MXPA04002866A - Composiciones bacterianas inmunogeneticas de celula completa incapacitadas. - Google Patents

Abstract

La invencion presenta composiciones inmunogenicas bacteriales de celula completa incapacitadas producidas al infectar bacterias con el bacteriofago Lys menos, que son deficientes en la proteina lisina. El bacteriofago Lys menos mantiene la actividad en la infeccion de estos hospedadores bacteriales apropiados, destruccion del genoma bacterial, y replicacion, que son suficientes para inhibir el crecimiento y replicacion bacterial. Las bacterias infectadas con Lys menos, resultantes, se proporcionan en un estado de bacterioestasis, y no son capaces de replicarse adicionalmente (por ejemplo, es "incapacitada"). Las bacterias incapacitadas pueden entonces usarse para erigir una respuesta inmune para propositos profilacticos y/o terapeuticos. La invencion, de esta manera, tambien presenta una bacteria incapacitada formulada apropiadamente para usarse en composiciones inmunogenicas para erigir una respuesta inmune, por ejemplo, para la produccion de anticuerpos en un hospedador no humano o en una vacuna bacterial de celula completa.

Description

COMPOSICIONES BACTERIANAS INMÜNOGENICAS DE CÉLULA COMPLETA INCAPACITADAS Campo de la Invención La invención se refiere a métodos y composiciones para la producción de composiciones bacterianas inmunogénicas iriactivadas de célula completa, que son muy similares a los patógenos infecciosos vivos pero no son infecciosas .

Antecedentes de la Invención El incremento alarmante en la resistencia bacteriana a los antibióticos disponibles, los viajes internacionales y las enfermedades infecciosas recientemente identificadas, han resaltado la necesidad de nuevas vacunas efectivas . Las vacunas de célula completa inactivadas, son un componente importante de los métodos que aparecen para cubrir estas necesidades de salud pública. La administración de vacunas de célula completa, es uno de los métodos más bien estudiados de vacunación contra infección bacteriana. Las ventajas particulares de las vacunas de célula completa incluyen la presentación de muchos antígenos (incluyendo antígenos protectores pero todavía indefinidos) , oportunidades mínimas de efectos naturales cuando se dan parenteralmente, un potencial de virulencia de cero y un carácter de tipo adyuvante. Los estudios en modelos animales y de humanos han Ref: 155067 mostrado inmunogenicidad cuando las vacunas de célula completa se administran oral o parenteralmente . La protección efectiva contra infecciones bacterianas respiratorias entéricas y sistémicas también se ha mostrado. Aunque solamente la vacuna de pertusis de célula completa inactivada se ha utilizado para inmunizar al público en general, otras vacunas de célula completa tiene el potencial para un uso global . Existen solamente dos tipos básicos de vacunas de célula completa: vivas, atenuadas e inactivadas. Las características de las vacunas vivas e inactivadas son diferentes, y estas características determinan como se usa la vacuna.

Vacunas vivas atenuadas Las vacunas vivas atenuadas se producen al modificar una bacteria productora de la enfermedad ("silvestre") en el laboratorio. Las vacunas vivas atenuadas disponibles en los Estados Unidos incluyen virus vivos y bacterias vivas . Estos virus o bacterias silvestres se atenúan o se debilitan en el laboratorio usualmente por un cultivo por repetido. Con objeto de producir una respuesta inmune, las vacunas atenuadas vivas deben replicarse (crecer) en la persona vacunada. Una dosis relativamente pequeña de virus o bacteria se da, la cual se replica en el cuerpo e incrementa hasta un gran volumen suficiente para estimular una respuesta inmune.

Cualquier cosa que dañe al organismo vivo en el vial (por ejemplo, calor luz) o interfiera con la replicación del organismo del cuerpo (anticuerpo en circulación) puede provocar que la vacuna sea ineficaz. Aunque las vacunas vivas atenuadas se replican usualmente no provocan enfermedad, tal como puede suceder con el organismo natural (silvestre) . Cuando una vacuna viva atenuada provoca enfermedad, es usualmente mucho más moderada que la enfermedad natural y se refiere como una reacción adversa. La respuesta inmune a una vacuna viva atenuada es virtualmente idéntica a aquella producida por una infección natural . El sistema inmune no se diferencia entre una infección con una bacteria de vacuna debilitada y una infección con una bacteria de tipo silvestre. Las vacunas vivas atenuadas son generalmente efectivas con una dosis excepto aquellas que se administran oralmente . Sin embargo, las vacunas vivas atenuadas satisfacen diversas limitaciones . Primero las vacunas vivas atenuadas puede provocar reacciones fatales o severas como resultado de una replicación descontrolada (crecimiento del virus de vacuna) . Esto sucede sólo en personas con inmunodeficiencia (por ejemplo, de leucemia, tratamiento con ciertos fármacos o infección por . VIH) . Además dependiendo de como se genera la cepa de la vacuna, una vacuna atenuada viva puede algunas veces revertirse a su forma original patogénica (que provoca la enfermedad) . A la fecha esto solamente se conoce que sucede con la vacuna de polio viva. La inmunidad activa de un vacuna atenuada viva puede no desarrollarse debido a la interferencia del anticuerpo en circulación al virus de vacuna. El anticuerpo de cualquier fuente (por ejemplo, transplacental , de transfusión) puede interferir con el crecimiento del organismo de vacuna, y conduce a una no respuesta a la vacuna (también conocida como falla de vacuna) . El virus de la vacuna de sarampión parece ser más sensible al anticuerpo en circulación. Los virus de la vacuna del rotavirus y de la polio son menos afectados. Las vacunas vivas atenuadas son débiles y se puede dañar o destruir por el calor y la luz. Se deben manejar y almacenar cuidadosamente. Las vacunas vivas atenuadas actualmente disponibles, incluyen virus vivos (sarampión, paperas, rubéola, polio, fiebre amarilla, vacunas y varicela) , y dos vacunas bacterianas vivas (BCG y tifoidea oral) .

Vacunas inactivadas Las vacunas inactivadas pueden estar compuestas de virus completos o bacterias o fracciones de cada una. Las vacunas fraccionadas son basadas en proteínas o basadas en polisacáridos . Las vacunas basadas en proteínas incluyen toxoides (toxinas bacterianas inactivadas) y productos de subunidad. La mayoría de las vacunas basadas en polisacáridos , se componen de un polisacárido de pared celular pura de las bacterias. Las vacunas de polisacárido conjugadas son aquellas en la cual el polisacárido se liga químicamente a una proteína. Esta ligadura hace al polisacárido una vacuna más potente. Estas vacunas se producen por el crecimiento de las bacterias en medios de cultivo, luego se inactivan con el calor y/o químicos (usualmente formalina) . En el caso de las vacunas fraccionadas, el organismo se trata además para purificar solamente aquellos componentes a incluirse en la vacuna (por ejemplo, la cápsula de polisacáridos de neumococo) . Las vacunas inactivadas no están vivas y no pueden replicar. La dosis completa del antígeno se administra en la inyección (en comparación con las vacunas atenuadas vivas, que proporcionan dosis adicionales con la replicación en el hospedador) . Las vacunas inactivadas no pueden provocar enfermedad de la infección aun en una persona inmunodeficiente . A diferencia de los antígenos vivos, los antígenos inactivados no se afectan usualmente por el anticuerpo en circulación. Las vacunas inactivadas se pueden dar cuando el anticuerpo está presente en la sangre (por ejemplo, en la infancia o después de recibir productos sanguíneos que contienen anticuerpos) . Las vacunas inactivadas siempre requieren de dosis múltiples. En general la primera dosis no produce una inmunidad protectora si no solamente se va al sistema inmune. Una respuesta inmune protectora se desarrolla después de la segunda o tercera dosis . En contraste con las vacunas vivas, en las cuales la respuesta inmune se asemeja cercanamente a la infección natural, la respuesta inmune a una vacuna inactivada es principalmente humoral . Resulta poca o ninguna inmunidad celular. Las concentraciones de anticuerpos contra antígenos inactivados caen durante el tiempo. Como .resultado algunas vacunas inactivadas pueden requerir dosis suplementarias periódicas para incrementar o reforzar las concentraciones de anticuerpo. En algunos casos el antígeno crítico para la protección contra la enfermedad puede no estar definido, requiriendo así el uso de vacunas de "célula completa" . Las vacunas inactivadas actualmente disponibles incluyen virus completos inactivados (influenza, polio, rabia, hepatitis A) y bacterias completas inactivadas (pertusis, tifoidea, cólera peste) . Las vacunas fraccionadas incluyen subunidades (Hepatitis B, influenza, pertusis acelular, tifoidea Vi, enfermedad de Lyme) , toxoides (difteria, tétanos, botulinum) , polisacáridos puros (neumococos, meningococos, Haemophilus influenzae de tipo B) , y conjugados de polisacáridos (Haemophilus influenzae de tipo b y neumococos) . En resumen se reconoce que entre más similar sea una vacuna a la enfermedad natural, mejor la respuesta inmune a la vacuna. Aunque las vacunas atenuadas son más prometedoras a este respecto, poseen riesgos de enfermedad en hospedadores inmunocomprometidos y la reversión al tipo silvestre, en organismos patogénicos. Las vacunas inactivadas evitan estos problemas, pero todavía puede ser menos deseable en que estas vacunas no imiten la infección natural, y entonces pueden no producir una respuesta inmune relevante o producir una respuesta inmune protectora tan robusta como se pudiera desear. Hay asi una necesidad en el campo de vacunas bacterianas seguras, que se asemejen al organismo infeccioso más cercanamente que las vacunas inactivadas pero que tengan un riesgo reducido o no importante de provocar una enfermedad en el sujeto vacunado. La presente invención atiende esta necesidad.

Breve Descripción de la Invención La invención caracteriza composiciones inmunogénicas bacterianas de célula completa incapacitadas, producidas por la infección de un bacteria con un bacteriófago Lys menos que es deficiente en la proteína de lisina. El bacteriófago Lys menos es incapaz de facilitar una lisis eficiente del hospedador bacteriano, ya que la actividad enzimática de la lisina de fago se necesita para la degradación enzimática de la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana. El bacteriófago Lys menos conserva su actividad en la infección de su hospedador bacteriano adecuado, la destrucción de genoma bacteriano y la replicacion que son suficientes para inhibir el crecimiento y replicacion bacteriano. La bacteria resultante infectada con Lys menos, se suministra en un estado de bacteriostasis, y no puede replicarse además (por ejemplo, está incapacitada) . Luego se puede usar la bacteria incapacitada para obtener una respuesta inmune para propósitos profilácticos y/o terapéuticos. La invención caracteriza también así bacterias incapacitadas formuladas adecuadamente para su uso en composiciones inmunogénicas para obtener una respuesta inmune, por ejemplo, para la producción de anticuerpos en un hospedador no humano o en una vacuna bacteriana de célula completa. En un aspecto, la invención caracteriza un método de obtención de una respuesta inmune a un patógeno bacteriano, el método comprende administrar una composición bacteriana inmunogénica de célula completa incapacitada, a un sujeto susceptible de infección por una enfermedad provocada por una bacteria patogénica. La composición comprende la bacteria patogénica incapacitada por infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis y se administra en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el hospedador. En otro aspecto, la invención caracteriza un método de obtención en un sujeto de una respuesta inmune protectora contra la enfermedad provocada por un patógeno bacteriano, el método comprende la administración a un sujeto susceptible a la enfermedad provocada por una bacteria patogénica, de una composición bacteriana inmunogénica de células completas incapacitadas . La composición comprende la bacteria patogénica incapacitada por infección por un bacteriófago defectuoso en la lisis, y se administra en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune protectora a la bacteria patogénica en el hospedador. Todavía en otro aspecto, la invención caracteriza el método para producir una respuesta inmune en un antígeno, el método comprende administrar a un sujeto una composición bacteriana de célula completa incapacitada. La composición comprende una bacteria incapacitada por una infección por un bacteriófago defectuoso en la lisis, y se administra en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune en el sujeto a un antígeno presente en o sobre la bacteria. En modalidades específicas en el antígeno no es un antígeno bacteriano endógeno a la bacteria o un antígeno recombinante. En algunas modalidades en el antígeno recombinante es exógeno a la bacteria. Todavía en otro aspecto, la invención caracteriza una composición inmunogénica que comprende una bacteria incapacitada y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la bacteria incapacitada se produce por una infección de una bacteria patogénica con un bacteriófago defectuoso en la lisis. En modalidades específicas de cada uno de los aspectos anteriores, la bacteria patogénica es de un género seleccionado del grupo que consiste de Micobacterias, Estafilococos, Vibrio, Enterobacter, Enterococo, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Sal onella, Estreptococo, Klebsiella y Yersinia, y en donde el bacteriófago inhibe el crecimiento de las bacterias infecciosas. En modalidades específicas adicionales de cada uno de los aspectos anteriores, el bacteriófago defectuoso en la lisis es el bacteriófago Lys menos. Una característica de la invención, es que proporciona métodos para producir una composición de células completas bacterianas inm nogénicas que está incapacitada en una forma que mantiene la inmunogenicidad o antigenicidad de la bacteria, pero que no permite la recuperación de la bacteria y la replicacion e infección en el hospedador. Otra característica de la invención, es suministrar métodos y composiciones para efectuar una respuesta inmune protectora contra infecciones bacterianas, particularmente infecciones por bacterias patogénicas. Una ventaja de la invención es que la bacteria incapacitada por infección con los bacteriófagos Lys menos, no pueden recuperarse de la bacteriostasis con la eliminación del bacteriófago libre. Así, las vacunas bacterianas incapacitadas se asocian con un riesgo substancialmente reducido de provocar la enfermedad en un hospedador vacunado en comparación con las vacunas vivas atenuadas . Otra ventaja de la invención es que el antígeno contra el cual se desea una respuesta inmune, cuando se produce en bacterias incapacitadas por fagos no se modifica significativamente en términos de los antígenos presentes en la superficie de células bacterianas, o en términos de los antígenos que se suministran como inclusión o cuerpos agregados dentro de las bacterias que procesan por el sistema inmune, por ejemplo, siguiendo la fagocitosis de la bacteria por un macrófago. En contraste, la inactivación bacteriana inducida químicamente puede resultar en el reticulado de proteínas de superficie y una modificación química e irreversible del antígeno. Estos y otros objetivos, ventajas y características de la invención, serán evidentes a aquellas personas expertas en la técnica con la lectura de los detalles de las composiciones de la invención y sus métodos de uso como se describen más completamente a continuación.

