DE60218327T2

DE60218327T2 - Inaktivierte immunogene bakterielle ganzzell-zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60218327T2
Application number: DE60218327T
Authority: DE
Inventors: Janakiraman Palo Alto RAMACHANDRAN; Sriram Padmanabhan; Bharathi Sriram
Original assignee: Gangagen Inc
Current assignee: Gangagen Inc
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2022-09-28
Also published as: ATE354370T1; JP4554206B2; JP2010180227A; US6913753B2; WO2003026690A1; US20030152589A1; ES2282460T3; CA2461710A1; JP2005508912A; EP1438066A4; MXPA04002866A; EP1438066B1; EP1438066A1; WO2003026690A9; DE60218327D1; CA2461710C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von inaktivierten immunogenen bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzungen, die dem lebenden infektiösen Pathogen sehr ähnlich, aber nicht infektiös sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der alarmierende Anstieg der bakteriellen Resistenz gegenüber verfügbaren Antibiotika, internationales Reisen und neu identifizierte Infektionserkrankungen unterstreichen den Bedarf an neuen wirksamen Impfstoffen. Inaktivierte Ganzzellen-Impfstoffe sind eine wichtige Komponente der aufkommenden Ansätze, um diesen Gesundheitsbedürfnissen der Öffentlichkeit gerecht zu werden. Die Verabreichung von Ganzzellen-Impfstoffen ist eines der am besten untersuchten Verfahren der Impfung gegen bakterielle Infektionen. Die besonderen Vorteile von Ganzzellen-Impfstoffen umfassen die Präsentation von vielen Antigenen (umfassend schützende, aber noch nicht definierte Antigene), minimale Wahrscheinlichkeit von Nebenwirkungen bei nicht parenteraler Verabreichung, kein Virulenzpotential und adjuvansähnliche Wirkung. Untersuchungen bei Tiermodellen und Menschen haben eine Immunogenität gezeigt, wenn die Ganzzellen-Impfstoffe oral oder parenteral verabreicht wurden. Wirksamer Schutz gegen respiratorische, enterische und systematische bakterielle Infektionen wurde ebenfalls nachgewiesen. Wenngleich bisher nur ein inaktivierter Ganzzellen-Pertussis-Impfstoff zur Immunisierung der breiten Öffentlichkeit eingesetzt wurde, weisen andere Ganzzellen-Impfstoffe das Potential für einen weltweiten Einsatz auf.
Es gibt nur zwei Grundtypen von Ganzzellen-Impfstoffen: attenuierte Lebendimpfstoffe und inaktivierte Impfstoffe. Die Eigenschaften von Lebendimpfstoffen und inaktivierten Impfstoffen sind verschieden, und diese Eigenschaften bestimmen, wie der Impfstoff eingesetzt wird.
Grundling et al., J. Bacteriol. 182 (21), 6082-6090 (Nov. 2000), beschreiben die genetische und biochemische Analyse von Dimer- und Oligomer-Wechselwirkungen von λ-S-Holin, einem kleinen Membranprotein, das die Innenmembran zu einem exakt geplanten Zeitpunkt nach der Infektion durchlässig macht und Endolysin den Zugang zu seinem Substrat ermöglicht, wodurch es zu einer Wirtszellenlyse kommt. Mindich et al., J Virol. 44 (3), 1013-1020 (Dez. 1982), beschreiben die Isolation von Nichtsinnmutanten eines lipidhaltigen PRD1-Bakteriophagen.
Attenuierte Lebendimpfstoffe
Attenuierte Lebendimpfstoffe werden durch die Modifizierung einer ("wilden") Bakterie, die eine Erkrankung hervorruft, im Labor hergestellt. Attenuierte Lebendimpfstoffe, die in den USA erhältlich sind, umfassen lebende Viren und lebende Bakterien. Diese wilden Viren oder Bakterien werden im Labor attenuiert, oder abgeschwächt, gewöhnlicherweise durch wiederholtes Kultivieren. Um eine Immunantwort hervorzurufen, müssen sich die attenuierten Lebendimpfstoffe in der geimpften Person replizieren (wachsen). Es wird eine relativ geringe Dosis von Viren oder Bakterien verabreicht, die sich im Körper repliziert und bis zu einem Volumen ansteigt, das ausreicht, um eine Immunantwort hervorzurufen. Alles, das den lebenden Organismus entweder in der Ampulle beschädigt (z.B. Hitze, Licht) oder die Replikation des Organismus im Körper beeinträchtigt (ein zirkulierender Antikörper), kann verursachen, dass der Impfstoff unwirksam wird. Wenngleich sich attenuierte Lebendimpfstoffe replizieren, verursachen sie gewöhnlicherweise keine Erkrankung, wie sie durch die natürlichen ("wilden") Organismen hervorgerufen werden kann. Wenn attenuierte Lebendimpfstoffe eine "Erkrankung" verursachen, ist sie gewöhnlicherweise viel schwächer als die natürliche Erkrankung und wird als Nebenreaktion bezeichnet. Die Immunantwort auf einen attenuierten Lebendimpfstoff entspricht praktisch exakt der, die durch eine natürliche Infektion hervorgerufen wird. Das Immunsystem unterscheidet nicht zwischen einer Infektion mit einem geschwächten Impfstoffbakterium und einer Infektion mit einem Wildtypbakterium. Attenuierte Lebendimpfstoffe sind im Allgemeinen, mit Ausnahme der oral verabreichten, nach einer Dosis wirksam.
Jedoch weisen attenuierte Lebendimpfstoffe einige Beschränkungen auf. Erstens können attenuierte Lebendimpfstoffe in der Folge von unkontrollierter Replikation (Wachstum) des Impfstoffvirus schwerwiegende oder tödliche Reaktionen hervorrufen. Das kommt nur bei Personen mit Immunschwäche (z.B. aufgrund von Leukämie, der Behandlung mit bestimmten Arzneimitteln oder einer HIV-Infektion) vor. Zusätzlich dazu kann ein attenuierter Lebendimpfstoff, abhängig von der Herstellungsweise des Impfstoffstamms, manchmal in seine ursprüngliche pathogene (krankheitserregende) Form rückmutieren. Bisher ist das nur bei Polio-Lebendimpfstoff bekannt. Aufgrund des Einflusses eines zirkulierenden Antikörpers auf das Impfstoffvirus kann es vorkommen, dass sich durch einen attenuierten Lebendimpfstoff keine aktive Immunität entwickelt. Antikörper aus einer beliebigen Quelle (z.B. transplazentare, Transfusions-) können das Wachstum des Impfstofforganismus beeinträchtigen und dazu führen, dass es zu keiner Antwort auf den Impfstoff kommt (auch als Impfversagen bezeichnet). Das Masernimpfstoffvirus scheint gegenüber zirkulierenden Antikörpern am empfindlichsten zu sein. Polio- und Rotavirusimpfstoffviren sind am wenigsten betroffen. Attenuierte Lebendimpfstoffe sind labil und können durch Hitze und Licht beschädigt oder zerstört werden. Sie müssen sorgfältig gehandhabt und gelagert werden. Derzeitig verfügbare attenuierte Lebendimpfstoffe umfassen Lebendviren-(Masern, Mumps, Röteln, Polio, Gelbfieber, Vaccinia und Varizellen) und zwei Lebendbakterienimpfstoffe (BCG und oraler Typhus).
Inaktivierte Impfstoffe
Inaktivierte Impfstoffe können entweder aus ganzen Viren oder Bakterien oder Bruchstücke von Viren oder Bakterien bestehen. Aus Bruchstücken bestehende Impfstoffe sind entweder auf Protein- oder auf Polysaccharidbasis. Impfstoffe auf Proteinbasis umfassen Toxoide (inaktivierte bakterielle Toxine) und Untereinheitenprodukte. Die meisten Impfstoffe auf Polysaccharidbasis bestehen aus reinem Zellwandpolysaccharid von Bakterien. Konjugierte Polysaccharidimpfstoffe sind jene, in denen das Polysaccharid chemisch an ein Protein gebunden ist. Diese Bindung macht aus dem Polysaccharid einen potenteren Impfstoff. Diese Impfstoffe werden durch das Kultivieren von Bakterien in einem Nährmedium, deren darauf folgende Inaktivierung mittels Hitze und/oder chemischen Substanzen (gewöhnlich Formalin) erzeugt. Im Fall von Impfstoffen aus Bruchstücken wird der Organismus weiter behandelt, um nur jene Komponenten zu reinigen, die in dem Impfstoff enthalten sein sollen (z.B. die Polysaccharidkapsel von Pneumokokkus).
Inaktivierte Impfstoffe sind tot und können sich nicht replizieren. Die gesamte Antigendosis wird durch die Injektion verabreicht (im Vergleich dazu stellen attenuierte Lebendimpfstoffe weitere "Dosen" durch ihre Replikation im Wirt bereit). Inaktivierte Impfstoffe können keine Erkrankung durch Infektion hervorrufen, auch nicht bei Personen, die an einer Immunschwäche leiden. Im Gegensatz zu lebenden Antigenen werden inaktivierte Antigene gewöhnlicherweise nicht durch zirkulierende Antikörper beeinträchtigt. Inaktivierte Impfstoffe können verabreicht werden, wenn ein Antikörper im Blut vorhanden ist (z.B. im Säuglingsalter oder nach dem Erhalt von Antikörper-hältigen Blutprodukten). Inaktivierte Impfstoffe erfordern immer mehrfache Dosen. Im Allgemeinen ruft die erste Dosis keine schützende Immunität hervor, sondern "zündet" das Immunsystem nur. Eine schützende Immunantwort entwickelt sich erst nach der zweiten oder dritten Dosis.
Im Gegensatz zu Lebendimpfstoffen, bei denen die Immunantwort der natürlichen Infektion sehr ähnlich ist, ist die Immunantwort auf einen inaktivierten Impfstoff zumeist humoral. Es entsteht nur eine geringe oder keine zellvermittelte Immunität. Die Antikörpertiter gegen inaktivierte Antigene sinken mit der Zeit. In der Folge ist es möglich, dass manche inaktivierten Impfstoffe regelmäßig zusätzliche Dosen erfordern, um die Antikörpertiter zu verstärken oder "aufzufrischen". In manchen Fällen ist es möglich, dass das Antigen, das für den Schutz gegen die Erkrankung eine wesentliche Rolle spielt, nicht definiert ist, was "Ganzzellen"-Impfstoffe erforderlich macht. Derzeit umfassen die verfügbaren inaktivierten Impfstoffe inaktivierte ganze Viren (Influenza, Polio, Tollwut, Hepatitis A) und inaktivierte ganze Bakterien (Pertussis, Typhus, Cholera, Pest). "Bruchstück"-Impfstoffe umfassen Untereinheiten (Hepatitis B, Influenza, Pertussis azellulär, Typhus Vi, Lyme-Borreliose), Toxoide (Diphtherie, Tetanus, Botulinumtoxin), reine Polysaccharide (Pneumokokken, Meningokokken, Haemophilus influenzae Typ b) und Polysaccharidkonjugate (Haemophilus influenzae Typ b und Pneumokokken).
Zusammengefasst ist anerkannt, dass die Immunantwort auf den Impfstoff umso besser ist, je ähnlicher der Impfstoff der natürlichen Erkrankung ist. Wenngleich attenuierte Impfstoffe in dieser Hinsicht am vielversprechendsten sind, besteht bei diesen das Risiko einer Erkrankung bei Wirten mit beeinträchtigtem Immunsystem und einer Rückmutation in pathogene Wildtyporganismen. Inaktivierte Impfstoffe vermeiden diese Probleme, können jedoch weniger wünschenswert sein, da diese Impfstoffe keine natürliche Infektion nachahmen und es vorkommen kann, dass diese die erforderliche Immunantwort nicht hervorrufen oder eine Immunantwort hervorrufen, die nicht so stark und schützend wie erwünscht ist.
Es besteht demnach auf dem Gebiet ein Bedarf an sicheren bakteriellen Impfstoffen, die dem infektiösen Organismus ähnlicher sind als die inaktivierten Impfstoffe, aber ein geringeres oder insignifikantes Risiko aufweisen, eine Erkrankung bei dem geimpften Individuum hervorzurufen. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit diesem Bedarf.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Inaktivierte immunogene bakterielle Ganzzellen-Zusammensetzungen, die durch die Infektion eines Bakteriums mit einem Lys-Minus-Bakteriophagen, dem das Protein Lysin fehlt, hergestellt wird, sind Teil der Erfindung. Lys-Minus-Bakteriophagen sind nicht in der Lage, eine wirksame Lyse des bakteriellen Wirts zu ermöglichen, da die enzymatische Aktivität des Lysins des Phagen für den enzymatischen Abbau der Peptidoglycanschicht der bakteriellen Zellwand erforderlich ist. Lys-Minus-Bakteriophagen behalten eine Aktivität bei der Infektion eines geeigneten bakteriellen Wirts, der Zerstörung des bakteriellen Genoms und der Replikation bei, die ausreicht, um das bakterielle Wachstum und die Replikation zu hemmen. Das resultierende Lys-Minus-infizierte Bakterium wird im Zustand der Bakteriostase bereitgestellt und ist nicht in der Lage, sich weiter zu replizieren (ist also beispielsweise "inaktiviert"). Das inaktivierte Bakterium kann dann eingesetzt werden, um eine Immunantwort zu prophylaktischen und/oder therapeutischen Zwecken hervorzurufen. Inaktivierte Bakterien, die angemessen für die Verwendung in immunogenen Zusammensetzungen zur Auslösung einer Immunantwort, z.B. zur Herstellung von Antikörpern in einem nicht-menschlichen Wirt, oder in einem bakteriellen Ganzzellen-Impfstoff formuliert sind, sind ebenfalls Teil der Erfindung.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Auslösung einer Immunantwort auf ein bakterielles Pathogen in einem Individuum bereit, das für die Infektion mit einer Erkrankung anfällig ist, die durch ein pathogenes Bakterium hervorgerufen wird, wobei die Zusammensetzung ein pathogenes Bakterium umfasst, das durch die Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktiviert ist, und das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um in dem Wirt eine Immunantwort auf das pathogene Bakterium auszulösen.
In einem weiteren Aspekt wird die Verwendung einer inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung für die Herstellung eines Impfstoffs zur Impfung eines Individuums gegen eine durch ein bakterielles Pathogen hervorgerufene Erkrankung bereitgestellt, wobei der Impfstoff das durch Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktivierte pathogene Bakterium umfasst und der Impfstoff in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um in dem Individuum eine Immunantwort auf das pathogene Bakterium auszulösen.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments bereit, das in einem Individuum eine Immunantwort auf ein Antigen auslöst, wobei die Zusammensetzung ein durch Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktiviertes Bakterium umfasst und das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um in dem Individuum eine Immunantwort auf ein in oder auf dem Bakterium vorhandenes Antigen auszulösen.
Die Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, die ein inaktiviertes Bakterium und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst, wobei das inaktivierte Bakterium durch die Infektion eines pathogenen Bakteriums mit einem Lys-Minus-Bakteriophagen erzeugt wird.
In spezifischen Ausführungsformen jedes der oben genannten Aspekte gehört das pathogene Bakterium zu einer aus der aus Mykobakterium, Staphylokokkus, Vibrio, Enterobacter, Enterokokkus, Escherichia, Hämophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Salmonella, Streptokokkus, Klebsiella und Yersinia bestehenden Gruppe ausgewählten Gattung, wobei der Bakteriophage das Wachstum der infizierenden Bakterien hemmt. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform jedes der oben genannten Aspekte ist der lysedefekte Bakteriophage ein Lys-Minus-Bakteriophage.
Es ist Teil der Erfindung, dass sie Verfahren zur Herstellung einer immunogenen bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung bereitstellt, die so inaktiviert ist, dass sie die Immunogenität oder Antigenität des Bakteriums beibehält, aber nicht ermöglicht, dass sich das Bakterium wiederherstellt, in dem Wirt repliziert und eine Infektion hervorruft.
Ein weiterer Teil der Erfindung ist, dass sie Verfahren und Zusammensetzungen zur Auslösung einer schützenden Immunantwort auf bakterielle Infektionen, insbesondere auf durch pathogene Bakterien hervorgerufenen Infektionen, bereitstellt.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass die durch die Infektion mit Lys-Minus-Bakteriophagen inaktivierten Bakterien nicht in der Lage sind, sich bei Entfernung von freien Bakteriophagen von der Bakteriostase zu erholen. Demnach bringen inaktivierte bakterielle Impfstoffe im Vergleich mit attenuierten Lebendimpfstoffen ein deutlich gesenktes Risiko mit sich, eine Erkrankung in dem geimpften Wirt hervorzurufen.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass das Antigen, gegen das eine Immunantwort erwünscht ist, wenn es in Phagen-inaktivierten Bakterien produziert wird, in Bezug auf die auf der Bakterienzelloberfläche vorhandenen Antigene oder in Bezug auf die als Einschluss- oder Aggregatkörper in Bakterien bereitgestellte Antigene, die durch das Immunsystem verarbeitet werden, z.B. nach der Phagocytose des Bakteriums durch einen Makrophagen, kaum modifiziert wird. Im Gegensatz dazu kann die chemisch induzierte bakterielle Inaktivierung zur Vernetzung der Oberflächenproteine und irreversiblen chemischen Modifikationen des Antigens führen.
