eine Seroprotektion sind nachstehend in Tabelle 4 angegeben.
In Tabelle 3 werden die folgenden herkömmlichen Abkürzungen verwendet: n = Anzahl der untersuchten Individuen; GMT = geometrischer mittlerer Titer; und CI = Konfidenzintervall um jeden GMT-Wert, bestimmt durch eine herkömmliche statistische Methode.
In Tabelle 4 entsprechen die Kriterien für eine Seroprotektion der Referenz, welche durch die Fachleute auf dem Gebiet der Vakzinologie für jede Komponente im Hinblick auf die erwartete Antikörperantwort, welcher nach einer Primärimmunisierung, bestehend aus drei Dosen, welche in einem Abstand von 1 bis 2 Monaten verabreicht werden, oder nach einer Auffrischimmunisierung, welche etwa ein Jahr nach der ersten Immunisierung verabreicht wird, erhalten wird, allgemein anerkannt ist. Das Kriterium für eine Seroprotektion für die PT- und FHA-Antigene ist ein 4-facher Anstieg zwischen den Titern vor und nach der Reihe von Primärimmunisierungen und den Titern nach der vierten Dosis. SPR ist die Seroprotektionsrate und entspricht dem Prozentsatz der Individuen, welche das Kriterium für eine Antwort erfüllen. GMT hat die gleiche Bedeutung wie in Tabelle 3.
Tabelle 3(a): HBsAg-Antikörperantwort durch die Impfstoffgruppe
Tabelle 3(b): PT- und FHA (EIA)-Antikörperantworten durch die Impfstoffgruppe
Tabelle 3(c): Tetanus- und Diphtherie-Antikörperantworten
Tabelle 3(d): Neutralisierende Antikörperantwort auf Poliomyelitisvirus-Typ 1, 2 und 3
Tabelle 3(e): PRP-Antikörperantwort
Tabelle 4: Seroprotektion für die vollständige flüssige Zubereitung
Die einen Monat nach der Reihe von Primärimmunisierungen im Alter von 2, 3 und 4 Monaten erhaltenen Ergebnisse im Hinblick auf die Sicherheit und die Immunogenität veranschaulichen den Nutzen der multivalenten Impfstoffe der vorliegenden Erfindung. Die Immunantwort auf die D-, T- und IPV-Antigene war sehr gut ausgeprägt. Mehr als 87% der Kleinkinder reagierten auf die azellulären Pertussis-Komponenten mit einem 4-fachen Anstieg der anti-PT- und anti-FHA-Antikörper-Titer.
Für PRP sowie für Hepatitis-B wurde mit einem Spiegel von 0,15 μg eine gute Immunantwort nachgewiesen, wobei beide eine Seroprotektion von 92% hervorriefen. Diese Ergebnisse sind in den obigen Tabellen 3 und 4 aufgeführt.
Ergebnisse der Auffrischimmunisierung
Die IgG-Antworten auf jede Komponente der getesteten multivalenten Impfstoffe wurden mittels einer herkömmlichen serologischen Analyse, bei welcher die Antikörpertiter im Anschluß an die letzte Auffrischdosis, welche in einem Alter zwischen 12 und 14 Monaten verabreicht wurde, mit den Titern vor der Auffrischimpfung (nach der Dosis 3) verglichen wurden, miteinander verglichen. Diese Ergebnisse sind in ihrer Gesamtheit, bezogen auf einer Komponente-zu-Komponente-Basis, nachstehend in den Tabellen 5(a)–(e) aufgeführt, und die Endergebnisse im Hinblick auf eine Seroprotektion sind nachstehend in Tabelle 6 angegeben. Alle Abkürzungen in den folgenden Tabellen sind wie vorher für die obigen Tabellen 3(a)–(e) und 4 definiert.
Tabelle 5(a): HBsAg-Antikörperantwort auf die Auffrischimpfung
Tabelle 5(b): Pertussis-Antikörperantworten auf die Auffrischimpfung (PT und FHA)
Tabelle 5(c): Tetanus- und Diphtherie-Antikörperantworten auf die Auffrischimpfung
Tabelle 5(d): Poliomyelitisvirus-Typ 1, 2 und 3-Antikörperantwort auf die Auffrischimpfung
Tabelle 5(e): PRP-Antikörperantwort auf die Auffrischimpfung
Tabelle 6: Seroprotektion für die vollständige flüssige Zubereitung
Die Erfinder beobachten für alle Antigene einen ausgezeichneten Auffrischungseffekt, 5 welcher durch die vierte Dosis hervorgerufen wurde, was das Vorhandensein eines ausgezeichneten Immungedächtnisses bestätigt, das durch die schnelle Folge von Primärimpfungen im Alter von 2, 3 und 4 Monten entwickelt wurde. Diese Ergebnisse sind in den obigen Tabellen 5 und 6 gezeigt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sehen eine Seroprotektion gegen jede Krankheit vor.
