DE69331437T2

DE69331437T2 - Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff

Info

Publication number: DE69331437T2
Application number: DE69331437T
Authority: DE
Inventors: B. Dale
Original assignee: University of Tennessee Research Foundation
Current assignee: University of Tennessee Research Foundation
Priority date: 1992-09-16
Filing date: 1993-09-15
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2013-09-16
Also published as: AU5128593A; US20020176863A1; CA2123580A1; DK0618813T3; CA2123580C; EP0618813A4; EP0618813B1; WO1994006465A1; US6419932B1; US20070053937A1; IL107026A0; US7074416B2; ATE211654T1; DE69331437D1; EP0618813A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf das Gebiet rekombinanter Impfstoffe. Die Impfstoffe sind darauf gerichtet, Streptokokken-Infektionen der Gruppe A vorzubeugen, die ansonsten zu rheumatischem Fieber führen können.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Akutes rheumatisches Fieber (ARF) ist die Hauptursache von Herzkrankheiten bei Kindern weltweit. Die Krankheit steigt in Entwicklungsländern stark an, in denen die Verbreitungsraten rheumatischer Herzkrankheiten bei 35-40 pro tausend Individuen liegen können. Nach einer Schätzung sind annähernd 6 Millionen Kinder im schulpflichtigen Alter in Indien betroffen. Obwohl die Häufigkeit von ARF in den Vereinigten Staaten und anderen westlichen Ländern während der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts merklich zurückgegangen ist, hat ein außergewöhnliches Aufleben der Krankheit in den Vereinigten Staaten stattgefunden.
Streptokokken sind eine Gruppe von Bakterien mit der Fähigkeit, in Ketten zu wachsen. Viele Arten sind Teil der normalen bakteriellen Flora bei Menschen und sind nicht besonders schädlich. Eine bestimmte Untergruppe von Streptokokken jedoch, genannt Gruppe A und vertreten durch Streptococcus pyogenes, ist ein Humanpathogen. Zwischen 20 und 30 Mio. Fälle von Gruppe A-Streptokokken-Infektionen treten alleine in den Vereinigten Staaten jedes Jahr auf. Diese Fälle umfassen Infektionen der Haut und des Rachens, Formen von Lungenentzündung und eine kürzlich identifizierte Krankheit, die dem toxischen Schock ähnelt. Die häufigste Infektion ist die akute Streptokokken-Pharyngitis oder Halsentzündung, die überwiegend bei Kindern im schulpflichtigen Alter auftritt. Die Halsentzündung ist ein wichtiges weltweites Gesundheitsproblem, wenn sie nur nach Zeitverlust von Schule und Arbeit und die Menge an damit in Beziehung stehenden Arzthonoraren beurteilt wird.
Der Tribut der Halsentzündung ist jedoch viel größer. Bei 4% der Pharyngitis-Fälle, die nicht oder unwirksam behandelt werden, führt die Streptokokken-Infektion zu ARF. Gegenwärtige Bestrebungen, um ARF vorzubeugen, basieren auf der Behandlung der Pharyngitis mit Antibiotika. Während eines kürzlichen Ausbruchs von ARF in Utah haben nur ein Viertel der Patienten medizinische Versorgung vor dem Entstehen von Symptomen in Anspruch genommen und nur ein Drittel erinnerte sich an kürzliche Halsschmerzen. Die Entdeckung, daß ARF einer subklinischen Infektion in so einem hohen Prozentsatz von Individuen folgen kann und die Tatsache, daß ein Zugang zu medizinischer Versorgung in Entwicklungsländern nicht weitgehend zur Verfügung steht, dient dazu, den Bedarf für einen sicheren und wirksamen Impfstoff gegen Gruppe A-Streptokokken zu unterstreichen.
Der ursächliche Zusammenhang zwischen Streptokokken-Pharyngitis und ARF wurde vor über 50 Jahren festgestellt, und dennoch ist der Mechanismus der Pathogenese der Krankheit ungeklärt geblieben. Es wird weitgehend angenommen, daß ARF eine Autoimmunkrankheit ist und daß die Infektion im empfänglichen Wirt eine Immunantwort auslöst, die zu entzündlichen und manchmal zerstörerischen Veränderungen in den Zielgeweben führt. Es wurde gezeigt, daß Streptokokken Antigene enthalten, die immunologisch mit Wirtsgeweben kreuzreagieren (14, 20, 24, 26, 27, 35, 39, 40, 41, 44, 55) und es ist gezeigt worden, daß Herzkreuzreagierende Antikörper von Patienten mit rheumatischem Fieber mit Streptokokken reagieren (15). Es wurde jedoch auch gezeigt, daß Seren von Patienten mit unkomplizierter Pharyngitis auch Herzkreuzreagierende Antikörper (57) enthalten können, und diese Patienten trotzdem keine klinischen Anzeichen von Karditis entwickeln. Bis die Signifikanz von Gewebe-kreuzreagierenden Antikörpern in der Pathogenese von ARF besser verstanden ist, besteht ein Bedürfnis, möglicherweise schädliche Epitope von Impfstoffzusammensetzungen auszuschließen.
Das Oberflächen-M-Protein von Gruppe A-Streptokokken ist der Hauptvirulenzfaktor und das schützende Antigen dieser Organismen (45). Gruppe A-Streptokokken haben ein System entwickelt, um einige der antimikrobiellen Abwehrkräfte eines menschlichen Wirts zu vermeiden. Stämme von Streptokokken, die reich an M-Protein sind, entgehen der Phagozytose durch PMNs und vermehren sich im nicht-immunen Blut (45). Es ist jedoch eine Resistenz gegenüber einer Infektion mit diesen Bakterien möglich, wenn der Wirtskörper opsonisierende Antikörper, gerichtet gegen das M-Protein, erzeugen kann. Solche Antikörper werden die schützende Fähigkeit des M-Proteins neutralisieren und ermöglichen, daß die Streptokokken durch Phagozyten aufgenommen und zerstört werden. Es wird auch angenommen, daß die Entwicklung von sekretorischer oder mukosaler Immunität beim Vorbeugen von Streptokokken-Infektionen eine wichtige Rolle spielt.
Ein Haupthindernis der wirksamen Impfstoffentwicklung ist die enorme Anzahl an M- Protein-Serotypen (derzeit über 80) (33) gewesen. Labortests legen nahe, daß Antikörper gegen einen Serotyp keinen Schutz gegen andere bieten. Die Immunität scheint also typ- oder serospezifisch zu sein und optimale Impfstoffe würden es erfordern, daß die meisten der Serotypen vertreten sind. Es gibt Hinweise, daß nicht alle Serotypen der Gruppe A- Streptokokken dasselbe Potential haben, um akutes rheumatisches Fieber bei empfänglichen Individuen (12) auszulösen. Das Konzept von "rheumatogenen" und "nicht-rheumatogenen" Organismen wird durch zahlreiche Beobachtungsstudien über viele Jahre und in verschiedenen Gebieten der Welt unterstützt. Demnach gibt es wahrscheinlich ungefähr 12 bis 15 Serotypen, die für die meisten Fälle von ARF verantwortlich sind. Einige dieser Typen sind 1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24, 27 und 29.
Frühere Studien haben gezeigt, daß in vielen Fällen die schützenden Epitope der M-Proteine von den möglicherweise schädlichen Autoimmunepitopen der Moleküle (4, 5, 7, 23, 29) getrennt werden können. Die NH&sub2;-terminalen Abschnitte der M-Proteine haben Antikörper mit der größten bakteriziden Aktivität (5, 23, 38) hervorgerufen.
Frühere Studien haben auch gezeigt, daß synthetische Peptide, die begrenzte Regionen der Typ 5, 6 und 24 M-Proteine kopieren, typspezifische, opsonisierende Antikörper hervorrufen, die nicht mit Herzgewebe kreuzreagierten (4, 5, 23). Aufgrund ihres Fehlens an Immunogenität (Haptene) wurden die synthetischen Peptide chemisch kovalent an Trägerproteine (4, 5 und 23) gebunden. Solche Fragmente von M-Proteinen jedoch, die mit chemischen Reagenzien an Trägerproteine gebunden werden, ergeben keine Hybridproteine oder definierten Strukturen. Somit ist es im allgemeinen nicht möglich gewesen, Antigene zu erhalten, die spezifische, erwünschte Antikörper hervorrufen können, oder die das Risiko von unerwünschten Nebenreaktionen herabsetzen. Des weiteren ist die Bildung von Hapten- Trägerkomplexen unter Verwendung chemischer, kreuzvernetzter Reagenzien zeitraubend und teuer und führt zu undefinierten, heterogenen Gemischen von Impfstoffbestandteilen.
Es ist aufgrund dieser Beschreibung des Standes der Technik offensichtlich, daß ein maßgebliches Bedürfnis für einen Impfstoff besteht, der durch Erhöhen serospezifischer Antikörper gegen die verschiedenen Serotypen der Gruppe A-Streptokokken, insbesondere solche Serotypen, die in der Lage sind, akutes rheumatisches Fieber auszulösen, welches dafür bekannt ist, daß es auf Halsschmerzen folgt, ohne Kreuzreaktionen mit menschlichem Gewebe hervorzurufen, wirksam ist. Insbesondere besteht ein wichtiges Bedürfnis für einen Impfstoff, der nicht nur diese Eigenschaften hat, sondern der auch in der Lage ist, schützende Antikörper hervorzurufen, um Halsschmerzen, Hautinfektionen, verborgene Gewebeinfektionen und Streptokokken-Infektionen von der Art, die nicht notwendigerweise zu rheumatischem Fieber führen, vorzubeugen. Die Erfindung trägt dazu bei, diese Bedürfnisse der menschlichen Gesundheit zu lösen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Patentanmeldung bezieht sich auf und ist am gleichen Tag eingereicht wie Patentanmeldung Nr. EP-A 06 250 43 mit dem Titel "RECOMBINANT MULTIVALENT M PROTEIN VACCINE" mit den benannten Erfindern James B. Dale und James W. Lederer.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante M-Protein-Antigene zur Verfügung. Die Antigene werden durch rekombinante DNA-Verfahren konstruiert. Sie werden von Aminosäurefragmenten der Serotypen des M-Proteins, von denen mindestens einer der Serotyp M1 ist, umfaßt, wobei die Fragmente ein oder mehrere Epitope tragen, die opsonisierende Antikörper gegen spezifische Serotypen der Gruppe A-Streptokokken hervorrufen und, falls erwünscht, wenn die Fragmente geeignete Epitope tragen, auch schützende Antikörper hervorrufen. Die Fragmente sind entweder direkt fusioniert oder in Tandem durch einen Aminosäure-Linker an einen entsprechenden Träger gebunden. Aufgrund ihrer Molekulargröße oder aus anderen Gründen sind die Antigene in allgemeinen nicht immunogen (oder nicht angemessen immunogen).