Diese und andere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung durch das Lesen der Details der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und der Einsatzverfahren, die untenstehend umfassender beschrieben werden, erkennen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung, die die Verwendung eines bakteriellen Wirts, der ein Plasmid mit einem mutierten Lysin-Gen aufweist, für die Verwendung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lys-Minus-Bakteriophagen zeigt.
2 veranschaulicht die SDS-PAGE der durch die Plasmide pGMB011 und pGMB021 produzierten Genprodukte (Spur 1: pGMB011, nicht induziert; Spur 2: pGMB011, induziert; Spur 3: pGMB021, nicht induziert; Spur 4: pGMB021, induziert; Spur 5: 14-97-kDa-Marker).
3 veranschaulicht die PCR des pGMB021-Konstrukts, das für die Rekombinationsexperimente eingesetzt wird (Spur 1: GMB1/GMB2-Primer; Spur 2: GMB2/GMBS-Primer; Spur 3: Marker; Spur 4: GMBS/GMB6-Primer).
4 zeigt die PCR von trüben Plaques für ein GFP-Genprodukt (Spuren 1-5, 7, 8, 17 & 18: Pools, positiv für GFP-Genprodukt; Spuren 6, 11-16: Pools, negativ für GFP-Genprodukt; Spuren 9, 19: positive Kontrolle; Spuren 10,20: MG-Marker).
5 veranschaulicht die PCR von trüben Plaques für ein Lysin-GFP-Lysin-Genprodukt (Spuren 1-6: trübe Plaques Nr. 1, 2, 3, 4, 7, 8; Spur 7: positive Kontrolle für Lysin-GFP-Lysin-Produkt (Plasmid-DNA); Spur 8: MG-Marker; Spur 9: positive Kontrolle für Lysinprodukt (Plasmid-DNA); Spur 10: negative Kontrolle).
6 veranschaulicht rekombinante Phagenlysate, die auf einem E.-coli-Rasen gesprenkelt sind und verschiedene Ausmaße der Verunreinigung mit wilden Phagen oder ein vollständiges Fehlen von wilden Plaques aufweisen (Fleck Nr. 1: Lysat Nr. 11, das eine zählbare Zahl an wilden Plaques aufweist; Fleck Nr. 2: Lysat, das eine hohe Anzahl an wilden Plaques aufweist, die die Zellen vollständig lysiert haben; Fleck Nr. 3: Lysat, das keine wilden Plaques aufweist).
7 veranschaulicht rekombinante Phagen, die Lysate enthalten, die auf einem E.-coli-Rasen gesprenkelt sind und ein Fehlen von Plaques zeigen.
8 veranschaulicht Lysate, die rekombinante Phagen (RP) enthalten, was dazu führt, dass infizierte E.-coli-Zellen nicht mehr lebensfähig sind (Quadrant Nr. 1: ~ 50 % Verlust der Lebensfähigkeit mit RP-Lysat Nr. 33; Quadranten Nr. 2 & 4: vollständiger Verlust der Lebensfähigkeit bei RP-Lysaten Nr. 34 & Nr. 36; Quadrant Nr. 3: kein signifikanter Verlust der Lebensfähigkeit mit RP-Lysat Nr. 35).
Bevor die vorliegende Erfindung beschrieben wird, ist klarzustellen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die beschriebene Methodik, die beschriebenen Protokolle, Bakteriophagen, bakteriellen Pathogene, Tierspezies oder -gattungen, Konstrukte und Reaktanten beschränkt ist, da diese selbstverständlich variieren können. Es ist ebenfalls klar, dass die hierin verwendete Terminologie dem Zweck dient, nur bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben, und nicht einschränkend verstanden werden soll, da der Umfang der Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche eingeschränkt wird.
Wenn ein Bereich von Werten bereitgestellt wird, ist klar, dass jeder in diesem Bereich zwischen der oberen und unteren Grenze liegende Wert, bis zu einem Zehntel der Einheit der unteren Grenze, wenn es der Kontext nicht deutlich anders vorgibt, ebenfalls spezifisch offenbart ist. Jeder kleinere Bereich zwischen einem beliebigen angegebenen Wert oder einem Wert, der in einem angegebenen Bereich liegt, und einem anderen Wert, der angegeben ist oder in einem angegebenen Bereich liegt, ist Teil des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die Unter- und Obergrenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig in dem Bereich eingeschlossen oder aus diesem ausgeschlossen sein, und jeder Bereich, von dem eine der Grenzen, keine Grenze oder beide Grenzen Teil des kleineren Bereichs sind, sind ebenfalls Teil des Umfangs der Erfindung, vorbehaltlich von spezifisch ausgeschlossenen Grenzen in dem angegebenen Bereich. Wenn der angegebene Bereich eine oder beide Grenzen umfasst, sind Bereiche, die eine oder beide der eingeschlossenen Grenzen ausschließen, ebenfalls Teil der Erfindung.
Wenn nicht anders angegeben haben alle hierin verwendeten Fachbegriffe und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutung, wie sie von Fachleuten auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung verstanden wird. Wenngleich beliebige Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich sind oder entsprechen, bei der Praxis oder bei Tests der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben.
Es ist anzumerken, dass die hierin und in den beigefügten Ansprüchen verwendeten Singularformen "ein/e", "und" und "der/die/das" Pluralbezüge umfasst, wenn es der Kontext nicht klar anders vorgibt. Der Bezug auf "einen Bakteriophagen" umfasst beispielsweise eine Vielzahl solcher Bakteriophagen, und der Bezug auf "die Wirtszelle" umfasst den Bezug auf eine oder mehrere Wirtszellen und Äquivalente davon, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, usw.
Die hierin erläuterten Publikationen werden nur aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin ist als Eingeständnis auszulegen, dass die vorliegende Erfindung nicht das Recht hat, vor solchen Veröffentlichung aufgrund der früheren Erfindung datiert zu werden. Außerdem können sich die bereitgestellten Veröffentlichungsdaten von den eigentlichen Veröf fentlichungsdaten, die eine unabhängige Bestätigung erfordern können, unterscheiden.
DETAILLIERTERE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen für die Herstellung von inaktivierten Ganzzellen-Bakterien bereit, wobei die Bakterien unter Einsatz von Bakteriophagen hergestellt werden, die eine defektive Fähigkeit aufweisen, bakterielle Wirtszellen zu lysieren. Bakteriophagen sind hochspezifische Viren, die Bakterien infizieren. Nach der Infektion eines Bakteriums, wie z.B. E.coli, durch einen lytischen Phagen, wie z.B. T4, findet eine umfassende Neuordnung aller makromolekularer Synthesen statt. Die RNA-Polymerase (RNAP) des Wirtsbakteriums bindet an die Initiationsstellen des Phagen-Genoms, das als unmittelbar-frühe Gene (IE-Gene) bekannt ist, und transkribiert diese. Einige IE-Genprodukte zersetzen die (bakterielle) Wirt-DNA, der die modifizierte Base Hydroxymethylcytosin (HMC) fehlt, während ein anderes Produkt, ADP-Ribose, an die α-Untereinheiten der bakteriellen RNAP bindet und sie außer Stande setzt, die bakteriellen Zellpromotoren zu erkennen. Das führt zu einer Beendigung der Transkription der Wirtsgene. Dieses Ereignis tritt in den ersten 3 bis 5 min nach der Infektion ein.
In der nächsten Phase erkennt die modifizierte RNAP die sogenannten verzögertfrühen Gene (DE-Gene) und bindet an diese, wodurch die weitere Expression der IE-Gene des Phagen eliminiert wird. Die DE-Genprodukte sind an der Replikation des Phagengenoms unter Einsatz von zersetzten bakteriellen DNA-Basen beteiligt. Eines der Produkte der DE-Gene ist ein neuer Sigma-Faktor, der verursacht, dass die Wirts-RNAP nur die späten Gene (L-Gene) erkennt, die als nächste transkribiert werden sollen. Die späten Gene sind an der Synthese von neuen Kapsidproteinen, Schwänzen und Schwanzfasern der Assemblierung von Proteinen beteiligt, die alle erforderlich sind, um Nachkommenphagenpartikel zu bilden. Schließlich wird das Phagen-Lysozymgen aktiviert, was zur Lyse der bakteriellen Wirtszelle und der Freisetzung der Nachkommenphagen führt.
In den letzten zehn Jahren wurden die Schlüsselkomponenten für die Wirtslyse durch Bakteriophagen untersucht. Es ist nun anerkannt, dass zwei Proteine, ein Endolysin und ein Holin, erforderlich sind, damit es zu einer Wirtslyse kommen kann. Endolysine sind muralytische Enzyme, die sich in Cytosol ansammeln, und Holine sind kleine Membranproteine, die den Zugang der Endolysine zu der Zellwand durch die cytoplasmatische Membran steuern (Wang et al., Ann. Rev. Microbiol. 54, 799-825 (2000)). Diese Lyse-Genregion von Bakteriophage Lambda wurde in ein Plasmid mit hoher Kopienzahl kloniert, pBH20, unter der Transkriptionskontrolle des Lac-Operators, und die Induktion dieses "Lyse-Operons" führte zu einem lytischen Verhalten parallel zu dem der mit Bakteriophagen infizierten Zellen (J. Garrett et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981)). Die beiden Lyse-Gene cph1 und cpl1 des Streptokokkus-pneumoniae-Bakteriophagen Cp-1, die für Holin bzw. Lysin kodieren, wurden kloniert und in E. coli exprimiert (Martin et al., J. Bacteriol. 180, 210(1998)). Die Expression des Cph1-Holins führte zum Tod, aber nicht zur Lyse der bakteriellen Zellen. Die gleichzeitige Expression von Holin und Lysin des Phagen Cp-1 in E. coli führte zu Zelllyse. Außerdem war das cph1-Gen in der Lage, die λ-Sam-Mutation (die eine Amber-Mutation in dem Holin-Gen trägt) in dem nicht-supprimierenden E.-coli-HB101-Stamm zu ergänzen, um Phagennachkommen freizusetzen. Die regulierte Expression der Lambda-Phagen-Lysegene S und R führt zu einer dramatischen Lyse der Zellen von Vibrio chloreae und Salmonella enterica serovar Typhimurium (Jain et al., Infect. Immun. 68, 986 (2000)).
Die vorliegende Erfindung nutzt Bakterien, die inaktiviert sind (z.B. nicht in der Lage sind, sich zu replizieren, um eine Infektion in einem Wirt zu unterstützen), wobei die Bakterien durch eine Infektion mit spezifischen Bakteriophagen, denen eine oder mehrere Komponenten des Phage-Lyse-Systems fehlt, inaktiviert sind. Der modifizierte Phage tritt in den bakteriellen Wirt ein, unterbricht die makromolekularen Synthesen des Wirts, repliziert sich, aber lysiert den bakteriellen Wirt nicht. Die phagen-infizierten Bakterien sind inaktiviert und nicht in der Lage, die Infektion zu verbreiten, sondern halten die Antigen-Epitope auf der Zelloberfläche in einer im Wesentlichen nativen Konformation und Konfiguration oder exprimieren das Antigen als einen Einschlusskörper oder in einer Aggregatform, die dann durch das Immunsystem verar beitet werden können, z.B. nach der Phagocytose des Bakteriums durch einen Makrophagen. Die phagen-infizierten Bakterien weisen im Wesentlichen dieselbe Immunogenität wie das lebende Pathogen auf und lösen deshalb eine schützende Immunantwort gegen das bakterielle Pathogen aus. Die inaktivierten Bakterien der vorliegenden Erfindung sind deshalb beispielsweise für das Auslösen einer Immunantwort gegen ein Antigen von Interesse wirksam, z.B. für die Herstellung von Antikörpern in einem nicht-menschlichen Tier, als bakterieller Ganzzellen-Impfstoff und dergleichen.
Spezifische Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun detaillierter beschrieben.
Definitionen
Unter "Bakteriophage" und "Phage" (diese Bezeichnungen werden hierin synonym verwendet) versteht man eine beliebige Vielfalt an Viren, die eine spezifische Affinität zu Bakterien aufweisen und diese infizieren. Diese umfassen demnach Coliphagen, die Escherichia coli infizieren (z.B. Lampda-Phage und die geradzahligen T-Phagen T2, T4 und T6). Phagen bestehen im Allgemeinen aus einer Proteinhülle oder einem Proteinkapsid, die/das das genetische Material, DNA oder RNA, umschließt, das bei einer Infektion in das Bakterium injiziert wird. Bei virulenten Phagen wird die gesamte Synthese von DNA, RNA und Proteinen des Wirts beendet, und das Phagen-Genom wird eingesetzt, um die Synthese der Nucleinsäuren und Proteine des Phagen unter Einsatz des Transkriptions- und Translationsapparats des Wirts zu steuern. Diese Phagen-Komponenten setzen sich dann selbst zusammen, um neue Phagen-Partikel zu bilden. Die Synthese eines Phagen-Lysozyms führt zur Zerstörung der bakteriellen Zellwand, wodurch typischerweise 100-200 Phagen-Nachkommen freigesetzt werden. Die temperenten Phagen, wie z.B. Lamda-Phagen, können diesen lytischen Zyklus auch aufweisen, wenn sie eine Zelle infizieren, aber häufiger rufen sie Lysogenie hervor, wobei sich der Phage in die DNA des bakteriellen Wirts integriert, um als Prophage fortzubestehen. Im Allgemeinen sind die Bakteriophagen, die für die vorliegende Erfindung von Interesse sind, eher lytische Phagen als temperente Phagen.
Unter "Lys-Minus-Phage" oder "Lys-Minus-Bakteriophage", wobei diese Bezeichnungen hierin synonym verwendet werden, versteht man einen Phagen, dem Lysin-Protein fehlt. Lys-Minus-Bakteriophagen sind nicht in der Lage, eine wirksame Lyse des bakteriellen Wirts zu erleichtern, da die enzymatische Aktivität des Lysins des Phagen erforderlich ist, um die Peptidoglycan-Schicht der bakteriellen Zellwand abzubauen. Lys-Minus-Bakteriophagen behalten ihre Aktivität bei der Infektion eines angemessenen bakteriellen Wirts, bei der Zerstörung des bakteriellen Genoms und bei der Replikation bei, wobei diese ausreicht, um das Wachstum und die Replikation des Bakteriums zu verhindern. Lys-Minus-Phagen umfassen jene, die durch Mutation oder Deletion des Gens, das für das Lysin des Phagen-Lyse-Systems kodiert, hergestellt werden. Lys-Minus-Phagen umfassen Phagen, denen Lysin fehlt, und zwar aufgrund einer Deletion aller oder eines Teils der für Lysin kodierenden Nucleinsäuren, so dass kein nachweisbares Lysin mehr hergestellt wird oder eine trunkierte Form von Lysin produziert wird, die eine gesenkte Aktivität bei der Erleichterung der Lyse aufweist (z.B. ist trunkiertes Lysin für die Unterstützung einer wirksamen Lyse des bakteriellen Wirts nicht wirksam und erleichtert eine beliebige nachweisbare, durch Lysin des Wildtyps hervorgerufene Lyse-Aktivität ebenfalls nicht). Lys-Minus-Phagen umfassen auch jene, in denen eine für Lysin kodierende Nucleinsäure operabel so an einen induzierbaren Promotor gebunden ist, dass Lysin in einer Menge produziert wird, die wirksam ist, nur dann eine Lyse zu induzieren, wenn ein Wirkstoff vorhanden ist, der den induzierbaren Promotor aktiviert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Induktor um einen, der normalerweise nicht in einem Wirt vorhanden ist, der unter Einsatz des Phagen behandelt werden soll, z.B. ist der Induktor kein Wirkstoff, der bei einem zu behandelnden Wirt endogen ist.