Breve Descripción De Las Figuras La figura 1 es un esquema que muestra el uso de un hospedador bacteriano que tiene un plásmido con un gen de Usina mutante, para uso en la producción de un bacteriófago Lys menos de la invención. La figura 2 ilustra el SDS-PAGE de los productos de genes producidos por los plásmidos pGMBOll y pGMB021 (pista 1: pGMBll, sin inducir; pista 2: pGMBOll, inducido; pista 3; pGMB021, sin inducir; pista 4: pGMB021, inducido; pista 5: marcador 14-97 Kda) . La figura 3 ilustra los resultados del PCR del constructo pGMB021 usado para experimentos de recombinación (pista 1: cebadores GMB1/GMB2 ; pista 2: cebadores GMB2/G B5; pista 3: marcadores; pista 4: cebadores GMB5/GMB6) . La figura 4 ilustra el PCR de las placas turbias producto del gen GFP (pistas 1-5, 7, 8, 17 y 18: acumulados positivos para los productos del gen GFP; pistas 6, 11-16; acumulados negativos para el producto del gen GFP; pistas 9, 19: control positivo; pistas 10, 20: marcador de PM) . La figura 5 es una fotografía que ilustra los resultados de PCR de placas turbias para el producto de gen lisina-GFP-lisina (pistas 1-6: placas turbias #1, 2, 3, 4, 7, 8: pista 7: control positivo para el producto lisina-GFP-lisina (ADN plásmido); pista 8: marcador PM; pista 9: control positivo para el producto de lisina (ADN plásmido) ; pista 10 : control negativo) . La figura 6 ilustra lisados de fagos recombinantes manchados en una capa de E. coli que muestra niveles diferentes de contaminación con el fago de tipo silvestre o la ausencia total de placas silvestres (mancha #1: lisado #11 que muestra un número que se cuenta de placas silvestres; mancha #2: lisado que muestra un alto número de placas que lisan completamente las células; mancha #3: lisado que no muestra ninguna de las placas silvestres) . La figura 7 ilustra el fago reco binante que contiene los lisados manchados en una capa de E. coli que muestra la ausencia de placas . La figura 8 ilustra lisados que contienen fagos recombinantes (RP) que conducen a la pérdida de viabilidad de las células E. coli infectadas (cuadrante #1: ~50% de pérdida de viabilidad observada con el lisado RP #33; cuadrantes #2 & 4 : pérdida total de viabilidad en el caso de los lisados RP #34 y #36; cuadrante #3: ninguna pérdida importante de viabilidad con el lisado RP #35) . Antes de que se describa la presente invención, se entenderá que esta invención, no está limitada a una metodología en particular, protocolos, bacteriófagos, patógenos bacterianos, especies o géneros animales, constructos y reactivos descritos como tal pueden por supuesto variar. También se entenderá, que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir solamente modalidades particulares, y no se pretende que sea limitante ya que el alcance de la presente invención estará solamente limitado por las reivindicaciones anexas. En donde se suministra un rango de valores se entiende que cada valor en intervención, hasta una décima de la unidad del limite inferior a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera, entre los límites superior e inferior de ese rango también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor declarado o valor en intervención, en un intervalo establecido, y cualquier otro valor declarado o de intervención en ese intervalo establecido se abarca dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños, se pueden incluir independientemente o excluir en el intervalo, y cada intervalo en donde alguno, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también se abarca dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. En donde el intervalo establecido incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien experto ordinario en la técnica a guien pertenece esta invención. Aunque se pueden usar algunos métodos y materiales similares equivalentes a aquellos aquí descritos, en la práctica o prueba de la presente invención se describen ahora los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan en la presente como referencia, para divulgar y describir los métodos y/o materiales en conjunto con los cuales se citan las publicaciones . Se debe observar que como se usa en la presente y en la reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", y" , y "los" , incluyen los referentes en plural al menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo la referencia a "un bacteriófago" incluye una pluralidad de tales bacteriófagos y la referencia a la célula hospedadora, incluye la referencia a una o más células hospedadoras y equivalentes de las mismas conocidos por aquellos expertos en la técnica y así sucesivamente. Las publicaciones aquí discutidas, se suministran únicamente para su divulgación previa a la fecha de presentación de la solicitud actual . Nada en la presente se constituye como una admisión de que la presente invención no está acreditada por ser anterior a tal publicación en virtud de la invención previa. Además, las fechas de publicación suministradas pueden ser diferentes de las fechas de publicación actuales que se pueden necesitar para confirmarse independientemente .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos y composiciones para la producción de bacterias con células completas inactivadas, cuyas bacterias se generan usando bacteriófagos defectuosos en la capacidad para lisar a la célula hospedadora bacteriana. Los bacteriófagos son virus altamente específicos que infectan a las bacterias. Después de las infección a una bacteria como E.coli por un fago Utico, tal como el T4, sucede una reconfiguración profunda de todas las síntesis macromoleculares . La polimerasa de ARN de la bacteria hospedadora se enlaza a los sitios de inicio del genoma del fago conocidos como genes tempranos inmediatos (IE) y los transcribe. Algunos de los productos IE degradan al ADN hospedador (bacteriano) que carece de la hidroxi metil citosina base modificada (mientras que a otro producto la ADP ribosa, se enlaza a las unidades alfa de ???? bacterianas y la hace incapaz de reconocer a los promotores celulares bacterianos. Esto resulta en el cese de la transcripción de los genes hospedadores . Estos eventos suceden en los primeros 3 a 5 minutos después de la infección. En la siguiente etapa el KNAP modificado reconoce y se une a los genes denominados temprano retrasados (DE) eliminando así una expresión adicional de los genes IE de fago. Les productos de genes DE están involucrados en la replicación del genoma de fagos usando las bases de ADN bacterianas degradadas . Uno de los productos de los genes DE es un factor sigma novedoso que provoca que el RNAP hospedador reconozca solamente los genes tardíos (L) que están a continuación a ser descritos. Los genes tardíos están involucrados en la síntesis de nuevas proteínas cápsidas, extremos y fibras de extremo y ensamblan proteínas todas las cuales son necesarias para ensamblar las partículas de fagos de progenie. Finalmente el gen de lisozima de fagos se activa resultando en la lisis de la célula hospedadora bacteriana y la liberación del fago de la progenie. Durante la década anterior, se han investigado los componentes claves esenciales para la lisis de hospedador por bacteriófagos. Se reconoce ahora que dos proteínas, una endolisina y una holina, son necesarias para que suceda la lisis del hospedador. Las endolisinas son enzimas muralíticas que se acumulan en el citosol, y las holinas son proteínas de membrana pequeñas que regulan el acceso de las endolisinas a la pared celular a través de la membrana citoplásmica (Wang et al. Ann. Rev. Microbiol. 54, 799-825 (2000)). La región de gen de lisis del bacteriófago lambda se clona en un plásmido multi-copia, pBH 20 bajo el control transcripcional del operador lac y la inducción de este "operón de lisis" conduce a un comportamiento Utico paralelo con aquel de las células infectadas por bacteriófagos (Garrett, J. et al. Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981) . Los dos genes de lisis cphl y cpll del bacteriófago de Streptococcal pneumoniae Cp-1, que codifica la holina y la lisina respectivamente, se han clonado y expresado en E. coli (Martin et al. J. Bacteriol . 180, 210 (1998)) . La expresión de la holina Cphl resulta en una muerte celular bacteriana pero no en la lisis . La expresión concomitante de la holina y la lisina del fago Cp-1 en E. coli resulta en una lisis celular. Además, el gen cphl puede complementar una mutación lambda Sam (que lleva una mutación ámbar en el gen de holina) en la cepa no supresora E. coli HB101 para liberar la progenie de fagos. La expresión regulada de los genes S y R de la lisis de fagos lambda provoca una lisis dramática de las células de serovar Typhimurium del Vibrio cholerae y la Salmonella entérica (Jain et al. Infect Immun, 68, 986 (2000) . La presente invención caracteriza bacterias que están incapacitadas (por ejemplo, que no pueden replicarse como para soportar una infección en un hospedador) , cuyas bacterias se incapacitan por infección con un bacteriófago especifico que carece de uno o más componentes del sistema de lisis del fago. El fago modificado entra al hospedador bacteriano, rompe las síntesis macromoleculares del hospedador, se replica en sí mismo pero no lisa al hospedador bacteriano. Las bacterias infectadas con fagos están incapacitadas y no pueden esparcir la infección, pero conservan los epítopos antigénicos en la superficie celular en una conformación esencialmente nativa y la configuración o expresa el antígeno como un cuerpo de inclusión o forma agregada, que luego se puede procesar por el sistema inmune por ejemplo, siguiendo la fagocitosis de la bacteria por un macrófago. Las bacterias infectadas con fagos tienen esencialmente la misma inmunogenicidad que el patógeno vivo y producen por lo tanto una respuesta inmune protectora contra el patógeno bacteriano. Las bacterias incapacitadas de la invención son asi útiles en por ejemplo, producir una respuesta inmune contra un antígeno de interés por ejemplo, para la producción de anticuerpos en un animal no humano, como una vacuna bacteriana de célula completa y similares . Los aspectos específicos de la invención se describirán ahora en mayor detalle.