Die Erfindung stellt somit ein rekombinantes Fusionsantigen zur Verfügung, das ein Gen umfaßt, welches für das Trägerprotein und ein NH&sub2;- oder COOH-terminales M-Protein-Fragment kodiert, das ein oder mehrere Epitope trägt. Das rekombinante Antigen ruft keine Antikörper hervor, die mit humanem Herz- oder anderem humanem Gewebe kreuzreagieren.
In Übereinstimmung mit der Erfindung werden Gemische aus Antigenen zur Verfügung gestellt, die serotypspezifisch sind und denselben oder verschiedene Träger umfassen. Solch ein Gemisch ausgesuchter Antigenträger oder "Cocktail" bietet eine Immunogenität gegen verschiedene Serotypen (und falls erwünscht, ruft verschiedene schützende Antikörper hervor).
Die rekombinanten Fusionsantigene sind aus Segmenten des NH&sub2;-terminalen Teils des M- Proteins erzeugt worden, wobei diese Fragmente spezifische, opsonisierende Antikörper hervorrufen. Es werden auch Fusionsantigene zur Verfügung gestellt, die aus den COOH- terminalen Fragmenten der M-Proteine gebildet werden. Die COOH-terminalen Fragmente erhöhen die schützenden Antikörper des mukosalen oder sekretorischen Typs. In dem Antigen mit einem Aminosäure-Linker sind der Träger und das Fragment des M-Proteins, das das erwünschte Epitop trägt, in Tandem durch einen Aminosäure-Linker verbunden, in größerem Detail nachfolgend beschrieben, der die Fähigkeit besitzt, die Konformation des Fragments des M-Proteins zu fördern, um die Exponiertheit des Epitops zu optimieren und somit die erwünschten Antikörper optimal hervorzurufen.
Die Erfindung sieht auch ein Antigen vor, das von einem Träger umfaßt wird, der den carboxy-terminalen Teil eines Serotyps des M-Proteins bildet, verbunden durch einen Linker oder direkt an ein Aminosäurefragment des M-Proteins gebunden. Der Träger und das Fragment können von demselben oder verschiedenen Serotypen sein, wobei mindestens ein Serotyp M1 ist.
Es sind auch Träger offenbart, welche frei von Epitopen sind, die Antikörper gegen Serotypen von Streptokokken-M-Protein hervorgerufen.
Es sind rekombinante Hybrid-Gene offenbart, deren Nukleotidsequenzen für die Antigene der vorliegenden Erfindung kodieren und ein Verfahren zur Konstruktion solcher Gene.
Die Erfindung stellt weiterhin die neuen Fusionsgene oder DNA-Fragmente, die für die Hybrid-Antigene kodieren und die transformierten Mikroorganismen (Eukaryoten oder Prokaryoten), die die Hybrid-Antigene exprimieren, zur Verfügung.
Es sind nicht-virulente Mikroorganismen offenbart, die mit den Genen der vorliegenden Erfindung transformiert sind. Diese Mikroorganismen sind insbesondere zur oralen Verabreichung und zur Immunisierung von Säugetieren, insbesondere Menschen, geeignet.
Es sind Verfahren zum Verabreichen von Antigenen der vorliegenden Erfindung in therapeutischen Zusammensetzungen zur oralen, intranasalen und parenteralen Verabreichung offenbart, um opsonisierende und/oder schützende Antikörper gegen Serotypen von Gruppe A- Streptokokken zu induzieren oder hervorzurufen. Die verabreichten Zusammensetzungen verleihen immunisierten Säugetieren gegen Gruppe A-Streptokokken Immunität.
Die Erfindung stellt Impfstoffzusammensetzungen zur Verfügung, die von den Antigenen der vorliegenden Erfindung und biologisch akzeptablen Verdünnungsmitteln zur Verabreichung bei und Immunisierung von Säugetieren, insbesondere Menschen, umfaßt sind. Die Zusammensetzung ist oral, wobei die Antigene von den transformierten Mikroorganismen freigesetzt werden und die erwünschten Antikörper hervorrufen, intranasal und parenteral verabreichbar.
Es ist ein breites Schutzsprektrum und eine weitreichende Immunität gegen alle Serotypen von Gruppe A-Streptokokken, insbesondere rheumatogenen Streptokokken, durch die Rezeptur der Zusammensetzungen der Antigene, entweder einzeln oder als Gemische oder "Cocktails", offenbart.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt die DNA und abgeleitete Proteinsequenz des LT-B-M24-Hybrid-Moleküls.
Fig. 2 zeigt die Immunoblotanalyse gereinigten LT-B-M24-Hybridproteins.
Fig. 3 zeigt die Immunogenität von LT-B-M24 in Kaninchen, bestimmt durch ELISA.
Fig. 4 zeigt die Reihenfolge der Nukleotide und Aminosäurereste eines Antigens von einem Fragment des M5 und eines Trägers des COOH-terminalen Teil des M5.
Fig. 5 zeigt die Reihenfolge der Nukeotide und Aminoräurereste eines Antigens von einem Fragment des M5 und eines Trägers des COOH-terminalen Teils des M5.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die vorliegende Erfindung und viele der begleitenden Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung besser verstanden, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet werden, wobei:
Fig. 1 die DNA- und abgeleitete Proteinsequenz des LT-B-M24 Hybrid-Moleküls zeigt. Die Sequenz des Fusionsgens wurde von Base 228 bis zum 3'-Ende bestätigt. Der Rest der LT-B- Sequenz stammt von Clements (16). Die NcoI-Stelle verbindet die LT-B- und M24- Komponenten wie angegeben. Die M24-Untereinheit ist unterstrichen.
Fig. 2 die Immunoblot-Analyse des gereinigten LT-B-M24 Hybridproteins zeigt. Das gereinigte Protein wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrozellulosepapier tansferiert. Coomassie Blau färbte eine einzelne Bande mit einem ungefähren Molekulargewicht von 14kDa (Bahn A) an. Das gereinigte Protein reagierte mit Kaninchen-Antiserum gegen LT-B (Bahn B) und SM24 (1-29)C (Bahn C).
Fig. 3 Immunogenität von LT-B-M24 in Kaninchen zeigt, wie durch ELISA bestimmt. Es werden drei Kaninchen ( ; ; Δ) mit 300 ug LT-B-M24 zum Zeitpunkt 0 und nach 4 Wochen (Pfeile) immunisiert und das in zweiwöchigen Intervallen abgenommene Serum wurde auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen pep M24 durch ELISA getestet. Die Titer werden als reziproker Wert der letzten Verdünnung des Antiserums ausgedrückt, der eine O.D. von > 0,1 bei 580 nm ergab. Der in verschiedenen Intervallen nach der anfänglichen Injektion von LT-B-M24 durchgeführte ELISA offenbarte eine rasche Antikörperantwort, selbst nach einer einzigen intrakutanen Dosis von LT-B-M24, in allen drei Kaninchen.
Fig. 4 ein Konstrukt von 762 Nukleotiden, kodierend für ein Antigen von 254 Aminosäureresten, wie gezeigt, zeigt. Das Antigen wird von einem M5-Hapten-Fragment von 16 Aminosäuren umfaßt. Das Fragment ist durch eine Bam H1-Restriktionsschnittstelle an einen Träger, der die COOH-terminale Hälfte des M5 ist, gebunden. Der Träger beinhaltet 2,5 Crepetitive Sequenzen, wobei jede mit dem Tetrapeptid Asn-Lys-Ile-Ser beginnt. Obwohl kein Aminosäure-Linker das Fragment und den Träger verbindet, ist Bam H1 eine geeignete Schnittstelle, um einen passenden Linker einzufügen.
Fig. 5 ein Konstukt von 852 Nukleotiden zeigt, das für ein Antigen von 284 Aminosäureresten, wie gezeigt, kodiert. Das Antigen wird von drei Segmenten des M5, entsprechend bezeichnet als A, B und C, umfaßt. Das C-Segment ist durch eine Bam H1- Restriktionsschnittstelle an einen Träger gebunden, der die COOH-terminale Hälfte des M5 ist. Der Träger beinhaltet 2,5 Crepetitive Sequenzen, wobei jede mit dem Tetrapeptid Asn- Lys-Ile-Ser beginnt. Obwohl kein Aminosäure-Linker das Fragment und den Träger miteinander verbindet, ist Bam H1 eine geeignete Schnittstelle, um einen passenden Linker einzufügen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die oben genannten und verschiedene andere Aspekte und Vorzüge der vorliegenden Erfindung sind im folgenden beschrieben. Alle oben genannten und die folgenden Referenzen werden durch Referenz aufgenommen und im Literaturverzeichnis, wie im Text numeriert, kenntlich gemacht.
Die Erfindung stellt ein rekombinantes Hybrid-Streptokokken-M-Protein-Antigen zur Verfügung, das opsonisierende Antikörper gegen einen Serotyp der Gruppe A-Streptokokken hervorruft, wobei mindestens ein Serotyp M1 ist, das einen durch einen Aminosäure-Linker an ein Aminosäure-Fragment gebundenen Träger umfaßt und das Fragment mindestens ein Epitop von einem Serotyp des Gruppe A-Streptokokken-M-Proteins hat. Das Fragment ruft opsonisierende Antikörper gegen das Epitop oder die Epitope des Zielserotyps hervor, ohne kreuzreaktive Antikörper gegen Antigene aus Herzgewebe von Säugetieren hervorzurufen.