Lys-Minus-Phagen umfassen ebenfalls Phagen, die modifiziertes Lysin-Protein produzieren, wobei das Lysin die bakterielle Lyse aufgrund des Vorhandenseins von einer oder mehreren Mutationen nicht fördern kann. Solche Mutationen umfassen zumindest eine oder eine beliebige Kombination von einer oder mehreren der folgen den: Nucleinsäuredeletionen, -substitutionen, -additionen oder -insertionen, die zu einer Veränderung der entsprechenden Aminosäuresequenz des Lysin-Proteins, für das kodiert wird, führen. Demnach umfassen die Lys-Minus-Phagen im Allgemeinen Phagen, in denen das Lysin-Gen vollständig oder teilweise deletiert oder auf andere Weise modifiziert ist (z.B. durch Addition, Substitution oder Ersatz der kodierenden Nucleotide), um eine gesenkte oder im Wesentlichen keine Expression von funktionellem Lysin bereitzustellen. Lys-Minus-Phagen können auch hergestellt werden, indem die Lysin-Funktion in einem Wirt durch die Expression von interferierender RNA (z.B. Antisense-RNA) oder die Produktion von inhibierenden Peptiden in der Wirtszelle verhindert wird, wobei die interferierende RNA oder die inhibierenden Peptide durch diese Zelle (z.B. von einer genetisch modifizierten bakteriellen Wirtszelle) oder durch eine Phagen-Nucleinsäure hergestellt werden können.
"Inaktiviert" bedeutet im Zusammenhang mit inaktivierter Bakterienzelle, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde, dass die Bakterienzelle sich in einem Zustand irreversibler Bakteriostase befindet. Während das Bakterium seine Struktur – und somit beispielsweise die Immunogenität, Antigenität und/oder Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen eines Bakteriums des Wildtyps – beibehält, ist es aufgrund der Gegenwart eines infizierenden Phagen in der Bakterienzelle nicht in der Lage, sich zu replizieren.
"Isoliert" bedeutet, dass zumindest 60 Gew.-% des Materials frei von Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen es in seiner natürlichen Form verbunden ist. Vorzugsweise sind es zumindest 75 Gew.-%, noch bevorzugter zumindest 90 Gew.-% und besonders bevorzugt zumindest 99 Gew.-%, des Materials von Interesse. "Isoliert" umfasst somit Präparate, die mit dem erwünschten Material angereichert sind.
Die Bezeichnungen "Polynucleotid" und "Nucleinsäure", die hierin synonym verwendet werden, beziehen sich auf polymere Formen von Nucleotiden einer beliebigen Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxynucleotide. Diese Bezeichnungen umfassen demnach folgende, sind aber nicht auf diese beschränkt: einzel-, doppel- oder mehrsträngige DNA oder RNA, genomische DNA, cDNA, DNA-RNA-Hybride oder ein Polymer, das Purin- und Pyrimidin-Basen oder andere natürliche, chemisch oder biochemisch modifizierte, nicht natürliche oder derivatisierte Nucleotidbasen umfasst.
Die Bezeichnungen "Polypeptid" und "Protein", die hierin synonym verwendet werden, beziehen sich auf eine polymere Form von Aminosäuren mit einer beliebigen Länge, die kodierte und nicht-kodierte Aminosäuren, chemisch oder biochemisch modifizierte (z.B. Posttranslationsmodifikationen, wie z.B. Glykosylierung) und derivatisierte Aminosäuren, polymere Polypeptide und Polypeptide mit modifizierten Peptid-Gerüst umfassen können. Die Bezeichnung umfasst Fusionsproteine, die Fusionsproteine mit einer heterologen Aminosäuresequenz, Fusionen mit heterologen und homologen Leader-Sequenzen mit oder ohne N-terminale Methioninreste; immunologisch markierte Moleküle und der gleichen umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Bezeichnung "rekombinantes Polynucleotid" bezeichnet wie hierin verwendet ein Polynucleotid mit genomischem, cDNA-, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, das aufgrund seines Ursprungs oder von Manipulation: (1) nicht mit dem gesamten oder einem Teil eines Polynulceotids verbunden ist, mit dem es in der Natur verbunden ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid als mit jenem verbunden ist, mit dem es in der Natur verbunden ist, oder (3) in der Natur nicht vorkommt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und andere Bezeichnungen, die sich auf Mikroorganismen oder höhere eukaryotische Zellen beziehen, die als einzellige Gruppen gezüchtet werden, beziehen sich auf Zellen, die als Rezipienten für einen rekombinanten Vektor oder andere Transfer-DNA eingesetzt werden oder wurden, und umfassen die Nachkommen der ursprünglichen Zelle, die transfiziert wurde. Es ist klar, dass es sein kann, dass die Nachkommen einer einzigen parentalen Zelle aufgrund von natürlicher, zufälliger oder absichtlicher Mutation nicht notwendigerweise vollständig mit der Morphologie oder dem genomischen DNA-Komplement oder dem gesamten DNA-Komplement der ursprünglichen parentalen Zelle übereinstimmen.
"Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, wobei die so beschriebenen Komponenten so miteinander in Verbindung stehen, dass sie so funktionieren können, wie sie sollen. Eine Kontrollsequenz, die an eine kodierende Sequenz "operabel gebunden" ist, ist so mit dieser ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erfolgt, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Ein "offener Leseraster" (ORF) ist eine Region einer Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert; diese Region kann einen Teil einer kodierenden Sequenz oder eine vollständige kodierende Sequenz darstellen.
Eine "kodierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in mRNA transkribiert und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie von angemessenen regulierenden Sequenzen gesteuert wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startcodon an einem 5'-Ende und ein Translations-Stoppcodon an einem 3'-Ende bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann mRNA, cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen umfassen, ist aber nicht auf diese beschränkt.
"Heterolog" bezeichnet Materialien, die von verschiedenen Quellen stammen (z.B. von verschiedenen Genen, verschiedenen Spezies etc.).
"Transformation" bezieht sich wie hierin verwendet auf das Insertieren eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von dem für die Insertion eingesetzten Verfahren, beispielsweise direkte Aufnahme, Transduktion, f-Paarung oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als nicht-integrierter Vektor beibehalten werden, beispielsweise als Plasmid, oder kann alternativ dazu in das Wirtsgenom integriert werden.
Die Bezeichnungen "Individuum", "Person", "Wirt" und "Patient" werden hierin synonym verwendet und beziehen sich auf ein beliebiges Individuum, das eine bakterielle Infektion aufweist, die unter Einsatz der therapeutischen Bakteriophagen der vor liegenden Erfindung behandelt werden kann, und das behandelt oder therapiert werden soll. Säugetierindividuen und -patienten, insbesondere menschliche Individuen oder Patienten, sind von besonderem Interesse. Andere Individuen können Rinder, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Pferde usw. umfassen.
Die Bezeichnungen "Behandlung", "Behandeln", "behandeln" und dergleichen werden hierin verwendet, um allgemein auf das Erhalten einer erwünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Wirkung zu verweisen. Die Wirkung kann prophylaktisch sein und eine Erkrankung oder deren Symptome vollständig oder teilweise verhindern und/oder therapeutisch sein und eine Erkrankung und/oder mit dieser in Zusammenhang stehende Nebenerscheinungen teilweise oder vollständig stabilisieren oder heilen. "Behandlung" bezieht sich wie hierin verwendet auf eine beliebige Behandlung einer Erkrankung eines Individuums, insbesondere eines Säugetier-Individuums, insbesondere eines Menschen, und umfasst: (a) Prävention des Auftretens einer Erkrankung oder eines Symptoms bei einem Individuum, das veranlagt ist, die Erkrankung oder das Symptom zu entwickeln, wobei diese aber noch nicht diagnostiziert wurden; (b) Verhindern der Erkrankung/des Symptoms, d.h. Beenden seiner Entwicklung; oder Lindern der Erkrankung/des Symptoms, d.h. Hervorrufen des Rückgangs der Erkrankung oder des Symptoms.
"Infizierendes Bakterium" bezeichnet ein Bakterium, das eine Infektion im Wirt hervorgerufen hat und das mit einer Erkrankung oder daraus folgenden unerwünschten Symptomen in Verbindung gebracht werden kann. Im Allgemeinen sind infizierende Bakterien pathogene Bakterien.
"Arzneimittel-resistente Bakterien" oder "Antibiotika-resistente Bakterien" bezeichnen einen Bakterienstamm, der gegen die Wachstumshemmung oder das Abtöten durch ein Antibiotikum resistent ist. Gegen mehrere Arzneimittel resistente Bakterien sind gegen zwei oder mehrere Antibiotika resistent. Arzneimittelresistenz kann beispielsweise dazu führen, dass die infizierenden Bakterien nur unwirksam abgetötet werden, so dass zumindest eine infektiöse Dosis in dem Individuum verbleibt und die In fektion nicht beendet wird, wodurch es zu einem Fortbestehen der Symptome der damit in Zusammenhang stehenden Infektionserkrankung oder späteren Anzeichen solcher Symptome kommt. Arzneimittelresistenz kann auch dazu führen, dass das Wachstum der Arzneimittel-resistenten Bakterien solange gehemmt wird, bis die Therapie beendet wird, wonach die Bakterien erneut beginnen, sich zu replizieren, und die Infektionserkrankung weiter besteht.
Mit "Hemmung des bakteriellen Wachstums" ist im Zusammenhang mit der Infektion einer bakteriellen Zelle mit einem Lys-Minus-Bakteriophagen gemeint, dass der Bakteriophage nach der Infektion der Bakterien die normalen Transkriptions- und/oder Translationsmechanismen der bakteriellen Wirtszelle hemmt oder diese beeinträchtigt, so dass die infizierten Bakterien keine wesentliche Zellteilung (Replikation) erfahren und in einen Zustand der Bakteriostase gebracht werden.
Die Bezeichnung "schützende Immunität" bedeutet, dass eine Vakzine, eine immunogene Zusammensetzung oder ein Immunisierungsplan, die/der einem Säugetier verabreicht wird, eine Immunantwort hervorruft, die die Entwicklung einer Erkrankung, die durch ein pathogenes Bakterium ausgelöst wird, verhindert oder verzögert oder die Schwere der Erkrankung senkt oder die Symptome der Erkrankung verringert oder gänzlich eliminiert.
Die Phrase "in einer ausreichenden Menge, um eine Immunantwort auf die in dem Präparat vorhandenen Epitope auszulösen", bedeutet, dass ein nachweisbarer Unterschied zwischen dem vor und dem nach der Verabreichung eines bestimmten Impfstoffpräparats oder einer immunogenen Zusammensetzung gemessenen Immunantwortindikator besteht. Immunantwortindikatoren umfassen folgende, sind aber nicht auf diese beschränkt: Antikörpertiter oder -spezifizität wie durch einen Test, wie z.B. eine enzymgekoppelte Immunbestimmung (ELISA), bakterizide Tests, Durchflusszytometrie, Immunfällung, Ouchter-Lowngy-Immundiffusion nachgewiesen; Bindungsnachweistests beispielsweise in Bezug auf Flecken-, Western-Blotting- oder Antigenanordnungen; Cytotoxizitätstests etc.
Die Bezeichnungen "immunogene bakterielle Zusammensetzung", "immunogene Zusammensetzung" und "Impfstoff' werden hierin synonym verwendet und bezeichnen ein Präparat, das in der Lage ist, eine zelluläre und/oder humorale Immunantwort in einem Individuum hervorzurufen, wenn sie/es in ausreichender Menge verabreicht wird, um eine Immunantwort auf Epitope hervorzurufen, die in dem Präparat vorhanden sind.
Ein "Oberflächen-Antigen" ist ein Antigen, das in der Oberflächenstruktur einer bakteriellen Zelle (z.B. äußere Membran, innere Membran, Periplasma, Kapsel, Pili etc.) vorhanden ist.
Die Bezeichnung "immunologisch naiv" in Bezug auf ein bestimmtes bakterielles Pathogen bezieht sich auf ein Individuum (z.B. ein Säugetier, wie z.B. einen menschlichen Patienten), das einem spezifischen bakteriellen Pathogen oder einer von solchen Bakterien abgeleiteten Antigen-Zusammensetzung noch nie (durch Infektion oder Verabreichung) in ausreichenden Mengen ausgesetzt war, um eine schützende Immunität aufzubauen, oder das trotz Exposition nicht in der Lage war, eine schützende Immunantwort zu bilden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Antikörper" auf ein Polypeptid oder eine Polypeptidgruppe, die zumindest eine Antikörperkombinationsstelle umfasst. Eine "Antikörperkombinationsstelle" oder "Bindungsstelle" wird durch die Faltung von variablen Domänen eines Antikörper-Moleküls/von Antikörper-Molekülen zur Bildung von dreidimensionalen Bindungsstellen mit einer inneren Oberflächenform und Ladungsverteilung, die komplementär zu den Merkmalen eines Epitops oder Antigens sind, gebildet, wodurch eine Immunreaktion mit dem Antigen ermöglicht wird. Eine Antikörperkombinationsstelle kann durch eine Schwerketten- und/oder eine Leichtkettendomäne (V_H bzw. V_L) gebildet werden, die hypervariable Schleifen bilden, die zur Antigen-Bindung beitragen. Die Bezeichnung "Antikörper" umfasst beispielsweise Vertebraten-Antikörper, Hybrid-Antikörper, chimäre Antikörper, veränderte Antikörper, einwertige Antikörper, Fab-Proteine und Einzeldomänen-Antikörper.
Ein "Anti-Idiotyp"-Antikörper ist eine Antikörperart, die die Struktur eines Antigens nachahmt, für das ein anderer Antikörper spezifisch ist.
Bakteriophagen für die Herstellung von Lys-Minus-Bakteriophagen für die Verwendung zur Herstellung von inaktivierten bakteriellen Vakzinen
Ein Lys-Minus-Phage, der für die Herstellung von inaktivierten Bakterien wirksam ist, die wiederum in erfindungsgemäßen Impfstoffen zweckdienlich sind, kann ausgehend von einem beliebigen Wildtyp-Bakteriophagen, vorzugsweise von einem lytischen Phagen, hergestellt werden. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können demnach auf die Entwicklung eines beliebigen aus einer Vielfalt von Lys-Minus-Bakteriophagen, die für eine Vielzahl von Bakterien spezifisch sind, eingesetzt werden und sind demnach für die Behandlung einer Vielzahl von bakteriellen Infektionen wirksam. Während in Betracht gezogen wird, dass die vorliegende Erfindung eingesetzt werden kann, um eine Vielzahl von bakteriellen Ganzzellen-Impfstoffen herzustellen, wobei diese Impfstoffe prophylaktisch und therapeutisch sowie einzeln oder in Verbindung mit anderen Therapien (beigeordnete oder eigenständige) für bakterielle Infektionen eingesetzt werden können.
Die Entwicklung von Vakzinen für klinisch bedeutende Bakterienspezies und -stämme, insbesondere Arzneimittel-resistente Bakterienspezies und -stämme, sind von besonderem Interesse. Beispiele für solche Bakterien sind untenstehend aufgelistet. Die Zugangsnummern der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Md.) für einen beispielhaften Bakteriophagen des Wildtyps, der die entsprechenden klinisch relevanten Stämme infiziert, werden nach dem Stamm, den er infiziert, angeführt. Solche Phagen sind Beispiele für jene, die modifiziert werden können, um Lys-Minus zu sein und erfindungsgemäße Bakteriophagen bereitzustellen. Die Liste sieht wie folgt aus:

1. Alle klinisch bedeutsamen Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie, die folgende umfasst, aber nicht auf diese beschränkt ist: a. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Escherichia, wobei E. coli von besonderem Interesse ist (ATCC-Phage Nr. 23723-B2); b. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Klebsiella, wobei K. pneumoniae (ATCC-Phage Nr. 23356-B1) von besonderem Interesse ist; c. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Shigella, wobei S. dysenteriae von besonderem Interesse ist (ATCC-Phage Nr. 11456a-B1); d. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Salmonella, umfassend S. abortusequi (ATCC-Phage Nr. 9842-B1), S. typhi (ATCC-Phage Nr. 19937-B1), S. typhimurium (ATCC-Phage Nr. 19585-B1), S. newport (ATCC-Phage Nr. 27869-B1), S. paratyphi-A (ATCC-Phage Nr. 12176-B1), S. paratyphi-B (ATCC-Phage Nr. 19940-B1), S. potsdam (ATCC-Phage Nr. 25957-B2) und S. pollurum (ATCC-Phage Nr. 19945-B1); e. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Serratia, insbesondere S. marcescens (ATCC-Phage Nr. 14764-B1); f. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Yersinia, insbesondere Y. pestis (ATCC-Phage Nr. 11953-B1); g. Alle klinisch bedeutsamen Stämme von Enterobacter, insbesondere E. cloacae (ATCC-Phage Nr. 23355-B1);
2. Alle klinisch bedeutsamen Enterococci, insbesondere E. faecalis (ATCC-Phage Nr. 19948-B1) und E. faecium (ATCC-Phage Nr. 19953-B1);
3. Alle klinisch bedeutsamen Haemophilus-Stämme, insbesondere H. influenzae (beispielhafte Phagen können von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) oder anderen Laboratorien erhalten werden, die sie allgemein erhältlich machen);
4. Alle klinisch bedeutsamen Mycobacteria, insbesondere M. tuberculosis (ATCC-Phage Nr. 25618-B1), M. avium-intracellulare, M. bovis und M. leprae (beispielhafte Phagen sind allgemein von der WHO, über The National Institute of Public Healthy & Environmental Protection, Bilthoven, Niederlande, erhältlich);
5. Neisseria gonorrhoeae und N. meningitidis (beispielhafte Phagen können allgemein von der WHO und anderen Quellen erhalten werden);
6. Alle klinisch bedeutsamen Pseudomonads, wobei P. aeruginosa von besonderem Interesse ist (ATCC-Phage Nr. 14203-B1);
7. Alle klinisch bedeutsamen Staphylococci, wobei S. aureus (ATCC-Phage Nr. 27690-B1) und S. epidermis (beispielhafte Phagen sind allgemein über die WHO und das Colindale Institute in London erhältlich) von besonderem Interesse sind;
8. Alle klinisch bedeutsamen Streptococci, wobei S. pneumoniae von besonderem Interesse ist (beispielhafte Phagen können allgemeine von der WHO und anderen Quellen erhalten werden); und
9. Vibrio cholera (Phage Nr. 14100-B1).

Zusätzliche bakterielle Pathogene, die zu zahlreich sind, um hier erwähnt zu werden, insbesondere jene, die Arzneimittel-Resistenz entwickelt haben, können ebenfalls durch eine Therapie gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Kurz gesagt, können alle bakteriellen Infektionen, die durch Bakterien hervorgerufen werden, für die der entsprechende Phage verfügbar ist oder identifiziert werden kann, unter Einsatz der vorliegenden Erfindung behandelt werden, indem der entsprechende Phage Lys-Minus gemacht wird und die Bakterien mit dem Lys-Minus-Phagen kontaktiert werden.
