DE60031974T2

DE60031974T2 - Abgeschwächte Mikroorganismen zur Behandlung von Infektionen

Info

Publication number: DE60031974T2
Application number: DE60031974T
Authority: DE
Inventors: Microscience Limited Gordon Wokingham DOUGAN; David Joseph Wokingham SANTANGELO; William David Wokingham HOLDEN; Elizabeth Jacqueline Wokingham SHEA; Microscience Limited Zoe Wokingham HINDLE
Original assignee: Microscience Ltd
Current assignee: Emergent Product Development UK Ltd
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-09
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2020-05-10
Also published as: ATE346090T1; CY1107656T1; CN1177863C; CN1360594A; NO20015464L; KR20020018193A; US7887816B2; ZA200108912B; CA2372553C; EP1702927B1; BRPI0010418B8; KR100680391B1; HUP0201117A3; DE60031974D1; JP4583607B2; EP1183269A1; DE60043868D1; US6756042B1; ES2277591T3; PT1183269E

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft abgeschwächte bzw. attenuierte Mikroorganismen, die in Vakzinzusammensetzungen zur Prävention oder Behandlung von bakteriellen oder viralen Infektionen verwendet werden können.
Hintergrund der Erfindung
Es ist bekannt, dass lebende attenuierte Mikroorganismen hochwirksame Vakzine sind. Durch derartige Vakzine hervorgerufene Immunantworten sind oftmals stärker und länger andauernd als solche, die durch nicht-replizierende Immunogene erzeugt werden. Eine Erklärung dafür kann sein, dass lebende attenuierte Stämme begrenzte Infektionen im Wirt hervorrufen und die frühen Stadien einer natürlichen Infektion imitieren. Des Weiteren sind im Gegensatz zu abgetöteten Präparaten lebende Vakzine zur Induktion wirksamer zellvermittelter Reaktionen befähigt, was mit ihrer Befähigung zur Replikation in Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen zusammenhängen könnte.
Es besteht eine lange Geschichte der Verwendung lebender attenuierter Salmonella-Vakzine als sichere und wirksame Vakzine zur Prävention einer Salmonellose in Tieren und Menschen. Tatsächlich hat sich das lebende attenuierte orale Typhus-Vakzin Ty21a (Vivotif), hergestellt vom Schweizerischen Serum Vakzin Institut, als sehr erfolgreiches Vakzin zur Prävention von Typhusfieber herausgestellt, und es wurde in vielen Ländern, einschließlich den Vereinigten Staaten und Europa, lizenziert.
Die Abschwächung bzw. Attenuierung dieses Stammes wurde jedoch unter Verwendung von chemischen Mutagenesetechniken vorgenommen, und die Grundlage der Abschwächung bzw. Attenuierung des Stammes wird nicht vollständig verstanden. Aufgrund dessen ist das Vakzin in Bezug auf die Anzahl von Dosen (derzeit vier) und der Anzahl an lebenden Organismen, die bei jeder Dosis verabreicht werden müssen, nicht ideal.
Moderne molekularbiologische Techniken in Verbindung mit der vertieften Kenntnis der Salmonella-Pathogenese haben zur Identifizierung von einigen Genen geführt, die für das in vivo Wachstum und Überleben des Organismus essentiell sind. Dies stellt neue Zielgene für die Attenuierung bereit, was zu dem Konzept führt, dass künftige Vakzinstämme „rationell" attenuiert werden können, indem definierte nicht-umkehrbare Mutationen in ausgewählte Gene, von denen bekannt ist, dass sie an der Virulenz beteiligt sind, eingeführt werden. Dies wird die Entwicklung insbesondere hinsichtlich der Immunogenizität verbesserter Vakzine und daher der Anzahl der zu verabreichenden Dosen erleichtern.
Obwohl viele attenuierte Salmonella-Stämme bekannt sind, haben sich wenige als potentielle Vakzinkandidaten zur Verwendung im Menschen als geeignet erwiesen. Dies kann teilweise am Erfordernis liegen, ein Gleichgewicht zwischen der Immunogenizität des Vakzins und der Möglichkeit, dass der Salmonella-Organismus reaktiv wird, zu finden.
Es ist klar, dass die Auswahl geeigneter Ziele zur Attenuierung bzw. Abschwächung, die einen geeigneten Vakzinkandidaten ergeben, nicht unkompliziert ist und nicht einfach vorhergesagt werden kann. Viele Faktoren können die Eignung des attenuierten Stammes als geeignetes Vakzin beeinflussen, und es wird viel daran geforscht, geeignete Stämme zu identifizieren. Beispielsweise führen viele attenuierte Stämme, die als Vakzinkandidaten getestet werden, zu einer Vakzinämie oder Abszessen im Patienten.
Es ist daher wünschenswert, ein Vakzin zu entwickeln, das einen hohen Immunogenizitätsgrad bei verminderter Wahrscheinlichkeit des Mikroorganismusstammes dafür aufweist, zu einer reaktiven Form zurückzukehren, und das ein gutes Sicherheitsprofil mit eingeschränkten Nebenwirkungen zeigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, dass zwei spezifische attenuierende bzw. abschwächende Mutationen, die in einen Salmonella-Mikroorganismus eingeführt werden, ein Vakzin erzeugen kann, das einen hohen Immunogenizitätsgrad und ein geringes Risiko dafür aufweist, dass sich der Mikroorganismus in eine reaktive Form zurückentwickelt. Die resultierenden Vakzinstämme zeigen ein gutes Nebenwirkungsprofil.
Die erste Mutation ist in einem Bereich der Salmonella-Pathogenizitätsinsel Zwei (Spi2) enthalten. Die zweite ist eine auxotrophe Mutation, d. h. eine Mutation zur Störung der Expression eines Gens, das ein Protein codiert, welches in einem biosynthetischen Stoffwechselweg erforderlich ist.
Unter einem ersten Gesichtspunkt der Erfindung weist ein Salmonella-Mikroorganismus eine Attenuierungsmutation auf, welche die Expression des ssaV-Gens, das sich innerhalb der Spi2-Pathogenizitätsinsel befindet, aufhebt, und eine Attenuierungsmutation auf, welche die Expression des aroC-Gens aufhebt.
Der Mikroorganismus umfasst vorzugsweise weiterhin ein oder mehrere heterologe Antigene oder therapeutische Proteine, beispielsweise Antigene für pathogene E. coli, Shigella, Hepatitis A-, -B- oder -C, Herpes-simplex-Virus und humanen Papillomavirus. Daher kann der Mikroorganismus als Verabreichungsvehikel zur Immunisierung gegen andere Infektionen als Salmonella dienen.