Es ist auch eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, daß das Antigen aus Träger und Fragment ohne das Vorhandensein eines Linkers verbunden oder miteinander fusioniert ist.
Das Aminosäure-Fragment ist ein Teil des Streptokokken-M1-Protein-Serotys der Gruppe A- Streptokokken. Das Fragment hat eine Peptidgröße, die an sich nicht immunogen (oder nicht ausreichend immunogen) ist. In diesem Sinne kann das Fragment als Hapten betrachtet werden, wenn es alleine in Erwägung gezogen wird. Wobei das Hapten als eine bestimmte Gruppe niederen Molekulargewichts definiert ist, die von sich aus nicht immunogen ist, aber es wird, wenn sie an einem größeren "Träger"-Molekül (11) plaziert wird. Wenn an ein Trägerprotein von geeigneter Größe gebunden, sind Haptene in der Lage, eine starke Immunantwort in einem Tier oder Menschen hervorzurufen.
Durch die vorliegende Erfindung werden die rekombinanten Hybridproteine so ausgewählt, daß sie Amino-terminale (NH&sub2;) Fragmente von M-Proteinen darstellen, die immunprotektive Epitope enthalten, welche opsonisierende Antikörper gegen einen Zielserotyp des Gruppe A- Streptokokken-M-Proteins, von dem mindestens einer M1 ist, hervorrufen. Diese Fragmente der vorliegenden Erfindung enthalten keine kreuzreaktiven oder autoimmunen Epitope, um eine Autoimmunantwort zu erzeugen, die gegen Herz- und andere Gewebe-Antigene gerichtet ist. Daher ist das Risiko der Entwicklung von ARF minimiert. Die Fragmente des M-Proteins rufen Antikörper des opsonisierenden oder Serumtyps hervor, die die phagozytische Aufnahme der Gruppe A-Streptokokken unterstützen. Die Fragmente der M-Proteine können auch, soweit erwünscht, schützende Antikörper hervorrufen, die sekretorische oder mukosale Antikörper sind (z. B. aus den Saliva- oder Nasalmembranen), die eine wichtige Rolle in der Verteidigung in vorderster Front gegen eindringende Streptokokken am Ort oder der Stelle der Infektion spielen. In diesem Fall sind die Fragmente Teile der COOH-terminalen Hälfte der M-Proteine, wobei die Fragmente frei von Epitopen sind, die Antikörper hervorrufen, welche mit Herz- oder anderen Geweben kreuzreagieren.
Somit werden zwei Typen von Antikörpern von Epitopen, lokalisiert auf zwei verschiedenen Teilen des M-Protein-Moleküls, hervorgerufen. Die NH&sub2;-terminalen Fragmente enthalten Epitope, die Serum oder opsonisierende Antikörper in immunisierten Säugetieren hervorrufen. Die COOH-terminalen Fragmente des M-Proteins rufen schützende sekretorische oder mukosale Immunität im immunisierten Säugetier, z. B. IgA-Antikörper, hervor.
Es sollte im Zusammenhang mit der Erfindung beachtet werden, wie hierin beschrieben worden ist, daß nicht alle M-Protein-Epitope in ihrem NH&sub2;-terminalen Teil serospezifisch sind. Einige Epitope von speziellen Serotypen, wie z. B. M5, kreuzreagieren im gewissen Ausmaß mit Streptokokken von einem anderen Typ als M5, wie z. B. M6 oder M19. Bis zu einem gewissen Grad geschieht dies auch mit anderen M-Serotypen. Dementsprechend ist es innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, daß, wenn sich auf Typenspezifität bezogen wird, dies nicht einige Kreuzreaktivität zwischen bestimmten, geteilten Strukturen von verschiedenen Serotypen ausschließt. Man sollte jedoch aufpassen, zu bemerken, daß solche geteilten Epitope, die mit Herzgewebe kreuzreagieren würden, von den ausgewählten Fragmenten auszuschließen sind. NH-terminale Fragmente, die zusätzlich zum Hervorrufen opsonisierender Antikörper auch Epitope enthalten, die schützende sekretorische oder mukosale Antikörper hervorrufen, sind auch umfaßt.
Es wird ein Gemisch oder Cocktail von Antigenen zur Verfügung gestellt. Die Antigene in dem Gemisch enthalten NH&sub2;- oder COOH-terminale Fragmente des M-Proteins verschiedener Serotypen, die entsprechend opsonisierende und schützende Antikörper hervorrufen können, gerichtet gegen einen großen Bereich von Serotypen, insbesondere der rheumatogenen Streptokokken, wobei mindestens ein Serotyp M1 ist.
Somit, wenn es in Übereinstimmung mit der Erfindung erwünscht ist, um Immunität gegen Streptokokken-Infektionen zur Verfügung zu stellen, die höchstwahrscheinlich rheumatisches Fieber verursachen, werden DNA-Moleküle konstruiert, die für NH&sub2;- oder COOH-terminale Fragmente kodieren, die Epitope enthalten, die opsonisierende oder schützende Antikörper für z. B. Typen 1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24, 27 oder 29 der M-Proteine hervorrufen und in Tandem durch einen Aminosäure-Linker verbunden sind oder direkt mit einem geeigneten Träger fusioniert sind.
Beispiele geeigneter NH&sub2;-terminaler Fragmente von M-Protein zur Konstruktion von Antigenen, die opsonisierende Antikörper in einem immunisierten Tier hervorrufen, sind im folgenden beschrieben. Für M24 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Val- Ala-Thr-Arg-Ser-Gln-Tbr-Asp-Thr-Leu-Glu-Lys-Val-Gln-Glu zur Verfügung gestellt. Für M5 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Ala-Val-Thr-Arg-Gly-Thr- Ile-Asn-Asp-Pro-Gln-Arg-Ala-Lys-Glu zur Verfügung gestellt. Für M6 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Arg-Val-Phe-Pro-Arg-Gly-Thr-Val-Glu-Asn-Pro- Asp-Lys-Ala-Arg zur Verfügung gestellt. Für M19 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Arg-Val-Arg-Tyr-Thr-Arg-His-Thr-Pro-Glu-Asp-Lys-Leu-Lys-Lys zur Verfügung gestellt. Für M3 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Asp-Ala- Arg-Ser-Val-Asn-Gly-Glu-Phe-Pro-Arg-His-Val-Lys-Leu zur Verfügung gestellt. Für M1 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Asn-Gly-Asp-Gly-Asn-Pro-Arg- Glu-Val-Ile-Glu-Asp-Leu-Ala-Ala zur Verfügung gestellt. Für M18 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge Ala-Pro-Leu-Thr-Arg-Ala-Thr-Ala-Asp-Asn-Lys-Asp-Glu- Leu-Ile zur Verfügung gestellt. Für M12 wird ein 15 Aminosäuren langes Fragment der Reihenfolge His-Ser-Asp-Leu-Val-Ala-Glu-Lys-Glu-Arg-Leu-Glu-Asp-Leu-Gly zur Verfügung gestellt. Diese NH&sub2;-terminalen Fragmente werden opsonisierende Antikörper in immunisierten Tieren hervorrufen, wenn sie mit einem geeigneten Träger verbunden oder fusioniert sind, wobei der Träger bevorzugt auch erwünschte Antikörper hervorrufen kann. Diese, ebenso wie andere Antigene der vorliegenden Erfindung, können einem Säugetier als ein Cocktail oder Gemisch verabreicht werden, um ein breites Spektrum an Antikörpern hervorzurufen. In solch einer Art und Weise wird ein breites Immunitätsspektrum den immunisierten Säugetieren gegen Gruppe A-Streptokokken zur Verfügung gestellt.
Es ist wichtig zu bemerken, daß die Erfindung nicht auf eine bestimmte Aminosäuresequenz beschränkt ist, wo immer sich auf Aminosäuresequenzen bezogen wird oder welche beschrieben sind, wie oben. In irgendeiner, hierin wiedergegebenen, speziellen Aminosäuresequenz oder einem -fragment können ein oder mehrere Aminosäuren entfernt, substituiert oder durch einige andere Aminosäuren(-säure) ersetzt werden, festgelegt, daß die erwünschten Epitope durch die Veränderungen in der Primärstruktur der Proteinfragmente nicht nachteilig beeinflußt werden. In der Tat ist das eine relativ verbreitete Erscheinung für das M-Protein unter verschiedenen Stämmen innerhalb desselben Serotyps. Diese Variationstendenzen der Sequenz des M-Proteins ist für verschiedene solcher M-Proteine gezeigt worden (9 und 23).
Dementsprechend kann jedes einzelne Fragment eines gegebenen Serotyps, kodiert durch ein Gen, in seiner Sequenz verändert werden, um multiple Epitope für eine Vielzahl von Stämmen innerhalb desselben Serotyps abzudecken. In dieser Art und Weise wird ein einzelnes Antigen erwünschte Antikörper gegen eine Anzahl von Stämmen mit demselben Serotyp hervorrufen. Es ist daher ein wichtiges Konzept der Erfindung, daß, wenn auf einen speziellen Serotypen Bezug genommen wird (d. h. auf irgendeinen der bekannten oder der zu entdeckenden Serotypen, z. B. 1-82), die Bezugnahme nicht für einen einzelnen Stamm eines Typs, sondern für die verschiedenen Stämme innerhalb des Serotyps verstanden werden soll. Somit ist es nicht nur ein fundamentales Konzept der Erfindung, einen Impfstoff aus einem Cocktail oder Gemisch gegen verschiedenen Serotypen zur Verfügung zu stellen, sondern auch einen Impfstoff, der gegen verschiedene Stämme innerhalb des speziellen Serotyps gerichtet ist.
Somit wird in Übereinstimmung mit der Erfindung ein Impfstoff zur Verfügung gestellt, der nicht nur gegen verschiedene Serotypen der M-Proteine, sondern auch gegen verschiedene Stämme innerhalb der individuellen Serotypen wirksam ist.
Die Aminosäure-Linker-Sequenzen tragen idealerweise zur maximalen Zugänglichkeit der Epitope der Fragmente bei, um die erwünschten Antikörper zu erzeugen. Somit können die Linker dazu dienen, die Orientierung, Konformation oder andere Aspekte des Aminosäurefragment-Trägermoleküls zu beeinflussen. Idealerweise trägt der Linker zur Orientierung bei, so daß das Hybrid-Molekül oder zumindest das Aminosäurefragment das native Molekül nachahmt.
