DE69322773T2

DE69322773T2 - Haemophilus somnus immunogene proteine

Info

Publication number: DE69322773T2
Application number: DE69322773T
Authority: DE
Inventors: Richard Harland; Cheryl Pfeiffer; Reno Pontarollo; Andrew Potter; Clement Rioux; Michael Theisen
Original assignee: University of Saskatchewan
Current assignee: University of Saskatchewan
Priority date: 1992-04-09
Filing date: 1993-04-05
Publication date: 1999-09-02
Anticipated expiration: 2013-04-06
Also published as: CA2133441A1; CA2133441C; EP0635055B1; WO1993021323A1; DE69322773D1; AU3883893A; EP0635055A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein bakterielle Antigene. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Proteine, die von Haemophilus somnus stammen, und deren Verwendung in Impfzusammensetzungen.

Hintergrund

Haemophilus somnus ist ein gramnegatives Bakterium, das mit mehreren Actinobacillus-Arten verwandt ist und mit Histophilus ovis und Haemophilus agni identisch zu sein scheint (Philbey et al., Aust. Vet. J. (1991) 88: 387-390). H. somnus verursacht in Tieren eine Reihe von Krankheitssyndromen. Das Bakterium wird üblicherweise in Verbindung gebracht mit thromboembolischer Meningoencephalitis (ITEME), Septikämie, Arthritis und Pneumonie (Corbeil, L. B., Can. J. Vet. Res. (1990) 54: S57-S62; Harris, F. W. und Janzen, E. D., Can. Vet. J. (1990) 30: 816-822; Humphrey, J. D., und Stephens, L. R., Vet. Bull. (1983) 53: 987-1004). Diese Erkrankungen können für die Agrarindustrie signifikante ökonomische Verluste verursachen. Derzeit erhältliche Impfstoffe basieren entweder auf getöteten ganzen Zellen oder auf Präparationen von äußerem Membranprotein (outer membrane protein, OMP). (Siehe z. B. US-Patente Nrn. 4,981,685 und 4,877,613). Bakterienvakzine aus ganzen Zellen und Oberflächenproteinextrakte enthalten jedoch oftmals immunsuppressive Komponenten, die Tiere anfälliger für Infektionen machen können. Darüber hinaus ist lediglich gezeigt worden, daß eine mit OMP angereicherte Vakzine bzw. Impfstoff in einem experimentellen Expositionsmodell einen signifikanten Schutz gegen H. somnus induzierte Erkrankungen bietet (Harland, R. J., et al., Res. Work. Anim. Dis. 71st (1990) 29: 6). Sogenannte Subunit-Vakzinen, d. h. Vakzinen, die ausgewählte, von dem gesamten Bakterium abgetrennte Proteine enthalten, bieten ein Verfahren, um die der Verwendung der zuvor genannten Vakzinen innewohnenden Probleme zu überwinden.
Eisen ist ein wesentlicher Nährstoff für bakterielles Wachstum, und die Fähigkeit, Eisen aus der Eisen nur eingeschränkt enthaltenden Umgebung eines Wirtes zu erlangen, ist notwendig, um eine Infektion angehen zu lassen und aufrecht zu erhalten. Eine Korrelation zwischen Virulenz und der Fähigkeit, Eisen aus dem Wirt aufzusammeln, ist bereits gezeigt worden (Archibald, F. S., und DeVoe, I. W., FEMS Microbiol. Lett. (1979) 6: 159-162; Archibald, F. S., und DeVoe, I. W., Infect. Immun. (1980) 27: 322-334; Herrington, D. A., und Sparling, F. P., Infect. Immun. (1985) 48: 248-251; Weinberg, E. D., Microbiol. Rev. (1978) 42: 45-66).
Bakterien können Eisen aus einer Reihe von Quellen aufsammeln. Eisenhaltige Verbindungen, wie freies Häm, Hämoglobin, Myoglobin, Transferrin, Lactoferrin, Katalase, Cytochrome, Häm-Hämopexin, Häm-Albumin, Hämoglobin- Haptoglobulin und dergleichen, können Eisen je nach dem fraglichen Bakterium bereitstellen. Eine begrenzte Anzahl gramnegativer Bakterien, einschließlich Haemophilus-Arten, können Hämin als Eisenquelle benutzen.
Bakterien haben eine Reihe von Mechanismen entwickelt, um das benötigte Eisen einzufangen. Die Aquisition von Eisen aus Eisenquellen des Wirtes kann durch die Produktion von Hämolysinen und Cytolysinen erleichtert werden, die Wirtszellen lysieren und intrazelluläre Eisenkomplexe freisetzen. Das Eisen kann dann mittels einer Vielzahl von Methoden eingefangen werden. Beispielsweise benutzt E. coli Siderophore, um mit externem Eisen einen Chelatkomplex zu bilden, der dann an einen verwandten Rezeptor für die nachfolgende Aufnahme gebunden wird. Cross, J. G., Microbiol. Rev. (1989) 53: 517-530; Nellands, J. B., Annu. Rev. Microbiol. (1982) 36: 285-309. Anders als E. coli scheint H. influenzae Eisen durch einen Siderophorunabhängigen, rezeptorvermittelten Prozeß einzufangen. Schryvers, A. B., J. Med. Microbiol. (1989) 29: 121-130; Lee, B. C., Infect. Immun. (1992) 60: 810-816. Sowohl Hämin-bindende Proteine als auch Hämolysine sind in Plesiomonas shigelloides gezeigt worden (Daskaleros, P. A., et al., Infect. Immun. (1991) 59: 2706-2711). In ähnlicher Weise ist gezeigt worden, daß H. influenzae Hämin-bindende Proteine aufweist (Lee, B. C.. Infect. Immun (1992) 60: 810-816 und Hanson, M. S., und Hansen, E. J., Mol. Microbiol. (1991) 5: 267-278). Ein Transferrin-bindendes Protein ist aus H. somnus isoliert worden (WO90/12591).
Hämolysine und Cytolysine sind in einer Reihe anderer Bakterien gezeigt worden. A. pleuropneumoniae-Stämme erzeugen mehrere Cytolysine. Siehe z. B. Rycroft, A. N., et al., J. Gen. Microbiol. (1991) 137: 561-568 (der ein 120 kDa-Cytolysin aus A. pleuropneumoniae beschreibt); Chang, Y. F., et al., DNA (1989) 8: 635-647 (der ein aus A. pleuropneumoniae-Serotyp 5 isoliertes Cytolysin beschreibt); Kamp, E. M., et al., Abstr. CRWAD (1990) 1990: 270 (der das Vorliegen von 103, 105 und 120 kDa- Cytolysinen in A. pleuropneumoniae-Stämmen beschreibt) und Welch, R. A., Mol. Microbiol. (1991) 5: 521-528 (der über Cytolysine von gramnegativen Bakterien einschließlich Cytolysinen von A. pleuropneumoniae berichtet). Eines dieser Cytolysine scheint zu dem Alpha-Hämolysin von E. coli homolog zu sein, und ein anderes zu dem Leukotoxin von Pasteurella haemolytica. Welch, R. A., Mol. Microbiol. (1991) 5: 521-528. Diese Proteine weisen eine Molekularmasse von etwa 105 000 kDa auf und schützen in Mäuse- und Schweine-Tiermodellen bei Exposition mit dem homologen Serotyp. Der Schutz durch Kreuzreaktivität der Serotypen ist jedoch bestenfalls limitiert (Higgins, R., et al., Can. J. Vet. (1985) 26: 86-89; MacInnes, J. I., et al., Infect. Immun. (1987) 55: 1626-1634). Die Gene für zwei dieser Proteine sind kloniert worden und in E. coli exprimiert worden, und ihre Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Chang, Y. F., et al., J. Bacteriol. (1991) 173: 5151-5158 (der die Nukleotidsequenz für einen A. pleuropneumoniae-Serotyp 5-Cytolysin beschreibt); und Frey, J., et al., Infect. Immun. (1991) 59: 3026-3032 (der die Nukleotidsequenz für ein A. pleuropneumoniae-Serotyp 1-Cytolysin beschreibt). Hämin-bindende Proteine und Hämolysine aus H. somnus sind jedoch bislang nicht isoliert worden.
Die äußere Membran von H. somnus enthält ein 40 kDa-Protein (bestimmt mittels SDS-PAGE), das mit konvaleszentem Serum reagiert (Corbeil, L. B., et al., infect Immun. t1987) 55: 1381-1386; Goglolewski, R. P., et al., Infect. Immun. (1988) 56: 2307-2316). Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß Antikörper, die gegen ein 40 kDa-OMP gerichtet sind, in vitro eine Infektion in einem Neutralisationsexperiment verhindern (Gogolewski et al., siehe oben) und ein seroreaktives Protein von 40 kDa in sämtlichen H. somnus-Isolaten vorliegt, die getestet worden sind (Corbeil et al.. 1987).
Ein 39 kDa-OMP, das antigenisch verschieden ist von dem zuvor beschriebenen 40 kDa-OMP, ist ebenfalls identifiziert worden. Dieses Protein reagiert mit Serum der Konvaleszenz- Phase und wird unter allen getesteten H. somnus-Isolaten konserviert.
Eine steigende Anzahl von bakteriellen Antigenen ist nun als Lipoproteine identifiziert worden (Anderson, B. E., et al., J. Bacteriol. (1988) 170: 4493-4500; Bricker, T. M., et al., Infect. Immun. (1988) 56: 295-301; Hanson, M. S., und Hansen, E. J., Mol. Microbiol. (1991) 5: 267-278; Hubbard, C. L., et al., Infect. Immun. (1991) 59: 1521-1528; Nelson, M. B., et al., Infect. Immun. (1988) 56: 128-134; Thirkell, D., et al., Infect. Immun. (1991) 59: 781-784). Diese Lipoproteine sind im allgemeinen in der Zellhülle lokalisiert und sind daher dem Immunsystem des Wirtes ausgesetzt. Es ist gezeigt worden, daß das Murein-Lipoprotein der äußeren Membran von Escherichia coli als ein starker Aktivator für murine Lymphozyten wirkt, der sowohl Proliferation als auch Immunoglobulinsekretion induziert (Bessler, W., et al., Z. Immun. (1977) 153: 11-22; Melchers, F., et al., J. Exp. Med. (1975) 142: 473-482). Es ist gezeigt worden, daß der aktive Lipoproteinteil des Proteins in der fettsäurehaltigen, N-terminalen Region des Proteines sitzt. Jüngere Untersuchungen, bei denen synthetische Lipopeptide auf der Basis dieses Proteins verwendet wurden, zeigen, daß selbst kurze Peptide, die zwei bis fünf Aminosäuren kovalent verknüpft mit Palmitat enthalten, in der Lage sind, murine Lymphozyten zu aktivieren (Bessler, W. G., et al., J. Immunol. (19851 135: 1900-1905).
Ein Lipoprotein aus H. somnus ist positiv identifiziert worden. Dieses als "LppA" bezeichnete Protein ist ein OMP mit einer scheinbaren Molekularmasse von 40 kDa, wie mittels Gelelektrophorese bestimmt wurde. Die Nukleotidsequenz für LppA ist bestimmt worden (Theisen, M., et al., Infect. Immun. (1992) 60: 826-831). Die Schutzfähigkeit dieses Proteins ist jedoch früher nicht untersucht worden.
Ein zweites Lipoprotein aus Haemophilus somnus, das als "LppB" bezeichnet wird, ist bekannt. Es wird berichtet, daß eine Genombibliothek von Haemophilus somnus in E. coli mit bovinen Hyperimmunseren gescreent wurde und ein Klon gefunden wurde, der ein stark seroreaktives 40 kDa-Protein codierte (Theisen, M., et al., Abstr. Gen. Meeting. Am. Soc. Microbiol. (92. Meeting), New Orleans, Mai 1992). Es wird ebenfalls berichtet, daß das gesamte DNA-Insert sequenziert wurde und gefunden wurde, daß der größere von zwei offenen Leserahmen das seroreaktive Protein codierte. Dieses Protein soll ein LppB-Lipoprotein sein.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Auffinden immunogener Proteine aus H. somnus und der Isolierung der verschiedenen, diese codierenden Gene. Diese Proteine können das native Protein, immunogene Fragmente davon, Analoge davon oder chimäre Proteine sein, die diese enthalten. Neue Subunit-Vakzinen zum Schutz vor H. somnus- Infektionen in Wirbeltieren umfassen das LppB-Protein, Fragmente oder Analoge davon und/oder chimäre Proteine, die diese umfassen, und zwar alleine oder in Kombination mit anderen immunogenen H. somnus-Proteinen oder mit anderen Antigenen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vakzine- bzw. Impfzusammensetzung bereit, die ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel und ein rekombinantes, immunogenes Haemophilus somnus-Protein umfaßt, die in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein lipidiert oder nicht- lipidiert sein kann und umfaßt
(a) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 17 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder
(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).
Wie im folgenden ausführlicher beschrieben ist, kann das Protein nichtlipidiert sein oder mit einer Lipidgruppe lipidiert sein, die normalerweise nicht in Gesellschaft mit dem Protein gefunden wird, oder mit einer Lipidgruppe lipidiert sein, die normalerweise in Gesellschaft mit dem Protein gefunden wird.
Das immunogene Protein der erfindungsgemäßen Vakzine- bzw. Impfzusammensetzungen kann ein Fusionsprotein sein, d. h. ein Protein, in dem die Aminosäuresequenz der zuvor genannten Punkte (a), (b), (c) oder (d) mit einer nicht-Haemophilus somnus-Aminosäuresequenz verknüpft ist. Beispiele solcher Proteine werden hier diskutiert.
Die Impfzusammensetzungen können, wie zuvor beschrieben, mehr als ein immunogenes Protein umfassen und können zusätzlich zu einem LppB-Protein ein anderes Haemophilus somnus-Protein als ein LppB-Protein umfassen. Andere Haemophilus somnus-Proteine, immunogene Fragmente davon, Analoge davon und chimäre Proteine, die diese enthalten, werden hier beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Herstellen einer Impfzusammensetzung bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
(1) Züchten einer transformierten Wirtszelle, wobei die Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor unter Bedingungen transformiert worden ist, bei denen dasjenige Protein exprimiert wird, das durch die in dem rekombinanten Vektor vorliegende Codierungssequenz codiert wird, wobei der rekombinante Vektor umfaßt:
(i) eine Nukleotidsequenz, umfassend eine Codierungssequenz für ein immunogenes Haemophilus somnus-Protein, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein umfaßt
(a) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 17 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder
(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c),
und
(ii) Kontrollsequenzen, die funktionsfähig verknüpft sind mit der Nukleotidsequenz, wobei die Codierungssequenz in eine Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, und wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen zu der Codierungssequenz heterolog ist, und
(2) Mischen des exprimierten Proteins mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch den Schritt des Transformierens einer Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor umfassen, um die transformierte Wirtszelle zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung sieht darüber hinaus die Verwendung eines rekombinanten immunogenen Haemophilus somnus-Proteins bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Behandeln oder Verhindern einer Haemophilus somnus-Infektion in einem Wirbeltier vor, wobei das Protein in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, lipidiert oder nicht- lipidiert ist und umfaßt
(a) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 17 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder
(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).
Insbesondere vorgesehen ist die Verwendung eines solchen Proteins bei der Herstellung einer Vakzine bzw. eines Impfstoffs für die Behandlung oder die Verhinderung von thromboembolischer Meningoencephalitis, Septikämie, Arthritis, Pneumonie, Myocarditis, Pericarditis, spontanem Abort, Infertilität und/oder Mastitis, die durch Infektion mit Haemophilus somnus verursacht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Carriervirus, der in der Lage ist, ein immunogenes Haemophilus somnus-Protein zu exprimieren, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein umfaßt:
(a) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 17 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder
(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).
Erfindungsgemäß wird eine Vakzine- bzw. Impfzusammensetzung bereitgestellt, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger bzw. Vehikel und einen rekombinanten Träger- bzw. Carriervirus wie zuvor beschrieben umfaßt. Der Träger- bzw. Carriervirus kann ein Pockenvirus, vorteilhafterweise der Vaccina-Virus, ein Adenovirus oder ein Herpesvirus sein.
Ebenfalls durch die Erfindung bereitgestellt wird eine pharmazeutische Zubereitung, die zur Nucleinsäureimmunisierung geeignet ist, wobei die Zubereitung eine Nucleinsäuresequenz umfaßt, die ein immunogenes Haemophilus somnus-Protein codiert, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein umfaßt:
(a) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 17 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder
(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder
(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).
Eine derartige Nucleinsäuresequenz kann in einer Form vorliegen, die zur direkten Verabreichung an das Wirbeltier geeignet ist, oder sie kann in einer Form vorliegen, die zur Einführung in zu dem Wirbeltier gehörende Zellen mittels Gentransfer geeignet ist.
Fig. 1 zeigt den Ort des hly- und hmb-Gens auf den Plasmiden pRAP117, pRAP401 und pRAP501.
Fig. 2 ist eine Darstellung der Nukleotidsequenz des Plasmids pRAP501. Ebenfalls gezeigt sind die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der verschiedenen offenen Leserahmen (ORFs), einschließlich ORF1, der das Hämin-bindende Protein von H. somnus codiert.
Fig. 3 zeigt die ORFs in pRAP501, abgeleitet von der in Fig. 2 angegebenen Sequenz.
Fig. 4 ist eine Darstellung der abgeleiteten Aminosäuresequenz für das Hämin-bindende Protein von H. somnus.
Fig. 5 zeigt die Nukleotidsequenz, die in Plasmid pGCH5 enthalten ist. Die Sequenz enthält das lktA-Gen von Pasteurella haemolytica, verknüpft mit einem trunkierten hmb-Gen.
Fig. 6 ist die Darstellung der in Plasmid pGCH4 enthaltenen Nukleotidsequenz. Die Sequenz enthält das lktA-Gen von P. haemolytica, verknüpft mit einem trunkierten hmb- Gen.
Fig. 7 ist die Darstellung der Nukleotidsequenz und abgeleiteten Aminosäuresequenz der lppA-Region von H. somnus. Die Sequenz des Antisense-Stranges ist mit einer Numerierung angegeben, die vom 5'-Ende der Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz ausgeht. Der Transkriptionsstart des lppA-Gens ist durch 1 angegeben.
Fig. 8 zeigt die Struktur und die Eigenschaften von Plasmiden, die in Beispiel 1 beschrieben sind. Die obere Linie zeigt eine partielle Restriktionskarte des Plasmids pMS22, in der die relevanten Stellen angegeben sind. Der Pfeil gibt den Ort und die Richtung der Transkription des lppA-Gens an. Die schattierten Balken unterhalb des Pfeils veranschaulichen die in jeden der angegebenen Plasmide klonierte DNA. Plasmidnamen, die mit einem Schrägstrich versehen sind, bezeichnen Fragmente, die in beiden Orientierungen kloniert wurden. Die unteren beiden Linienpaare zeigen die DNA, die in den Deletionsplasmiden verbleibt, die zum Bestimmen der Nukleotidsequenz des lppA-Genes verwendet werden. Die Spalte ganz rechts gibt die Fähigkeit der verschiedenen Plasmide an, die Synthese von LppA in JM105 zu steuern.
Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Gens, das H. somnus-LppB codiert. Das Präprotein wird codiert durch die Nukleotidpositionen 872 bis 1708 (Aminosäurereste 1 bis 279). Das reife Protein wird codiert durch die Nukleotidpositionen 920 bis 1708 (Aminosäurereste 17 bis 279).
Fig. 10 ist die Darstellung der Nukleotidsequenz und vorhergesagten Aminosäuresequenz des Gens, das H. somnus-LppC codiert. Das Präprotein überspannt die Nukleotidpositionen 108 bis 1850 (Aminosäurereste 1 bis 581), wobei die Positionen von 171 bis 1850 (Aminosäuren 22 bis 581) reichen.
Fig. 11 ist die Darstellung der Nukleotidsequenz und vorhergesagten Aminosäuresequenz, die in Plasmid pCRR28 enthalten sind. Die Sequenz enthält das lktA-Gen von P. haemolytica, verknüpft mit dem lppB-Gen.