Der Salmonella-Mikroorganismus kann in der Herstellung eines Medikaments zur intravenösen oder oralen Verabreichung zur Behandlung einer bakteriellen oder viralen Infektion, z. B. zur Behandlung von Typhus, verwendet werden.
Der attenuierte Salmonella-Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung bildet Vakzine, die überraschenderweise sowohl die mukosale als auch die systemische Immunität stimulieren. Des Weiteren rufen die Mikroorganismen keine Milzabszesse im Tiermodell hervor, während dies bei Mutanten mit einzelnen Mutationen der Fall ist. Dies ist ein besonderer Vorteil der vorliegend definierten Doppelmutanten.
Beschreibung der Erfindung
Die Mikroorganismen und Vakzinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch bekannte Techniken hergestellt werden.
Die Auswahl bestimmter Salmonella-Mikroorganismen und die Selektion der geeigneten Mutation kann vom Fachmann ohne unzumutbare Experimente getroffen werden. Ein bevorzugter Mikroorganismus ist Salmonella typhimurium.
Eine erste Mutation wird in das ssaV-Gen eingeführt, das sich im Bereich der Salmonella-Pathogenizitätsinsel 2 befindet, wobei dieser Bereich in WO-A-9617951 offenbart ist.
Die Salmonella-Pathogenizitätsinsel Zwei (Spi2) ist eine von zwei klassischen Pathogenizitätsinseln, die sich auf dem Salmonella-Chromosom befinden. Spi2 umfasst einige Gene, die für ein Typ-III-Sekretionssystem codieren, das beim Transport von Spi2-codierten Virulenz-assoziierten Proteinen (sogenannte Effektorproteine) aus den Salmonella-Bakterien und potentiell direkt in Zielwirtszellen wie Makrophagen beteiligt ist. Ein Teil von Spi2 (die Apparategene) codiert den Sekretionsapparat des Typ-III-Systems. Spi2 ist für die Pathogenese und Virulenz von Salmonella in der Maus absolut essentiell. Dies ist eine Beobachtung, die von mehreren verschiedenen Gruppen in der ganzen Welt dokumentiert wurde. S. typhimurium Spi2-Mutanten sind in Mäusen stark abgeschwächt bzw. attenuiert, die durch orale, intravenöse und intraperitoneale Verabreichungswege getestet wurden.
Die Apparatgene, die sich in Spi2 befinden, sind gut charakterisiert; siehe beispielsweise Hensel et al., Molecular Microbiology (1997); 24 (1): 155–167. Die Mutation im ssaV-Gen muss sich nicht notwendigerweise innerhalb des Gens, so dass dessen Funktion gestört wird, befinden. Beispielsweise kann auch eine Mutation in einer stromaufwärts gelegenen regulatorischen Region die Genexpression aufheben, was zur Attenuierung führt. Mutationen in einer intergenen Region können ebenfalls ausreichen, um die Genfunktion aufzuheben.
Die zweite Mutation wird als „auxotrophe Mutation" bezeichnet, da sie das aroC-Gen zerstört, das für einen biosynthetischen Stoffwechselweg essentiell ist. Der biosynthetische Stoffwechselweg liegt in Salmonella jedoch nicht in Säugetieren vor. Daher können die Mutanten nicht auf Metaboliten wachsen, die sich im behandelten Patienten befinden, um die Wirkung der Mutation zu unterlaufen.
Die Mutationen können in den Mikroorganismus unter Verwendung einer beliebigen bekannten Technik eingeführt werden. Vorzugsweise ist die Mutation eine Deletionsmutation, wobei die Zerstörung des Gens durch das Ausschneiden von Nukleinsäuren hervorgerufen wird. In einer anderen Ausführungsform können Mutationen durch die Insertion von Nukleinsäuren oder durch Punktmutation eingeführt werden. Verfahren zur Einführung der Mutationen in die spezifischen Bereiche sind einem Fachmann ersichtlich.
Zusätzlich zu den zwei Mutationen kann der Salmonella-Mikroorganismus auch heterologe Antigene umfassen. Der attenuierte Mikroorganismus kann daher als Verabreichungsvehikel zur Verabreichung von Antigenen gegen andere bakterielle oder virale Infektionen dienen. Antigene, die zur Verwendung auf diese Weise geeignet sind, sind einem Fachmann ersichtlich und schließen:
Pathogene E.-coli-Antigene, d. h. ETEC
Hepatitis A, B und C Antigene
Lime-Erkrankungsantigene
Vibrio-Cholera-Antigene
Helicobacter-Antigene
Herpes-simplex-Virus-Antigene
Humaner-Papillomavirus-Antigene
ein.
Dieses System weist auch das Potential zur Verabreichung therapeutischer Proteine, z. B. Zytokine, zur Behandlung von Patienten, z. B. mit Hepatitis infizierten Patienten, ein. Verfahren zur Verabreichung heterologer Antigene oder therapeutischer Proteine unter Verwendung der Vakzinzusammensetzungen sind einem Fachmann ersichtlich.
Unter Verwendung des Mikroorganismus der Erfindung hergestellte Vakzine finden ihre Anwendung in der Behandlung von Infektionen in humanen Patienten und in der Behandlung von veterinären Infektionen.
Die Doppelmutation stellt ein wirkungsvolles Mittel zur Attenuierung des Mikroorganismus bereit, um einen sicheren Vakzinkandidaten zu erzeugen.
Die Vakzinzusammensetzungen stellen einen wirksamen Schutz sogar in immungeschwächten Patienten bereit und stellen bedeutsamerweise ein geringes Risiko hinsichtlich der Entwicklung von Milzabszessen dar. Milzabszesse wurden bei Verwendung von Vakzinen, die auf einer einzelnen Mutation basieren, festgestellt, und daher können die vorliegenden Zusammensetzungen einen wesentlichen Vorteil für die Patienten darstellen.
Zur Formulierung der Vakzinzusammensetzungen können die Mikroorganismus-Mutanten in einer Zusammensetzung zusammen mit einem beliebigen geeigneten pharmazeutisch verträglichen Adjuvanz, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel vorliegen. Geeignete Formulierungen sind einem Fachmann ersichtlich. Die Formulierungen können für jeden beliebigen geeigneten Verabreichungsweg entwickelt werden. Die bevorzugte Verabreichung erfolgt über den oralen oder intravenösen Weg, und die Vakzine sind lebende attenuierte Salmonella-Mikroorganismen. Die Anzahl von Mikroorganismen, die in den Formulierungen vorliegen muss, kann vom Fachmann bestimmt und optimiert werden. Allgemein können jedoch einem Patienten ungefähr 10⁷–10¹⁰ CFU, vorzugsweise ungefähr 10⁸–10⁹ CFU in einer einzelnen Dosiseinheit verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines mit ZH9 bezeichneten Mutantenstammes, der eine Wirksamkeit als humanes orales Typhusvakzin aufweist. Der Stamm leitet sich vom virulenten Stamm S. typhi Ty2 ab, der ursprünglich bei einem Fall von Typhus isoliert wurde. Der davon abgeleitete Stamm weist eine definierte Mutation in purA und aroA auf.