Die Aminosäuresequenz des Linkers wird durch Konstruktion eines Gens, kodierend für die erwünschte M-Protein-Aminosäuresequenz und den Träger mit einer Restriktionsschnittstelle, die durch Einfügen der DNA, die für den Linker zwischen den Sequenzen des Fragments und des Trägers kodiert, wobei der Linker den Träger und das Fragment im Tandem verbindet, zur Verfügung gestellt. Veranschaulichend ist solch ein Linker ein prolinreicher Linker wie Pro- Gly-Asn-Pro-Ala-Val-Pro. Andere Aminosäure-Linker, wie z. B. Ile-Pro-Gly-Asp-Pro-Arg- Val-Pro-Ser-Ser oder His-Gly können verwendet werden. Ein Aminosäure-Linker mit Asp- Pro-Arg-Val-Pro-Ser-Ser oder sein Äquivalent wird auch als geeignet erachtet. Während in der Theorie ein Linker durch eine Aminosäure erzeugt werden kann, so lange wie die erwünschte immunoreaktive Konformation erreicht ist, können längere Linkerregionen geeigneter sein, um die Immunogenität der Epitope zu optimieren.
Der Einfluß der verschiedenen Linker auf die Immunogenität des Hybrid-Moleküls kann weitere Untersuchungen rechtfertigen. Es ist nicht ausgeschlossen, daß, abhängig von dem Typ und der Anzahl der Aminosäuren des Linkers, ein Hybrid-Antigen idealer oder nahe der idealen hohen Immunogenität identifiziert werden kann.
Ein Linker aus hydrophoben Säuren, wie z. B. Tryptophan, Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Tyrosin, Phenylalanin, Prolin, Methionin und Kombinationen derselben, ist besonders bevorzugt. Die Linker können sich in der Zahl von 2 bis 30 bewegen, festgelegt, daß es keinen nachteiligen Effekt auf die Immunogenität des Moleküls gibt. Relativ zufriedenstellende Ergebnisse wurden mit einem Linker aus zwei Aminosäuren aus His-Gly erhalten, was andeutet, daß solch ein kleines Molekül für M-Protein-Komponenten ausreichend sein kann. Die Sequenz der Aminosäuren in irgendeinem speziellen Linker scheint zu diesem Zeitpunkt nicht entscheidend zu sein.
Wie weiter unten beschrieben, sind die Linker nützlich aber nicht unverzichtbar, um den Träger und das Fragment zu verbinden. Der Träger und das Fragment können direkt zusammen verbunden oder fusioniert werden.
Es werden Genkonstrukte zur Verfügung gestellt, die ein Amino-terminales Fragment eines M-Protein-Serotyps, verbunden mit der COOH-terminalen Hälfte eines M-Proteins, die als Träger dient, kodieren. Siehe Fig. 4 und 5. Wie darin gezeigt, dient eine Bam H1- Restriktionsschnittstelle als eine Verbindung zwischen dem Fragment und dem Träger. Es wird daran gedacht, daß die Restriktionsschnittstelle eine geeignete Stelle zum Einfügen eines geeigneten Aminosäure-Linkers ist. Der COOH-terminale Träger kann schützende mukosale oder sekretorische Antikörper gegen Serotypen des M-Proteins hervorrufen. Diese Antikörper können eine wichtige Rolle beim Vorbeugen der Besiedlung und Infektion durch Gruppe A- Streptokokken spielen. Solch ein Träger dient somit einem doppelten Zweck. Er dient der Aufgabe des Einfügens des Epitops (der Epitope), präsentiert auf dem Amino-terminalen Hapten-Fragment, gegenüber den Makrophragen zum Prozessieren und der Antigen- Präsentation gegenüber T-Helferzellen zum Erzeugen einer typspezifischen humoralen Antwort. Und der Träger besitzt Epitope, die in breiterer Weise schützende IgA-Antikörper auf mukosalem oder sekretorischem Niveau hervorrufen können. Diese Antikörper sind in breiterer Weise schützender als der typspezifische opsonisierende Typ, da sie mehr homologe Epitope unter den verschiedenen Typen rheumatogener Streptokokken teilen. In dieser Art und Weise sind solche schützenden Antikörper einer kreuz-schützenden oder kreuz-serotypischen Natur vorteilhaft.
Anstelle der Verwendung des gesamten Carboxy-Terminus irgendeines der Serotypen, kann es vorteilhaft und erwünscht sein, nur ein oder mehrere repetitive C-Sequenzen des M- Proteins als einen Träger zu verwenden. Es ist erwähnenswert, daß der Carboxy-terminale Teil des M-Proteins, der im Konstrukt verwendet wird, nicht vom selben Serotyp sein muß, wie der, der den Amino-terminalen Teil des Konstrukts bildet.
Anstelle der Verwendung des COOH-terminalen Teils oder der Hälfte eines M-Proteins als Träger, umfassen andere geeignete Träger für die Fragmente Oberflächenproteine von Grampositiven Kokken (meistens von Streptokokken oder Staphylokokken) (32). Diese Proteine, die sequenziert worden sind, sind IgA-bindende Proteine (ARP 4), Fe-bindende Proteine (FCRA), humane IgG Fc-bindende Proteine (Protein H), C5a-Peptidase (SCP) und T6- Oberflächenprotein von S. pyogenes; wandassoziiertes Protein (wap A) und Zelloberflächenproteine (PAc und spa P) von S. mutans; Protein G und IgG-bindende Proteine von Gruppe G- Streptokokken, Protein A und Fibronektin-bindende Proteine (FnBP) von S. aureus und Zellwandprotease (wg 2) von S. cremoris. Beginnend am C-terminalen Ende dieser Moleküle, haben all diese Proteine und die M-Proteine eine ähnliche Anordnung der Aminosäuren. Am C-Terminus werden bis zu 7 geladene Aminosäuren gefunden, die aus einem Gemisch von sowohl negativ als auch positiv geladenen Resten bestehen. Unmittelbar N-terminal zu dieser kurzen geladenen Region befindet sich ein Bereich von 15-22 hauptsächlich hydrophoben Aminosäuren. Ungefähr neun Aminosäuren N-terminal beginnend von der hydrophoben Domäne wird ein Hexapeptid mit der Konsensus-Sequenz LPSTGE, das innerhalb all der Proteine überaus konserviert ist, gefunden. Analysen von 12 dieser Oberflächenmoleküle haben gezeigt, daß diese Proteine repetitive Sequenzbereiche, wie in den M-Proteinen, enthalten und innerhalb der Region, die die repetitiven Sequenzbereiche enthält, hautpsächlich helikal waren.
Diese Proteine, als Träger, können in Tandem durch einen Aminosäure-Linker an NH&sub2;- oder COOH-terminale Fragmente gebunden oder direkt mit den Fragmenten fusioniert werden, solange, wie die Immunogenität der Antigene nicht negativ beeinflußt wird.
Die Aminosäurefragmente der vorliegenden Erfindung sind entweder mit oder ohne einen Linker an einen entsprechenden Träger gebunden. Zu diesem Zweck wird jeder Typ von Träger in Erwägung gezogen, solange das an den Träger gebundene Aminosäurefragment eine opsonisierende oder schützende Immunantwort gegen die Epitope des Fragments erzeugt. Der Träger kann ein Molekül sein, das frei von einem Epitop ist, das Antikörper gegen einen Serotyp eines Streptokokken-M-Proteins hervorruft. Ein Beispiel wäre die B-Untereinheit von E. coli labilem Toxin (LT-B). Alternativ kann der Träger aus dem COOH-terminalen Teil des M-Proteins ausgewählt sein, der nicht mit menschlichem Gewebe kreuzreagiert und der bevorzugt schützende mukosale Antikörper hervorruft. Oder der Träger kann der COOHterminale Teil von Oberflächenproteinen Gram-positiver Kokken, wie oben beschrieben, sein.
Andere Beispiele für geeignete Träger können das Keyhole Limpet-Hämocyanin (KLH), Tetanus-Toxoid, Diphterie-Toxoid, Rinderserumalbumin, Hühnereilysozym, Gelatine, Rindergammaglobulin und Flagellinpolymer sein.
Wie in Fig. 4 und 5 gezeigt, ist offenbart, daß das Vorhandensein von Linkem in den Genkonstrukten, die das Fragment und den Träger in Tandem verbinden, nicht notwendig ist, um opsonisierende oder schützende Antikörper in einem immunisierten Wirt hervorzurufen. Das Fragment und der Träger in dieser Ausführungsform der Erfindung sind direkt miteinander fusioniert. Ein Fusionsantigen ist so lange geeignet, wie die Immunogenität des Antigens nicht nachteilig beeinflußt ist. Die erhaltenen Genkonstrukte sind Fusionskonstrukte.
Alternativ kann ein Linker aus Aminosäuren durch chemische Mittel angefügt werden, nach dem das Antigen exprimiert ist, z. B. durch Behandlung mit Succinimidyl-4-(N-maleiamidomethyl) cyclohexon-1-carboxylat.
Es wird auch in Erwägung gezogen, daß die Konstrukte der Erfindung so gestaltet werden, daß sie ein Fragment der NH&sub2;- oder COOH-terminalen Region der Serotypen, von denen nicht bekannt ist, daß sie einen rheumatogenen Effekt haben, wie solche oben und in der Literatur beschriebenen Typen, enthalten. Unter diesen Umständen, wo solche Fragmente noch nicht sequenziert oder noch nicht veröffentlicht worden sind, ob rheumatogen oder nicht- rheumatogen, kann eine auf dem Fachgebiet sachkundige Durchschnittsfachperson solche Strukturen durch leicht zugängliche Verfahren sequenzieren. Die Erfindung beinhaltet auch die Gestaltung von Hybrid-Konstrukten, die repetetive Amino-terminale oder Carboxyterminale M-Protein-Fragmente unter Verwendung von PCR enthalten. Eine auf dem Fachgebiet sachkundige Durchschnittsfachperson kann homologen Regionen von publizierten M- Protein (emm)-Gensequenzen der Gruppe A-Streptokokken (GAS; Streptococcus pyogenes) zum Gestalten dreier Primerpaare für PCR und dreier Oligonukleotid-Sondensequenzen innerhalb der amplifizierten Produkte verwenden. Ein Set von Primern und die entsprechende Sonde können detektieren und führen zur Amplifikation von emm(-ähnlichen) Genen praktisch jeden Typs ("alle M"). Ein anderes Set ("SOR&supmin;M") amplifiziert nur emm(-ähnliche) Gene von GAS, negativ für die Serumtrübungsreaktionen (SOR). Und ein drittes Set ("SOR&supmin;M") erweitert nur emm(-ähnliche) Gene von SOR&supmin;GAS. Unter Verwendung des "alle M"- Primerpaars in der PCR mit genomischer DNA von 29 verschiedenen M-Typen, ebenso wie von einem Gruppe C- und Gruppe G-Streptokokken-Isolat, wurden DNA-Fragmente innerhalb des erwarteten Größenbereichs bei jedem Test amplifiziert. Alle PCR-Produkte reagierten mit der "alle M"-Sonde (49).