Neue Phagen können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingesetzt werden. Solche neuen Phagen werden fortlaufend durch Standardverfahren aus Krankenhausabwasser und anderen Quellen isoliert. Typischerweise werden 9 ml Abwasser mit 1 ml 10 X LB-Bouillon gemischt, 0,1 ml Übernacht-LB-Bouillon-Schüttelkultur-Wachstum des Zielbakterienstamms werden zugesetzt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Chloroform (0,1 ml) wird zugesetzt und 15 min lang unter Schütteln bei 300 U/min bei 37 °C inkubiert. Das Ergebnis wird dann bei 14.000 U/min 20 min lang bei 4 °C zentrifugiert, und der Überstand wird in sterilen Eppendorf-Röhrchen gelagert. Diese rohen Phagen-Präparate werden dann nach Bedarf weiter gereinigt und charakterisiert.
Phagen-Lysine
Die Lyse der bakteriellen Wirtszelle durch viele Bakteriophagen-Arten hängt von zumindest zwei verschiedenen Protein-Sätzen ab (Young et al., Microbiol. Rev. 56, 430 (1992)). Der Abbau der bakteriellen Zellwand erfolgt durch die Lysine. Die am besten untersuchten Beispiele sind das T4-e-Genprodukt, ein Lysozym (Tsugita et al., J. Biol. Chem. 243, 391 (1968)) und das Lambda-R-Protein, eine Transglykosylase (Garrett et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981)). Die Lysin-Gene einer Vielzahl von Bakteriophagen wurden in den letzten 10 Jahren identifiziert und charakterisiert. Diese umfassen die Lysine von Bakteriophage T7 (Inouye et al., Biol. Chem. 248, 7247 (1973), gp 19 von Salmonella-typhimurium-Phage P22 (Rennell et al., Virol. 143, 280 (1985), phi 29 pg 15 von zwei Phagen der grampositiven Bakterien Lactococcus lactis und Bacillus subtilis (Garvey et al., Nucleic acids Res. 14, 10001 (1986)), der Pneumokokken-Bakteriophage Cp-1 (Garcia et al., J. Virol. 61, 2573 (1987)), der Pseudomonas-Phage f6 (Caldentey et al., Biochim. Biophys. Acta 1159, 44 (1992)), das K-Gen des Bakteriophagen P2 (Ziermann et al., J. Bacteriol. 176, 4974 (1994)), Gen 17 des Bakteriophagen P1 (Schmidt et al., Bacteriol. 178, 1099 (1996)), die Listeria-monocytogenes-Bakteriophagen-Lysine Ply 511 und Ply 518 (Gaeng et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 2951 (2000)) sowie zahlreiche Phagen, die Lactobacilli infizieren (Shearman et al., Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063 (1994); Henrich et al., J. Bacteriol. 177, 723 (1995)).
Zusätzliche Phagen-Lysine, über die in der Literatur berichtet wird, sind untenstehend angeführt.

Ackermann, Tailed bacteriophages: the order caudovirales, Adv. Virus Res. 51, 135-201 (1998).
Arendt et al., Molecular characterization of lactococcal bacteriophage Tuc2009 and identification and analysis of genes encoding lysin, a putative holin, and two structural proteins, Appl. Environ. Microbiol. 60, 1875-1883 (1994).
Auad et al., Physical mapping and partial genetic characterization of the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus bacteriophage Ib539, Arch. Virol. 144, 1503-1512 (1999).
Boizet et al., Cloning, expression and sequence analysis of an endolysin-encoding gene of Lactobacillus bulgaricus bacteriophage mv1, Gene 94, 61-67 (1990).
Calandra et al., Lysis and protoplast formation of group B streptococci by mutanolysin, Infect. Immun. 28, 1033-1037 (1980).
Calandra et al., Cellular streptolysin S-related hemolysins of group A Streptococcus C203S, Infect. Immun. 12, 13-28 (1975).
Chandry et al., Analysis of the DNA sequence, gene expression, origin of replication and modular structure of the Lactococcus lactis lytic bacteriophage sk1, Mol. Microbiol. 26, 49-64 (1997).
Cohen et al., Simple procedure for production by group C streptococci of phageassociated lysin active against group A streptococci, Appl. Microbiol. 29, 175-178 (1975).
Coleman et al., Cloning and expression in Escherichia coli and Staphylococcus aureus of the beta-lysin determinant from Staphylococcus aureus: evidence that bacteriophage conversion of beta-lysin activity is caused by insertional inactivation of the beta-lysin determinant, Microb. Pathog. 1, 549-564 (1986).
Coleman et al., Staphylococcus aureus bacteriophages mediating the simultaneous lysogenic conversion of beta-lysin, staphylokinase and enterotoxin A: molecular mechanism of triple conversion, J. Gen. Microbiol. 135, 1679-1697 (1989).
Cooney et al., Molecular cloning and genetic analysis of the determinant for gammalysin, a two-component toxin of Staphylococcus aureus, J. Gen. Microbiol. 134, 2179-2188 (1988).
de Ruyter et al., Food-grade controlled lysis of Lactococcus lactis for accelerated cheese ripening, Nat. Biotechnol. 15, 976-979 (1997).
Diaz et al., The two-step lysis system of pneumococcal bacteriophage EJ-1 is functional in gram-negative bacteria: triggering of the major pneumococcal autolysin in Escherichia coli, Mol. Microbiol. 19, 667-681 (1996).
Dietrich et al., Delivery of antigen-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes, Nat. Biotechnol. 16, 181-185 (1998).
Elias et al., Staphylococcus aureus haemolysins: their use in strain typing, Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 27, 183-190 (1980).
Fischetti et al., Purification and physical properties of group C streptococcal phageassociated lysin, J. Exp. Med. 133, 1105-1117 (1971).
Garcia et al., Cloning, purification, and biochemical characterization of the pneumococcal bacteriophage Cp-1 lysin, J. Virol. 61, 2573-2580 (1987).
Garcia et al., Mechanism of phage-induced lysis in pneumococci, J. Gen. Microbiol. 129, 479-487 (1983).
Garcia et al., Biochemical characterization of a murein hydrolase induced by bacteriophage Dp-1 in Streptococcus pneumoniae: comparative study between bacteriophage-associated lysin and the host amidase, J. Bacteriol. 159, 793-796 (1984).
Gindreau et al., Molecular analysis of the region encoding the lytic system from Oenoccccus oeni temperate bacteriophage phi 10MC, FEMS Microbiol. Lett. 171, 231-238; 1999).
Henrich et al., Primary structure and functional analysis of the lysis genes of Lactobacillus gasseri bacteriophage phi adh, J. Bacteriol. 177, 723-732 (1995).
Hill et al., Identification of a lysin associated with a bacteriophage (A25) virulent for group A streptococci, J. Bacteriol. 145, 696-703 (1981).
Karneko et al., Complete nucleotide sequence and molecular characterization of the temperate staphylococcal bacteriophage phiPVL carrying Panton-Valentine leukocidin genes, Gene 215, 57-67 (1998).
Kühnemund, Studies on the lysis of streptococcus pyogenes (group A, type 1) by phage-associated lysin (Übers. des Autors), Z. Immunitatsforsch. Exp. Klin. Immunol. 143 184-191 (1972).
Loessner et al., Modified Listeria bacteriophage lysin genes (ply) allow efficient overexpression and one-step purification of biochemically active fusion proteins, Appl. Environ. Microbiol. 62, 3057-3060 (1996).
Loessner et al., Heterogeneous endolysins in Listeria monocytogenes bacteriophages: a new class of enzymes and evidence for conserved holin genes within the siphoviral lysis cassettes, Mol. Microbiol. 16, 1231-1241 (995).
Martin et al., Functional analysis of the two-gene lysis system of the pneumococcal phage Cp-1 in homologous and heterologous host cells, J. Bacteriol. 180, 210-217 (1998).
Mindich et al., Cell wall lysin as a component of the bacteriophage phi 6 virion, J. Virol. 30, 489-496 (1979).
Mullan et al., Lysin production by phi C2(W), a prolate phage for Streptococcus lactis C2, J. Dairy Res. 52, 113-121 (1985).
Mullan et al., Partial purification and some properties of phi C2(W) lysin, a lytic enzyme produced by phage-infected cells of Streptococcus lactis C2, J. Dairy Res. 52, 123-138 (1985).
Nelson et al., Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 4107-4112 (2001).
Oki et al., Cloning, sequence analysis, and expression of the genes encoding lytic functions of Bacteriophage phi g1e, Gene 176, 215-223 (1996).
Payne et al., Exploitation of a chromosomally integrated lactose operon for controlled gene expression in Lactococcus lactis, FEMS Microbiol. Lett. 136, 19-24 (1996).
Raina, Purification of Streptococcus group C bacteriophage lysin, J. Bacteriol. 145, 661-663 (1981).
Sable et al., The lysins of bacteriophages infecting lactic acid bacteria, Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 1-6 (1995).
Sanders et al., A chloride-inducible gene expression cassette and its use in induced lysis of Lactococcus lactis, Appl. Environ. Microbiol. 63, 4877-4882 (1997).
Shearman et al., Cloning and DNA sequence analysis of a Lactococcus bacteriophage lysin gene, Mol. Gen. Genet. 218, 214-221 (1989).
Shearman et al., Controlled expression and structural organization of a Lactococcus lactis bacteriophage lysin encoded by two overlapping genes, Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063-3073 (1994).
Sheehan et al., Analysis of the catalytic domain of the lysin of the lactococcal bacteriophage Tuc2009 by chimeric gene assembling, FEMS Microbiol. Lett. 140, 23-28 (1996).
Sheehan et al., The lytic enzyme of the pneumococcal phage Dp-1: a chimeric lysin of intergeneric origin, Mol. Microbiol. 25, 717-725 (1997).
Sheehan et al., Identification and characterization of a lysis module present in a large proportion of bacteriophages infecting Streptococcus thermophilus, Appl. Environ. Microbiol. 65, 569-577(1999).
Sonstein et al., Staphylococcal bacteriophage-associated lysin: a lytic agent active against Staphylococcus aureus, J. Bacteriol. 107, 499-504 (1971).
Tourville et al., Lactic streptococcal phage-associated lysin. I. Lysis of heterologous lactic streptococci by a phage-induced lysin, J. Dairy Sci. 49, 158-162 (1966).
van der Vijver et al., Induction of mutation in Staphylococcus aureus by ethylmethane sulphonate, J. Med. Microbiol. 8, 265-277 (1975).
van Sinderen et al., Sequence analysis and molecular characterization of the temperate lactococcal bacteriophage r1t, Mol. Microbiol. 19, 1343-1355 (1996).
Ward et al., Sequence analysis of the lysin gene region of the prolate lactococcal bacteriophage c2, Can. J. Microbiol. 39, 767-774 (1993).
Wheeler et al., Production of group C streptococcus phage-associated lysin and the preparation of Streptococcus pyogenes protoplast membranes, J. Gen. Microbiol. 120, 27-33 (1980).
Yoon et al., Characterization of a lytic Lactobacillus plantarum bacteriophage and molecular cloning of a lysin gene in Escherichia coli, Int. J. Food Microbiol. 65, 63-74 (2001).
Young, Bacteriophage lysis: mechanism and regulation, Microbiol. Rev. 56, 430-481 (1992).

Wenn das Lysin-Gen eines Bakteriophagen von Interesse noch nicht identifiziert wurde, kann diese Identifikation unter Einsatz von Verfahren erfolgen, die auf dem Gebiet der Erfindung Routine sind. Bakteriophagen-Lysin-Gene können beispielsweise durch Verfahren identifiziert werden, die auf dem Sequenzieren des Bakteriophagen-Genoms und dem Vergleich der Sequenz mit jenen der Bakteriophagen, in welchen das Lysin-Gen beschrieben wurde, beruhen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der bisher beschriebenen Lysine offenbart drei konservierte Regionen (Schmidt et al., J. Bacteriol. 178, 1099 (1996)). Die erste konservierte Region umfasst die katalytische Stelle mit der EG-Sequenz und der Antigenbindungsstellen-Spalte. Die Lysin-Gene von neu isolierten Bakteriophagen oder Bakteriophagen, in denen das Lysin-Gen noch nicht beschrieben wurde, können identifiziert und durch Nucleinsäure-Amplifikationstechniken (z.B. PCR) unter Einsatz von Primern, die den Nucleotidsequenzen der konservierten Regionen von bekannten Lysin-Genen entsprechen, isoliert werden. Unter Einsatz von konservierten Teilen der Lysin-Gene können die Lysin-Gene eines beliebigen Phagen isoliert werden, unter Einsatz von degenerierten Oligos, die zu beliebigen zwei oder drei konservierten Regionen homolog sind. Wenn dieses PCR-Produkt sequenziert wurde, können neue Primer hergestellt werden, um die Regionen stromauf oder stromab von den Lysin-Genen zu sequenzieren, wobei Phagen-DNA als Matrix für das Sequenzieren herangezogen wird.
Herstellung von Lys-Minus-Phagen-Mutanten
Lys-Minus-Phagen können auf viele verschiedene Weisen hergestellt werden, wobei ein lysedefekter Phage gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird. Vorzugsweise werden Lys-Minus-Phagen durch die Modifikation des Bakteriophagen-Genoms hergestellt, so dass dem Bakeriophagen Lysin-(Lys-) Protein des Wildtyps fehlt oder der Bakteriophage ein funktionelles Lysin-Gen umfasst, das operabel an einen induzierbaren Promotor gebunden ist. Alternativ dazu können Bakteriophagen mit gesenktem Lysin-Spiegel und demnach gesenkten Lyse-Geschwindigkeit ausgewählt werden, indem auf Phagen gescreent wird, die Bakterien infizieren und die Replikation des bakteriellen Wirts hemmen, aber gesenkte Lyse-Raten aufweisen, z.B. dient der Bakteriophage als bakteriostatischer Wirkstoff des bakteriellen Wirts, aber lysiert die bakterielle Wirtszelle nicht in einer Geschwindigkeit oder in einem Maß, das mit einem Wildtyp-Phagen, der kein mangelhaftes Phage-Lyse-System aufweist, assoziiert wird.
Bakteriophagen mit Lysin-Protein-Mangel ("Lys-Minus"-Phagen) umfassen jene, die durch Mutation oder Deletion des Gens hergestellt werden, das für das Lysin des Phage-Lyse-Systems kodiert. "Lys-Minus"-Phagen umfassen Phagen, die aufgrund der Deletion der gesamten oder eines Teils der für das Lysin kodierenden Nucleinsäure einen Lysin-Mangel aufweisen, in der Form, dass kein nachweisbares Lysin produziert wird oder eine trunkierte Form von Lysin produziert wird, die eine gesenkte Aktivität in Bezug auf die Förderung der Lyse aufweist (trunkiertes Lysin ist z.B. unwirksam für die Förderung der effizienten Lyse des bakteriellen Wirts oder erleichtert keine nachweisbare, durch Lysin des Wildtyps vermittelte Lyse-Aktivität). "Lys-Minus"-Phagen umfassen ebenfalls Phagen, die modifiziertes Lysin-Protein produzieren, wobei das Lysin aufgrund des Vorhandenseins von einer oder mehrerer Mutationen in Bezug auf die Förderung der bakteriellen Lyse mangelhaft ist. Solche Mutationen umfassen zumindest eine oder eine beliebige Kombination von einer oder mehreren der folgenden: Nucleinsäuredeletionen, -substitutionen, -additionen oder -insertionen, die zu einer Veränderung der entsprechenden Aminosäuresequenz des Lysins, für das sie kodiert, führen.