Ty2 zur Herstellung von ZH9
S. typhi Ty2 wurde ursprünglich aus einer Person mit Typhusfieber im Jahr 1916 isoliert und wurde für die Erzeugung sämtlicher lizenzierter Typhusvakzine verwendet. Der Stamm wurde von der Nationalen Kultursammlung PHLS in Colindale erhalten. Er wurde als lyophilisierte Kultur erhalten, wobei die NCTC-Nummer 8385 lautet.
Klonierung des S.-typhi-aroC-Gens aus S. typhi Ty2
S. typhi Ty2 wurde aus der Stammkultur gewonnen und über Nacht in Luria-Bertani-(LB)-Medium angezüchtet. Die Zellen wurden geerntet, und die Gesamtzell-DNA wurde präpariert. Es wurden DNA-Fragmente von S.-typhi-Ty2-DNA durch partielle Spaltung mit dem Restriktionsenzym Sau3A erzeugt, und die resultierenden Fragmente wurden mit BamH1-gespaltenem pHC79 ligiert, um eine Cosmid-Bibliothek von S.-typhi-Typ2-DNA unter Verwendung von E. coli HU835 als Empfänger zu erzeugen. Um aus der S. typhi DNA die für aroC codierende DNA zu isolieren, wurde die Cosmid-Bibliothek verwendet, um E. coli AB2849 zu transduzieren, die eine Mutation im aroC-Gen aufweisen und deren Wachstum von aromatischen Verbindungen abhängt. Das transduzierende Gemisch wurde auf Minimalmedium ohne aromatische Verbindungen ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Nach Über-Nacht-Kultur wurde eine Anzahl isolierter Kolonien beobachtet. Diese Bakterien tauchten wahrscheinlich aufgrund einer Komplementation der aroC-Mutation in AB2849 durch einen Cosmid-Klon, welcher das intakte aroC-Gen enthielt, auf. Die Cosmid-DNA aus einem dieser Stämme wurde aufgereinigt. Es wurde ein 5,2-kB-HindIII-Fragment aus diesem Cosmid in pUC18 kloniert, um das Plasmid pTAC2 zu ergeben, welches dazu befähigt war, die Deletion des aroC in AB2849 zu komplementieren, was zeigt, dass es das S.-typhi-aroC-Gen enthält.
Erzeugung einer definierten Deletion des klonierten S.-typhiTy2-aroC
Es wurde eine definierte Deletion von 600 Bp unter Verwendung von PCR im klonierten aroC-Gen erzeugt. Die in der PCR verwendeten Oligonukleotid-Starter bzw. -Primer wurden unter Verwendung der veröffentlichten DNA-Sequenz des S.-typhi-aroC-Gens (Zugriffs-Nr. M27715) ausgewählt. Die 5' zum aroC-Gen befindliche DNA wurde ausgehend von pTAC2 unter Verwendung der Primer SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 1 amplifiziert. SEQ ID NO: 3 lagert sich an Vektor-DNA an, SEQ ID NO: 1 lagert sich an die 5'-Region von aroC an. Die 3' zum aroC-Gen befindliche DNA wurde unter Verwendung der Primer SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 2 amplifiziert. SEQ ID NO: 4 lagert sich an Vektor-DNA an, SEQ ID NO: 2 lagert sich an die 3'-Region von aroC an. Die resultierenden PCR-Produkte wiesen XbaII-Schnittstellen auf, die in die 5'-Enden eingebaut wurden, um das Klonieren zu erleichtern. Die Fragmente wurden in den Vektor pUC18 kloniert. Das Plasmidendkonstrukt, bezeichnet mit pMI-AC23, enthält eine definierte aroC-Deletion (Position 544 bis 1143) in einem 4,8 kB HindIII-Fragment. Das HindIII-Fragment wird in die HindIII-Schnittstelle von pUC18 eingefügt. An der Stelle der aroC-Deletion befindet sich ein einzelne XbaI-Schnittstelle.
Einführung der aroC-Mutation in das S.-typhi-Ty2-Genom
Es wurde das Suizidplasmid pCVD442 (Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310–4317) als Vektor verwendet, um die aroC-Deletion in das Genom von S. typhi Ty2 einzuführen. Das die aroC-Deletion enthaltende 4,8-kB-HindIII-Fragment wurde aus pMIAC23 isoliert und die Enden in stumpfe Enden unter Verwendung des Stratagene DNA-Polishing-Kits überführt. Das Plasmid pCVD442 wurde durch Verdau mit SmaI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den Fragmenten mit stumpfen Enden ligiert. Das erwünschte Konstrukt wurde isoliert und mit pYCVC21 bezeichnet.
pYCVC21 wurde in S. typhi Ty2 unter Verwendung eines Standard-Elektroporationsprotokolls eingeführt. Das Plasmid war zur Integration in das Ty2-Genom nach Rekombination zwischen den homologen Regionen in dem Plasmid und dem Genom befähigt, so dass sich Ampicillin-resistente Transformanten erga ben. Diese Transformanten enthielten eine Kopie sowohl des ursprünglichen Wildtyp aroC als auch des verkürzten aroC-Gens. Das Züchten dieser Stämme in Abwesenheit von Ampicillin führte zu einem zweiten Rekombinationsereignis, das im Verlust der pCVD442-DNA-Sequenzen und einer Kopie des aroC-Gens, entweder der Wildtyp-Kopie oder der verkürzten Kopie, resultierte. S.-typhi-Ty2-Bakterien, welche dieses zweite Rekombinationsereignis aufwiesen, wurden als Ampicillin-sensitive Abkömmlinge identifiziert, die zum Wachstum in Gegenwart von 5% Sucrose (pCVD442 enthält das sacB-Gen, das bei seiner Expression einen Sucrose-sensitiven Phänotyp zeigt) befähigt waren. Stämme, die nur das deletierte aroC-Gen behalten hatten, wurden zunächst als Stämme identifiziert, die unfähig waren, auf Platten mit Minimalmedium ohne ergänzte aromatische Verbindungen zu wachsen. Der aroC-Genotyp wurde unter Verwendung einer PCR-Analyse überprüft. Primer mit der SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 ergaben ein Produkt mit 994 Bp beim Wildtyp-aroC und mit 400 Bp beim deletierten bzw. verkürzten aroC-Gen. Eine Sequenzanalyse der resultierenden PCR-Produkte bestätigte das Vorhandensein der erforderlichen Deletion in fünf einzelnen Isolaten, die mit DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 und DTY10 bezeichnet wurden. Diese Stämme wurden in Microbank-Gefäßen bei –70°C zur Langzeitlagerung gelagert. Der Stamm DTY8 wurde für weitere Umsetzungen ausgewählt.