Ausführliche Beschreibung

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, Virologie,, rekombinanten DNA-Technologie und Immunologie eingesetzt, die zum fachlichen Können gehören. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig erläutert. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989); DNA Cloning, Bd. I und II (D. N. Glover Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization tB. D. Hames & S. J. Higgins Ed. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney Ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe Methods In Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan Ed., Academic Press, Inc.); und Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell Hrsg., 1986, Blackwell Scientific Publications).
Sämtliche Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert sind, sowohl zuvor, als auch im folgenden, werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

A. Definitionen

Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, und sie sollen wie im folgenden angegeben definiert werden.
Der Begriff "Haemin-bindendes H. somnus-Protein" oder eine dieses codierende Nukleotidsequenz bedeutet ein Protein bzw. eine Nukleotidsequenz, die von dem Haemin-bindenden (hmb) Gen von H. somnus abgeleitet ist und in Plasmid pRAP117 (ATCC Accession Nr. 68952) gefunden und in Fig. 2 als ORF1 dargestellt ist.
Der Begriff "H. somnus-Haemolysin" oder eine dieses codierende Nukleotidsequenz bedeutet ein Protein bzw. eine Nukleotidsequenz, die von dem in Plasmid pAA504 gefundenen Haemolysin (hly)-Gen stammt bzw. abgeleitet ist.
Der Begriff "LppA" oder eine dieses codierende Nukleotidsequenz bedeutet ein Protein bzw. eine Nukleotidsequenz, die von einer benachbarten Sequenz abgeleitet ist, die in die Positionen 1 bis einschließlich 247 von Fig. 7 fällt.
Der Begriff "LppB" oder eine dieses codierende Nukleotidsequenz bedeutet ein Protein bzw. eine Nukleotidsequenz, die von einer benachbarten Sequenz abgeleitet ist, die in die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 fällt.
Der Begriff "LppC" oder eine dieses codierende Nukleotidsequenz bedeutet ein Protein bzw. eine Nukleotidsequenz, die von einer benachbarten Sequenz abgeleitet ist, die in die Positionen 1 bis einschließlich 581 von Fig. 10 fällt.
Das abstammende bzw. abgeleitete Protein oder Nukleotidsequenzen müssen nicht körperlich von den zuvor beschriebenen Genen abstammen, sondern können auf beliebige Art erzeugt werden, einschließlich beispielsweise chemischer Synthese, Isolierung (entweder von H. somnus oder einem anderen Organismus, der die Proteine exprimiert) oder durch rekombinante Herstellung auf der Basis der hier gegebenen Informationen. Darüber hinaus bedeuten die Begriffe Proteine, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die im wesentlichen homolog sind zu benachbarten Aminosäuresequenzen, die durch die Gene codiert werden. Somit umfassen die Begriffe sowohl Sequenzen voller Länge, trunkierte und partielle Sequenzen als auch Analoge und Vorstufenformen der Proteine. Repräsentative trunkierte Sequenzen, die von dem hmb-Gen abgeleitet sind, liegen als Fusionen bzw. Verknüpfungen mit einem trunkierten Leukotoxin-Gen von P. haemolytica in den Plasmiden pGCH5 und pGCH4 vor und sind in den Fig. 5 und 6 angegeben. Vorstufenformen von mehreren der Proteine sind im folgenden beschrieben. Die Begriffe umfassen auch Proteine in neutraler Form oder in der Form von basischen oder sauren Additionssalzen, je nach Herstellungsmodus. Derartige saure Additionssalze können freie Aminogruppen aufweisen, und basische Salze können mit freien Carboxylgruppen gebildet werden. Pharmazeutisch verträgliche basische und saure Additionssalze werden im folgenden diskutiert. Zusätzlich können die Proteine durch Kombination mit anderen biologischen Materialien, wie Lipiden (sowohl solche, die natürlich mit dem Molekül auftreten, als auch andere Lipide, die die Aktivität nicht zerstören) und Sacchariden, oder durch Seitenkettenmodifikation, wie Acetylierung von Aminogruppen, Phosphorylierung von Hydroxylseitenketten, Oxidation von Sulfhydrylgruppen, Glycosylierung von Aminosäureresten, sowie durch andere Modifikationen der codierten Primärsequenz modifiziert werden. Ein Protein, das von dem hmb-Gen oder dem hly-Gen stammt bzw. abgeleitet ist, muß nicht notwendigerweise eine Haemin-bindende bzw. haemolytische Aktivität zeigen.
Eine "isolierte" Proteinsequenz ist eine Proteinsequenz, die von dem gesamten Organismus (lebend oder abgetötet), mit dem das Protein in der Natur normalerweise vergesellschaftet ist, abgetrennt und diskret ist. Ein in einem zellfreien Extrakt enthaltenes Protein würde somit ein "isoliertes" Protein darstellen, wie dies auch ein synthetisch oder rekombinant hergestelltes Protein tun würde. Line "isolierte" Nukleotidsequenz ist eine Nukleotidsequenz, die von dem gesamten Organismus, mit dem die Sequenz in der Natur gefunden wird, abgetrennt und diskret ist, oder eine Sequenz, die ganz oder teilweise frei ist von Sequenzen, in deren Gesellschaft sie normalerweise in der Natur vorkommt, oder eine Sequenz, wie sie in der Natur vorkommt, die jedoch heterologe Sequenzen (wie im folgenden definiert wird) aufweist, die mit dieser vergesellschaftet sind.
Der Begriff "Epitop" betrifft die Stelle auf einem Antigen oder Hapten, auf die spezifische B-Zellen und T-Zellen antworten. Der Begriff wird auch austauschbar mit "antigener Determinante" oder "Ort der antigenen Determinante" verwendet.
Eine "immunologische Antwort" auf eine Zusammensetzung oder eine Vakzine bzw. einen Impfstoff ist die Entwicklung einer zellulären und/oder antikörpervermittelten Immunantwort in dem Wirt auf die interessierende Zusammensetzung oder Impf stoff.
Üblicherweise umfaßt eine solche Antwort einen oder mehrere der folgenden Effekte, ist jedoch nicht auf diese beschränkt; die Produktion von Antikörpern, B-Zellen, T- Helferzellen, T-Suppressorzellen und/oder cytotoxischen T-Zellen und/oder γ-δ-T-Zellen, die spezifisch auf ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, die in der interessierenden Zusammensetzung oder dem Impfstoff enthalten sind.
Die Begriffe "immunogenes" Protein oder Polypeptid beziehen sich auf eine Aminosäuresequenz, die eine immunologische Antwort wie zuvor beschrieben hervorruft. Ein "immunogenes" Protein oder Polypeptid, wie es hier verwendet wird, umfaßt die Sequenz des fraglichen H. somnus-Proteins in ihrer gesamten Länge, Analoge davon oder immunogene Fragmente davon. Mit "immunogenem Fragment" ist ein Fragment eines Polypeptides gemeint, das eines oder mehrere Epitope enthält und somit die zuvor beschriebene immunologische Antwort hervorruft. Solche Fragmente können beispielsweise identifiziert werden durch gleichzeitiges Synthetisieren einer großen Anzahl von Peptiden auf festen Trägern, wobei die Peptide mit Teilen des Proteinmoleküls korrespondieren, und Umsetzen der Peptide mit Antikörpern, während die Peptide noch an dem Träger befestigt sind. Solche Techniken sind in der Technik bekannt und beispielsweise beschrieben in dem US-Patent Nr. 4,708,871; Geysen, H. M., et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen, H. M., et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, die sämtliche hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Untersuchungen mit einigen bakteriellen Lipoproteinen haben gezeigt, daß der Teil des Moleküls, der für die biologische Aktivität verantwortlich ist, in der Region liegt, der die N-terminale Fettsäure enthält. Es ist gezeigt worden, daß kurze Peptide, die zwei bis fünf Aminosäuren enthalten, die mit Palmitat kovalent verknüpft sind, biologische Aktivität aufweisen (Bessler, W. G., et al., J. Immunol. (1985) 135: 1900-1905). Dementsprechend werden immunogene Fragmente für die Zwecke der vorliegenden Erfindung üblicherweise mindestens etwa 2 Aminosäuren lang sein, bevorzugter etwa 5 Aminosäuren lang, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 10 bis 15 Aminosäuren lang. Es gibt keine kritische Obergrenze für die Länge des Fragmentes, die nahezu die gesamte Länge der Proteinsequenz oder sogar ein Fusionsprotein, das zwei oder mehr Epitope des H. somnus-Proteins umfaßt, umfassen kann.
Die Begriffe "Polypeptid" und "Protein" werden austauschbar und in ihrem breitesten Sinn verwendet, d. h. jedes beliebige Polymer von Aminosäuren (Dipeptid oder größer), das durch Peptidbindungen verknüpft ist. Somit umfaßt der Begriff "Polypeptid" Proteine (die sowohl die Sequenz in Gesamtlänge als auch Fragmente davon aufweisen), Oligopeptide, Analoge, Muteine, Fusionsproteine und dergleichen.
Als "rekombinante" Polypeptide werden Polypeptide bezeichnet, die durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden, d. h., von Zellen erzeugt werden, die durch ein exogenes DNA-Konstrukt, das das gewünschte Polypeptid codiert, transformiert sind. "Synthetische" Polypeptide sind solche, die durch chemische Synthese hergestellt werden.
Ein "Replikon" ist jedes genetisches Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine eigenständige Einheit der DNA-Replikation in vitro oder in vivo fungiert, d. h., unter seiner eigenen Kontrolle zur Replikation in der Lage ist.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an den ein anderes DNA-Segment angebracht werden kann, um so die Replikation des angebrachten Segmentes zu bewirken.
Eine "Codierungssequenz" einer DNA oder eine "Nukleotidsequenz, die codiert für" ein besonderes Protein, ist eine DNA-Sequenz, die in vitro oder in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter Regulationssequenzen gestellt wird. Die Grenzen der Codierungssequenz werden bestimmt durch einen Startcodon am 5'-(Amino)-Terminus und einen Translations-Stopcodon am 3'-(Carboxy)-Terminus. Eine Codierungssequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z. B. Säuger-) DNA und selbst synthetische DNA-Sequenzen enthalten, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Eine Transkriptions-Terminationssequenz wird sich üblicherweise bei 3' zu der Codierungssequenz befinden.
DNA-"Kontrollsequenzen" ist eine Sammelbezeichnung für Promotorsequenzen, Ribosomenbindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptions-Terminationssequenzen, stromaufwärts liegende Regulator-Domänen, Enhancer und dergleichen, die kollektiv für die Transkription und Translation einer Codierungssequenz in einer Wirtszelle sorgen. Nicht alle diese Kontrollsequenzen müssen immer in einem rekombinanten Vektor vorliegen, solange das gewünschte Gen transkribiert und translatiert werden kann.
Als "operabel verknüpft" wird eine Anordnung von Elementen bezeichnet, in der die so beschriebenen Komponenten so konfiguriert sind, daß sie ihre übliche Funktion ausüben. Kontrollsequenzen, die mit einer Codierungssequenz operabel verknüpft sind, sind somit in der Lage, die Expression der Codierungssequenz zu bewirken. Die Kontrollsequenzen müssen nicht an die Codierungssequenz angrenzen, solange sie deren direkte Expression bewirken. Daher können beispielsweise dazwischenliegende, nicht translatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen einer Promotorsequenz und der Codierungssequenz vorliegen, und die Promotorsequenz kann dennoch als mit der Codierungssequenz "operabel verknüpft" angesehen werden. In ähnlicher Weise ist eine Codierungssequenz "operabel verknüpft mit" einer anderen Codierungssequenz (d. h. im Fall eines chimären Proteins), wenn RNA-Polymerase die beiden Codierungssequenzen zu mRNA transkribiert, die dann translatiert wird zu den Polypeptiden, die durch die beiden Codierungssequenzen codiert werden. Die Codierungssequenzen brauchen nicht benachbart zu sein, solange das endgültige Processing an der transkribierten Sequenz zum Herstellen des gewünschten Proteins noch nicht abgeschlossen ist.
Eine Kontrollsequenz "lenkt die Transkription" einer Codierungssequenz in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Promotorsequenz bindet und die Codierungssequenz zu mRNA transkribiert, die dann translatiert wird zu dem Polypeptid, das durch die Codierungssequenz codiert wird.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die durch eine exogene DNA-Sequenz transformiert worden ist oder zur Transformation in der Lage ist.
Eine Zelle ist durch exogene DNA "transformiert" worden, wenn eine solche exogene DNA in die Zellmembran eingeführt worden ist. Exogene DNA kann oder kann nicht integriert (kovalent verknüpft) sein in die chromosomale DNA, die das Genom der Zelle ausmacht. In Prokaryoten und Hefen beispielsweise kann die exogene DNA in einem episomalen Element, wie einem Plasmid, aufrechterhalten werden. Hinsichtlich eukaryotischer Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine solche, in der die exogene DNA in das Chromosom integriert worden ist, so daß es von Tochterzellen durch Chromosomenreplikation ererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit eukaryotischer Zellen gezeigt, Zellinien oder Klone zu etablieren, die eine Population von Tochterzellen umfassen, die die exogene DNA enthalten.
Zwei DNA- oder Polypeptidsequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 80% (vorzugweise mindestens etwa 90%, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95%) der Nukleotide oder Aminosäuren über eine definierte Länge des Moleküls zusammenpassen bzw. einander entsprechen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine Homologie von mindestens 90% zwischen zwei Polypeptiden erforderlich, damit sie als "im wesentlichen homolog" zueinander angesehen werden. Wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "im wesentlichen homolog" auch Sequenzen, die mit der spezifizierten DNA oder Polypeptidsequenz identisch sind. DNA-Sequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter z. B. stringenten Bedingungen, wie sie für dieses spezielle System definiert werden, identifiziert sind. Das Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen gehört zum Fachwissen. Siehe z. B. Sambrook et al., siehe oben; DNA Cloning, Bd. I & II, siehe oben; Nucleic Acid Hybridization, siehe oben.
Der Begriff "funktional äquivalent" bedeutet, daß die Aminosäuresequenz des betreffenden Peptids eine ist, die eine immunologische Antwort, wie zuvor definiert, hervorruft, die äquivalent ist zu der Antwort, die hervorgerufen wird durch ein H. somnus-Haemolysin, Haemin-bindendes Protein, LppA-, LppB- oder LppC-antigenes Peptid, das entweder mit der gesamten Codierungssequenz für die verschiedenen nativen Proteine oder einem immunogenen Teil davon identisch ist.
Eine "heterologe" Region eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb eines anderen DNA-Moleküls oder an dieses gebunden, das in der Natur nicht in Gesellschaft mit dem anderen Molekül gefunden wird. Wenn die heterologe Region ein bakterielles Gen codiert, wird das Gen daher üblicherweise von DNA flankiert, die das bakterielle Gen im Genom der Bakterienquelle nicht flankiert. Ein anderes Beispiel für die heterologe Codierungssequenz ist ein Konstrukt, bei dem die Codierungssequenz selbst nicht in der Natur zu finden ist (z. B. synthetische Sequenzen, die Codons aufweisen, die von dem nativen Gen verschieden sind). Allelvariation oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse erzeugen keine heterologe DNA-Region, gemäß dem hier verwendeten Begriff.
Der Begriff "Behandlung", so, wie er hier verwendet wird, betrifft entweder (i) die Prävention einer Infektion oder Reinfektion (Prophylaxe) oder (ii) die Verminderung oder Eliminierung von Symptomen der interessierenden Erkrankung (Therapie). Die erfindungsgemäßen Impfstoffe und pharmazeutischen Zusammensetzungen können daher zur Prophylaxe oder Therapie verwendet werden.
Mit "Wirbeltier" ist jedes Mitglied der Subphylum Chordata gemeint, einschließlich und ohne Einschränkung Säuger, wie Vieh, Schafe, Schweine, Ziegen, Pferde und Menschen; Haustiere, wie Hunde und Katzen, und Vögel, einschließlich zahmer und wilder Vögel und Federwild, wie Hähne und Hennen, einschließlich Küken, Truthahn und anderer hühnerartiger Vögel. Der Begriff bezeichnet kein spezielles Alter. Es sollen daher sowohl erwachsene als auch neugeborene Tiere mit umfaßt werden.