Lys-Minus-Phagen umfassen auch jene, in denen das Gen, das für Lysin kodiert, so modifiziert wurde, dass das Gen operabel mit einem induzierbaren Promotor verbunden ist, so dass Lysin nur dann produziert wird, wenn der Phage entweder mit einem Wirkstoff oder einer Umweltbedingung (wie z.B. Temperatur, Metalle, Salze, Ionen, Nährstoffe, Arzneimittel etc.) kontaktiert wird, die den induzierbaren Promotor aktivie ren. Solche Lys-Minus-Phagen können durch eine Modifikation des Wildtyp-Lysin-Gens produziert werden, wobei dieses dann einen induzierbaren Promotor umfasst und die Modifikation erfolgt, indem das Lysin-Gen durch eine Nucleinsäure ersetzt wird, die für Lysin kodiert und operabel an einen induzierbaren Promotor gebunden ist; oder durch Mutation oder Deletion des Gens, das für Lysin kodiert, und das Insertieren einer Nucleinsäure, die für Lysin kodiert und operabel an einen induzierbaren Promotor gebunden ist, in den Phagen.
Bakteriophagen mit Lysin-Mangel können unter Einsatz von klassischen mikrobiologischen Verfahren, wie z.B. Plaque-Morphologie-Tests (siehe z.B. Streisinger et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 26, 25 (1961)), hergestellt werden.
Lys-Minus-Phagen können auch unter Einsatz von Rekombinationsverfahren, wie z.B. ortsgerichteter Mutagenese (Smith Ann. Rev. Genet. 19, 423 (1985)), z.B. unter Einsatz von Nucleinsäure-Amplifikationstechniken, wie z.B. PCR (Zhao et al., Methods Enzymol. 217, 218 (1993)), um leichte Deletionen, Insertionen und Punktmutationen einzuführen, hergestellt werden. Andere Verfahren für die Deletionsmutagenese umfassen beispielsweise den Einsatz von BAL-31-Nuclease, die ein doppelsträngiges DNA-Fragment schrittweise vom 5'- und 3'-Ende aus kürzt, oder Exonuclease III, die die Ziel-DNA vom 3'-Ende aus verdaut (siehe z.B. Henikoff, Gene 28, 351 (1984)). Das Ausmaß des Verdaus in beiden Fällen wird durch die Inkubationszeit oder die Reaktionstemperatur oder beides gesteuert. Punktmutationen können durch eine Behandlung mit Mutagenen, wie z.B. Natrimbisulfit, eingeführt werden, das Desoxycytidin in Desoxyuridin desaminiert, wodurch ein G:C-Basenpaar durch ein A:T-Basenpaar in etwa 50 % der Matrixmoleküle nach einer Replikationsrunde substituiert wird (Botstein et al., Science 229, 1193 (1985)).
Andere beispielhafte Verfahren für das Einführen einer Punktmutation umfassen die enzymatische Inkorporation eine Nucleotidanalogons oder die Fehlinkorporation von normalen Nucleotiden oder α-Thionucleotiden durch DNA-Polymerasen (Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1588 (1982)). Bei der Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese wird die Ziel-DNA in einen M13-Vektor kloniert, um einzelsträngige DNA-Matrizen des Wildtyps zu produzieren, an die das Oligomutagen reassoziiert wird. Dadurch wird eine nicht komplementäre (nach außen geschlungene) Region auf dem Oligoprimer oder der Matrix gebildet, wodurch es zu einer Insertion bzw. einer Deletion kommt. Eine Basenfehlpaarung zwischen der Matrix und dem Primer führt zu einer Punktmutagenese. Die auf PCR basierenden Mutageneseverfahren (oder andere Mutageneseverfahren, die auf Nucleinsäure-Amplifikationstechniken basieren) sind im Allgemeinen zu bevorzugen, da sie einfach und schneller als die oben beschriebenen klassischen Techniken sind (Higuchi et al., Nucleic Acids Res. 16, 7351 (1988); Vallette et al., Nucleic Acids Res. 17, 723 (1989)).
Bakteriophagen mit Lysin-Mangel können durch Screenen des vermutlichen Phagen beispielsweise durch einen Vergleich der Fähigkeit des vermutlichen Phagen, einen bakteriellen Wirt des Wildtyps zu lysieren, mit der Fähigkeit des vermutlichen Phagen, einen rekombinanten bakteriellen Wirt zu lysieren, der modifiziert wurde, um das Lysin-Protein zu exprimieren (z.B. durch einen Helfer-Phagen, von einem eingeführten Helfer-Plasmid, das für das Lysin des Phagen kodiert, oder von einer rekombinanten Phagen-Sequenz, die für Lysin kodiert und in das Genom des bakteriellen Wirts integriert wurde), identifiziert werden. Vermutliche Phagen, die Lysinexprimierende bakterielle Wirte lysieren, aber bakterielle Wirte des Wildtyps nicht lysieren oder nur unzureichend lysieren können, sind beispielhafte Lys-Minus-Phagen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Ein Ansatz von besonderem Interesse für die Herstellung von Lys-Minus-Phagen, die überhaupt keine Lysozom-Aktivität des Lysin-Gens aufweisen, ist die Deletion der ersten konservierten Region, die die katalytische Stelle und die Spalte der aktiven Stelle umfasst. Basierend auf der Nucleotidsequenz des Lysins wird ein PCR-Produkt/werden PCR-Produkte hergestellt, denen die konservierte Region I fehlt, und gemeinsam mit dem Wildtyp-Phagen in den geeigneten bakteriellen Wirt transformiert. Ein wählbarer Marker, wie z.B. das grünfluoreszierende Quallenprotein (GFP; M. Chalfie et al., Science 263, 802 (1994)), kann statt eines Antibiotika-Resistenz-Markers eingesetzt werden. Antibiotika-Resistenz-Marker können sich als unerwünscht erweisen, wenn der Phage sich in einer gewissen Menge in dem Impfstoff befindet (z.B. als Verunreinigung). Kopien der Resistenz-Bakterien werden dann (zur Vermeidung von UV-Mutagenese) unter UV-Licht in Bezug auf jene gescreent, die GFP exprimieren.
Herstellung von Lys-Minus-Phagen unter Einsatz von Marker-Rettungstechniken
In einer anderen Ausführungsform werden Lys-Minus-Phagen, die einen erwünschten Lysin-Gen-Defekt aufweisen, unter Einsatz von Marker-Rettungstechniken hergestellt. Die Technik der Marker-Rettung wurde umfassend eingesetzt, um Mutationen in Phagen aufzuzeigen und künstlich erzeugte Mutationen von Phagen-Genen, die in einem Plasmide an das Phagen-Genom kloniert wurden, zu übertragen (Volker et al., Mol. Gen. Genet. 177, 447 (1980)). Beispielhaft für den Einsatz dieser Technik ist die Anwendung zur Identifikation von Genen, die an der T4-Phagen-Bildung und -Reifung beteiligt sind. Spezifisch wurden Restriktionsfragmente, die die T4-Phagen-Bildungs- und -Reifungsgene 20 bis 22 umfassen, in Plasmiden kloniert, mutagenisiert, und die Mutationen wurden dann durch Infektion von E. coli, der das Plasmid mit einer T4-20/21-am(Amber)-Doppelmutante trug, in das Phagen-Genom rückkombiniert (Volker, s.o. (1980)). Die Phagen-Nachkommen, die erneut mit dem Plasmid einer Rekombination unterzogen worden waren, wurden durch Ausplattieren auf einem su^--Wirt (dem ein Amber-Suppressor fehlte) ausgewählt, wodurch die Auswahl eines rekombinanten Phagen ermöglicht wurde. Diese am⁺-Phagen wurden dann nicht-selektiv in Bezug auf die erwünschten Temperatur-sensiblen Mutationen in den Genen 20 und 21 gescreent.
Eine ähnliche Strategie kann für das Lysin-Gen eingesetzt werden. Die Lysin-Gen-Mutante (entweder ein nicht funktionelles Lysin-Gen oder eine funktionelles Lysin-Gen, das operabel an einen induzierbaren Promotor gebunden ist), die unter Einsatz der oben beschriebenen Rekombinationsverfahren hergestellt werden kann, wird in ein Plasmid mit einem selektierbaren Marker, z.B. Ampicillin-Resistenz, kloniert. Es werden zwei Arten von bakteriellen Wirten eingesetzt, die entweder Lysin-Gene des Wildtyps (WT-Lysin-Wirt) oder mutierte Lysin-Gene (mutierter Lysin-Wirt) umfassen.
Der erstere Stamm, der das Lysin-Gen des Wildtyps umfasst, wird als Helfer-Stamm für die Produktion von mutierten Lys-Minus-Phagen in großem Ausmaß eingesetzt, wobei den Lys-Minus-Phagen ein induzierbares Lysin-Gen fehlt. Der zweitere Stamm, der ein mutiertes Lysin-Gen umfasst; wird eingesetzt, um Lys^--Mutationen in Wildtyp-Phagen einzuführen. 1 stellt eine schematische Darstellung einer bakteriellen Wirtszelle bereit, die ein mutiertes Lysin-Gen aufweist, das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Lys-Minus-Phagen zweckdienlich ist.
Rekombinante mutierte bakterielle Wirte, die Lysin exprimieren, für die Herstellung von Lys-Minus-Phagen (wie in 1 dargestellt) können unter Einsatz von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Beispielswiese werden die Sequenzen der Regionen, die das Lysin-Gen flankieren (etwa 100 by auf jeder Seite), in jedem der Phagen, die mutiert werden sollen, isoliert. Im Allgemeinen wird eine Homologie von zumindest etwa 50 by auf jeder Seite, die die Region von Interesse flankiert, die für das Phagen-Lysin-Gen kodiert, bereitgestellt (Singer, Cell 31, 25-33 (1982)). Die DNA, die den Regionen stromauf und stromab jedes Phagen-Lysin-Gens entsprechen, werden durch Nucleinsäureamplifikation (z.B. PCR) isoliert und in ein Plasmid mit einem ersten selektierbaren Marker (z.B. Ampicillin-Resistenz) mit einer geeigneten Restriktionsstelle zwischen zwei Regionen für die Insertion einer DNA-Kassette kloniert, in der ein zweiter selektierbarer Marker (z.B. GFP) durch einen frühen Promotor desselben Phagen exprimiert wird. Dieses Plasmid wird in geeignete bakterielle Wirtszellen durch Transformation und Selektion des ersten selektierbaren Markers (als Beispiel ist hier Ampicillin-Resistenz angeführt) eingeführt. Ein beispielhaftes Plasmid mit einem mutierten Lysin-Gen, das für diese Technik nützlich ist, ist in 1 dargestellt. Alternativ dazu kann das Konstrukt des Plasmids genomisch in die genomische DNA des bakteriellen Wirts integriert werden.
Der bakterielle Wirt mit dem mutierten Lysin-Gen wird mit dem Wildtyp-Phagen bei einer geringen Infektionsmultiplizität infiziert. Wenn sich der Phage repliziert, werden manche Phagen durch ein Doppel-Crossing-over-Ereignis mit dem mutierten Lysin-Gen in dem bakteriellen Wirt rekombiniert, wodurch man Lys-Minus-Phagen erhält. Da es wahrscheinlich ist, dass die Rekombination mit einer beliebigen Zelle nicht zu 100 % wirksam ist, können in denselben Zellen wie die Lys-Minus-Phagen auch Wildtyp-Phagen vorhanden sein. Das Wildtyp-Virus wirkt als Helfer-Virus, um die Lyse der infizierten Zellen hervorzurufen, unabhängig davon, ob es zu einer Rekombination kommt oder nicht.
Die beiden Virus-Typen werden durch das Lysieren der bakteriellen Zellen mit Chloroform gesammelt, und die Lys-Minus-Phagen werden durch Plaque-Reinigung von den Wildtyp-Viren gereinigt. Das Virus jedes Plaques wird dann getestet, um festzustellen, ob es sich um einen Wildtyp oder einen Lys-Minus-Typ handelt. Das Testen zur Identifikation von Lys-Minus-Phagen kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass die Fähigkeit der Phagen von jedem Plaque untersucht wird, zwei Arten von Wirtszellen, wie durch die Plaque-Bildung nachgewiesen, zu infizieren und abzutöten. Eine Art der Wirtszelle ist das normale (Wildtyp-) Wirtsbakterium, die andere ist das oben beschriebene Wirtsbakterium mit Wildtyp-Lysin. Wildtyp-Phagen lysieren und töten beide Wirte wirksam, während Lys-Minus-Phagen nur die Wirtszellen töten, die Lysin exprimieren.
Wenn die Lys-Minus-Phagen einen nachweisbaren Marker (z.B. GFP) exprimieren und insbesondere wenn der selektierbare Marker durch einen frühen viralen Promotor exprimiert wird, können fluoreszierende Plaques, die Lys-Minus-Phagen darstellen, direkt bei der Plaque-Reinigung sichtbar gemacht werden. Der Lys-Minus-Phänotyp dieser Phagen kann dann durch ein oben beschriebenes Screening bestätigt werden.
Herstellung eines Lysin-Wirts des Wildtyps für die Scale-up-Herstellung von Lys-Minus-Phagen
Lys-Minus-Phagen können sich in Wirtsbakterien replizieren und bilden, sind aber per definitionem nicht in der Lage, den Wirt zu lysieren und die Nachkommen-Phagen wirksam freizusetzen. Für die Herstellung von therapeutischen Lys-Minus-Phagen ist die Freisetzung der modifizierten Phagen von dem bakteriellen Wirt wesentlich. Wenn es sich bei dem Lys-Minus-Phagen um einen solchen handelt, bei dem das Lysin-Gen von einem induzierbaren Promotor gesteuert wird, kann die Lyse des bakteriellen Wirts durch das Kontaktieren des Phagen mit einem Wirkstoff erfolgen, der den induzierbaren Promotor aktiviert, wodurch die Lysin-Produktion und die daraus folgende Lyse der bakteriellen Wirtszellen induziert wird.
Die Lyse der Wirtsbakterien und die Freisetzung von Lys-Minus-Phagen kann ebenfalls durch das Einführen eines Helfer-Plasmids erfolgen, das ein Lysin-Gen unter einem induzierbaren Promotor in den bakteriellen Wirt einführt. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Expression der Phagen-Lambda-Lyse-Gene in E. coli zu einer deutlich definierten Lyse führt (Garrett et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981)). Kürzlich wurden Lamda-Phagen-S- und -R-Genprodukte (Holin bzw. Lysin) in einem induzierbaren Lyse-System eingesetzt (Jain et al., Infection & Immunity 68, 986 (2000)). Demnach können große Mengen an Lys-Minus-Phagen in geeigneten Wirten hergestellt werden, die ein Helfer-Plasmid umfassen, das ein Lysin-Gen trägt, das für ein hoch-potentes Lysozym (z.B. T4-Lysozym) unter einem induzierbaren Promotor kodiert.
Lysin-Gene von einem beliebigen sequenzierten Phagen können durch Nucleinsäure-Amplifikationstechniken (z.B. PCR) isoliert und in ein Plasmid mit einem selektierbaren Marker (z.B. Antibiotika-Resistenz, wie z.B. Ampicillin-Resistenz) kloniert werden, so dass sie durch einen induzierbaren Promotor unter Einsatz von herkömmlichen DNA-Rekombinationsverfahren exprimiert werden. Das gewählte Lysin-Gen weist ein möglichst geringes Maß an Homologie mit dem Phagen-Lysin-Gen auf, um Rekombination zwischen dem Lys-Minus-Phagen und dem Lysin-Gen in dem Wirtsstamm zur Herstellung von Wildtyp-Rekombinanten zu vermeiden. Die Effizienz der ausschließlichen Herstellung von Lys-Minus-Phagen wird durch die Bestätigung getestet, dass der Lys-Minus-Phagen-Stamm keine Plaques auf einem Wirtsstamm produziert, dem das Lysin-Gen fehlt. Wenn erforderlich, kann eine Vielzahl von Helfer-Wirtsstämmen, die das Lysin aus verschiedenen Quellen exprimieren, und induzierbaren Promotoren eingesetzt werden, um empirisch den geeigneten Wirtsstamm, der die geringste Menge an Wildtyp-Rekombinanten produziert, zu ermitteln.
