DE69419966T2

DE69419966T2 - Impstoff gegen Streptococcus suis-Infektion

Info

Publication number: DE69419966T2
Application number: DE69419966T
Authority: DE
Inventors: Antonius Arnoldus Christiaan Jacobs
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1993-05-17
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 2000-01-20
Anticipated expiration: 2014-05-10
Also published as: HU9401511D0; CZ117594A3; PL303482A1; HU218154B; DE69419966D1; PL177219B1; JPH0710774A; SK281324B6; GR3031698T3; TW494103B; JP3578799B2; US5612042A; ATE183241T1; ES2137310T3; DK0626452T3; EP0626452B1; SK56394A3; EP0626452A1; HUT69796A; CZ289302B6

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid von Streptococcus suis, einen Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen Krankheiten, die durch Streptococcus suis verursacht werden, Antikörper, die mit dem Streptococcus suis-Polypeptid reagieren und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Impfstoffs.
Streptococcus suis wurde als ein hauptsächlicher Verursacher einer übertragbaren Krankheit in Schweinen identifiziert, die durch Arthritis, Septicemia, Menigitis, Pericarditis, Endocarditis, Polyserositis und/oder Pneumonie gekennzeichnet ist (Clifton-Hadley, F. A., Br. Vet. Journ. 139: 1-5 (1983); Vecht et al., Vet. Quarterly 7: 315-321 (1985); Windsor, R. S., Vet. Rec. 101: 378-379 (1977); Higgins et al., Can. J. Vet. Res. 54: 170-173 (1990); Devriese et al., Vet. Rec. 127: 168 (1999)). Die Morbidität ist besonders hoch bei Ferkeln im Alter von 3-12 Wochen (Windsor, R. S. und Elliot, S. D., J. Hyg. Camb. 75: 69-78 (1975); Giuse et al., Vet. Rec. 117: 43-44 (1985); Hoffman, L. J. und Henderson, L. M., Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28. Ann- Proc. 201-210: (1985)). Obwohl Schweine jeden Alters für dieses bakterielle Agenz empfänglich sind, ist die Mortalität in Schweinen im Alter von über 14 Wochen niedrig (Giuse et al., Vet. Rec. 117: 43-44 (1985); Hoffman, L. J. und Henderson, L. M., Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28. Ann. Proc. 201-210: (1985)).
Gelegentlich steht dieser Organismus auch mit einer Erkrankung in anderen Tierspezies und im Menschen in Verbindung (Devriese et al., Vet. Rec. 127: 168 (1990), Hommez et al., Vet. Rec. 123: 626-627 (1988); Arends et al., Rev. Infect. Dis. 10: 131-137 (1988); Gottschalk et al., J. Clinic. Microbiol. 27: 2633-2636 (1989); Arends, J. P. und Zanen, H. C., Rev. Infect. Dis. 10: 131- 137 (1988)). Infektionen in diesen Fällen treten gewöhnlich durch Hautläsionen auf.
Eine S. suis-Erkrankung wurde zuerst in den Niederlanden von De- Moor (DeMoor, C. E., Antonie von Leuwenhoek 29: 272-280 (1963)) beschrieben. Seitdem haben andere Forscher von Ausbrüchen sowohl in anderen europäischen Staaten als auch in Kanada, den Vereinigten Staaten und Australien berichtet. (Sanford, E. and Tilker, M. E., J. AM. Vet. Med. Assoc. 23: 5-97 (1982); Perch et al., J. Clinic. Microbiol. 17: 993-996 (1983); Larson, D. J. und Kott, B., Am. Assoc. Vet. Lab. Diagnosticians 28. Ann. Proc.: 121-130 (1985); Giuse et al., Vet. Rec. 117: 43-44 (1985); Clifton-Hadley, F. A., Br. Vet. Journ. 139: 1-5 (1983)).
Streptococcus suis-Stämme sind in eine grosse Zahl verschiedener Serotypen unterteilt worden.
Eine Serotyp-Bestimmung basiert auf dem kapsulären Polysaccharid-Antigen (Koehne et al., Am. J. Vet. Res. 40; 1640-1641 (1979); Perch et al., J. Clin. Microbiol. 17: 993-996 (1983). Bis jetzt wurden weltweit 29 verschiedene Serotypen nachgewiesen.
Verschiedene Serotypen herrschen jedoch in unterschiedlichen Ländern vor. In skandinavischen Ländern ist der Serotyp 7 der vorherrschendste, wohingegen in Österreich der Serotyp 9 am häufigsten auftritt. Der weltweit am vorherrschendste Serotyp ist der Serotyp 2 (Gogolewski et al., Aust. Vet. J. 67: 202-204 (1987); Boetner et al., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B 95: 233-239 (1987)).
Über die Pathogenese, Virulenzfaktoren oder schützende Antigene von Streptococcus suis ist wenig bekannt.
Dies impliziert, dass es keinen Hinweis darauf gibt, welche Faktoren für eine effiziente Impfung gegen diesen Krankheitserreger notwendig sind.
Ein im allgemeinen befolgter Weg zur Herstellung eines Impfstoffes gegen eine bakterielle Erkrankung ist die Herstellung und das Testen eine Impfstoffpräparats aus ganzen Zellen.
Dies wurde auch im Fall von Streptococcus suis gemacht, und es schien, als ob ein Impfstoff aus ganzen Zellen eine signifikanten Schutz in Schweinen gegenüber einen homologen Challenge hervorruft (Holt et al., Res. Vet. Sci 48: 23-27 (1990)).
Es scheint jedoch so zu sein (Kebede et al., Vet. Microbiol. 22: 249-257 (1990)), dass der durch Ganzzell-Präparate erhaltene Schutz serotypspezifisch ist. Andere allgemeine und gut bekannte Nachteile eines Ganzzell-Impfstoffs sind a) unerwünschte Reaktionen an und im Bereich der Injektionsstelle, und b) die grosse Menge an unspezifischem Protein, das verabreicht wird im Vergleich zu der Menge Material, die tatsächlich für die Induktion des Schutzes verantwortlich ist.
In Anbetracht der Tatsache, dass zur Zeit auf der Basis der Polysacchariskapseln bereits 29 verschiedene Streptococcus suis- Serotypen bekannt sind, impliziert dies, dass auf ganzen Zellen basierende Impfstoffe viele Serotypen enthalten sollten, um einen breiten Schutz zu erhalten.
Solch ein Impfstoff wurde tatsächlich hergestellt, um Menschen gegen Pneumonie zu schützen, die durch Streptococcus pneumonia verursacht wird (Boulnois, G. J.; Journ. Gen. Microbiol. 138: 249-259 (1992)).
Dieser Impfstoff enthält 23 Polysaccharide der am häufigsten auftretenden Serotypen. Dieser Impfstoff hat, neben seiner Komplexität, signifikante Nachteile, die auf den niedrigen Grad der Immunogenität der kapsulären Polysaccharide zurückzuführen ist.
Es wurden daher viele Versuche unternommen, die charakteristischen Faktoren zu bestimmen, die möglicherweise bei der Pathogenese von Streptococcus suis eine Rolle spielen.
Haemagglutinine und Fimbrien wurden als potentielle Virulenzfaktoren beschrieben, jedoch ist ihre genaue Rolle oder Funktion bei der Pathogenese nicht bekannt und die entsprechenden Moleküle oder Proteine wurden nicht identifiziert. (Jacques et al., J. Bacteriol. 172: 2833-2838 + 1990), Gottschalk et al., J. Clin. Microbiol. 28: 2156-2158 (1990)).
Bislang wurden vier Proteine als potentielle Virulenzfaktoren vorgeschlagen:
a) ein 44 kD-Protein (Gottschalk et al., Vet. Microb. 30: 59- 71 (1992)
b) ein 94 kD-Protein (Holt et al., J. Comp. Path. 1003: 85-94 (1990))
c) ein 110 kD-Protein (the E(xtracellular) F(actor)) (Vecht et al., Inf. Immun. 59: 3156-3162 (1991), Vecht et al., Inf. Immun. 60: 550-556 (1992), Smith und Vecht, PCT-Anmmeldung WO92/16630)
d) ein 136 kD-Protein (the (uramindase) R(eleased) (rotein) (Vecht et al., Inf. Immun. 59: 3156-3162 (1991), Vecht et al., Inf. Immun. 60: 550-556 (1992), Smith und Vecht, PCT-Anmmeldung WO92/16630).
Das 44 kD-Protein wurde in den pathogenen Stämmen von S. suis Serotyp 2 nachgewiesen und schien in einem nicht-pathogenen mutagenen Stamm nicht vorhanden zu sein. Antiseren, die sich gegen einen mutagenen Stamm richteten, dem das 44 kD-Protein fehlte, genügten nicht für einen vollen Schutz gegen de Eltern- Stamm. Es wurde daher angenommen, dass es zur Virulenz beiträgt. Antiserum, das in Hasen gegen das 94 kD-Protein von S. suis vom Serotyp 2 erzeugt wurde, induzierte in Mäusen einen Schutz gegen einen homologen Challenge.