Somit ist ein Hybrid-Fragment-Trägerprotein-Antigen, kodiert durch ein entsprechendes Gen oder entsprechende Gene zum Exprimieren in einem geeigneten Organismus, offenbart, wobei das Antigen die erwünschten Antikörper hervorrufen wird. Somit sind innerhalb des schützenden Umfangs der vorliegenden Erfindung Antigene umfaßt, die opsonisierende Antikörper-erzeugende NH&sub2;- oder COOH-terminale Fragmente vom M-Protein aller bekannten rheumatogenen Typen von Streptokokken und Fragmente von Typen von Streptokokken, die nicht oder zumindest noch nicht bekannt oder als existent gezeigt sind und mit ARF in Beziehung stehen, umfassen. Ein Beispiel eines nicht-rheumatogenen Streptokokkentyps, dessen M-Protein-Antigen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegt, ist Typ 12.
Die entsprechenden Gene werden wie im folgenden beschrieben konstruiert und exprimiert. Die Gene, die die geeigneten Träger der vorliegenden Erfindung kodieren, werden in entsprechende Plasmide eingefügt. Nicht-einschränkende Beispiele für die geeigneten Träger ist die Carboxy-terminale Hälfte von M-Proteinen, die Carboxy-terminale Hälfte von Oberflächenproteinen Gram-positiver Kokken und die B-Untereinheiten von E. coli labilem (LT-B) und Cholera-Toxin (CT-B) von Vibrio cholerae. Die Plasmide sind so verändert, daß sie einen kleinen Polylinker mit drei Restriktionsendonukleaseschnittstellen am 3'-Ende, gefolgt von Transkriptionsterminatoren in jedem Leseraster (16) enthalten. Die ausgewählten Gene, die die erwünschten NH&sub2;- oder COOH-terminalen Fragmente des M-Proteins kodieren, sind in einer geeigneten Weise konstruiert. Beispielsweise ist ein Paar Oligonukleotiden, die für die Fragmente kodieren, unter Verwendung eines automatischen DNA-Syntheseapparats (ABI, Modell 381A) synthetisiert worden. Die erwünschten Oligonukleotide kopieren die entsprechende erste Anzahl an Basenpaaren der Gene, die die erwünschten NH&sub2;- oder COOHterminalen Fragmente des M-Proteins kodieren. Zusätzlich umfassen die Oligonukleotide die rechte Seite einer geeigneten Restriktionsschnittstelle am 5'-Ende, z. B. NcoI. Die Oligonukleotide werden in äquimolaren Verhältnissen gemischt, auf eine entsprechende Temperatur erhitzt, und es wird ihnen ermöglicht, bei Umgebungstemperatur zu reassoziieren. Die entsprechenden Plasmide werden mit Restriktionsenzymen verdaut und die geschnittenen Plasmide dann gereinigt. Beispielsweise wird Plasmid pPX1604 mit NcoI und Eco RV verdaut und aus einem Agarosegel über Glasmilch (Geneclean, Bio 101, La Jolla, Ca) gereinigt. Die synthetischen Oligonukleotidepaare von Interesse werden dann in die Schnittstellen der Plasmide ligiert. Die Plasmide, die die M-Protein-Fragmente des Interesses enthalten, werden dann dazu verwendet, um einen geeigneten Mikroorganismus zu transformieren. Beispielsweise ist E. coli JM105 ein geeigneter Mikroorganismus. Die Transformanten werden dann mit einem entsprechenden Verfahren durchgemustert, z. B. Dot Blot-Analyse unter Verwendung geeigneter Antiseren.
Für eine hohe Expression der M-Protein-Antigene der vorliegenden Erfindung findet das Einfügen der ausgewählten Gen-Konstrukte, kodierend für die Antigene, in geeignete Plasmide statt. Ein Beispiel für ein geeignetes Plasmid ist pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Die Gene werden aus geeigneten Plasmiden, z. B. pPX1604, mit entsprechenden Restriktionsenzymen herausgeschnitten. Geeignete Enzyme sind EcoR1 und Sal I. Die ausgewählten Gene werden durch Ausschneiden aus Agarosegelen gereinigt. Zur Reparatur der Enden der gereinigten DNA wird Klenow-Fragment verwendet. Die gereinigten Genkonstrukte werden mit geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten, z. B. EcoR1. Die geschnittenen Genkonstrukte werden dann in die entsprechenden Restriktionsschnittstellen ausgesuchter Hochexpressions-Plasmide ligiert. Beispielsweise werden die ausgeschnittenen Gene in die EcoR1 und SmaI-Restriktionsenzymschnittstellen von pKK223-3-Plasmiden (53) ligiert. Die ausgewählten Plasmide, die die Genkonstrukte der vorliegenden Erfindung tragen, werden dann verwendet, um geeignete Mikroorganismen zu transformieren. Zum Beispiel wird E. coli JM105 mit den ausgewählten Plasmiden transformiert. Die Expression der Proteine wird in einer geeigneten Art und Weise detektiert, wie z. B. durch Dot Blot-Analyse unter Verwendung entsprechender Antiseren. Zum Beispiel werden die erwünschten Transformanten auf die Expression des Gens, das für ein NH&sub2;-terminales Fragment des M24-LT-B-Trägers (Untereinheit B von E. coli labilem Toxin) kodiert, durch Dot Blot-Analyse und Verwendung von Kaninchen-Antiseren gegen ein synthetisches Peptid von M24, SM24 (1-29) C und Kaninchen-Antiserum gegen gereinigtes LT-B (16), freundlicherweise von Dr. John Clements der Tulane Unversity zur Verfügung gestellt, durchgemustert. Die entsprechenden positiven Transformanten, die die ausgewählten Plasmide beherbergen, die die Gene der vorliegenden Erfindung tragen, werden auf Expression und Reinigung der rekombinanten Protein-Antigene der vorliegenden Erfindung hin ausgewählt.
Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung beinhalten die Antigene der Erfindung und biologisch akzeptable Verdünnungsmittel oder Adjuvanzien. Die Zusammensetzungen sind geeignet, um opsonisierende und/oder schützende Antikörper gegen Serotypen von M-Protein der Gruppe A-Streptokokken hervorzurufen. Die verabreichten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung rufen Antikörper hervor, ohne kreuzreaktive Antikörper gegen Herzgewebe-Antigene aus Säugetieren hervorzurufen.
Geeignete biologisch akzeptable Verdünnungsmittel und Adjuvanzien der vorliegenden Zusammensetzung können aus einer breiten Gruppe von solchen Verdünnungsmitteln oder Adjuvanzien, wie für eine auf dem Fachgebiet sachkundige Durchschnittsfachperson bestens bekannt, ausgewählt werden. Ein nicht-einschränkendes Beispiel für ein Verdünnungsmittel ist Phosphat-gepufferte Salzlösung. Die Zusammensetzungen können einzeln oder als ein Gemisch oder Cocktail verabreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Hybrid- oder Fusionsgene, die konstruiert worden sind, die die Antigene der vorliegenden Erfindung kodieren. Die Fusionsgene kodieren für die Antigene der Erfindung, konstruiert wie oben beschrieben, aus Aminosäurefragmenten, die mit dem ausgewählten Träger verbunden sind. Die Gene werden in geeignete selbst-replizierende Vehikel, wie Plasmide, eingebracht. Plasmide, die die Gene enthalten, werden dann verwendet, um nicht-virulente Mikroorganismen zu transformieren. Die transformierten Mikroorganismen exprimieren die Hybrid- oder Fusionsprotein-Antigene, die in der Lage sind, opsonisierende und/oder schützende Antikörper gegen Serotypen der Gruppe A-Streptokokken in immunisierten Säugetieren hervorzurufen, ohne kreuzreaktive Antikörper gegen Herzgewebe-Antigene von Säugetieren hervorzurufen.
Es wird ein Verfahren zur Verabreichung der Zusammensetzungen an Säugetiere, insbesondere Menschen, um opsonisierende und/oder schützende Antikörper, gerichtet gegen Epitope, die in den Hybrid-Antigenen der vorliegenden Erfindung vorhanden sind, hervorzurufen, zur Verfügung gestellt. Es werden keine Antikörper hervorgerufen, die mit Herzgewebe- Antigenen kreuzreagieren. Das Verfahren umfaßt das orale Verabreichen einer therapeutischen Zusammensetzung, die einen biologisch akzeptablen Träger und ein nicht-virulentes, lebendes Bakterium, wie im US-Patent Nr. 5,124,153 an Beachey et.al. beschrieben, wobei alle darin enthaltenen Referenzen hierin durch Referenz aufgenommen werden, an das Säugetier, in einer wirksamen Menge, um Immunität gegen Gruppe A-Streptokokken-Infektion zu verleihen. Das Bakterium ist mit einem Plasmid transformiert, das ein Antigen der vorliegenden Erfindung kodiert und exprimiert. Das Antigen wird vom Bakterium abgegeben, wobei schützende Antikörper gegen das Antigen desselben Serotyps, wie das immunisierende Antigen, hervorgerufen werden, ohne Antikörper hervorzurufen, die mit Herzgewebe- Antigenen kreuzreagieren. Dabei wird dem Säugetier Immunität gegen Streptokokken- Infektionen vermittelt.
Hierin ist das orale Verabreichen vielfacher therapeutischer Zusammensetzungen offenbart. Jede Zusammensetzung umfaßt ein Hybrid-Antigen eines Serotyps von Streptokokken. Die Zusammensetzungen können einzeln oder als ein Gemisch oder Cocktail verschiedener Zusammensetzungen verabreicht werden. In dieser Art und Weise wird ein Säugetier gegen einen oder mehrere rheumatogene Serotypen von Gruppe A-Streptokokken immunisiert. Es kann daher ein breites Spektrum schützender Immunität gegen alle rheumatogenen Streptokokken etabliert werden.