Definiciones Por "bacteriófago" y "fago", términos los cuales se usan intercambiablemente en la presente, significa cualquiera de una diversidad de virus que tiene una afinidad específica e infectan bacterias. Estas incluyen así, colifagos, que infectan Escherichia coli (por ejemplo, el fago lambda y los fagos uniformes T, T2, T4, y T6) . Los fagos comprenden un recubrimiento de proteína o cápsida que encierra al material genético, ADN o ARN, que se inyecta en la bacteria con la infección. En el caso de los fagos virulentos, todas las síntesis del ADN, ARN hospedador y proteínas se suspende y se usa el genoma del fago para dirigir la síntesis de los ácidos nucleicos de fagos y las proteínas que utilizan el aparato de traducción y de transcripción del hospedador. Estos componentes del fago luego se autoensamblan para formar nuevas partículas de fago. La síntesis de la lisozima de fago conduce a la ruptura de una pared celular bacteriana que libera típicamente una progenie de 100-200 fagos. Los fagos templados, tales como lambda, pueden también mostrar este ciclo lítico cuando infectan una célula, pero más frecuentemente inducen la lisogenie en la cual el fago se integra en el ADN del hospedador bacteriano para persistir como un profago. En general el bacteriófago de interés en la invención son fagos líticos más que fagos templados. Por "fago Lys menos" o " bacteriófago Lys menos" , cuyos términos se usan intercambiablemente, significa un fago deficiente en la proteína de lisina. Los bacteriófagos Lys menos son incapaces de facilitar una lisis eficiente del hospedador bacterial ya que la actividad enzimática de la lisina del fago se necesita para la degradación enzimática de la capa de péptidoglicano de la pared celular bacterial. El bacteriófago Lys menos mantiene una actividad en la infección de su hospedador bacterial apropiado, destrucción del genoma bacterial, y replicación, que son suficientes para inhibir el crecimiento bacterial y la replicación. El fago Lys menos incluye aquellos generados por mutación o eliminación del gen que codifica la lisina del sistema de lisis de fago. El fago Lys menos, abarca el fago defectuoso en la lisina debido a la eliminación de todo o una porción del ácido nucleico que codifica la lisina, de manera que se produce lisina no detectable, o una forma truncada se produce, lo que tiene una actividad reducida para facilitar la lisis (por ejemplo, la lisina truncada no es efectiva para promover una lisis eficiente del hospedador bacterial o no facilita ninguna actividad de lisis mediada por lisina de tipo silvestre detectable) . El fago Lys menos también incluye aquellos en los cuales un ácido nucleico que codifica la lisina se enlaza de manera operativa a un promotor inducible de manera que se presenta la producción de lisina a un nivel efectivo para inducir la lisis sólo cuando está en presencia de un agente que activa el promotor inducible. Preferiblemente, el agente inductor es uno que normalmente no se encuentra en el hospedador a tratarse usando el fago, por ejemplo, el inductor es un agente que es endógeno al hospedador a tratarse. El fago Lys menos, también incluye un fago que produce la proteina de lisina modificada cuya lisina es defectuosa para promover la lisis bacterial debido a la presencia de una o más mutaciones. Tales mutaciones incluyen al menos una, o una combinación de una o más, eliminaciones, substituciones, adiciones o inserciones de ácido nucleico, que resultan en una alteración en la correspondiente secuencia de aminoácido de la proteína de lisina codificada. Asi, el fago Lys menos abarca generalmente fagos en los cuales el gen de lisina está completa o parcialmente eliminado para el gen de lisina o modificado de otra manera (por ejemplo, por adición, substitución o reemplazo de los nucleótidos codificadores) para suministrar una expresión substancialmente disminuida o ninguna expresión de la lisina funcional. El fago Lys menos también se puede reproducir al inhibir la función de la lisina en un hospedador a través de la expresión del ARN de interferencia (por ejemplo, antisentido) o la producción de péptidos inhibidores en la célula hospedadora, los cuales interfieren con el ARN o péptidos inhibidores se pueden producir por esas células (por ejemplo, a partir de una célula bacteriana hospedadora modificada genéticamente) o a partir de una ácido nucleico administrado con fagos. El fago deficiente en lisina ejemplar se describe en una solicitud provisional de E.U comúnmente en propiedad número de serie 60/325,803 presentada, el 27 de septiembre de 2001, y en una solicitud de E.U comúnmente en propiedad copendiente titulada "Bacteriófagos deficientes en lisina que tienen inmunogenicidad reducida" , archivo del abogado número GA G-001 presentado en la misma fecha que la solicitud actual, cada una de las solicitudes se incorporan específicamente como referencia aquí en su totalidad. Por "incapacitado" en el contexto de una célula bacteriana incapacitada producida de conformidad con la invención, significa que la célula bacteriana está en un estado de bacterioestasis irreversible. Aunque la bacteria conserva su estructura, y conserva así por ejemplo, la inmunogenicidad, antigenicidad y/o interacciones ligando-receptor asociadas con una bacteria de tipo silvestre, no puede replicarse debido a la presencia de un fago infeccioso dentro de la célula bacteriana. Por "aislado" significa que el material es al menos 60%, en peso libre de las proteínas y las moléculas orgánicas que se presentan naturalmente con las cuales se asocia de manera natural. Preferiblemente el material es al menos 75%, más preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente al menos 99%, en peso de material de interés. "Aislado" abarca de esta manera preparaciones que se enriquecen del material deseado.

Los términos "polinucleótidos" y "ácido nucleico" , usados intercambiablemente en la presente, se refieren a formas poliméricas de nucleó idos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos . De esta manera, los términos incluyen pero no se limitan a, ADN o AR de hebra múltiple, doble o sencilla, híbridos de ADN-ARN, ADNc, ADN genómico, o un polímero que comprende purina y bases de pirimidina u otras bases de nucleótido derivados, no naturales, químicamente o bioquímicamente modificadas, o naturales . Los términos "polipéptidos" y "proteína", usados intercambiablemente en la presente, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoácidos codificados y no codificados, modificados químicamente o bioquímicamente (por ejemplo, modificación post-traduccional tal como glicosilación) , o aminoácidos derivados, polipéptidos poliméricos, y polipéptidos que tienen estructuras de péptidos modificados. El término incluye proteínas de fusión, incluyendo pero no limitándose a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heterólogos, fusiones con secuencias líderes heterólogas y homologas, con o sin residuos de metionina de terminal N; proteínas etiquetadas inmunológicamente y similares. El término "polinucleótido recombinante" como se usa en la presente, pretende un polinucleótido de un origen genómico, ADNc, semisintético, o sintético el cual en virtud de su origen, o manipulación: (1) no está asociado con una o una porción del polinucleótido con el cual se asocia en la naturaleza, (2) se enlaza a un polinucleótido diferente al cual se enlaza a la naturaleza, o (3) no se presenta en la naturaleza . "Células hospedadoras recombinantes" , "células hospedadoras" , "células" , "líneas celulares" , "cultivos celulares" , y otros términos denotan microorganismos o células eucarióticas superiores cultivadas como identidades celulares con referencia a las células a las cuales pueden, o tienen, que usarse como receptores para el vector recombinante u otro ADN de transferencia e incluye la progenie de la célula original que se ha transíectado . Se entenderá que la progenie de una célula familiar sencilla puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología, o el complemento de ADN genómico o total, como su precursor original, debido a la naturaleza, mutación deliberada o accidental . "Enlazado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes de esta manera descritos están en una relación que permite que funcionen en su manera pretendida. Una secuencia de "control enlazado operablemente" a una secuencia de codificación se liga de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se realiza bajo condiciones compatibles con la secuencia de control . Una "estructura de lectura abierta" (ORF por sus siglas en inglés) es una región de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de la secuencia de codificación o una secuencia de codificación total. Una "secuencia de codificación" es una secuencia de polinucleótido que se transcribe en AR m y/o se traduce en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación ' se determinan por el codón de inicio de traducción en la terminación 5' y un codón de detención de traducción en la terminación 3 ' . Una secuencia de codificación puede incluir pero no se limita a ARNm, ADNc y secuencia de polinucleótido recombinantes . "Heterólogos" significa que los materiales se derivan de diferente fuente (por ejemplo, de diferentes genes, diferentes especies etc) . "Transformación" , como se usa en la presente se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora, sin tener en cuenta ' el método usado para la inserción, por ejemplo, absorción directa, transducción, marcado F o electroporación. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o alternativamente, puede integrarse en el genoma hospedador. Los términos "individual", "sujeto", "hospedador", y "paciente" , se usan intercambiablemente en la presente y se refiere a cualquier sujeto que tiene una infección bacterial que se puede tratar usando el bacteriófago terapéutico de la invención, y del cual se desea el tratamiento o terapia. Los sujetos mamíferos y pacientes, particularmente sujetos o pacientes humanos son de interés particular. Otros sujetos pueden incluir ganado perros, gatos, conejillos de indias, conejos, ratas, ratones, caballos y demás. Los términos "Tratamiento" , "tratado" y "tratar" y similares, se usan en la presente para referirse generalmente a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente una. enfermedad o síntoma del mismo, y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización parcial o completa o cura para una enfermedad y/o efecto o adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento" , como se usa en la presente cubre cualquier tratamiento de una enfermedad de un sujeto, particularmente un sujeto mamífero, más particularmente un humano e incluye, (a) prevenir la enfermedad o síntoma de que suceda en un sujeto, que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que no se ha diagnosticado todavía por tenerlo; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, esto es, suspender su desarrollo, a aliviar el síntoma de la enfermedad, esto es, provocar el regreso de la enfermedad o síntoma. Por "bacteria infecciosa" significa una bacteria que tiene una infección establecida en el hospedador, y que se puede asociar con una enfermedad o un síntoma indeseable como resultado. Generalmente las bacterias infecciosas son bacterias patogénicas . Por "bacterias resistentes a fármacos" o "bacterias resistentes a antibióticos" significa una cepa bacteriana que es resistente a inhibición el crecimiento o al exterminio por un antibiótico. Las bacterias resistentes a multifármacos son resistentes a dos o más antibióticos. La resistencia a fármacos puede abarcar por ejemplo, un exterminio ineficaz de la bacteria infecciosa, tal que al menos permanece una dosis infecciosa del sujeto y continua la infección, resultando en síntomas continuos de la enfermedad infecciosa asociada o una evidencia posterior de tales síntomas . También puede abarcar la resistencia a fármacos la inhibición del crecimiento de bacterias resistentes a fármacos hasta que tal terapia de tiempo se descontinúa, después de lo cual las bacterias comienzan a replicarse y además la enfermedad infecciosa. Por "inhibición de un crecimiento bacteriano" en el contexto de la infección de una célula bacteriana con un bacteriófago Lys menos, significa que después de la infección de las bacterias el bacteriófago inhibe o interfiere con los mecanismos de traducción y/o transcripción normales de la célula hospedadora bacteriana, tal que las bacterias infectadas no se someten a una división substancial celular (replicación) y se provoca que entre a un estado de bacteriostasis .

El término "inmunidad protectora" significa que una vacuna, composición inmunogénica, o programa de inmunización que se administra a un mamífero induce una respuesta inmune que previene, retarda el desarrollo de, o reduce la severidad de una enfermedad que se causa por una bacteria patogénica o disminuye o elimina por completo los síntomas de la enfermedad. La frase "una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en la preparación" significa que es una diferencia detectable entre un indicador de respuesta inmune medido antes y después de la administración de una preparación de vacuna particular o composición inmunogénica. Los indicadores de respuesta inmune incluyen, pero no se limitan a: titulación o especificidad de anticuerpo, como se detecta por un ensayo tal como el inmunoensayo enlazado a la enzima (ELISA) , ensayo bactericida, citometrla de flujo, inmunoprecipitación, inmunodifusión Ouchter-Lowny,- ensayos de detección de enlace de, por ejemplo, manchado, manchado Western o ensayos de antígeno; ensayos de citotoxicidad, etc. Los términos "composición bacterial inmunogénica", "composición inmunogénica" , y "vacuna" se usan intercambiablemente en la presente para significar una preparación capaz de obtener una respuesta inmune celular y/o humoral en un sujeto cuando se administre en una cantidad suficiente para erigir una respuesta inmune a los epítopos presentes en la preparación. Un "antígeno de superficie" es un antígeno que está presente en la estructura de superficie de una célula bacterial (por ejemplo, la membrana exterior, la membrana interior, el espacio periplásmico, cápsula, pilos, etc.). El término "inmunológicamente nativo" con respecto a un patógeno bacterial particular, significa un individuo (por ejemplo, un mamífero tal como un paciente humano) que nunca se ha expuesto (a través de la infección o administración) a un patógeno bacterial específico o una composición de antígeno derivada de tal bacteria en cantidades suficientes para erigir una inmunidad protectora, o si se ha expuesto falla para montar una respuesta inmune protectora. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupos de polipéptidos que comprenden al menos un sitio de combinación de anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpos" o "dominio de enlace" se forma a partir de la repetición de dominios variables de moléculas de anticuerpo para formas espacios de enlace tridimensionales con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementaria a las características de un epítopo de un antígeno, lo que permite una reacción inmunológica con el antígeno. Un sitio de combinación de anticuerpo puede formarse a partir de un dominio de cadena pesada y/o ligera (VH y VL, respectivamente) , que forma circuitos hipervariables que contribuyen al enlace del antígeno. El término "anticuerpo" incluye por ejemplo, anticuerpos vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, la proteínas Fab y anticuerpos de dominio sencillo. Un anticuerpo "anti-idiotipo" , se refiere a un tipo de anticuerpo que imita la estructura de un antígeno al cual otro anticuerpo es específico.