Einführung einer ssaV-Mutation in die S.-typhi-aroC-Mutante DTY8
Ein 7,5 kB PstI-Fragment, das die ssaV-Region von S. typhi enthielt, wurde ausgehend von einer Gesamt-DNA-Präparation unter Verwendung einer PCR amplifiziert und in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Die verwendeten PCR-Oligonukleotid-Primer, welche die SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 aufwiesen, wurden anhand der S.-typhimurium-SPI2-Sequenz ausgewählt. Das resultierende Plasmidkonstrukt wurde mit pTYSV21 bezeichnet.
Ein Plasmidkonstrukt mit einer Deletion im ssaV-Gen wurde aus pTYSV21 unter Verwendung einer revers orientierten PCR erzeugt. An die 5'-(SEQ ID NO: 9) und 3'-(SEQ ID NO: 10)-Bereiche des offenen Leserahmens von ssaV anlagernde Primer wurden anhand der Sequenz von S. typhimurium Spi2 ausgewählt. Es wurde eine AvrII-Restriktionsschnittstelle in den 5'-Bereich jedes Primers eingebaut, eine XbaI- Schnittstelle wurde in SEQ ID NO: 10 eingefügt. Die XbaI-Schnittstelle dient als Markierung für die ssaV-Mutation, so dass sie in einfacher Weise durch Restriktionsanalyse nachgewiesen werden kann. Das resultierende PCR-Produkt wurde einem Verdau mit AvrII unterworfen, und die Rückgrat-Plasmidmoleküle wurden nach Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Die Rezirkularisierung der resultierenden Fragmente über die AvrII-Klebeenden ergab das erwünschte Deletionskonstrukt pYDSV1. pYDSV1 enthält ein 5,5-kB-PstI-Fragment mit einer 1894-Bp-Deletion im offenen Leseraster von ssaV.
Es wurde das Suizidplasmid pCVD442 als Vektor zur Einführung der ssaV-Deletion in das Genom der aroC-Mutante DTY8 von S. typhi Ty2 verwendet. Das die ssaV-Deletion enthaltende 5,5-kB-PstI-Fragment wurde aus pYDSV1 isoliert und die Enden in stumpfe Enden durch Behandlung mit Klenow-DNA-Polymerase überführt. Das Plasmid pCVD442 wurde durch Verdau mit SmaI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den stumpfendigen Fragmenten ligiert. Das erforderliche Konstrukt wurde isoliert und mit pYDSV214 bezeichnet.
pYDSV214 wurde in S. typhi DTY8 durch Elektroporation eingeführt. Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert und dann in Abwesenheit von Ampicillin gezüchtet, um einen Verlust der pCVD442-DNA-Sequenzen und einer Kopie des ssaV-Gens, entweder der Wildtyp-Kopie oder der verkürzten Kopie, herbeizuführen. Stämme, die dieses zweite Rekombinationsereignis aufwiesen, wurden als Ampicillin-sensitive, Sucrose-resistente Kolonien identifiziert. Stämme, die nur das verkürzte ssaV-Gen behielten, wurden unter Verwendung einer PCR-Analyse identifiziert. Primer mit der SEQ ID NO: 11 und der SEQ ID NO: 12 ergaben ein Produkt von 2485 Bp beim Wildtyp-ssaV und 591 Bp beim verkürzten ssaV-Gen. Eine Sequenzanalyse der resultierenden PCR-Produkte bestätigte das Vorhandensein der erwünschten Deletionen in fünf einzelnen Isolaten, ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 und ZH9. Der Stamm ZH9 wurde zur Herstellung einer cGMP-Hauptzellbank ausgewählt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines mit WT05 bezeichneten Mutantenstammes von S. typhimurium, der eine Wirksamkeit als Vakzin gegen humane Gastroenteritis aufweist. Der Stamm leitet sich vom bekannten humanen virulenten Stamm S. typhimurium TML ab.
TML zur Konstruktion von WT05
TML wurde ursprünglich aus einem Patienten, der an einer Gastroenteritis litt, isoliert und in den Laboratorien von Dr. John Stevens von der Universität Birmingham identifiziert. Er wurde bei den Wellcome Research Laboratories lyophilisiert und erhielt die Kulturnummer BRD519. Die Kultur wurde von der Universität Birmingham erhalten.
Erzeugung einer definierten Deletion des klonierten ssaV-Gens von S. typhimurium.
Es wurde ein Plasmid (Plasmid 7-2, Shea et al., PNAS, 1996; 93: 2593–2597) durch Klonierung eines aus S. typhimurium LT2 isolierten 7,5-kB-PstI-Fragments in die PstI-Schnittstelle von pUC18 erzeugt. ssaV ist zentral in diesem Fragment angeordnet. Ein Plasmidkonstrukt, das eine definierte Deletion im ssaV-ORF enthielt, wurde aus dem Plasmid 7-2 durch revers orientierte PCR erzeugt. Primer, die sich an die 5'-(SEQ ID NO: 13)- und 3'-(SEQ ID NO: 14)-Bereiche des offenen Leserasters von ssaV anlagerten, wurden entsprechend der Sequenz von S. typhimurium Spi2 ausgewählt. Es wurde eine AvrII-Restriktionsschnittstelle im 5'-Bereich jedes Primers und eine XbaI-Schnittstelle in SEQ ID NO: 14 eingeführt. Die XbaI-Schnittstelle dient als Markierung für die ssaV-Mutation, so dass sie leicht durch Restriktionsanalyse nachgewiesen werden kann. Das resultierende PCR-Produkt wurde einem Verdau mit AvrII unterworfen und die Rückgrat-Plasmidmoleküle nach Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Die Rezirkularisierung der resultierenden Fragmente über die AvrII-Klebeenden ergab das mit pMDSV1 bezeichnete erwünschte Deletionskonstrukt. pMDSV1 enthält ein 5,5-kB-PstI-Fragment mit einer definierten Deletion von 1894 Bp innerhalb des offenen Leserasters von ssaV, eine AvrII- und eine XbaI-Restriktionsschnittstelle befinden sich an der Stelle der Deletion.