Die 110 kD- und 136 kD-Proteine scheinen in hochpathogenen Stämmen vorzukommen und in nicht-pathogenen Stämmen abwesend zu sein, wohingegen das 110 kD-Protein in Stämmen mit niedriger Pathogenität nicht vorhanden zu sein scheint.
Dies könnte darauf hinweisen, dass die 110 und 136 kD-Proteine an der Pathogenese beteiligt sind. Andererseits wurden bis jetzt noch keine Schutzversuche auf der Basis von Isolaten dieser Proteine veröffentlicht.
Schlussfolgerung: von allen bislang bestimmten Virulenzfaktoren, konnte nur für das 44 kD- und das 94 kD-Protein gezeigt werden, dass sie beim Schutz gegen den Serotyp 2 eine Rolle spielen. Dieser Schutz wurde nur in Mäusen und mit einem homologen Challenge gezeigt.
Ausserdem wurde bis jetzt das Vorhandensein der vier oben genannten Proteine nur in den Streptococcus suis-Stämmen vom Serotyp 2 gezeigt.
Wie oben bemerkt, wäre auf Grund der grossen Zahl verschiedener Serotypen ein Serotyp unabhängiges und serologisch kreuzreaktives Antigen eine klar bevorzugte Basis für einen Impfstoff. Solch ein Antigen wurde für Streptococcus suis bislang nicht beschrieben.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass einige Streptococcus suis-Stämme ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 54 kD ausscheiden, das mit Thiol aktiviert, mit Cholesterin inhibiert werden kann und das haemolytische Aktivität zeigt.
Die haemolytischen Toxine teilen alle das Phänomen der Zerstörung von Säugetierzellen, indem sie die Membranintegrität und/oder Funktion zerstören. Diese Zerstörung ist vermutlich auf die Bildung einer Porenstruktur durch oligomere Formen des Toxins zurückzuführen, wenn sie einmal in die Zellmembran eingebaut sind.
Es wurde gezeigt, dass das haemolytische Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein durch Thiol aktivierbares Toxin ist. Thiol aktivierbare Proteine sind nur in reduziertem Zustand aktiv und verlieren ihre Aktivität, jedoch reversibel, nach einer Oxidation (Smyth, C. J. und Duncan, J. L., Bacterial Toxins and Cell Membranes, Jeljaszewicz, J. und Wadstrom, T. (Hersg.) London, Academic Press: 129-183 (1978).
Obwohl die Rolle der Thiolgruppe weitestgehend ungeklärt ist, wurde vorgeschlagen, dass sie ein wichtiger Teil eines Sequenzmotivs ist, das für die Bildung von Läsionen in Membranen von Bedeutung ist.
Der Mechanismus hinter der cytolytischen Wirkung einer bestimmten Gruppe von Haemolysinen schlägt die Bindung eines haemolytischen Polypeptids an Cholesterin in der Membran der Säugetierzelle vor. Ist das Protein einmal an der Membran gebunden, tritt es in die Lipiddoppelschicht ein. Dann werden oligomere Haemolysinkomplexe gebildet, von denen angenommen wird, dass sie Transmembranporen bilden.
Es wurde gezeigt, dass die haemolytische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu der Gruppe der Haemolysine gehört, die durch Cholesterin inhibiert werden können. Cholesterin scheint eine Schlüsselrolle bei der Bindung von Haemolysin an suszeptible Zellen zu spielen. Verschiedene Modelle wurden vorgeschlagen, in welchen Cholesterin die primäre Bindungsstelle des Toxins an die Zelle ist.
Freies Cholesterin ist ein potenter Inhibitor der zytolytischen Aktivität, was durch die Tatsache erklärt werden kann, das, falls die Sterol-Bindungsstelle von einem (freien) Cholesterin besetzt ist, dieses nicht länger an (membrangebundenes) Cholesterin binden kann. (Boulnois et al., Mol. Microbiol. 5: 2611- 2616 (1991)).
Das haemolytische Polypeptid der vorliegenden Erfindung hat ein geschätztes Molekulargewicht von ungefähr 54 kD. Dieses Molekulargewicht wurde gemäss standardisierter Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Bahn C in Fig. 1 zeigt das gereinigte Polypeptid, das von Markermolekülen (Bahnen A und D) flankiert wird.
Das haemolytische Polypeptid eines Streptococcus suis-Stammes, Stamm P1/7, wurde weiter durch die Bestimmung seiner N- terminalen Aminosäuresequenz charakterisiert. SEQ ID No. 1 stellt die N-terminale Sequenz des Polypeptids dar. Haemolytische Polypeptide können von einigen, jedoch nicht von allen Streptococcus suis-Stämmen isoliert werden. Es können leichte Modifikationen in der Nukleinsäuresequenz des Gens auftreten, das für das haemolytische Polypeptid in dem jeweiligen, das haemolytische Polypeptid produzierenden Streptococcus suis-Stamm codiert. Diese Modifikationen müssen keine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz des Polypeptids haben, im Fall, dass die Modifikation solcherart ist, dass das neue Triplett für die gleiche Aminosäure codiert. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn das G in dem Triplett CTG, das für Leucin codiert, durch ein C ersetzt wird, und dann ebenfalls für Leucin codiert. Falls jedoch das T durch ein C ersetzt worden wäre, würde das neu gebildete Triplett für ein Prolin anstatt eine Leucin codieren. Diese würde zu einer Änderung in der Aminosäuresequenz des haemolytischen Polypeptids führen.
Variationen in der Aminosäuresequenz können das Ergebnis eines Ersatzes einer oder mehrerer Aminosäuren durch funktionelle Äquivalente oder, seltener, durch die Einführung eines Stop- Codons oder im Fall von Deletionen/Insertionen in der Aminosäuresequenz die Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren sein. Der Ersatz durch funktionelle Äquivalente wird häufig beobachtet. Beispiele, die von Neurath et al. (The Proteins, Academic Press, New York (1979), Seite 14, Fig. 6) beschrieben werden, sind unter anderen der Ersatz der Aminosäure Alanin durch Serin; Ala/Ser oder Val/Ile, Asp/Glu usw. Ausser den Variationen, die zu einem Ersatz durch funktionell aquivalente Aminosäuren führen, können Variationen nachgewiesen werden, in denen eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, die kein funktionelles Äquivalent ist. Diese Art der Variation unterscheidet sich von dem Ersatz durch ein funk tionelles Äquivalent nur darin, dass ein Protein entsteht, das eine leichte Modifikation in seiner räumlichen Faltung aufweist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Impfstoff, der in der Lage ist, Schweine gegen eine Streptococcus suis-Infektion zu schützen, welcher das obengenannte haemolytische Polypeptid oder einen Teil davon umfasst, welches in der Lage ist, eine Immunantwort gegen das haemolytische Polypeptid von S. suis zu induzieren.
Solch ein Impfstoff kann zum Beispiel durch Verwendung eines synthetischen Polypeptids hergestellt werden, das das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mimt oder ein Teil davon, der in der Lage ist, eine Immunantwort gegen das haemolytische Polypeptid von S. suis zu induzieren.
Eine andere Möglichkeit einen solchen Impfstoff herzustellen ist die biochemische Reinigung des haemolytischen Polypeptids aus einer Bakterienkultur. Dies kann zum Beispiel durch Zentrifugation der Bakterien durchgeführt werden und die Verwendung von Gelfiltrationssäulen zur Trennung des haemolytischen Polypeptids von anderen Komponenten. Eine weitere Reinigung kann zum Beispiel durch selektive Präzipitation mit Ammoniumsulfat durchgeführt werden, gefolgt von einer Zentrifugation und Lösen des Pellets in einem geeigneten Puffer.