B. Allgemeine Verfahren

Im Mittelpunkt der vorliegenden Erfindung steht das Auffinden mehrerer einzigartiger, immunogener äußerer Membranproteine von H. somnus und insbesondere die LppB- Proteine. Die Gene für diese Proteine (hier als "hmb", "hly", "lppA", "lppB" und "lppC" bezeichnet) sind isoliert und charakterisiert worden. Die hmb- und verschiedene lpp-Gene sind sequenziert worden. Die Proteinprodukte von den hmb- und hly-Genen binden Hämin bzw. zeigen eine hämolytische Aktivität in den im folgenden beschriebenen Assays.
Wie in Fig. 1 gezeigt ist, befindet sich das hmb-Gen auf einem 3 kb XbaI-Fragment, das vom Plasmid pRAP117 (ATCC Accession Nr. 68952) abgeleitet ist. Mittels Western Blot-Analyse eines Klons, der dieses Fragment enthält, wird ein Protein mit einer scheinbaren Molekularmasse von 50 kDa nachgewiesen, das mit einem eisenregulierten H. somnus- Protein komigriert bzw. gemeinsam wandert. Das hly-Gen liegt in Plasmid pAA504 (ATCC Accession Nr. 68953) vor, wie durch Untersuchen dieses Plasmids mit einem 8 kb Hindill- Fragment von Plasmid pRAP117 bestätigt wurde. Das hly-Gen befindet sich auf dem distalen Ende dieses Fragments (siehe Fig. 1).
Das hmb-Gen ist in Fig. 2 als ORF1 gezeigt. Das Gen codiert ein Hämin-bindendes Protein mit 178 Aminosäuren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für das Hämin-bindende Protein von H. somnus ist in Fig. 4 gezeigt.
LppA scheint mit dem größeren 40 kfla-OMP von H. somnus zu korrespondieren. Das Gen, das LppA, lppA codiert, ist kloniert worden und die Nukleotidsequenz bestimmt worden. LppA wird durch einen einzigen Transkript einer Länge von etwa 1300 Nukleotiden spezifiziert. Der Startpunkt befindet sich an Position 757 von Fig. 7, was nahelegt, daß die Transkription jenseits des 3'-Endes der klonierten DNA endet. Es liegt ein offener Leserahmen (ORF) vor, der bei einem ATG-Codon bei Position 791 startet und bis zur Position 1531 von Fig. 7 (Aminosäurereste 1 bis 247) läuft. Diese Region scheint das Präprotein zu codieren. Das berechnete Molekulargewicht, basierend auf der Sequenz, ist 27072. Dieser Leserahmen wurde durch Sequenzieren der Fusionsverbindung zweier unabhängiger lppA::TnphoA-Genfusionen bestätigt. Obwohl das vorhergesagte Molekulargewicht geringer ist als erwartet, codiert der ORF somit tatsächlich das LppA-Protein. Das anomale Molekulargewicht liegt wahrscheinlich in der Lipidnatur des Moleküls begründet. Der Bereich stromabwärts von dem lppA-Gen enthält keine ORFs einer signifikanten Länge. Ebenso ist das LppA-Protein das einzige Polypeptid, das durch das H. somnus-Insert in E. coli-Minizellen spezifiziert ist. Es ist daher wahrscheinlich, daß lppA als ein einzelnes Cistron transkribiert wird.
Es ist keine signifikante Homologie zwischen der kompletten LppA-Aminosäuresequenz und in Genbank gesammelten Sequenzen gefunden worden.
LppA scheint eine Signalsequenz zu enthalten. Die 21 N-terminalen Aminosäuren zeigen eine starke Sequenzhomologie zu dem Signalpeptid anderer sekretierter Proteine, und die Sequenz, Leu-Leu-Ala-Ala-Cys, an der vermutlichen Spaltstelle ist identisch mit der Consensus-Spaltsequenz von Lipoproteinen Gram-negativer Bakterien. Das reife Protein reicht daher von den Positionen 854 bis einschließlich 1531 (Aminosäurereste 22 bis einschließlich 247) von Fig. 7. Der ORF codiert somit ein Präprotein mit 247 Aminosäureresten und ein reifes Polypeptid mit 226 Aminosäureresten.
Das Vorliegen der Lipidgruppe auf dem Protein wurde durch den Einbau radioaktiver Palmitinsäure in das natürliche H. somnus-Protein gezeigt. Palmitinsäure wurde auch in das Protein eingebaut, wenn es in E. coli rekombinant erzeugt wurde. Die Synthese von reifem LppA-Lipoprotein wurde durch Globomycin inhibitiert, was zeigt, daß eine Spaltung des Signalpeptides durch Signalpeptidase II in beiden Organismen vermittelt wird. Unter Verwendung gerichteter Mutagenese wurde der Cys-Rest an der Spaltstelle zu Glycin geändert. Radiomarkiertes Palmitat wurde in das mutierte Protein nicht eingebaut, was zeigt, daß Lipidmodifikation an dem Cys-22-Rest stattfindet.
Lipoprotein LppB wurde kloniert und untersucht. Das Gen, lppB, codiert auch ein äußeres Membran-Lipoprotein mit 40 kDa von H. somnus. Dieses Lipoprotein ist antigenisch distinkt von LppA, und Plasmide, die das lppB-Gen beherbergen, hybridisieren nicht mit Plasmiden, die LppA codieren. Lipidgruppen auf dem Molekül wurden wie zuvor beschrieben nachgewiesen. Fig. 9 stellt ein chromosomales Fragment dar, das lppB enthält. Der das LppB codierende ORF beginnt an der Position 872 und endet mit einem TAA-Codon an der Position 1709. Eine vermutliche Ribosomenbindungsstelle, GGAG, befindet sich stromaufwärts, und ein A/T-reicher Spacer mit sieben Basenpaaren geht dem ATG-Startcodon voran. Das lppB-Gen codiert ein Präprotein mit 279 Aminosäuren. Die ersten 16 Aminosäuren von LppB scheinen eine Signalsequenz zu spezifizieren. Auf die Aminosäurereste 1 bis 13 folgt eine Lipoproteinbox, Leu- Ala-Ala-Cys. Diese Region ähnelt stark den Signalpeptiden anderer prokaryotischer Lipoproteine, einschließlich dem zuvor beschriebenen LppA. Das reife Lipoprotein reicht von den Positionen 920 bis 1708 (Aminosäurereste 17 bis 279) von Fig. 9. Die berechnete Molekularmasse von LppB ist 31307 Dalton. Wiederum liegt die Diskrepanz in der Größe wahrscheinlich an der Lipidnatur des Proteins.
LppB bindet sowohl Kongorot als auch Hämin auf Agarplatten. Andererseits bindet das LppA keines dieser Proteine. Es ist bekannt, daß einige pathogene Bakterien den aromatischen Farbstoff Kongorot adsorbieren können und daß diese Fähigkeit mit der Virulenz stark korreliert (Daskaleros & Payne, Infect. Immun. (1985) 48: 165-168; Maurelli et al., Infect. Immun. (1984) 43: 397-401). Die molekulare Basis für diese Adsorption ist unklar, obwohl in E. coli und S. flexneri die Bindung von Kongorot mit dem Vorliegen eines großen Virulenzplasmids in Verbindung gebracht worden ist (Maurelli et al. 1984). Es ist auch vorgeschlagen worden, daß die Fähigkeit bestimmter Spezies, Kongorot zu binden, mit ihrer Fähigkeit zusammenhängt, Eisen zu sequestrieren, und daß die Bindung von Kongorot und die Adsorption von Hämin korreliert sind (Prpic et al. 1983). Die Fähigkeit von LppB, Kongorot und Hämin zu binden, kann als eine Selektionstechnik bei der rekombinanten Produktion verwendet werden.
Das Gen, das ein drittes Lipoprotein von H. somnus, LppC, codiert, ist ebenfalls kloniert worden. LppC ist ein 60 kDa-Lipoprotein, wie mittels Gelelektrophorese bestimmt wurde. Die Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von LppC ist in Fig. 10 angegeben. Ein ORF, der an der Position 108 beginnt und an der Position 1850 endet, codiert ein Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 63 336 Dalton. Wie bei LppA und LppB enthält das Präprotein eine typische prokaryotische Signalsequenz. Die Signalsequenz umfaßt die ersten 21 Aminosäuren, und somit beginnt die das reife Protein codierende DNA an der Nukleotidposition 171. Die Lipidnatur dieses Proteins wurde wie bei LppA und LppB bestätigt. Wie LppB ist auch LppC in der Lage, sowohl Kongorot als auch Hämin zu binden.
Wie zuvor erläutert wurde, werden die LppA-, LppB- und LppC-Proteine normalerweise in Gesellschaft mit Lipidgruppen gefunden. Es ist wahrscheinlich, daß die vorliegende Fettsäuregruppe ein Palmitinsäurederivat ist. Die erfindungsgemäßen Antigene machen das Vorliegen der Lipidgruppe nicht erforderlich, obwohl sie Epitope tragen, die von dem LppB-Lipoprotein abgeleitet sind. Darüber hinaus muß das Lipid, wenn es vorliegt, nicht ein Lipid sein, das üblicherweise mit dem Lipoprotein vergesellschaftet ist, solange die geeignete immunologische Antwort hervorgerufen wird. In jedem Fall können geeignete Fettsäuren, wie Palmitinsäure oder Palmitinsäureanaloge, jedoch nicht nur diese, zu der gewünschten Aminosäuresequenz bequem während der Synthese zugegeben werden, wobei Standardtechniken eingesetzt werden. Beispielsweise ist an S-Glyceryl-L-Cys gebundenes Palmitoyl (Pam&sub3;-Cys) im Handel erhältlich (z. B. durch Boehringer Mannheim, Dorval, Quebec) und kann ohne weiteres während der Synthese in eine Aminosäuresequenz eingebaut werden. Siehe z. B. Deres, K., et al., Nature (1989) 342: 561. Dies ist ein besonders bequemes Herstellungsverfahren, wenn relativ kurze Aminosäuresequenzen verwendet werden. In ähnlicher Weise können rekombinante Systeme verwendet werden, die die exprimierten Proteine durch Zugabe geeigneter Fettsäuren vervielfältigen. Repräsentative Systeme für eine rekombinante Produktion werden im folgenden diskutiert.
Ein LppB-Protein von H. somnus, Analoge davon, immunogene Fragmente davon oder chimäre Proteine, die selbige enthalten, können in Subunit-Impfzusammensetzungen bereitgestellt werden, und somit werden früheren Impfzusammensetzungen inhärente Probleme, wie lokalisierte und systemische Nebenreaktionen, sowie immunosuppressive Wirkungen, vermieden. Zusätzlich zur Verwendung in Impfzusammensetzungen können die Proteine oder Antikörper dagegen als Diagnosereagenzien zum Nachweis des Vorliegens einer H. somnus- Infektion in einem Lebewesen verwendet werden. In ähnlicher Weise kann das das Protein codierende Gen kloniert werden und zum Designen von Sonden für den Nachweis von H. somnus in Gewebeproben sowie für den Nachweis von homologen Genen in anderen Bakterienstämmen verwendet werden.
Es wird manchmal bevorzugt sein, mehr als ein Epitop von einem oder mehreren der Proteine in den erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen zur Verfügung zu haben. In der einfachsten Form kann dies erreicht werden durch Einsetzen eines Polypeptids, das die Sequenz des LppB-Proteins in voller Länge umfaßt (das mehr als ein Epitop umfaßt), oder durch Einsetzen einer Kombination von Polypeptiden, die die Sequenzen von zwei oder mehreren der beschriebenen Proteine umfassen. Die Impfzusammensetzungen könnten daher beispielsweise verschiedene Kombinationen umfassen, wie beispielsweise eines der LppB-Proteine und eines oder mehrere der anderen H. somnus-Proteine, oder eine Kombination aller beschriebenen Proteine.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen Fusionsproteine (die in dem obigen Wort "Protein" enthalten sind) enthalten, die Fragmente von einem oder mehreren der H. somnus-Antigene umfassen, die beispielsweise mit einem bakteriellen, pilzartigen, viralen oder protozoischen Antigen fusioniert bzw. verknüpft sind. Beispielsweise sind chimäre Proteine gebaut worden, die trunkierte Hämin-bindende Proteine umfassen, die mit dem P. haemolytica-Leukotoxin verknüpft sind; die Sequenzen sind in den Fig. 5 und 6 dargestellt. Die Chimäre in Fig. 5 enthält ein Gen, das ein Hämin-bindendes Protein codiert, dem die ersten beiden Aminosäurereste des nativen Produktes fehlen und mit einem trunkierten Leukotoxinmolekül verknüpft ist, das durch das lktA-Gen von P. haemolytica (erhältlich unter ATCC Accession Nr. 68283) codiert wird. Das in Fig. 6 dargestellte Konstrukt enthält eine Deletion der ersten 32 Aminosäurereste des Häminbindenden Proteins von H. somnus, ebenfalls verknüpft mit dem lktA-Gen von P. haemolytica. In ähnlicher Weise sind auch chimäre Konstrukte von lppB, verknüpft mit dem lktA- Gen von P. haemolytica, hergestellt worden; die Sequenz ist in Fig. 11 dargestellt. Derartige chimäre Proteine können mittels rekombinanter Techniken hergestellt werden, wie sie hier und z. B. im US-Patent Nr. 4,366,246; Hughes, H. P. A., et al. (1992) Infect. Immun. 60: 565-570; PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO/88/00971 (veröffentlicht 11. Februar 1988); und der bewilligten US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/571,301 beschrieben sind.
Die Impfzusammensetzungen können verwendet werden, um eine breite Vielfalt von H. somnus-Infektionen bei Tieren zu behandeln oder zu verhindern. Solche Infektionen umfassen thromboembolische Meningoencephalitis (ITEME), Septikämie, Arthritis und Pneumonie (Corbelll, L. B., Can. J. Vet. Res. (1990) 54: 557-562; Harris, F. W., und Janzen, E. D., Can. Vet. J. (1990) 30: 816-822; Humphrey, J. D., und Stephens, L. R., Vet. Bull. (1983) 53: 987-1004), sowie Myocarditis, Pericarditis, spontanen Abort, Infertilität und Mastitis. Andere Antigene können ebenfalls in den Impfzusammensetzungen enthalten sein, wie beispielsweise das weiter unten beschriebene P. haemolytica-Leukotoxin. Daher dienen diese Zusammensetzungen auch zur Prävention von Erkrankungen, die durch diese Organismen verursacht werden, d. h. unter anderem respiratorische Erkrankungen, die durch P. haemolytica verursacht werden, Symptome des sog. Shipping fever und bovine respiratorische Erkrankungen bei Feedlot- Rindern.