Das Suizidplasmid pCVD442 wurde als Vektor verwendet, um die ssaV-Deletion in das Genom von S. typhimurium TML einzuführen. Das die ssaV-Deletion enthaltende 5,5-kB-PstI-Fragment wurde aus pMDSV1 isoliert und die Enden wurden durch Be handlung mit Klenow-DNA-Polymerase in stumpfe Enden überführt. Das Plasmid pCVD442 wurde durch Verdau mit SmaI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den stumpfendigen Fragmenten ligiert. Das gewünschte Konstrukt wurde isoliert und mit pMDSV22 bezeichnet.
pMDSV22 wurde in S. typhimurium TML durch Konjugation eingeführt. Hierzu wurde das Konstrukt in den E.-coli-Stamm S17-1 λ pir transformiert. Die Konjugation wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt. Das Plasmid pMDSV22 konnte sich in das TML-Genom nach Rekombination zwischen den homologen Regionen auf dem Plasmid und dem Genom einfügen, so dass sich Ampicillin-resistente Transkonjugate ergaben.
Ein mit mdsv-WT2 bezeichnetes Transkonjugat wurde zur weiteren Verarbeitung ausgewählt. Dieses Transkonjugat enthält sowohl eine Kopie des ursprünglichen Wildtyp-ssaV als auch des verkürzten ssaV-Gens. Es wurde in Abwesenheit von Ampicillin gezüchtet, um ein zweites Rekombinationsereignis hervorzurufen, das im Verlust der pCVD442-DNA-Sequenzen und einer Kopie, entweder der Wildtyp-Kopie oder der verkürzten Kopie, des ssaV-Gens resultieren sollte. Isolate, bei denen dieses zweite Rekombinationsereignis auftrat, wurden als Ampicillin-sensitive Derivate identifiziert, die zum Wachstum in Gegenwart von 5% Sucrose befähigt waren (pCVD442 enthält das sacB-Gen, das bei seiner Expression einen Sucrose-sensitiven Phänotyp ergibt). Stämme, die nur das verkürzte ssaV-Gen behielten, wurden durch PCR-Analyse identifiziert. Primer mit der SEQ ID NO: 15 und der SEQ ID NO: 16 ergaben ein Produkt von 2485 Bp für das Wildtyp-ssaV- und 591 Bp für das verkürzte ssaV-Gen. Eine Sequenzanalyse der resultierenden PCR-Produkte bestätigte das Vorhandensein der erwünschten Deletion in vier einzelnen Isolaten, ZH20, ZH23, ZH25 und ZH26. Diese Stämme wurden in LB plus 15% Glycerin bei –80°C zu Langzeitlagerung gelagert. Der Stamm ZH26 wurde für weitere Arbeitsschritte ausgewählt.
Klonierung des S.-typhimurium-aroC-Gens aus S. typhimurium TML
Aus S. typhimurium TML wurde genomische DNA isoliert und mit HindIII gespalten. Die HindIII-Fragmente im Größenbereich von 5 bis 6 kB wurden gereinigt und mit HindIII-gespaltenem pBluescript ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation einer E.coli-aroC-Mutante AB2849 verwendet, und das aroC-Gen von S. typhimurium enthaltende Klone wurden aufgrund ihrer Befähigung zur Komplementation dieses Stammes selektiert. Die Analyse eines Klons, pDAC1, zeigte, dass er ein 5,2-kB-HindIII-Fragment enthielt.
Es wurde eine definierte Deletion von 600 Bp in dem klonierten aroC-Gen durch PCR erzeugt. Die Oligonukleotidprimer wurden unter Verwendung der veröffentlichten DNA-Sequenz des S.-typhi-aroC-Gens (Zugriffsnummer M27715) ausgewählt. Ausgehend von pDAC1 wurde die DNA 5' zum aroC-Gen unter Verwendung der Primer mit der SEQ ID NO: 19 und der SEQ ID NO: 17 amplifiziert. SEQ ID NO: 19 bindet an die Vektor-DNA, SEQ ID NO: 17 bindet an die 5'-Region von aroC. Die DNA 3' zum aroC-Gen wurde unter Verwendung der Primer mit der SEQ ID NO: 20 und der SEQ ID NO: 18 amplifiziert. SEQ ID NO: 20 bindet an die Vektor-DNA, SEQ ID NO: 18 bindet an die 3'-Region von aroC. Die resultierenden PCR-Produkte wiesen in die 5'-Enden eingebaute XbaI-Schnittstellen auf, um die Klonierung zu erleichtern. Die Fragmente wurden in den Vektor pUC18 kloniert. Das Plasmidendkonstrukt pMIAC8 enthält eine definierte Deletion im aroC (Position 544 bis 1143 gemäß Zugriffsnummer M27715) auf einem 4,8-kB-HindIII-Fragment. Das HindIII-Fragment wird in die HindIII-Schnittstelle von pUC18 eingefügt. Anstelle der Deletion befindet sich eine einzelne XbaI-Schnittstelle.
Einführung der aroC-Mutation in die S. typhimurium-ssaV-Mutante ZH26
Das Suizidplasmid pCVD442 wurde als Vektor verwendet, um die aroC-Deletion in das Genom von S. typhimurium TML einzubringen. Das 4,8-kB-HindIII-Fragment, das die aroC-Deletion enthielt, wurde aus pMIAC8 isoliert und die Enden durch das Stratagene DNA-Polishing-Kit (Katalog-Nr. 200409) in stumpfe Enden überführt. Das Plasmid pCVD442 wurde durch Verdau mit SmaI linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und mit den stumpfendigen Fragmenten ligiert. Das erwünschte Konstrukt wurde isoliert und mit pMCVC16 bezeichnet. pMCVC16 wurde durch Elektroporation in S. typhimurium ZH26 eingebracht. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt und in Abwesenheit von Ampicillin gezüchtet, um den Verlust der pCVD442-DNA-Sequenzen und einer Kopie des aroC-Gens, entweder der Wildtyp-Kopie oder der verkürzten Kopie, herbeizuführen. Stämme, bei denen dieses zweite Rekombinationsereignis auftrat, wurden als Ampicillin-sensitive Derivate identifiziert, die zum Wachstum in Gegenwart von 5% Sucrose befähigt waren. Stämme, die nur das verkürzte aroC-Gen behielten, wurden zunächst als Stämme identifiziert, die nicht dazu befähigt waren, auf Platten mit Minimalmedium in Abwesenheit einer Ergänzung mit aromatischen Verbindungen zu wachsen. Der aroC-Genotyp wurde durch PCR-Analyse überprüft. Primer mit der SEQ ID NO: 21 und der SEQ ID NO: 22 ergeben ein Produkt von 994 Bp für das Wildtyp-aroC- und 400 Bp für das verkürzte aroC-Gen. Die Sequenzanalyse der resultierenden PCR-Produkte bestätigte das Vorhandensein der erwünschten Deletion in vier einzelnen Isolaten, die mit WT05, WT09, WT10 und WT12 bezeichnet wurden. Der Stamm WT05 wurde zur Herstellung einer CGMP-Hauptzellbank ausgewählt.