Solch ein Impfstoff kann zum Beispiel auch mittels molekularen Klonierungstechniken hergestellt werden. Mit dieser Technik kann die Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einen Teil davon codiert, das in der Lage ist, eine Immunantwort gegen das haemolytische Polypeptid von S. suis zu induzieren, in einen Expressionsvektor kloniert werden und anschliessend in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert werden. Das Expressionsprodukt kann dann in einem Impfstoff verwendet werden. Mögliche Expressionssysteme sind bakterielle Hefe-, Pilz-, Insekten- und Säugetierzellexpressionssysteme.
Eine andere Möglichkeit das Polypeptid herzustellen ist das Klonieren der genetischen Information des Polypeptids in einen geeigneten Virusvektor und die Verwendung der Wirtszelle des Virus zur Expression des Proteins. Solche Systeme sind zum Beispiel der Vaccinia-Virus-Vektor in Kombination mit geeigneten Säugetierzellen, oder der Baculovirus-Vektor mit Spodoptera frugiperda-Zellen. Unbearbeitete oder gereinigte Zell-Lysate, die das exprimierte Polypeptid umfassen, können dann als Impfstoffbasis verwendet werden.
Noch eine weitere Annäherung ist es Viren als sogenannte Lebende Rekombinante Trägerviren zu verwenden, die das Schwein als Wirtstier haben. Dieses LRC ist ein Virus, in das zusätzliche genetische Information kloniert wurde. Tiere, die mit diesem rekombinanten Virus infiziert wurden, werden eine immunogene Antwort nicht nur gegen die Immunogene des Vektorvirus bilden, sondern auch gegen die immunogenen Teile des (der) Polypeptid(e)s, dessen genetischer Code zusätzlich in das rekombinante Virus kloniert wurde.
Ein Virus, das besonders geeigent als Lebendes Rekombinantes Trägervirus zum Tragen genetischer Information von fremden schweinepathogenen Organismen ist, ist das Pseudorabies Virus. Dieses Virus wurde bereits zuvor erfolgreich als ein LRC zum Beispiel bei der kombinierten Pseudorabies-/Schweinecholera- Virus-Impfung verwendet.
In einer bevorzugten Form umfasst der Impfstoff der vorliegenden erfindung auch andere Streptococcus suis-Immunogene.
Es wurde festgestellt, dass Antiseren, die gegen das haemolytische Polypeptid des S. suis-Serotyps 2 gerichtet sind, mit Haemolysinen aller anderen Haemolysin produzierenden S. suis-Stämmen reagieren, unabhängig von ihrem Serotyp.
Dies wurde nicht für die obengenannten 44 kD-, 94 kD-, 110 und 136 kD-Steptococcus suis-Polypeptide nachgewiesen.
Dennoch hat ein Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung, der eines dieser oder jedes andere Steptococcus suis-Immunogen ent hält, eine noch bessere Wirkung. Diese bessere Wirkung kann zum Beispiel als Ergebnis eines synergistschen Effekts angesehen werden. Dies kann zu der Herstellung wirksamerer Impfstoffe mit sogar niedrigerer antigener Belastung führen.
In einer bevorzugteren Form umfasst der Impfstoff der vorliegenden Erfindung auch einen Träger, der an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung gekoppelt ist. Als Träger können andere Moleküle, wie das Napfschneckenhaemocyan, bovines Serumalbumin, aber auch komplexe Zuckermoleküle verwendet werden.
In einer noch bevorzugteren Form umfasst der Impfstoff der vorliegenden Erfindung ein kapsuläres Polysaccharid, das an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung gebunden ist.
Verfahren zur kovalenten Bindung von Polypeptiden an Kohlenhydrate wurden unter anderem von Dick, W. E. und Beurt, M., Contrib. Microbiol. Immunol. 10: 48-114 (1989) geschrieben.
Es ist klar, dass andere Träger-Typen oder andere Bindungsverfahren eines Polypeptids an ein Kohlenhydrat ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der erfindungsgemässe Impfstoff auch Antigene von anderen für Schweine pathogene Organismen und Viren. Solche Organismen und Viren sind zum Beispiel Actinobacillus pleuropneumoniae, Pseudorabies-Virus, Schweineinfluenzavirus, Schweineparvovirus, Übertragbares Gastroenteritisvirus, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida und Bordetella bronchiseptica.
Der Impfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung kann in einer bevorzugten Präsentation auch ein Adjuvans enthalten. Adjuvantien umfassen im allgemeinen Substanzen, die die Immunantwort des Wirts auf eine unspezifische Art und Weise verstärken. Eine Zahl verschiedener Adjuvantien sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele von Adjuvantien sind Freund'sches vollständiges und unvollständiges Adjuvans, Vitamin E, nicht-ionische Block- Polymere, Muramyldipeptide, Quill A®, Mineralöl, z. b. Bayol® oder Markol®, Pflanzenöl und Carbopol® (ein Homopolymer) oder Diluvac® Forte.
Der Impfstoff kann auch ein sogenanntes "Vehikel" umfassen. Ein Vehikel ist eine Verbindung, an die sich das Polypeptid anlagert. Häufig verwendete Vehikel sind Verbindungen wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Siliciumdioxid, Kaolin und Betonit.
Eine spezielle Form eines solchen Vehikels, in das das Antigen teilweise eingebettet ist ist das sogenannte ISCOM (EP 109 942, EP 180 564, EP 242 380).
Der Impfstoff kann ausserdem noch einen oder mehrere geeignete oberflächenaktive Verbindungen oder Emulgatoren enthalten, z. B. Span oder Tween.
Häufig wird der Impfstoff mit Stabilisatoren gemischt, um zum Beispiel die für einen Abbau empfindlichen Polypeptide vor einem Abbau zu schützen, um die Lagerfähigkeit des Impfstoffs zu verlängern oder um die Wirksamkeit der Gefriertrocknung zu verbessern. Geeignete Stabilisatoren sind u. a. SPGA (Bovarnik et al., J. Bacteriology 59: 509 (1950)), Kohlenhydrate wie z. B. Sorbit, Mannit, Trehalose, Stärke, Saccharose, Dextran oder Glukose, Proteine wie Albumin oder Casein oder Abbauprodukte davon, und Puffer wie Alkalimetallphosphate.
Der Impfstoff kann ausserdem in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel gelöst sein.
Es ist selbstverständlich, dass andere Wege der Adjuvanszugabe, der Zugabe von Vehikelverbindungen oder Lösungsmittel, Emulgatoren oder Stabilistoren zu einem Polypeptid ebenfalls durch die vorliegende Erfindung mit eingeschlossen werden.
In einer anderen Ausführungsform werden Antikörper, die monospezifisch mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einem antigenen Teil davon reagieren, zur Weitergabe passiver Immunität verwendet.
Monospezifische Antikörper sind Antikörper, die insbesondere in der Lage sind, mit dem 54 kD-Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon zu reagieren, ohne spezifisch mit anderen Streptococcus suis-Antigenen zu reagieren.
In der passiven Immunisierung können Antikörper gegen Krankheitserreger erfolgreich verwendet werden. Der Vorteil dieser Art der Behandlung ist, dass Antikörper in dem Augenblick zur Verfügung stehen, in dem die Infektion auftritt. Es wird daher keine Zeit durch Warten auf die Aktivierung des Immunsystems des Wirts und der Entwicklung eines ausreichend hohen Verteidigungslevels verloren. Besonders in Fällen, in denen eine Infektion bereits aufgetreten ist und die Krankheit fortschreitet, heilt die Verabreichung von Antikörpern das Tier sofort von Krankheitserregen und den von ihnen produzierten Toxinen. Ein Impfstoff, der in der Lage ist Schweine vor einer Infektion mit Streptococcus suis auf der Basis von Antikörpern gegen das haemolytische Polypeptid von S. suis zu schützen, ist daher in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Verfügung, der in der Lage ist, Säugetiere vor Streptococcus suis-Infektionen zu schützen, welches Mischen des Polypeptids gemäss der vorliegenden Erfindung mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger, Adjuvans oder Lösungsmittel umfasst.