Herstellung der H. somnus-Proteine

Die zuvor beschriebenen Proteine und aktiven Fragmente, Analoge und chimären Proteine, die von diesen abgeleitet sind, können durch eine Vielzahl von Verfahren erzeugt werden. Insbesondere können die Proteine direkt von H. somnus aus Zubereitungen der äußeren Membran isoliert werden, wobei Standard-Reinigungstechniken verwendet werden. Siehe z. B. Theisen, M., und Potter, A., Infect. Immun. (1992), im Druck. Alternativ können die Proteine wie hier beschrieben rekombinant erzeugt werden. Die Proteine können auch auf der Basis der bestimmten Aminosäuresequenzen synthetisiert werden, wobei in der Technik gut, bekannte Techniken verwendet werden.
Beispielsweise können die Proteine aus Bakterien isoliert werden, die diese exprimieren. Dies wird allgemein erreicht, indem zunächst ein Rohextrakt hergestellt wird, dem zelluläre Komponenten und mehrere überzählige Proteine fehlen. Die gewünschten Proteine können dann weiter gereinigt werden, d. h. mittels Säulenchromatographie, HPLC, Immunoadsorptionstechniken oder anderer herkömmlicher, in der Technik gut bekannter Verfahren.
Die H. somnus-Proteine können bequem als rekombinante Polypeptide erzeugt werden. Wie zuvor beschrieben wurde, können diese rekombinanten Produkte in Form von partiellen Proteinsequenzen, Sequenzen in ihrer gesamten Länge oder sogar Fusionsproteinen vorliegen (d. h. mit einem geeigneten Leader für den rekombinanten Wirt, oder mit einer anderen Subunit-Antigensequenz für H. somnus oder einen anderen Krankheitserreger).
Die hmb- und hly-Gene können auf der Basis der Fähigkeit der Proteinprodukte, Hämin zu binden bzw. hämolytische Aktivität zu zeigen, isoliert werden. Auf diese Weise können Genbibliotheken aufgebaut und die so erhaltenen Klone verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Kolonien können vereinigt und auf geeignete Klone, die diese Eigenschaften aufweisen, gescreent werden. Kolonien können auch unter Verwendung von zu dem gewünschten Antigen polyklonalem Serum oder monoklonalen Antikörpern gescreent werden, um die lppA-, lppB- und lppe-Gene zu identifizieren.
Wenn die Aminosäuresequenzen einmal bestimmt wurden, können alternativ Oligonukleotidsonden, die die Codons für einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenzen enthalten, hergestellt und verwendet werden, um DNA-Bibliotheken auf Gene zu screenen, die die betreffenden Proteine codieren. Die grundlegenden Vorgehensweisen zum Herstellen von Oligonukleotidsonden und DNA-Bibliotheken sowie deren Screening durch Nucleinsäurehybridisierung sind dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. DNA Cloning: Bd. I, siehe oben; Nucleic Acid Hybridization, siehe oben; Oligonucleotide Synthesis, siehe oben; T. Maniatis et al., siehe oben. Wenn ein Klon aus der gescreenten Bibliothek einmal durch positive Hybridisierung identifiziert worden ist, kann mittels Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden, daß das spezielle Bibiliothekinsert das gewünschte H. somnus-Gen oder ein Homologes davon enthält.
Alternativ können DNA-Sequenzen, die die interessierenden Proteine codieren, nicht kloniert, sondern vielmehr synthetisch hergestellt werden. Die DNA-Sequenzen können mit den geeigneten Codons für die spezifische Aminosäuresequenz designed werden. Allgemein wird man bevorzugte Codons für den beabsichtigten Wirt auswählen, wenn die Sequenz für die Expression verwendet wird. Die vollständige Sequenz wird zusammengesetzt aus überlappenden Oligonukleotiden, die mittels Standardverfahren hergestellt und zu einer vollständigen Codierungssequenz zusammengefügt werden. Siehe z. B. Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.
Sind erst einmal Codierungssequenzen für die gewünschten Proteine hergestellt oder isoliert worden, können sie in jeden geeigneten Vektor oder Replikon kloniert werden. Zahlreiche Klonierungsvektoren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors ist eine Frage der Wahl. Beispiele für rekombinante DNA-Vektoren zum Klonieren und Wirtszellen, die sie transformieren können, umfassen den Bakteriophagen λ(E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (Gram-negative Bakterien), pGV1106 (Gram-negative Bakterien) pLAFR1 (Gram-negative Bakterien), pME290 (Gram-negative nicht-E. coli-Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces) pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCpl9 (Saccharomyces) und bovinen Papillomavirus (Säugetierzellen). Siehe allgemein DNA Cloning: Bd. I & II, siehe oben; T. Maniatis et al., siehe oben; B. Perbal, siehe oben.
Das Gen kann unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle (für bakterielle Expression) und wahlweise eines Operators (hier kollektiv als "Kontroll"elemente bezeichnet) gestellt werden, so daß die DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein codiert, in der Wirtszelle, die durch einen diese Expressionskonstruktion enthaltenden Vektor transformiert worden ist, zu RNA transkribiert wird. Die Codierungssequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz enthalten oder nicht. Wenn Signalsequenzen enthalten sind, können diese entweder native Sequenzen oder heterologe Sequenzen sein. Leadersequenzen können durch den Wirt bei posttranslatorischem Processing entfernt werden. Siehe z. B. US-Patent Nrn. 4,431,739; 4,425,437; 4,338,397.
Andere Regulationssequenzen, die eine Regulation der Expression der Proteinsequenzen relativ zu dem Wachstum der Wirtszelle ermöglichen, können ebenfalls wünschenswert sein. Regulatorische Sequenzen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt; Beispiele umfassen diejenigen, die dazu führen, daß die Expression eines Gens als Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Reiz, einschließlich das Vorliegen einer regulatorischen Verbindung, ein- bzw. ausgeschalten wird. Andere Arten von regulatorischen Elementen, beispielsweise Enhancersequenzen, können ebenfalls in dem Vektor vorliegen.
Die Kontrollsequenzen und andere Regulationssequenzen können vor der Insertion in einen Vektor, wie den zuvor beschriebenen Klonierungsvektoren, an die Codierungssequenz gebunden werden. Alternativ kann die Codierungssequenz direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden, der die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle bereits enthält.
In einigen Fällen kann es erforderlich sein, die Codierungssequenz zu modifizieren, so daß sie an die Kontrollsequenzen mit der geeigneten Orientierung angebracht werden kann; d. h. um den richtigen Leserahmen aufrecht zu erhalten. Es kann auch wünschenswert sein, Mutanten oder Analoge des interessierenden H. somnus-Proteins zu erzeugen. Mutanten oder Analoge können hergestellt werden durch Deletion eines Teils der Sequenz, die das Protein codiert, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution einer oder mehrerer Nukleotide innerhalb der Sequenz. Techniken zum Modifizieren von Nukleotidsequenzen, wie gerichtete Mutagenese, sind z. B. beschrieben in Sambrook et al., siehe oben; DNA Cloning, Bd. I und II, siehe oben; Nucleic Acid Hybridization, siehe oben.
Der Expressionsvektor wird dann zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle verwendet. In der Technik sind eine Anzahl von Säugetierzellinien bekannt und umfassen immortalisierte Zellinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, wie beispielsweise, jedoch nicht darauf beschränkt, Ovarialzellen von chinesischen Hamstern (CHO-Zellen), HeLa-Zellen, Nierenzellen von Babyhamstern (BHK-Zellen), Nierenzellen von Affen (COS-Zellen), menschliche hepatozelluläre Karzinomzellen (z. B. Hep G2), bovine Madin-Darby Nieren ("MDBK")-Zellen, sowie andere. Auf ähnliche Weise finden bakterielle Wirte, wie E. coli, Bacillus subtilis und Streptococcus spp., in den vorliegenden Expressionskonstrukten Verwendung. In der vorliegenden Erfindung brauchbare Hefewirte umfassen u. a. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica. Insektenzellen zur Verwendung mit saculovirus-Expressionsvektoren umfassen u. a. Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni.
Je nach ausgewähltem Expressionssystem und Wirt werden die Proteine erzeugt durch Kultivieren von Wirtszellen, die von einem zuvor beschriebenen Expressionsvektor unter Bedingungen transformiert worden sind, unter denen das interessierende Protein exprimiert wird. Das Protein wird dann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem das Protein in die Wachstumsmedien sekretiert, kann das Protein direkt aus den Medien gereinigt werden. Wenn das Protein nicht sekretiert wird, wird es aus Zelllysaten isoliert. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und Gewinnungsverfahren gehören zum fachlichen Können.
Die Proteine können auch durch chemische Synthese, wie Festphasen-Peptidsynthese, erzeugt werden, wobei bekannte Aminosäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen verwendet werden, die von der DNA-Sequenz der interessierenden Gene abgeleitet sind. Solche Verfahren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Chemische Synthese von Peptiden kann bevorzugt sein, wenn ein kleines Fragment des fraglichen Antigens in der Lage ist, eine immunologische Antwort in dem interessierenden Lebewesen hervorzurufen.
Die Proteine oder deren Fragmente können verwendet werden, um sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper zu erzeugen. Wenn polyklonale Antikörper erwünscht sind, wird ein ausgewähltes Säugetier (z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd, usw.) mit einem erfindungsgemäßen Antigen oder dessen Fragment oder einem mutierten Antigen immunisiert. Serum des immunisierten Tieres wird gesammelt und gemäß bekannter Vorgehensweisen behandelt. Wenn polyklonale Antikörper enthaltendes Serum verwendet wird, können die polyklonalen Antikörper mittels Immunoaffinitätschromatographie unter Verwendung bekannter Vorgehensweisen gereinigt werden.
Zu den Proteinen und zu deren Fragmenten monoklonale Antikörper können ebenfalls ohne weiteres von einem Fachmann auf diesem Gebiet erzeugt werden. Die allgemeine Methodologie zum Herstellen von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung der Hybridomatechnologie ist gut bekannt. Immortale Antikörper-produzierende Zellinien können durch Zellfusion und auch durch andere Techniken erzeugt werden, wie direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus. Siehe z. B. M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); siehe auch US-Patente Nrn. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4.444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632 und 4,493,890. Panels monoklonaler Antikörper, die gegen das interessierende Antigen oder Fragment davon produziert wurden, können auf verschiedene Eigenschaften gescreent werden, d. h. auf Isotyp, Epitop, Affinität, usw. Monoklonale Antikörper sind brauchbar bei der Reinigung der einzelnen Antigene, gegen die sie gerichtet sind, wobei Immunoaffinitätsverfahren verwendet werden.