Alternative Strategien zur Herstellung von lysedefekten Bakteriophagen
Lysedefekte Bakteriophagen gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls nicht nur Phagen umfassen, die ein defektes Lysin-Gen aufweisen, sondern auch Phagen, die aufgrund eines anderen Defekts als eines Defekts des Lys-Gens oder eines zusätzlichen Defekts zu dem des Lys-Gens einen defekten Lyse-Mechanismus aufweisen. Beispielsweise können, anstelle dessen, dass nur das Lysin-Gen defekt ist, sowohl das Lysin-Gen als auch das Holin-Gen deletiert oder verändert sein, um in dem Phagen oder dem Lyse-System nicht funktionell zu sein. Solche defekten Phagen können durch das Exprimieren von fehlenden oder defekten Lyse-System-Komponenten auf einem Helfer-Plasmid in dem bakteriellen Wirt hergestellt werden. Martin et al. (J. Bacteriol. 180, 210 (1998)) haben gezeigt, dass die gleichzeitige Expression von Holin und Lysin in dem Pneumokokken-Phagen Cp-1 in E. coli zu Zelllyse führte. Ähnliche oben erläuterte Strategien können eingesetzt werden, um die Herstellung von Wildtyp-Phagen durch Rekombination in der Herstellungsphase zu vermeiden.
Da die Holine die membrandurchdringenden Proteine sind, die den Phagen-Lysinen den Zugang zu dem bakteriellen Zellwand-Murein ermöglichen, reicht auch eine Deletion oder Inaktivierung des Holin-Gens alleine aus, um therapeutische Bakteriophagen mit fehlendem Immunantwort-Potential zu erzeugen. Je nach Struktur und Eigenschaften des spezifischen Phagen können Deletion oder Inaktivierung des Lysin-Gens, des Holin-Gens oder von beiden eingesetzt werden, um den erwünschten therapeutischen Phagen zu erzeugen.
Ein beliebiger Phagen-Stamm, der in der Lage ist, direkten oder indirekten Schaden für Bakterien (oder andere Pathogene) zu erleichtern (z.B. durch Hemmung oder Beeinträchtigung der Transkription und/oder Translation der bakteriellen DNA (z.B. durch Wettbewerb der Phagen-DNA in Bezug auf dieselben Wirtszellen-Mechanismen), Hemmung der bakteriellen Replikation und dergleichen), wird als in der vorliegenden Erfindung wirksam in Betracht gezogen. Demnach können Phagen, die ly tisch sind, und Phagen, die lysogen sind, aber später lytisch werden können, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
Bakterielle Pathogene, für die inaktivierte Ganzzellen-Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können
Eine beliebige Vielzahl von pathogenen Bakterien kann eingesetzt werden, um einen inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Beispielhafte bakterielle Pathogene sind die oben gemeinsam mit den entsprechenden Bakteriophagen (wenn bekannt) beschriebenen.
Zusätzlich dazu können die Lys-Minus-Bakteriophagen eingesetzt werden, um inaktivierte bakterielle Ganzzellen-Impfstoffe unter Verwendung von Bakterien herzustellen, die genetisch verändert sind, um ein heterologes Protein zu exprimieren oder ein endogenes Protein zu überexprimieren. Das Bakterium kann beispielsweise genetisch verändert sein, um eine oder mehrere Nucleinsäuren zu exprimieren, die für ein oder mehrere Moleküle von Interesse kodieren, insbesondere für Moleküle, die eine schützende Immunantwort hervorrufen oder verstärken, z.B. rekombinante Antigene. Antigene Fragmente solcher Moleküle, z.B. Epitope, sind von besonderem Interesse. Die Nucleinsäuren können beispielsweise vollständig oder teilweise für ein äußeres Membran-Protein, Pilin, Flagellum oder ein anderes Protein, das an der Auslösung einer schützenden Immunantwort beteiligt ist, kodieren.
Eine beliebige DNA-Sequenz, die für ein Antigenmolekül oder ein Fragment davon (z.B. Epitop) kodiert, von einem heterologen oder einem endogenen Organismus, die eine schützende Immunantwort gegen den Organismus oder eine Erkrankung oder Störung, die durch den Organismus hervorgerufen wird, auslöst, wenn sie in Bakterien exprimiert wird, kann für die Verwendung in den Impfstoffpräparaten der vorliegenden Erfindung isoliert werden. In einer Ausführungsform ist das Antigen ein Oberflächen-Antigen. In einer anderen Ausführungsform ist der Organismus ein pathogener Mikroorganismus. In einer weiteren Ausführungsform ist das Antigenmolekül oder das Fragment davon charakteristisch für Krebs und stellt eine schützende Immunität gegen Krebs bereit oder löst eine Immunantwort gegen Krebs aus, die zum Rückgang oder zur Elimination von Krebs in einem Individuum führt.
Antigenmoleküle oder Fragmente davon sind auf Pathogenen, wie z.B. Bakterien, Parasiten, Viren oder Pilzen, zu finden. Bakterien, Parasiten, Viren und Pilze von Interesse umfassen die in der untenstehenden Tabelle angeführten, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Zusätzlich dazu können Antigenmoleküle von Krebszellen eingesetzt werden. Antigene, die für Krebszellen charakteristisch und für die erfindungsgemäßen Impfstoffpräparate zweckdienlich sind, umfassen folgende, sind aber nicht auf diese beschränkt: MAGE, MUC1, Her2/neu, CEA, pS3, Tyrosinase, MART-1/melan A, gp 100, TRP-1, TRP-2, PSA, CDK4-R24C, BCR/ABL, Mutiertes K-ras, ESO-1, CA15-3, CA125, CA19-9, CA27.29, TPA, TPS, Cytokeratin 18 und mutiertes p53.
Wenn noch keine Antigene identifiziert wurden, können potentiell wirksame Antigene für die Impfstoffformulierungen anhand zahlreicher Kriterien identifiziert werden, z.B. Beteiligung des Antigens an der Neutralisierung der Infektivität eines Pathogens (E. Norrby, Summary, in Vaccines 85 (1985), R.A. Lerner, R.M. Chanock und F. Brown (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory, 388-389, Gold Spring Harbor, N.Y.), Typ- oder Gruppenspezifizität, Erkennung durch die Antiseren oder Immunzellen eines Patienten und/oder Nachweis der schützenden Wirkung von Antiseren oder Immunzellen, die für das Antigen spezifisch sind.
Immunreaktive Moleküle können durch Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert und charakterisiert werden. Monoklonale Antikörper können an der Oberfläche oder an anderen Molekülen eines Pathogens gebildet werden, um die zu identifizieren, die von den Antikörpern erkannt werden können. Alternativ dazu können kleine synthetische an Trägermoleküle konjugierte Peptide in Bezug auf die Bildung von monoklonalen Antikörpern getestet werden, die an die Stellen binden, die den Peptiden an intakten Molekülen entsprechen (siehe z.B. I.A. Wilson, Cell 37, 767 (1984)).
Genetisch veränderte Bakterien, die für die Verwendung in der Erfindung wirksam sind, können unter Einsatz von DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Eine Nucleotidsequenz, die für ein Antigenmolekül von Interesse kodiert, wird in einen Expressionsvektor insertiert, in eine geeignete bakterielle Wirtszelle transformiert oder transfiziert und unter für die Expression geeigneten Bedingungen kultiviert. Diese Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und allgemein in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), beschrieben.
Die Nucleotidsequenz, die für ein Antigenmolekül kodiert, kann auch mit einer bakteriellen oder einer anderen Nucleinsäure fusioniert werden, um die Expression und/oder, wenn erwünscht, die Präsentation des exprimierten Antigenpolypeptids auf der bakteriellen Zelloberfläche zu erleichtern (Cattozzo et al., J. Biotechnol. 56, 191 (1997); Stocker and Newton, Int. Rev. Immunol. 11, 167 (1994); Stocker, Res. Microbiol. 141, 787 (1990); Newton et al., Science 244, 70 (1989), US-Patent 6.130.082). Newton et al. (Res. Microbiol. 146, 203 (1995)) fusionierten beispielsweise ein HIV-1-gp41-Epitop, das Teil des gp160-Proteins ist, in korrekter Ausrichtung und dem richtigen Leseraster an ein Salmonella-flagellum-Gen. Das Plasmid wurde in einen Flagellin-negativen Lebendimpfstoff-Salmonella-Stamm platziert, der dann mit der darin integrierten Fremd-HIV1-Epitopsequenz ein Protein bildete. Mäuse, die mit einem Lebendimpfstoff aus rekombinanter Salmonella immunisiert wurden, wiesen eine Antikörperproduktion mit Affinität zu gp160 auf.
Die Nucleotidsequenz, die für ein Antigenmolekül kodiert, kann auch mit einer bakteriellen oder einer anderen Nucleinsäure fusioniert werden, um die Präsentation des exprimierten Antigen-Polypeptids auf der Zelloberfläche genetisch veränderter Bakterien zu erleichtern (Cattozzo et al., J. Biotechnol. 56, 191 (1997); Stocker and Newton, Int. Rev. Immunol. 11, 167 (1994); Stocker, Res. Microbiol. 141, 787 (1990); Newton et al., Science 244, 70 (1989), US-Patent 6.130.082). Newton et al. (Res. Microbiol. 146, 203 (1995)) fusionierten beispielsweise ein HIV-1-gp41-Epitop, das Teil des gp160-Proteins ist, in korrekter Ausrichtung und dem richtigen Leseraster an ein Salmonella-flagellum-Gen. Das Plasmid wurde in einen Flagellin-negativen Lebendimpfstoff-Salmonella-Stamm platziert, der dann mit der darin integrierten Fremd-HIV1-Epitopsequenz ein Protein bildete. Mäuse, die mit einem Lebendimpfstoff aus rekombinanter Salmonella immunisiert wurden, wiesen eine Antikörperproduktion mit Affinität zu gp160 auf.
Die Immunwirksamkeit des durch die genetisch veränderten Bakterien exprimierten Antigenmoleküls in einem inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Impfstoffpräparat kann durch die Beobachtung der Immunantwort von Versuchstieren nach der Immunisierung mit den Bakterien, die das rekombinante Antigen exprimieren, ermittelt werden. Versuchstiere umfassen Mäuse, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühner, Schimpansen und andere Primaten und schließlich menschliche Patienten. Verfahren für die Einführung der inaktivierten rekombinanten Bakterien können orale, intradermale, Intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale und andere Standardimmunisierungswege umfassen.
Die Immunantwort der Versuchsindividuen kann durch verschiedene Ansätze analysiert werden, wie z.B.: (a) die Reaktivität des resultierenden Immunserums in Bezug auf das native Antigen oder ein Fragment davon oder auf den isolierten natürlich vorkommenden Organismus (z.B. Wildtyp-Organismus), von dem das Versuchsantigenmolekül stammt, wie sie durch bekannte Techniken getestet wird, z.B. durch en zymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), Immunoblots, Radioimmunausfällungen etc.; (b) die Reaktivität der aus dem immunisierten Individuum isolierten Lymphozyten in Bezug auf das native Antigen oder ein Fragment davon oder auf den isolierten natürlich vorkommenden Organismus (z.B. Wildtyp-Organismus), von dem das Versuchsantigenmolekül stammt, wie sie durch bekannte Techniken getestet wird, z.B. Tests in Bezug auf die blastogene Reaktion, Cytotoxizitättests, DTH etc.; (c) die Fähigkeit des Immunserums, die Infektivität des Organismus in vitro oder die biologische Aktivität des nativen Antigens zu neutralisieren, sowie (d) Schutz vor der Erkrankung und/oder Linderung von Infektionssymptomen bei immunisierten Tieren.
Verwendung von inaktivierten Bakterien für die Herstellung von Antikörpern
Für die Herstellung von Antikörpern gegen ein Antigenmolekül, das durch Bakterien exprimiert wird, wobei die Bakterien genetisch verändert sein können, um ein heterologes Protein zu exprimieren oder ein endogenes Protein zu überexprimieren, können verschiedene Wirtstiere durch die Injektion einer inaktivierten immunogenen Ganzzellen-Zusammensetzung, die das durch die Infektion mit einem lysedefekten Phagen inaktivierte Bakterium umfasst, immunisiert werden.
Solche Wirtstiere umfassen folgende, sind aber nicht auf diese beschränkt: Kaninchen, Mäuse und Ratten, um nur einige wenige aufzuzählen. Verschiedene Adjuvanzien können in Abhängigkeit von der Wirtsspezies eingesetzt werden, um die immunologische Antwort zu verstärken, wobei diese folgende umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind: (vollständiges oder unvollständiges) Freundsches Adjuvans, Mineralgele, wie z.B. Aluminiumhydroxid, Tenside, wie z.B. Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Dinitrophnol und potentiell wirksame menschliche Adjuvanzien, wie z.B. BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren von mit einem Antigen immunisierten Tieren abstammen. Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern können Wirtstiere wie die oben beschrie benen durch Injektion mit einer erfindungsgemäßen inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung immunisiert werden. Die Zusammensetzung kann mit einem Adjuvans ergänzt sein.
Der Antikörper-Titer des immunisierten Individuums kann über einen Zeitraum hinweg durch herkömmliche Techniken, wie z.B. durch enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) unter Einsatz des immobilisierten Polypeptids, beobachtet werden. Wenn erwünscht, können die Antikörpermoleküle aus dem Säugetier (z.B. aus dem Blut) isoliert und weiter durch bekannte Techniken gereinigt werden, wie z.B. Protein-A-Chromatographie, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Antikörper, die für ein Antigen spezifisch sind, oder Fragment davon, insbesondere für ein rekombinantes Antigen-Molekül, das durch genetisch veränderte Bakterien exprimiert wird, können z.B. durch eine Affinitätschromatographie ausgewählt (z.B. teilweise gereinigt) oder gereinigt werden.
Ein rekombinant exprimiertes und gereinigtes (oder teilweise gereinigtes) Protein-Antigen wird beispielsweise in genetisch veränderten Bakterien, wie hierin beschrieben, hergestellt und kovalent oder nicht-kovalent an einen festen Träger, wie z.B. eine Chromatographiesäule, gebunden. Die Säule kann dann eingesetzt werden, um Antikörper, die für die Proteine einer Probe spezifisch sind, die gegen eine große Zahl verschiedener Epitope gerichtete Antikörper umfasst, zu affinitätsreinigen, wodurch eine im Wesentlichen gereinigte Antikörperzusammensetzung hergestellt wird, d.h. eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen keine verunreinigenden Antikörper aufweist. Unter einer im Wesentlichen gereinigten Antikörperzusammensetzung versteht man in diesem Zusammenhang, dass die Antikörperprobe maximal nur 30 % (in Bezug auf das Trockengewicht) verunreinigender Antikörper aufweist, die gegen andere Epitope gerichtet sind als die auf dem gewünschten Protein oder Polypeptid von Interesse, vorzugsweise sind maximal 20 %, noch bevorzugter maximal 10 % und besonders bevorzugt maximal 5 % (bezogen auf das Trockengewicht), der Probe verunreinigende Antikörper. Eine gereinigte Antikörperzusammensetzung bedeutet, dass zumindest 99 % der Antikörper in der Zusammensetzung gegen das gewünschte Antigenprotein oder -polypeptid gerichtet sind.
Monoklonale Antikörper, die homogene Populationen von Antikörpern in Bezug auf ein bestimmtes Antigen sind, können durch eine beliebige Technik erhalten werden, die die Herstellung von Antikörpern, beispielsweise durch fortlaufende Zelllinien in einer Kultur, bereitstellt. Diese umfassen folgende, sind aber nicht auf diese beschränkt: die Hybridomtechnik von Kohler und Milstein (Nature 256, 495-497 (1975), und US-Patent Nr. 4.376.110), die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kosbor et al., Immunology Today 4, 72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030 (1983)) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc. (1985)). Solche Antikörper können einer beliebigen Immunglobulin-Klasse angehören, wie z.B. IgG, IgM, IgF, IgA, IgD und allen Unterklassen von diesen. Das Hybridom, das den erwünschten mAb produziert, kann in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von hohen mAbs-Titern in vivo ist das derzeit bevorzugte Herstellungsverfahren.
Verwendung von gegen inaktivierte Bakterien gerichteten Antikörpern
Die gegen die inaktivierte bakterielle immunogene Ganzzellen-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung gebildeten Antikörper können potentiell in diagnostischen Immuntests, passiver Immuntherapie und für die Herstellung von antiidiotypischen Antikörpern eingesetzt werden. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung, die für die Bildung der Antikörper eingesetzt wird, Bakterien, die genetisch verändert wurden, um ein heterologes Protein zu exprimieren oder ein endogenes Protein zu überexprimieren.