BEISPIEL I

Bakterienstämme

S. suis Typ 2-Stämme P1/7 und 688/9 wurden von Dr. T. Alexander, University of Cambridge, U.K. zur Verfügung gestellt; die Typ 2-Stämme 4005, D282, 3921, 3977, 3889 und T15 wurden von Dr. U. Vecht, CDI-DLO, Lelystad, Niederlande, erhalten. Typ 7-Stämme 10681, 10727 und 14391 wurden von Dr. B. Nielsen, Intervet Scandinavia, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Die Refe renz-Stämme 1-22 wurden von Dr. J. Henrichsen, Statens Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark erhalten.
Stamm B19, Serotyp 1 ist ein jüngeres Feldisolat, das von dem "Gezondheidsdienst voor dieren, Ost-Nederland" in Deventer, Niederlande erhalten wurde.
Die Stämme NV92109, Serotyp 8, 22089KM Serotyp 9 und 220891 GV Serotyp 14 sind jüngere Feldisolate aus erkrankten Schweinen.

Bakterienkulturen

Die Bakterienstämme wurden auf Schafsblutagar ausgestrichen und 24 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Zur Bestimmung der Haemolysin- Produktion in den Chargen wurden wenige Kolonien in 100 ml Todd Hewitt-Medium (Difco) inokuliert und bis zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase (gewöhnlich 5-6 Stunden) bei 37ºC gezüchtet. Anschliessend wurden die Zellen durch 10-minutig Zentrifugation bei 10.000 · g entfernt und der Überstand bei -20ºC bis zum Gebrauch aufbewahrt.

Haemolysin-Inhibitionstest

Für die Titration der Haemolysin-Inhibitions-Titer der Seren wurden serielle Zweifach-Verdünnungen (75 ul) der Seren in Tieflochtitrierplatten unter Verwendung von 10 mM Tris- gepufferter Salzlösung pH 7,4 als Verdünnungsmittel hergestellt. Anschliessend wurden 75 ul einer Haemolysinlösung, die 2&sup5; haemolytische Einheiten enthielt, in jede Vertiefung gegeben. Nach einer 10 minütigen Inkubation bei 20ºC wurden 150 ul einer 2%- igen (gewaschenen) Pferdeerythrocytensuspension in jede Vertiefung gegeben und der Test wurde, wie oben für die Titration der haemolytischen Aktivität beschrieben, fortgesetzt. Der Titer wurde als die höchste Verdünnung definiert, die, minimal, in einer 50%-igen Inhibition der Haemolyse resultierte. Die Kapazität des spezifischen Schweineserums P399 gegenüber gereinigtem Haemolysin (vom S. suis Typ 2 stammend) zur Inhibition der haemolytischen Aktivität, die von verschiedenen (Serotyp-) Stämmen pro duziert wurde, wurde in einer einzelnen Vertiefung unter Verwendung von 75 ul 1 : 128 vorverdünnten Serum von P399 und 75 ul unverdünnten Kulturüberständen der verschiedenen Stämme bestimmt. Der Test wurde dann wie oben beschrieben vervollständigt. Prä- Immunserum, ebenfalls 1 : 128 verdünnt, wurde als Kontrolle verwendet (maximale Haemolyse). Eine Kreuzneutralisation trat auf, wenn das Serum P399 die Haemolyse zu mehr als 50% im Vergleich zum Prae-Immunserum, inhibierte. Proben mit einem Haemolysintiter 24 ergeben keine Ergebnisse in diesem Test, da die maximale Haemolyse (Prä-Immunserum) nicht den zweifachen Hintergrund erreicht (Prä-Serum P399).

BEISPIEL II

Reinigung des Haemolysins

250 ml einer Übernachtkultur des Stamms P1/7 wurde 6 Stunden unter anaeroben Bedingungen in 12 Liter Todd Hewitt-Medium bei 37ºC wachsen gelassen, wonach die Zellen durch eine kontinuierliche Flusszentrifugation entfernt wurden. Der Kulturüberstand wurde auf 4ºC abgekühlt, durch einen 0,8 um-Filter gegeben und dann auf PTCG 10.000 NMWL-Filtern konzentriert. Nach der Passage durch einen 0,2 um-Filter, wurden 1,0 ml-Portionen auf eine Superose-12 Gelfiltrationssäule gegeben (FPLC, Pharmacia) und mit 40 mM phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,2, die 0,5 M NaCl enthielt, eluiert. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS-PAGE, Immunblotting und im Haemolysintest analysiert. Die Spitze der haemolytischen Aktivität wurde mit den Fraktionen 35- 45 eluiert (Fig. 2).
Eine Analyse der verschiedenen Säulenfraktionen in der SDS-PAGE und mit Hilfe von Immuno-blotting zeigte, dass die haemolytische Aktivität mit einem einzelnen Antigen von ungefähr 54 kD comigrierte (Fig. 3). Die haemolytischen Fraktionen wurden gepoolt und geringfügige Kontaminationen wurden durch selektive Präzipitation mit 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 4ºC während 3 Stunden entfernt. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in 20 ml 40 mM phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2 resuspendiert. Diese endgültige Präparation erschien als einzelne Polypeptid-Spezies in der SDS-PAGE nach dem Färben mit Coomassie-Brilliantblau bei ungefähr 54 kD (Fig. 1) und besass eine spezifische Aktivität von ungefähr 0,7 · 10&sup6; haemolytischen Einheiten/mg nach der Reduktion mit β-Mercaptoethanol.