Impfformulierungen und Verabreichung

Die H. somnus-Proteine können entweder alleine oder in Kombination mit anderen Antigenen zu Impfzusammensetzungen formuliert werden, die bei der Immunisierung von Lebewesen verwendet werden, wie im folgenden beschrieben ist. Verfahren für die Herstellung solcher Formulierungen sind z. B. beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. Auflage, 1975. Üblicherweise werden die erfindungsgemäßen Impfstoffe als Injektionen hergestellt bzw. zubereitet, und zwar entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen. Feste Formen, die zum Lösen oder Suspendieren in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch emulgiert sein, oder der aktive Bestandteil kann in Liposomenvehikeln eingekapselt sein. Der aktive immunogene Bestandteil ist im allgemeinen mit einem kompatiblen pharmazeutischen Vehikel vermischt, wie beispielsweise Wasser, Kochsalzlösungen, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen, und Kombinationen davon. Darüber hinaus kann das Vehikel, falls gewünscht, geringe Mengen Hilfssubstanzen, wie Netzmittel oder Emulgatoren und pH-Puffersubstanzen, enthalten.
Adjuvantien, die die Effektivität des Impfstoffs verbessern, können der Formulierung ebenfalls zugegeben werden. Adjuvantien können beispielsweise Muramyldipeptide, Avridin, Aluminiumhydroxid, Öle, Saponine, Cytokine und andere in der Technik bekannte Substanzen umfassen.
Das Protein kann mit einem Träger bzw. Carrier verbunden sein, um seine Immunogenität zu erhöhen. Geeignete Träger umfassen große, langsam verstoffwechselte Makromoleküle, wie Proteine, einschließlich Serumalbumine, Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, Immunoglobulinmoleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere Proteine, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind; Polysaccharide, wie Sepharose, Agarose, Cellulose, Cellulosebeads und dergleichen; polymere Aminosäuren, wie Polyglutaminsäure, Polylysin und dergleichen; Aminosäure-Copolymere und inaktive Viruspartikel.
Die Proteinsubstrate können in ihrer nativen Form verwendet werden, oder ihre funktionelle Gruppe kann beispielsweise durch Succinylierung von Lysinresten oder Umsetzen mit Cys-Thiolacton modifiziert sein. Eine Sulfhydrylgruppe kann ebenfalls in den Träger (oder das Antigen) eingebaut sein, beispielsweise durch Reaktion funktioneller Aminogruppen mit 2-Iminothiolan oder dem N-Hydroxysuccinimidester von 3-(4-Dithiopyridylpropionat. Geeignete Träger können auch modifiziert sein, um Spacerarme (wie Hexamethylendiamin oder andere bifunktionale Moleküle ähnlicher Größe) zum Befestigen von Peptiden einzubauen.
Andere geeignete Träger für die Proteine umfassen VP6-Polypeptide von Rotaviren oder funktionale Fragmente davon, wie in dem US-Patent Nr. 5,071,651 beschrieben ist, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Ein Fusionsprodukt aus einem viralen Protein und den betreffenden Immunogenen, die durch in dem US-Patent Nr. 4,722,840 beschriebene Verfahren erzeugt werden, ist ebenfalls brauchbar. Noch andere geeignete Träger umfassen Zellen, wie Lymphozyten, da das Vorliegen in dieser Form die natürliche Art des Vorliegens in dem Lebewesen imitiert, was zu dem immunisierten Zustand führt. Alternativ können die Proteine der vorliegenden Erfindung an Erythrozyten, vorzugsweise die eigenen Erythrozyten des Lebewesens, gekoppelt werden. Verfahren zum Koppeln von Peptiden an Proteine oder Zellen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Darüber hinaus können die Proteine (oder Komplexe davon) in entweder neutraler Form oder Salzform zu Impfzusammensetzungen formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die sauren Additionssalze (die mit den freien Aminogruppen der aktiven Polypeptide gebildet werden), die mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salz- oder Phosphorsäuren, oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet werden. Salze, die von freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen stammen, wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisen(III-)hydroxide, und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und dergleichen.
Injizierbare Impfformulierungen enthalten eine "therapeutisch wirksame Menge" des aktiven Bestandteils, d. h. eine Menge, die in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Lebewesen hervorzurufen, dem die Zusammensetzung verabreicht wird. Die exakte Menge läßt sich ohne weiteres von einem Fachmann auf diesem Gebiet bestimmen. Der aktive Bestandteil liegt tyischerweise im Bereich von etwa 1% bis etwa 95% (Gew./Gew.) der Zusammensetzung, oder falls angemessen, sogar höher oder niedriger. Bei den vorliegenden Impfformulierungen sollten 50 bis 500 ug aktiver Bestandteil pro ml injizierte Lösung ausreichend sein, um eine immunologische Antwort hervorzurufen, wenn eine Dosis von 1 bis 3 ml pro Tier verabreicht wird. Um ein Lebewesen zu immunisieren, wird der Impfstoff im allgemeinen parenteral verabreicht, normalerweise durch intramuskuläre Injektion. Andere Arten der Verabreichung, wie subkutane, intraperitoneale und intravenöse Injektion, sind jedoch ebenfalls annehmbar. Die zu verabreichende Menge hängt ab von dem zu behandelnden Tier, der Fähigkeit des Immunsystem des Tiers, Antikörper zu synthetisieren, und dem gewünschten Grad des Schutzes. Wirksame Dosierungen können von dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet durch Routineversuche, mittels derer Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt werden, ohne weiteres ermittelt werden. Das Lebewesen wird durch Verabreichen des Impfstoffs in mindestens einer Dosis, und vorzugsweise in zwei Dosen, immunisiert. Darüber hinaus können dem Tier so viele Dosen verabreicht werden, wie erforderlich sind, um einen Zustand der Immunität gegen eine H. somnus-Infektion zu erhalten.
Zusätzliche Impfformulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, umfassen Suppositorien und in manchen Fällen Aerosol-, Intranasal- und orale Formulierungen und Formulierungen mit Langzeitwirkung. Für Suppositorien enthält die Vehikelzusammensetzung herkömmliche Bindemittel und Träger, wie polyalkalische Glycole oder Triglyceride. Solche Suppositorien können aus Gemischen gebildet sein, die den aktiven Bestandteil im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 10% (Gew./Gew.), vorzugsweise etwa 1% bis etwa 2%, enthalten. Orale Vehikel umfassen solche normalerweise verwendeten Exzipientien wie beispielsweise Mannit, Lactose, Stärke, Magnesium, Stearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen in pharmazeutischem Reinheitsgrad. Diese oralen Impfzusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit Langzeitwirkung oder Pulver genommen werden und enthalten von etwa 10% bis etwa 95% aktiven Bestandteil, vorzugsweise etwa 25% bis etwa 70%.
Intranasale Formulierungen enthalten üblicherweise Vehikel, die weder die Nasenschleimhaut reizen, noch die Funktion des Ciliums wesentlich stören. Verdünnungsmittel, wie Wasser, wäßrige Kochsalzlösung oder andere bekannte Substanzen, können mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Nasalformulierungen können auch Konservierungsstoffe enthalten, wie Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid, jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein Surfactant kann vorhanden sein, um die Absorption der betreffenden Proteine durch die Nasenschleimhaut zu verbessern.
Formulierungen für kontrollierte oder Langzeitwirkung werden hergestellt, indem das Protein in Träger oder Vehikel, wie Liposome, nicht-resorbierbare, impermeable Polymere, wie Ethylenvinylacetat-Copolymere und HytrelR-Copolymere, quellbare Polymere, wie Hydrogele, oder resorbierbare Polymere, wie Kollagen, und bestimmte Polysäuren oder Polyester, wie diejenigen, die für die Herstellung von resorbierbaren Nahtmaterialien verwendet werden, eingebaut wird. Die Proteine können auch unter Verwendung implantierter Minipumpen verabreicht werden, die in der Technik gut bekannt sind.
Die Proteine können auch über einen Carriervirus verabreicht werden, der diese exprimiert. Carrierviren, die in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden, umfassen die Vaccinia- und andere Pockenviren, Adenovirus und Herpesvirus, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispielsweise können Vaccinia-Virus-Rekombinanten, die die Proteine exprimieren, wie folgt konstruiert werden. Die das spezifische Protein codierende DNA wird zunächst in einen geeigneten Vektor eingebracht, so daß sie an einen Vaccinia-Promotor angrenzt und Vaccinia-DNA-Sequenzen, wie die Thymidinkinase (TK) codierende Sequenz, flankiert. Dieser Vektor wird dann verwendet, um Zellen zu transfizieren, die gleichzeitig mit Vaccinia infiziert werden. Mittels homologer Rekombination wird der Vaccinia-Promotor und das Gen, das das betreffende Protein codiert, in das virale Genom eingebracht. Die so erhaltene TK-Rekombinante kann durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart von 5-Bromdesoxyuridin und Wählen dazu resistenter viraler Plaques ausgewählt werden.
Ein alternativer Weg der Verabreichung umfaßt die Gentherapie oder Nucleinsäureimmunisierung. Auf diese Weise können Nukleotidsequenzen (und begleitende regulatorische Elemente), die die betreffenden Proteine codieren, einem Lebewesen direkt für deren in vivo-Translation verabreicht werden. Alternativ kann der Gentransfer dadurch erreicht werden, daß die Zellen oder Gewebe des Lebewesens ex vivo transfiziert und das transformierte Material wieder in den Wirt eingeführt wird. DNA kann direkt, d. h. durch Injektion, in den Wirtsorganismus eingeführt werden (siehe internationale Veröffentlichungs-Nr. WO/90/11092; und Wolff et al., Science (1990) 247: 1465-1468). Liposomenvermittelter Gentransfer unter Verwendung bekannter Verfahren kann ebenfalls durchgeführt werden. Siehe z. B. Hazinski et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1991) 4: 206-209; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. (1989) 298: 278-281; Canonico et al., Clin. Res. (1991) 39: 219A; und Nabel et al., Science (1990) 249: 1285-1288. Targetagentien, wie Antikörper, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind, die auf spezifischen Zelltypen exprimiert werden, können kovalent an die liposomale Oberfläche konjugiert werden, so daß die Nucleinsäure an spezifische Gewebe und Zellen transportiert werden kann, die für H. somnus-Infektionen anfällig sind.
Es folgen Beispiele für spezifische Ausführungsformen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele sind nur zum Zwecke der Veranschaulichung angegeben und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken.
Beispiel 6 beschreibt die Klonierung und Charakterisierung von LppB. Beispiel 9 beschreibt den Bau von Leukotoxin- LppB-Fusionsproteinen, und Beispiel 10 betrifft deren Schutzfähigkeit. Beispiel 8 ist ein Vergleichsbeispiel, das die Schutzfähigkeit von LppB, LppB + LppA und LppA betrifft. Beispiele 1 bis 5 und 7 betreffen andere H. somnus-Proteine, die mit LppB-Proteinen in erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen enthalten sein können.

Hinterlegung von Stämmen, die für die Durchführung der Erfindung brauchbar sind

Biologisch reine Kulturen der folgenden Stämme wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Die angegebene Hinterlegungs- bzw. Accessions-Nr. wurde nach erfolgreichem Test auf die Lebensfähigkeit zugeteilt, und die erforderlichen Gebühren wurden entrichtet. Die bezeichneten Hinterlegungen werden für eine Zeitdauer von dreißig (30) Jahren ab dem Hinterlegungsdatum oder für fünf (5) Jahre nach der letzten Anfrage nach der Hinterlegung aufrechterhalten, je nachdem, welcher Zeitraum länger ist. Sollte eine Kultur nicht mehr lebensfähig sein oder versehentlich zerstört werden oder, im Falle von Plasmid enthaltenden Stämmen, ihr Plasmid verlieren, wird es durch eine lebensfähige Kultur (Kulturen) derselben taxonimischen Beschreibung ersetzt werden.

C. Experimentell

Materialien und Verfahren

Enzyme wurden von kommerziellen Quellen erworben und gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Radionukleotide und Nitrocellulosefilter wurden ebenfalls von kommerziellen Quellen erworben.
Bei der Isolierung von DNA-Fragmenten wurden alle DNA- Manipulationen, außer wo anders angegeben, gemäß Standardvorgehensweisen durchgeführt. Siehe Sambrook et al., siehe oben. Restriktionsenzyme, Ta-DNA-Ligase, E. coli, DNA- Polymerase I, Klenow-Fragment und andere biologische Reagenzien können von kommerziellen Lieferanten erworben und gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet werden. Doppelsträngige DNA-Fragmente wurden auf Agarosegelen getrennt.

Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsbedingung.

Plasmid pHC79 wurde verwendet, um die Cosmidbibliothek aufzubauen, und ist im Handel erhältlich von Boehringer- Mannheim.
E. coli-Stamm MC1061 ist ohne weiteres erhältlich. E. coli DH5a (φ80, lacZ M15, endA1, recA1, hsdR17 (rk, mk+), supE44, thi-1, gyrA96, relA1 (lacZYA-argF), U169)/'laclq proAB+lacZ M15, Tn5(IKmR); und JM105 (endAl, thi, rpsL, sbcB15, hsdR4, lac-proAB), [F'traD36, proAB+, laclq Z M15)] sind im Handel erhältlich (d. h. Stratogene) und CC118 (aroD139, (ara, leu)7697, lacX74, phoA 20, galE, galK, thi, rpsE, rpoB, argEam, recA1) von C. Manoil, Harvard University (Manoil, C., und Beckwith, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8129-8133).
E. coli-Stämme wurden in Luria-Nährmedium (LB) oder M9 (Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, (1972) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) wachsen gelassen. Ampicillin wurde mit 100 ug/ml und Kanamycin mit 25 ug/ml verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist.
H. somnus-Stamm HS25 ist in Expositionsexperimenten verwendet worden, um experimentelle Haemophilosis in Kälbern zu induzieren (Harland, R. J., et al., Conf. Res. Work. Anim. Dis. 71st (1990) 29: 6). Die Wachstumsbedingungen für Stamm HS25, das Plasmid pGH433 und der Aufbau der Genombibliothek sind beschrieben worden tTheisen, M., und Potter, A. A., J. Bacteriol. (1992) 174: 17-23). Für Wachstum bei eingeschränkt vorliegendem Eisen wurde der Hirn-Herz- Infusionsnährlösung (BHI-TT) (Difco Laboratories), die 0,1% Tris-Base und 0,001% Thiaminmonophosphat enthält, der Eisen-Chelatbildner 2,2-Dipyridyl (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) bis zu einer Endkonzentration von 100 uM zugesetzt. Eisengesättigte Bakterien wurden in BHI-TT, die 50 uM Fe(NO&sub3;)&sub3; enthielt, wachsen gelassen.

DNA-Techniken.

Restriktionsenzyme, das Klenow-Fragment von E. coli-DNA- Polymerase I, T4-DNA-Ligase und Exonuclease III wurden wie von den Lieferanten empfohlen verwendet. Die DNA- Sequenzierung wurde durch das Ketten-Abbruch-Verfahren erreicht, im wesentlichen wie von Messing, 1983 (Manoil, C., und Beckwith, J., Science (1986) 233: 1403-1408) beschrieben wurde. Die Primerextension wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Theisen, M., et al., Infect. Immun. (1992) 60: 826-831).

Screening der Genombibliothek von H. somnus.

Rekombinante Plasmide wurden in den E. coli-Stamm JM105 transformiert und auf LB-Agarplatten gegeben, die 0.05% Kongorot enthielten (für LppB und LppC). Nach zweitägiger Inkubation bei 37ºC färbten sich etwa 0,5% der Kolonien dunkelrot. Kongorot bindende Kolonien wurden ausgewählt und zu einzelnen Kolonien auf identischen Platten gereinigt. Eine von jeder wurde dann mittels des Kolonie-Blot- Verfahrens auf die Expression von H. somnus-Antigenen getestet (French, B. T., et al., Anal. Biochem. (1986) 156: 417-423). LppA wurde mittels des Colony blot-Verfahrens gescreent (French, B. T., et al., Anal. Biochem. (1986).

TnphoA-Transposon-Mutagenese.