Zusammenfassung der Offenbarung
Vorstehend wird die Herstellung von zahlreichen multivalenten Impfstoffen ausführlich beschrieben. Die oben beschriebenen, umfassenden klinischen Prüfungen zeigen eindeutig, daß die multivalenten, immunologischen Zusammensetzungen der vorliegenden 5 Erfindung sicher und in der Übertragung eines Schutzes gegen einen ausgedehnten Bereich von Pathogenen wirksam sind.
Diese Ergebnisse sind insofern überraschend, als zu erwarten gewesen wäre, daß Mischungen aus zahlreichen Impfstoffkomponenten zu dem gut bekannten Phänomen der Antigenkompetition oder gegenseitigen Beeinflussung beitragen, wodurch bestimmte Impfstoffkomponenten, welche in der Lage wären, eine Seroprotektion zu übertragen, wenn sie einzeln in einen immunkompetenten Wirt eingebracht werden, weniger wirksam werden, wenn sie in Kombination mit anderen Antigenen verabreicht werden. Somit vereinfachen die erfindungsgemäßen Impfstoffe den Immunisierungsprozess und minimieren die Zahl der einzelnen Immunisierungen, welche notwendig sind, um Patienten im Kleinkindalter vor einer Infektion mit Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Haemophilus influenzae, Poliovirus und Hepatitis-B-Virus zu schützen, außerordentlich.
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Claims

Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung umfassend: (a) Pertussistoxoid und filamentöses Hämagglutinin in gereinigter Form, (b) Tetanustoxoid, (c) Diphtherietoxoid, (d) inaktiviertes Poliovirus, (e) ein Haemophilus-influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugat, (f) ein Hepatitis-B-Oberflächenartigen und (g) ein Aluminiumsalz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Herstellen einer angesäuerten Aluminiumhydroxidgelsuspension bei Raumtemperatur; (2) stufenweise Hinzugabe von Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid zu der Gelsuspension; (3) Hinzugabe von Pertussistoxoid und filamentösem Hämagglutinin, wobei jedes voneinander getrennt auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, zu der in (2) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren und einem weiteren Stehenlassen über Nacht; (4) Hinzugabe von Carbonatpuffern in Medium 199 zu der in (3) erhaltenen Mischung und Einstellen des pH-Wertes auf ungefähr 7,0 bis 7,2; (5) Einbringen von inaktiviertem Poliovirus in die in (4) erhaltene Mischung und dann Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 6,8 und 7,0; (6) Hinzugabe von Hepatitis-B-Oberflächenartigen, welches vorher auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, zu der in (5) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren; und (7) Hinzugabe einer Lösung eines Haemophilus-influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugates, welche vorher in einem Phosphatpuffer und einem Tris-Saccharosepuffer hergestellt wurde, zu der in (6) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren.
Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung umfassend: (a) Pertussistoxoid und filamentöses Hämagglutinin in gereinigter Form, (b) Tetanustoxoid, (c) Diphtherietoxoid, (d) inaktiviertes Poliovirus, (e) ein Haemophilus-influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugat, (f) ein Hepatitis-B-Oberflächenartigen und (g) ein Aluminiumsalz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Herstellen einer angesäuerten Aluminiumhydroxidgelsuspension bei Raumtemperatur; (2) Hinzugabe von Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid zu der Gelsuspension; (3) Hinzugabe von Pertussistoxoid und filamentösem Hämagglutinin, wobei jedes voneinander getrennt auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, zu der in (2) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren und einem weiteren Stehenlassen über Nacht; (4) Hinzugabe von Carbonatpuffern in Medium 199 zu der in (3) erhaltenen Mischung und Einstellen des pH-Wertes auf ungefähr 7,0 bis 7,2; (5) Einbringen von inaktiviertem Poliovirus in die in (4) erhaltene Mischung, und dann Einstellen des pH-Wertes auf einen Wert zwischen 6,8 und 7,0; (6) Hinzugabe einer Lösung eines Haemophilus-influenzae-Typ-B-Polysaccharidkonjugates, welche in einem Phosphatpuffer und einem Tris-Saccharosepuffer hergestellt wurde, zu der in (5) erhaltenen Mischung, gefolgt von mindestens 30 Minuten Rühren; (7) Einfüllen von 0,5 ml der in (6) erhaltenen Mischung in die distale Kammer einer 1ml-Bypassspritze; und (8) Hinzugabe von 0,5 ml Hepatitis-B-Oberflächenartigen, welches vorher auf Aluminiumsalzen adsorbiert wurde, in die proximale Kammer der in Schritt (7) verwendeten Bypassspritze.