Bacteriófago para la producción del bacteriófago Lys menos para usarse en la producción de vacunas bacteriales incapacitadas Un fago Lys menos útil en la producción de una bacteria incapacitada, que a su vez son útiles en vacunas de la invención, pueden generarse de cualquier bacteriófago de tipo silvestre, preferiblemente de un fago lítico. De esta manera, los métodos y composiciones de la invención pueden aplicarse al desarrollo de cualesquiera de una variedad de bacteriófagos Lys menos que son específicos para cualesquiera de una variedad de bacterias, de esta manera son útiles en el tratamiento de una amplia variedad de infecciones bacteriales . Aunque está contemplado que la presente invención puede usarse para generar cualesquiera de una variedad de vacunas bacteriales de célula completa, cuyas vacunas pueden usarse profilácticamente o terapéuticamente, ya sea solas o en conjunto con otras terapias (adjuntas o de presentación única) para infecciones bacteriales. De interés particular es el desarrollo de vacunas para especies bacteriales clínicamente importantes, y cepas, particularmente especies y cepas bacteriales resistentes a fármacos. Los ejemplos de tales se enlistan a continuación. La American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, D) número de acceso para un bacteriófago de tipo silvestre ejemplar que infecta las cepas clínicamente relevantes correspondientes, se proporcionan a continuación las cepas infectadas. Tales fagos son ejemplares de aquellos que pueden modificarse para ser Lys menos para proporcionar el bacteriófago de conformidad con la invención. La lista es como sigue: 1. Todos los miembros clínicamente importantes de la familia Enterobacteriaceae, incluido pero no limitado a: a. Todas las cepas clínicamente importantes de Escherichia, con E.coli siendo de interés particular (ATCC fago #23723 -B2) ; b. Todas las cepas clínicamente importantes de Klebsiella, con K.pneumoniae (ATCC fago # 23356-B1) que es de particular interés . c. Todas las cepas clínicamente importantes de Shigella, con S. dysenteriae que son de particular interés (ATCC fago #11456a-Bl) . d. Todas las cepas clínicamente importantes de Salmonella incluyendo S. abortus-equi (ATCC fago #9842-?1) , S. t p i (ATCC fago #19937-B1) , S. t p ii7mrium (ATCC fago #19585-B1) , S, newport (ATCC fago #27869-?1) , S. paratyphi-A (ATCC fago #12176-B1) , S. paratyphi-B (ATCC fago #19940-B1) , S. potsdam (ATCC fago #259578-B2) , y S. pollurum (ATCC fago #19945-B1) . e. Todas las cepas clínicamente importantes de Serratia, más notablemente S. marcescens (Fago ATCC #14764-B1) . f. Todas las cepa clínicamente importantes de Yersinia, más notablemente Y. pestis (Fago ATCC #11953-B1) . g. Todas las cepas clínicamente importantes de Enterobacter, más notablemente E. cloacae (Fago ATCC #23355-Bl) ; 2. Todas las clínicamente importantes de Enterococcx, más notablemente E. faecalis (Fago ATCC #19948-B1) y E. faecium (Fago ATCC #19953-Bl) . 3. Todas las cepas clínicamente importantes de Haemophilus, más notablemente H. influenzae (el fago ejemplar se puede obtener de la Organización Mundial de la Salud (OMS) o de otros laboratorios que los hagan disponibles de forma pública) ; 4. Todos ¦ los Mycobacteria clínicamente importantes, más notablemente M. tuberculosis (Fago ATCC #25618-B1) , M avium-intracellulare, M bovis, y M leprae. (fago ejemplar comercialmente disponible de la OMS, por medio del Instituto Nacional de Salud Pública y Protección Ambiental, Bilthoven, Países Bajos) ; 5. Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis (fago ejemplar que se puede obtener de manera pública de la OMS y de otras fuentes) ; 6. Todas las Pseudomonads, clínicamente importantes con P. aeuruginosa siendo de interés en particular (Fago ATCC #14203-B1) ; 7. Todos los Staphylococci , clínicamente importantes con S. aureus (Fago ATCC#27690-B1) y S. epidermidis (fago ejemplar públicamente disponible a través de la OMS, por medio del instituto Colindale en Londres) que es de interés en particular; 8. Todos los Streptococci , clínicamente importantes siendo de particular interés S. pneumoniae (fago ejemplar que se puede obtener públicamente de la OMS o de otras fuentes) ; y 9. Vibrio cholera (fago #14100-B1) . Los patógenos bacterianos adicionales, demasiado numerosos para mencionarse aquí particularmente aquellos en los cuales se ha desarrollado una resistencia a fármacos, también pueden ser susceptibles a terapia de acuerdo con la presente invención. En resumen, todas las infecciones bacterianas provocadas por bacterias para las cuales hay un fago correspondiente actualmente disponible, o por la cual se puede identificar el fago, se pueden tratar usando la presente invención al hacer el fago correspondiente Lys menos, y poner en contacto las bacterias con el fago Lys menos . También se puede usar un fago novedoso en la presente invención. Tales fagos novedosos se aislan continuamente de desechos de hospitales y de otras fuentes por procedimientos estándar. Típicamente, 9 mi de una muestra de desechos se mezclan con un 1 mi de caldo 10X LB, 0.1 mi de caldo LB durante la noche, se agita el crecimiento del cultivo de una cepa bacteriana objetivo se agrega y se incuba durante la noche a 37°C. Se agrega cloroformo (0.1 mi) y se incuba a 37°C por 15 minutos con agitación a 300 rpm. Esto luego se centrífuga a 14, 000 rpm por 20 minutos @4C y el sobrenadante se almacena en tubos estériles Eppendorf . Estas preparaciones crudas de fagos se purifican y caracterizan además como se necesiten.

Lisinas de fagos La lisis de la célula bacteriana del hospedador por muchos tipos de bacterióf gos, depende de al menos 2 diferentes tipos de proteínas (Young et al. icrobiol. Rev. 56,430 (1992)). La degradación de la pared celular bacteriana se logra por las lisinas. Los ejemplos mejor estudiados son el producto de gen T4 e, una lisozima (Tsugita et al. J. Biol. Chem. 243,391 (1968)) y la proteína lambda R, una transglicosilasa (Garrett et al. Mol. Gen. Genet . 182,326 (1981) ) . Se han identificado los genes de lisina de un gran número de bacteriófagos y se han caracterizado en la década pasada. Estos incluyen las lisinas del bacteriófago T7 (Inouye et al. Biol. Chem. 248,7247 (1973), gp 19 del fago P22 de Salmonella typhimurium (Rennell et al. Virol . 143,280 (1985) , phi 29 gp 15 de 2 fagos de las bacterias gram-positivo Lactococcus lactis y Bacillus subtilis (Garvey et al. Nucleic Acids Res. 14,10001 (1986)), el bacteriófago del pneumococo Cp-1 (García et al. J. 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Generación de los fagos imitantes Lys Menos El fago Lys menos se pueden generar en cualquiera de una diversidad de formas consistentes con el suministro de un fago defectuoso en la lisis de conformidad con la invención. Preferiblemente, el fago Lys menos se genera al modificar el genoma del bacteriófago de manera que el bacteriófago es deficiente en la protelna de lisina de tipo silvestre (Lys) o de manera que el bacteriófago contiene un gen de lisina funcional ligado operativamente a un promotor inducible. Alternativamente, el bacteriófago tiene niveles reducidos de lisina, y así velocidades reducidas de lisis, se puede seleccionar al separar por exclusión el fago que infecta las bacterias e inhibe la aplicación del hospedador bacteriano, pero que tiene tasas reducidas de lisis, por ejemplo, el bacteriófago actúa como agente bacteriostático del hospedador bacteriano, pero no lisa la célula hospedadora bacteriana a un velocidad o nivel asociado con un fago de tipo silvestre que no es deficiente en el sistema de lisis de fagos. Los bacteriófagos deficientes en la proteina de lisina (fagos "Lys menos"), incluyen aquellos generados por la mutación o eliminación del gen que codifica la lisina del sistema de lisis de fagos. El fago ¾Lys menos" abarca fagos defectuosos en lisina debido a la eliminación de toda o de una porción del ácido nucleico que codifica la lisina, de manera que no se produce ninguna lisina detectable, o se produce una forma truncada de lisina que tiene una actividad disminuida al facilitar la lisis (por ejemplo, la lisina truncada es ineficiente en promover una lisis eficiente del hospedador bacteriano, o no facilita ninguna actividad de lisis mediada por la lisina de tipo silvestre detectable) . El fago "Lys menos" también incluye el fago que produce una proteína de lisina modificada, cuya lisina es defectuosa en la promoción de la lisis bacteriana debido a la presencia de una o más mutaciones. Tales mutaciones incluyen al menos una, o alguna combinación de una o más eliminaciones, substituciones, adiciones o inserciones de ácidos nucleicos, que resultan en una alteración en la secuencia correspondiente de aminoácidos de la proteína codificada de lisina . El fago Lys menos también incluye aquellos en los cuales el gen que codifica la lisina se ha modificado de manera tal que el gen se liga operativamente a un promotor inducible de manera que la lisina se produce solamente cuando el fago hace contacto con un agente o condición ambiental (tal como temperatura, metales, sales, iones, nutrientes, fármacos, etc.) que activa al promotor inducible. Tal fago Lys menos puede producirse al modificar el gen de lisina de tipo silvestre, para que incluye un promotor inducible, al reemplazar el gen de lisina con un ácido nucleico codificador de lisina, ligado operativamente a un promotor de inducción, o al mutar o eliminar el gen que codifica lisina e insertarlo en el fago un ácido nucleico que codifica lisina, ligado operativamente a un promotor de inducción. Se puede generar el bacteriófago que tiene una lisina defectuosa usando métodos microbiológicos clásicos, tales como ensayos de morfología de placas (ver por ejemplo, Streisinger et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol . 26,25 (1961) ) . También se puede generar el fago Lys menos, usando técnicas recombinantes tal como la mutagénesis dirigida al sitio (Smith Ann. Rev. Genet . 19, 423 (1985)), por ejemplo, usando técnicas de amplificación de ácido nucleico tal como PCR (Zhao et al. Methods Enzymol . 217, 218(1993)) para introducir eliminaciones sencillas, inserciones y mutaciones de punto. Otros métodos para la mutagénesis de eliminación involucran por ejemplo el uso de la nucleasa BAL31, que acorta progresivamente un fragmento de ADN de hebra doble desde las terminaciones 5' y 3', o la exonucleasa III, que digiere el ADN objetivo de la terminación 3' (ver por ejemplo, Henikoff Gene 28,351 (1S84) ) . El grado de digestión en ambos casos, está controlado por el tiempo de incubación o la temperatura de reacción o ambos. Se pueden introducir mutaciones de punto por el tratamiento con mutagenos tal como bisulfito de sodio, que desamina la desoxicitidina a desoxiuridina lo que resulta en la. substitución de un par base A:T por un par base G:C en aproximadamente 50% de las molécula de plantilla después de una ronda de replicación (Botstein et al. Science 229,1193 (1985)). Otros métodos ejemplares para introducir mutaciones de punto, involucran la incorporación enzimática de análogos de nucleótido o la mala incorporación de nucleotidos normales o alfa-tionucleótidos por polimerasa de ADN (Shortle et al. Proc. Nati. Acad. Sci . USA 79,1588 (1982)). En la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos , se clona el ADN objetivo en un vector 13 para producir una plantilla de ADN de tipo silvestre de hebra sencilla, a la cual se combinan los pares bases, del mutágeno oligo. Esto produce una región no complementaria (en circuito) en el cebador oligo o sobre la plantilla, lo que resulta en una inserción o eliminación respectivamente. La no coincidencia de pares base entre la plantilla y el cebador resulta en una mutagénesis de punto. Los métodos de mutagénesis basados en PCR (u otros métodos de mutagénesis basados en técnicas de amplificación de ácidos nucleicos) , se prefieren generalmente ya que son simples y más rápidos que las técnicas clásicas antes descritas (Higuchi et al. Nucleic Acids Res. 16,7351(1988); Vallette et al. Nucleic Acids Res. 17,723(1989)). Se pueden identificar bacteriófagos defectuosos en lisinas, al separar por exclusión un fago candidato mediante por ejemplo, la comparación de la capacidad del fago candidato para lisar un hospedador bacteriano de tipo silvestre, a la capacidad del fago candidato para lisar un hospedador bacteriano recombinante, modificado para expresar la proteína de lisina (por ejemplo, por un fago de ayuda, a partir de un plásmido de ayuda introducido que codifique la lisina del fago, o a partir de una secuencia codificadora de lisina de una fago recombinante, integrado en el genoma del hospedador bacteriano) . El fago candidato que lisa el hospedador bacteriano que expresa la lisina, pero que falla al efectuar o no efectúa eficientemente, la lisis del hospedador bacteriano de tipo silvestre, representa un fago ejemplar Lys menos adecuado para su uso en la invención. Un método de particular interés para generar los fagos Lys menos que carecen totalmente de la actividad de lisozima del gen de lisina, es eliminar la primera región conservada que contiene el sitio catalítico y la hendidura del sitio activo. Con base en la secuencia de nucleótidos de la lisina, los productos pos PCR de la región conservada I, se generan y transforman en el hospedador bacteriano adecuado junto con el fago de tipo silvestre. Un marcador de selección, tal como la proteína fluorescente verde de medusas (GFP; Chalfie, M. et al, Science 263, 802, 1994), se puede usar en lugar de un marcador de resistencia al antibiótico. Los marcadores de resistencia al antibiótico pueden ser indeseables en donde el fago puede estar dentro de la vacuna en cierto nivel (por ejemplo, como un contaminante) . Las réplicas de las bacterias de resistencia (para evitar la mutagénesis UV) luego se separan por exclusión bajo luz UV para aquellas que expresan GFP.