Fusionen von lppA an TnphoA wurden geschaffen mit λ:: TnphoA (Gutierrez, C., et al., J. Mol. Biol. (1987) 195: 289-297). Bei diesem System wird alkalische Phosphatase (AP)-Aktivität nur erhalten, wenn sich TnphoA auf eine solche Weise auf eine DNA-Sequenz transponiert, daß AP in dem Rahmen und stromabwärts von einer exprimierten Codierungssequenz verknüpft wird, die geeignete Sequenzen für die Insertion in die Membran enthält (Hoffman, C. 5., und Wright, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 5107-5111; Manoil, C., und Beckwith, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8129-8133; Manoil, C., und Beckwith, J., Science (1986) 233: 1403-1408). Das Plasmid pMS22 wurde in den Stamm CC118 transformiert. Der so erhaltene Stamm wurde mit λ::TnphoA infiziert und 15 Stunden lang bei 30ºC wachsen gelassen. Aliquote wurden auf LB-Agarplatten gegeben, denen 300 ug/ml Kanamycin, 100 ug/ml Ampicillin und 40 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat (BCIP) zugesetzt worden waren. Die Platten wurden 2-3 Tage lang bei 30ºC inkubiert, und Plasmid-DNA wurde aus fünf Pools von blauen Kolonien extrahiert und zur Transformation von CC118-Zellen verwendet. Einzelne AP (blaue)-Kolonien wurden bei 37ºC isoliert, und deren Plasmid-DNA wurde mittels Restriktionskartierung analysiert.

PAGE und Immunoblotting.

SDS-PAGE von H. somnus- und E. coli-Proteinen wurde in dem Laemmli-System (Laemmli, U. K., Nature (1970) 227: 680-685) oder unter Verwendung der Tricin-SDS-Polyacrylamid-Gele mit einem 16,5% T, 6% C Trenngel (Schagger, H., und von Jagow, G., Anal. Biochem. (1987) 166: 368-379) durchgeführt. Der Proteintransfer auf Nitrocellulosemembranen wurde wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Blots wurden zwei Stunden lang mit Rinderserum, das 1 : 500 mit TBS-1% BSA (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 140 mM NaCl) verdünnt war, inkubiert. Die verwendeten Antiseren waren bovines Hyperimmunserum gegen lebenden H. somnus HS25 (Theisen & Potter, 1992) und Kaninchenserum gegen H. somnus-OMPs. Nach dreimaligem Waschen in 0,5% Tween 20 enthaltendem TBS wurden seroreaktive Proteine nachgewiesen mit Ziegeantibovinem IgG, das an alkalische Phosphatase gekoppelt war (Kirkegaard und Perry), und zwar mit 1 : 5000 in TBS-1% BSA. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wurde unter Verwendung des NBT/BCIP-Systems wie vom Lieferanten (Progema) beschrieben sichtbar gemacht. Vorgefärbte oder ungefärbte Proteinstandards wurden von BioRad erhalten.

Hvbridisierungstechniken.

Northern (RNA)-Blotting wurde wie von Maniatis beschrieben durchgeführt. RNA wurde aus H. somnus und E. coli mittels Standardtechniken extrahiert (Theisen, M., und Potter, A. A., J. Bacteriol. (1992) 60: 826-831) und durch 1,5%ige, Formaldehyd enthaltende Agarosegele elektrophoretisch aufgetrennt. Pro Lauf wurden drei Mikrogramm RNA verwendet. Die RNA wurde auf Nitrocellulosemembran geblottet und zu DNA-Sonden hybridisiert, die am 5'-Ende markiert waren. Nach der Hybridisierung wurden die Blots zweimal in 0,1 · SSC, 0,5% SDS zwei Stunden lang gewaschen.

Analyse der plasmidcodierten Proteine.

Minizellen wurden aus Kulturen von BD1854, das die geeigneten Plasmide enthielt, durch Zentrifugieren auf einem 5%igen bis 25%igen Sucrosegradienten isoliert, mit [355]Methionin markiert und SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine wurden mittels Elektroblotting auf Nitrocellulosemembran transferriert, und das Antigen wurde unter Verwendung von Hyperimmunserum gegen H525 nachgewiesen. Die Position der markierten Polypeptide wurde dann durch Autoradiographie des Western Blot bestimmt.

Markierung von Proteinen mit [³H]Palmitat.

E. coli-Stamm DH5αF'IQ, der die spezifizierten Plasmide beherbergt, wurde in M63-Medium, dem Glycerin (0,5% Gew./Vol.) und Casaminosäuren (2% Gew./Vol.) zugesetzt war, wachsen gelassen. Der H. somnus-Stamm HS25 wurde in BHI-TT-Medium wachsen gelassen. Zu den exponentiell wachsenden Zellen (4 · 10&sup8; Zellen/ml) wurde [³H]Palmitat (5 mCi/ml) bis zu einer Endkonzentration von 50 uCl/ml zugegeben, und die Inkubation wurde zwei Stunden lang fortgesetzt. Die Markierung wurde durch Ausfällen mit Trichloressigsäure (10% Gew./Vol.) für 30 Min. auf Eis beendet. Wenn angegeben, wurde Globomycin (Sankyo Co. Tokyo, Japan) (10 mg/ml in Dimethylsulfoxid) mit 100 ug/ml 5 Min. vor der Zugabe von Palmitat zugegeben. Die Proteine wurden durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 15000 · g pelletisiert, und die Pellets wurde zweimal mit Methanol gewaschen, um Fette zu entfernen. Die getrockneten Pellets wurden in Probenpuffer resuspendiert und mittels Tricin- SDS-PAGE analysiert. Die radiomarkierten Proteinstreifen in dem getrockneten Gel wurden mittels Fluorographie nachgewiesen.

Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese.

Ein synthetisches Oligonukleotid mit 33 Resten mit der Sequenz 5'-TGTATTATTAGCAGCTGGTAATGAAAAAAATAA wurde synthetisiert, um den Cys-22-Rest des lppA-Proteins zu ändern (die unterstrichene Base unterscheidet sich von der Sequenz des Wildtyps). Die Punktmutation in dem erhaltenen Plasmid pMS67 wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.

Beispiel 1

Klonierung und Charakterisierung von H. somnus-Haeminbindendem Protein und H. somnus-Hämolysin

Eine genomische Cosmidbibliothek von H. somnus H525-DNA wurde aufgebaut, indem Fragmente, die durch partielle Sau3A-Restriktion erzeugt wurden, in die BamHI-Stelle des Vektors pHC79 kloniert wurden. Die ligierte DNA wurde in vitro mit einem Lambda-Packagingsextrakt (Promega) verpackt und zum Infizieren von E. coli MClO61 verwendet. Ampicillinresistente Klone wurden bei -70 Grad C gelagert. Diese Bibliothek wurde auf Klone gescreent, die in der Lage waren, bovines Hämin (Sigma) zu binden, indem Zellen auf M9-Minimalagarplatten gegeben wurden (Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, (1972) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), denen 0,01% Hämin zugesetzt waren. Die Bildung kleiner dunkler Kolonien zeigte die Häminbindung an. Die Bibliothek wurde auch auf Klone gescreent, die hämolytische Aktivität zeigten, wobei Schafblut-Agarplatten von Oxoid, Kanada, verwendet wurden. Es wurde eine Anzahl von Klonen erhalten, die sowohl den Häminbindenden Phänotypus (Hb+), als auch den hämolytischen Phänotypus (Hly+) aufwiesen, und zwei wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Das als pRAP117 bezeichnete Plasmid (ATCC Accession Nr. 68952) enthielt sowohl das Hämin-bindende (hmb) Gen als auch das Hämolysin (hly)-Gen auf einem 25 kb-Insert (Fig. 1). Plasmid pAA504 (ATCC Accession Nr. 68953) enthielt das Hämolysin (hly)-Gen. Nachfolgend wurde gezeigt, daß pRAP 117 und pAA504 ähnliche Restriktionsendonuclease- Verdauungsmuster aufwiesen und wahrscheinlich überlappende homologe Regionen enthielten. Dies wurde durch Sondieren von pAA504-DNA mit einem 8 kb HindIII-Fragment von pRAP117 bestätigt.
Das hmb-Gen wurde subkloniert, indem das 8 kb-HindIII- Fragment von pRAP117 in den Vektor pTZ19R (Pharmacia Canada Ltd.) ligiert wurde. Dieser Klon, der als pRAP401 bezeichnet wurde (Fig. 1) behielt sowohl die Hämin-bindende als auch die hämolytische Aktivität der Elternteile. Nachfolgendes Subklonieren in pTZ19R lokalisierte den Hb+, Hly- Phänotypus auf einem kleineren 3 kb-XbaI-Fragment. Dieser Klon wurde als pRAP501 bezeichnet (Fig. 1). Dieser Klon band Hämin, war jedoch nicht hämolytisch. Daher befindet sich das hly-Gen am distalen Ende des in Fig. 1 gezeigten 8 kb-HindIII-Fragments.
Mittels Western Blotting des Hb+,Hly-Klons mit Serum, das gegen äußere Membranproteine (OMPs) von HS25 gerichtet war, wurde ein Protein mit einer scheinbaren Molekularmasse von 50 000 kDa nachgewiesen, das mit einem eisenregulierten Protein von einer OMP-angereicherten Fraktion von HS25 komigrierte.

Beispiel 2

Nukleotidseguenzanalyse von Hämin-bindendem Protein von H. somnus

Klon pRAP501 wurde verwendet, um Exonuclease III-Deletionen für die DNA-Sequenzanalyse zu erzeugen, und die Sequenzierung wurde an einzelsträngigen DNA- Matrizensträngen durchgeführt, die von diesen eingebauten (nested) Deletionen abgeleitet waren. Die Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt. Die offenen Leserahmen und Ribosomenbindungsstellen sind in Tabelle 1 und Fig. 3 zusammengefaßt. Wie ersichtlich ist, sind insgesamt acht offene Leserahmen vorhanden, die das hmb-Gen codieren könnten. In der entgegengesetzten Orientierung wurden keine signifikanten offenen Leserahmen gefunden. Tabelle 1 Vorhergesagte offene Leserahmen in Plasmid pRAP501

Beispiel 3

Lokalisierung des hmb-Gens

Um das hmb-Gem zu lokalisieren, wurden zwei Strategien verwendet:
(i) Subklonieren; und
(ii) TnphoA-Transposon-Mutagenese.
A. Subklonieren. pRAP501-DNA wurde mit XbaIKpn1 verdaut, und die beiden Fragmente wurden in pTZl8 ligiert, wobei man die Plasmide pPRAP503 und pRAP504 erhielt. pRAP503 enthielt die Basen 1 bis 1389 von pRAP501 (siehe Fig. 1), während pRAP504 den Rest des Inserts enthielt. pRAP504 enthaltende Zellen waren in der Lage, Hämin zu binden, wie mittels Platten-Bioassays bestimmt wurde, die wie zuvor beschrieben durchgeführt wurden, während diejenigen, die pRAP503 enthielten, dies nicht taten. Daher wurde das hmb-Gen durch ORF1, 4, 6, 7 oder 8 codiert. ORF7 wurde aufgrund seiner geringen Größe ausgeschlossen.
B. TnphoA-Transposon-Mutagenese. Um das hmb-Gen näher zu lokalisieren, wurde TnphoA-Transposon-Mutagenese eingesetzt. Diese Technik ist aus zwei Gesichtspunkten brauchbar:
(i) die Insertion in einen offenen Leserahmen eliminiert die Funktion eines Genprodukts; und
(ii) sog. In-frame-Fusion in einen offenen Leserahmen, der für ein sekretiertes Protein codiert, führt aufgrund der Expression von alkalischer Phosphatase in das Periplasma zu blauen Kolonien auf dem BCIP-Agar.
Die Mutagenese von CC118/pRAP504 führte zu der Isolierung von drei Mutanten, von denen zwei in ORF1 und die andere in ORF4 waren. Die Phänotypen dieser Mutanten sind in Tabelle 2 beschrieben. Diese Ergebnisse zeigen, daß ORF1 das hmb-Gen codiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für das hmb-Gen ist in Fig. 4 gezeigt. Die ersten 17 Aminosäuren dieses Proteins repräsentieren eine potentielle prokaryotische Signal-Peptidase Eins-Signalsequenz. Die Identifizierung des ORF1 als das hmb-Gen wird gestützt durch die Beobachtung, daß Deletionen, die für die DNA- Sequenzanalyse konstruiert bzw. erzeugt wurden (siehe oben), die sich in diese Region erstreckten, die Häminbindung aufhoben, während diejenigen außerhalb dieses offenen Leserahmens keine Auswirkung zeigten. Tabelle 2 Eigenschaften der TnphoA-Fusionen
¹ Hmb = Hämin-bindender Phänotypus
² Ort = Stelle der Insertion, wobei die Basennummern von Fig. 2 verwendet wurden
N. D. = nicht bestimmt

Beispiel 4

Expression von hmb

Das hmb-Gen wurde in E. coli exprimiert als eine Fusion mit dem P. haemolytica-Leukotoxin-Gen lktA, das durch Plasmid pAA352 (ATCC Accession Nr. 68283) codiert wurde. Plasmid pAA352 wurde mit BamHI verdaut, mit Mungobohnennuclease und schließlich mit intestinaler Phosphatase von Kälbern behandelt. Zwei das hmb-Gen enthaltende Restriktionsfragmente wurden dann in diesen Vektor eingebracht. Das erste war ein 1,2 kb XmnlSmaI-Fragment von pRAP501, und das zweite war ein 1,1 kb HincII-Fragment von pRAP504. Ersteres startet bei dem dritten Aminosäurerest von ORF1, während letzteres bei dem 33. Aminosäurerest desselben offenen Leserahmens startet. Diese Plasmide wurden pGCH5 bzw. pGCH4 genannt, und deren Nukleotid- plus Aminosäuresequenzen sind in den Fig. 5 bzw. 6 gezeigt.

Beispiel 5

Klonierung und Charakterisierung von LppA

A. Klonierung von lppA in E. coli

Eine Genombibliothek von H. somnus HS25-DNA wurde aufgebaut, indem 2- bis 7-kb-Fragmente, die durch partielle Sau3A-Restriktion erzeugt wurden, in den Plasmid- Expressionsvektor pGH433 kloniert wurden, und positive Transformanten wurden mittels des Kolonie-Blot-Verfahrens nachgewiesen (French, B. T., et al., Anal. Biochem. (1986) 156: 417-423), wobei Antiserum gegen den H. somnus-Stamm HS25 verwendet wurde. Achtundzwanzig positive Klone wurden identifiziert und für weitere Analysen aufbewahrt. Um die mit dem Serum reagierenden, Plasmid-codierten Proteine zu identifizieren, wurden Lysate ganzer Zellen von IPTGinduzierten Zellkulturen mittels PAGE und nachfolgend Western Blotting untersucht. Drei Plasmide, die ein seroreaktives Protein, mit einer Mr von etwa 40 000 codierten, wurden identifiziert. Eines davon mit einem DNA- Insert von 2-kb, wurde als pMS22 bezeichnet. Unter Verwendung des radiomarkierten Inserts von pMS22 als einer Sonde wurde gezeigt, daß die drei Plasmide gemeinsame Sequenzen enthielten, was anzeigt, daß die rekombinanten 40 kDa- Proteine identisch waren. Ein Western Blot des von E. coli JM105/pMS22 synthetisierten Proteins ließ sich mit Zellfraktionen von H. somnus vergleichen. Es ist offensichtich, daß das seroreaktive LppA-Protein überwiegend in den äußeren Membranfraktionen von H. somnus vorliegt und daß es mit dem rekombinanten 40 kDa-Protein komigriert. Darüber hinaus reagiert Serum von Kälbern, die mit dem rekombinanten LppA-Protein immunisiert wurden, stark mit dem nativen 40 kDa-OMP von H. somnus.