Die gebildeten Antikörper können durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Standardtechniken (z.B. Immunaffinitätschromatographie, Zentrifugation, Ausfällung etc.) isoliert und für diagnostische Immuntests eingesetzt werden, um die Gegenwart von Krebszellen oder Viren, Bakterien, Pilzen oder Parasiten, die von medizinischer oder veterinärer Bedeutung sind, in menschlichem oder tierischem Gewebe, Blut, Serum etc. nachzuweisen. Die Antikörper können auch eingesetzt werden, um den Fortschritt einer Behandlung und/oder einer Erkrankung zu beobachten. Ein auf dem Gebiet der Erfindung bekanntes Immuntestsystem, wie die hierin angeführten, kann zu diesem Zweck eingesetzt werden, wobei diese folgende kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme umfassen, die Techniken, wie z.B. Radioimmuntests, ELISA (enzymgekoppelte Immunabsorptionstests), "Sandwich"-Immuntests, Precipitinreaktionen, Geldiffusionprecipitinreaktionen, Immundiffusionstests, Agglutinationstests, Komplementfixierungstests, immunradiometrische Tests, Fluoreszenz-Immuntests, Protein-A-Immuntests und Immunelektrophoresetests etc., nutzen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Das erfindungsgemäße Impfstoffpräparat kann ebenfalls eingesetzt werden, um Antikörper für die Verwendung in der passiven Immuntherapie herzustellen, bei der der kurzfristige Schutz eines Wirts durch die Verabreichung von vorgebildeten, gegen einen heterologen Organismus gerichteten Antikörpern erreicht wird.
Die Antikörper, die durch die erfindungsgemäßen Impfstoffpräparate gebildet werden, können auch für die Produktion von antiidiotypischen Antikörpern eingesetzt werden. Die antiidiotypischen Antikörper können dann wiederum für die Immunisierung eingesetzt werden, um Subpopulationen von Antikörpern zu produzieren, die das ursprüngliche Antigen des pathogenen Mikroorganismus binden (N.K. Jerne, Ann. Immunol. 125c, 373, Paris (1974); N.K. Jerne et al., EMBO 1, 234 (1982)).
Formulierungen, Verabreichungswege und Dosierungen
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können auf beliebige passende Weise formuliert werden. Im Allgemeinen können die Vakzinen der vorliegenden Erfindung oral, nasal, nasopharyngeal, parenteral, enterisch, gastrisch, topisch, transdermal, subkutan, intramuskulär, in Tabletten-, Pulver-, Aerosolform, in fester oder flüssiger Form, fokal oder systemisch, mit oder ohne zusätzliche(n) Exzipienten verabreicht werden. Tatsächliche Verfahren für die Herstellung von Zusammensetzungen, die parenteral verabreicht werden können, sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt oder für diese offensichtlich und werden detailliert in Publikationen, wie z.B. Remington's Pharmaceutical Science (15. Aufl.), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), beschrieben.
Es wird anerkannt, dass die oben beschriebenen Polypeptide und verwandte Verbindungen vor Verdauung geschützt werden müssen, wenn sie oral verabreicht werden. Das kann dadurch erreicht werden, dass das inaktivierte Bakterium mit einem geeigneten resistenten Träger, wie z.B. einem Lipsom, gemischt oder in diesem verpackt wird. Die Präparate können ebenfalls als kontrolliert oder langsam freisetzende Darreichungsformen bereitgestellt werden, und die Verabreichung der Antigen-Präparate kann als Gemisch oder seriell erfolgen.
Die inaktivierten Vakzinen der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen in Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten bereitgestellt. Verschiedene pharmazeutisch annehmbare Exzipienten sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Wie hierin verwendet, umfassen "pharmazeutisch annehmbare Exzipienten" ein beliebiges Material, das es, wenn es mit einem Wirkstoff einer Zusammensetzung kombiniert wird, dem Wirkstoff ermöglicht, seine biologische Aktivität beizubehalten, ohne disruptive Reaktionen mit dem Immunsystem des Individuums hervorzurufen.
Beispielhafte pharmazeutische Träger umfassen sterile wässrige und nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele umfassen einen beliebigen pharmazeutischen Standardexzipienten, wie z.B. Phosphat-gepufferte Salzsäure, Wasser, Emulsionen, wie z.B. Öl/Wasseremulsionen, und verschiedne Arten von Benetzungsmitteln, sind aber nicht auf diese beschränkt. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie z.B. Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie z.B. Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen und Suspensionen, wie z.B. Salzlösung und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchloridlösung, Ringersche Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, taktierte Ringersche oder fette Öle. Intravenöse Träger umfassen Flüssigkeits- und Nährstoffauffüller, Elektrolytauffüller (wie z.B. die auf Ringerscher Dextrose basierenden) und dergleichen.
Eine Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Bakteriophagen umfasst, kann auch unter Einsatz von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Mitteln gefriergetrocknet werden, um dann rekonstituiert und gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt zu werden.
Formulierungen für liposomale Zuführung und Formulierungen, die mikroverkapselte bakterielle Ganzzellen-Vakzinen umfassen, sind ebenfalls von Interesse. Zusammensetzungen, die solche Exzipienten umfassen, werden gemäß bekannten herkömmlichen Verfahren formuliert (siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences (14. Aufl.), Kapitel 43, Mack Publishing Col, Easton, Pennsylvania 18042, USA).
Im Allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in verschiedenen Formen hergestellt werden, wie z.B. Körnchen, Tabletten, Pillen, Suppositorien, Kapseln (z.B. für die orale Zuführung geeignet), Mikroperlen, Mikrokugeln, Liposomen, Suspensionen, Salben, Lotionen und dergleichen. Für die pharmazeutische Verwendung geeignete organische und anorganische Träger und/oder Verdünnungsmittel, die für orale und topische Anwendung geeignet sind, können eingesetzt werden, um Zusammensetzungen herzustellen, die die therapeutisch aktiven Verbindungen umfassen. Verdünnungsmittel, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, umfassen wässrige Medien, pflanzliche und tierische Öle und Fette. Stabilisierende Wirkstoffe, Benetzungsmittel und Emulgatoren, Salze für die Variation des osmotischen Drucks oder Puffer zur Sicherstellung eines angemessenen pH-Werts.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zusätzlich zu dem Bakteriophagen weitere Komponenten umfassen. Zusätzlich dazu können die pharmazeutischen Zusammensetzungen mehr als einen Bakteriophagen, beispielsweise zwei oder mehr, drei oder mehr, fünf oder mehr oder zehn oder mehr verschiedene Bakteriophagen, umfassen, wobei die verschiednen Bakteriophagen für dieselben oder verschiedene Bakterien spezifisch sein können. Wie obenstehend angemerkt, können die Bakteriophagen gemeinsam mit anderen Wirkstoffen verabreicht werden, wie z.B. herkömmlichen antimikrobiellen Mitteln (siehe obenstehende Tabelle). In einigen Ausführungs formen kann es wünschenswert sein, den Bakteriophagen und ein Antibiotikum in derselben Formulierung zu verabreichen.
Die Zusammensetzungen werden einem Tier verabreicht, für das das Risiko besteht, dass es eine Erkrankung ausbildet, die von einem bakteriellen Pathogen hervorgerufen wird, um die Entwicklung der Erkrankung und der damit verbundenen Komplikationen zu verhindern oder zumindest teilweise zu stoppen. Eine Menge, die ausreicht, um das zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" bezeichnet. Mengen, die für den therapeutischen Einsatz wirksam sind, hängen beispielsweise von der Antigen-Zusammensetzung, der Verabreichungsart, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und der Einschätzung durch den verschreibenden Arzt ab. Es können einfache oder mehrfache Dosen der Zusammensetzungen verabreicht werden, abhängig von der Dosierung, der erforderlichen Häufigkeit, die der Patient verträgt, sowie vom Verabreichungsweg.
Mengen des Gemischs für die Immunisierung liegen im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 0,001 mg bis etwa 1,0 mg pro 70 kg Patient, üblicher zwischen etwa 0,001 mg bis etwa 0,2 mg pro 70 kg Patient. Dosierungen von 0,001 bis zu etwa 10 mg pro Patient pro Tag können eingesetzt werden, insbesondere wenn das Antigen an einer abgeschlossenen Stelle und nicht in den Blutkreislauf verabreicht wird, wie z.B. in eine Körperhöhle oder in den Hohlraum eines Organs. Deutlich höhere Dosierungen (z.B. 10 bis 100 mg oder mehr) sind bei oraler, nasaler oder topsicher Verabreichung möglich. Auf die erste Verabreichung des Gemischs kann eine Auffrischungsimmunisierung mit demselben oder einem anderen Gemisch folgen, wobei zumindest eine Auffrischung, gewöhnlicher zwei Auffrischungen, bevorzugt sind.
Die Erfindung zieht auch in Betracht, dass die Impfstoff-Zusammensetzung, die eine inaktivierte bakterielle Vakzine enthält, einen oder mehrere Bakterienstämme umfasst.
Die Vakzinen können einem beliebigen Individuum verabreicht werden, im Allgemeinen einem Säugetier, das an einer Infektion, die durch ein bakterielles Pathogen her vorgerufen wird, leidet oder zu dieser neigt. Individuen, die von besonderem Interesse sind, umfassen folgende, sind aber nicht notwendigerweise auf diese beschränkt: Menschen und Haustiere (z.B. Nutzvieh, Haustiere und dergleichen) sowie Tiere, die in Gefangenschaft gehalten werden (z.B. in Zoos oder Wasserparks).
Wenngleich das Individuum nicht immunologisch naiv sein muss, werden die erfindungsgemäßen Vakzinen typischerweise Individuen verabreicht, die in Bezug auf das bestimmte bakterielle Pathogen immunologisch naiv sind. In einer bestimmten Ausführungsform ist das Säugetier ein menschliches Kind im Alter von etwa 5 Jahren oder jünger und vorzugsweise im Alter von 2 Jahren oder jünger. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann als einzige Dosis verabreicht werden, oder, wenn erwünscht oder erforderlich, es kann auf die erste Dosis nach einigen Tagen, Wochen, Monaten oder Jahren eine Auffrischung folgen. Im Allgemeinen wird die Verabreichung an Säugetiere vorzugsweise vor dem ersten Auftreten von Krankheitssymptomen initiiert oder bei den ersten Anzeichen für eine mögliche oder tatsächliche Berührung mit dem bakteriellen Pathogen.
BEISPIELE
Die zuvor erläuterten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Beispielen detaillierter erläutert. Die vorliegende Erfindung wird jedoch durch die Beispiele nicht eingeschränkt, und Variationen werden für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar sein, ohne von dem Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Insbesondere können beliebige Bakterien und Phagen, von denen bekannt ist, dass sie diese Bakterien infizieren, in den Experimenten der folgenden Beispiele verwendet werden. Die folgenden Beispiele werden angeführt, um für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung eine vollständige Offenbarung und Beschreibung bereitzustellen, wie die vorliegende Erfindung herzustellen und einzusetzen ist, und sollen den Umfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, nicht einschränken. Man hat sich bemüht, die verwendeten Zahlen genau anzugeben (z.B. Mengen, Temperatur etc.), jedoch sollten experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, Molekulargewicht ist das gewichtsmittlere Molekulargewicht, Temperatur ist in Grad Celsius angegeben, und der Druck entspricht atmosphärischem Druck oder ist diesem nahe.
Beispiel 1: Bildung von Lys-Minus-T4-Phagen
Owen et al. (J. Mol. Biol. 165, 229 (1983)) berichteten über die Nucleotidsequenz des Lysozym-(e)-Gens des Bakteriophagen T4 zusammen mit 130 zusätzlichen Nucleotiden an jeder Seite. Die DNAs, die 100 Nucleotiden der stromab und stromauf gelegenen Regionen des e-Gens entsprechen, werden durch PCR isoliert und in das Ampicillin-resistente Plasmid PUC 18 kloniert, wobei zwischen den zwei Regionen einzelne Restriktionsstellen (Xba I und Pst I) liegen (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Eine DNA-Kassette, die das Gen für eine mutierte Form eines grünfluoreszierenden Proteins (GFP) umfasst, das 40-mal heller fluoresziert als das Wildtyp-Protein, wird als Xba-I-Pst-I-Fragment des Plasmids pmut2 hergestellt, das gfp trägt (B.P. Cormack, R.H. Valdivia und S. Falkow, Gene 173, 33 (1996)), und zwischen den stromauf und stromab gelegenen Sequenz des Lysozym-Gens in pUC18 (pGG8) eingeführt. Der Promotor und Terminator für die Expression von GFP in dieser Kassette werden durch den frühen Promotor des T4-Dihydrofolatreductasegens frd (M. Rosenberg und D. Court, Ann. Rev. Genet. 13, 319 (1979)) an dem 5'-Ende ersetzt, und der Transkriptionsterminator wird zwischen den Genen 44 und 45 von T4 (Spicer und Konigsberg in Bacteriophage T4, S. 299, Mathews, Kutter, Mosig und Berget (Hrsg.), American Society for Microbiology, Washington, DC (1983)) und dem 3'-Ende angeordnet. Der frd-Promotor befindet sich in der Klasse der unmittelbaren frühen T4-Promotoren, die unter den ersten sind, die in den mit T4 infizierten Zellen exprimiert werden. Die Wirts-RNA-Polymerase wird für die Transkription von diesem Promotor genutzt.
Das Plasmid pGG8 wird durch das RbCl-Verfahren in E.-coli-HB101-Zellen transformiert und aufgrund von Ampicillin-Resistenz ausgewählt. E.-coli-HB101-Zellen, in denen das Plasmid pGG8 zusammen mit dem mutierten Lysozym-Gen vorhanden ist, werden dann mit dem T4-Phagen des Wildtyps bei einer geringen Infektionsmultiplizität infiziert. Bei der Replikation erfolgt teillweise eine Kombination mit dem mutierten Lysozym-Gen, das auf den Plasmiden in den Zellen getragen wird, um Lys-Minus-Phagen zu erhalten. Es ist wahrscheinlich, dass die Rekombination in beliebigen Zellen nicht zu 100 % wirksam ist. Beide Phagen-Typen werden durch das Lysieren der bakteriellen Zellen mit Chloroform gesammelt, und die Lys-Minus-Phagen werden von den Phagen des Wildtyps durch Plaque-Reinigung getrennt. Jedes Plaque wird dann getestet, um festzustellen, ob es Wildtyp oder Lys-Minus ist. Lys-Minus-Phagen können durch die grüne Fluoreszenz der Replika-Platten unter UV-Licht identifiziert werden, da GFP durch den frühen T4-Promotor exprimiert wird. Das kann weiters dadurch bestätigt werden, dass der Phage von jedem Plaque mit normalen E.-coli-HB101-Zellen sowie Zellen, die das unten beschriebene Lysin-Gen exprimieren, getestet wird. Während der Phage des Wildtyps beide Wirte tötet, tötet der Lys-Minus-Phage nur die Wirtszellen, die Lysin exprimieren.
Beispiel 2: Herstellung von Lys-Minus-T4-Phagen in E. coli
Das Zwei-Gen-Lysesystem des Pneumokokkan-Phagen Cp-1 wurde kloniert und in E. coli exprimiert (Martin et al., J. Bacteriol. 180, 210 (1998)). PCR unter Einsatz von Cp1-DNA als Matrix erzeugt DNA-Fragmente, die das cpl1-(Lysin-) Gen oder die cph1-cpl1-(Holin-Lysin-) Kassettengene enthalten, wobei die Gene ihre eigenen Ribosomen-Bindungsstellen beibehalten. Unter Einsatz der geeigneten Oligonucleotide werden Sac-II- und Sac-I-Restriktionsstellen an dem 5'- und dem 3'-Ende der PCR-Fragmente erzeugt, um in das Plasmid pNM185 zu klonieren (Mermod et al., J. Bacteriol. 167, 447 (1986)). Das cpl1-Gen oder die Kassette, die die cph1- und cpl1-Gene umfasst, werden unter Kontrolle eines positiv regulierten Promotors (Pm) des Meta-Weg-Operons des TOL-Plasmids exprimiert. Die Transkription der Gene von Pm wird spezifisch durch das Produkt des xylS-Regulator-Gens nur dann induziert, wenn Effektormoleküle, wie z.B. 3-Methylbenzoat, vorhanden sind. Die Transformation von E.-coli-HB101-Zellen mit den pNM185-Plasmiden, die cpl1 oder die cph1-cpl1-Kassette tragen, erfolgt unter Einsatz des RbCl-Verfahrens (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Die transformierten E.-coli-HB101-Zellen werden in LB-Bouillon oder einem anderen geeigneten Medium kultiviert und mit dem Lys-Minus-T4-Phagen geimpft. Zu einem geeigneten Zeitpunkt wird die Expression von cpl1 oder der cph1-cpl1-Kassette auf dem pNM185-Plasmid durch die Zugabe von 2 mM 3-Methylbenzoat induziert, um die Lys-Minus-T4-Phagen-Nachkommen freizusetzen.