Producción de los fagos Lys menos usando técnicas de rescate del marcador En otra modalidad, el fago Lys menos que tiene un defecto deseado en el gen de lisina, se genera usando técnicas de rescate del marcador. La técnica de rescate del marcador se ha utilizado ampliamente para mapear mutaciones en los fagos, y para transferir mutaciones generadas artificialmente de los genes de los fagos clonados en un plásmido al genoma de los fagos (Volker et al. Mol. Gen. Genet . 177,447(1980)). Un ejemplo del uso de esta técnica, es la aplicación para identificar genes involucrados en el ensamble y maduración del fago T4. Específicamente, los fragmentos de restricción que contienen el ensamble del fago T4 y los genes de maduración 20 a 22 se clonaron en plásmidos, hicieron mutagénesis y luego se recombinaron las mutaciones de vuelta en el genoma del fago por infección de E. coli que lleva el plásmido con un imitante doble T4 20/21 am (ámbar) (Volker, supra, 1980) . La progenie del fago que se habla sometido a la recombinación con el plásmido, se seleccionó por formación de placas en un hospedador su" (que carece de un supresor ámbar) permitiendo la selección del fago recombinante . Estos fagos am+ luego se separaron por exclusión de forma no selectiva para la mutaciones sensibles a temperaturas deseadas en los genes 20 y 21. Se puede emplear una estrategia similar para el gen de lisina. El gen de lisina mutante (ya sea un gen de lisina no funcional o un gen de lisina funcional ligado operativamente a un promotor inducible) , que se puede generar usando técnicas recombinantes antes descritas, se clonan en un plásmido que tiene un marcador de selección, por ejemplo de resistencia a ampicilina . Dos tipos de hospedadores bacterianos que contienen plásmidos con genes de lisina mutante o de tipo silvestre (hospedador de lisina WT) (hospedador de lisina mutante) se usan. Se usa la cepa anterior que contiene el gen de lisina de tipo silvestre, como la cepa de ayuda para producción a gran escala del fago mutante Lys menos, en donde el fago Lys menos es uno que carece de un gen de lisina de inducción. La cepa posterior que contiene el gen de lisina mutante, se usa para introducir la mutaciones Lys en el fago de tipo silvestre. La figura 1 proporciona una esquema de una célula ospedadora bacteriana que tiene un gen de lisina mutante útil para la generación del fago Lys menos de la invención. Los hospedadores bacterianos que expresan la lisina mutante recombinante , para la producción de los fagos Lys menos (como se ilustra en la figura 1) se pueden generar por el uso de métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las secuencias de la regiones que flanquean el gen de lisina (alrededor de 100 pares base en cada lado) en cada uno de los fagos a ser mutados se aislan. Generalmente, al menos alrededor de una homología de 50 pb se suministra a cada lado, flanqueando la región de interés que codifica el gen de lisina de fagos (Singer (1982) Cell, 31: 25-33). Los ADN que corresponden a la regiones en dirección ascendente y descendente de cada gen del fago de lisina se aislan por amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) y se clonan en un plásmido que tiene un primer marcador de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina) con un sitio de restricción adecuado entre las dos regiones para la inserción de un cásete de ADN en el cual un marcador de selección segundo (por ejemplo GFP) se expresa de un promotor temprano del mismo fago. Este plásmido se introduce en células hospedadoras bacterianas adecuadas por transformación y selección del primer marcador de selección (ejemplificado aquí por la resistencia ampicilina) . Se muestra un plásmido ejemplar con un gen de lisina mutante útil en esta técnica en la figura 1. Alternativamente el constructo del plásmido se puede integrar genómicamente en el ADN genómico del hospedador bacteriano. El hospedador bacteriano que aloja al gen de lisina mutante, se infecta con un fago de tipo silvestre a una baja multiplicidad de infección. Cuando se replica el fago, alguno de los fagos se recombinan por un evento doble de cruce con el gen de lisina mutante en el hospedador bacteriano, para producir el fago Lys menos. Ya que es probable que la recombinación en cualquier célula no se ha 100% eficiente, puede haber un fago de tipo silvestre en las mismas células como en el fago Lys menos. El virus de tipo silvestre actuará como un virus de ayuda para provocar la lisis de las células infectadas ya sea que suceda o no la recombinación.

Los dos tipos de virus se recolectan al lisar las células bacterianas con cloroformo, y el fago Lys menos se purifica del virus del tipo silvestre por purificación de placas. El virus de cada placa luego se prueba para ver si es de tipo silvestre o de Lys menos. La prueba para identificar el fago Lys menos se puede lograr mediante por ejemplo, examinar la capacidad del fago de cada placa para infectar y exterminar dos tipos de células hospedadoras cuando se detectan por la formación de placas. Un tipo de célula hospedadora es la bacteria hospedadora normal (de tipo silvestre) , el otro es la bacteria hospedadora de lisina de tipo silvestre antes descrita. El fago de tipo silvestre lisará efectivamente y exterminará ambos tipos de hospedadores , mientras que el fago Lys menos extermina -solamente las células hospedadoras que expresan lisina. En donde el fago Lys menos expresa un marcador de detección (por ejemplo, GFP) , y particularmente en donde el marcador de selección se expresa a partir de un promotor temprano viral, se pueden visualizar directamente las placas fluorescentes que representan el fago Lys menos durante la purificación de placas. El fenotipo Lys menos de estos fagos puede luego confirmarse mediante separación por exclusión como se describe arriba.

Generación de la lisina de tipo silvestre en el hospedador para producción de escalamiento del fago Lys menos Los fagos Lys menos se pueden replicar y ensamblar en sus bacterias hospedadoras pero por definición, no podrán lisar al hospedador y liberar de manera eficiente los fagos de la progenie. Para la producción de los fagos terapéuticos Lys menos, es esencial la liberación de los fagos modificados del hospedador bacteriano . En donde el fago Lys menos es uno en el cual gen de lisina está bajo control de un promotor inducible, se puede lograr la lisis del hospedador bacteriano al poner en contacto el fago con un agente que active al promotor de inducción, con lo cual se induce la producción de lisina y la lisis consecuente de la células de bacteria del hospedador . La lisis de las bacterias del hospedador y la liberación del fago Lys menos también se puede lograr al introducir un plásmido de ayuda que lleve un gen de lisina bajo un promotor de inducción en un hospedador bacteriano. Los estudios previos han demostrado que la expresión de los genes de lisis del fago lambda en E.coli resultan en una lisis uniformemente definida (Garrett et al. Mol. Gen. Genet . 182, 326,1981). Recientemente los productos del gen S y R de fago lambda (holina y lisina respectivamente) se ha usado en un sistema de lisis inducible (Jain et al. Infection & Immunity £8, 986, 2000) . Así se pueden producir grandes cantidades de los fagos Lys menos en hospedadores adecuados que contiene un plásmido de ayuda que lleva un gen de lisina que codifica la lisosima altamente potente (por ejemplo, la lisosima T4) bajo un promotor de inducción. Los genes de lisina de cualquiera de los fagos formados en secuencia se pueden aislar por técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) y clonarse en un plásmido que tiene marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos tal como resistencia a la ampicilina) de manera que se expresa a partir de un promotor de inducción utilizando procedimientos estándar de ADN recombinantes . El gen de lisina escogido será al menos con la menor cantidad de homología con el gen de lisina del fago, para evitar la recombinación entre el fago Lys menos y el gen de lisina en la cepa del hospedador para producir recombinantes de tipo silvestre. La eficacia de la producción de solamente los fagos Lys menos se prueba y confirma que el inventario de fagos Lys menos no produce placas en una cepa del hospedador que carece del gen de lisina. Si es necesario, se puede usar una diversidad de cepas de hospedador ayuda que expresa lisina de fuentes diferentes y promotores de inducción, para encontrar empíricamente la cepa hospedadora adecuada que produce el nivel más bajo de recombinantes de tipo silvestre.

Estrategias Alternativas para Producción de Bacteriófagos Defectuosos en la Lisis. Los bacteriófagos defectuosos en la lisis de la invención, abarcan no solamente el fago que tiene un gen de lisina defectuoso, sino también el fago que es defectuoso en la maquinaria de lisis debido a defectos diferentes al gen Lys o además del gen Lys . Por ejemplo, más que ser defectuoso solamente en el gen de lisina, se pueden eliminar o alterar el gen de lisina y el gen de holina para no ser funcionales en el fago y el sistema de lisis. Tales fagos defectuosos se puede producir para expresar los componentes faltantes o defectuosos de lisis en un plásmido de ayuda en un hospedador bacteriano. Martin et al. (J, Bacteriol . 180,210 (1998) ha demostrado que la expresión conconmitante de holina y lisina del fago de neumococos Cp-1 en E.coli resulta en una lisis celular. Se pueden usar estrategias similares antes descritas para evitar la generación del fago de tipo silvestre por recombinación durante la fase de producción. Ya que las holinas son las proteínas que cubren membranas que permiten que las lisinas de fagos tengan acceso a la mureína de pared celular bacteriana, la eliminación o activación del gen de holina solo, también es suficiente para generar los bacteriófagos terapéuticos que carecen de un potencial de respuesta inmune. Dependiendo de la estructura y propiedades del fago específico, la eliminación o inactivación del gen de lisina, el gen de holina o ambos se puede emplear para generar el fago terapéutico deseado. Cualquier cepa de fago que pueda facilitar un daño directo o indirecto a bacterias (o a otros patógenos) (por ejemplo al inhibir o interferir con la transcripción y/o traducción del ADN bacteriano (por ejemplo a través de la competencia del ADN de fago para la misma maquinaria de células hospedadoras) , que inhibe la replicación bacteriana y similares) se contempla como útil en la presente invención. Estos fagos que son Uticos y los fagos que son lisogénicos pero pueden después convertirse en líticos se pueden adaptar para su uso en la presente invención.

Patógenos bacteriales para los cuales pueden generarse las vacunas de célula completa incapacitadas de conformidad con la invención Cualesquiera de una variedad de bacterias patogénicas puede usarse para generar una vacuna bacterial de célula completa, incapacitada,- de conformidad con la invención. Los patógenos bacteriales ejemplares son aquellos descritos arriba junto con sus correspondientes bacteriófagos (donde se conocen) . Además, el bacteriófago Lys menos pueden usarse para crear vacunas bacteriales de célula completa incapacitadas, usando bacterias que son producidas genéticamente con ingeniería para expresar una proteína heteróloga o para sobreexpresar una proteína endógena. Por ejemplo, las bacterias pueden modificarse genéticamente para expresar uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas de interés, particularmente, moléculas que erigen o aumentan una respuesta inmune protectora, por ejemplo, antígenos recombinantes . De interés particular son los fragmentos antigénicos de tales moléculas, por' ejemplo, epítopos . Los ácidos nucleicos pueden por ejemplo, codificar toda o parte de una proteína de membrana exterior, pilina, flagelo, u otra proteína que está implicada en erigir una respuesta inmune protectora. Cualquier secuencia de ADN que codifica una molécula antigénica, o fragmento de los mismos, (por ejemplo, epítopo) ya sea, un organismo heterólogo o endógeno, que cuando se expresa en una bacteria produce una inmunidad protectora contra el organismo o contra una condición o trastorno causado con el organismo, pueden aislarse para usarse en las preparaciones de vacuna de la presente invención. En una modalidad, el antigeno es un antígeno de superficie. En otra modalidad el organismo es un microorganismo patogénico. Todavía en otra modalidad, la molécula antigénica o fragmento de la misma, es característica del cáncer y proporciona una inmunidad protectora contra el cáncer o erige una respuesta inmune contra el cáncer lo que resulta en la reducción o eliminación del cáncer de un sujeto. Moléculas antigénicas, o fragmentos de las mismas, pueden encontrarse en patógenos, tales como bacterias, parásitos, virus, u hongos. Las bacterias, parásitos, virus y hongos de interés incluyen pero no se limitan a, aquellos enlistados en la tabla a continuació .

Parásitos Bacteria Especies Plasmodium por Especies Vibrio (por ejemplo, V. Cholerae) ejemplo, P. falciparum, P. Especies Neisseria (por ejemplo, N vivax, P. ovale, P malariae) roenigitidis, N. Gonorroeae) Especies Eittieria Corynebacteria diptheriae Especies Scistosoma Clostridium tetará Especies Tripanosoma Brarihamella catarrhalis Especies Babesia Bordetella pertussis Especies I_eisnmania Especies Haemophilus (por ejemplo, H.