Jeder biologisch akzeptable Träger kann verwendet werden. Ein biologisch akzeptabler Träger kann PBS sein, als nicht-einschränkendes Beispiel. Insbesondere bevorzugt ist eine Dosis der therapeutischen Zusammensetzung, suspendiert in 25 ml PBS, pH 7,2, enthaltend 5 mg/ml Kanamycinsulfat und 1 mg/ml von jeweils Paraaminobenzoesäure (PABA) und 2,3- Dihydrobenzoesäure (DHB).
Es ist bevorzugt, daß die Plasmide, die die M-Protein-Gene der vorliegenden Erfindung kodieren, zuerst in Escherichia coli kloniert und exprimiert werden. Alle anderen Darmbazillen der coliformen Gruppe wie z. B. Klebstella oder Enterobacter können verwendet werden, aber normalerweise ist E coli bevorzugt. Folglich wird das Plasmid, das das M-Gen trägt, isoliert und gereinigt und dann ein Konstrukt hergestellt, um das erwünschte nicht-virulente Bakterium, wie z. B. araA-S. typhimuium (SL3261), zu transformieren. Es soll beachtet werden, daß dieser Mutantenstarum sowohl für PABA als auch für 2,3-DHB einen Ernährungsmarker aufweist. Es soll beachtet werden, daß eine andere bevorzugte Spezies von S. typhimurium recA-S. typhimurium ist, insbesondere Stamm Ty21a (17).
Es kann erwünscht sein, das M-Protein-Gen von einem virulenten Stamm von S. pyogenes zu erhalten. Es ist jedoch bevorzugt, das Gen von einem abgeschwächten, nicht-virulenten Stamm von S. pyogenes zu erhalten oder die Nukleotidsequenz, die für das erwünschte M- Protein kodiert, herzustellen.
Die rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren sind nicht zur Verwendung bei einer einzelnen Spezies oder einem einzelnen Stamm von Salmonellen beschränkt. Ganz im Gegenteil können die Vektoren breit angewendet und können in Wirtszellen anderer Gram-negativer Bakterien, wie z. B. der Gattung der Enterobacteriaceae (wie z. B. Shigella und Klebstella wie Klebstella pneumoniae; Enterobacter wie z. B. Enterobacter aerogenes), transformiert werden. Salmonellen, wie z. B. Salmonella arizona und Citrobacter können verwendet werden, wenn sie entsprechend nicht-virulent gemacht worden sind oder abgeschwächt wurden.
Herkömmliche Salmonellen-Spezies, die verwendet werden können, wenn sie abgeschwächt oder nicht-virulent gemacht worden sind, beinhalten die folgenden: S. paratyphi A, S. schottmulleri, S. typhimurium, S. paratyphi C, S. choleraesuis, S. montevideo, S. newport, S. typhi, S. enteritidis, S. gallinarum und S. anatum.
Es können als Wirt für die rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung auch Bakterien der Gattung Streptokokkus verwendet werden, die nicht-virulent sind oder die nicht-virulent gemacht wurden, oder abgeschwächt sind, einschließlich Streptokokken der immunologischen Gruppen A-O, aber im allgemeinen andere als A. Geeignete Streptokokken, die als bakterieller Wirt verwendet werden können, beinhalten S. cremoris, S. faecalis, S. salivarius, S. mitior, S. mitis, S. mutans und S. sanguis. Besonders bevorzugt ist S. mutans, der nicht-cariogen ist.
Weitere geeignete Mikroorganismen, die abgeschwächt und in Übereinstimmung mit der Erfindung transformiert werden können, sind bekannt (31).
Im allgemeinen kann jedes Darmbakterium als Wirtsbakterium dienen. Es ist bevorzugt, daß das Wirtsbakterium im Subjekt nur lange genug überlebt, um die opsonisierende Antwort hervorzurufen, aber im allgemeinen kann jeder Bakterienstamm, der so abgeschwächt worden ist, daß er nicht kolonisiert, sich jedoch noch immer bis zu einem begrenzten Grad vermehrt, verwendet werden, um Antikörper gegen das Protein-Antigen der vorliegenden Erfindung hervorzurufen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der aro&supmin;-Stamm von S. typhimurium verwendet, der zwei Metabolite benötigt, PABA und 2,3-DHB, die nicht in Geweben von Säugetieren gefunden werden. Infolgedessen sterben die inokulierten Bakterien nach mehreren Generationen aufgrund des Mangels an diesen Metaboliten.
Es kann jedoch jedes mutierte mikrobielle Agens mit einem metabolischen Defekt für Ernährungsverbindungen, die sich nicht im Gewebe des zu immunisierenden Subjektes befinden, oder jedes das durch genetische Manipulation so hergestellt ist, verwendet werden.
Es soll bemerkt werden, daß die Expression im nicht-virulenten aro&supmin;-Salmonella typhimurium SL3261, der mit einem Plasmid transformiert worden ist, das ein rekombinantes Hybridgen enthält, kodierend für ein Protein-Antigen, welches das M5-Protein-Molekül exprimiert, beinahe ausschließlich auf den zytoplasmatischen Raum des S. typhimurium beschränkt ist. Es ist einzigartig und unerwartet, daß ein immunogenes und schützendes Oberflächenantigen, wie z. B. das Streptokokken-M-Protein-Antigen im Zytoplasma des nicht-virulenten Wirtsbakteriums exprimiert wird.
Somit kann erkannt werden, daß die erwünschte Nukleotidsequenz, die für das Protein- Antigen kodiert und es exprimiert, welches wirksam opsonisierende und/oder schützende Antikörper gegen Streptokokken-Serotypen hervorruft, in eine Reihe von Wirten kloniert werden kann. In einem breiteren Sinne dessen muß der transformierte Wirt, in dem die Nukleotidsequenz nach Replikation gefunden wird, weder im Hinblick auf die Nukleotidsequenz heterolog sein, noch muß die Sequenz im Hinblick auf den Mikroorganismus heterolog sein.
In Übereinstimmung mit einer speziellen Ausführungsform des Verfahrens der Immunisierung eines warmblütigen Tieres ist gezeigt worden, daß a) perorale Verabreichung von bis zu 1,65 · 10&sup9; Mutanten nicht-virulenter Salmonellen, die das Plasmid pMK207 enthalten, was für ein Antigen des Serotyps M5 kodiert, von Mäusen gut vertragen wurden; b) Plasmid pMK207 sowohl in vitro als auch in vivo extrem stabil war; c) die Mäuse, die die höchste Dosis (10&sup9;) an Bakterie erhielten, die Mikroorganismen für so lange wie drei Wochen ohne Krankheitssymptome in der Leber trugen; d) die mit nicht-virulenten, transformierten Salmonellen, exprimierend das Gen, oral immunisierten Mäuse nach drei Wochen opsonisierende Serumantikörper gegen Serotyp-M 5-Streptokokken entwickelten; und e) die immunisierten Mäuse nach drei Wochen gegen intraperitoneale Behandlungen mit homologen Serotyp-M 15- (aber nicht der heterologen Serotyp M24-) Streptokokken geschützt waren.
Es ist erwähnenswert, daß keine kreuzreaktive Immunität beobachtet wurde, wenn die Zusammensetzung der Erfindung oral verabreicht wird. Die zytoplasmatische Expression des M- Protein-Antigens im nicht-virulenten Bakterium ist insbesondere für diese orale Verabreichung vorteilhaft. Das Antigen wird innerhalb des Zytoplasmas des nicht-virulenten Bakteriums vor den Magensäuren und anderen zerstörenden Agenzien geschützt, bis die nicht- virulente Zelle stirbt und das Antigen entläßt, gewöhnlich im Dünndarm, welches der bevorzugte Ort zur Abgabe des Antigens ist.
Das nicht-virulente Bakterium kann auch als ein Wirt für rekombinante DNA- Klonierungsvektoren, die Nukleotidsequenzen enthalten, die für die immunogenen Protein- Antigene der vorliegenden Erfindung kodieren und diese exprimieren, welche besonders wirksam sind, um Immunität gegen Streptokokken-Infektionen zu verleihen, und welche nicht mit menschlichen Gewebe-Antigenen, insbesondere solche des Herzens, kreuzreagieren, verwendet werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch parenteral verabreicht werden. Säugetiere, insbesondere Menschen, die parenteral mit einer ausreichenden Menge der therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung immunisiert worden sind, entwickeln opsonisierende und/oder schützende Antikörper, die gegen die Epitope des Hybrid-Streptokokken-M-Protein-Antigens gerichtet sind. Nicht-einschränkende Beispiele solcher parenteralen Wege der Verabreichung sind intrakutan und intramuskulär.
Zur intrakutanen Injektion in ein Säugetier wurden 100-300 ug des Hybrid-Antigens, in komplettem oder inkomplettem Freund'schen Adjuvans emulgiert, verabreicht. Eine Booster- Injektion mit ungefähr derselben Dosis in Salzlösung wurde ungefähr einen Monat später verabreicht. Es wurde vor der ersten Injektion und in zweiwöchigen Intervallen danach für acht Wochen Blut abgenommen.
Es wird auch ein topisches Verfahren zum Verabreichen zur Verfügung gestellt, nämlich intranasal.
Zur intranasalen Verabreichung erhielt ein Säugetier ungefähr 50 ug bis ungefähr 10 mg des gereinigten Antigens in einem zur Verabreichung geeigneten Verdünnungsmittel.
In Übereinstimmung mit der Erfindung kann die therapeutische Zusammensetzung einzeln in Serien oder vorteilhafterweise in einem Gemisch oder Cocktail von vielfachen Zusammensetzungen verabreicht werden, um ein breites Immunitätsspektrum gegen Gruppe A- Streptokokken hervorzurufen.
Andere Vorzüge der Erfindung werden durch die nicht-einschränkenden Materialien, Verfahren und Beispiele, die folgen, offensichtlich.