Protein-Bestimmung

Protein-Konzentrationen wurden mit Hilfe des Verfahrens von Lowry et al. (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)) unter Verwendung von bovinem Serumalbumin als Standard gemessen.

SDS-PAGE und Westernblotting

SDS-Page in 9%-igen Slab-Gelen und die Herstellung der Proben wurden im wesentlich wie von Laemmli (Laemmli, U.K.; Nature 227: 680-685 (1970)) beschrieben, durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Polypeptide mit Coomassie-Brilliantblau R250 gefärbt oder mittels Elektroblotting auf Immobilon PVDF-Membranen aufgebracht. Die Blots wurden mit polyklonalem Hasenserum R2089 oder polyklonalem Mausserum M189 (siehe im Abschnitt "Antiseren") als Sonden behandelt. Nach dem Waschen wurden die gebundenen Antikörper unter Verwendung von Meerettich-Peroxidase- Ziegen-anti-Hase- beziehungsweise Ziegen-anti-Maus-Konjugat und Diaminobenzidin als Substrat dargestellt.

Haemolytische Aktivität nach verschiedenen Behandlungen

Für alle Behandlungen wurden 0,5 ml-Portionen gereinigtes Haemolysin in 40 mM mit Phopshat gepufferter Salzlösung pH 7,2 mit einem Titer von 2&sup7; verwendet. Die Wirkung der unterschiedlichen Temperaturen wurde in dem Haemolysin-Assay nach der Inkubation des Haemolysins bei der jeweiligen Temperatur von beispielsweise -20ºC, 4ºC, 20ºC, 37ºC und 100ºC gemessen. Um die Wirkung einer Proteinase K-Behandlung zu testen, wurden 5 ul einer konzentrierten Enzymlösung (2 mg/ml) zu 0,5 ml einer Haemolysinlösung gegeben und 10 Minuten bei 20ºC inkubiert. Anschliessend wurde die restliche haemolytische Aktivität in dem Haemolysin-Assay gemessen.
Um die Wirkung der Reduktion durch β-Mercaptoethanol zu testen, wurden 5 ul einer 10%-igen (V/V) β-Mercaptoethanollösung zu 0,5 ml einer Haemolysinlösung gegeben und 10 Minuten bei 20ºC inkubiert, wonach die Aktivität in dem Haemolysin-Assay gemessen wurde.
Um die Wirkung der Oxidation durch H&sub2;O&sub2; zu testen, wurden 5 ul einer 10%-igen H&sub2;O&sub2;-Lösung zu 0,5 ml einer Haemolysinlösung gegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 20ºC. Anschliessend wurde jegliche, verbliebene Aktivität in dem Haemolysin-Assay gemessen.
Die Wirkung der Alkylierung mit einer beliebigen Thiolgruppe mit TLCK (N-A-p-Tosyl-L-Lysin-Chlormethylketon, Sigma) wurde durch Zugabe von 5 ul einer 1%-igen (G/V) TLCK-Lösung zu 0,5 ml einer Haemolysin-Lösung gegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 20ºC. Anschliessend wurde jegliche, verbliebene Aktivität in dem Haemolysin-Assay gemessen.
Die Wirkung von Cholesterin wurde durch Zugabe von 10 ul 5%-igem Cholesterin (in 10% Ethanol) zu 5 ml einer Haemolysin-Lösung getestet, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 20ºC, wonach jegliche, verbliebene Aktivität in dem Haemolysin-Assay gemessen wurde.
Die Reversibilität durch Reduktion einiger Behandlungen wurde durch Zugabe von überschüssigem β-Mercaptoethanol (2% Endkonzentration) zu einem Teil der Reaktionsmischungen getestet, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 20ºC und Titration der haemolytischen Aktivität.
Die Wirkungen der verschiedenen Behandlungen der haemolytischen Aktivität sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Haemolysin hitzelabil und empfindlich gegenüber einem Proteinase K-Verdau, Oxidation durch H&sub2;O&sub2; und Alkylierung mit TLCK ist. Darüberhinaus wird die haemolytische Aktivität durch Cholesterin inhibiert. Nach Inkubation mit β-Mercaptoethanol wurde eine erhöhte Aktivität festgestellt und und die Zugabe von überschüssigem β-Mercaptoethanol zu der mit H&sub2;O&sub2; oxidierten Präparation resultierte in einer Wiederherstellung der haemolytischen Aktivität. Die Zugabe von überschüssigem β-Mercaptoethanol zu der mit TLCK behandelten Präparation resultierte in einer teilweisen Wiederherstellung der haemolytischen Aktivität. Diese teilweise Wiederherstellung kann durch die Anwesenheit oxidierter Thiol- Gruppen erklärt werden, die nicht mit TLCK reagiert haben. Die Wirkungen der Temperatur und Cholesterin konnte nicht durch Zugabe von β-Mercaptoethanol aufgehoben werden.
Doppelproben, in denen das jeweilige Reagenz oder das Haemolysin weggelassen wurde, zeigten keine Wirkung der jeweiligen Methode auf die haemolytische Aktivität beziehungsweise Wirkungen der Reagenzien auf Erythrocyten.
Empfindlichkeit verschiedener Erythrocytenspecies auf Haemolysin Die Empfindlichkeit verschiedener Erythrocytenspecies, z. B. menschliche, bovine, Truthahn-, Taube-, Maus-, Huhn, Meerschweinchen- Hase-, Hund- und Schweinerythrocyten wurde unter Verwendung einer reduzierten (0,1% β-Mercaptoethanol) Präparation gereinigtem Haemolysin mit einem Titer von 2&sup8; getestet. Die Tests wurden im wesentlich wie unter "Titration haemolytischer Aktivität" beschrieben, durchgeführt. Alle Erythrocyten schienen ungefähr gleich empfindlich gegenüber Haemolysin zu sein. Die Titer variierten von 2&sup7; (Maus, Katze und Truthahn) bis 210 (Mensch).

N-terminale Aminosäuresequenz

Die ersten 16 Aminosäurereste des gereinigten Haemolysins, das von dem Stamm P1/7 erhalten wurde, wurde durch automatisierten Edman-Abbau, wie in SEQ ID NO. 1: dargestellt, erhalten.

Vorhandensein von Haemolysin-Molekülen in verschiedenen S. suis- Stämmen

Alle zur Verfügung stehenden Stämme, die Serotyp-Stämme 1-22 einschliesend, wurde in Todd-Hewitt-Medium bis zum Ende der exponentiellen Wachstumsphase (5-6 Stunden) gezüchtet, wonach die Zellen durch Zentrifugation entfernt wurden. Die Anwesenheit von Haemolysinmolekülen in dem Kulturüberstand wurde in dem Haemolysin-Assay und durch Immunblotting bestimmt. Viele, aber nicht alle Stämme schienen verschiedene Mengen an haemolytischer Aktivität in dem Kulturüberstand zu produzieren (Tabelle 2).
Alle haemolytischen Proben, einschliesslich Proben mit niedriger Aktivität, schienen durch Cholesterin und H&sub2;O&sub2; inhibiert zu werden. Ausserdem resultierte die Zugabe von überschüssigem β- Mercaptoethanol zu den mit H&sub2;O&sub2; oxidierten Proben in einer vollständigen Wiederherstellung der haemolytischen Aktivität. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die meisten getesteten Stämme haemolytische Aktivität in dem Kulturüberstand zu produzieren scheinen, die immunologisch und biochemisch mit Haemolysin verwandt zu sein scheint und dass kein Hinweis auf andere, nicht verwandte Haemolysine festgestellt wurden.