Especies Cryptosporidia influenzae) Especies Toxoplasma Especies Chlamydia Especies Pneumocystis. Especies Escherichia (por ejemplo, E. coli) Bacillus anthracis Borrelia burgdorferi Especies Shigella (por ejemplo. S. dysenteriae) Especies Pseudomona (por ejemplo, P. aeuruginosa) Especies Enterococcus (por ejemplo, E. faecalis, E. faecium) Especies Streptococcus (por ejemplo S. pneumoniae) Especies Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus, S. epidermidis Especies Salmonella (por ejemplo S. abortus- equi, S. typhi, S. l¾)himurium, S. newport, S. paratyphl-A, S. paratyphi B, S. potsdam, y S. pollurum) Especies Serratia (por ejemplo S. marcescens) Klebsiella spp. (por ejemplo, K. pneumoniae) Yersini spp. (por ejemplo, Y. pestis) Enterobacter spp. (por ejemplo, E. cloacae) Serratia spp. Mycobacterium spp. (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium-intracellulare, M. bovis, M. leprae) Rickettsia spp. (por ejemplo, R. prowazekii, R. typhi, R. rickettsii) Rochalimaea quintana Coxiella burnetii Hongos Virus Especies Candida (por Virus de inmunodeficiencia humana, ejemplo, C. albicans) tipo I Especies Cryptococcus Virus de inmunodeficiencia humana, (por ejemplo, C. tipo II neoformans) Virus de inmunodeficiencia de Especies Blastomyces simios (por ejemplo, B. Virus de linfocito T humano, tipo dermatitidis) I, II y III Especies Histoplasma Virus sinscitial respiratorio (por ejemplo, H. Virus de la hepatitis A capsulatum) Virus de la hepatitis B Especies Coccidioides Virus de la hepatitis C (por ejemplo, C immitis) Virus de la hepatitis no A, no B Especies Virus de la herpes simplex, tipo I Paracoccidioides (por Virus de la herpes simplex, tipo II ejemplo, P. Citomegalovirus brasiliensis) Virus de la influenza Especies Aspergillus Virus de la para influenza Virus de la polio virus de la viruela Rotavirus Coronavirus Virus de la rubéola Virus del sarampión Virus de las paperas Varicela Virus Epstein Barr Adenovirus Virus del papiloma Flaviviridae (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus de la fiebre del dengue, virus de la encafilitis japonesa Además, las molécula antigénicas de células de cáncer pueden usarse. Los antígenos característicos de células de cáncer y útiles en preparaciones de vacuna de la presente invención incluyen, pero no se limitan a MAGE, MUC1, HER2/neu, CEA, pS3 , tirosinasa, MART-l/melan A, gp 100, TRP-1, TRP-2, PSA, CDK4-R24C, BCR/ABL, K-ras mutada ESO-1, CAI5-3, CA125, CA19-9, CA27.29, TPA, TPS , citoceratina 18, y p53 mutada . Donde los antígenos no se han identificado aún, los antígenos potencialmente útiles para formulaciones de vacuna pueden identificarse por varios criterios, tales como el involucramiento del antígeno en la neutralización de la infección por patógenos (Norrby, E . , 1985, ' Summary, en Bacines 85, Lerner, R. A., R. M. Chanock, and F. Brown (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., pp. 388-389), tipo o grupo de especificidad, reconocimiento por las células inmunes o antisuero del paciente, y/o la demostración de efecto protectores del anti suero o células inmunes específicas para el antígeno. Las moléculas inmunoreactivas pueden identificarse y caracterizarse por métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse a la superficie u otras moléculas de un patógeno para identificar aquellos que son capaces de reconocerse por los anticuerpos. Alternativamente, los péptidos sintéticos pequeños conjugados a moléculas portadoras pueden probarse para la generación de anticuerpos monoclonales que se enlazan a los sitios correspondientes al péptido en la molécula intacta (ver por ejemplo, Wilson, I. A., et al., 1984, Cell 37:767). Las bacterias producidas genéticamente por ingeniería útiles en la invención pueden emplearse al emplear tecnología de ADN recombinante . Una secuencia de nucleótido que codifica una molécula antigénica de interés se inserta en un vector de expresión, transformado o transfectado en una célula (hospedadora bacteriana apropiada y cultivada bajo condiciones apropiadas para la expresión. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se describen generalmente en Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . La secuencia de nucleótidos que codifica una molécula antigénica también pueden fusionarse con un ácido nucleico, bacterial o de otra manera, para facilitar la expresión y/o donde se desea, facilita la presentación del polipéptido antigénico expresado en la superficie de la celular de la bacteria producida genéticamente por ingeniería (Cattozzo et al., J. Biotechnol 56,191 (1997), Stocker and Newton, Int. Rev. Immunol . 11, 167 (1994), Stocker, Res. Microbiol . 141,787 (1990), Newton et al., Science 244,70 (1989), USPN 6,130,082)). Por ejemplo, Newton et al. (Res. Microbiol. 146,203 (1995)) fusiona un epítopo de VIHl gp41, que es parte de la proteína gpl60, a un gen de flagelo de Salmonella en la orientación correcta y estructura abierta. El plásmido se coloca en la cepa de Salmonella, de vacuna viva de flagelina negativa, que se hace entonces una proteína con la secuencia de epitopo de VIHl externo integrada a este. Ratones inmunizados con la vacuna viva de la Salmonella recombinante muestra la producción de un anticuerpo con afinidad para gpl60. La secuencia de nucleótidos que codifica una molécula antigénica también pueden fusionarse con un ácido nucleico, bacterial o de otra manera, para facilitar la presentación del polipéptido antigénico expresado en la superficie de la celular de la bacteria producida genéticamente por ingeniería (Cattozzo et al., J. Biotechnol 56,191 (1997), Stocker and Newton, Int. Rev. Immunol . 11,167 (1994), Stocker, Res. Microbiol. 141,787 (1990), Newton et al., Science 244,70 (1989), USPN 6,130,082)). Por ejemplo, Newton et al. (Res. Microbiol. 146,203 (1995)) fusiona un epítopo de VIHl gp41, que es parte de la proteína gpl60, a un gen de flagelo de Salmonella en la orientación correcta y estructura abierta. El plásmido se coloca en la cepa de Salmonella, de vacuna viva de flagelina negativa, que se hace entonces una proteína con la secuencia de epítopo de VIHl externo integrada a este. Ratones inmunizados con la vacuna viva de la Salmonella recombinante muestra la producción de un anticuerpo con afinidad para gpl60. La inmunopotencia de la molécula inmunogénica expresada por la bacteria producida genéticamente por ingeniería es una preparación de vacuna de célula completa, incapacitada, puede determinarse al observar la respuesta inmune de animales de prueba después de la inmunización con la bacteria que expresa el antígeno recombinante. Los animales de prueba pueden incluir ratones conejillos de indias, conejos, pollos, chimpancés y otros primates, y eventualmente sujetos humanos. Los métodos de introducción de la bacteria recombinante incapacitada pueden incluir oral, intradermal , intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, intra nasal, o cualquier otra ruta estándar de inmunización. La respuesta inmune de los sujetos de prueba puede analizarse por varios enfoques tales como: (a) la radioactividad del suero inmune resultante al antígeno nativo o un fragmento del mismo, o para el organismo que se presentan naturalmente aislado (por ejemplo, organismo de tipo silvestre) del cual se deriva la molécula antigénica de prueba, como se ensaya por técnicas conocidas, por ejemplo ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) , inmunomanchado, radioinmuno precipitaciones, etc., (b) la reactividad de los linfocitos aislados del sujeto inmunizado para el antígeno nativo fragmentos del mismo, o el organismo que se presenta naturalmente del cual se deriva la molécula antigénica de prueba, como se ensaya por técnicas conocidas, por ejemplo, ensayos de respuesta blastogénica, ensayos de citotoxicidad, hipersensibilidad de tipo retardado, etc. (c) la capacidad del suero inmune para neutralizar la infección del organismo in vitro o la actividad biológica del antígeno nativo, y (d) la protección de la enfermedad y/o mitigación de síntomas infecciosos en animales inmunizados.

Uso de la bacteria inactivada para la producción de anticuerpos Para la producción de anticuerpos con una molécula antigénica expresada por un bacteria, cuya bacteria puede producirse genéticamente por ingeniería ara expresar una proteína heteróloga o para sobre expresar una proteína endógena puede inmunizarse varios animales hospedadores por inyección con una composición inmunogénica de célula completa incapacitada que comprende la bacteria incapacitada para infección con un fago defectuoso en lisis. Tales animales hospedadores pueden incluir, pero no se limitan a conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos. Pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospedadoras , incluyendo pero no limitándose a Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias de superficie activa tal como lisolectina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, hemocianina de una especie de lapa, dihidrofenol , y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivados de los sueros de animales inmunizados con el antigeno. Para la producción de anticuerpo policlonales, los animales hospedadores tales como aquellos descritos arriba, pueden inmunizarse con una inyección por una composición bacterial de célula completa incapacitada de la invención. La composición puede complementarse con adyuvantes. La titulación de anticuerpo en el sujeto inmunizado pueden observarse durante el tiempo por técnicas estándar, tales como con un ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) usando un polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo pueden aislarse del mamífero (por ejemplo, el mamífero de la sangre) y purificarse además por técnicas bien conocidas, tales como cromatografí de proteína A para obtener la fracción IgG. Los anticuerpos específicos para un antígeno, o fragmento del mismo, particularmente, para una molécula antigénica recombinante expresada por una bacteria producida genéticamente por ingeniería, pueden seleccionarse para (por ejemplo, parcialmente purificada) o purificada por, por ejemplo, cromatografía de afinidad. Por ejemplo, un antígeno de proteína recombinantemente expresado y purificado (o parcialmente purificado) se produce en una bacteria producida genéticamente por ingeniería como se describe en la presente, y se acopla covalentemente o no covalentemente a un soporte sólido tal como, una columna de cromatografía. La columna puede entonces usarse para purificar por afinidad anticuerpos específicos para las proteínas de una muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran número de diferentes epítopos, por ello generando una composición de anticuerpos substancialmente purificada, esto es, una que esta substancialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por una composición de cuerpos substancialmente purificada, significa, en este contexto, que la muestra de anticuerpo contiene como máximo solo 30% (por peso seco) de los anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopos diferentes a aquellos en la proteína deseada o polipéptido de interés, y preferiblemente, como máximo 20%, aun más preferiblemente como máximo 10% y más preferiblemente como máximo 5% (por peso seco) de la muestra es anticuerpos contaminantes. Una composición de anticuerpo purificada significa que al menos 99% de los anticuerpos en la composición se dirigen contra la proteína o polipéptido antigénico deseado . Los anticuerpo monoclonales , que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno en particular, pueden obtenerse por cualquier técnica que proporciona la producción de anticuerpos por, por ejemplo, líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen pero no se limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y ilstein, (1975, Nature 256, 495-497; y patente de E.U.A. No. 4,376,110), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72; Colé et al., 1983, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), y la técnica de hibridoma-EBV (Colé et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cuales quiera de las sub-clases de las mismas. El hibridoma que produce el mAb deseado puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de altas concentraciones de mAbs in vivo hace esto el método de producción actualmente preferido.

Usos de anticuerpos dirigidos contra la bacteria inactivada.

Los anticuerpos generados contra la composición bacterial inmunogénica de células completa ' incapacitada de la invención tiene usos potenciales en inmunoensayos de diagnostico, inmunoterapia pasiva, y generación de anticuerpos antiidiotípicos . En una modalidad, la composición usada para generar los anticuerpos comprende bacterias producidas genéticamente por ingeniería para expresar una proteina heteróloga o para sobreexpresar una proteína endógena . Los anticuerpos generados pueden aislarse por técnicas estándar conocidas en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc) y usarse en inmunoensayo de diagnostico para detectar la presencia de células o virus cancerosos, bacterias hongos o parásitos e importancia médica o veterinaria en tejidos humanos o animales, sangre suero etc. Los anticuerpos también pueden usarse para observar el proceso de tratamiento y/o enfermedad. Cuales quiera de los sistemas inmunoensayo conocidos en la técnica, tales como aquellos enlistados en la presente, pueden usarse para este propósito incluyen pero no se limitan a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivo que usan técnicas tales como radio inmunnoensayos , ELISA (ensayos inmunoabsorbentes enlazados a la enzima) , inmunoensayos "intercalado" , reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión de gen ensayo de inmundifusión, ensayo de aglutinación, ensayos de fijación ensayos de complemento, ensayo de inmunoradiometrico, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína y ensayos de electroforesis , etc, en donde tales inmunoensayos se conocen en la técnica.

Las preparaciones de vacuna de la presente invención también pueden usarse para producir anticuerpos para usarse en la inmunoterapia pasiva, en los cuales la protección de corto plazo de un hospedador se realiza por la administración de un anticuerpo o preformado dirigido contra un organismo heterólogo . Los anticuerpos generados por las preparaciones de vacuna de la presente invención también pueden usarse en la producción de anticuerpo antiidiotípico . El anticuerpo antiidiotípico pueden entonces a su vez, usarse para inmunización, con objeto de producir una subpoblación de anticuerpos que se enlacen al antígeno inicial del microorganismo patogénico (Jerne, N, K. , 1974, Ann. Iramunol . (París) 125c:373; Jerne, N.K., et al., 1982. EMBO 1:234).

Formulaciones, rutas de administración y dosis. Las vacunas de la invención pueden formularse de cualquier manera apropiada. En general las vacunas de la invención pueden administrarse oralmente, nasalmente, nasofaringealmente , parenteralmente , entéricamente, gástricamente, tópicamente, transdermalmente, subcutáneamente, intramuscularmente , en tableta, sólido, polvos, liquido forma de aerosol localmente o sistétnicamente, con o sin excipientes agregados . En métodos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrabies son bien conocidos o aparentes por aquellos expertos en la técnica y se describen en más detalle en publicaciones tales como Remingtons Pharmaceutical Science, 15tb ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pennylvania (1980) . Se reconoce que los polipéptidos y compuestos relacionados descritos arriba cuando se administran oralmente deberán protegerse de la digestión. Esto puede realizarse ya sea al mezclar o empacar la bacteria incapacitada en un portador apropiado altamente resistente tal como una liposoma. Las preparaciones también pueden proporcionarse en formas de liberación controladas y liberación retardada para liberarse en la administración de las preparaciones antigénicas como una mezcla o de una manera en serie. Las vacunas incapacitadas de las invención se proporcionan generalmente en composiciones con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Varios excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Como se usa en la presente, "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combinan con un ingrediente activo de una composición, permite que el ingrediente mantenga la actividad biológica y sin causar reacciones de ruptura con el sistema inmune del sujeto. Los portadores farmacéuticamente ejemplares incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas.