BEISPIEL 1

Reinigung von LT-B-M24-Hydridprotein.

Das rekombinante LT-B-M24-Protein wurde aus Zellextrakten von JM105 (tragend das pEC LT-B-M24), gewachsen über Nacht in einem Liter L-Flüssigmedium, versetzt mit 75 ug/ml Ampicillin, 25 ug/ml Streptomycin und 1 mM Isoproylthiogalactosid (IPTG, Bethesda Reserch Laboratories, Inc., Bethesda, MD), gereinigt. Die Zellen wurden bei 7.000Xg pelletiert und in 50 ml 100 mM Carbonatpuffer, pH 11, enthaltend 100 ug/ml Lysozym, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 100 ug/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma Chemical Co.), resuspendiert und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden bei 7.000Xg zentrifugiert und der Überstand gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Reinigung wurde durch Laden von 50 mg des Hybridprotein-Extrakts auf eine präparative Polyacrylamidgel-Elektrophorese-Einheit (Prep Cell, Modell 491, Bio Rad., Inc.) unter Verwendung einer 37 mm-Säule und einem 9 cm 11%igem Polyacrylamidgel durchgeführt. Es wurden sechs-ml-Fraktionen gesammelt und auf das Vorhandensein rekombinanten Proteins hin durch Western Blot-Analyse unter Verwendung eines Kaninchen-Antiserums gegen pep M24 (8) getestet. Die Fraktionen, die Aktivität enthielten, wurden vereinigt, dialysiert und lyophilisiert.

BEISPIEL 2

Immunisierung von Kaninchen.

Es wurden Kaninchen intrakutan mit 300 ug LT-B-M24- Protein, emulgiert in komplettem Freund'schen Adjuvans, immunisiert. Eine Booster- Injektion derselben Dosis in Salzlösung wurde vier Wochen später verabreicht. Es wurde vor der ersten Injektion und in zweiwöchigen Intervallen danach für acht Wochen Blut abgenommen.

BEISPIEL 3

Test auf M-Protein-Antikörper.

Die Kaninchenantiseren wurden auf das Vorhandensein von M-Protein-Antikörpern hin durch ELISA unter Verwendung von LT-B, pep M24 oder SM24 (1-29)C als feste Phasen-Antigene, wie zuvor beschrieben (30, 38), getestet. Opsonisierende Antikörper gegen Typ 24-Streptokokken wurden mit in vitro Opsonophagocytose-Tests (10) getestet. Kurz gesagt, 0,1 ml des Testserums wurden zu 50 ul einer Standardsuspension von Streptokokken zugefügt. Es wurden 0,4 ml heparinisiertes, nicht-immunes, normales menschliches Blut zugefügt und das Gemisch wurde kopfüber für 30 Minuten rotiert. Das Vorhandensein opsonisierender Antikörper wurde durch Zählen des Prozentsatzes Neutrophiler, die mit Streptokokken auf gefärbten Ausstrichen assoziiert waren (Prozentopsonisierung), bestimmt (10). Es wurden indirekte bakterizide Tests unter Verwendung des gleichen Gemisches, wie oben beschrieben, durchgeführt, mit dem Unterschied, daß weniger Streptokokken zugefügt wurden (9). Die Testgefäße wurden für drei Stunden rotiert und es wurden Plattengußtests unter Verwendung von 0,1 ml des Testgemisches in 5% Schafblut-Agar durchgeführt. Die CFU überlebender Streptokokken wurden nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC gezählt.

BEISPIEL 4

Test auf Herz-kreuzreaktive Antikörper.

Kaninchen-Antiseren gegen LT-B-M24 wurden auf das Vorhandesnsein von Herz-kreuzreaktiven Antikörpern hin durch indirekte Immunofluoreszenz-Tests und Verwendung dünner Schnitte (4u) von menschlichem Myocardium, wie zuvor beschrieben (28), durchgemustert.

BEISPIEL 5

Passive Protektionstests an der Maus.

Passive Protektionstests an der Maus wurden, wie zuvor beschrieben (9), durchgeführt. Kurz gesagt, Balb/c-Mäusen wurde intraperitoneal 0,5 ml Testserum injiziert und 24 Stunden später Mäusegruppen mit 10fachen Verdünnungen von Typ 24-Streptokokken intraperitonal behandelt. Es wurden Plattengußtests durchgeführt, um die CFU von Streptokokken, die jede Gruppe erhalten hatte, zu bestimmen. Der LD&sub5;&sub0; wurde unter Verwendung des Verfahrens von Reed und Muench (52) berechnet.

BEISPIEL 6

Test für M-Protein-Epitope, die mukosale Antikörper hervorrufen, die einen breiten Schutz gegen Infektion bieten.

Kaninchenantiseren wurden auf das Vorhandensein von Antikörpern hin, die einen breiten Schutz bieten, unter Verwendung passiver Protektionstests an der Maus (20) durchgemustert. Zuerst wurden Antiseren durch ELISA auf ihre Fähigkeit hin getestet, mit dem Oberflächen-M-Protein multipler heterologer Serotypen von Gruppe A- Streptokokken zu reagieren. Diejenigen, die M-Protein-Epitope in ihren nativen Konformationen erkannten, wurden dann verwendet, um Mäuse gegen intranasal verabreichte Infektionen passiv zu schützen. Die Antikörper wurden an virulente Streptokokken absorbiert und die Mäuse intranasal mit 10&sup7; CFU behandelt. An den darauffolgenden Tagen wurden Rachenkulturen erhalten und es wurden die Toten über die folgenden 14 Tage hinweg gezählt.
Durch die Beispiele ist gezeigt worden, daß die Antigene der vorliegenden Erfindung opsonisierende und/oder schützende Antikörper hervorrufen, die gegen Epitope der Antigene gerichtet sind und immunisierten Säugetieren gegen Gruppe A-Streptokokken Immunität verleihen. Die Antigene können vorteilhafterweise gemischt werden, um einen Cocktail zu bilden.