BEISPIEL III

Impfstoffe

Vier Impfstoffe, basierend auf gereinigtem Haemolysin, konzentriertem Kulturüberstand oder gepoolte Fraktionen 19-31 aus der Superose-12-Säule sowie PLACEBO-Impfstoff wurden vom Stamm P1/7 hergestellt.
Zum Vergleich wurde ein Impfstoff basierend auf gereinigtem EF hergestellt.
Ein Impfstoff, basierend auf konzentriertenm Kulturüberstand, wurde aus dem Stamm B10 hergestellt.
Die Impfstoffe wurden wie folgt hergestellt:
Gereinigtes Haemolysin (40 ug Protein/ml) wurde 1 : 1 mit Diluvac Forte®-Adjuvans gemischt, bis eine homogene Mikroemulsion erhalten wurde. Dieser Impfstoff wurde VAC-SLY genannt.
Für den Impfstoff, der konzentrierten Kulturüberstand enthielt, wurde ein Teil des PTCG-Konzentrats (1,9 mg Protein/ml) 1 : 1 mit Diluvac Forte®-Adjuvans gemischt, bis eine homogene Suspension erhalten wurde. Dieser Impfstoff wurde als VAC-CCS bezeichnet. Der dritte Impfstoff wurde durch Mischen (1 : 1) der gepoolten und konzentrierten Superose-12-Säulenfraktionen 19-31 (2 mg Protein/ml enthaltend) hergestellt, bis eine homogene Suspension erhalten wurde. Die Säulenfraktionen 19-31 enthielten den grössten Teil der vom S. suis-Stamm P1/7 produzierten extrazellulären Proteine, war jedoch im wesentliche frei von Haemolysin. Dieser Impfstoff wurde VAC-SCF genannt.
Ein vierter Impfstoff wurde durch Filtration des Kulturüberstands durch einen 0,2 um (u)-Filter hergestellt, gefolgt von einer 16-stündigen Präzipitation mit 60%-igem, gesättigtem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 0ºC.
Nach der Zentrifugation wurde das Pellet in PBS resuspendiert, um ein Präparat zu ergeben, dass im Vergleich zu dem Kulturüberstand etwa 100-fach konzentrierter ist.
PLACEBO-Impfstoff wurde wie oben beschrieben hergestellt, ausser, dass die Antigen-Lösung durch 40 mM gepufferte Salzlösung pH 7,2 ersetzt wurde.
Stamm B10 wurde verwendet, um einen Impfstoff basierend auf einer 16-stündigen Präzipitation mit 60%-igem, gesättigtem (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei 0ºC, wie oben beschrieben, herzustellen.
Der EF-Impfstoff wurde nach hydrophober Interaktionschromatographie (Phenyl-Sepharose-Phast-Fluss-Säule, hoch substituiert) des Kulturüberstands des P1/7-Stammes unter Verwendung eines abfallenden Gradienten von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; hergestellt. Die gereinigte EF- Endpräparation (nach Dialyse und Verdünnung) enthielt ungefähr 150 ug EF/ml. Basierend auf SDS-PAGE und Coomassieblau-Färbung hatte die Präparation eine Reinheit von 95%.

Antiserum

Spezifisches polyklonales Schweineserum (P399) gegen gereinigtes Haemolysin wurde wie folgt erhalten. Ein vier Wochen altes Schwein wurde intramuskulär (Hals) mit 2 ml des Impfstoffs VAC- SLY immunisiert. Zwei Wochen nach dem Priming wurde das Schwein unter Verwendung der gleichen (Menge) Impfstoff und des gleichen Impfweges zum Verstärken nochmals geimpft (booster). Zwei Wochen nach der Verstärkungsimpfung wurden die Schweine ausgeblutet und das Serum bis zu seiner Verwendung bei -20ºC gelagert.

Mausschutztest

Vier Wochen alte Balb-c-Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt und subkutan mit 0,5 ml VAC-CCS, VAC-SCF, VAC-SLY oder mit dem PLACEBO-Impfstoff geimpft. Zwei Wochen nach dem Priming wurden die Mäuse unter Verwendung der gleichen Impfstoffe und des gleichen Impfweges zum Verstärken nochmals geimpft. Zwei Wochen nach der Verstärkungsimpfung wurden ein Challenge der Mäuse durch intraperotoneale Verabreichung (0,5 ml) des Stammes P1/7 in Todd Hewitt-Medium, das 4 · 10&sup9; PbE/ml enthielt, durchgeführt. Nach dem Challenge wurde während 7 Tagen die Mortalität registriert. Ergebnisse
Nach dem Challenge starben die mit PLACEBO geimpften Mäuse innerhalb von 3 Tagen, wohingegen Mäuse, die VAC-CCS und VAC-SLY geimpft wurden, vollständig geschützt zu sein schienen (Tabelle 3). VAC-SCF induzierte nur einen teilweisen Schutz. Dieser Impfstoff enthielt die meisten der extrazellulär produzierten Antigene des Stamms P1/7, war jedoch im wesentlichen frei von Haemolysin.

Schlussfolgerung

Wir schlossen daraus, dass ein Impfstoff, der gereinigtes Haemolysin gemäss der vorliegenden Erfindung enthält, in Mäusen schützend wirkt. Dies zeigt, dass das Haemolysin ein Virulenzfaktor ist und dass die Neutralisation dieses einzelnen Virulenzfaktors ausreichend ist, Mäuse gegen die schädliche Wirkungen einer S. suis Typ 2-Infektion zu schützen.

Maus-heterologe Schutzexperimente

Versuchstiere

Es wurden Balb/c-Mäuse (vier Wochen alt), die von Iffca Credo erhalten wurden, verwendet.

Versuchsaufbau

Gruppen von 30 Mäusen (2 · 15) wurden geimpft, einmal subkutan mit 0,4 ml der jeweiligen Impfstoffe oder sie blieben ungeimpft (eine Gruppe von 30 Mäusen), wie in Tabelle 6 dargestellt. Vier Wochen nach der Impfung wurden die Mäuse intraperitoneal einem Challenge mit 0,5 ml einer 6 Stunden-Kultur des Stammes B10 (Typ 1) und die andere Hälfte mit dem Stamm P1/7 (Typ 2) unterzogen. Die Mortalität wurde während 7 Tagen registriert. Stamm B10 war für Mäuse weniger pathogen (ungefähr 20% Mortalität) als Stamm P1/7 (100% Mortalität). Daher wurde die Anzahl der erkrankten Mäuse in der B10-Gruppe ebenfalls registriert. Kurz vor dem Challenge wurden Blutproben entnommen und die gepoolten Gruppenseren in einem Immunblot getestet.

Ergebnisse

In der Haemolysin-Testkultur des Stammes B10 (Serotyp 1) hatte der Überstand eine haemolytische Aktivität von 29,5, wohingegen der Kulturüberstand des Stammes P1/7 (Serotyp 2) eine Aktivität von 2&sup7; hatte. Der Stamm B10 produzierte daher 5 · mehr haemolytische Aktivität als der Stamm P1/7.
Basierend auf SDS-PAGE und Coomassieblau-Färbung schien es, als ob beide konzentrierte Kulturüberstände der Stämme B10 und P1/7 ein 54 kD-Protein (SLY) enthielten und dass der konzentrierte Kulturüberstand des Stammes B10 mehr von dem 54 kD-Protein enthielt, was in Übereinstimmung mit der höheren Aktivität steht. Gereinigtes EF enthielt kein 54 kD-Protein.
Nach dem Challenge stellte sich heraus, dass beide die Kulturüberstände enthaltenden Impfstoffe sowohl homologen als auch heterologen Schutz in Mäusen induzierten (siehe Tabelle 6).
Wenn gepoolte Gruppenseren in einem Immunblot unter Verwendung des Kulturüberstands des Stammes P1/7 oder B10 als Antigen getestet wurden, schien es, dass beide Impfstoffe aus Kulturüberständen anti-SLY-Antiköper induziert hatten (Tabelle 6). Mit dem anti-B10-Kulturüberstand wurde eine stärkere Reaktion festgestellt, als mit dem anti-P1/7-Kulturüberstand. Wenn sie heterolog in einem Immunblot getestet wurden (anti-B10-Kulturüberstand gegen P1/7-Kulturüberstand und anti-P1/7-Kulturüberstand gegen B10-Kulturüberstand), war das 54 kD-Protein das hauptsächliche oder einzige reaktionsfähige Antigen.
Mäuse, die mit gereinigtem EF geimpft wurden, obwohl in hohen Dosen verabreicht, schienen gegenüber einem heterologen oder homologen Challenge nicht geschützt zu sein, obwohl Antikörper induziert wurden Tabelle 6).

Schlussfolgerung:

Beide Impfstoffe aus Kulturüberständen induzierten sowohl homologen als auch heterologen Schutz in Mäusen. Die Tatsache, dass das 54 kD-Antigen das einzige oder hauptsächliche reaktionsfähige Antigen, wenn heterolog getestet, in einem Immunblot ist, zeigt klar, dass SLY ein Kreuzschutzfaktor in Mäusen ist.

Schutzexperimente in Schweinen

VAC-SLY, VAC-SCF und PLACEBO wurden wie oben beschrieben hergestellt.
VAC-SLY enthielt 20 ug/ml gereingtes Haemolysin in Diluvac Forte ®-Adjuvans. VAC-SCF (2 mg Protein/ml) enthielt hauptsächlich extrazellulär produzierte Proteine von Streptococcus suis, war jedoch im wesentlichen frei von Haemolysin.
Neun 4 Wochen alte Schweine wurden in Gruppen von jeweils 3 Schweinen aufgeteilt und mit 2 ml VAC-SLY, VAC-SCF oder PLACEBO geimpft (intramuskulär, Hals). Zwei Wochen nach dem Priming wurden die Schweine nochmals verstärkend unter Verwendung der gleichen Impfstoffe und des gleichen Impfweges geimpft (Booster) Zwei Wochen nach der Verstärkungsimpfung wurde intravenös ein Challenge (0,5 ml) durchgeführt, unter Verwendung einer 6 Stunden-Kultur des Stammes P1/7 in Todd Hewitt-Medium, das 4 · 10&sup9; PbE/ml (4) enthielt. Kurz vor dem Priming und Challenge wurden Blutproben entnommen und die Seren bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert.

Rückgewinnung der Bakterien

Bei der Sektion wurden Abstriche vom Gehirn, der Lunge und dem Fussknochen genommen, wenn möglich von den am meisten befallenen Bereichen. Bakterienwachstum wurde mit 0, 1, 2, 3 oder 4 bewertet, je nach Ausmass des Wachstums.

Ergebnisse

Nach dem Challenge entwickelten die PLACEBO geimpften Schweine schwere klinische Symptome, gekennzeichent durch Hinken, das verschiedene Gelenke einbezog, ein depressives Erscheinungsbild und hohe Temperaturen. Zwei der drei PLACEBO geimpften Schweine entwickelten neurologische Zeichen und waren so stark beeinträchtigt, dass sie getötet werden mussten. Die mit VAC-SCF geimpften Schweine zeigten die gleichen klinischen Zeichen wie die Kontrollen, jedoch in geringerem Ausmass. Ein Schwein aus dieser Gruppe entwickelte neurologische Zeichen und musste getötet werden. Die mit VAC-SLY-geimpften Schweine waren am wenigsten betroffen. Die Schweine dieser Gruppe zeigten nur milde Symptome, die im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen rascher abklangen. Die klinischen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Bei der Sektion schienen die mit PLACEBO geimpften Tiere starke Polyarthritis zu haben, die die meisten Gelenke befallen hatte (Tabelle 5), Die mit VAC-SCF geimpften Schweine hatten ebenfalls Polyarthritis, jedoch in geringerem Aussmass, wohingegen die meisten Gelenke der mit VAC-SLY geimpften Schweine normal erschienen (Tabelle 5).
Streptococcus suis wurde in unterschiedlichen Mengen und aus unterschiedlichen Geweben aus zweien der drei mit PLACEBO geimpften Schweine isoliert und aus allen drei mit VAC-SCF geimpften Schweinen, jedoch nicht aus den mit VAC-SLY geimpften Schweinen (die Zahlen unter "Gesamtbewertung der Rückisolierung" stellen die relative Mengen der Bakterien dar, die von der Gesamtzahl der Tiere in jeder Gruppe rückgewonnen wurde) (Tabelle 5). Die histologische Untersuchung der Hirnproben (Tabelle 5) zeigte, dass zwei der drei mit VAC-SCF und zwei der mit PLACEBO geimpften Schweine Meningitis hatten.

Schlussfolgerung

Obwohl die mit VAC-SLY geimpften Schweine während weniger Tage klinische Symptome zeigten, waren diese Symptome weniger ernst und von kürzerer Dauer als im Vergleich zu VAC-SCF- oder PLACEBO geimpften Schweinen. Bei der Sektion war die fibröse Arthritis weniger ernst und wurde weniger häufig in den mit VAC- SLY geimpften Schweinen beobachtet, als in den mit VAC-SCF oder mit PLACEBO geimpften Schweinen. Ausserdem hatten zwei mit SCF und zwei mit PLACEBO geimpfte Schweine Meningitis, wohingegen keines der mit VAC-SLY geimpften Schweine Meningitis zeigte. Darüberhinaus erschienen die Lungen, Gelenke und Gehirne der VAC-SLY-geimpften Schweine steril, wohingegen aus den meisten dieser Organe der beiden anderen Gruppen Streptococcus suis Typ 2 isoliert wurde. In einem Immunblot reagierten Seren (am Tag des Challenge entnommen) der mit VAC-SLY geimpften Schweine mit einer einzelnen Antigenbande bei 54 kD in dem gesamten Kultur überstand, was bestätigte, dass das Haemolysin immunogen und die Haemolysinpräparation hoch gereinigt war.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Streptococcus suis-Haemolysin ein wichtiger Faktor ist und dass die Neutralisation dieses einzelnen Faktors ausreichend ist, um Schweine signifikant gegen die zerstörerischen Wirkungen einer Streptococcus suis-Infektion zu schützen und die Bakterien aus den verschiedenen Organen und Geweben zu beseitigen. Tabelle 1 Aktivität des gereinigten Haemolysins nach verschiedenen Behandlungen
NB = nicht bestimmt Tabelle 2 Vorkommen von Haemolysin-ähnlichen Strukturen im Kulturüberstanden verschiedener S. suis-Stämme Tabelle 2 (Fortsetzung)
a Für die Typ 2 Stämme sind die Phänotypen wie von Vecht et al. beschrieben, dargestellt.
b Titration der haemolytischen Aktivität, Inhibition der haemolytischen Aktivität durch 0,1% Cholesterin, reversible Inaktivierung der haemolytischen Aktivität durch Inkubation mit H&sub2;O&sub2; und β-Mercaptoethanol, Inhibition der haemolytischen Aktivität durch spezifisches Schweineserum P399 und Immunblotting unter Verwendung spezifischen Mäuseserums M189 wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt.
c# = Test durchgeführt, jedoch ohne Ergebnis, da die haemolytische Aktivität zu niedrig war (siehe Text).
d NB = nicht bestimmt