Los ejemplos incluyen pero no se limitan a, alguno de los excipientes farmacéuticos estándar tales como solución salina amortiguada de fosfato, agua, emulsiones tal como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Los ejemplos de los solventes no acuosos son propilen glicol , polietilen glicol, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen soluciones acuosas/alcohólicas, agua, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de dextrosa y de sodio, aceites fijos o de Ringer lactados. Los vehículos intravenosos incluyen reabastecedores de fluidos y nutrientes, re-abastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en la dextrosa de Ringer) y similares . Una composición que comprende un bacteriófago de la invención, también se puede liofilizar usando medios bien conocidos en el arte, para la reconstitución posterior y uso de conformidad con la invención. Son también de interés, las formulaciones para la administración liposomal, y formulaciones que comprenden el bacteriófago microencapsulado . Las composiciones que comprenden tales excipientes se formulan por métodos convencionales bien conocidos (ver, por ejemplo, Remington Pharmaceutical Sciences, Capítulo 43, 14a Ed. ack Publishing Col, Easton PA 18042, USA) . En general, se pueden preparar las composiciones farmacéuticas en diversas formas tales como gránulos, tabletas, pildoras, supositorios, cápsulas (por ejemplo, adaptadas para administración oral) micro-perlas, micro-esferas, liposomas, suspensiones, ungüentos, lociones y similares. Los portadores y/o diluyentes orgánicos o inorgánicos de grado farmacéutico, adecuados para uso oral y tópico se pueden usar para elaborar composiciones que comprenden los compuestos terapéuticamente activos. Los diluyentes conocidos en el arte incluyen medios acuosos, aceites animales y vegetales y grasas . Los agentes estabilizantes, agentes emulsificantes y humectantes, sales para variar la presión osmótica o amortiguadores para asegurar un valor adecuado de pH. La composición farmacéutica puede comprender otros componentes además del bacteriófago. Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender más de un bacteriófago, por ejemplo dos o más, tres o más, cinco o más, o diez o más- bacteriófagos diferentes, en donde el bacteriófago diferente puede ser específico para bacterias iguales o diferentes. Como se nota arriba el bacteriófago puede administrase en conjunto con otros agentes, tales como un agente microbiano convencional (ver tabla anterior) . En algunas modalidades puede desearse administrar el bacteriófago y antibiótico con la misma formulación. Las composiciones se administran a un mamífero que esta en riesgo de adquirir una enfermedad causada por el patógeno bacterial para prevenir o al menos detener parcialmente el desarrollo de las enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para uso terapéutico dependerán de, por ejemplo, la composición de antigeno. La manera de administración, el peso y estado general de salud del paciente y el juicio del médico que prescribe. Las dosis sencillas o múltiples de las composiciones pueden administrarse dependiendo de la dosis y frecuencia requerida y tolerado por el paciente, y la ruta de administración. Las cantidades para la inmunización de la mezcla generalmente están en el rango de alrededor de 0.001 mg hasta alrededor de 1.0 mg por 70 kilogramos del paciente, más comúnmente es de alrededor de 0.001 mg hasta alrededor de 0.2 mg por 70 kilogramos del paciente. Las dosis desde 0.001 hasta alrededor de lOmg por paciente por día pueden usarse, particularmente cuando el antígeno se administra a un sitio aislado y no en el torrente sanguíneo tal como en la caridad corporal o en un volumen en órgano. Las dosis substanci lmente mayores (por ejemplo, 10 hasta lOOmg o más) son posibles en administración oral nasal o tópica. La administración inicial de la mezcla puede seguirse por una inmunización de inyección de refuerzo de la misma o diferente mezcla, con al menos una inyección de refuerzo, más usualmente dos inyecciones de refuerzo, siendo preferidas. La invención también contempla que la composición de vacuna comprenda una vacuna bacterial incapacitada que puede incluir una o más cepas de bacteria. Las vacunas pueden administrase a cualquier sujeto, generalmente un sujeto mamífero, que tiene o es susceptible a, una infección por un patógeno bacterial. Los sujetos de interés particular incluyen pero no se limitan necesariamente a humanos, y animales domésticos (por ejemplo, ganado mascotas y similares) así como animales mantenidos en cautiverio (por ejemplo, en zoológicos o parques acuáticos) .

Aunque el sujeto no necesita ser inmunológicamente nativo, las vacunas de la invención se administran típicamente a un sujeto que es inmunológicamente nativo con respecto al patógeno bacterial particular. En una modalidad particular, el mamífero es un niño humano de alrededor de 5 años o más joven y preferiblemente alrededor de 2 años de edad o más joven. La vacuna de la invención puede administrarse como una dosis sencilla o, desea o es necesaria, la dosis inicial puede seguirse por vacunas de refuerzo varios días, varias semanas, o varios meses o años después de la dosis inicial . En general la administración a cualquier mamífero se inicia preferiblemente antes del primer signo de los sxntomas de la enfermedad, o al primer signo una exposición posible o actual al patógeno bacterial.

Ejemplos Las modalidades anteriores de la presente invención, se describen además en los siguientes ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada por los ejemplos, y serán evidentes las variaciones para aquellos expertos en la técnica, sin alejarse del alcance de la presente invención. En particular, se puede sustituir cualquier bacteria y fago conocido por infectar a las bacterias, en los experimentos de los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se proponen para suministrar a aquellos expertos en la técnica, con una descripción y divulgación completa de la forma de hacer y utilizar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores refieren como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se debe tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en número, la temperatura esta en grados centígrados y la presión de o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1; Creación del fago T4 Lys menos La secuencia de nucleotidos del gen de lisozima (e) del bacteriófago T4, junto con 130 nucleotidos adicionales a cada lado, se reporta por O en et al (J. Mol. Biol. 165, 229, 1983) . Los ADN que corresponden a los nucleotidos de las regiones de dirección ascendente y dirección descendente del gen e, se aislan por PCR y se clonan en el plásmido de resistencia a la ampicilina pUC 18 con sitios únicos de restricción (Xba I y Pst I) entre las dos regiones ( (Sambrook, J. et al Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) . Un cásete de ADN que contiene el gen para una forma mutante de la proteina fluorescente verde (GFP) que tiene una fluorescencia 40 veces más brillante que la proteína de tipo silvestre, se genera como un fragmento Xba I-Pst I a partir del plásmido pmut2 que lleva gfp (Cormack, B.P., Valdivia, R.H. y Falkow, S. Gene 173, 33, 1996), y se introduce entre las secuencias de la dirección ascendente y dirección descendente del gen de lisozima en pUC18 (pGG8) . El promotor y terminador para la expresión de GFP en este cásete se reemplaza por el promotor temprano del gen de la dihidrofolato reductasa T4 frd (Rosenberg, M. y Court, D.

Ann. Rev. Genet . 13, 319, 1979) en la terminación 5' , y el terminador de la trascripción situado entre los genes 44 y 45 de T4 (Spicer y Konigsberg in Bacteriophage T4 eds . Mathews, utter, Mosig y Berget, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1983, pp. 299) en la terminación 3' respectivamente . El promotor frd está en la clase temprana inmediata de los promotores T4 que son los primeros a expresarse en células bacterianas infectadas con T4. Se usa la polimerasa del ARN del hospedador para la transcripción desde este promotor. Este plásmido pGG8 se transforma en células de E.coli HB101 por el método RbCl y se selecciona para resistencia a la ampicilina. Las células de E.coli HB101 que portan el plásmido pGG8 con el gen de lisozima imitante, se infectan entonces con el fago T4 de tipo silvestre a una multiplicidad baja de infección. Durante la replicación, algunos se recombinan con el gen de lisozima imitante llevado en el plásmido en las células para proporcionar el fago Lys menos . Es posible que la recombinación en cualquier célula no será 100% eficiente. Ambos tipos de fagos se colectan al lisar las células bacteriales con cloroformo, y el fago Lys menos se separa del tipo silvestre por purificación de placa. Cada placa se prueba entonces para ver si es del tipo silvestre o Lys menos . Los fagos Lys menos pueden identificarse por la fluorescencia verde de las placas de replicado bajo luz UV ya que el GFP se expresa bajo el promotor temprano T4. Esto se puede confirmar además al probar el fago de cada placa en E.coli HB101 asi como células que expresan el gen de Usina descrito abajo. Mientras que el fago de tipo silvestre elimina ambos hospedadores, el fago Lys menos sólo elimina las células hospedadoras que expresan la lisina.

Ejemplo 2: Producción del fago T4 Lys menos en E.coli El sistema de lisis de dos genes del fago neumococal Cp-1, se ha clonado y expresado en E.coli (Martín et al. J. Bacteriol . 180, 210 (1998). El ADN Cp-1 que usa PCR como plantilla, genera fragmentos de ADN que contienen el gen cpll (Usina) o los genes de cásete cphl -cpll (holin- lisina) , en los cuales los genes mantienen sus propios sitios enlazados a la ribosoma. Con el uso de los oligonucleótidos apropiados, se crean los sitios de restricción Sac II y Sac I en los extremos 5' y 3' de los fragmentos PCR para clonarse en el pNM185 plásmido (Mermod et al. J. Bacteriol. 167, 447 (1986)). El gen cpll o el cásete que contiene los genes cphl ? cpll se expresan bajo el control de un promotor positivamente regulado {Pm) del operón de trayectoria meta del plásmido TOL. La transcripción de los genes de Pm se induce específicamente por el producto del gen regulador xylS solamente cuando las moléculas efectoras tipo 3-metil benzoato se presentan. La transformación de células de E.coli HB101 con los plásmidos pN 185 que llevan el cásete cpll o cphl-cpll, se lleva a cabo por el método RbCl ( (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)) . Las células de E.coli HB101 transformadas se hacen crecer en caldo LB u otro medio apropiado, y se inocula con el fago T4 Lys menos. Al momento apropiado, la expresión del cásete cpll o el cphl-cpll en el plásmido pNM185 se induce por la adición de 3-metil benzoato 2mM para efectuar la liberación de la progenie del fago T4 Lys menos.

Ejemplo 3; Creación del plásmido pGMB021 para usar en la generación del fago recombinante Lys menos Materiales y Métodos. La polimerasa de ADN Tag, dNTP, Fosfatasa Intestinal de Becerro, enzimas de restricción, cebadores y ligasa de ADN T4, se procuran de Bangalore Genei Pvt . Ltd (BGPL) , Bangalore. Los vectores pRSET fueron de Invitrogen Ltd, USA. Las ligaduras se realizan con la relación vector : inserto de 1:10M. Los productos PCR junto con los vectores digeridos se purifican de gel de agarosa usando los reactivos del kit de extracción en gel Qiagen salvo que se mencione de otra manera.

Construcción del clon de llsozima T4 en promotor T7 con base en el vector pRSETB (pRSETB-T4L) . La amplificación PCR del gen de lisina de T4 se realiza con el fago T4 de tipo silvestre obtenido de BGPL, usando los siguientes cebadores: GMB1: Delantero 5' CG GAA TTC CAT ATG AAT ATA TTT GAA ATG TTA CGT 3' (SEQ ID N0:1) G B2 : Inverso 5 ' AA AGC GGC CGC AAG CTT TAG ATT TTT ATA CGC GTC CCA 3' (SEQ ID NO: 2) . La desnaturalización inicial fue a 95°C durante 4 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, recociendo a 55°C durante 30 segundos, y una extensión a 72°C durante 30 segundos. Los contenidos se extendieron finalmente durante 7 minutos a 72 °C. A continuación, el producto PCT obtenido se purificó y se rellenó con Klenow en el ligado anterior al vector pRSETB digerido con PvuII y desfosforilado con CIP. La relación vector a inserto se mantiene a 1:10M. El ligado se realiza a 22 °C durante 5 horas y luego se transforman células competentes DH5 alfa con la mezcla de ligado anterior. Los transformantes se seleccionan entonces en una placa LB amp (concentración final 100 ug/ml) a 37°C durante la noche. Los transformantes se tamizan por PCR de colonia de acumulados y los clones positivos se revisan entonces para digestión por restricción después del aislado del ADN. El ADN de los clones positivos se secuenció por ABI Prism de Pharmacia. El clon anterior expresa la proteína lisozima T4 como se observa en el gel SDS-PAGE. La proteína fue una proteína de lisina etiquetada His de 25 Kda como se espera (ver Figura 2, pistas 1 y 2) . PGMB011 se selecciona para uso adicional .