Beispiel 3
Das folgende Konstrukt wurde zum Test der Vakzin-Doppelmutanten in einem Tiermodell hergestellt. S. typhimurium SL1344, ein Mäuse-infizierender Stamm mit einzelner und doppelter Mutation wurde verwendet.
Eine ssaV::aph (unpolare) Mutante von S. typhimurium 12023s wurde in SL1344 P22-transduziert, um eine einzelne Spi2-Mutante zu ergeben.
Der aroC-Deletion/pCVD422-Suizidvektor pMCVC16 wurde in den S.-typhimurium-Stamm LB5010 elektroporiert, und es wurden Merodiploide erhalten. Das aroC-Deletionsmerodiploid wurde dann aus dem LB5010-Merodiploid in SL11344 P22-transduziert. Das SL1344-Merodiploid wurde dann durch Sucrose-Selektion selektioniert, um die aroC-Einzelmutante zu erhalten.
Die Doppelmutante wurde durch P22-Transduktion des aroC-Deletionsmerodiploids aus LB5010 in SL1344 ssaV::aph erzeugt. Die Plasmidsequenzen wurden aus dem Merodiploid aufgeklärt, was den Stamm 3, die aroC-Deletionsmutation im SL1344 ssaV::aph-Hintergrund zurückließ.
Präklinische pharmakodynamische Untersuchungen mit definierten aroC/ssaV-Salmonella-Mutanten
Es wurden Salmonella-Mutanten (Stamm SL1344), welche definierte Mutationen entweder im aroC, ssaV oder eine Kombination beider Mutationen aufwiesen, umfangreich in BALB/C-Mäusen untersucht, um die Abschwächung bzw. Attenuierung, Persistenz der Organismen und die Befähigung zur Immunisierung gegen eine Infektion mit dem Wildtyp-Stamm festzustellen.
Beispiel 4
Über den intravenösen Weg immunisierte Tiere
Protektionsstudien
Gruppen von zehn BALB/C-Mäusen wurden i. v. mit 10⁵ und 10⁶ SL1344-aroC-, SL1322-ssaV- und SL1344-aroC:asaV immunisiert, die über Nacht in LB-Medium gezüchtet und in Salzlösung zur Verabreichung resuspendiert wurden. Die Mäuse wurden sechs Wochen danach mit 10⁵ Organismen vom Wildtyp infiziert, die intravenös verabreicht wurden. Zehn Organismen dieses Wildtyp-Stammes, intravenös verabreicht, reichen aus, um Mäuse zu töten.
Sämtliche Mäuse, denen die aroC- oder ssaV-Einzelmutanten gegeben wurden, wurden, wurden nach Infektion mit beiden Dosen solide geschützt, und es ging ihnen während des gesamten Experiments gut, wobei sie kein Anzeichen einer Erkrankung zeigten. Von den Doppelmutanten waren 90% der Tiere, welche die Immunisierung mit 10⁶ Organismen erhielten, solide geschützt. Eines der Tiere starb 8 Tage nach der Infektion. Von den Tieren, die mit der geringeren Dosis immunisiert wurden, überlebte nur eine der Mäuse die Infektion.
Dieses Experiment zeigt, dass die Immunisierung mit Salmonella-ssav-Mutanten, entweder einzeln oder in Kombination mit einer aroC-Mutation Mäuse gegen die Infektion mit einem Salmonella-Wildtypstamm immunisiert.
Persistenz der Stämme
Gruppen von Mäusen wurden 10⁶ Organismen der drei vorstehend beschriebenen Salmonella-Mutanten verabreicht. Vier Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten bis zum Tag 14 getötet und die Organismen in den Lebern und Milzen gezählt. Die Anzahl bei den drei Mutanten wurden bis zum Tag 10 vergleichbar, wobei sich ungefähr 5 × 10⁵ Organismen in jedem Organ befanden. Am Tag 14 zeigte sich ein Unterschied zwischen den Einzelmutanten und den Doppelmutanten, wobei sich sowohl in der Leber als auch in der Milz eine Größenordnung kleinere Anzahlen bei den Doppelmutantenorganismen ergaben.
Der andere wichtige Unterschied zwischen den Einzelmutanten und der aroC/ssaV-Doppelmutante besteht darin, dass bei den Doppelmutanten zu keinem Zeitpunkt während des Experiments Leberabszesse auftraten. Die mit den Einzelmutanten infizierten Mäuse wiesen jedoch Leberabszesse auf, die sich am Tag 10 und 14 zeigten. Dies ist eine wichtige Erkenntnis und stützt maßgeblich die Verwendung dieser Kombination von Mutationen zur Evaluierung der Herstellung von Vakzinen.
Immunogenität
Den vorstehend immunisierten Mäuse wurde Blut abgenommen, und die Antikörpertiter wurden gegen vollständige Salmonella-Zellen unter Verwendung eines ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass alle drei Stämme hoch immunogen waren und hohe Titer zirkulierender IgG gegen Salmonella erzeugten.
Beispiel 5
Über den oralen Weg immunisierte Tiere
Persistenz der Stämme
Mit 5 × 10⁹ Organismen von jedem der drei Salmonella-Mutanten immunisierte Gruppen von Mäusen wurden nach periodischen Intervallen getötet, und die Anzahl von Organismen in Lebern und Milzen bestimmt. Bei der aro-Einzelmutante und der ssaV-Einzelmutante betrugen die Zahlen in den Lebern und Milzen 10³ bzw. 10² bis etwa zum Tag 21. Danach fielen die Anzahlen. Bei den Mäusen, welche die aroC:ssaV-Doppelmutanten erhielten, waren praktisch keine Organismen in den Lebern und Milzen nach oraler Immunisierung nachweisbar.
Orale Immunisierung und intravenöse Infektion von mit Salmonella typhimurium TML aroC/ssav (WT05) vakzinierten A/J-Mäusen.
Der Zweck dieses Experiments bestand in der Bestimmung der Schutzwirkung von 5 × 10⁹ aroC/ssaV S. typhimurium TML-Mutanten in einem Modell zur ity^r-Mausvakzinierung und intravenösen Infektion. Dieses Modell ähnelt stärker der humanen Reaktion gegen Salmonella, indem diese Tiere weniger empfindlich als ein ity^s-Hintergrund sind.