Tabelle 3 Wirkung der Immunisierung mit verschiedenen Impfstoffen auf Grund der Überlebensrate von Mäusen, die einem Challenge intraperitoneal mit dem S. suis-Stamm P1/7 unterzogen wurden

Impfstoff Überlebensrate
VAC-CCSa 9/9
VAC-SCFb 6/10
VAC-SLYc 10/10
Placebo 0/10
a Impfstoff, konzentrierten Kulturüberstand enthaltend
b Impfstoff, Superose-Säulenfraktionen 19-31 enthaltend
C Impfstoff, gereinigtes Suilysin enthaltend Tabelle 4 Die zusammenfassende Tabelle zeigt die gesamten numerischen klinischen Bewertungen am Challenge-Tag und an den Tagen 1-7 post-Challenge
a) Die Bewertungen am Tag 1-4 stellen das Mittel der beiden Untersuchungen (morgens und abends) dar. Tabelle 5 Die zusammenfassende Tabelle zeigt die klinische Zeichen am Sektionstag, makroskopische Beobachtungen beim Sezieren, Rückisolierungsdaten und Anzahl der Meningitisfälle Tabelle 6 Ergebnisse des heterologen Mausschutzexperiments Gruppen von 15 Mäusen werden 1x subkutan mit 0,4 ml verschiedener Impfstoffe in GNE- Adjuvans geimpft. 4 Wochen nach der Impfung werden die Mäuse intraperitoneal mit 0,5 ml einer Sechs-Stunden-Kultur des Stammes P1/7 oder des Stammes B10 "gechallenged", 3 · 10&sup9; Bakterien/ml enthaltend. Blutproben wurden kurz vor dem Challenge entnommen und gepoolte Gruppenseren wurden in einem Immunblot auf anti-SLY oder anti-EF-Antikörper unter Verwendung des Kulturüberstands der Stämme P1/7 oder 810 getestet.
a (Anzahl toter Mäuse · 3) + (Anzahl erkrankter Mäuse · 1)

Legende zu den Figuren

Fig. 1: SDS-PAGE von Markern mit niedrigem Molekulargewicht (Bahn A), konzentriertem Kulturüberstand (Bahn B), gereinigtem Streptococcus suis-Haemolysin (Bahn C) und Markern mit hohem Molekulargewicht. Das Gel wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Die Numerierung auf der rechten und der linken Seite bezieht sich auf das Molekulargewicht der Marker-Proteine.
Fig. 2: Elutionsprofil der Superose-12-Chromatographie von konzentriertem Kulturüberstand des S. suis Typ 2-Stamms P1/7. Durchgezogene Linie: Absorption bei 280 nm; getrichelte Linie: Haemolysintiter
Fig. 3: Western Blot von Marker-Proteinen (Bahn A), konzentrierter Kulturüberstand des Stamms P1/7 (Bahn B) und von Superose-12- Säulenfraktionen (Bahnen C-N). Bahn C: Fraktion 15, Bahn D: Fraktion 18, Bahn E: Fraktion 20, Bahn F: Fraktion 23, Bahn G: Fraktion 26, Bahn H: Fraktion 28, Bahn I: Fraktion 30, Bahn J: Fraktion 32, Bahn K: Fraktion 34, Bahn L: Fraktion 38, Bahn M: Fraktion 38, Bahn N: Fraktion 40.
Marker-Proteine (Bahn A) wurden mit Coomassie Brilliantblau gefärbt. S. suis-Antigene (Bahnen B-N) wurden mit Hasenserum markiert und dann unter Verwendung von Ziegen-anti-Hasen-Konjugat und Diaminobenzidin als Substrat gefärbt. Die molekularen Gewichte der Marker-Proteine sind links aufgeführt.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:
(A) NAME: AKZO N. V. (B) STREET: Velperweg 76 (C) CITY: Arnhem (E) COUNTRY: The Netherlands (F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM (G) TELEPHONE: 04120-66381 (H) TELEFAX: 04120-50592 (I) TELEX: 37503 akpha nl
(ii) TITLE OF INVENTION: Vaccine against Streptococcus suis infection
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1
(iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 16 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: protein
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(v) FRAGMENT TYPE: N-terminal
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Streptococcus suis (B) STRAIN: P1/7 (C) INDIVIDUAL ISOLATE: -
(vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: -
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

Claims

1. Polypeptid von Steptococcus suis mit einem Molekulargewicht von ungefähr 54 kD, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid von S. suis ausgeschieden wird und durch Thiol aktiviert und durch Cholsterin inhibiert werden kann und dass es in seiner nativen Form hämolytische Aktivität besitzt, oder ein Teil des genannten Polypeptids, welches eine Immunantwort gegen das genannte Polypeptid induzieren kann.

2. Polypeptid gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Polypeptid eine N-terminale Aminosäuresequenz bestehend aus Asp-Ser-Lys-Gln-asp-Ile-Asn-Gln-Tyr-Phe-Gln-Ser-Leu- Thr-Tyr-Glu oder einen Teil des genannten Polypeptids umfasst.

3. Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen Streptococcus suis-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Polypeptid gemäss Ansprüchen 1-2 umfasst.

4. Impfstoff gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich ein anderes Streptococcus suis-Immunogen umfasst.

5. Impfstoff gemäss Ansprüchen 3.4, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid an einen Träger gekuppelt ist.

6. Impfstoff gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein kapsuläres Polysaccharid ist.

7. Impfstoff gemäss Ansprüchen 3-6, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Adjuvans umfasst.

8. Impfstoff gemäss Ansprüchen 3-7, dadurch gekennzeichnet, dass er ein zusätzliches Immunogen umfasst, welches von einem für Schweine pathogenen Virus oder Mikroorganismus stammt.

9. Impfstoff gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunogen ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Actinobacillus pleuropneumoniae, Pseudorabies-Virus, Schweine- Influenzavirus, Schweine-Parvovirus, übertragbares Gastrenteritisvirus, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusipathiae, Pasteurella multocida und Bordetella bronchiseptica.

10. Antikörper, welche monospezifisch mit einem Polypeptid gemäss Ansprüchen 1-2 reagieren.

11. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutz von Säugetieren gegen Streptococcus suis-Infektion, welches Mischen des Polypeptids gemäss Ansprüchen 1-2 mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Adjuvans oder Verdünnungsmittel umfasst.