Construcción de GFP como su proteína de fusión tag en el vector pRSETA (pSETA-GFP) . Para interrumpir el gen de lisina con el gen reportero, se elige el gen GFP. Primero, el gen GFP se amplifica del plásmido pUC-GFP en el kit de enseñanza GFP de BGPL, usando los siguientes cebadores: GMB5: Delantero 5' CC GGA ATT CAT ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC 3' (SEQ ID NO: 3) G B6: Inverso 5' CC GGA ATT CAT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC 3' (SEQ ID NO: 4). La desnaturalización inicial fue a 95°C durante 4 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, combinando los pares base a 60°C durante 30 segundos, y una extensión a 72°C durante 30 segundos. La extensión final fue a 72°C durante 7 minutos. El producto purificado se digirió con EcoRl y luego se ligó con pRSETA cortado con EcoRl . Los clones se separaron por exclusión por PCR de colonia de acumulados para GFP y la expresión de escala pequeña de GFP se observa en SDS-PAGE. Todos los clones se revisaron bajo luz UV para la fluorescencia GFP que indica que el clon tiene GFP en la orientación correcta con respecto al promotor T7. El tamaño de la proteína GFP fue de 36 KDa como se espera .

Interrupción del gen de Usina T4 con GFP en la estructura con la terminal 5' del gen de Usina T4 para el constructo pGMB021. El fragmento GFP del clon pRSETA-GFP se subclona entonces en pGMBOll parcialmente digerido (un vector pRSETB-T4L producido arriba) con EcoRl . los transformantes se separaron por exclusión para PCR con GMB5/GMB6 y luego se revisaron por expresión de escala pequeña de la proteína de fusión GFP-lisina etiquetada his. La proteína de fusión GFP-lisina etiquetada His expresada del clon anterior (42 KDa) (ver Figura 2, pistas 3 y 4) y su fluorescencia mostrada bajo luz UV, indica que el gen GFP estba intacto en este constructo . El clon anterior se probó además para PCR con cebadores GMB1/GMB2 (cebadores específicos de lisina T4) . Como se espera, el PCR con GMB1/GMB2 dio un producto de lisina-GFP-lisina de aproximadamente 1200 pb que muestra lo intacto de la lisina y genes GFP (Figura 3) . Este clon se usó en el experimento recombinante descrito en el Ejemplo 4 abajo.

Ejemplo 4: Generación y aislado del fago recombinante Lys menos Se infectan células DH5ot que contienen el plásmido pGMB021 con el fago T4 de tipo silvestre a 2.5 m.o.i. Esta alta mul iplicidad de infección asegura que cada célula se infecta con al menos un fago. Después de 40 minutos de incubación, se agrega cloroformo (1%) y el lisado se centrifuga. Se separa el sobrenadante y se coloca al aire durante 30 minutos a temperatura ambiente para evaporación del cloroformo residual. El lisado se trata con DNasa (50 ug/ml) durante 30 minutos a 37°C para digerir el ADN cromosomal y plásmido, y luego se titula. ? continuación, se infectan células de E.coli (que no portan plásmido) con el lisado a 0.1 m.o.i. Esta baja multiplicidad de infección asegura que todas las células infectadas contienen un fago sencillo, lo que a su vez sirve para separar el fago recombinante y los fagos de tipo silvestre. La mezcla de infección anterior se incuba a 37°C durante 30 minutos y luego se centrífuga. El peletizado celular y el sobrenadante se separa. Las células que contienen el fago Lys menos no se lisan y, por lo tanto, se presentan en el peletizado celular junto con células no infectadas. Se descarta el sobrenadante, como esta fracción es posible que contenga la mayoría de los fagos de tipo silvestre. El peletizado se vuelve a suspender entonces en el medio de cultivo (Caldo Luria) y se lisa con lisozima de huevo blanco (lOOug/ml) y cloroformo (2%) . Este lisado se usa para infectar células E BL21(DE3) a 0.1 m.o.i., y se planta en un tramo de las mismas células. Estas células se eligen específicamente para esta etapa ya que expresan constitutivamente, de un plásmido, la lisozima del fago T7 y deberían ayudar al fago Lys menos a formar placas . Dos tipos de placas se aprecian en el plato, varias-placas de tipo silvestre y algunas placas de minuto o punta de alfiler. Las placas de punta de alfiler se pinchan y vuelven a suspender en el medio de cultivo. A continuación, éstas se permite que infecten células BL21(DE3) pLysE y luego se plantan en una mezcla 1:1 de células BL21 (DE3) LysE (que hacen la lisozima T7) y células LE392 (sin lisozima) . Las áreas turbias que representan el fago recombinante se distinguen entre las placas de tipo silvestre en el tramo de la mezcla de células. Estas áreas turbias se recogen. Una parte se vuelve a suspender en agua para PCR y el resto se vuelve a suspender en un medio de cultivo. El producto de gen GFP fue amplificable de muchas de las placas turbias (Figura 4) . La lisina-GFP-lisina T4 de longitud completa también se amplifica. Sin embargo, el producto de gen de lisina de tipo silvestre también se presenta, lo que indica la presencia del fago de tipo silvestre (Figuras 5 y 6) . La eliminación selectiva del fago de tipo silvestre de estos lisados se da al infectar células a un bajo m.o.i. y la lisis de las células a 40 minutos. En este momento, el fago de tipo silvestre debería tener otra ronda de entrada de infección y deberá estar en etapa de eclipse (en forma de ADN) . La lisis de las células destruye de esta manera el fago de tipo silvestre antes de ensamblarse en partículas. Después de 3-5 rondas de tal eliminación, los lisados fueron menos placas (Figura 7) . La confirmación de la presencia del fago Lys menos recombinante en tales lisados, y la cuantificación se da al estimar el número de células viables después de la infección. La pérdida de viabilidad de las células infectadas fue evidente durante el plantado de la mezcla de infección (Figura 8) . Con objeto de enriquecer el fago recombinante y evitar el uso de cloroformo y complementación externa de lisizima, se usa un tipo de célula de E.colx mutante sensible a la temperatura (RE 7) (que crece a 30°C y se lisa a 42°C) . El enriquecimiento del fago recombinante al nivel de alrededor de 2xl08/ml se alcanza. Esta preparación se uso para infectar una cepa patogénica de E. coli a 2 m.o.i. Estas células en su ' estado nativo provocan la muerte del 80% de los animales cuando se inyectan a una dosis de 108 células/ratón dentro de 48 horas. Las células patogénicas inactivadas con el fago recombinante, han sido inyectadas en ratones para evaluar la eficacia como una vacuna inactivada de célula completa .

Ejemplo 5: Estudio preliminar de la eficacia del fago Lys menos en la protección de ratones contra una infección experimental por E. coli: Se inyectaron ratones macho y hembra Swiss Albino de 6 a 8 semanas de edad, intraperitonealmente con una cepa patogénica de E. coli que provoca un 100% de mortalidad a 108 cfu. Todos los ratones murieron dentro de 48 horas. Cuando se inyectaron los ratones con 5xl07 células, se observo una mortalidad de 70-80%. No hubo mortalidad sin embargo, a 10s cfu. Por lo tanto se inyectaron los ratones con (i) 10s células de tipo silvestre o (ii) 106 células que no se hicieron viables por infección con el fago Lys menos. Después de permitir 10 días para el desarrollo de una respuesta inmune, se aplico una prueba inmunogénica a los animales con células de tipo silvestre (5x107 cfu) junto con animales que fueron solamente administrados con soluciones salina y se observaron hasta un periodo de 10 días. Hubo una mortalidad importante en el grupo inyectado con E. coli inactivada con el fago Lys menos probablemente debido a la endotoxina. En el grupo del control del vehículo, hubo una mortalidad del 80% como se esperaba. En el grupo en donde se usaron células de tipo silvestre como vacuna, se observó una mortalidad de 20% lo que indica una protección de 80%. En el grupo en donde las células habían resultado no viables por el fago Lys menos, no hubo mortalidad en absoluto lo que indica una protección total .

Grupo No. de No. de No. de animales No. de % de ratones supercon la prueba superprotección /grupo vivientes inmunogénica vivientes Vehículo de 10 10. 10 2 20% control (solución salina) Tipo 10 10 10 8 80% silvestre (106 cfu) Células 16 8* 8 8 100% infectadas con Lys-P- Nota: Lys-P aparece para el fago que infecta las células de E. coli y las hace no viables pero no lisa la células. *Las muertes observadas pueden ser un efecto de la endotoxina que puede haber resultado de las células bacterianas comprometidas dentro del cuerpo. Esto se puede evitar al usar un número inferior de células incapacitadas para inmunización, y repetir con una dosis de refuerzo 2 semanas después de la inmunización primaria. Un lavado adicional de las células bacterianas incapacitadas previa a la administración también puede eliminar el problema.

Respuesta de anticuerpos : Para verificar la presencia de anticuerpos en los ratones que sobrevivieron en grupos diferentes, se sacrificaron los ratones 7 días después de la dosis de prueba inmunogenica que se administro y se recolectó el suero. Se recolectó el suero a partir de los animales del grupo de control de vehículo sin prueba inmunogenica que sirvieron como control negativo. Se verificaron las muestras de suero para la reactividad a células 443 de E. coli. La presencia de anticuerpos anti-E. coli en los sueros se confirmo en un formato estándar ELISA usando una preparación de células E. coli (cepa #MTCC443) recubierta en pozos de micro placas para la captura y IgG de anti ratón conjugado con la enzima de fosfataza alcalina como reportero. Se marcaron los ratones como positivo paras los anticuerpos anti-E. coli contra la media de los valores OD de 6 sueros de control negativo usados . Todos los ratones que sobreviven a la prueba inmunogenica muestran la presencia de 443 anticuerpos anti-E. coli. El grupo del fago Lys menos fue comparable al grupo que se le administraron células vivas. Todos los valores que se muestran en la tabla a continuación representan la media de los ensayos por duplicado. La media OD de los animales de control (6) no expuestos a E. coli (control sin infectar) fue de 0.3.

Resultados ELISA: Valores O.D. (405 mn) SI Grupo con Ratón No prueba 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 inmunogénica 1. Grupo con células 1.19 1.0 0.87 1.0 No ensayado 8 supervivas vivientes 2. Grupo con el fago Lys 0.6 0.72 0.83 0.7 0.9 0.9 0.6 0.7 8 supermenos vivientes 3. Control de 1.2 0.5 2 supervivientes vehículo Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones 1. Un método para obtener una respuesta inmune a un patógeno bacteriano, el método caracterizado porque comprende : administrar una composición bacteriana de célula completa incapacitada, a un sujeto susceptible a infección por una enfermedad provocada por una bacteria patogénica, en donde la composición comprende la bacteria patogénica incapacitada por infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, la administración es en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el hospedador.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria patogénica es de un género seleccionado del grupo que consiste de Mycobacteria, Staphylococci , Vibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudo onas, Shigella, Serratia, Salmonella, Streptococcus, Klebsiella y Yersinia.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el bacteriófago defectuoso en la lisis es un bacteriófago de Lys menos .
4. 4. Un método para la vacunación de un sujeto contra una enfermedad provocada por un patógeno bacteriano, el método caracterizado porque comprende: administrar . a un sujeto susceptible a la enfermedad provocada por una bacteria patogénica, una vacuna bacteriana incapacitada de célula completa, la vacuna comprende la bacteria patogénica, incapacitada por infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, la administración está en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el sujeto.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la bacteria patogénica incapacitada por una infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis se prepara por ingeniería genética para sobreexpresar un antigeno endógeno.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la bacteria patogénica es de un género seleccionado del grupo que consiste de Mycobacteria, Staphylococci, Vibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Sal onella, Streptococcus, Klebsiella y Yersinia .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el bacteriófago defectuoso en la lisis es un bacteriófago Lys menos.
8. 8. Un método para producir una respuesta inmune a un antígeno, el método caracterizado porque comprende: administrar a un sujeto una composición bacteriana de célula completa incapacitada, en donde la composición comprende una bacteria incapacitada por infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, la administración está en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune en el sujeto a un antígeno presente en o sobre la bacteria.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porgue el antigeno es un antígeno bacteriano endógeno a la bacteria.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porgue el antígeno es un antígeno recombinante.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porgue el antígeno recombinante es exógeno a la bacteria .
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el bacteriófago defectuoso en la lisis es un bacteriófago Lys menos .
13. 13. Una composición caracterizada porque comprende una bacteria incapacitada ' y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la bacteria incapacitada se produce por la infección de una bacteria patogénica con un bacteriófago defectuoso en la lisis. 1 . La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la bacteria patogénica es del género seleccionado del grupo que consiste de: Mycobacteria, Staphylococci , Vibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigell , Serratia, Salmonella, Streptococcus, Klebsiella y Yersinia . 15. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el bacteriófago defectuoso en la lisis es un bacteriófago Lys menos.