5 × 10⁹ S. typhimurium TML aroC/ssaV in einem Volumen von 0,2 ml PBS wurden oral über eine Ernährungssonde in 10 A-J-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen angeimpft und 8 Wochen belassen. Zwei Mäusen wurde zu diesem Zeitpunkt nur PBS verabreicht, und diese dienten als Kontrolltiere. Nachdem 8 Wochen vergangen waren, wurden die zwei immunisierten Gruppen intravenös mit 10⁷ Wildtyp S. typhimurium TML infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse für 30 Tage beobachtet.
Alle Tiere wurden gegen eine Wildtyp-Infektion solide bzw. gut geschützt (100% Überlebensrate, 10/10 Tiere überlebten). Mäuse, denen nur PBS verabreicht und dann mit Wildtyp S. typhimurium TML infiziert wurden, starben am Tag 6 nach der Infektion.
Vor einem ity^r-Hintergrund scheint die Doppelmutante S. typhimurium TML aroC/ssaV Mäuse zu schützen, denen eine orale Dosis von 5 × 10⁹ verabreicht wurde. Dies kann für das humane Umfeld bedeutsam sein, da ity^r-Mäuse ein besseres Modell der humanen Salmonellose hinsichtlich der Empfänglichkeit für eine Infektion darstellen.
Es wurden ebenfalls Untersuchungen durchgeführt, um die Persistenz der Doppelmutanten in den Lebern und Milzen der Mäuse zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die Doppelmutanten mit geringen Anzahlen bis etwa zum Tag 21 persistieren. Am Tag 28 war der mutierte Stamm verschwunden.
Beispiel 6
Humane klinische Untersuchung
Es wurden 18 gesunde Freiwillige für eine offene, nicht Plazebo-kontrollierte Studie gewonnen. Nach einer geeigneten Durchmusterung erhielt jeder von drei Freiwilligen eine einzelne orale Dosis mit entweder 10⁷, 10⁸ oder 10⁹ CFU S. typhi ZH9 oder S. typhimurium WT05. Die wie vorstehend präparierten Mikroorganismen wurden entsprechend der geeigneten Dosiskonzentrationen in einem Endvolumen von 100 ml von 2% (w/v) Natriumbicarbonat-Lösung zur Neutralisation von Gallensäuren resuspensiert. Diese flüssige Suspension wurde den Freiwilligen oral verabreicht. Die Freiwilligen wurden dann für 72 Stunden isoliert und dann nach der Immunisierung hinsichtlich Sicherheit und Immunogenität nachverfolgt.
Die Freiwilligen wurden hinsichtlich der Verträglichkeit und anderen mit der Vakzinierung zusammenhängenden Nebenwirkungen durch Beobachtung, physikalische Untersuchung und durch Ausfüllen von Tagebuchkarten untersucht. Darüber hinaus wurden Blut-, Stuhl- und Urinkulturen abgenommen, um sie hinsichtlich einer Vakzinämie, Shedding und Persistenz der Vakzinstämme zu untersuchen. Weitere Sicherheitsdaten wurden durch Messung der Spiegel des C-reaktiven Proteins (CRP) und der Leberfunktionsenzyme (ALT) im Blut, Zählungen der gesamten weißen Blutzellen (WBC) und Erythrozyten-Sedimentationsraten (ESR) durch Standardprozeduren erhalten. Diese Parameter wurden im bis zum Tag 7 täglich abgenommenen Blut und dann wöchentlich bis zum Tag 28 gemessen.
Analyse der mukosalen und systemischen Immunreaktionen
Blut- und Speichelproben wurden vor der Immunisierung und dann an den Tagen 7, 14, 21 und 28 nach der Immunisierung gewonnen, Speichel und Serum wurden bei –70°C bis zur Analyse durch ELISA eingefroren. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes wurden gewonnen und hinsichtlich des Vorhandenseins Antikörper-sekretierender Zellen (ASC) unter Verwendung der ELISPOT-Technik getestet.
Sowohl S. typhi ZH9 als auch S. typhimurium WT05 wurden von allen Freiwilligen gut toleriert. Es wurden bei keinem der Freiwilligen bei jedem der drei Dosisspiegel schwere Nebenwirkungen festgestellt, und die Blut- und Urinkulturen blieben bei allen Vakzinen zu allen drei untersuchten Zeitpunkten negativ. Somit ruft die Immunisierung sowohl mit S. typhi ZH9 als auch mit S. typhimurium WT05 keine Vakzinämie hervor. Keiner der Freiwilligen, denen einer der Stämme verabreicht wurde, entwickelte einen Durchfall oder dauerhaft hohes Fieber, was weiter die Sicherheit der Vakzinstämme anzeigt. Bis zum Tag 7 wurde keine persistierende Exkretion oder Vakzinämie in den drei Dosisgruppen von S. typhi ZH9 oder bei der niedrigen Dosis (10⁷) von S. typhimurium WT05 festgestellt.
Durch S. typhi ZH9 hervorgerufene mukosale und systemische Immunantworten
Die orale Immunisierung mit einer einzelnen niedrigen Dosis (1 × 10⁷ CFU) von S. typhi ZH9 resultiert im Priming bzw. in der Ankurbelung von S.-typhi-spezifischen IgA-sekretierenden ASC, die 7 Tage nach der Immunisierung in 2 von 3 Freiwilligen festgestellt wurden. Nachfolgende Untersuchungen am Tag 14 und 21 zeigten, das IgA-ASC weiterhin, jedoch mit sehr viel geringeren Spiegeln nachweisbar waren und am Tag 28 verschwanden. Im Wesentlichen bei sämtlichen eine Antwort hervorrufenden Vakzinen waren die ASC-Zahlen am Tag 7 am höchsten. Überraschenderweise ergab eine Einnahme einer höheren Dosis (10⁸ CFU) von S. typhi ZH9 eine geringe IgA-ASC-Reaktion in nur einem von drei Vakzinierten. Einnahme der höchsten Dosis (1 × 10⁹ CFU) kurbelte IgA-ASC in 2 von 3 Freiwilligen an.
Salmonella-spezifische Serumantikörperreaktion
Die orale Immunisierung mit einer einzelnen geringen Dosis (1 × 10⁷ CFU) von S. typhi ZH9 erzeugte keine S. typhi LPS-spezifischen Serum-IgG (trotz der Hervorrufung von IgA-ASC in 2/3 Vakzinierten), wenn an den Tagen 7, 14, 21 und 28 untersucht wurde. In ähnlicher Weise bildete nur 1/3 sehr geringe Spiegel Flagellen- spezifischer IgG. Die Einnahme von 10⁸ CFU ergab jedoch die Herstellung hoher Spiegel sowohl von LPS- als auch Flagellen-spezifischer IgG in allen drei Freiwilligen. Erhöhte Spiegel von S. typhi LPS-spezifischen IgG und Flagellen-spezifischen IgG wurden schon am Tag 7 nach der Vakzinierung festgestellt, die am Tag 14 anstiegen und am Tag 28 hoch blieben. Die höchste Dosis mit 10⁹ CFU stimulierte ebenfalls LPS- und Flagellen-spezifische IgG in 2 von 3 vakzinierten Personen, was am Tag 7 bzw. 14 nachweisbar war.