Beispiel 3: Herstellung des Plasmids pGMB021 für den Einsatz in der Produktion von rekombinanten Lys-Minus-Phagen
Materialien und Verfahren. Markierte DNA-Polymerase, dNTP, Phosphatase aus Kälberdarm, Restriktionsenzyme, Primer und T4-DNA-Ligase wurden von Bangalore Genei Pvt., Ltd. (BGPL), Bangalore, bezogen. pRSET-Verktoren wurden von Invitrogen Ltd., USA, bezogen.
Die Ligationen erfolgten mit einem Vektor:Insert-Verhältnis von 1:10 M. Die PCR-Produkte wurden, wenn nicht anders angegeben, gemeinsam mit verdauten Vektoren unter Einsatz der Reaktanten eines Quiagen-Gelextraktionssets von Agarose-Gel gereinigt.
Konstruktion des T4-Lysozym-Klons in einem T7-Promotor-basierten pRSETB-Vektor (pRSETB-T4L). Die PCR-Amplifikation des Lysin-Gens von T4 erfolgte mit dem von BGPL bezogenen T4-Phagen des Wildtyps unter Einsatz der folgenden Primer:

GMB1: Vorwärts 5' CG GAA TTC CAT ATG AAT ATA TTT GAA ATG TTA CGT 3' (Seq.-ID. Nr. 1)
GMB2: Rückwärts 5' AA AGC GGC CGC AAG CTT TAG ATT TTT ATA CGC GTC CCA 3' (Seq.-ID. Nr. 2)

Die ursprüngliche Denaturierung erfolgte 4 min lang bei 95 °C, wonach 30 30 s lange Denaturierungszyklen bei 95 °C, 30 s langes Annealing bei 55 °C und 30 s lange Ex tension bei 72 °C folgten. Die Inhalte wurden schließlich 7 min lang bei 72 °C verlängert.
Dann wurde das erhaltene PCR-Produkt gereinigt und vor der Ligation an den mit Pvull verdauten und mit CIP dephosphorylierten pRSETB-Vektor mit Klenow aufgefüllt. Das Verhältnis von Vektor zu Insert wurde bei 1:10 M gehalten. Die Ligation erfolgte 5 h lang bei 22 °C, und dann wurden die DH5-α-kompetenten Zellen mit dem oben erläuterten Ligationsgemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf einer LB-amp-Platte (100 μg/ml Endkonzentration) bei 37 °C über Nacht ausgewählt. Die Transformanten wurden durch eine Pool-Kolonie-PCR gescreent, und die positiven Klone wurden in Bezug auf Restriktionsverdau nach der DNA-Isolation untersucht.
Die DNA der positiven Klone wurde mittels ABI-Prism von Pharmacia sequenziert. Die oben genannten Klone exprimierten T4-Lysozym-Protein, wie auf SDS-PAGE-Gel beobachtet wurde. Das Protein war, wie erwartet, ein His-markiertes Lysin-Protein mit 25 kDa (siehe 2, Spuren 1 und 2). PGMB011 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
Konstruktion von GFP als His-Markierungs-Fusionsprotein in einem pRSETA-Vektor (pRSETA-GFP). Um das Lysin-Gen mit einem Reportergen zu unterbrechen, wurde das GFP-Gen ausgewählt. Zunächst wurde das GFP-Gen von pUC-GFP-Plasmid in dem GFP-Lehrset von BGPL unter Einsatz der folgenden Primer amplifiziert:

GMB5: Vorwärts 5' CC GGA ATT CAT ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC 3' (Seq.-ID Nr. 3)
GMB6: Rückwärts 5' CC GGA ATT CAT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC 3' (Seq.-ID Nr. 4)

Die ursprüngliche Denaturierung erfolgte 4 min lang bei 95 °C, gefolgt von 30 30 s langen Denaturierungszyklen bei 94 °C, 30 s langem Annealing bei 60 °C und 30 sec langer Extension bei 72 °C. Die endgültige Extension erfolgte 7 min lang bei 72 °C. Das gereinigte Produkt wurde mit EcoR1 verdaut und dann mit pRSETA, das mit EcoR1 geschnitten war, ligiert.
Die Klone wurden dann mittels Pool-Kolonie-PCR in Bezug auf GFP gescreent, und eine geringe Expression von GFP war auf SDS-PAGE zu erkennen. Alle Klone wurden unter UV-Licht in Bezug auf GFP-Fluoreszenz untersucht, was darauf hindeutete, dass die Klone GFP in korrekter Ausrichtung in Bezug auf den T7-Promotor aufwiesen. Die Größe des GFP-Proteins betrug, wie erwartet, 36 kDa.
Unterbrechung des T4-Lysin-Gens mit GFP im Raster mit dem 5'-Ende des T4-Lysin-Gens zur Konstruktion von pGMB021. Das GFP-Fragment des pRSETA-GFP-Klons wurde dann in teilweise mit EcoR1 verdautes pGMB011 (einen oben hergestellten pRSETB-T4L-Vektor) subkloniert. Die Transformanten wurden mit GMB5/GMB6 in Bezug auf PCR gescreent und dann durch die geringe Expression des Hismarkierten Lysin-GFP-Fusionsproteins untersucht. Das His-markierte Lysin-GFP-Fusionsprotein wurde von dem oben genannten Klon exprimiert (42 kDa) (siehe 2, Spuren 3 und 4) und fluoreszierte unter UV-Licht, was darauf hinwies, dass das GFP-Gen in dieser Konstruktion intakt war.
Der oben genannte Klon wurde weiters mit GMB1/GMB2-Primern (T4-Lysin-spezifische Primer) in Bezug auf PCR getestet. Wie erwartet, ergab die PCR mit GMB1/GMB2 ein Produkt von Lysin-GFP-Lysin mit etwa 1200 bp, das intakte Lysin- und GFP-Gene aufwies (3). Dieser Klon wurde in dem untenstehend in Beispiel 4 beschriebenen Rekombinationsexperiment eingesetzt.
Beispiel 4: Herstellung und Isolation von rekombinanten Lys-Minus-Phagen
DH5α-Zellen, die das Plasmid pGMB021 enthielten, wurden mit wilden T4-Phagen bei einer Infektionsmultiplizität von 2,5 infiziert. Diese hohe Infektionsmultiplizität stellt sicher, dass jede Zelle mit zumindest einem Phagen infiziert ist. Nach 40 min Inkubation wurde Chloroform (1 %) zugesetzt, und das Lysat wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde getrennt und 30 min lang bei Raumtemperatur belüftet, um das restliche Chloroform abzudampfen.
Das Lysat wurde 30 min lang bei 37 °C mit DNase (50 μg/ml) behandelt, um die chromosomale DNA und die Plasmid-DNA zu verdauen, und wurde dann getitert. Dann wurden normale E.-coli-Zellen (die kein Plasmid trugen) mit dem Lysat bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1 infiziert. Diese geringe Infektionsmultiplizität stellt sicher, dass alle infizierten Zellen einen einzigen Phagen umfassen, der dann dazu dient, die rekombinanten von den wilden Phagen zu trennen.
Das oben beschriebenen Infektionsgemisch wurde 30 min lang bei 37 °C inkubiert und dann zentrifugiert. Das Zell-Pellet und der Überstand wurden getrennt. Die Zellen, die einen rekombinante Lys-Minus-Phagen enthalten, lysieren nicht und waren deshalb gemeinsam mit den nicht-infizierten Zellen in dem Zell-Pellet vorhanden. Der Überstand wurde verworfen, da dieser Anteil wahrscheinlich die meisten wilden Phagen enthielt. Das Pellet wurde dann in Nährmedium (Luria-Bouillon) suspendiert und mit Eiweiß-Lysozym (10 μg/ml) und Chloroform (2 %) lysiert. Dieses Lysat wurde eingesetzt, um BL21(DE3)-pLys-E-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1 zu infizieren, und wurde auf einen Rasen derselben Zellen ausplattiert. Diese Zellen wurden speziell für diesen Schritt ausgewählt, da sie von einem Plasmid konstitutiv T7-Phagen-Lysozym exprimieren und Lys-Minus-Phagen helfen würden, Plaques zu bilden.
Zwei Arten von Plaques waren auf der Platte sichtbar – mehrere Wildtyp-Plaques und wenige winzige oder Nadelpunkt-Plaques. Die Nadelpunkt-Plaques wurden aufgesammelt und in Kulturmedium suspendiert. Dann wurde ermöglicht, dass diese die BL21(DE3)pLysE-Zellen infizieren, wonach sie auf einem 1:1-Gemisch von BL21(DE3)pLysE-(die T7-Lysozym produzieren) und LE392-Zellen (kein Lysozym) ausplattiert wurden.
Trübe Bereiche, die die rekombinanten Phagen darstellen, waren auf dem Rasen des Zellgemischs unter den Wildtyp-Plaques zu erkennen. Diese trüben Bereiche wurden gesammelt. Ein Teil wurde für eine PCR in Wasser suspendiert, und der Rest wurde in Kulturmedium suspendiert. Aus vielen dieser trüben Plaques konnte GFP-Genprodukt amplifiziert werden (4).
Das T4-Lysin-GFP-Lysin mit voller Länge wurde ebenfalls amplifiziert. Jedoch war auch Wildtyp-Lysin-Genprodukt vorhanden, was auf die Gegenwart von wilden Phagen hindeutete (5 und 6). Die selektive Eliminierung der wilden Phagenform dieser Lysate erfolgte durch das Infizieren der Zellen bei einer niedrigen Infektionsmultiplizität und die 40 min lange Lyse der Zellen. Zu diesem Zeitpunkt hätten die wilden Phagen eine weitere Infektionsrunde begonnen und befinden sich (in DNA-Form) in der Eklipse-Stufe. Die Lyse der Zellen zerstört demnach die wilden Phagen, bevor sie Partikel bilden. Nach 3-5 Eliminierungsrunden wiesen die Lysate keine Plaques mehr auf (7). Die Bestätigung der Gegenwart von rekombinanten Phagen in solchen Lysaten und die Quantifizierung erfolgten durch eine Schätzung der Anzahl der lebensfähigen Zellen nach der Infektion. Der Verlust der Lebensfähigkeit von infizierten Zellen wurde beim Ausplattieren des Infektionsgemischs deutlich (8).
Um die rekombinanten Phagen anzureichern und den Einsatz von Chloroform und die externe Zuführung von Lysozym zu vermeiden, wurde ein sensibler mutierter E.-coli-Zelltyp (RE 7) (der bei 30 °C wächst und bei 42 °C lysiert) verwendet. Die Anreicherung der rekombinanten Phagen auf ~2 × 10⁸/ml wurde erreicht. Dieses Präparat wurde verwendet, um einen pathogenen E.-coli-Stamm mit einer Infektionsmultiplizität von 2 zu infizieren. Diese Zellen verursachen in ihrem nativen Zustand den Tod von 80 % der Tiere, wenn sie in einer Dosis von 10⁸ Zellen/Maus innerhalb von 48 h injiziert werden. Die durch die rekombinanten Phagen inaktivierten pathogenen Zellen wurden in Mäuse injiziert, um die Wirksamkeit als inaktivierte Ganzzellen-Vakzine zu bewerten.
Beispiel 5: Voruntersuchung der Wirksamkeit von Lys-Minus-Phagen für den Schutz von Mäusen gegen eine experimentelle E.-coli-Infektion:
6-8 Wochen alten männlichen und weiblichen Schweizer Albinomäusen wurde intraperitoneal ein pathogener E.-coli-Stamm injiziert, der bei 108 KBE eine 100 %ige Mortalität verursacht. Alle Mäuse starben innerhalb von 48 h.
Als den Mäusen 5 × 10⁷ Zellen injiziert wurden, wurde eine 70-80% ige Mortalität beobachtet. Bei 10⁶ KBE lag jedoch keine Mortalität vor.
Mäusen wurden (i) 10⁶ Wildtyp-Zellen oder (ii) 10⁶ Zellen, die durch eine Infektion mit Lys-Minus-Phagen nicht lebensfähig waren, injiziert. Nach 10 Tagen für die Entwicklung der Immunantwort wurden die Tiere mit Wildtyp-Zellen (5 × 10⁷ KBE) provoziert, ebenso wie Tiere, denen nur Salzlösung verabreicht worden war, und bis zu 10 Tage lang beobachtet. In der Gruppe, der mit Lys-Minus-Phagen inaktivierte E.coli verabreicht worden waren, lag eine signifikante Mortalität vor, wahrscheinlich aufgrund von Endotoxin.
In der Träger-Kontrollgruppe betrug die Mortalität, wie erwartet, 80 %. In der Gruppe, in der Wildtyp-Zellen als Vakzine verwendet wurden, wurde eine 20%ige Mortalität beobachtet, was auf einen 80%igen Schutz hindeutet. In der Gruppe, in der die Zellen durch den Lys-Minus-Phagen inaktiviert worden waren, lag keine Mortalität vor, was auf einen vollständigen Schutz hindeutet.
Antikörperantwort:
Um die Gegenwart von Antikörpern in den Mäusen, die in den verschiedenen Gruppen überlebt hatten, zu untersuchen, wurden diese Mäuse 7 Tage nach Verabreichung der provozierenden Dosis getötet, und es wurde Serum gewonnen. Das Serum wurde von Tieren der nicht provozierten Kontrollträger-Gruppe als negative Kontrolle gewonnen. Die Serumproben wurden in Bezug auf ihre Reaktivität auf E.-coli-443-Zellen untersucht. Die Gegenwart von Anti-E.-coli-Antikörpern in den Seren wurde durch einen herkömmlichen ELISA unter Einsatz eines E.-coli-Zell-Präparats (Stamm Nr. MTCC443), das in Mikroplattenvertiefungen zum Einfangen aufgetragen wurde, und von mit alkalischen Phosphatase-Enzymen konjugiertem Anti-Maus-IgG als Reporter getestet. Die Mäuse wurden im Vergleich mit dem Mittel der OD-Werte der 6 verwendeten negativen Kontrollseren als "positiv" für Anti-E.-coli-Antikörper bewertet.
Alle Mäuse, die die Provokation überlebten, wiesen Anti-E.-coli-443-Antikörper auf. Die Lys-Minus-Phagen-Gruppe war mit der Gruppe, der Lebendzellen verabreicht worden war, vergleichbar. Alle in der untenstehenden Tabelle angeführten Werte sind Mittelwerte von Doppeltests. Die mittlere OD der Kontrolltiere (6), die E. coli nicht ausgesetzt wurden (nicht infizierte Kontrolle), betrug 0,3.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Auslösung einer Immunantwort auf ein bakterielles Pathogen in einem Individuum, das anfällig für eine Infektion mit einer Krankheit ist, die durch ein pathogenes Bakterium ausgelöst wird, worin die Zusammensetzung das durch Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktivierte pathogene Bakterium umfasst und worin das Medikament in einer Menge verabreicht wird, die zur Auslösung einer Immunantwort auf das pathogene Bakterium im Wirt wirksam ist.
Verwendung einer inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung bei der Herstellung einer Vakzine zur Impfung eines Individuums gegen eine Krankheit, die durch ein bakterielles Pathogen ausgelöst wird, wobei die Vakzine das durch Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktivierte pathogene Bakterium umfasst und worin die Vakzine in einer Menge verabreicht wird, die zur Auslösung einer Immunantwort auf das pathogene Bakterium im Individuum wirksam ist.
Verwendung einer inaktivierten bakteriellen Ganzzellen-Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Auslösung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum, worin die Zusammensetzung ein durch Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktiviertes Bakterium umfasst und worin das Medika ment in einer Menge verabreicht wird, die zur Auslösung einer Immunantwort auf ein im oder am Bakterium vorhandenes Antigen wirksam ist.
Zusammensetzung, ein inaktiviertes Bakterium und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfassend, worin das inaktivierte Bakterium durch Infektion eines pathogenen Bakteriums mit einem Lys-Minus-Bakteriophagen hergestellt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin das pathogene Bakterium, das durch Infektion mit einem lysedefekten Bakteriophagen inaktiviert ist, gentechnisch verändert ist, um ein endogenes Antigen zu überexprimieren.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das pathogene Bakterium zu einer aus der aus Mykobakterium, Staphylokokkus, Vibrio, Enterobacter, Enterokokkus, Escherichia, Hämophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Salmonella, Streptokokkus, Klebsiella und Yersinia bestehenden Gruppe ausgewählten Gattung gehört.
Verwendung nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3 oder Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der lysedefekte Bakteriophage ein Lys-Minus-Bakteriophage ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Antigen ein bakterielles Antigen ist, das in Bezug auf das Bakterium endogen ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin das Antigen ein rekombinantes Antigen ist.
Verwendung nach Anspruch 9, worin das rekombinante Antigen in Bezug auf das Bakterium exogen ist.