B. Analyse der rekombinanten Plasmide

Um das lppA-Gen zu subklonieren und Plasmide aufzubauen, die geeignet sind für den Exonuclease III-Abbau der klonierten Region, wurde das BglII-NcoI-Fragment von pMS22 in pTZ28R kloniert (Fig. 8). Es wurden zwei Plasmide, pMS63 und pMS65, mit dem Insert in entgegengesetzten Orientierungen, erhalten. Beide exprimierten das LppA- Protein, was anzeigt, daß das Gen von einem Promotor transkribiert wird, der sich auf der Insert-DNA befindet. Um eine Serie eingebauter Deletionen zu erzeugen, wurden die Plasmide pMS63 und pMS65 jeweils an den einzigen SacI- und BamHI-Stellen (Fig. 8) geschnitten und Exonucleaseabbau, Entfernung des Überhangs durch S1-Nuclease und Religation unterzogen. Eine Anzahl von Plasmiden wurde analysiert, das Ausmaß der Degradierung (wie mittels Restriktionskartierung oder DNA-Sequenzierung beurteilt) wurde mit dem Phänotypus verglichen (Fig. 8). Ausgehend von diesem Deletionsversuch scheint das lppA-Gen zwischen den Deletionsendpunkten von d.3 und d.8.1 lokalisiert zu sein, da Plasmide mit einem größeren Insert LppA&spplus; sind, wohingegen Plasmide mit Deletion, die weiter in das Insert hineinreicht, LppA&supmin; sind. Dies gilt mit einer Ausnahme, nämlich d.10, welches eine trunkierte seroreaktive Version des LppA-Proteins mit einer Mr von etwa 37 000 erzeugt (Daten nicht gezeigt). DNA- Sequenzierung der Deletionsendpunkte der beiden Plasmide ergab, daß in d.10 das α-Peptid von lacZ im Rahmen mit dem lppA-ORF verknüpft ist (siehe unten), wodurch die Transkription des Gens von lacP oder einem anderen vektorcodierten Promotor und die Translation von der translatorischen lacZ-Startstelle ermöglicht wird. Im Gegensatz dazu wird lacZ in d.9 außerhalb des Rahmens mit dem lppA-ORF verknüpft.

C. DNA-Sequenzierung und Analyse

Die vollständige DNA-Sequenz beider lppA-Stränge wurde mittels des Didesoxy-Verfahrens mit modifizierter T7-DNA-Polymerase und einzelsträngiger DNA als dem Matrizenstrang bestimmt. Die Sequenz ist in Fig. 7 gezeigt. Auf der sequenzierten DNA liegt nur ein ORF vor, der ausreichend lang ist, um das lppA-Genprodukt zu codieren. Er beginnt mit einem ATG-Codon an Position 791-793 und endet mit dem TAA-Stopcodon an Position 1532-1534. Dieser ORF würde ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 27 072 codieren. Dem ATG-Startcodon geht eine purinreiche Sequenz AATGAG voraus (die unterstrichenen Basen sind komplementär zu 16 S rmA), die als eine Ribosomenbindungsstelle in E. coli dient (Theisen, M., und Potter, A. A., Infect. Immun. (1992), im Druck).
Der vorgeschlagene Leserahmen wurde durch Sequenzieren zweier unabhängiger lppA::TnphoR-Genfusionen bestätigt (siehe Fig. 7). Der weitere Beweis dafür, daß der angezeigte ORF lppA war, wurde erhalten durch Subklonieren des DraI-Fragments von pMS22 (Fig. 8) in die SmaIl-Stelle von pTZ18R und Erzeugen von pMS83 und pMS84, mit dem Insert in entgegengesetzten Orientierungen. DraI schneidet 209 Basenpaare stromaufwärts von dem vermutlichen ATG- Startcodon und unmittelbar stromabwärts von dem TAA- Stopcodon. Das lppA-Protein wurde in JM105 exprimiert, das beide Plasmide beherbergte. Der N-terminale Teil des vorhergesagten Polypeptids ähnelt stark einem Signalpeptid, und die Aminosäuresequenz Leu-Leu-Ala-Ala-Cys an Position 842-856 ist in hohem Maße homolog zu der Consensus-Spaltstelle, die in bakteriellen Lipoproteinen gefunden wurde (von Gabin, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 652-657).

D. Identifizierung des 5'-Terminus von lppA-mRNA

Das 5'-Terminus des lppA-Transkripts wurde mittels Primerextensionskartierung bestimmt. Die als Primer verwendete DNA war ein am 5'-Ende markiertes, synthetisches Oligonukleotid, das zu den Nukleotiden zwischen 817 und 835 komplementär war. mRNA wurde aus dem H. somnus-Stamm HS25 und den beiden E. coli-Stämmen JM105/pMS65 (LppA+) und JM105/pGH433 (LppPc) isoliert. Ein größeres lppA- Transkript, das mit dem A-Rest an Position 756 beginnt (Fig. 7), wird sowohl in HS25 als auch in JM105/pMS65 erzeugt. In Zellen, die den Plasmidvektor pGH433 beherbergten, wurde kein Produkt beobachtet. Eine Pribnow-Box und -35-Region, die für E. coli-Promotoren charakteristisch ist (Harley, C. B., und Reynolds, R. P., Nuc. Acids Res. (1987) 15: 2343-2361) befinden sich an den Positionen 744 bis 749 (TATGCT) bzw. Positionen 722 bis 727 (TTATCA).

E. Posttranslatorische Modifikation des LppA-Proteins.

Da die abgeleitete Aminosäuresequenz des LppA-Proteins eine Sequenz enthält, die identisch mit der Consensus-Sequenz Leu-Ala(Gly)-Ala(Gly)-Cys für Lipidmodifikation in E. coli ist (von Gabin et al., 1983), könnte das lppA-Genprodukt ein Lipoprotein sein. Um zu testen, ob das LppA-Protein lipidmodifiziert war, wurde [³H]Palmitat in H. somnus HS25 und die beiden E. coli-Stämme, DH5aF'IQ/pMS65 und DH5αF'IQ/pTZ18R, eingebaut. Proteine aus Lysaten von ganzen Zellen wurden mittels PAGE getrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Das lppA-Genprodukt wurde durch Immunoblotting mit Antiserum gegen HS25 identifiziert. Mindestens zehn H. somnus-Proteine waren mit Palmitat markiert. Eines davon war ein 40 kDa-Protein, das stark mit H. somnus-Antiserum reagierte, was zeigte, daß es das lppA-Genprodukt war. Palmitat wurde auch in das rekombinante lppA-Genprodukt eingebaut, da ein radiomarkiertes, immunreaktives 40 kDa-Protein, das mit dem LppA-Protein von HS25 komigrierte, in Zellen nachgewiesen wurde, die pMS65 beherbergten, jedoch nicht in dem Plasmidvektor pTZl8R. Also wird das H. somnus-lppA-Gen in E. coli lipidmodifiziert. Behandeln der Zellen mit Globomycin führt zur Akkumulation von nicht prozessiertem Lipoprotein, und sowohl das natürliche H. somnus-LppA-, als auch das rekombinante LppA-Protein liegen überwiegend als eine größere, vermutliche Vorläuferform in mit Globomycin behandelten Zellen vor.
Um zu bestimmen, ob die Lipidmodifikation des LppA-Proteins am Cysteinrest Cys-22 auftritt, wurde der Cysteincodon (TGT) zu einem Glycincodon (GGT) geändert, der das Plasmid pMS67 erzeugte. pMS67 beherbergende Zellen waren LppA&spplus;. In einem Western Blot wurde jedoch nur ein seroreaktives Protein, das mit der größeren Vorläuferform komigriert, nachgewiesen. Globomycin änderte die Mobilität des mutierten LppA-Proteins nicht, was anzeigt, daß das mutierte LppA-Protein nicht länger ein Substrat für Signalpeptidase II war. Darüber hinaus war dieses Protein nicht mit Palmitat markiert, was zeigt, daß die Lipidmodifikation an dem Cys-22-Rest stattfindet.

Beispiel b

Klonierung und Charakterisierung von LppB

A. Klonierung des Gens für LppB

Eine Genombibliothek im Plasmid pGH433, die wie zuvor beschrieben aufgebaut wurde, wurde in JM105 transformiert, und es wurde gefunden, daß unter mehreren tausend ampicillinresistenten Transformanten etwa 0,1% Kongorot auf Kongorot-Agarplatten banden (Crb+). Der E. coli-Stamm JM105 wies nur eine bescheidene Fähigkeit auf, Kongorot auf diesen Platten zu binden. Zwanzig Crb+-Transformanten wurden mit Hyperimmunserum in einem Colony Blot-Assay gescreent, und es wurde gefunden, daß fünf seroreaktiv waren. Western Blots (Immunoblots) von Proteinen aus ganzen Zellen, die auf Polyacrylamidgelen abgetrennt wurden, zeigten, daß ein Transformant ein Plasmid (pMSl0) enthielt, das ein etwa 60 kDa-seroreaktives Protein codierte, drei Transformanten enthielten Plasmide (pMS11, pMS14 und pMS15), die ein etwa 40 kDa-seroreaktives Protein codierten, und einer enthielt ein Plasmid (pCRx), das ein 15 kDa-Antigen codierte. Es wurde gefunden, daß das radioaktiv markierte DNA-Insert von pMS11 mit pMS14, pMS15 und H. somnus hybridisierte, jedoch nicht mit den Plasmiden pMS10 und pCRx, was zeigte, daß die drei 40 kDa-Proteine identisch, jedoch von den 60 kDa- und 15 kDa-Antigenen verschieden waren. Auch hybridisierte dasselbe Insert nicht mit Plasmid pMS22, das LppA codiert (Theisen et al., 1992), was zeigt, daß pMS11 ein neues 40 kDa-Protein codiert.
Sowohl JM105/pMS11 als auch JM105/pMS10 bilden kleine, dunkle Kolonien auf Minimalplatten, die 0,01% Hämin enthalten, was nahelegt, daß die 40 kDa- und 60 kDa- Proteine Hämin-bindend sein könnten.

B. Ort des Gens für LppB

Das aus pMS11 isolierte 1.9 kb-Insert wurde in die Sma1-Stelle von pTZl8R subkloniert, wobei E. coli JM105 als der Wirtsstamm verwendet wurde. Man erhielt zwei Plasmide, pMS92 und pMS96, die das Insert in entgegengesetzten Orientierungen trugen. LppB wurde von beiden Plasmiden exprimiert, was anzeigt, daß lppB von einem Promotor transkribiert wird, der auf der Insert-DNA lokalisiert ist. Die Zugabe von 2 mM IPTG zu dem Wachstumsmedium erhöhte die lppB-Expression von pMS11 etwa um das Vierfache (wie mittels Western Blot beurteilt wurde), was anzeigt, daß lppB auf dem DNA-Insert war. Die angegebenen Plasmide wurden in einen Minizellen produzierenden Stamm transformiert, und plasmidcodierte Proteine wurden mittels PAGE analysiert. Die Plasmide pMS11, pMS92 und pMS105 codieren allesamt ein LppB-Protein. Daher muß LppB stromabwärts an der sog. Ahall-Stelle bei Base 641 in Fig. 9 lokalisiert sein.

C. Nukleotidseguenzanalyse

Um eine Reihe eingebauter Deletionen für die Sequenzierung zu erzeugen, wurde jedes der Plasmide pMS92 und pMS96 an den einzigen in dem Vektor vorliegenden Sacl- und BamHl- Stellen geschnitten und einem Exonucleaseabbau, Entfernung des überhangs durch S1-Nuclease und Religation unterzogen. Fig. 9 zeigt die Sequenz des gesamten chromosomalen Fragments. Zwei große ORFs wurden auf dem Insert identifiziert. Der erste ORF startet mit einem ATG-Codon bei Nukleotid 256 und endet mit einem TAA-Codon bei Nukleotid 829. Unmittelbar stromabwärts von diesem ORF ist ein zweiter ORF lokalisiert, der mit einem ATG-Codon bei Position 872 beginnt und mit einem TAA-Codon bei Position 1708 endet. Letzterer scheint mit dem lppB-Gen zu korrespondieren, da es stromabwärts von der Ahall-Stelle bei Position 641 in Fig. 9 lokalisiert ist und daher auf dem zweiten Plasmid enthalten ist, das LppB in dem Minizell- Versuch exprimierte. Stromaufwärts von diesem ORF befindet sich eine vermutliche Ribosomenbindungsstelle GGAG und ein A/T-reicher Spacer mit sieben Basenpaaren, gefolgt von einem potentiellen ATG-Startcodon.
Die DNA-Sequenz wurde auf Nukleotidsequenz-Homologie in Genbank Release 65 untersucht. Sequenzen von der Position 1590 bis zum Ende der klonierten DNA in Fig. 9 zeigten 65,5% Identität mit der katE-Promotorregion von E. coli (Mulvey & Loewen, 1989). Das katF-Genprodukt ist ein angenommener Sigmafaktor, der die Katalase HPII (katE)- und Exonuclease III (xth)-Expression positiv reguliert (Sask et al. 1989). Es ist interessant, daß H. somnus Sequenzen aufweist, die katF ähnlich sind, da ihm die Katalaseaktivität fehlt (Sample & Czuprynsky, 1991).

D. Aminosäuresequenzanalyse

Der ORF in der als lppB bezeichneten Nukleotidsequenz codierte 279 Aminosäurereste, wie in Fig. 9 angegeben ist. Es wurde errechnet, daß die Molekularmasse des abgeleiteten Proteins 31307 Dalton beträgt. Es ist eine kurze hydrophobe Region von den Aminosäuren 1 bis 13 vorhanden, gefolgt von einer Lipoproteinbox, Leu-Ala-Ala-Cys, an der vorhergesagten Signalpeptidase II-Spaltstelle. Die hydrophobe Region-Lipoproteinbox-Sequenzen ähneln stark dem Signalpeptid von prokaryotischen Lipoproteinen, einschließlich dem vor kurzem charakterisierten Lipoprotein LppA von H. somnus.
Die Lipidnatur von LppB wurde wie zuvor beschrieben bestätigt.

Beispiel 7

Klonierung und Charakterisierung von LppC

Eine Genombibliothek von H. somnus-DNA wurde in E. coli aufgebaut, wobei der Expressionsvektor pGH433 verwendet wurde, wie zuvor beschrieben wurde. Diese Bibliothek wurde auf Klone gescreent, die in der Lagewaren, Kongorot zu binden, indem Zellen auf LB-Agarplatten gegeben wurden, denen Ampicillin und 0,05 % Farbstoff zugesetzt worden waren. Nach zweitägiger Inkubation bei 37ºC färbten sich etwa 0,1% der Kolonien dunkelrot. Zwanzig dieser Kolonien wurden mit Hyperimmunserum gegen H. somnus in einem Colony Blot-Assay gescreent, und es wurde gefunden, daß fünf Klone seroreaktiv waren. Western Blot-Analyse dieser Klone zeigte, daß drei ein Protein mit einem Molekulargewicht von 40 000 erzeugten (LppB; pMS11, pMS14, pMS15), während die anderen zwei Proteine mit Molekulargewichten von 15 000 (pCRR22) und 60 000 (LppC; pMS10) codierten. Da Kongorot als ein Analog von Porphyrinverbindungen wirken kann und einer dieser Klone (pMS10) ein Protein erzeugte, das in der Größe anderen bakteriellen Transferrinrezeptoren ähnlich war, wurde dieser Klon detaillierter charakterisiert.
Das DNA-Insert wurde in die Vektoren pTZ18R und pTZ19R subkloniert, und überlappende Deletionen wurden unter Verwendung von Exonuclease III erzeugt. Die Nukleotidsequenz des Inserts wurde dann unter Verwendung des Kettenabbruchverfahrens bestimmt und ist in Fig. 10 angegeben. Ein offener Leserahmen, der bei Nukleotid 108 startet und bei Nukleotid 1850 endet, codiert ein Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 65 000. Die ersten 21 Aminosäuren dieses Proteins codieren eine typische prokaryotische Signalsequenz, und daher starrer die DNA, die das reife Protein codiert, wahrscheinlich bei Nukleotid 171. Dieses Protein hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 63 336, nahe dem Molekulargewicht von 60 000, das auf Polyacrylamidgelen beobachtet wurde. Dieser Unterschied kann durch die Beobachtung erklärt werden, daß LppC am ersten Cystein des reifen Peptids lipidmodifiziert ist. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des reifen Peptids ist in Fig. 11 gezeigt.
Ein anderes Konstrukt, pCRR27, wurde hergestellt, indem das Insert von pMS10 genommen und in den Vektor pTZ18R subkloniert wurde, wodurch pCRR26 entstand. Eine HindIII- Verdauung von pCRR26 wurde in die HindIII-Stelle von pGH432 subkloniert, wobei man Plasmid pCRR27 erhielt. Dieses Konstrukt ergibt einen hohen Grad an LppC-Expression.
Die Lipidnatur des Moleküls wurde wie zuvor beschrieben bestätigt.

Beispiel 8

Schutzfähigkeit von LppB, LppB + LppA (Beispiele) und LppA (Vergleichsbeispiel)

A. Antigen-Zubereitung

Die LppA- und LppB-Antigene wurden aus den Stämmen JM105/pMS88 bzw. JM105/pMS103 extrahiert. Bakterien wurden in einem Liter L-Nährlösung, der 50 ug/ml Ampicillin zugesetzt waren, bis zur mid-log-Phase wachsen gelassen. Als die Absorption bei 600 nm 0,6 erreichte, wurde Isopropyl-β, D-thiogalactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und die Kulturen wurden unter kräftigem Hin- und Herbewegen 2 Std. lang bei 37ºC inkubiert. Die Bakterien wurden mittels Zentrifugieren geerntet, in 40 ml 25% Sucrose/50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) resuspendiert und bei -70ºC gefroren. Die gefrorenen Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, und 10 ml Lysozym (10 mg/ml in 250 mM Tris-HCl, pH 8) wurden zugegeben. Nach 15 Minuten auf Eis wurden 300 ml Detergensgemisch (5 Teile 20 mM Tris-HCl, pH 7,4/300 mM Natriumchlorid/2% Desoxycholsäure/2% Nonidet-P40 und 4 Teile 100 mM Tris- HCl, pH 8/50 mM EDTA/2% Triton X-100) zugegeben. Die Viskosität wurde durch Sonikation bzw. Schallbehandlung reduziert, und Proteinaggregate wurden durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 27 000 X g geerntet. Die Pellets wurden in einem Minimalvolumen von 4 M Guanidinhydrochlorid aufgelöst. Die Proteine wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert, und die Proteinkonzentration wurde geschätzt, indem die Intensität der Coomassie-Blau-gefärbten Banden mit einem Rinderserumalbumin-Standard verglichen wurden.

B. Impfformulierung

Jede Impfstoffdosis wurde hergestellt, indem 100 ug Antigen, allein und in Kombiation, mit Emulsigen Plus gemischt wurden, so daß das Endvolumen bei einer Adjuvanskonzentration von 33% (Vol./Vol.) 2 ml betrug. Placebodosen wurden hergestellt, indem sterile Kochsalzlösung mit Emulsigen Plus wie zuvor beschrieben vereinigt wurden. Jeder Impfstoff wurde durch Schallbehandlung gemischt und in sterilen Impfstoff-Ampullen bei 4ºC aufbewahrt.

C. Immunisierung

Alle Kälber wurden mit 2 ml Impfstoff immunisiert, die durch intramuskuläre Injektion verabreicht wurden. Nach drei Wochen erhielten alle Tiere eine zweite Impfung, wie zuvor beschrieben wurde. Die serologische Antwort auf die Impfung wurde überwacht, wobei Serumproben verwendet wurden, die vor der Impfung, am Tag der zweiten Impfung und 10-12 Tage nach der zweiten Impfung gesammelt wurden.

D. Impfversuch 1.

Es war das Ziel dieses Versuchs, die serologische Antwort auf die Impfung mit zwei erfindungsgemäßen Impfstoffen, wobei einer LppB umfaßte und einer sowohl LppA + LppB umfaßte, und, zum Vergleich, mit LppA und einem Placebo zu bestimmen. Vier Gruppen mit sechs Kälbern wurden wie zuvor beschrieben mit diesen Impfstoffen immunisiert, und die serologische Antwort wurde unter Verwendung eines sog. enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) bestimmt. Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen an, daß beide Antigene eine Immunantwort hervorriefen, wobei LppB von beiden das bessere war. Es wurde keine gegenseitige Beeinflussung beobachtet, wenn beide Antigene im selben Impfstoff vorlagen.

E. Impfversuch 2.

Es war das Ziel dieses Versuchs, die Schutzfähigkeit von LppA (Vergleichsbeispiel) und LppB zu bestimmen, wobei ein experimentelles Expositionsmodell verwendet wurde. Drei Gruppen mit je acht Kälbern wurden mit LppA, LppB oder einem Placebo geimpft, die wie zuvor beschrieben formuliert waren. Zwölf Tage nach der zweiten Impfung wurden alle Tiere durch intravenöse Impfung von 1 · 10&sup8; cfu von H. somnus-Stamm HS25 exponiert. Die Tiere wurden nach der Exposition 12 Tage lang täglich auf klinische Krankheitszeichen hin untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 bis 10 zusammengefaßt. Die Immunisierung mit LppA reduzierte die Schwere von einigen der klinischen Zeichen von Haemophilosis, einschließlich Lahmheit und der täglichen Anzahl der Erkrankungen, wohingegen die Immunisierung mit LppB alle klinischen Krankheitszeichen wesentlich reduzierte. Obwohl beide Antigene brauchbare Immunogene für die Prävention der H. somnus-Erkrankungen zu sein scheinen, scheint daher LppB gegenüber LppA verbesserte Ergebnisse zu, liefern.

Beispiel 9

Konstruktion von Leukotoxin-LppB-Fusionsproteinen

Eine Genfusion, bestehend aus dem P. haemolytica- Leukotoxin-Gen (lktA), das in Plasmid pAA352 (ATCC Accession Nr. 68283) gefunden wurde, und LppB wurde hergestellt, um den Expressionsgrad zu erhöhen. Plasmid pAA352 wurde mit BamHI verdaut, mit Mungobohnennuclease behandelt und mit intestinaler Phosphatase von Kälbern dephosphoryliert. Das lppB enthaltende Plasmid pMSl1 (zuvor beschrieben) wurde mit MaeI und AccI verdaut, und das so erhaltene 0,855 kb-Fragment wurde mit dem DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment aufgefüllt und in den pAA352-Vektor ligiert. Im Anschluß an die Transformation wurden Klone ausgewählt, die mit Kaninchen-Antiseren gegen LppB in einem Colony Immunoblot reagierten, und es wurde gezeigt, daß ein solcher Klon, JM105/PCRR28, ein IPTG-induzierbares Protein mit dem korrekten Molekulargewicht erzeugt. Die vorhergesagte Nukleotid- und Aminosäuresequenz dieser Fusion ist in Fig. 11 gezeigt.

Beispiel 10

Schutzfähigkeit von LktA::LppB

Ein Impfversuch unter. Verwendung des Leukotoxin-LppB- Fusionsproteins aus Beispiel 9 wurde durchgeführt, um dessen Schutzfähigkeit zu testen. Das rekombinante Protein wurde wie in Beispiel 8 beschrieben aus Einschlußkörpern hergestellt. Die Einschlußkörper wurden in 0,5% Natriumdodecylsulfat solubilisiert, und das nicht gebundene Detergens wurde mittels Dialyse gegen vier Liter Trisgepufferte Kochsalzlösung für 48 Stunden entfernt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE wie bei Laemli (1970) beschrieben analysiert, und die Proteinkonzentration wurde geschätzt, indem die Intensität der Coomassie-Blaugefärbten Bande mit einem Rinderserumalbumin-Standard verglichen wurde (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). Das Antigen wurde so in VSA formuliert, daß die Endkonzentration 100 ug pro ml LktA::LppB, 30% Emulsigen Plus, 0,9% Tween-80 und 2,5 mg pro ml DDA betrug. Das Dosisvolumen betrug 2 cm³, das 200 ug rekombinantes Antigen enthielt.
Drei Gruppen mit je acht Kälbern waren an dem Versuch beteiligt, und diese erhielten den LppB-Fusionsprotein- Impfstoff, Somnu-Star (formuliert in VSA, erhalten von BIOSTAR Inc.) als eine positive Kontrolle und schließlich ein Placebo. Der Impf- und Expositionszeitplan war wie in Beispiel 8 beschrieben. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 11 zusammengefaßt, und es ist ersichtlich, daß die Impfung mit Somnu-Star oder LktA::LppB die Zahl der Todesfälle, die Anzahl der klinisch auffälligen Tiere und Gewichtsverlust reduzierte. Diese Ergebnisse bestätigen, daß LppB ein protektives Antigen von H. somnus ist und daß die Fusion des LppB codierenden Gens mit dem P. haemolytica-Leukotoxin dessen Schutzfähigkeit nicht vermindert. Da H. somnus- und P. haemolytica-Impfstoffe häufig zusammen als Kombinationsprodukte formuliert sind, weist dieses Antigen den weiteren Vorteil auf, daß die Produktionskosten für einen solchen Impfstoff reduziert werden.
Daher sind das immunogene LppB-Protein von H. somnus, Analoge davon, immunogene Fragmente davon und chimäre Proteine beschrieben, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben. Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung recht detailliert beschrieben worden sind, ist es offensichtlich, daß offensichtliche Variationen vorgenommen werden können, wie durch die angefügten Patentansprüche definiert ist. Tabelle 3. Impfversuch 111: Serologische Antwort auf die Impfung.
N. D. = nicht durchgeführt
Gruppe 1 = Placebo
Gruppe 2 = LppA
Gruppe 3 = LppB
Gruppe 4 = IppA + LppB Tabelle 4. Impfversuch #2: Gesamte Gewichtsveränderung pro Gruppe Tabelle 5. Impfversuch #2: Durchschnittliche tägliche Temperaturen pro Gruppe Tabelle 6: Impfversuch #2: Durchschnittliche tägliche Anzahl lahmer Tiere pro Gruppe Tabelle 7: Impfversuch #2: Durchschnittliche tägliche Anzahl kranker Tiere pro Gruppe Tabelle 8: Impfversuch tf 2:. Taglicrie Anzaril aer Kalber mit Fieber*
* Temperatur > = 40,0 Tabelle 9: Impfversuch #2: Tägliche Anzahl kranker Kälber*
* Anzahl klinisch kranker Tiere > 0 (Tote Tiere zählten als krank) Tabelle 10. Impfversuch #2: Zusammenfassung der klinischen Befunde Schutz gegen H. somnus-Exposition durch Subunit-Impfstoffe Tabelle 11. Zusammenfassung des LktA::LppB-Impfversuchs

Claims

1. Impfzusammensetzung, umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel und ein rekombinantes, immunogenes Haemophilus somnus-Protein, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein lipidiert oder nicht-lipidiert sein kann und umfaßt

(a) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 1 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder

(b) eine Aminosäuresequenz, die durch die Positionen 17 bis einschließlich 279 von Fig. 9 dargestellt ist, oder

(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist zu der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder

(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).

2. Impfzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein entweder nicht-lipidiert ist oder mit einer Lipidgruppe lipidiert ist, die normalerweise nicht in Gesellschaft mit dem Protein gefunden wird.

3. Impfzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Protein mit einer Lipidgruppe lipidiert ist, die normalerweise in Gesellschaft mit dem Protein gefunden wird.

4. Impfzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die darüber hinaus ein Adjuvans umfaßt.

5. Impfzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aminosäuresequenz von (a), (b), (c) oder (d) mit einer Aminosäuresequenz verknüpft ist, die nicht von Haemophilus somnus stammt.

6. Impfzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Aminosäuresequenz, die nicht von Haemophilus somnus stammt, eine Aminosäuresequenz für das P.haemolytica-Leukotoxin ist.

7. Impfzusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Protein die in Fig. 11 dargestellte Sequenz aufweist.

8. Impfzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die nach ein Haemophilus somnus-Frotein umfaßt, das ein anderes Protein ist, als dasjenige, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die in (a), (b), (c) oder (d) von Anspruch 1 dargestellt ist.

9. Verfahren zum Herstellen einer Impfzusammensetzung, wobei das Verfahren umfaßt:

(1) Züchten einer transformierten Wirtszelle, wobei die Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor unter Bedingungen transformiert worden ist, bei denen dasjenige Protein exprimiert wird, das durch die in dem rekombinanten Vektor vorliegende Codierungssequenz codiert wird, wobei der rekombinante Vektor umfaßt:

(i) eine Nukleotidsequenz, umfassend eine Codierungssequenz für ein immunogenes Haemophilus somnus-Protein, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein umfaßt

(c) eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90% homolog ist 2u der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), oder

(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c), und

(ii) Kontrollsequenzen, die funktionsfähig verknüpft sind mit der Nukleotidsequenz, wobei die Codierungssequenz in eine Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, und wobei mindestens eine der Kontrollsequenzen zu der Codierungssequenz heterolog ist, und

(2) Mischen des exprimierten Proteins mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.

10. Verfahren nach Anspruch 9, das darüber hinaus das Transformieren einer Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor umfaßt, um die transformierte Wirtszelle zu erhalten.

11. Verwendung eines rekombinanten, immunogenen Haemophilus somnus-Proteins bei der Herstellung eines Impfstoffes zur Behandlung oder Verhinderung einer Haemophilus somnus-Infektion in einem Vertebraten, wobei das Protein, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, lipidiert oder nicht-lipidiert ist und umfaßt

(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).

12. Verwendung eines rekombinanten, immunogenen Haemophilus somnus-Proteins bei der Herstellung eines Impfstoffes zur Behandlung oder zur Prävention von thromboembolischer Meningoencephalitis, Septikämie, Arthritis, Pneumonie, Myocarditis, Pericarditis, spontanem Abort, Infertilität und/oder Mastitis, die durch Infektion mit Haemophilus somnus verursacht werden, wobei das Protein in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, und wobei das Protein lipidiert oder nicht-lipidiert ist und umfaßt

(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).

13. Erfindung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) , (c) oder (d), verknüpft mit einer Aminosäuresequenz, die nicht von Haemophilus somnus stammt, umfaßt.

14. Erfindung nach Anspruch 13, wobei die Aminosäuresequenz, die nicht von Haemophilus somnus stammt, eine Aminosäuresequenz für das P.haemolytica-Leukotoxin ist.

15. Erfindung nach Anspruch 13, wobei das Protein die in Fig. 11 dargestellte Sequenz aufweist.

16. Rekombinanter Carriervirus, der in der Lage ist, ein immunogenes Haemophilus somnus-Protein zu exprimieren, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein umfaßt

(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).

17. Impfzusammensetzung, die ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel und einen rekombinanten Carriervirus nach Anspruch 16 umfaßt.

18. Impfzusammensetzung nach Anspruch 17, bei der der Carriervirus ein Pockenvirus, vorteilhafterweise der Vaccina-Virus, ein Adenovirus oder ein Herpesvirus ist.

19. Pharmazeutische Zubereitung, die zur Nucleinsäureimmunisierung geeignet ist, wobei die Zubereitung einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine Nucleinsäuresequenz umfaßt, die ein immunogenes Haemophilus somnus-Protein codiert, das in der Lage ist, eine protektive Immunantwort gegen Haemophilus somnus hervorzurufen, wobei das Protein umfaßt

(d) ein Fragment einer Aminosäuresequenz entsprechend (a), (b) oder (c).