Schlussfolgerungen
Diese Studie zeigt die Eignung der ssaV-Mutation als Komponente eines beliebigen neuen Stammes für ein orales Typhusvakzin. Ein S.-typhi-Stamm, der ausschließlich aro-Mutationen aufweist, hätte bei den verabreichten Dosen Vakzinämien hervorgerufen. Die ssaV-Mutation stellt daher eine zusätzliche Sicherheitsstufe für die aro-Mutation allein bereit, indem sie die Vakzinämien durch diese frühere Formulierungen verhindert.
Neben der erwiesenen guten Toleranz wurde ebenfalls gezeigt, das ZH9 bei allen drei verabreichten Dosen immunogen ist. Hinsichtlich der Stimulierung von Serumantikörpern erwiesen sich die mittleren (10⁸ CFU) und höchsten (10⁹ CFU) Dosen als hoch immunogen, wobei 3/3 Vakzinierte, denen 10⁸ CFU verabreicht wurden, und 2/3 Vakzinierte, denen 10⁹ CFU verabreicht wurden, sowohl hohe Titer von S. typhi LPS- als auch Flagellen-spezifischem Serum-IgG zeigten. Diese Reaktionen sind sehr vielversprechend, da es allgemein schwierig ist, durch orale Vakzinierung Serumantikörper hervorzurufen.
Neben der Erzeugung S.-typhi-spezifischer Serumantikörperreaktionen kurbelte ZH9 auch IgA-ASC an, was eine Immunstimulation der intestinalen Schleimhaut anzeigt. Insgesamt zeigten 5/9 Freiwillige eine Reaktion in Bezug auf S. typhi LPS-spezifische IgA-sezernierende Zellen (ASC), die nicht dosisabhängig zu sein schien.
WT05 wurde ebenfalls gut toleriert, und es wurden keine Vakzinämien nachgewiesen. Interessanterweise konnten keine Durchfälle oder Symptome einer Gastroenteritis bei den Freiwilligen festgestellt werden. Die unter Verwendung des mutanten TML-Stammes mit einer einzelnen aro- oder SPI2-Mutation in Mäuse verabreichten S. typhimurium erhaltenen Daten deuteten darauf hin, dass eine aroC/ssaV-Doppelmutante lokale intestinale Nebenwirkungen, z. B. Durchfall, Krämpfe im Menschen, hervorrufen könnte. Da keine dieser Wirkungen auftrat, stärkt dies die Eignung der Kombination der aro- und SPI2-Mutationen.
Beispiel 7
Heterologe Antigenträger
Um die Eignung der ssaV:aroC-Doppelmutantenstämme zur Expression und Übertragung von Fremdantigenen zu zeigen, wurde WT05 mit einem Plasmid (pBRD026) transformiert, welches das Gen für die hitzeempfindliche Enterotoxin-B-Untereinheit (LT-B) von E. coli exprimiert.
BALB/C-Mäuse (n = 10/Gruppe) wurden oral an den Tagen 0 und 28 mit 10⁹ CFU (200 ml in PBS) pBRD026-exprimierender WT05, oder mit dem WT05-Vektorstamm (Kontrolle) immunisiert. Zum Vergleich (und als Positivkontrolle) wurde eine Mausgruppe (n = 5) oral an den Tagen 0 und 28 mit 10 μg gereinigtem LT (Sigma) immunisiert. Die Mäuse einer Negativkontrolle (n = 5) wurden oral an den Tagen 0 und 28 mit 200 μl PBS immunisiert. Den Mäusen wurde aus der Schwanzvene an den Tagen 21, 28, 35 und durch Kardialpunktion am Tag 42 Blut abgenommen und Seren und Intestinalflüssigkeit wurden (nur am Tag 42) gewonnen und bei –20°C gelagert.
Außer einer entwickelten alle mit WT05/LT-B-immunisierten Mäuse LT-spezifische IgG (Titer von 3000–50000) am Tag 28 nach einer einzigen oralen Dosis. Keine der drei mit WT05 oder PBS oral immunisierten Mäuse entwickelte LT-spezifische IgG. Die orale Immunisierung mit einer einzelnen Dosis von gereinigtem LT erzeugte höhere Titer LT-spezifischer Antikörper (Titer von 6000 bis > 50000). Bei der Untersuchung des Isotyps der LT-B-spezifischen Serum-IgG wurde festgestellt, das der pBRD026-exprimierende WT05-Stamm fast ausschließlich LT-spezifische IgG2a hervorrief, was einen Hang zu einer TH1-typischen Immunantwort indiziert. Im Gegensatz dazu erzeugten mit gereinigtem LT (Sigma) immunisierte Mäuse fast ausschließlich LT-spezifische IgG1, was eine TH2-typische Reaktion indiziert. Daher er leichtert die Expression von LT-B im aroC/ssaV-Stamm eine profunde Immunmodulation. Die durch den aroC/ssaV-Salmonella-Stamm erzeugten TH1-gerichteten Reaktionen dürften bedeutsam sein, wenn Antigene aus pathogenen Organismen, gegen die TH1-typische Reaktionen schützen, exprimiert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Salmonella-Mikroorganismus, der eine Attenuierungsmutation, welche die Expression des ssaV-Gens aufhebt, und eine Attenuierungsmutation, welche die Expression des aroC-Gens aufhebt, aufweist.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus des Weiteren ein heterologes Antigen oder ein therapeutisches Protein umfasst.
Mikroorganismus nach Anspruch 2, wobei das Antigen ein Hepatitis-A-, -B- oder -C-Antigen ist.
Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Mikroorganismus Salmonella typhi Ty2 ist.
Mikroorganismus nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Therapie.
Vakzinzusammensetzung, die einen Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein Adjuvanz und ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, die 10⁷–10¹⁰ CFU in einer einzelnen Dosiseinheit umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, die 10⁸–10⁹ CFU umfasst.
Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Mikroorganismus zur Herstellung eines Medikaments zur intravenösen Verabreichung zur Behandlung einer systemischen bakteriellen Infektion.
Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definierten Mikroorganismus zur Herstellung eines Medikaments zur oralen Verabreichung zur Behandlung einer systemischen bakteriellen Infektion.
Verwendung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10 zur Behandlung von Typhus.