MATERIALIEN UND METHODEN

Konstruktion und Expression des LT-B-M24-Fusionsgens.

Plasmid pPX1604, das das Gen für LT-B enthält, wurde freundlicherweise von Robert Brey, Praxis Biologics, Rochester, NY., zur Verfügung gestellt. pPX1604 ist ein Derivat von pJC217 (16) und wurde modifiziert, um einen kleinen Polylinker mit drei Endonukleaserestriktionsschnittstellen am 3'-Ende zu erhalten, gefolgt von Transkriptionsterminatoren in jedem Leseraster (16). Die M24- Komponente des Hybridgens bestand aus einem Paar Oligonukleotide, die unter Verwendung eines automatischen DNA-Syntheseapparates (ABI, Modell 381A), synthetisiert wurden. Die Oligonukleotide kopierten die ersten 36 Basenpaare des emm24-Gens und beinhalteten die rechte Seite einer NcoI-Schnittstelle am 5'-Ende. Die Oligonukleotide wurden in äquimolaren Verhältnissen in Ligationspuffer gemischt, auf 65º erhitzt, und ihnen wurde ein Reassoziieren bei Raumtemperatur ermöglicht. Das Plasmid pPX1604 wurde mit NcoI und EcoRV verdaut und das geschnittene Plasmid aus einem Agarosegel über Glasmilch (Geneclean, Bio101, La Jolla, CA) gereinigt. Das synthetische M24-Oligonukleotidpaar wurde dann in die NcoI- und EcoRV-Schnittstellen von pPX1604 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um den E. coli-Stamm JM105 zu transformieren. Die Transformanten wurden auf Expression von M24 und LT-B hin durch Dot Blot-Analyse unter Verwendung von Kaninchenserum gegen ein synthetisches Peptid von M24, SM24 (1-29)C und Kaninchen-Antiserum gegen gereinigtes LT-B (16) durchgemustert. Das gereinigte LT-B wurde freundlicherweise von Dr. John Clements, Tulane University zur Verfügung gestellt.
Für einen hohen Expressionsgrad des Fusionsproteins wurde das LT-B-M24-Gen in pKK223- 3 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) eingeführt. Das Hybridgen wurde aus pPX1604 mit EcoRI und SalI herausgeschnitten und dann das Fragment durch Ausschneiden aus einem Agarosegel gereinigt. Klenow-Fragment (53) wurde verwendet, um die Enden der gereinigten DNA zu reparieren, die dann mit EcoRI geschnitten und in die EcoRI- und SmaI- Restriktionsenzymschnittstellen von pKK223-3 (53) ligiert wurde. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um JM105 zu transformieren und die Expression des LT-B-M24- Hybridproteins wurde durch Kolonien-Blots, wie oben beschrieben, detektiert. Ein positiver Transformant, der pKK223-3, das das Hybrid-LT-B-M24-Gen enthielt, trug (pEC. LT-B-M24) wurde zur Expression und Reinigung des rekombinanten Proteins selektiert.

DNA-Sequenzierung.

Das LT-B-M24-Gen wurde unter Verwendung doppelsträngiger Plasmid-DNA und ³²P-markierten dNTPs mit Hilfe des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens von Sanger (54) sequenziert. Synthetische Oligonukleotide, kopierend den Sense-Strang von pKK223-3 bei der EcoR1-Schnittstelle, Basen 289-303 des LT-B-Gens, und den Antisense- Strang bei der HindIII-Schnittstelle von pKK223-3, stellten Sequenzdaten zur Verfügung, die die Lage das Startcodons der LT-B-Komponente des Gens, die Position des M24- synthetischen Oligonukleotidpaares und der NcoI-Schnittstelle bestätigten.

ERGEBNISSE

Immunogenität von LT-B-M24-Hybridvroteinen.

Mit LT-B-M24 immunisierte Kaninchen entwickelten hohe Antikörper-Titer gegen LT-B, pep M24 und SM24 (1-12)C, wie durch ELISA (Tabelle 1) bestimmt wurde. Interessanterweise waren die Antikörper-Titer gegen das synthetische Peptid äquivalent zu denen gegen das native pep M24, was vermuten läßt, daß der Hauptanteil der M24-Antikörper durch die LT-B-M24-Hybrid-erkennenden M-Protein- Epitope im nativen Molekül hervorgerufen wurde. Immunseren von allen drei Kaninchen opsonisierten Typ 24-Streptokokken, was nahelegt, daß die M-Protein-Antikörper gegen schützende Epitope des Oberflächen-M-Proteins (Tabelle 1) gerichtet waren. Keines der Antiseren kreuzreagierte mit menschlichem Myocardialgewebe (Daten nicht gezeigt). In verschiedenen Intervallen nach der ersten Injektion von LT-B-M24 durchgeführte ELISAs offenbarten eine rasche Antikörperantwort in allen drei Kaninchen, selbst nach einer einzelnen intrakutanen Dosis von LT-B-M24 (Fig. 3).
Die gegen LT-B-M24 erzeugten Kaninchen-Antiseren enthielten typspezifische, bakterizide Antikörper gegen Typ 24-Streptokokken (Tabelle 2). Alle drei Antiseren zeigten signifikante bakterizide Aktivität gegen Typ 24-Streptokokken, welche in einigen Fällen äquivalent zu der war, die mit Antiserum gegen intaktes pep M24 beobachtet wurde. Keines der Antiseren hatte bakterizide Aktivität gegen Typ 5-Streptokokken, was vermuten läßt, daß die Typspezifität der M-24-Epitope im LT-B-M24-Hybridprotein (4) enthalten war. Passive Protektionsschutztests an der Maus, durchgeführt mit Antiseren von Kaninchen # 9146, ergaben, daß Antikörper gegen LT-B-M24 einen signifikanten Todesschutz zur Verfügung stellen, verglichen mit Serum vor der Immunisierung, nach intraperitonealer Behandlung mit Typ 24- Streptokokken (Tabelle 3). In einem getrennten Experiment betrug die LD&sub5;&sub0; der Typ 24- Streptokokken 1,5 · 10&sup5; CFU nach intraperitonealen Injektionen des präimmunen Serums, wobei der LD&sub5;&sub0; nach gegebenen LT-B-M24-Antiserum 2,5 · 106 war.
Es soll verstanden werden, daß die oben beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nicht limitierend sind und nur erläuternden Zwecken dienen und daß verschiedene Modifikationen oder Veränderungen in diesem Zusammenhang von einer auf dem Fachgebiet sachkundigen Durschnittsfachperson vorgeschlagen werden können und in den Geist und den Bereich dieser Anmeldung und den Schutzumfang der anhängenden Ansprüche aufgenommen sind. Tabelle 1. Immunogenität in Kaninchen gegen LT-B-M24-Hybridprotein. Tabelle 2. Typspezifische, bakterizide Antikörper, hervorgerufen in Kaninchen durch LT-B-M24-Hybridprotein.
* Präimmunseren wurden gleichmäßig für die Kontrolle vereinigt. Immunseren wurden 6 Wochen nach der ersten Injektion mit LT-B-M24 erhalte.
τ TNTC, zu zahlreich zum Zählen, was im allgemeinen > 2000 CFU bedeutet. Tabelle 3. Passiver Schutz von Mäusen, die intraperitoneal mit Typ 24-Streptokokken durch Antiserum gegen LT-B-M24-Hybridprotein behandelt wurden.
*Mäusen wurden 0,5 ml Serum i.p. verabreicht und 24 h später wurden sie i.p. mit virulenten Streptokokken behandelt. Tote wurden für eine Woche aufgezeichnet.
π Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Fisher-Exakt-Tests auf der MultiStat Software (Biosoft, Cambridge, UK) durchgeführt.

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Claims

1. Gereinigtes rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein Antigen, das einen an ein Aminosäurefragment fusionierten Träger umfaßt, wobei das Aminosäurefragment ein Epitop eines Serotyps von Gruppe A Streptokokken M Protein aufweist, das opsonisierende Antikörper gegen denselben Serotyp hervorruft, ohne kreuzreaktive Antikörper gegen Säuger-Herzgewebe Antigene hervorzurufen, wobei das Streptokokken M Protein M 1 ist.

2. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 1, wobei der Träger und das Fragment durch einen Aminosäuren umfassenden Linker in Tandem verbunden sind.

3. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 1, das mucosale Antikörper hervorruft.

4. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 1, wobei der Träger frei von einem Epitop ist, das Antikörper gegen einen Serotyp von Streptokokken M Protein hervorruft.

5. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 4, wobei der Träger die B-Untereinheit von E. coli labilem Toxin ist.

6. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 4, wobei der Träger der C-repeat-Teil eines Streptokokken M Proteins ist.

7. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 4, wobei der Träger der COOH-terminale Teil des Proteins ist.

8. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 2, wobei der Linker Pro-Gly-Asn-Pro-Ala-Val-Pro ist.

9. Rekombinantes Hybrid Streptokokken M Protein nach Anspruch 2, wobei der Linker His-Gly ist.

10. Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch von gereinigten Hybrid Streptokokken M Proteinen nach einem der Ansprüchen 1 bis 9.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Gemisch mindestens einen der Serotypen M3, M5, M6, M14, M18, M19, M24, M27 und M29 umfaßt.

12. Gereinigtes immunogenes rekombinantes Hybrid M Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei der Immunisierung eines Säugers gegen Streptokokken- Infektion.

13. Verwendung eines gereinigten immunogenen rekombinanten multivalenten Hybrid M Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Säugers gegen Streptokokken-Infektionen.

14. Rekombinantes DNA Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Hybrid M Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert.