DE3886506T2

DE3886506T2 - Avirulente mikroben und deren verwendungen.

Info

Publication number: DE3886506T2
Application number: DE3886506T
Authority: DE
Inventors: Roy Curtiss
Original assignee: MEGA HOLDING; St Louis University
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1987-06-04
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2008-06-02
Also published as: EP0315682B1; NZ224884A; DK52789A; CA1338957C; EP0315682A1; DK175512B1; CN1030018A; JPH01503442A; IE881646L; DK52789D0; KR0139950B1; ZA883954B; DE3886506D1; ATE98870T1; AU623599B2; US5389368A; IE63905B1; JP2640525B2; WO1988009669A1; IL86583A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft avirulente Mikroben, deren Herstellungsverfahren und Verwendung in Impfstoffen.
Früher verwendete Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten haben im allgemeinen umfaßt (I) spezifische Bestandteile, die aus den etiologischen Agentien gereinigt waren, einschließlich intakter Antigene, Fragmente davon, oder synthetischer Analaga van natürlich vorkommenden Antigenen oder Epitopen, (II) antiidiotypische Antikörper, (III) das ganze abgetätete etiologische Agens, oder (IV) ein avirulentes Derivat des etiologischen Agens als Lebendimpfstoff. Es gibt zahlreiche Impfstoffe dieser Typen, von denen die folgenden ausgewählte Beispiele darstellen:
US 4.250.262 offenbart Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Glucosyltransferase aus Streptococcus mutans sowie die Verwendung dieses gereinigten Enzyms zur lokalen Immunisierung gegen Zahnkaries, ein Impfstoff vom Typ (I). Details zur Züchtung der Bakterien, Beinigung des Enzyms und Verwendung des Enzyms zur Stimulierung von IgA-Antikörper in Speichel sind für Serotyp a, c oder g von S. mutans dargelegt. Weitere Beispiele von Impfstoffen aus gereinigten spezifischen Bestandteilen von Bakterien sind zu finden in US 4.203.971 und 3.239.749, welche einen Impfstoff zur Verwendung gegen Infektion durch Neisseria gonnorrhoeae offenbaren, welcher aus einem Glycoprotein aus dem Aussenüberzugsmaterial von Gonokokken besteht. Die Injektion des Glycoproteins stimuliert einen bakteriziden Antikorper.
Die Verwendung toter S. mutans Zellen zur Immunisierung gegen Zahnausfall durch Verabreichung in den Mund, welche in US 3.931.398 offenbart ist, stellt ein Beispiel eines Impfstoffs vom Typ III dar. Die Erfinder haben herausgefunden, daß Immimoglobulin A (IgA)-Antikörper die erzeugten Antikörper waren und zu einer Abnahme bei der Zahnschmelzbildung führten.
Ein baktierieller Lebendimpfstoff (Typ IV), der ausgewählte Stämme von Escherichia coli-Bakterien enthält, ist in US 3.975.517 offenbart. Die Bakterien wurden mit verdünntem Formalin behandelt, um sie abzuschwächen oder teilweise zu inaktivieren, vor der Injektion in die Brustdrüse einer Sau. Der dabei erzeugte Antikörper wurde später in der Milch gefunden und schützte neugeborene Schweine vor E. coli Infektionen. Die Behandlung mit Formalin, die die Inaktivierung der E. coli hervorrief, war nur eine zeitlich begrenzte Abschwächung der Bakterien, und es mußte Sorge getragen werden, ein bakterielles Wiederauftreten vor einer Injektion zu verhindern. Ein solches Wiederauftreten hätte eher zu einer ernsthaften Infektion als zu einem Schutz geführt.
Es ist möglich gewesen, avirulente Stämme durch die Einführung von Mutanten in die genannten Stämme zu entwickeln, was bei den Stämmen dazu führt, daß sie zu einem Überleben in einer Wirtszelle im wesentlichen nicht befähigt sind. Von diesen Stämmen kann gesagt werden, daß sie genetisch abgeschwätht sind. Zur leichteren Beschreibung werden die Prinzipien der genetischen Herabsetzung unter Bezug auf das Salmonella- System erläutert, die Prinzipien sind jedoch in breitem Umfang anwendbar, wie dies nachfolgend diskutiert wird.
Salmonella typhimurium, S. typhi, und weitere Salmonella-Spezies mit Eindringeigenschaften befallen tiefe Gewebe nach oraler Einnahme, indem sie sich festsetzen an, eindringen und fortpflanzen in die/den Zellen des Darm-bezogenen Lymphoidgewebes (gut-associated lmphoid tissue = GALT; Peyer's Patches) (Carter and Collins, J. Exp. Med. 139: 1189 - 1203, (1974)). Da eine Salmonellen-vermittelte Lieferung eines Antigens an das GALT eine verallgemeinerte sekretorische Immunreaktion sowie humorale und zelluläre Immunreaktionen hervorbringt, ist es wahrscheinlich, daß avirulente Salmonella-Mutanten, die die Fähigkeit zur Verursachung einer Erkrankung oder Beeinträchtigung ihrer Befähigung zum Festsetzen und Eindringen am bzw. in das GALT verloren haben, als wirksam me Vektoren dienen, um fremde Antigene, wie Kolonisations- oder Virulenzantigene, an das GALT zu liefern und eine schützende Immunität gegen das Pathogen zu induzieren, aus welchem solche Antigene abgeleitet wurden. Der Aufbau avirulenter Salmonella-Impfstoffstämme, die Antigene aus anderen Mikroorganismen exprimieren, ist über klassiche Gentransferverfahren (Formal et al., Infect. Immun. 34; 746-750, (1981)) sowie durch Anwendung rekombinanter DNA-Technologien vollbracht worden. Im letzteren Fall sind avirulente Salmonella-Stämme aufgebaut worden, wobei Gene aus Organismen exprimiert wurden, die normalerweise genetische Informationen mit Salmonellen austauschen (Stevenson and Manning FEMS Microbiol. Lett 28:317-321 (1985); Clements et al., Infect. Imm. 53: 685-692, (1986) sowie aus Mikroorganismen, die zur Übertragung genetischer Information an Salmonellen unfähig sind, durch klassische Berfahrensmaßnahmen von Genübertragung (Curtiss J. Dent Res 65: 1039-1045, (1986)). Bei solchen bivalent avirulenten Salnonella-Stämmen ist gezeigt worden, daß sie Antikörper und in 1 Beispiel eine zelluläre Immunreaktion (Braun et al., J. Infect Dis. 155:86-92 (1987)) auf das exprimierte Antigen hervorbringen, aber es mangelt immer noch an Daten, betreffend die Induktion einer Schutzimmunität gegen das Pathogen, wobei das Kolonisations- oder Virulenzantigen geliefert wird.
Bacon et al (Brit. J. Exp. Pathol. 32:85-96, (1951)) waren die ersten, die die Avirulenz auzotropher Mutanten von S. typhi. untersucht haben. Sie bemerkten, daß Mutanten mit Bedarfserfordernissen für Purine, p-Aminobenzoesäure und Aspartat bei Mäusen eine herabgesetzte Virulenz aufwiesen. Germanier und Furer (Infect. Immun. 4:663-673 (1971)) untersuchten als erste die Verwendung von galE-Mutanten von S. typhimurium zui Avirulenz und Immunogenizität bei Mäusen und schlugen dann die Verwendung des S. typhi galE-Mutanten Ty21a als einen Impfstoff gegen Typhoidfieber bei Menschen vor (J. Infect. Dis. 131:553-558 (197-5)). Stocker (US 4.550.081) wandte eine Transposon-Mutagenese bei Tn10 unter anschließender Selektion für Fusarinsäureresistenz an, welche zum Deletionsverlust von Tn10 und angrenzender DNA-Sequenzen führt, um Deletionsmutanten zu ergeben, die unbefähigt sind, zu revertieren, ein Problem, das bei den von Bacon et al. verwendeten Mutanten erkennbar war. Stocker isolierte anfänglich aroA-Deletions (Δ) -Mutanten, die in der Befähigung beeinträchtigt waren, die aromatische Aminosäurefamilie von Verbindungen, einschließlich p-Aminobenzoesäure, benötigt zur Folat-Biosynthese, und Dihydroxybenzoesäure, eine Vorstufe zu Enterochelin, zu synthetisieren, und kürzlich kombinierte er den ΔaroA-Mutant mit einem Deletionsmutant, unter Abschaffung der Adenin-Biosynthese. Tn10-induzierte und Fusarinsäureresistenz-erzeugte Δasd-Mutanten, die einen Bedarf für Diaminopimelinsäure auferlegen, sind angewandt worden, um S. typhimurium avirulent zu stellen, ohne dessen Befähigung zu beeinträchtigen eine verallgemeinerte sekretorische Immunreaktion zu induzieren. Da viele Salmonellen ein Plasmid besitzen, das zur Virulenz beiträgt sind Plasmid-entledigte Derivate untersucht und zur Verwendung als Lebendimpfstoffe vorgeschlagen worden (Nakamura et al., Infect. Immun. 50:586-587 (1985)).
Obwohl jede der oben beschriebenen Maßnahmen, Salmonellen ohne Beeinträchtigung der Immunigenzizität avirulent zu stellen, ihre Verdiene ste aufweist, birgt jede Maßnahme auch ihre Probleme in sich. galE- Mutanten sind bei Aufrechterhaltung der Immunogenizität nur schwierig zu züchten, da sie Galactose-empfindlich sind, müssen aber in der Gegenwart von Galactose gezüchtet werden, um normal LPS zu erzeugen, was allerdings selektiv zu Galactose-resistenten Varianten führt, die nicht-Immunogen sind. Obwohl ΔaroA-Mutanten die Synthese sowohl von Enterochelin als auch von Folsäure abschaffen, ist die Notwendigkeit von Enterochelin für S. typhimurium-Virulenz durch die umfangreichen Ergebnisse von Benjamin et al (Infect. Immun. 50:392-97 (1985)) in Frage gestellt worden, welche belegen, daß jegliche und alle Mutanten, die die Befähigung von S.typhimurium stören, Eisen zu chelatisieren und transportieren, onne signifikante Wirkung auf die Virulenz sind. Deshalb ist die Avirulenz von ΔaroA-Mutanten sehr wahrscheinlich lediglich begründet durch die Unfähigkeit, p-Aminobenzoesäure (p-ABA) und demzufolge Folsäure zu synthetisieren. Da Bacon et al (siehe oben) beobachtete, daß eine Verabreichung von p-Aminobenzoesäure bei der Diätbehandlung von Mäusen, die mit zur Synthese von pABA nicht befähigten Mutanten infiziert waren, zu Gehalten von Virulenz eines wilden Typs führten, muß man mit phänotypischer Umkehr vov Avirulenz in Impfstoffstämmen wegen diätetischen Verbrauch von Metaboliten rechnen, deren Synthese in den avirulenten Mutanten blockiert ist. Die Δasd-Mutanten, obwohl sie einige dieser weiteren Schwierigkeiten nicht aufweisen, sterben rasch ab in der Folge von oraler Verfütterung und Invasion des GALT, und sie sind daher nur dahingehend wirksam, eine verallgemeinerte mukosale Immunität herbeizuführen, und sie sind unwirksam zur Induzierung humoraler und zellulärer Immunität.
WO-A-8603123 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines nichtrevertierenden Salmonellen-Lebendimpfstoffes. Bei diesem Verfahren werden Zellen eines eine Immunreaktion erzeugenden Stammes übertragen, so daß sein Genom unbefähigt ist, Metaboliten zu exprimieren, die in der Wirtszelle normalerweise unerhältlch sind. Die entstehenden Mutanten können nicht durch eine einzelne Stufe wie durch Polynukleotidaddition oder - inversion repariert werden. Der Mutant mit diesen Mutationen weist eine reduzierte Virulenz auf, behält aber die angestrebte Immunogenizität bei. Agrigultural and Biological Chemistry, Vol. 48, Nr. 8, 1984, S. 2129-2130, offenbart ein Verfahren zur Konstruktion (Erstellung) von Adenylat-Cyclase oder c-AMp-Fezeptorprotein-Mangelmutanten von E. Coli K- 12.
Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf die Behebung der Mängel von Impfstoffen des Standes der Technik, und zwar durch Einsatz Transposon-induzierter Mutanten, bei denen die zu Avirulenz führende Beeinträchtigung durch Diätbehandlung oder durch irgendetwas, was der tierische Wirt liefern könnte nicht zu reparieren bzw. aufzuheben ist. Diese Deletionen konnten, natürlich, durch rekombinante DNA-Techniken eingeführt werden.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Impfstoff für die Immunisierung eines Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers bereitgestellt, welcher ein avirulentes Derivat einer pathogenen Mikrobe umfaßt wobei das genannte Derivat im wesentlichen unbefähigt ist, funktionelle Adenylat- Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein zu produzieren.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein Imfpstoff für die Immunisierung eines Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers bereitgestellt, welcher ein avirulentes Derivat einer Mikrobe umfaßt, wobei das genannte Derivat unbefähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclische AMP- Rezeptorprotein zu produzieren, wobei es befähigt ist, ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das aus einem Pathogen des genannten Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers abgeleitet ist, um ein Antigen zu produzieren, das befähigt ist, eine Immunreaktion im genannten Wirbeltier oder wirbellosen Tier gegen das genannte Pathogen zu induzieren.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen unbefähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein zu produzieren, zur Herstellung eine Impfstoffes zur Stimulierung des Immunsystems in einem Wirbeltier oder wirbellosen Tier zur Verfügung gestellt.
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenfalls die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen unbefähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Bezeptorprotein zu produzieren, zur Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung, Regulierung und Desensibilisierung des Immunsystems in einem Wirbeltier oder wirbellosen Tier zur Verfügung gestellt.
Durch die vorliegende Erfindung wird schließlich auch ein Verfahren zur Erzeugung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat unbefähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-.Rezeptorprotein zu produzieren, zur Verfügung gestellt, wobei die pathogene Mikrobe mittels Transposon-Mutagenese mutiert wird, um Deletionsmutanten in jedem der Gene für Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP.-Rezeptorprotein zu bilden, und wobei man die genannten Derivate isoliert. Dieselbe Aufgabe kann auch gelöst werden durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken, um Deletionen in den Genen für Adenylat-Cyclase und die cyclischen AMP-Rezeptorproteine zu erzeugen. Fig. 1 zeigt die Gewinnung von S. typhimurium Δcya Δcrp χ4064 (O) und Wild-Typ χ3456 ( ) aus Peyer's Patches (d.h. GALT) zu bestimmten Zeitpunkten nach peroraler Inoculation mit 7,4 x 10&sup8; cfu an χ4064 und 4,0 x 10&sup8; cfu an χ3456. Die senkrechten Balken geben die Standardabweichungen an.
Fig. 2 zeigt die Gewinnung von S. typhimurium Δcya Δcrp χ4064 ( Δ) und Wild-Typ χ3456 ( Δ) aus mesenterischen Lymphknoten ( ) und aus Milz (Δ Δ) zu bestimmten Zeitpunkten nach peroraler Inoculation mit 7,4 x 10&sup8; cfu an χ4064 und 4,0 x 10&sup8; cfu an χ3456. Die senkrechten Balken geben die Standardabweichungen an.
Fig. 3 zeigt den Plasmidgehalt bestimmter S. typhimurium Stämme. Plasmid-DNA wurde durch das Verfahren von Birnboim (Methods, Enzmol. 100:243-255, 1983) extrahiert, in einem 0,5%-igen (G/V) Agarosegel gelöst und mit Ethidiumbromid angefärbt. χ3344 und χ3337 Lysate wurden mit Phenol/Chloroform/Ether extrahiert und einer Dichtegradientzentrifugation nicht unterzogen. Stamm (100 kb Plasmid) in Bahnen: a, χ30000 (pStLT100) b, χ3447(-); c, χ3347 (pStLT101); d, χ3306(pStSR100); e, χ3337(-) f, χ 3338(pStSR101) ; g, χ3339(pStSL100, 90 kb, 6 kb); h, χ3340 (90 kb, 8 kb); i, χ3351 (pStSR101) : Marker-Plasmide waren R1drd (100 kb) und dimeres pACYC184 (8 kb) (nicht gezeigt).
Fig. 4 zeigt die Restriktionsenzymabbauprofile von 100 kb Plasmiden. Plasmid-DNA wurde mit HindIII abgebaut, in 0,6-%-igem (G/V) Agarosegel aufgelöst und mit Ethidiumbromid angefärbt. Bahn a enthält Phage λDNA, abgebaut mit HindIII. Die folgenden Stämme (und der entsprechende Plasmidgehalt) sind in den Bahnen gezeigt: b, χ 3000 (pStLT100); c, χ3306(pStSR100); d, χ3388 (pStSR101); e, 3339 (pStSL100, 90 kb, 8 kb); und f, χ3340 (90 kb, 8 kh).
Fig. 5 zeigt Gesamt-CFU in (A) Peyer's Patches und (B) Milzpräparaten nach p.o. Inoculation von Mäusen mit S typhimurium SR-11. χ3306 ( ), χ3337 ( ). Geometrischer Durchschnittswert + SD, n=2 bis 7 Mäuse. P-Werte in 1-t(ailed) Test nach Student für CFU χ3306 größer als χ3337: a < 0,0125, b < 0,0005.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse einer gemischten p.o. Infektion von Mäusen mit Wild-Typ und 100 kb Plasmid-entledigtem SR-11. Geometrischer Durchschnttswert + SD von Verhältnissen von Wild-Typ χ3456 zu entledigtem χ3337, gewonnen aus Peyer's Patches ( ), mesenterischen Lymphknoten (Δ) und Milzpräparaten ( ). n= 3 bis 7 Mäuse, n = 1 für 7 Tage post-Inoculation. P-Werte in-t(ailed) Test nach Student für geometrischen Durchschnittswert des Verhältnisses größer als 1: a< 0,05, b < 0,0125, c < 0,0025, d < 0,0005.
Das Verhältnis von Milzpräparaten war größer als das Verhältnis von Peyer's Patches bei 3 Tagen (P < 0,0125), 4 Tagen (P < 0,0005) und 5 Tagen (P < 0,0025) post-Infektion. Das Verhältnis von mesenterischen Lymphknoten wr größer als das Verhältnis von Peyer's Patches bei 3 Tagen (P < 0,05) und 5 Tagen (P < 0,005) post-Infektion.
Fig. 7 zeigt die CFU-Werte in Mäusegeweben nach p.o. Inoculation von Mäusen mit SL1344. χ3339 (offene Symbole), χ3340 (ausgefüllte Symbole). Peyer's Patches ( ) mesenterische Lympnknoten ( ), Milzpräparate ( ). Geometrische Durchschnittswert + SD, n=2 bis 7 Mäuse. p-Werte in einem 1-t(ailed) Test nach Student für CFU χ3339 größer als χ 3340: a < 0,025, b < 0,0125, c < 0,0005.
Die vorliegende Erfindung beruht darauf, daß herausgefunden worden ist, daß bestimmte Mutanten eine Mikrobe avirulent machen können, ohne deren Immunogenizität wesentlich zu beeinflussen. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung mikrobielle Impfstoffe, in denen die Mikrobe die Deletions(Δ)-Mutanten Δcya und Δcrp trägt welche die Befähigung ausschalten, Adenylat-Cyclase (ATP-Pyrophosphat-Lyase (cyclisierend) EC 4.6.1.1) bzw. das cyclische AMP-Rezeptorprotein (CRP) zu synthetisieren.
Cyclisches 3',5'-AMP (cAMP) und das cyclische AMP-Rezeptorprotein sind notwendig zur Transkription einer großen Anzahl von Genen und Operonen, die mit dem Transport und Zusammenbrechen einer großen Anzahl von Kataboliten befaßt sind. Es ist der Beweis erbracht worden, der zeigt, daß Systeme, die zur Transportierung von Brennstoff/Kohlenstoff- Quellen verwendet werden, alle unter positiver Steuerung durch cAMP stehen, wie auch einige Aminosäure-Permeasen. Zusätzlich zu ihrer sehr wichtigen Rolle im Katabolismus beeinflußt die cAMP-Konzentration in Zellen auch die Lysogenisierung durch Temperatphagen, die Synthese von Fimbriae, Synthese von Flagella und Synthese von mindestens einem Außenmembranprotein. Obwohl cAMP in Säugetierzellen vorhanden ist, liegen die in Makrophagen und weiteren Zellen, in die Salmonellen eindringen und sich vervielfältigen können, vorhandenen Konzentrationen unterhalb einer Konzentration von 0,1 bis 1,3 mM cAMP, die notwendig ist, um es Δcya Mutanten zu ermöglichen, einen Phänotyp vom wilden Typ in vitro zu ergeben. Ferner würde der Einschluß des Acrp Mutant im wesentlichen jeglichen Vorteil abschaffen, der aus der Anfnahme von cAMP in vivo durch diese Δcya Mutanten erwachsen könnte.
Ist die Avirulenz durch die Einführung der Δcya Δcrp Mutanten erst einmal hergestellt, dienen die Mikroben als die imunogene Komponente eines Impfstoffes, um Immunität gegen die Mikrobe zu induzieren. Mithin ist die Verwendung einer jeden Mikrobe, die die Gene für Adenylat-Cyclase und cAMP-Rezeptorproteine besitzen, im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Salmonellen, E. coli - S. typhimurium Hybride, Shigella, Erwinia, Yersinia, Pasteurella, Legionella oder Brucella. Bevorzugte Mikroben sind Mitglieder des Genus Salmonella wie S.typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, S. gallinarum, S. enteritidis, S. choleraesuis, S. arizona oder S. dublin.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann das avirulente Derivat einer pathogenen Mikrobe, das hier auch als Trägerbakterium bezeichnet wird, verwendet werden, ausgewählte Antigene an das GALT zu liefern, z.B. an die Peyer's Patches des Krummdarms. Von einigen Arten von Bakterien, wie von Salmonellen ist es bekannt, daß sie von Peyer's Patches beherbert werden (Carter, P.B. und F.M. Collins, J.Exp. Med. 139:1189 (1974)). Bei S. typhimurium-E.coli-Hybriden ist auch gezeigt worden, daß sie Peyer's Patches in Mäusen besiedeln (Hohmann, A.W., et al, Infect. and Immun. 22:763 (1978)). Wenn diese Trägerbakterien ein rekombinantes Gen aus einem pathogenen Organismus enthalten und exprimieren, werden Antikörper gegen das aus dem Pathogen erzeugte antigene Genprodukt induziert. Mit dem Aufkommen rekombinanter DNA-Techniken wird es nun möglich, vollkommen einzigartige Impfstoffe zu entwickeln, in denen spezifische Antigene erzeugt werden, und zwar nicht durch das etiologische Agens, sondern durch einen anderen Wirtsstamm von Bakterien, der dazu befähigt ist, das Gen für das Antigen zu exprimieren. Es ist ebenfalls möglich, wenn Antigene in eine Kreuzreaktion mit einem Antigen der Säugetierwirtszelle treten und somit die Induktion einer Selbstimmunität potenzieren könnten, rekombinante DNA-Techniken anzuwenden, um das Gen zu verändern, so daß die beeinflussende, in eine Kreuzreaktion tretende antigene Determinante nicht erzeugt wird. Somit können rekombinante DNA-Techniken angewandt werden, um Impfstoffe zu entwickeln, die kein Material aufweisen, das dazu befähigt ist, mit Wirbeltierwirtsantigenen eine Kreuzreaktion einzugehen oder dazu befähigt wäre, einen autoimmunen Zustand hervorzubringen.
Es ist ersichtlich, daß der vorliegende Erfindungsgegenstand einen breiten Anwendungsrahmen zur Entwicklung wirksamer Impfstoffe gegen hakterielle, fungale, parasitäre oder virale Krankheitserreger beeinhaltet, wo lokale Immunität von Bedeutung ist und eine erste Abwehrlinie zu bilden vermag. Einige Beispiele sind Impfstoffe zur Kontrolle von pneumconischer Plage, hervorgerufen durch Yersinia pestis, von Gonorrhö, hervorgerufen durch Neisseria gonorrhöe, von Syphilis, hervorgerufen durch Treponema pallidum, und von Geschlechtskrankheiten sowie Augeninfektionen, hervorgerufen durch Chlamydia trachomatis. Spezies von Streptococci aus sowohl Gruppe A als auch Gruppe B, wie diejenrngen Spezies, die einen wunden Rachen oder Herzkrankheiten hervorrufen, nämlich Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae, Hemophilus influenzae, Bordetella perturssis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Bordetella avium, Escherichia coli, Streptococcus ecui, Streprococcus pneumoniae, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica, Vibrio cholera, Shigella Spezies sowie Legionella pneumophila, stellen weitere Beispiele von Bakterien innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung dar, aus denen Gene erhalten werden konnten. Virale Impfstoffe, wie die gegen Erkältungsviren erzeugten, sind ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfaßt. Virale Impfstoffe können auch gegen weitere Viren, entweder DNA- oder RNA-Viren hergestellt werden, z.B. aus den Klassen Papovirus, Adenovirus, Herpesvirus, Poxvirus, Parvovirus, Reovirus, Picornavirus, Myxovirus, Paramyxovirus oder Retrovirus. Impfstoffe zum Schutz gegen Infektion durch pathogene Fungi, Protozoen und Parasiten sind ebenfalls in den Rahmen der vorliegenden Erfindung einzubeziehen.
In einer weiteren Ausgestaltung kann, wenn die immunogene Komponente des Impfstoffes ein Allergen der Wirtszelle darstellt, solch ein Impfstoff in einer Behandlungskur verwendet werden, die dazu gedacht ist, einen allergischen Wirt spezifisch zu desensibilisieren.
In einer seiner Ausgestaltungsformen läßt sich der vorliegende Erfindungsgegenstand als ein Impfstoff zur Immunisierung eines Wirbeltieres oder wirbellosen Tieres beschreiben, welcher ein lebendiges avirulentes Derivat einer pathogenen Mikrobe umfaßt, wobei das genannte Derivat unbefähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cAMP-Rezeptorprotein zu produzieren, wohingegen es befähigt ist, ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das aus einem Organismus abgeleitet ist, der ein Pathogen davon darstellt oder ein Allergen des genannten Lebewesens produziert.
In noch einer weiteren Ausgestaltungstorm können die avirulenten Mikroben der vorliegenden Erfindung als Vekroren für die Synthese verschiedener Wirtsproteine verwendet werden. Weil die avirulenten Mikroben der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl immunokompetenter Strukturen, einschließlich GALT, mesenterischer Lympthknoten und der Milz, nach Einführung in den Wirt, zu durchqueren vermögen, können diese Mikroben dazu verwendet werden, sich auf eine Vielzahl immunoregulatorischer Produkte als Zielpunkte zu richten. Demgemäß können ein oder mehrere, immunoregulatorische Proteine oder Peptide chiffrierende Gene rekombinant in die avirulenten Mikroben eingeführt werden, so daß sie, wenn die Mikroben ihren Aufenthalt im entsprechenden immunokompetenten Gewebe einnehmen, befähigt sind, die Immunreaktion in der Wirtszelle zu unterdrücken, zu steigern oder zu modifizieren. Beispiele immunoregulatorischer Moleküle schließen, jedoch ohne Einschränkung darauf, ein: koloniestimulierende Faktoren (Makrophag, Granulozyt, oder gemischt), Makrophag-Chemotoxin, Makrophag-Inhibierungsfaktor, Leukozyt-Inhibierungsfaktor, Lymphotoxine, Plastogenfaktor, Interferon und Interleukine.
Noch eine weitere Ausgestaltung des Erfindungsgegenstandes betrifft die Verwendung der hier in Betracht gezogenen avirulenten Mikroben, pharmakologisch aktive Produkte zu liefern und zu produzieren, welche verschiedene physiologische Funktionen (d.h. Wachstumsgeschwindigkeit, Blutdruck usw.) stimulieren oder unterdrücken könnten.
Jeder der Begriffe in diesen Ausgestaltungsformen der vorliegenden Erfindung wird in der folgenden Diskussion analysiert.
Unter Impfstoff wird ein Agens verstanden, das dazu verwendet wird, das Immunsystem eines lebenden Organismus zu stimulieren, so daß Schutz vor zukünftiger Erkrankung bereitgestellt wird. Immunosierung betrifft den Vorgang der Induzierung eines fortgesetzt hohen Gehalts an Antikörper und/oder cellulärer Immunreaktion, wobei T-Lynphozyten entweder das Pathogen abzutöten und/oder weitere Zellen (z.B. Phagozyten) zu aktivieren vermögen, um dies in einem Organismus zu bewerkstelligen, der gegen ein Pathogen oder Antigen gerichtet ist, denen dei Organismus vorher ausgesetzt war. Obwohl der Begriff "Immunsystem" Reaktionen unizellulärer Organismen auf die Gegenwart fremder Körper, z.B. Interferonproduktion, umfassen kann, ist der Begriff in der vorliegenden Anmeldung beschränkt auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen, durch welche ein multizellulärer Organismus Antikörper gegen ein antigenes Material erzeugt das in die Zellen des Organismus oder die extrazelluläre Flüssigkeit des Organismus eindringt. Der so erzeugte Antikörper kann zu jeder der immunologischen Klassen gehören, wie zu Immunoglobulin A, D, E, G oder M Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, die die Produktion von Immunoglobulin A (IgA) stimulieren, da dieses das prinzipielle Immunoglobulin darstellt, das durch das sekretorische System von Warmblütlern erzeugt wird, obwohl die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung nicht auf diejenigen beschränkt sind, welche die IgA-Produktion stimulieren. Beispielsweise eignen sich die Impfstoffe der hier beschriebenen Art dazu, einen weiten Bereich weiterer Immunreaktionen zusätzlich zur IgA-Bildung zu erzeugen, z.B. celluläre und humorale Immunität. Die Immunreaktion auf Antigene ist gut untersucht und in breitem Umfang abgehandelt. Ein Überblick über Immunologie ist dargelegt in Barrett, James, T., Textbook of Immunology: Vierte Ausgabe. C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983), dessen Gesamtinhalt durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist.
Ein Wirbeltier ist jedes Mitglied des Subphylums Vertebrata, einer primären Abteilung des Phylums Chordata, welche die Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere einschließt, welche alle durch eine segmentierte knöcherne oder knorpelartige Wirbelsäule gekennzeichnet sind. Alle Wirbeltiere weisen ein funktionales Immunsystem auf und reagieren auf Antigene durch Produktion von Antikörpern. Mithin sind alle Wirbeltiere dazu befähigt, auf Impfstoffe zu reagieren. Obwohl Impfstoffe am üblichsten Säugetieren, wie Menschen oder Hunden (Tollwut-Impfstoff) verabreicht werden, liegen Impfstoffe für kommerziell aufgezogene Wirbeltiere anderer Klassen, wie Fische und Vögel, falls von der hier beschriebenen Natur, innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
Ein wirbelloses Tier ist jedes Mitglied des Tierreichs, ausschließlich der Wirbeltiere. Diese Lebewesen bilden die Abteilung Invertebrata und weisen Rückgrat oder Wirbelsäule nicht auf. Diese Klassifizierung schließt alle Lebewesen ausser Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere ein. Viele wirbellose Tiere sind dazu befähigt eine primitive Immunreaktion auf antigene Stimulation hervorzubringen, und sie sind auf dieselben Mikroorganismen empfindlich, die Wirbeltiere infizieren und hierin gemäß der vorliegenden Erfindung oftenbart sind. Beispielhaft für diese wirbellosen Lebewesen sind Schellfisch und Weichtiere sowie weitere verwandte Lebewesen. Obwohl die Verwendung von Impfstoffen zum Schutz wirbelloser Lebewesen bisher nicht allzu gut dokumentiert ist, wird der Fachmann die Anwendbarkeit des Erfindungsgegenstandes auf die genannten wirbellosen Lebewesen durch die Nutzung von deren primitiven Immunsystemen erkennen. Beispielsweise wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Empfindlichkeit von Schellfischen auf Infektion durch Salmonellen die Einführung avirulenter Stämme von Salmonellen-Spezies ermöglichen und dadurch ein Potential zur Reaktion für das primitive Immunsystem bereitstellen. Deshalb liegt innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, die zur Infektion eines wirbellosen Lebewesens befähigt ist, um eine Reaktion aus einem Immunsystem zu stimulieren, das im genannten wirbellosen Lebewesen gegen ein Pathogen vorhanden ist.
Eine Ausgestaltungsform der vorliegen Erfindung betrifft die Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, die auf den GALT oder BALT als ein Träger des Genprodukts beherbergt ist, das zur Stimulierung einer Antikörperreaktion gegen ein Pathogen oder Allergen verwendet wird. Avirulent bedeutet nicht, daß eine Mikrobe dieses Genus oder dieser Spezies überhaupt nicht als ein Pathogen fungieren kann, sondern daß die besondere zur Verwendung gelangende Mikrobe avirulent ist bezüglich des besonderen zu behandelnden Lebewesens. Die Mikrobe kann zu einem Genus oder sogar einer Spezies gehören, die normalerweise pathogen sind, muß aber zu einem Stamm gehören, der avirulent ist. Mit pathogen ist die Befähigung gemeint, einen Krankheitszustand hervorzurufen oder eine normale physiologische Funktionsweise zu beeinträchtigen. Avirulente Stämme sind nicht dazu befähigt, eine volle Abfolge von Symptomen des Krankheitszustandes zu induzieren, der normalerweise mit dessen virulentem pathogenen Gegenpart verbunden ist. Die hier verwendeten Mikroben schließen Bakterien, Protozoen und einzellige Fungi ein.
Techniken zur Übertragung genetischen Materials aus einem ersten Organismus auf einen zweiten Organismus, der normalerweise genetisches Material mit dem ersten Organismus nicht austauscht, sind kürzlich in breitem Umfang als Ergebnis einer sich rasch ausbreitenden rekombinanter DNA-Technologie verfügbar gemacht worden. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird genetisches Material, das aus einer: Organismus in einen zweiten in einer solchen Weise übertragen worden st, daß die Reproduktion des zweiten Organismus Abkömmlinge entstehen läßt die dasselbe genetische Material enthalten, als ein rekombinantes Gen bezeichnet. Dei Begriff Gen wird hier in seinem breitesten Sinn verwendet, um jedwede biologische Vererbungseinheit darzustellen. Es ist nicht notwendig, daß das rekombinante Gen ein vollständiges Gen ist, wie vorliegend im Ausgangsmechanismus, der zur Erzeugung oder Regulierung der Erzeugung eines Makromoleküls, z.B. eines funktionierenden Polypeptids, befähigt war. Es ist lediglich notwendig, daß das Gen dazu befähigt ist, als das Templat zu fungieren, daß als ein Leitstoff bei der Erzeugung eines Antigenprodukts genutzt wird. Das Produkt kann eines sein, das in dieser exakten Form im Ausgangsorganismus nicht zu finden war. Beispielsweise kann ein funktionelles Kodierungsgen für ein Polypeptidantigen, das 100 Aminosäurereste umfaßt, teilweise in eine Trägermikrobe transferiert werden, so daß ein Peptid mit nur 75, oder sogar nur 10. Aminosäureresten durch den zellulären Mechanismus der Wirtszelle erzeugt wird. Ist dieses Genprodukt jedoch ein Antigen, das die Bildung von Antikörpern gegen ein im Ausgangsorganismus vorhandenes ähnliches Antigen verursachen wird, ist das Gen als innerhalb des Rahmens der Begriffsbedeutung Gen zu betrachten, wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert ist. Alternativ dazu, ist es, falls die Aminosäuresequenz eines besonderen Antigens oder Fragments davon bekannt ist, möglich, das DNA-Fragment oder Analog davon mittels automatisierter Gen-Synthesierer oder dgl. chemisch zu synthesieren und die genannte DNA-Sequenz in den geeigneten Expressionsvektor einzuführen. Am anderen Ende des Spektrums ist ein langer Abschnitt von DNA, der für mehrere Genprodukte kodiert, von denen eines oder alle antigen sein können. Somit stellt ein Gen, wie es hier definiert und beansprucht ist, jede Vererbungseinheit dar, die zur Erzeugung eines Antigens befähigt. Das Gen kann chromosomalen, plasmiden oder viralen Ursprungs sein.
Damit das Gen zur Auslösung einer Immunreaktion wirksam ist, muß das Gen exprimiert sein. Exprimierung eines Gens bedeutet, daß die innewohnende Information in der Struktur des Gens (die Sequenz der DNA- Basen) in ein körperliches Produkt in der Form eines RNA-Moleküls, Polypeptids oder eines weiteren biologischen Moleküls durch die biochemmschen Mechanismen der Zelle übertragen wird, in der sich das Gen befindet. Das so erzeugte biologische Molekül wird das Genprodukt genannt. Der hier verwendete Begriff Genprodukt betrifft jede(s) biologische(n) Produkt oder Produkte, die als Ergebnis der biochemischen Reaktionen erzeugt werden, die unter Steuerung eines Gens ablaufen. Das Genprodukt kann, z.B. ein RNA-Molekül, Peptid oder ein Produkt sein, welche unter der Steuerung eines Enzyms oder weiteren Moleküls erzeugt werden, das das Ausgangsprodukt des Gens ist, d.h. ein metabolisches Produkt. Beispielsweise kann ein Gen zuerst die Synthese eines RNA-Moleküls steuern, das durch die Wirkung von Ribosomen in ein Enzym translatiert wird, welches seinerseits wieder die Bildung von Glycanen in der Umgebung ausserhalb der urspünglichen Zelle, in der das Gen gefunden wurde, steuert. Das RNA- Molekül, das Enzym und das Glycan stellen allesamt Genprodukte dar, und zwar wie der Begriff hier verwendet wird. Jedes dieser sowie viele weitere Typen von Genprodukten, wie Glycoproteine und Polysaccharide, wirken als Antigene, wenn sie in das Immunsystem eines Lebewesens eingeführt sind. Protein-Genprodukte, einschließlich Gtycoproteine und Lipoproteine, stellen bevorzugte Genprodukte zur Verwendung als Antigene in Impfstoffen dar.
Damit ein Impfstoff zur Erzeugung von Antikörpern wirksam ist, muß das antigene Material in einer solchen Weise freigesetzt werden, daß dei Antikörper erzeugende Mechanismus des geimpften Lebewesens ins Spiel gebracht werden kann. Deshalb muß der Mikrobenträger des Genprodukts in das Lebewesen eingeführt werden. Um eine bevorzugte Reaktion der GALT- oder BALT-Zellen zu stimulieren, wie vorher diskutiert, ist die Einführung der Mikrobe oder des Genprodukts direkt in die Gedärme (gut) oder in die Bronchien bevorzugt und zwar durch orale Verabreichung, gastrische Intubation oder in Form von Aerosolen, obwon weitere Verfahrensweisen der Verabreichung des Impfstoffes, wie intravenose, intramuskuläre, subkutane Injektion oder Intramammale oder Intrapeniale oder vaginale Verabreichung, möglich sind.
Wird die avirulente Mikrobe als eine Trägermikrobe verwendet und ist die Trägermikrobe erst einmal im Lebewesen vorhanden, muß das Antigen für das Immunsystem des Lebewesens verfügbar gemaht werden. Dies läßt sich bewerkstelligen, wenn die Trägermikrobe abstirbt, so daß die Antigenmoleküle freigesetzt werden. Natürlich ist die Verwendung von "leckenden (leaky)" avirulenten Mutanten, die die Gehaltstoffe des eriplasmas freisetzen, ohne Lysis ebenfalls möglich. Alternativ dazu, kann ein Gen ausgewählt werden, das die Produktion eines Antigens steuert, das durch die Trägerzelle für die Aussenumgebung vor dem Absterben der Zelle verfügbar gemacht werden wird. Auf diese Weise ist es möglich, eine lebensfähige Mikrobe zu verwenden, die in geimpften Lebewesen bestehen bleiben wird, z.B. in dessen Peyer's Patches, und die fortfahren wird, Antigene zu erzeugen und dadurch Antikörperbildung kontinuierlich zu induzieren. Ein bevorzugtes Genprodukt unter diesen Rahmenbedingungen ist ein Produkt das durch die Zellmembran in die Aussenumgebung übertragen wird, oder ein Produkt, das sich festmachen läßt an oder eingebettet wird in die Aussenmemoran, so daß alles oder ein Teil des Genprodukts der Umgebung ausgesetzt sind. Typisch für diesen letzteren Typ von Genproduksind Antigene, die normalerweise an der Oberfläche des Organismus, gegen den Schutz angestrebt wird, aufzufinden sind, Werden diese Antigene auf die Zelloberfläche in einer normalen Weise übertragen, wird die Antikörperbildung gegen die Antigene gesteigert.
Die Verwendung von Pathogenen zur Lieferung von Antigenen aus weiteren Pathogenen an das GALT oder BALT wäre ungeeignet, wäre es nicht wegen der Tatsache, daß solche Pathogene avirulent gemacht werden können wobei sie die Fähigkeit beibehalten, Peyer's Patches oder das BALT zu befallen.
Der Organismus, aus dem das rekombinante Gen abgeleitet wird, kann jedes Pathogen des zu impfenden Lebewesens sein, oder kann ein Organismus sein, der ein Allergen oder weiteres Antigen des Lebewesens erzeugte. Allergene sind Substanzen, die eine allergische Reaktion verursachen, und zwar in diesem Fall in dem Lebewesen, das gegen jene geimpft werden wird. Viele unterschiedliche Materialien können Allergene sein, wie tierisches Hautschuppenmaterial und Pollen, und die allergische Reaktion der individuellen Lebewesen wird für jedes besondere Allergen schwanken. Es ist möglich, Toleranz gegenüber einem Allergen in einem Lebewesen zu induzieren, das normalerweise eine allerglsche Reaktion zeigt. Die Verfahren zur Induzierung von Toleranz sind wohl bekannt und umfassen im allgemeinen eine Verabreichung des Allergens an das Lebewesen in sich steigernden Dosismengen. Eine weitere Abhandlung von Toleranzinduktion ist dargelegt im bereits vorher zitierten Textbuch von Barrett. Letztlich kann der Wirtsorganismus selbst als eIne Quelle von genetischem Material dienen, wenn immunoregulatorische Gene oder Gene fur weitere pharmakologisch wirksame Substanzen durch die Vektoren exprimiert werden.
Die Verabreichung eines Lebendimpfstoffes des oben offenbarten Typs an ein Lebewesen kann durch jedes bekannte oder Standardverfahren durchgeführt werden. Diese schließen orale Einnahme, gastrische Intubation oder broncho-nasales Sprühen ein. Alle diese Verfahren ermöglichen es, daß der Lebendimpfstoff die GALT- oder BALT-Zellen leicht erreicht und Antikörperbildung induziert, und sie stellen die bevorzugten Verabreichungsverfahrensweisen dar. Weitere Verabreichungsverfahrensweisen, wie intravenöse Injektion, die es der Trägermikrobe ermöglichen, den Blutstrom des Lebewesens zu erreichen, können zulässig sein. Intravenöse, Intramuskuläre oder intramammale Injektionen sind mit weiteren Ausgestaltungsformen der Erfindung ebenfalls zulässig, wie später beschrieben wird.
Da bevorzugte Verfahren der Verabreichung orale Einnahme, Aerosol- Spray und gastrische Intubation sind, stellen bevorzugte Trägermikroben jene dar, die zur Spezies gehören, die vorzugsweise auf jeder der lymphoepithelianen Strukturen der Eingeweide oder Bronchien des zu impfenden Lebewesens beherbergt sind. Diese Stämme sollten bevorzugt avirulente Derivate enteropathogener Stämme sein, die durch genetische Manipulation enteropathogener Stämme erzeugt werden. Stämme, die auf Peyer's Patches beherbergt sind und somit die Produktion von IgA direkt stimulieren, sind am meisten bevorzugt. Bei Lebewesen schließen diese spezifische Stämme von Salmonellen sowie Salmonella-E. coli- Hybride ein, die auf den Peyer's Patches beherbergt sind.
Die rekombinante DNA-Verfahrenstechniken sind nun in hinreichender Maße wohl bekannt und weit verbreitet, so daß sie als Routineverfahren zu betrachten sind. In sehr allgemeinen und breit gefaßten Begriffsbezügen beruht dieses Verfahren darauf, das genetische Material, oder üblicher einen Teil des genetischen Materials, eines Organismus auf einen zweiten Organismus zu übertragen, so daß das übertragene genetische Material ein permanenter Teil des (rekombiniert mit) des (dem) genetischen Material(s) der Organismen wird, auf die es übertragen wird Dies umfaßt gewöhnlich, daß zuerst ein kleines Stück von DNA aus dem Ausgangsmechanismus entweder aus einem Plasmid oder einem Ausgangschromosom erhalten wird. Ein Plasmid (auch bezeichnet als extrachromosomales Element) stellt eine Vererbungseinheit dar, die körperlich oetrennt vom Chromosom der Zelle vorliegt. Die DNA kann jede Größe aufweisen und wird oft durch die Wirkungsweise eines Restriktionsendonuklease-Enzyms erhalten, das bewirkt daß DNA- Moleküle an spezifischen Basenpaar-Stellen gespalten werden. Im Anschluß an die Verbindung an Plasmid, Phage oder Cosmid-Vektoren zur Bildung rekombinanter Moleküle können die rekombinanten Moleküle auf eine Wirtszelle durch verschiedene Maßnahmen wie Transformation (Aufnahme nackter DNA aus der Aussenumgebung, die künstlich durch das Vorhandensein verschiedener chemischer Mittel, wie Kalziumionen, Induziert werden kann) übertragen werden. Weitere Verfahren wie Transduktion sind ebenfalls geeignet, wobei die rekombinante DNA In eine Phage als transduzierende Phage oder Cosmid-Vektoren verpackt wird. Ist die rekombinante DNA erst einmal in der Trägerzelle, kann sie fortfahren, als ein getrenntes Stück zu existieren (im allgemeinen gültig für komplette transmittierte Plasmide), oder sie läßt sich in das Wirtszellenchromosom insertieren und kann mit dem Chromosom während der Zellteilung reproduziert werden.
Obwohl die Übertragung genetischen Materials relativ geradlinig verläuft, ist eine Vorhersage, welche Transfers zu exprimierten Genen führen werden, noch nicht möglich. Dieses Auswahlverfahren stellt jedoch keine Schwierigkeit für den vorliegenden Erfindungsgegenstand dar. Da die Wirtsmikrobe das übertragene Gen exprimieren muß und dadurch ein Antigen erzeugt, funktioniert eine Näherung durch "Streuschuß" ("Shotgun") gut. Antikörper werden zuerst gegen das gewunschte Antigen produziert, z.B. Fragmente von Zellmembranen aus pathogenen Mikroben, und zwar durch Standardverfahren. DNA aus dem Organismus, der die Quelle des Antigens darstellt, wird in multiple Fragmente durch Endonukleasen gespalten, und die Fragmente werden beliebig bzw. zufällig in die Trägermikrobe insertiert, vorzugsweise mittels Khlonierungsvektoren. Die Mikroben, die Antigene aus dem Pathogen exprimieren, lassen sich durch deren Reaktion mit Antikörper gegen Pathogenantigene leicht identifizieren. Antigenexprimierte Mikroben können selektiert und kloniert werden, um den angestrebten rekombinanten Organismus zu ergeben Streuschuß-Klonieren (shotgun cloning) ist wohl bekannt und im Detail in Maniatis, T., et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1932), beschrieben, welche Literaturstelle durch Bezugnahme hierin aufgenommen ist. Die Techniken des Gentransfers werden nicht als Teil der vorliegenden Erfindung betrachtet, und jedes Verfahren, das zur Erzeugung rekombinanter Organismen befähigt umfassend Gene aus einem Organismus, die in avirulenten Mikroben exprimiert werden, wird den angestrebten Zweck erfüllen.
In Fällen, in denen die Spezies normalerweise genetische Informationen austauschen, können klassischere Verfahren des Gentransfers zur Anwendung gelangen, wie Konjugation, Transformation oder Transduktion.
Derivate avirulenter Mikroben werden ebenfalls als im Rahmen der vorliegenden Erfindung betrachtet. Mit Derivat sind sexuell oder asexuell abgeleitete Nachkommenschaft und Mutanten der avirulenten Stämme gemeint einschlißlich einzelner oder mehrfacher Basensubstitutionen, -deletionen -insertionen oder -inversionen, welche die Nichtbefähigung beibehalten, funktionelle Adenylat-Cyclase und cAMP-Rezeptorprotein mit oder ohne natürlich vorkommenden Virulenz-Plasmiden zu produzieren. Z.B. tragen Stämme wie χ4062 und χ4064 den gyrA-Mutant, der Nalidixinsäure-Resistenz vermittelt, welche hierin als ein bequemes Markierungsmittel verwendet worden ist, um die Kulturstämme im Anschluß an die orale Inoculation zu verfolgen. Jedoch stellt die Arzneimittelresistenz kein erwühschtes Attribut für als Impfstoffe einzusetzende Stämme dar. So läßt sich der gyrA&spplus;-Mutant leicht beseitigen, und zwar durch Transduzieren des gyrA&spplus;- (Empfindlichkeit auf Nalidixinsaure verleihender)-Gens in Stämme durch Selektieren für Vererbung eines nahe verbundenen Tn10 und anschließende Entfernung von Tn10 durch Seektion für Fusarinsäure-Resistenz.
Die erforderlichen Dosierungsmengen schwanken in Abhängigkeit der Antigenizität des Genprodukts und brauchen nur in einer Menge vorzuliegen, die ausreicht, um eine für bestehende Impfstoffe typische Immunreaktion zu induzieren. Durch Routineversuch läßt sich die erforderliche Menge leicht feststellen. Typische Anfangsdosierungsmengen des Impfstoffes könnten 0,001 bis 1 mg Antigen/kg Körpergewicht betragen, mit sich steigernden Mengen oder mehrfachen Dosierungen, verabreicht wie erforderlich, um das angestrebte Niveau der Schutzwirkung bereitzustellen.
Der pharmazeutische Trägerstoff, worin der Impfstoff suspendiert oder gelöst wird, kann jedes Lösungsmittel oder jeder Feststoff oder jedes in ein Material eingekapselte Produkt sein, welche gegenüber dem Inoculierten Lebewesen nicht-toxisch und mit dem Trägerorganismus oder antigenen Genprodukt verträglich sind. Geeignete pharmazeutische Träger schließen flüssige Träger, wie Normal-Kochsalzlösung und weitere nichttoxische Salze bei oder in der Nähe von physiologischen Konzentrationen sowie feste Träger, wie Talk oder Sucrose, ein, und sie können auch Futtermitteln für Farmtiere einverleibt werden. Hilfstoffe können zugefügt werden, um die Antigenizität zu steigern, falls gewünscht. Bei Verwendung zur Verabreichung über die Bronchialröhren liegt der Impfstoff vorzugsweise in der Form eines Aerosols vor.
Die Immunisierung mit einem aus Genprodukt abgeleiteten Pathogen kann auch in Zusammenwirken mit früherer Immunisierung mit dem avirulenten Derivat eines pathogenen Mikroorganismus angewandt werden, der als ein Träger wirkt, um das Genprodukt zu exprimiern, das durch ein rekombinantes Gen aus einem Pathogen spezifiziert ist. Diese parenterale Immunisierung kann als ein Verstärker dienen, um die Exprimierung der sekretorischen Immunreaktion zu steigern, wenn das sekretorische Immunsystem auf dieses Pathogen-abgeleitete Genprodukt erst einmal durch Immunisierung mit der Trägermikrobe geprimt worden ist, die das Pathogenabgeleitete Genprodukt exprimiert, um die Lymphoidzellen des GALT oder BALT zu stimulieren. Die gesteigerte Reaktion ist bekannt als eine Sekundär-, Verstärker- oder anarnnestische Reaktion und führt zu verlängertem Immunschutz beim Wirtszellenorganismus. Verstärker-Immunisierungen lassen sich mehrmals mit vorteilhaften Ergebnissen wiederholen.
Der vorstehend dargelegte Offenbarungsrahmen beschreibt ganz allgemein die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis ist erhältlich unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele, die hier lediglich zum Zwecke einer Verdeutlichung gegeben sind und keine Einschränkung darstellen sollen, wenn nichts anderes im einzelnen angegeben ist.
Hinterlegungen von zur Ausführung der Erfindung geeigneten Stämmen Es wurde eine Hinterlegung biologisch reiner Kulturen der folgenden Stämme bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, am 15. Juli 1967 vorgenommen, und die angegebene Zugangsnummer wurde nach erfolgreichem Lebensfähigkeitstest zugewiesen, und es wurden die erforderlichen Gebühren bezahlt. Die Hinterlegungen wurden gemäß den Maßgaben des Budapester Vertrages durchgeführt, die genannten Kulturen werden ständig für eine Dauer von mindestens 5 Jahren nach der jüngsten Nachfrage zur Auslieferung einer Probe sowie in jedem Fall 30 Jahre lang nach dem Datum der Hinterlegung verfügbar bleiben.
Sollte die Kultur nicht lebensfähig oder versehentlich zerstört werden, wird sie durch (eine) lebensfähige Kultur(en) derselben taxonomischen Beschreibung ersetzt. Stamm ATCC-Nummer

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Erstellung einer avirulenten Mikrobe durch die Einführung von cAMP-Synthese beeinflussenden Deletionsmutanten sowie deren Verwendung.
Bakterienstämme. Die eingesetzten Salmonella typhimurium-Stämme sind in Tabelle 1 aufgelistet. Sie wurden als eingefrorene Kulturen, suspendiert in 1%-igem Bacto-Pepton, enthaltend 5 Glycerin, schnellgefroren in Trockeneis-Ethanol zur Lagerung in Duplikat bei -70ºC und ebenfalls suspendiert in 1%-igem Bacto-Pepton, enthaltend 50% Glycerin, zur Aufbewahrung bei -20ºC zur Routineverwendung gehalten.
Medien. Komplexmedien zur Routinekultivierung waren L-Nährlösung (Lennox, Virology 1:190-206, (1965)) und Luria-Nährlösung (Luria and Burrous, J. Bacteriol 74:461-476 (1957)). Difco-Agar wurde der Luria- Nährlösung mit 1,2% für Basis-Agar und mit 0,65% für weiches Agar zugefügt. Penassay-Agar wurde zur Routinezählung von Bakterien herangezogen. Die Fermentation wurde bewertet durch Zufügung von Mat Conkey-Basis-Agar oder Eosin-Methylenblau-Agar (Curtiss, Genetics 58:9-54 (1968)) mit 1% Endkonzentration eines geeigneten Kohlenhydrates.
Synthetische Medien waren Minimalflüssigkeit (ML) und Minimalagar (MA), ergänzt mit Nährstoffen in optimalen Gehaltsmengen, wie vorher beschrieben (Curtiss, J. Bact. 89: 28-40 (1965)). Gepufferte Kochsalzlösung mit Gelatine (BSG) (Curtiss, 1965, siehe oben) wurde routinemäßig als Verdünnungsmittel eingesetzt.
Transduktion. Bakteriophage P22HT int wurde routinemäßig zur Transduktion unter Anwendung von Standardverfahren herangezogen (Davis et al, "A Man. for Genet. Eng.-Adv. Bact. Genetics". Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1979)). Eine Übernachtkultur des Donorstammes wurde auf 1:20 in vorgewärmte Luria-Nährläsung verdünnt, 60 Minuten lang unter Schütteln bei 37ºC wachsen gelassen und dann mit P22 HT int mit einer Multiplizität von 0,01 infiziert. Die Infektionsmischung wurde über Nacht ca. 15 h lang geschüttelt, es wurde Chloroform zugefügt. und man ließ das ganze weitere 10 Minuten lang bei 37ºC schütteln, und die Suspension wurde zentrifugiert (Sorvall RC5C, SS-34 Rotor, 7.000 Upm, 10 Min), um die bakteriellen Überbleibsel zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend den Phagen (ca. 10¹&sup0;/ml), wurde bei 4ºC über Chloroform aufbewahrt. Tetracyclin bis zu einer Konzentration von 12,5 u g/ml wurde zur Selektion zur Transduktion von Tn10-induzierten Mutanten verwendet.
Fusarinsäure-Selektoin für Deletionsmutanten.
Es wurden die Medien und Verfahren, beschrieben von Maloy und Nunn (J. Bact. 145:1110-1112) (1981)) herangezogen. Stämme mit Tn10 induzierten Mutanten wurden über Nacht in L-Nährlosung, enthaltend 12,5 u g Tetracyclin / ml, bei 37ºC auf ca. 5 x 10&sup8; cfu/ml gezüchtet. Die Kulturen wurden dann auf 1:40 in vorgewärmter L-Nährlösung ohne Tetracyclin verdünnt, und bei 37ºC auf einen Titer von 2x10&sup9;cfu/ml belüftet. Geeignete Anzahlen von Zellen (d.h. 10&sup7; - 10&sup8;), verdünnt in BSG, wurden auf Fusarinsäure enthaltendes Plattenmedium gegeben und 24 h lang bei 37ºC inkubiert. Fusarinsäure-resistente Isolate wurden auf demselben selektiven Medium gereinigt. Einzelisolate wurden herausgenommen, wachsengelassen und auf Tetracyclinempfindlichkeit auf Penassay-Agar mit und ohne 12,5 ug Tetracyclin/ml getestet.
Mäuse. Weibliche BALB/c-Mäuse (Sasco, St. Louis, MO) wurden für alle Infizierungs- und Immunisierungsversuche herangezogen. Es wurden 3 oder 7 Wochen alte Tiere gekauft und 1 Woche lang in einem Quarantäneraum gehalten, bevor sie in den Versuchen eingesetzt wurden. Die Versuchsmäuse wurden in mit Nalgene-Filter bedeckte Käfige mit Drahtböden gegeben. Futter und Wasser wurden nach Lust und Laune angeboten. Der Tierraum wurde bei 22 bis 23ºC unter einer 12stündigen Beleuchtungsdauer gehalten.
Infizierbarkeit der Tiere. Die Virulenz von S. typhimurium-Stämmen wurde gemäß peroraler oder intraperitonealer Inoculation ermittelt. Bakterien zur Inoculation in Mäusen wurden über Nacht als stehende Kulturen bei 37ºC in L-Nährlösung gezüchtet. Diese Kulturen wurden auf 1:50 in vorgewärmter L-Nährlösung verdünnt, und bei 37ºC ca. 4 h lang auf einen OD&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 0,8 bis 1,0 belüftet. Die Zellen wurden auf das 50- fache durch Zentrifugation in einem GSA-Rotor bei 7000 Upm über 10 min. bei 4ºC in einer Sorvall RC5C Zentrifuge aufkonzentriert und anschließend in BSG suspendiert. Geeignete Verdünnungen wurden auf Penassay-Platten- Agar zur Titerbestimmung und auf Mac Conkey-Agar mit 1% Maltose gegeben, um den Cya/Crp-Phänotyp zu verifizieren.
Für alle peroralen Inoculationen wurden die Mäuse von Futter und Wasser 4 h lang vor der Infektion ferngehalten. Dann wurden ihnen 30 ul 10%-iges (G/V) Natriumbicarbonat unter Verwendung eines Pipetman P200 5 Min. vor unter Verwendung eines Pipetman P20 durchgeführter peroraler Verfütterung von 20 ul S.typhimurium, suspendiert in BSG, gegeben. Futter und Wasser wurden 30 Minuten nach der oralen Inoculation wieder angeboten. Die Krankheitsanfälligkeit und Sterblichkeit der Mäuse wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen beobachtet.
Die intraperitoneale Inoculation von nicht unter Fasten gebaltenen Mäusen wurde unter Verwendung einer 26-er Nadel durchgeführt, um 300 ul Bakteriensuspension, verdünnt in BSG, zu liefern. Die Krankheitsanfälligkeit und Sterblichkeit der Mäuse wurde über einen Zeitraum von 30 Tagen beobachtet.
Bewertung der Schutzimmunität In den Anfangsversuchen wurde jede Maus, die die Infektion mit jedem S.typhimurium-Mutantenstamm 30 Tage lang überlebt hatte, am Tag 31 mit 10³ bis 10&sup4;-fahen LD&sub5;&sub0;-Dosismengen des Wild-Typ-Maus-virulenten S. typhimurium SR11-Stamms χ3306 über perorale Verabreichung einer herausfordernde Behandlung unterzogen. Anschließend wurden Gruppen von Mäusen peroral mit verschiedenen Dosismengen avirulenter Mutanten immunisiert und dann mit verschiedenen Dosismengen an virulenten χ3306-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der anfänglichen Immunisierung einer herausfordernden Behandlung unterzogen. Krankheitsanfälligkeit und Sterblichkeit wurden während des Versuchs durchgängig und mindestens 30 Tage lang nach Herausforderung mit den χ 3306-Zellen beobachtet.
Zählung von lebensfähigen S.typhimurium Zellen in vivo. Kolonisation und Beständigkeit von Wild-Typ und mutanten S. typhimurium SR11-Stämmen wurden ermittelt, nachdem die perorale Inoculation von Mäusen mit annähernd 1 x 10&sup9; Zellen durch die oben beschriebenen Verfahren erfolgt war. Die Titer von S. typhimurium Zellen wurden ermittelt 4, 24, 48, 72 und 96 Stunden sowie 7 Tage nach peroraler Infektion in den Inhaltsstoffen des Dünn- und Dickdarms und in den Homogenaten von Peyer's Patches (8-10), und in einem 10 cm Abschnitt von Dünndarmwand, gelegen am entfernten Abschnitt des Krummdarms, bei entiernten Peyer's Patches, sowie in der Dickdarmwand. Die Titer von Zellen in Homogenaten mesenterischer Lymphknoten und der Milz wurden ebenfalls ermittelt. Die Mäuse wurden durch CO&sub2; - Erstickung euthanisiert, und die mesenterischen Lymphknoten, die Milz, der Dünn- und Dickdarm wurden sofort in gekühlte ML + 15% Sucrose-Minimalsalze (MLS) gegeben, die auf Eis gehalten wurden. Eine Petrischale, enthaltend 4,0 ml gekühlte MLS, wurde verwendet, die Dünndarmmaterialien aufzunehmen, während die Peyer's Patches mit kleinen chirurgischen Messern entfernt wurden. Die Peyer's Patches wurden zweimal mit jeweils 1 ml gekühlter BSG gespült, bevor sie in ein Glasröhrchen mit Schraubenkappe (15 x 100 mm), enthaltend 1 ml gekühlte MLS und Glasperlen, gegeben wurden. Die Dünndarmpräparate wurden dann längsweise geschnitten, und die Inhaltstoffe und Wandungen in ein 50 ml entsorgbares konisches Röhrchen gegeben, und es wurde MLS auf ein Volumen von 5,0 ml zugefügt, bevor eine Minute lang verwirbelt wurde. Ein 10 cm Abschnitt des Dünndarms wurde entfernt, zweimal in 5 ml BSG gespült und in ein Glasröhrchen mit Schraubenkappe (15 x 100 mm) gegeben, enthaltend 2,5 ml gekühlte MLS und Glasperlen. Die Inhaltstoffe des Dünndarmpräparats wurden aus der gekühlten MLS, die während des Längsschneidens und beim Waschen des Dünndarmmaterials verwendet wurde, gewonnen und dem 50 ml entsorgbaren konischen Röhrchen zugefügt das die Dünndarminhaltstoffe enthielt. Eine Petrischale, enthaltend 4,0 ml gekühlte MLS, wurde herangezogen, das Dickdarmmaterial aufzunehmen, und bei es längsweise durch den Blinddarm hindurch geschnitten wurde. Die Gehaltsmengen des Dickdarms und der Dickdarmwand wurden in ein 50 ml Endvolumen gegeben, bevor sie 1 Minute lang verwirbelt wurden. Die Dickdarmwand wurde dann entfernt und zweimal in 5 ml BSG gespült, bevor sie in ein Glasröhrchen mit Schraubenverschluß (15 x 100 mm), enthaltend 2,5 ml gekühlte MLS und Glasperlen gegeben wurde. Die Inhaltstoffe des Dickdarms wurden aus der gekühlten MLS, die beim Längsschneiden und Waschen des Dickdarms verwendet wurde, gesammelt, und dem 50 ml entsorgbaren konischen Röhrchen zugefügt enthaltend die Dickdarminhaltstoffe. Die mesentertschen Lymphknoten sowie das verbindende Fettgewebe wurden in ein Glasröhrrhen mit Schraubenverschluß (15 x 100 mm), enthaltend 1,0 ml gekühlte MLS und Glasperlen, gegeben und verwirbelt. Die Milzpräparate, die nach 96 h und 7 Tagen geerntet werden, werden verarbeitet, indem man sie direkt in einen Dounce-Pistill-Typ-Gewebehomogenisierer gibt und mit 2,8 ml gekühlter MLS verreibt. Jedes Röhrchen mit Glasperlen und Gewebe wurde 4 bis 5 Minuten lang mittels eines Super-Mixer bei hoher Geschwindigkeit verwirbelt. Die Suspensionen wurden in BSG verdünnt und auf Mac Conkey-Plattenagar gegeben, enthaltend 1% Lactose und 40 ug Nalidixinsäure/ml. Die lebensfähigen Gesamttiter wurden unter Heranziehung der Volumina der Suspensionen und Verdünnungen sowie der Plattenzählungen ermittelt. Mac Conkey-Agars, enthaltend 1% an verschiedenen Kohlenhydraten, wurden herangezogen, um zu belegen, daß die gewonnenen Organismen den erwarteten Phänotyp aufwiesen.
Erstellung von s.typhimurium SR11-Stämmen mit cya- und crp-Mutanten.
Der S- typhimurium-Stamm χ3041 wurde zur peroralen Infketion von BALB/c-Mäusen verwendet. Ein erkennbar krankes Tier wurde nach 5 Tagen geopfert, und es wurde das anschließend verifizierte völlig Maus-virulente Isolat χ3181 aus einem Peyer's Patch gewonnen. Ein gyrA-Mutant, de Resistenz gegen Nalidixinsäure überträgt, wurde in χ3181 durch P22- Transduktion eingeführt, um χ3306 zu ergeben, den Ausgangsstamm für alle hier zu beschreibenden Stämme (Tabelle 1).
Indem aufgezeigt worden ist, daß S. typhimurium Isolate, die entledigt bzw. geheilt ("cured") sind vom 100 kb Virulenz-Plasmid, vollständig dazu befähigt sind, festgemacht zu werden an, einzudringen und zu bestehen in Peyer's Patches, daß es ihnen aber ermangelt, auf die mesenterischen Lymphknoten und die Milz zu traversieren, wurden cya und crp- Mutanten in den Plasmid-entledigten S. typhimurium SR11-Stamm χ3337 sowie in das Plasmid enthaltende SR 11-Derivat χ33C6 eingeführt. Es sollte ausdrücklich festgestellt sein, daß die Reintroduktion des pStSR100- Plasmids in χ3337 dessen Virulenz vollständig wiederherstellt (siehe Beispiel 3), wodurch sichergestellt ist, daß keine sekundären Mutanten in χ3337 während der Behandlung mit dem Virulenz-Plasmid entstanden sind. TABELLE 1 BAKTERIENSTÄMME Stammnummer Ausgangsstamm/Plasmid Relevanter Genotyp Ableitung prototroph virulent prototroph Charles Turnbough William Benjamin spontan Malidixinsäure-resistenter Mutant von χ3000 ner Maus durchlaufe χ3041 Virulenz-Plasmid
Die Tabelle 2 enthält aufgelistet die phänotypischen Eigenschaften aller Mutantenstämme und ihrer Ausgangsstämme bezüglich der Zuckerfermentation und des Wachstums auf verschiedenen Kohlenstoffquellen. Die Phänotypen stellen sich wie erwartet dar, und zwar auf der Grundlage von veröffentlichten Berichten der Erfordernisse für cyclisches AMP und das cyclische AMP-Rezeptorprotein für katabolische Aktivitäten. (Eine Ausnahme stellt χ 4060 dar, der sich eher wie ein ca crp-Doppelmutant als ein cya-Einzelmutant verhielt). Allen cya/crp-Mutantenstämmen fehlen Fimbriae und Flagella, wie auf der Grundlage früherer Ergebnisse erwartet (Saier et al, J. Bact. 134 (1):356-358 (1978; Yokota und Gots, J. Bact. 103:513-16 (1970); und Komeda et al., Mol. Gen'l Genet. 142:289-298 (1975)). Es ist auch belegt, daß das Vorhandensein bzw. die Gegenwart des pStSR100- Plasmids keinen Effekt auf diese Phänotypen ausübte.
Auf jeder Stufe bei der Herstellung im Anschluß an die Selektion eines Fusarinsäure-resistenten Tetracyclin-empfindlichen Derivats wurde eine Untersuchung im Hinblick darauf durchgeführt, ob Tetracyclin-resistente Revertanten/Mutanten mit hoheren Häufigkeiten gewonnen werden konnten, als dies für den χ3306-Ausgangsstamm beobachtet werden konnte. In allen Fällen wurden solche Tetracyclin-resistenten Revertanten/Mutanten nicht beobachtet. TABELLE 2 : Fermentations- und Wachstumseigenschaften von Bakterienstämmen Stammnummer Phanotyp Fermentationsphänotyp auf MacConkey-Agar, enthaltend: a Wachstum auf Minimalagar, enthaltend: a: + = positiv für Fermentation und Wachstum; +/- = intermediäres Rosa- oder Trüb-Typ-Wachstum; - = negative für Fermention oder Wachstum
Koloniedurchmesser auf MA, enthaltend 0,5% Glucose, sind als Funkton von Inkubationszeit und Entstehungszeiträumen in ML, enthaltend 0,5% Glucosa, von einigen der Mutantenstämme und ihren Ausgangsstämmen in Tabelle 3 dargestellt. Es ist belegt daß die Δcya-Stämme mit oder ohne dem/den Δ crp-Mutant und unabhängig von der An- oder Abwesenheit des pStSR100- Plasmids viel langsamer wachsen als die χ3306 Ausgangskultur. TABELLE 3 Wachstumeigenschaften von Bakterienstämmen Stamm-Nummer Relevanter Genotyp Koloniedurchmesser Entstehungszeit b (Min) a Kolonien, verteilt - 100 pro Platte auf MA + 0,5% Glucose b Wachstum in ML + 0,5% Glucose
Virulenz von Mutantenstämmen für Mäuse. Eine vorläufige Information über die Virulenz von Mutantenstämmen wurde erhalten, indem einzelne Mäuse mit entweder 10&sup5; Mutantenzellen intraperitoneal oder mit 10&sup8; Mutantenzelien peroral infiziert und Morbidität und Mortalität aufgeschrieben wurden. Da χ3395 mit dem cya::Ta10-Mutant und χ3396 mit dem crp::Tn10Mutant offensichtlich avirulent waren, und da Mäuse, die die Infektion mit beiden überleben, immun gegen die Herausforderung durch Wild-Typ χ3306 Zellen werden, wurden weitere Untersuchungen an der Viruenz von χ3395 und χ3390 unternommen. Tabelle 4 enthält Daten, die zeigen, daß Mäuse eine Infektion mit ca. dem 10³-fachen der LD&sub5;&sub0;-Dosis von entweder dem cya::Tn10 Mutant oder dem crp::Tn10-Mutant überleben. Es wurden sodann Untersuchungen begonnen mit Stämmen, in denen das Tn10 und angrenzende DNA-Sequenzen deletiert worden waren. Tabelle 5 zeigt Daten über Morbidität und Mortalität von Mäusen, die peroral mit S. typhimurium Wild-Typ, Δcya- und Δcrp-Stämmen infiziet wurden. Es ist belegt, das ohne Berücksichtigung des Alters der Mäuse zum Zeitpunkt der Infektion alle Mäuse die Infektion mit 1000 bis 4000 Wild-Typ-LD&sub5;&sub0;-Dosen eines jeden der Mutantenstämme überleben. Die Information in Tabelle 5, die die Avirulenz des pStSR100-entledigten Derivats χ3337 betrifft, steht in Übereinstimmung mit den in Beispiel 3 dargelegten gründlicheren Untersuchungen.
Tabelle 6 enthält zusätzliche Daten, betreffend die Infektion mit den Δcya- und ΔcyaΔdcrp-Stämmen χ4060 und χ4062 (Plasmid-entledigt) sowie mit χ4032 und χ4064 (Plasmid-enthaltend), die belegen, daß Mäuse, die peroral mit 1 x 10&sup9; Bakterien infiziert sind, im wesentlichen genausogut wachsen wie Mäuse, die uninfiziert bleiben.
Tabelle 7 zeigt Daten für intraperitoneale Herausforderung mit S. typhimurium Mutanten. Die Mäuse überlebten eine Infektion mit dem 10² bis 10³-fachen der Wild-Typ-LD&sub5;&sub0;-Dosis für die verschiedenen Mutantenstämme. Bei höheren Dosismengen wurde Erkrankung beobachtet, die teilweise auf Effekte von Endotoxin zurückzuführen sein kann. TABELLE 4 VIRULENZ von S. typhimurium SR-11 cya::Tn10 /und crp 773::TN10 in BALB/c weiblichen Mäusen 30 Tage nach peroraler Inoculation Stammnummer Relevanter Genotyp Inoculierungsdosis (cfu) Alter der Mäusea Überlebenlebendig/gesamt Durchschnittstag des Todesb Gesundheitc Wild-Typ Wochen schäbig gesund a zum Zietpunkt der Immunisierung b von Tieren, die starben c gesund - keine erkennbaren Anzeichen einer Erkrankung; schäbig - erkennbar krank TABELLE 5 Morbidität und Mortalität 30 Tagenach peroraler Herausforderung von BALB/c Mäusen mit S. typhimurium SR-11 Δcya und/oder Δcrp-Stämmen Stammnummer Relevanter Genotyp Inoculierungsdosis (cfu) Alter der Mäusea Überleben lebendig/gesamt Gesundheitb Wild-Typ Wochen schäbig gesund a zum Zeitpunkt der Herausforderung b gesund - keine erkennbaren Anzeichen einer Erkrankung; schäbig - erkennbar krank c Durchschnittstag des Todes = 7 TABELLE 6 Bewertung des wachstums von 8 wochen alten BALB/c weiblichen Mäusen 30 Tage nach Verabreichung von ΔcyaΔcrp S. typhimurium SR-11 Gewicht (in Gramm) bei: Stammnummer Relevanter Genotyp Inoculierungsdosis Zeitpunkt der Infektion 30 Tage nach der Infektion uninfiziert TABELLE 7 Morbidität und Mortalität 30 Tage nach interperitonealer Herausforderung von 8 Wochen alten BALB/c weiblichen Mäusen mit S. typhimurium SR-11 Δcya und/oder Δcrp-Stämmen Stammnummer Relevante Genotyp Herausforderungsdosis cfu Überleben lebendig/gesamt Durchschnittstag des Todesa Gesundheitb schäbig keine gesund moderat a von Tieren, die starben b gesund - keine erkennbaren Anzeichen einer Erkrankung; moderat - gemäßigt krank; schäbig - erkennbar krankWirksamkeit der Immunisierung mit avirulenten Mutanten. Tabelle 8 zeige Daten, betreffend die Fähigkeit der verschiedenen S. typhimurium Δcya und Δcya Δcrp-Mutanten, Immunität auf anschließende perorale herausfordernde Verabreichung des 10&sup4;-fachen der LD&sub5;&sub0; Dosismengen von voll virulenten S.typhimurium SR11 χ3306-Zellen zu induzieren. Unter diesen Herausforde rungsbedingungen des schlimmsten Falles zeigten viele der Mäuse moderate Krankheitsanzeichen mit herabgesetztem Nahrungsmittelverbrauch, ausgenommen Mäuse, die mit χ4064 immunisiert waren, die gesund blieben und normal aßen und wuchsen. Die Opferung aller Tiere (sogar derjenigen, die mit χ 4064 immunisiert waren) 30 Tage nach der Herausforderungsunterziehung, zeigten eine Milzvergrößerung, und man war in die Lage versetzt, den χ 3306 Wild-Typ-Herausforderungsstamm, jedoch nioht die avirulenten Δcyaoder Δcya Δcrp-Impfstoffstamme wiederzugewinnen. im Gegensatz dazu, wurden Milzvergrößerung und Wiedergewinnung des Herausforderungsstammes nicht beobachtet, als Mäuse, die mit ca. 1 x 10&sup9; χ4064 immunisiert waren, mit dem nur 100- bis 1000-fachen der LD&sub5;&sub0;-Dosen des voll virulenten χ 3306-Ausgangsstammes einem Herausforderungstest unterzogen wurden.
Gewebetrophismus und Beständigkeit avirulenter Mutanten in vivo. Fig. 1 und 2 zeigen Daten, betreffend die Wiedergewinnung des Δcya Δcrp Stammes 74064, im Vergleich zur Wiedergewinnung des Nalidixinsaureempfindlichen Wild-Typ-Stammes 73456 (Tn-mini-tet-markiert; siehe Tabelle 1), als Funktion der Zeit nach peroraler Inoculation. Es ist belegt, daß Δcya- und Δcrp-Mutanten die Befähigung von S. tyxphimurium nicht signifikant beeinträchtigen, festzumachen an, einzudringen und zu bestehen in den Peyer's Patches, und zwar mindestens für eine Zeitdauer, die ausreicht, Protektivimmunität zu induzieren (Fig. 1), daß sie aber die Befähigung beeinträchtigen, die Milz zu erreichen oder darin zu überleben (Fig. 2). TABELLE 8 Wirksamkeit der Immunisierung mit avirulenten S. typhimurium Sr-11 Δcya Δcrp beim Schutz gegen Herausforderung mit 2 x 10&sup9; cfu Wild-Typ virulenten S. typhimurium SR-100a Stammnummer Relevanter Genotyp Dosis cfu an Immunisierungsstamm Alter der Mäuseb Überleben (lebendig/gesamt) Durchschnittstag des Todes c Gesundheitd Wochen moderat gesund a30 Tage nach Immunisierung von 4 oder 8 Wochen alten Müusen mit den angegebenen Stämmen, die Mäuse wurden einem Herausforderungstest unterzogen mit einer peroralen Dosis von 2,0 x 10&sup9; cfu an χ3306 Wild-Typ virulentem S. typhimurium SR-11. bzur Zeit der Immunisierung cnach Immunisierung des Tieres, das starb dgesund - keine erkennbaren Anzeichen einer Erkrankung; moderat - gemäßigt krank
Genetische Stabilität avirulenter Mutanten. Oral als Lebendimpfstoffe zu verabreichende Stämme müssen vollständige Stabilität aufweisen, und zwar hinsichtlich sowohl ihrer Avirulenz als auch ihre immunogenen Attribute. Einige der als Kandidaten vorgesehenen Impfstoffstämme sind deshalb in L- Nährlösung auf eine späte log-Phase unter Belüftung wachsen gelassen, 50- fach aufkonzentriert und bei verschiedenen Verdünnungen auf einer Reihe von Minimalagarmedien einer Plattenkultur unterzogen worden, enthaltend Kohlenstoffquellen, die das Wachstum des Ausgangsmutant nicht fördern (Tabelle 2). Ein Duplikatsatz von Platten wurde ultraviolettem Licht mit einer Intensität ausgesetzt, die 70% Zelltod verursachte. Spontane Revertanten/Mutanten wurden bei niedrigen, jedoch meßbaren Häufigkeiten (Tabelle 9) beim Δcya Stamm χ4032 und bei höheren Häufigkeiten beim Δ cya Stamm χ4060 beobachtet; viele dieser Revertanten waren zum Wachstum auf den meisten Kohlenstoffquellen befähigt, und es lag bei ihnen deshalb die Wahrscheinlichkeit vor, crp*- (Schalte und Postma, J. Bact 141:751-57 (1980); Garges und Adhya, Zell 41:745-51 (1935) oder csm-(Melton et al, Mol. Gen'l Genet. 182:480-89 (1981)) Mutanten zu sein, die es CRP ermöglichen, Transkription in der Abwesenheit cyclischen AMP's zu aktivieren.
Revertanten/Mutanten aus den Δcya Δcrp-Stämmen wie χ4064 waren extrem selten (Tabelle 9), und obwohl dazu fähig, auf der Kohlenstoffquelle (d.b. Mannit) zu wachsen, an der sie selektiert wurden, scheiterten sie, auf jeder der weiteren Kohlenstoffquellen zu wachsen, an deren Nutzung der ursprüngliche Stamm scheiterte (Tabelle 2). Diese Revertanten/Mutanten weisen unzweifelhaft Promotor-Mutanten auf, unter Verursachung von Transkription des spezifischen Gens/Operons, um unabhängig von CRP zu sein. Bestrahlung mit ultraviolettem Licht steigerte nicht die Mutations-/Reversionshäufigkeiten.
Sechs Revertanten/Mutanten sind bezüglich der Virulenz bewertet worden. Vier Mäuse wurden herangezogen, jeden Revertanten zu testen. Eine erhielt eine perorale Dosis von 10&sup5; Zellen, eine weitere eine perorale Dosis von ca. 10&sup8; Zellen, eine weitere eine intraperitoneale Dosis von 10² Zellen und schießlich eine weitere eine intraperitoneale Dosis von 10&sup5;. In allen Beispielsfällen behielten die vier Revertanten aus Δcya- Mutanten und die zwei Revertanten von Δcya Δcrp-Stämmen die Avirulenz ihres Ausgangsstammes bei, da alle 32 Mäuse bei keinen erkennbaren Krankheitsanzeigen gesund blieben. Es scheint daher der Fall zu sein, daß die Avirulenz von Δcya Stämmen nicht nur zurückzuführen sein kann auf einen defekten Kohlenhydrat-Katabolismus. TABELLE 9 Spontane Reversion / Mutation von Δcya Δcrp-Stämmen, wie gezeigt durch Plattenkultur von 50fach konzentrierten Kulturen auf Minimalagar mit 0,5% Endkonzentration verschiedener Kohlenhydrate Stammnummer relevanter Genotyp Reversionshäufigkeit aTMTC = zu viele zum Zählen (too many to count)
Das obige Resultat belegt die Erstellung einer Anzahl von Derivaten des Maus-virulenten S. typhimurium SR11-Stammes χ3306, dem die Befähigung fehlt, Adenylat-Cyclase und das cyclische APM-Rezeptorprotein zu synthetisieren, und welcher das pStSP100-Virulenz-Plasmid besitzt oder nicht besitzt. Obwohl alle Stämme auf dem peroralen Weg der Inoculation avirulent sind, und alle einen hohen Grad an Protektivimmunität gegen anschließende Herausforderungsaussetzung mit virulenten S. typhimurium Wild-Typ-Zellen induzieren, snd χ4062 und χ4064, welche beide Δcya und Δcrp Mutanten enthalten, bevorzugt. Die Verwendung des Doppelmutanten mit der Deletion des crp-Gens beugt einem Wiedererstehen von crp*-Mutanten vor, die Transkription von Genen und Operonen ermöglichen, welche eine Aktivierung durch das CRP-Protein bei Abwesenheit jeglichen Bedarfs für cyclisches AMP erfordern. In ähnlicher Weise beugt die Abwesenheit des crp-Gens dem Wiedererstehen von cms-Supressor-Mutanten vor, die in naher Verbindung zum crp-Gen stehen, und welche auch zur Umgehung des Bedarfs für cyclisches AMP befähigen. Obwohl sogar die getesteten Δcya crp*- oder cms-Revertantenstämme avirulent blieben, sind genügend unabhängige revertante Isolate auf Virulenz getestet worden, um die Schlußfolgerung zu ziehen, daß eine Virulenz nicht wiederhergestelit werden konnte; deshalb sollte der Δcrp-Mutant eine solche Wiederherstellung von Virulenz ausschließen, und zwar unbeschadet, wie unwahrsche-nlich solche Änderungen sein könnten. Zudem setzt der Δcrp::Tn10-Mutant die Virulenz von S. typhimurium (Tabelle 4) signifikant herab, und deshalb würde in dem unwahrscheinlichen Vorfall, daß der Δcya -Mutant durch irgendeinen Typ von Gentransfervorfall verlorgenginge, der Δcrp-Murant, den Stamm immer noch avirulent stellen.
Der Impfstoffstamm χ4064, der noch das pStSR100-Plasmid besitzt, induziert einen höheren Grad von Immunität, als dies der Plasmid-freie Stamm χ4062 tut (Tabelle 8). Dies ist unzweifelhaft mit der gesteigerten Fähigkeit von χ4064 (Fig. 1 und 2) und von Plasmid-enthaltenden Stämmen im allgemeinen begründet, höhere Titer zu erzielen, und länger zu bestehen als Pasmid-freie Stämme in mesenterischen Lymphknoten und der Milz (siehe Beispiel 3). Andererseits könnte die Immunisierung mit χ4064 weniger gut toleriert werden als eine Immunisierung mit χ4062 bei jungen Lebewesen oder bei Personen, die unterernährt oder anderweitig beeinträchtigt sind. Diesbezüglioh könnte man, falls zwei Immunisierungen wünschenswert wären, zuerst mit χ4062 und dann mit χ4064 immunisieren.
Eine erwünschte Verwenlung von Impfstoffstämmen wie χ4062 und χ4064 ist es, als Trägerstoffe zu dienen und Kolonisations oder Virulenz- Antigene als Zielpunkte heranzuziehen, die durch Gene aus anderen Pathogenen auf das Eingeweide-verbunden Lymphoidgewehe (GALT) exprimiert werden, um so eine verallgemeinerte sekretorisohe Immunreaktion sowie humorale und zelluläre Immunität zu nduzieren, falls dies angestrebt sein sollte. Deshalb sind eine Vielzahl von Klonierungsvektoren in χ4062 und χ4064 eingeführt worden und diese Plasmide weisen eine Stabilität auf, die gleich derjenigen oder größer als diejenige in den Wild-Typ Ausgangsstämmen ist. Tatsächlich steigert die langsamere Wachstumsge schwindigkeit von χ4062 und χ4064 (Tabelle 3) unzweifelhaft die Befähigung von Plasmid-Replikonen, mit der chromosomalen Replikation mitzuhalten, um sicherzustellen, daß Nachkommenschaftszelien Plasmid enthalten. Zudem ist eine Vielzahl rekombinanter Derivate erstellt worden, und es ist herausgefunden worden, daß das Kolonisierungs-Antigen SpaA, das notwendig ist zur Kolonisation von 3. mutans und S. sobrinus auf die Speicherglycoprotein-überzogene Zahnoberfläche (Cirtiss, J. Dent. Res. 65: 1034-1045 (1986)), mit einem höheren Grad in den Δcya Δcrp Mutanten als in S. typhimurium-Stämmen mit anderen Avirulenz-verleihenden Mutanten exprimiert ist.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt wie die Δcya Δcrp-Mutanten in andere Salmonella- Spezies eingeführt werden können, um die genannten Spezies avirulent zu stellen und sich somit als Impfstoff-Komponenten verwenden lassen.
Salmonella-Spezies, die sich zur Ausführung dieser Ausgestaltungsform der Erfindung verwenden lassen, schließen S. arizona und S. gallinarum als Vogel-Salmonella-Stämme, S. choleraesuis als eine Schwein-spezifische Salmonelle, S. dublin als eine Rind-spezifische Salmonelle sowie eine Anzahl von S. typhimurium Derivaten ein, die aus Hühhern, Truthähnern, Rinderkälbern, Schweinen und Pferden isoliert worden sind. Diese Stämme können verwendet werden, Δcya Δcrp Mutanten mit und ohne Virulenz- Plasmiden zu erstellen, um Protektivimmunität zuerst in Mäusen und dann in besonderen Lebewesenwirtsspezies zu bewerten. Diese avirulenten Salmonella-Derivate lassen sich auch dazu verwenden, bivalente Lebendimpfstoffstämme zur Stimulation von schützender Immunitat gegen die Kolonisation und die Virulenz-Proteine weiterer bakterieller Pathogene zu erstellen. In besonderer Weise kennen Impfstoffe gegen B. avium und E. coli, zwei respiratorische Pathogene, die für hohe Krankheitsanfälligkeit und Mortalität bei Geflügel verantwortlich sind, sowie gegen Streptococcus equi hergestellt werden, welcher Erstickungen bei Pferden hervorruft.
Erstellung avirulenter Salmonella-Stämme.
S. typhimurium LT-2-Stämme, die cya::Tn10 oder crp::Tn10 mit dem Δ[gal-uvrB] 1005-Mutant besitzen, der einen glatten oder rauhen Phänotyp abhängig macht von der jeweiligen An- oder Abwesenheit von Galactose im Kulturmedium, werden verwendet, um den Δcya Δcrp - Genotyp zu erzeugen. Transduktion mit P22 HT int wird angewandt, um die cya:: Tn10 und crp Tn10 Mutanten in Stämme von S. typhimurium, erhalten aus verschiedenen Wirtszellen, sowie in S. typhi, S. paratyphi und weitere Salmonellen mit ähnlichen O-Antigenen einzuführen. Der rauh-spezifisch generalisierte transduzierende Phage P1L4 wird angewandt, um die Tn10-induzierten Mutanten in S. arizona, S. callinarum, S. dublin sowie S. choleraesuis einzuführen. P1L4-Transduktion der Salmonella-Spezies, oben beschrieben, machen Isolation rauher Mutanten erforderlich. Selektion auf 2-Deoxygalactose-Resistenz führt zu galE-Mutanten. Der galE-Defekt kann letztlich durch Transduktion mit P1L4, fortgepflanzt auf einem rauhen Mutant, mit dem Wild-Typ-gal&spplus;-Gen eliminiert werden.
Stabile Deletions-Mutanten werden durch Selektion auf Fusarinsäure- resistente Derivate von Stämmen isoliert, die die cya::Tn10- und/oder crp::Tn10-Insertions-Mutanten enthalten. Fusarinsäure-resistente Derivate sind Tetracyclin-empfindlich wegen ungenauer Ausschneidung des Transposons und angrenzender Wirts-Chromosomengene. Ist eine anschließende Verwendung von Tn10 erwünscht, ist es notwendig, zu verifizieren, daß die Fusanrinsäure-resistenten Isolate Tn10 vollständig verloren haben, z.B. durch Einsatz eines λ::Tn10-Vektors als eine Hybridisierungssonde.
Salmonella-Stämme, die mit dem Virulenz-Plasmid behandelt sind, werden durch Anwendung von Verfahren und genetischen Werkzeugen aufgebaut, die für S.typhimurium entwickelt sind (siehe Beispiele 1 und 3). Tnmini-tet, beschrieben von Way et al, (Gene 32:369-79 (1984)), wird auf dieser Stufe des Aufbauverfahrens eingesetzt. Dieses Transposon, dem Transposase fehlt und das eine Deletion nicht spontan bewerkstelligen kann, wird insertiert in die Virulenz-bezogene Region des 100 kb Virulenz-Plasmids, das wahrscheinlich homolog ist zu den Virulenz-Plasmiden von S. dublin, S. gallinarium und S. choleraesuis (Popoff et al., Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 135A: 389-358 (1984)). Die Transposon-Insertionen werden in die homologen Sequenzen von galE-Mutanten dieser weiteren Spezies transduziert. Tnmini-tec-markierte Virulenz-Plasmide werden einer Kur unterzogen, indem man Bakterien in Novobiocin, einem DNA- Gyrase-Inhibitor bei erhöhten Temperaturen von ca 4300 wachsen läßt. Die Heilung/Entledigung ("Curing) der Virulenz-Plasmide läßt sich durch Hybridisierung geheilter/entledigter Derivate mit ³²p-markiertem nativen Virulenz-Plasmid nachweisen bzw. verifizieren.
Alle aufgebauten Stämme werden bezüglich der Stabilität der genetischen Attribute bewertet, und es ist zu ermitteln, daß der in S. typhimurium-Mutanten wiedergegebene Phänotyp in weiteren Salmonella Spezies wiedergegeben ist. Ein letzter Schritt zur Erleichterung der Untersuchungen bei Tieren ist es, ein Markierungsmittel für Arzneimittelbeständigkeit einzuführen, um bei der Verfolgung des Salmonella-Stammes beim Tierversuch behilflich zu sein. Gewöhnliche Resistenz gegeüber entweder Nalidixinsäure oder Rifampicin wird herangezogen, da diese Resistenzen in der normalen Flora von Mäusen, Hühnern oder Truthennen nicht vorherrschend sind.
Die Einführung einiger der Transposon-induzierten Mutanten in einige der Salmonella-Spezies durch Transduktion kann unmöglich sein. Alternativ dazu, läßt sich die Konjugation vorteilhaft anwenden, wobei der Transposon-induzierte Mutant auf einem Plasmid kloniert ist, das aus einem Hfr- mit einem integrierten IncF- oder IncP-Plasmid in die Salmonelle mobilisiert sein kann. Eine weitere Alternative wird noch durch ein Transformationsverfahren bereitgestellt, worin die Stufen der Selektion auf Rekombination der Sequenz in das Chromosom, Eliminierung des Plasmids und Verifikation der präzisen genetischen Verletzung durchgeführt werden
Bewertung von Immunogenizität, Kolonisation und Bestehensfähigkeit Die oben erstellten avirulenten Salmonella-Stämme können in Mäusen unter Anwendung peroraler Inoculatitn, gastrischer Intubation oder intraperitonealer Injektion bewertet werden.
Das Verfahren wird in Gang gesetzt indem man Slamonella-Stämme bis zur log-Phase wachsen läßt und sie aufkonzentriert auf annähernd 10¹&sup0; Zellen/ml in einer gepufferten Kochsalzlösung mit Gelatine. Die Tierdie peroral oder durch gastrische Intubation zu inoculieren sind, werden 4 Stunden vor der Inoculation von Futter und Wasser ferngehalten. Natriumbicarbonat wird den Mäusen 5 Minuten vor der Inoculation verabreicht, um die sauren Bedingungen im Magen zu neutralisieren. Futter und Wasser werden den Mäusen 30 Minuten nach der Inoculation wieder angeboten. Auf der Grundlage früherer Versuche mit diesen Mutantenstammen von S. typhimurium bei Mäusen stellen die Merausforderungsmengen bei Mäusen gewöhnlich 10³ LD&sub5;&sub0;-Dosismengen dar. Dies könnte nicht praktisch sein, wenn dem Wild-Typ der verschiedenen Salmonella-Spezies keine LD&sub5;&sub0;-Werte ergibt, die so hoch sind, wie sie bereits für den Maus-virulenten S. typhimurium beobachtet wurden. Dies stellt eher ein Problem für den peroralen Weg der Inoculation dar, da eine Verabreichung von mehr als 10&sup9; Organismen schwierig durchzuführen ist. Intraperitoneale Inoculationen lassen sich ebenfalls mit Dosismengen bis zu dem Niveau durchführen, das zu endotoxischem Schock (annähernd 10&sup7; Zellen) führen würde. Die Gewichts- und Gesundheitsbedingungen der Tiere werden einen Monat lang verfolgt. Mäuse, die mit dem mutanten Salmonella-Stamm inoculiert sind und 30 Tage überlebt haben, werden einem Herausforderungstext mit 10³ LD&sub5;&sub0;-Werten des virulenten Salmonella-Ausgangsstammes über den peroralen oder intraperitonealen Weg ausgesetzt. Der Gesundheitszustand der infizierten Tiere wird täglich mit periodischer Bewertung der Wachstumsgeschwindigkeit verfolgt. Vor dem Herausforderungstest werden Speichelproben durch Pilokarpin-Stimulation sowie jeweils Tierblutproben genommen, um Serum zu sammeln. Es werden quantitative Titer von sekretorischem IgA und IgG im Speichel und von IgA und IgG im Serum gegen Salmonella-Oberflächenantigene ermittelt. Die Wirkung der sekundären Immunisierung auf Antikörper- Titer und die Beständigkeit der Immunität wird auch festgestellt.
Impfstoffstämme, die avirulent sind, einen hohen Grad an Immunität induzieren und die Gewichtszunahme nicht gegenteilig beeinflussen, werden dazu verwendet, die quantitativen Titer des Stammes zu bestimmen, der sich an den Wänden des Dünn- und Dickdarms festgesetzt hat, sowie in Peyer's Patches, den Inhaltsstoffen des Dünn- und Dickdarms, den mesenterischen Lymphknoten und in der Milz vorhanden ist, und zwar nach 4, 24, 48, 72 und 96 Stunden sowie in wöchentlichen Abständen danach, falls dies notwendig sein sollte. Diese Information wird mit den Daten über die erhaltene Immunreaktion korreliert.
Stämme, die in Mäusen avirulent und immunogen sind, werden dann in der geeigneten Tierspezies getestet, z.B. S. arizona, S. callinarium und Vogel-S.typhimurium-Stämme in Huhn- und Truthennengeflügeltier. Zur Bewertung von Avirulenz und Immunogenizität in Vogelwirtszellen werden die Titer virulenter Salmonella im Kropf, Blinddarm und Bursa of Fabricious zusätzlich zu den bei Mäusen untersuchten Geweben ermittelt.
Erstellung und Testung bivalenter Impfstoffstämme zur Immunisierung gegen Bordetella avium.
Impfstoffe gegen B. avium sollten die bei der Kolonisation involvierten Oberflächenstrukturen und die antigenen, aber nicht toxischen Determinanten von dermonekrotischem Toxin exprimieren. Imfpstoffe zu Oberflächenproteinen sollten Immunität erzeugen, indem sie die Besiedlung der Tracheen blockieran, während Antikörper auf dermonekrotisches Toxin dessen Gegeneffekte neutralisieren sollten. Obwohl die bei der Kolonisation involvierten B. avium-Oberflächenstrukturen nicht bekannt sind, befähigt die Verfügbarkeit aus Gen-Bibliotheken von B. avium in λgt11 Expressionsvektoren und Transposon-induzierten B.avium-Mutanten zur Isolation und Identifikation von Genen, die die Oberflächenproteine einkodieren. Durch Einführung der rekombinante Plasmide enthaltenden Gene für Oberflächenproteine und/oder Determinanten für dermonekrotisches Toxin in eine avirulente Salmonelle kann man einen bivalenten Stamm selektieren, der schützende Immunität indbziert, indem man die Kolonisation verhindert (um somit in der Kolonisation involvierte Gene zu identifizieren), oder indem man Toxin neutralisiert.
Die Gene für B. avium-Aussenmembranproteine und/oder dermonekrotisches Toxin werden auf geeignete avirulente S. arizona, S. gallinarum und/oder S.typhimurium Derivate über Transformatin gemäß dem Verfahren von Curtiss übertragen (Manual of Meth. in Bacteriol., ASM. Washington, D.C. (1981)), und die Expression dieser Proteine wird unter Anwendung von Western-Blot-Verfahren Towbin et al, Proc Nat'l, Acad. Sci. (USA) 78:4350-54 (1979)) untersucht. Ein 5-Minuten-Hitzeschock bei 50ºC vor der Transformation wird angewandt, um jede Restriktionsbarriere in Salmonellen zu überwinden. Frühere Berichte haben aufgezeigt, daß Bordetella-Gene in E. coli nicht wirksam exprimieren, wenn sie nicht aus einem E. coli- Promotor transkribiert sind. Diese Probleme mit Expression von B. avium Genen und Translocation der Proteine auf die Aussenmembran der Salmonellen werden durch den Einsatz eines rekombinanten Vektors beseitigt in welchem das Gen in das E. coli lamB- oder ompA-Gen verschmolzen ist. Zudem würden die B.avium- Proteine auf die Aussenmembran von Salmonellen translozieren und die Wahrscheinlichkeit der Stimulierung einer starken Immunreaktion vergrößern, wenn erst einmal der bivalente Impfstoffstamm die Peyer's Patches besiedelt. Sind erst einmal B. avium-Gene in Salmonellen insertiert, werden die rekombinanten Klone auf Expression der Gene durch Kolonie-Immunoblots unter Anwendung spezifischer Antikörper und von Elektronenmikroskopie immunomarkierter Salmonellen, wie beschrieben von Chorbit et al EMBO J. 5:3029-37 (1986),) analysiert.
1 bis 3 Tage alte Geflügeltiere werden peroral mit dem bivalenten Impfstoff und Serum immunisiert, und die respiratorischen Sekretionen werden verfolgt und aufgezeichnet, um den Typ (IgY (IgG, 75 Ig), IgM, und IgA (IgB)) und die Menge der Antikörper-Reaktion zu bestimmen. Immunisierte und nicht-immunosierte Geflügeltiere werden verglichen im Hinblick auf Gewichtsverlust, um mögliche Nebeneffekte des bivalenten Impfstoffes aufzuzeichnen. Zusätzlich werden Truthahn-Geflügeltiere einem Herausforderungstest durch intranasale Inoculation mit 10&sup9; virulentem B. avium unterzogen, oder indem sie infizierten Vögeln ausgesetzt werden. Die herausgeforderten Truthahn-Geflügeltiere werden bezüglich der Krankheit, Nekropsied, beobachtet und auf tracheale Gewebeschädigung und Änderung be den Titern des Oragnismus untersucht.
Ist eine mukoslae Immunreaktion gegen B. avium ungeeignet, sehr junge Hühner und Puten zu schützen, können Bruthennen mit avirulenten almonellen Immunisiert werden, die B. avium Kolonisation und/oder Virulenz-Antigene exprimieren, um einen Ei-Transfer mütterlicher Antikörper zu ermöglichen. Eine solche Behandlung wurde die Immunität auf B. avium erhöhen, während die jungen Huhn- oder Putengeflügeltiere heranwachsen. Eine schützende pertrale Immunisierung unter Anwendung desselben rekornbinanten Trägers kann ebenfalls während der Reifungs- bzw. Wachstumsphase verabreicht werden.
Erstellung und Testung bivalenter Impfstoffstämme, um gegen Vogel- E.coli zu immunisieren. Rekombinante Klone, die avirulente E. coli mit gesteigerter Virulenz oder Befähigung ausstatten, Lufthöhlen bei Hühnern zu kolonisieren, werden in avirulente Stämme von S. gallinarum und/oder S. typhimurium durch die oben beschriebenen Verfahren eingeführt. Die Expression von Virulenz-Determinanten auf die Salmonellen-Zelloberfläche wird ermittelt durch fluoreszierende Antikörper-Verfahrenstechniken, es sollte jedoch festgestellt sein, daß die Wahrscheinlichkeit gegeben ist, daß E. coli-Zelloberflächen-Determinanten auf die Oberfläche von Salmonellen exprimiert werden.
Hühner werden peroral mit dem bivalenten Impfstoffstamm immunisiert und einem Herausforderungstest unterzogen, dem man virulentes E. coli in die Lufthöhle im Hinterteil injiziert. Falls sich Septizemie nicht entwickelt, sind Vögel als nekropsied zu bestimmen, wenn die Befähigung zur Kolonisierung der Lufthöhle beeinflußt worden ist. Anschließend wird eine zusammenfassende Untersuchung der Typen, Menge und Dauer der Antikörperreaktion in den respiratorischen Sekretionen und im Serum, wie oben beschrieben, für Putengeflügeltier durchgeführt.
Verfahrensweise zur Impfstoffverabreichung und Bewertung sind dieselben wie die vorher für den B. avium-Impfstoff beschriebenen.
Erstellung und Testung bivalenter Impfstoffstämme zur Verleihung von Immunität gegen Streptococcus equi. Avirulente Derivate von S. typhimurium, die das S. equi M Protein exprimieren, sind aufgebaut worden.
DNase I erzeugte Zufalisfragmente des S.equi M Proteingens werden in einen λgt11 Expressionsvektor kloniert. Die Genbibliothek wird sequentiell abgetastet mit Antiserum gegen die M-Proteinfragmente, die Protektivimmunität und Antiserum gegen die M Protaindeterminanten hervorbringen, die in den Immunkomplexen von Pferden mit purpura hemorrhagica vorhanden sind. Klonierte Gene, die die schützenden, aber nicht die purpuragenen Determinanten exprimieren, werden zur Fusion auf entweder das lamB- oder ompA-Gen selektiert. Die Immunreaktion gegen avirulente Salmonellen, die jene Determinanten tragen, wird zuerst in Mäusen und dann in Ponies und Pferden untersucht.
Die Verfügbarkeit des beschriebenen Salmonella-Stammes, der auf seiner Oberfläche die relevanten Epitope des M- Proteins von S. equi exprimiert, stellt einen sehr wirksamen Weg zur Stimulierung einer mukosalen nasopharyngealen Protektivimmunreaktion gegen Erstickungsanfälle beim Pferd dar. Das Herausschneiden der purpuragenen Determinanten des M- Proteins trägt zur Sicherheit des Impfstoffes bei.

Beispiel 3

Dieses Beispiel verdeutlicht den Effekt von Virulenz-Plasmid-Deletion auf Immunogenizität und Virulenz einiger Salmonella-Stämme.
Bakterienstämme. Die in diesem Beispiel herangezogenen Bakterienstämme sind in Tabelle 10 zusammen mit Plasmidbeschreibungen aufgelistet. Drei Linien von S. typhimurlum Stämmen wurden eingesetzt Maus-durchlaufene, virulente Stämme SR-11 und SL1344 sowie der weniger virulente Stamm LT2. Escherichia coli HB101 und C600 wurden in genetischen Manipulationen verwendet.
Kulturmedien und Wachstumsbedingungen. Wenn nichts anderes ausgesagt ist, wurden die Bakterien in L-Nährmedium oder an L-Agarplatten (Lennox, Virology 1:190-206 (1955)), ergänzt mit geeigneten Antibiotika in den folgenden Konzentrationen
(ug/ml): Ampicillin (Amp) - 100-200, Tetracyclin (Tet) - 12,5 - 25, Chloramphenicol (Chl) - 30, Kanamycin (Kan) - 50, Streptomycin (Str) - 50, und Nalidixinsäure (Nal) - 50. Zur Anhaftung, Invasion und Mikrophageninfektion wurden einige Kulturen in Brain Heart Infusion-Nährmedium (Difco, Detroit) gezüchtet, weil dieses Medium die bakterielle Anhaftung an die eingesetzten Säugetierzellen steigert alle Kulturen ließ man über Nacht bei 37ºC in ruhenden Nährlösungen des geeigneten Mediums wachsen, und sie wurden subkultiviert in unter Schütteln gehaltene Nährmedien bis zur späten logarithmischen Wachstumsphase (OD&sub6;&sub0;&sub0;:annähernd 0,4 bis 0,7).
Genetischer Austausch. Transformation wurde durchgeführt unter Anwendung des Verfahrens von Bagdasarian und Timmis (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1881)). Phage P22 HTint-medierte Transduktion wurde durchgeführt, wie beschrieben von Schmeiger (Mol. Gen'l Genet. 119:75-88 (1972)). Die Konjugationsverfahren wurden entweder durch Platten-Mattierungen oder Filter-Mattierungen durchgeführt (Willetts, Meth. in Microbiol. 17:35-58 (1984)). TABELLE 10 - BAKTERIENSTÄMME Stamm 100 kb Plasmid Genotyp Beschreibung S. Typhimurium: Wild-Typ Aus C. Turnbough (69) spontanNalr-Derivat von χ3000 100 kb Plasmid-entledigter χ3000 pStLT101 (Tnmini-tet-markierter pStLT100, erhalten durch Transposition aus pNK561) transformiert in χ3344, Tetr verwendet zum Erhalt von Rc Chemotyp LPS; S.A. Tinge und R. Curtiss (veröffentlicht); Δ(galE-uvrB)-1005, erhalten aus B.A.D. Stocker in P22 HTint Δysat aus S154000 SR-11 (57), isoliert aus Peyer's Patch einer infizierten Maus; von Suzanne Michalek gycA1816, transduziert in χ3181 aus χ3147; Mausdurchlaufen 100 kb Plasmid-entledigter χ3306 Stamm 100 kb Plasmid Genotyp Beschreibung E. Coli pStSr101 (Tnmini-tet-markierter pStR100), erhalten durch Transduktion aus χ3000 (pStLT101), transformiert in χ3337, Tetr χ3181 mit Tnmini-tet-markiertem pStR100, erhalten durch Transduktion aux χ3000 (pStLT101), Tetr aus B.A.D. Stocker Maus-durchlaufener 100 kb Plasmid-entledigter χ3339 pStSR101 (Tnmini-tet-markierter pStSR100), transformiert in χ3340, Tetr spontan Nalr-Derivat von C600
DNA-Manipulationen. Großmaßstähige und schnelle Minilysat-Plasmidextraktionen wurden durchgeführt unter Anwendung des Verfahrens von Birnboim (Meth Enzymol. 100:243-255 (1983)). Cäsiumchlorid-Dichtegradient-Zentrifugation, Southern-Blot Hybridisierung, Kolonie-Blot-Hydridisierung und Gel-Elektrophorese wurden unter Anwendung von Standartverfahren durchgeführt. Nick-Translation von DNA mit (γ³² P)ATP (Amersham, Arlington Heights, Ill.; spezifische Aktivität = 1445 Ci/mMol) wurde bei Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md., durchgeführt, (BRL)-Kit gemäß Anleitung des Herstellers. Restriktionsenzym-Abbauverfahren wurden mit Enzymen von BRL gemäß Anleitung des Herstellers durchgeführt.
Markierung des S. typhimurium 100 kb Plasmids mit Tnmini-tet. Der pStLT100 enthaltende Stamm χ3000 wurde transformiert mit pNK861, das Tnmini-tet besitzt (Way et al, Gene 32:369-79 (1984)). Tnmini-tet ist im wesentlichen das TetR-Gen von Tn10 mit invertierten Wiederholungen. pNK861 wurde aus der Genbibliothek von AmpR, TetR χ3000 (pstLT100, pNK861) durch die Mobilisierung im inkompatiblen Plasmid von pNK259 aus χ 3000 (pNK259, F::Tn5) unter Einsatz von F::Tn5 ausgeschlossen. Zur Selektion für Tnmini-tet-Insertionen in das 100 kb Plasmid, das durch F mobilisierbar ist, wurde die (3000::Tnmini-tet (pNK259, F:: Tn5)-Bibliothek mit E. coli HB101, selektiert für TetR, KanR und StrR, mattiert. Potentielle Tnmini-tet-markierte 100 kb Plasmiae in HB 101 wurden zurückmobilisiert in den S. typhimurium Stamm χ3147, durch Selektion bezüglich TetR und NalR. Einige NalR, TetR, KanS-Isolate, die F::Tn5 nicht besaßen, wurden herausgepickt.
Tnmini-tet-Insertionen in das 100 kb Plasmid wurden in jedem der 100 kb Plasmid-enthaltenden, Wild-Typ S.typhimurium-Stämme durch Phage P22 HT int-mediierte Transduktion übertragen.TetR-Transduktanten wurden gerastert auf gesteigerte Größe des 100 kb Plasmids und auf Veränderung im Restriktionsenzymprofil gegenüber demjenigen des Ausgangsplasmids.
Ein Alternativverfahren zur Isolierung von pStLT100::Tnmini-tet- Insertionen beruhte darauf, Plasmid-DNA aus χ3000 (pStLT100, pNK861) zu erhalten und E. Coli HB101(pNK259) zu transformieren, unter Selektierung bezüglich TetR und ChlR.
Behandlung von S. typhimurium mit dem Tnmini-tet markierten 130 kb Plasmid. S. typhimurium Stämme mit Tnmini-tet-Insertionen im 100 kb Plasmid wurden zwei Heilungsverfahren unterzogen - Wachstum bei 43ºC oder Wachstum in Novobiocin enthaltendem Nährmedium. Tnmini-tet-markierte Stämme ließ man täglich mit niedrigen Inocula (10³ - 10&sup4; Kolonien bildenden Einheiten (Colony-forming units) (CFU)) für jedes der Heilungsverfahren durchlaufen. Als die Kulturen die stationäre Phase erreicht hatten (OD&sub6;&sub0;&sub0;: annähernd 0,9), wurde ein Anteil verdünnt und auf eine Fusarinsäure enthaltende L-Agar-Plattenkultur gegeben. Fusarinsäure-resistente Kolonien wurden bezüglich TetS gerastert, und die Plasmidgehalte von Fusarinsäure-resistenten TetS-Kolonien wurden unter Anwendung einer Minilysat-Analyse untersucht. Die behandelten Derivate wurden ferner durch Southern-Blot-Hybridisierung von Minilysaten und Kolonie-Blot- Hybridisierung von Bakterienzellen mit ³²P-markiectem pStSR100 untersucht, um die Behandlung/Heilung und das Fehlen eines chromosomal integrierten Plasmids zu bestätigen.
Maus-Infektionen. Sieben bis 10 Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse (Harlan Sprague(Dawley (Indianapolis) und Sasco (St. Louis)) wurden für alle Tierinfektionen herangezogen. Ältere Mäuse wurden herangezogen, um peritoneale Makrophagen zu erhalten. Normalmausserum wurde von männlichen Mäusen verschiedener Alterstufen erhalten.
Für p.o. Inoculation wurden die Mäuse 6 Stunden lang von Futter und Wasser ferngehalten, dann mit 50 ul 10%-igem (G/V) Natriumbicarbonat und dann mit 20 ul Bakterien, suspendiert in gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,1% (G/V) Gelatine (BSG), gefüttert. Die perorale Inoculation wurde mit einer Mikropipettenspitze unternommen, die direkt hinter den Schneidezähnen plaziert wurde, um eine Schädigung der oralen Mukosa zu vermeiden. Den Mäusen wurde 30 Minuten nach der Inoculation Futter und Wasser wieder gegeben.
Zur i.p. Inoculation und intravenösen (i.v.) Inoculation in die seitliche Schwanzvene wurden Mäusen, die nicht unter Fasten gehalten wurden, 0,1 bis 0,2 ml Bakterien, suspendiert in BSG, injiziert.
Organe und Gewebe von infizierten Mäusen wurden auf Vorhandensein von Salmonellen wie folgt untersucht. Die Mäuse wurden durch CO&sub2;-Erstikkung getötet. Die Milz wurde aseptisch entfernt und in 2,5 ml BSG in entweder einem OMNI-Mixer, ausgerüstet mit einem Mikrobecher (Dupont, Wilmington, Del.), oder in einem Glasgewebe-homogenieserer homogenisiert. Die Peyer's Patches wurden aus dem Dünndarm entfernnt und durch Verwirbeln in 2 ml BSG 2mal gewaschen die gespülten Peyer's Patches wurden in 2,5 ul BSG in entweder einem OMINI-Mixer oder durch Verwirbeln in Glasperlen enthaltenden Glasröhrchen homogenisiert. Mesenterische Lymphknoten wurden in 2,5 ml BSG in Glasgewebe Homogenisiergeräten homogenisiert. Verdünnungen von Gewebe- und Organ-Homogenaten wurden auf L-Agarplatten, enthaltend geeignete Antibiotika, einer Plattenkultur unterzogen.
Statistische Verfahren. Zum Vergleich von CFU in Geweben von mit entweder mit Wild-Typ oder geheilt/entledigten S.typhimurium infizierten Mäusen wurden die geometrischen Mittelwerte bestimmt und in einem 1-t- (ailed) Test nach Student für Wild-Typ CFU verglichen, dessen Wert größer war als derjenige für CFU im gehellten Fall. Zur Analyse gemischter Infektionen wurden die geometrischen Mittelwerte von Verhältnissen von CFU vom Wild-Typ zum Plasmid-entledigten Fall aus einzelnen Mäusen in einem 1-t(ailed) Test nach Student für den Durchschnittswert von log&sub1;&sub0; von Verhältnissen größer als 0 (Verhältnisse größer als 1) verglichen. Maus LD&sub5;&sub0;-Werte wurden ermittelt durch das Verfahren von Reed und Muench (Amer. J. Hyg. 27:493-497 (1938)). Bakterielles CFU in Gewebekultur und Makrophageninfektionen wurden verglichen durch t-Test nach Student des durchschnittlichen CFU/Loch in einem 2-t(ailed) Test.
Vorliegen von 100 kb Plasmiden in S. typhimurium Stämmen. Alle drei untersuchten Stämme von S. typhimurium besaßen 100 kb Plasmide (Fig. 3). Zudem wies χ3339 zwei weitere Plasmide von 90 kb und 8 kb auf. Das folgende dreiteilige Nomenklatur-System für 100 kb Plasmide der S. typhimurium-Stämme wurde in dieser Studie verwendet. Zur Identifizierung des Serotyps als S. typhimurium wurde die Bezeichnung "St" eingeschlossen. Es folgt die Stammbezeichnung ("Lt" für LT2, "SR" für SR-11 und "SL" für SL1344). Schließlich identifiziert eine numerische Bezeichnung das Plasmid als Wild-Typ (100) oder als ein Derivat (101 für eine besondere Tnmini-tet-Insertion, usw.) Das Wild-Typ-Plasmid von Stamm SR-11 ist deshalb ein pSSR100. Gereinigte Plasmid-Präparationen wurden durch Restriktionsenzymabbau analysiert, und es wurden identische Profile für die 100 kb Plasmide aus allen drei Stämmen mit HindIII (Fig. 4) und EcoRI (Daten nicht gezeigt) erhalten. Restriktionsenzymabbau des vom 100 kb- Plasmid geheilten bzw. entledigten SL1344, χ3340, zeigte (Fig. 4), Bahn f) den Verlust der Banden, die den Banden aus pStLR100 (Fig. 4, Bahn b. und aus pStSR100 (Fig. 4, Bahn c) entsprechen, die in χ3339 vorhanden waren (Bahn e). Mithin waren die 100 kb Plasmide eines jeden der in diesen Untersuchungen geprüften drei S. typhlmurium-Stämme sehr ähnlich, wenn nicht identisch.
Erstellung eines Stammes. Es wurde das Transposon Tnmini-tet, beschrieben von Way et al (siehe oben), verwendet, um die 100 kb Plasmide mit einem Tet-Resistenz-Markierungsmittel zu markieren. Tnmini-tet, ein Tn10-Derivat, besitzt nicht das IS10R-Transposase-Gen innerhalb der invertierten Wiederholungen, daher ist das Transposase-Gen bei der Transposition aus dem Dcnor-Plasmid pNK861 verlorengegangen und kann demzufolge die Transpositon oder Deletion von Tnmini-tet nicht vermitteln.Deshalb sind Tnmini-tet-Insertionen viel stabiler als diejenigen des Ausgangsprodukts Tn10.
Eine Tnmini-tet-Insertion in das 100 kb Plasmid von Stamm 3000, die zu pStLT101 führt, ermöglichte die Selektion von Derivaten, die des 100 kb Plasmids mit einer Häufigkeit von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup7; Zelle&supmin;¹ Generation &supmin;¹ entledigt waren, gemäß Wachstum in Novibiocin oder Wachstum bei 43ºC, was den Stamm χ3344 ergab. Diese selbe Tnmini-tet-Insertion wurde dann in χ 3339 und χ3306 transduziert und dazu verwendet, diese Stämme ihrer 100 kb Plasmide zu entledigen, was die Stämme χ3340 bzw. χ3337 ergab. χ3340 behielt die 90 kb und 8 kb Plasmide bei (Fig. 3, Bahn h). Die Heilung/Entledigung von den 100 kb Plasmiden wurde durch Gel-Elektrophorese von Plasmid-DNA aus geklärten Lysaten (Fig. 3) und durch Hybridisierung von Minilysaten in Sothern Blots sowie durch lysierte Bakterien in Kolonie-Blots mit ³²P-markiertem pStSR100 (Daten nicht gezeigt) bestätigt. Das Fehlen von Hybridisierung in Kolonie-Blots der geheilten Derivate zeigte an, daß kein Chromosom integriertes Plasmid vorhanden war. Keine Plasmid-geheilten Derivate (des Plasmids entledigt), die integrierte Plasmide besessen hätten, wurden beobachtet.
Tnmini-tet-markierte Plasmide von χ3000, pStLT101, sowie von χ3306, pSTSR101, wurden erneut in die geheilten Derivate durch Transformation eingeführt, was die Stämme χ3347 bzw. χ3338 ergab. pStsR101 wirde in χ 3340 transformiert und ergab χ3351 (Tabelle 3, Fig. 3, Bahn i).
Maus-Virulenz. Die p.o LD&sub5;&sub0;-Werte in BALB/c Mäusen eines jeden der Wild-Typ, entledigten und retransformierten Derivate wurden ermittelt (Tabelle 11). Die p.o. LD&sub5;&sub0;-Werte der Maus-durchlaufenen χ3306 und χ3339 betrugen 3 x 10&sup5; CFU bzw. 6 x 10&sup4; CFU und der p.o. LD&sub5;&sub0; von χ3000 betrug > 10&sup8; CFU. Die p.o. LD&sub5;&sub0;-Werte der jeweiligen geheilten/entledigten Derivate betrugen > 10&sup8; CFU. Mit χ3337 und χ3340 infizierte Mäuse wurden krank, und es wurden gelegentliche Todesfälle beobachtet. Die LD&sub5;&sub0;-Werte der 100 kb Plasmid-retransformierten Derivate wurden auf diejenigen der Wild-Typ-Ausgangsstämme rückgestellt. Dies bestätigte, daß die genetische Verletzung der geheilten/entledigten Derivate tatsächlich den Verlust des 100 kb Plasmids darstellte. TABLELLE 11 Mause LD&sub5;&sub0;-Wertea (CFU) für Wild-Typ und 100 Kb Plasmid-entledigtes S. typhimurium STAMM 100kb Plasmid a bestimmt nach dem Verfahren von Reed und Hensch (siehe oben) b Durchschnittszeit zum Tod für χ3337 (12.3Tage) größer als die von χ3306 (7.0Tage) (p < 0.001 t-Test nach Student) c NT - nicht getestet
Die i.p. LD&sub5;&sub0;-Werte von Wild-Typ und geheilten/entledigten Derivaten waren nicht so unterschiedlich, als dies die p.o. LD&sub5;&sub0;-Werte waren (Tabelle 11). Die i.p. LD&sub5;&sub0;-Werte von χ3306 und χ3339 betrugen < 50 CFU, mit 100%-iger Mortalität bei jedem dieser Inocula. Das geheilte/entledigte Derivat von χ3306, der Stamm χ3337, tötete ebenfalls die meisten der Mäuse, die mit weniger als 50 CFU injiziert waren. Die Durchschnittszeit bis zum Eintritt des Todes war jedoch für χ3337 (12,3 Tage) größer verglichen mit χ3306 (7,0 Tage) (p < 0,001 1-t(ailed) Test nach Student). Im Gegensatz dazu wurde der i.p. LD&sub5;&sub0;-Wert von 100 kb Plasmid-entledigtem SL1344, dem Stamm χ3340, auf 400 CFU von < 50 CFU angehoben. Wiedereinführung des Tnmini-tet-markierten 100 kb Plasmids in χ3340 stellte den i.p. LD&sub5;&sub0;-Wert für den Wild-Typ wieder her. Die i.p. LD&sub5;&sub0;-Werte für Wild-Typ und geheilte LT2 Stämme betrugen jeweils annähernd 2000 CFU.
Effekte des Plasmidaustausches zwischen den Stämmen SR-11 und LT2.
Der Stamm LT2 war viel weniger virulent als der Stamm SR-11, auf dem p.o. Weg (Tabelle 11). Zur Bestimmung, ob die 100 kb Plasmide dieser beiden Stämme eine Rolle bei diesem Unterschied in der Virulenz spieltenwurden die Tnmini-tet-Derivate eines jeden der 100 kp Plasmide in die heterologen geheilten Stämme transformiert. Mäuse, die p.o. mit ich CFU an Stamm SR-11, aufweisend entweder pStLT101 oder pStSR100, infiziert waren, starben 7 Tage nach der Inoculation, wogegen der Stamm LT2 avirulent (p.o. Inoculum: 10&sup9; CFU) in jedem der beiden Plasmide war. Deshalb war die Avirulenz des Stammes LT2 nicht begründet durch die Defekte in seinem 100 kb Plasmid. Dieses Ergebnis, zusätzlich zu dem erhalten durch Einführung des SR-11 Plasmids, pStSR100, in Stamm SL1344, um virulenten χ 3351 zu ergeben (Tabelle 11), zeigten, daß die 100 kb Plasmide dieser drei Stämme funktionell äquivalent waren.
Pathogenese nach p.o. Inoculation. Die ausgeprägteren Unterschiede der Virulenz zwischen Wild-Typ und geheilten Derivaten über den p.o. Weg gegenüber den i.p. Weg eröffneten die Möglichkeit, daß das 100 kb Plasmid in die Virulenz in den Gedärmen involviert wurde, anstatt während späterer Stufen einer invasiven Erkrankung. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurden Mäuse mit entweder dem Wild-Typ SR-11, dem Stamm χ3306, oder dem des 100 kb Plasmids entledigten SR-11, dem Stamm χ3337, p.o. infiziert, und die Peyer's Patches und die Milz wurden auf S. typhimurium zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion untersucht. Die zusammenge faßten Ergebnisse der drei Versuche sind in Fig. 5 dargelegt. Nach 3 Stunden nach der Infektion wurde nur sehr wenig S. typhimurium in Peyer's Patches (< 100 CFU) nachgewiesen. Dies war nicht das Ergebnis einer ineffizienten Passage von Inocula aus der Mundhöhle in die Gedärme, da im wesentlichen 100% der Inocula aus dem Darm wiedergewonnen wurden, in erster Linie aus den Dickdarminhalten, und zwar innerhalb 2 Stunden nach der Inoculation. Ferner waren die CFU-Werte in den Dünndarminhalten gleich zwischen Wild-Typ- und geheiltem SR-11, bis zu 3 Tagen nach der Inoculation. Bei 1 und 2 Tagen nach der Inoculation stieg der CFU-Wert in Peyer's Patches graduell auf 10³ bis 10&sup4; CFU an, und der CFU Wert in der Milz blieb niedrig. 3 Tage nach der Inoculation wiesen die Peyer's Patches und die Milz deutlich mehr Wild-Typ χ3306 als geheiltes χ3337 auf. Der Unterschied in CFU in den Peyer's Patches wurde in den verschiedenen Versuchen nicht konsistent beobachtet und war temporär, wie die Daten aus anderen Zeitpunkten zeigen. Jedoch blieb der CFU-Wert in der Milz signifikant verschieden, bei χ3306 und übertraf χ3337 in zunehmenden Mengenmaßen, bis die mit χ3306 infizierten Mäuse 8 Tage nach der Inoculation starben. χ3337 in der Milz erreichte Niveauwerte in der Größenordnung von 10&sup4; CFU und blieb in der Milz nachweisbar, und zwar bis 25 Tage nach der Inoculation. Somit war der primäre Unterschied in der Pathogenese nacn einer p.o Inoculation zwischen Wild-Typ- und Virulenz-Plasmid-entledigtem S. typhimurium SP-11 bei den Zahlenmengen von S. typhimurium, die die Milz erreichten und/oder sich dort vervielfachten.
Um die relativen Virulenzen von Wild-Typ und Plasmid-entledigtem SR-11 zu vergleichen, wurden gemischte Infektionsversuche mit TetR, Wild- Typ-SR-11, der Kultur χ3456, und mit NalR, Plasmid-entledigtem SR-11, der Kultur χ3337, durchgeführt. Die Verhältnisse der CFU-Werte des Wild-Typs zum Plasmid-entledigten Typ wurden für jede Maus ermittelt. Ausserdem wurden die CFU-Verhältnisse für die mesenterischen Lymphknoten ermittelt, die Zwischenstufen im Eindringablauf aus den Peyer's Patches in die Milz darstellen. Es wurden große Bereiche an CFU-Werten sowie den entsprechen den Verhältnissen unter den einzelnen Mäusen beobachtet, was die Analyse der geometrischen Mittelwerte der Verhältnisse erforderlich machte Zusammengefaßte Ergebnisse der drei Versuche sind in Fig. 6 dargestellt. Wie für die Versuche mit Mäusen beobachtet, die entweder mit Wild-Typ oder Plasmid-entledigtem S. typhimurium infiziert waren (Fig. 5), waren keine signifikanten Unterschiede in den CFU-Werten in den Peyer's Patches oder den Milzmaterialien bei Mäusen mit gemischten Infektionen bes 3 Tage nach der Inoculation nachweisbar, als die Verhältnisse von Wild-Typ- zu entledigten Produkten in Peyer's Patches, mesenterischen Lymphknoten und den Milz-Materialien 11:1, 230:1 bzw. 79:1 betrugen. 4 Tage nach der Inoculation war das Verhältnis für die Milz-Materialien signifikant größer als 1,0 (Verhältnis = 160:1( während die Peyer's Patches und mesenterischen Lymphknoten Verhältnisse von 1,5 : 1 bzw. 13:1 aufwiesen Wiederum, wie beobachtet bei Mäusen mit separaten Infektionen, waren die CFU-Werte in den Peyer's Patcbes annähernd gleich für Wild-Typ und entledigtes SR11 nach den vorübergehenden unterschiedlichen Werten, die 3 Tage nach der Inoculation festgestellt wurden. 5 Tage nach der noculation wiesen die mesenterischen Lymphknoten und die Milzmaterialien Verhältnisse von 200:1 bzw. 1600:1 auf; das Peyer's Patch Verhältnis betrug 1,1 : 1. 7 Tage nach der Inoculation überlebte eine einzelne Maus mit Verhältnissen in Peyer's Patch, mesenterischer Lymphknote und Milz von 2,1:1, 290:1 bzw. 210:1. Die größten Unterschiede bei den CFU-Werten in den verschiedenen Organen tragen in der Milz und den mesenterischen Lymphknoten, verglichen mit den Peyer's Patches, auf. 3, 4 und 5 Tage nach der Inoculation waren die Milz-Verhältnisse deutlich größer als die Peyer's Patch Verhältnisse, und 3 und 5 Tage nach der Inoculation waren die mesenterischen Lymphknoten-Verhältnisse deutlich größer als die Verhältnisse in Peyer's Patch (Fig. 6).
Die Pathogenese von Wild-Typ SL1344, der Kultur χ3339, und dem 100 kb Plasmid entledigten SL1344, der Kultur χ3340 wurde in p.o infizierten Mäusen untersucht. Die Ergebnisse von zwei Versuchen sind in Fig. 7 gezeigt. Drei Tage nach der Inocultion wurden keine signifikanten Unterschiede bei den CFU-Werten in den Peyer's Patches, mesenterischen Lymphknoten oder den Milzmaterialien zwischen Wild-Typ und entledigtem SL1344 festgestellt. 7 bis 8 Tage nach der Inoculation wurden deutlich größere Zahlenwerte des Wild-Typ-χ3333 als beim entledigten χ3340 in allen drei Organen nachgewiesen. Größere Unterschiede wurden in den mesenterischen Lymphknoten und Milzmaterialien als in den Peyer's Patches festgestellt Ferner war der Unterschied in 1 der Versuche beim CFU-Wert in Peyer's Patches nicht deutlich. Somit stellte die Infektion der mesenterischen Lymphknoten und der Milzmaterialien den konsistenteren Unterschiedswert bei den Pathogenizitäten zwischen Wild-Typ und 100 kb Plasmid-entledigtem SL1344 dar. 14 Tage nach der Inoculation waren alle mit Wild-Typ-χ33339 infizierten Mäuse tot, während mit entledigtem χ3340 infizierte Mäuse eine Infektion der Peyer's Patches und der Milz von 2 x 10³ CFU bzw. 6,3 x 10³ CFU aufwiesen. 31 Tage nach der Inoculation wiesen die Peyer's Patches und die Milzmaterialien von mit χ3340 infizierten Mäusen 400 CFU bzw. 320 CFU auf. Somit überlebte 100 kb Plasmid-entledigtes SL1344 in Peyer's Patches und der Milz über verlängerte Zeiträume nach p.c Inoculation.
Infektion der Milz nach i.v. Inoculation. Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten an, daß das 100 kb Plasmid in erster Linie involviert ist in das Eindringvermögen aus den Peyer's Patches in die mesenterischen Lymphknoten und die Milz nach p.o. Inoculation, anstatt in die Infektion der Peyer's Patches oder früherer Vorgänge involviert zu sein. Zur Überprüfung des Wachstums von S. typhimurium in den Milz wurden Mäuse i.v. mit Mischungen aus Wild-Typ-SR-11, der Kultur χ3456, und Plasmid- entledigtem SR-11, der Kultur χ3337, inoculiert, und die Milzmaterialien wurden bezüglich der CFU-Werte untersucht und die Werte aufgezeichnet (Tabelle 12). Als die Mäuse i.v. mit 10&sup5; ZFU von χ3456 und χ3337 inoculiert wurden, wurden die Stämme gleichartig zu Materialien aus der Milz eine Stunde nach der Inoculation geklärt. Somit beeinflußte die Gegenwart des 100 kb Plasmids die Klärung aus dem Blut nicht. Weitere Mäuse wurden i.v. mit 1 x 10³ bis 4 x 10³ CFU von Mischungen aus χ3456 und χ3337 inoculiert. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den CFU Werten in den Milzmaterialien 4 Tage nach der Inoculation nachgeiwesen (Tabelle 12), jedoch 6 bis 7 Tage nach der Inoculation betrugen die aus den Milzmaterialien gewonnenen erhältnisse von Wild-Typ- zu entledigtem S. typhimurium 11,5 : 1. Zu diesem Zeitpunkt betrugen die Durchschnittswerte in den Milzmaterialien von χ3456 und χ3337 2,7 x 10&sup6; bzw. 2,3 x 10&sup5; CFU. Somit überlebte und replizierte sich Plasmid-enthaltendes SR-11 in der Milz über längere Zeiträume nach i.v. Inoculation. Das Verhältnis von Wild-Typ zu entledigtem Typ für SR-11 in Milzmaterialien von 11,5:1 eine Woche nach i.v. Inoculation stand in scharfem Gegensatz zu den Verhältnissen von 1600:1 und 210:1, erhalten 5 und 7 Tage nach der p.o Inoculation. Das mit gemischter i.v Inoculation erhaltene niedrigere Verhältnis stellte sich nicht ein wegen einer Synergie zwischen χ3456 und χ3337, weil 6 Tage nach der Inoculation Mäuse, die mit 2x10³CFU von χ3337 allein oder von mit gleichen Mengen an χ3456 vermischtem χ3337 infiziert waren durchschnittliche Milzwerte von 2,3 x 10&sup5; CFU für χ3337 erreichten (Tabelle 12). Tabelle 12 Infektion von Milzmaterialien nach i.v. Inoculation von Mäusen ZEIT NACH INOCULATION CFU Verhältnis
a Mäusevene inoculiert i.v. mit gleichen Mischungen vom Wild-Typ χ3456 und 100 kb Plasmid-entledigtem χ3337 (n = 3 bis 5 Mäuse
bInoculation = 5 x 10&sup5; CFU, jeweils von χ3456 und χ3337
cInoculation = 1 x 10&sup4; bis 4 x 10&sup4; CFU, jeweils von χ3456 und χ3337 (gleiche Inoculation wurde bei jedem Verusch gegeben)
dGeometriesches Mittel von CFU aus den Milzmaterialien
e Bei 6 Tagen post-Inocultion, Mäuse, infiziert mit 2 x 10³ CFU an χ3337 allein besaßen Milzgehalte von 2,3 x 10&sup5; CFU an χ3337
fGeometriesches Mittel des Verhältnisses χ3456 : χ3337 (P-Wert in 1- t(aled) Test nach Student für Verhältnis > 1:1)
g Durchschnitt von log&sub1;&sub0; von Verhältnissen ± Standardabweichungen, herangezogen zur statistischen Analyse.
Plasmid-entledigtes S. typhimurium war dazu befähigt, sich in Peyer's Patches zu verfielfachen, und erreichte die mesenterischen Lymphknoten sowie die Milz nach einer p.o. Inoculation (Fig. 5, 6, 7). Unterschiede in den Befähigungen von Wild-Typ gegenüber Plasmid-entledigtem S. typhimurium, in die mesenterlschen Lymphknoten und die Milz einzudringen, wurden allerdings beständig aufgefunden. Es wurde auch ermittelt, daß Wild-Typ S. typhimurium viel wirksamer bei der Infektion der Milz nach p.o. Inoculation von Mäusen war (Verhältnisse von Wild-Typ zu entledigten Typen von 1600:1; Fig. 6). Allerdings erreichten sogar entledigte Derivate Milzwerte in einer Höhe von 10&sup4;CFU und blieben der Milz über einen so langen Zeitraum wie 31 Tage nach der Inoculation nachweisbar (Fig. 5). Nach der p.o Inoculation mit Mischugnen von Wild-Typ und entledigtem SR- 11 wurden deutlich höhere Verhältnisse von Wild-Typ- zu geheiltem SR-11 in Milzmaterialien und mesenterischen Lymphknoten ausgefunden, verglichen mit Peyer's Patches. (Fig. 6).
Die i.p. LD&sub5;&sub0;-Werte von Plasmid-entledigtem SR-11 und von SL1344 betrugen < 50 CFU bzw. 400 CFU. was anzeigt daß 100 kb Plasmid-entledigtes S. typhimurium eine deutliche Virulenz auf diesem Wege der Inoculation beibehielt (Tabelle 11). Es ist wichtig anzumerken, daß keine der entledigten Stämme mit ³²P-markiertem Virulenz-Plasmid hybridisierte, so daß das Vorliegen einer chromosomal integrierten Kopie des Plasmids, das zur Virulenz beitragen könnte, ausgeschlossen wurde. Die Befähigungen vor. Wild-Typ und entledigten Stämmen zur Infektion der Milz nach i.v. Inoculation wurde untersucht, und es wurden signifikante Unterschiede an den CFU-Werten in Milzmaterialien eine Woche nach i.v. Inoculation mit Mischungen aus Wild-Typ- und entledigtem S. typhimurium aufgefunden (Durchschnittsverhältnisse von Wild-Typ- zu entledigten Typen von 7,5 : 1 und 20:1). Die Unterschiede bei den ZFU-Werten in der Milz nach i.v Inoculation waren nicht so groß wie die 5 bis Tage nach einer p.o. Inoculation erhaltenen (1600:1 - und 210:1-fach). Diese Versuche belegen erneut, daß Plasmid-entledigtes S. typhimurium hohe Gehalte in den Milzmaterialien erreichte, und sich vervielfachte, und daß die größten Effekte des 100 kb Plasmids auf die Pathogenese sich nach einer p.o Inoculation einstellten. Wir stellen die Hypothese auf, daß 100 kb Plasmid entledigtes s. typhimurium Virulenz auf dem i.p. Weg beibehält, weil sich die Bakterien rasch extracellulär vervielfältigen und in der Magenhöhle nicht wirksam phagocytosiert werden; daher entwickelt sich eine überwältigende Infektion, bevor die Mäuse die Infektion checken, indem sie die Bakterien zu Makrophagen klären. Bei Verabreichung auf dem p.o. Weg kann von allen oder den meisten der eindringenden Bakterien angenommen werden, daß sie intrazellulär sind, bevor sie die mesenterischen Lymphknoten erreichen.

Claims

1. Impfstoff zur Immunisierung eines Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers, umfassend ein avirulentes Derivat einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen nicht dazu befähigt funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein herzustellen.

2. Impfstoff gemäß Anspruch 1, worin die Mikrobe dazu befähigt ist, ein rekombinantes Gen zu exprimieren, das aus einem Pathogen des genannten Wirbeltiers oder wirbellosen Tiers abgeleitet ist, um ein Antigen herzustellen, das dazu befähigt eine Immunreaktion im genannten Wirbeltier oder wirbellosen Tier gegen das genannte Pathogen zu induzieren.

3. Impfstoff gemäß Anspruch 2, worin das genannte rekombinante Gen ein Pharmakologisch wirksames Produkt einkodiert enthält.

4. Impfstoff gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die genannte pathogene Mikrobe ein Bakterium ist.

5. Impfstoff gemäß Anspruch 4, worin das genannte Bakterium Shigella, Erwinia, Yersinia, Pasteurella, Legionella oder Brucella ist.

6. Impfstoff gemäß Anspruch 4, worin das Baktefium zu einer Species gehört, die eine lymphoepitheliale Struktur des genannten Wirbeltiers beheimatet oder das genannte wirbellose Tier infiziert.

7. Impfstoff gemäß Anspruch 6, worIn das genannte Bakterium durch Salmonella- oder Salmonella-Escherichia-Hybride dargestellt ist.

8. Impfstoff gemäß Anspruch 7, worin das genannte Bakterium aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus S. typhimurium, S. typhi, S paraty phi, s. gallinarum, S. enteritidis, S. dublin, S. choleraesuis und S. arizona.

9. Impfstoff gemäß Anspruch 8, worin das genannte Bakterium durch einen Derivat-Stamm dargestellt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus χ4062 (ATCC 53647) und χ4064 (ATCC 53648) sowie aus Derivaten davon.

10. Impfstoff gemäß jedem Anspruch 1 bis 3, worin das genannte Pathogen durch ein Virus, Bakterium, eine Protozoe, einen Parasit oder Fungus dargestellt ist.

11. Impstoff gemäß Anspruch 10, worin das genannte Pathogen durch Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Straptococcus mutans, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponma palladium, Neisseria maningitidis, Mycoplasma pneumoniae, Hemophilus influenzae Bordetella pertussis, Bordetella avium, Escherichia coli oder Streptococcus equi dargestellt ist.

12. Trägermikrobe zur Synthese eines Wirtsproteins in einem Wirbeltier oder wirbellosen Tier, umfassend ein avirulentes Derivat einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen nicht dazu befähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein herzustellen, während es befähigt ist, ein rekombinantes Gen zu experimieren, das aus einem Wirbeltierwirt abgeleitet ist, um ein Produkt herzustellen, das dazu befähigt, eine Immunreaktion im genannten Wirbeltier oder wirbellosen Tier zu unterdrücken, zu modulieren oder zu steigern.

13. Mikrobe gemäß Anspruch 12, worin die genannte Trägermikrobe durch ein Bakterium dargestellt ist.

14. Mikrobe gemäß Anspruch 12 oder 13, worin das genannte Bakterium durch Salmonella- oder Salmonella-Escherichia-hybride dargestellt ist und welche eine lymphoepitheliale Struktur des genannten Wirbeltiers beheimatet oder das genannte wirbellose Tier infiziert.

15. Mikrobe gemäß Anspruch 14, worin das genannte Bakterium Salmonella typhimurium ist.

16. Mikrobe gemäß Anspruch 15, worin das genannte Bakterium durch χ4062 (ATCC 53647) oder χ4064 (ATCC 53648) oder durch Derivate davon dargestellt ist.

17. Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen nicht befähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und clyisches AMP-Rezeptorprotein zu produzieren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung des Immunsystems in einem Wirbeltier oder wirbellosen Tier.

18. Verwendung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen nicht befähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein zu produzieren, zur Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung, Regulierung oder Denseibilisierung des Immunsystems in einem Wirbeltier oder wirbellosen Tier.

19. Verfahren zur Herstellung eines avirulenten Derivats einer pathogenen Mikrobe, wobei das genannte Derivat im wesentlichen unbefähigt ist, funktionelle Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein herzustellen, wobei die pathogene Mikrobe mittels rekombinanter DNA-Verfahrenstechniken oder Transposon-Mutagenese mutiert wird,um einen Deletions- Mutant in jedem der Gene für Adenylat-Cyclase und cyclisches AMP-Rezeptorprotein zu bilden, und wobei die genannten Derivate isoliert werden.