DE69231619T3

DE69231619T3 - Methode und Zusammensetzung zur Verhütung der Lyme-Krankheit

Info

Publication number: DE69231619T3
Application number: DE69231619T
Authority: DE
Inventors: Dr. Ian Livey; Dr. Prof. Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-09
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2012-07-10
Also published as: JP2611095B2; EP0522560A3; SK217292A3; SI9200143A; DE69231619D1; DK0522560T3; AU1934992A; EP0522560B2; EP0522560A2; NO922746L; HRP950174B1; DE69231619T2; NO304546B1; HRP950174A2; AU660178B2; DK0522560T4; EP0522560B1; ATE198489T1; SI9200143B; FI107334B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Die Erfindung betrifft die Vorbeugung von Lyme-Borreliose in Säugern. Insbesondere betrifft die Erfindung immunogene Formulierungen und Verfahren zur ihrer Verwendung, um die Entwicklung von Lyme-Borreliose zu verlangsamen oder ihr vorzubeugen.
Die Ausdrücke "Lyme-Borreliose" und "Lyme-Borreliosis" bezeichnen allgemein Infektionen durch Zecken, die durch die Spirochaete Borrelia burgdorferi bewirkt werden, die die häufigste durch Zecken übertragene Krankheit in sowohl den USA wie auch in Europa darstellt. Lyme-Borreliose ist der Syphillis aufgrund des Befalls einer Vielzahl von Organen, am häufigsten der Haut, des Nervensystems, des Herzens und der Gelenke, und weil sie sich in Stufen entwickelt und chronisch werden kann, ähnlich.
Da Lyme-Borreliose andere Krankheiten nachahmen kann, besteht ein Bedarf an genauen diagnostischen Instrumenten, insbesondere in schwierigen Fällen, in denen das klinische Bild unbestimmt ist. Es besteht auch ein Bedarf an Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung der Krankheit. Antibiotikatherapien können wirksam sein, wenn mit ihnen bald nach der Infektion begonnen wird, aber eine langwierige, hochdosierte Behandlung ist notwendig, sobald die Krankheit fortgeschritten ist. Zudem ist die Antibiotikatherapie nicht immer erfolgreich. Siehe Preac Mursic et al., Infection 18: 332-341 (1990). Dementsprechend wird ein Impfstoff zur Verhinderung von Lyme-Borreliose erwünscht.
Verschiedene Antigene von B. burgdorferi sind bekannt. Zwei Hauptaussenoberflächenproteine von B. burgdorferi, ospA (31kd) und ospB (34kd) werden von Barbour, Clin. Microbiol. Revs. 1: 399-414 (1988) diskutiert. ospA kommt in den meisten Stämmen vor, ist aber heterogen; d.h. ospA-Proteine von verschiedenen Stämmen können sich bezüglich des Molekulargewichts und in der serologischen Reaktivität unterscheiden.
ospB ist weniger unter den Stämmen verbreitet als ospA, und besteht, wie ospA, in verschiedenen serologischen Formen und in verschiedenen Molekulargewichten. Die Gene für ospA und ospB, die plasmidkodiert sind, sind kloniert, sequenziert und in E. coli exprimiert worden. Siehe Barbour et al., Rev. Inf. Dis. 1(6): S1470-74 (1989); Bergström et al., Mol. Mikrobiol. 3: 479-86 (1989).
Das pC (24kd)-Protein von B. burgdorferi ist in mancher Hinsicht dem ospA und B ähnlich. Es ist auch ein Lipoprotein und zeigt eine serologische Heterogenität und eine Heterogenität bezüglich des Molekulargewichts und wird auf der Zelloberfläche freigelegt (es steht auf der Zelloberfläche für die Bindung agglutinierenden Antikörper zur Verfügung, und zellassoziiertes pC wird leicht von Proteasen verdaut). Stämme, die das pC-Protein exprimieren, sind in Europa verbreitet. Zwischen 40 und 50% der 28 in Europa isolierten, die von Wilske et al., N.Y. Acad. Sci. 539: 126-143 (1988) getestet wurden, waren bezüglich des pC-Proteins positiv, obwohl dies eine Unterschätzung sein kann, weil die pC-Expression Schwankungen unterliegt.
Andere B. burgdorferi-Antigene schliessen das Aussenoberflächenprotein ein, das in der 60kd-Region gefunden wurde, Barbour et al., supra; das Flagellatenstrukturprotein in der 41kd-Region, Gassmann et al., Nucleic Acids Res. 17: 3590 (1989); das Protein in der 39kd-Region, Simpson et al., J. Clin. Micro. 28: 1329-37 (1990); und ein etwa 94kd-Protein, Fuchs et al., Forth International Conference on Lyme-Borreliosis (1990).
Verschiedene Reinigungsverfahren sind zur Herstellung der Antigene für weitere Untersuchungen und die Charakterisierung in diesem Zusammenhang verwendet worden. Zum Beispiel unterwarfen Wilske et al., Zbl. Bakt. Hyg. 263: 92-102 (1986) vollständiges Borreliae einem SDS-PAGE, bei dem die Proteine durch Wärme und durch Aussetzen des Tensids Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2-Mercaptoethanol denaturiert wurden. Hansen et al., J. Clin. Microbiol. 26(2): 338-46 (1988) offenbarten die Reinigung von B. burgdorferi-Geisseln. Die internationale Patentanmeldung Nr. 90/04411 von Bergström et al. lehrt ein nicht-denaturierendes Verfahren, um Fraktionen von Borrelia burgdorferi teilweise zu reinigen.
Untersuchungen haben sich auch auf die Präparierung und Charakterisierung von verschiedenen Antigenen zum Zwecke der Entwicklung diagnostischer Test fokusiert. So wird ein diagnostisches Verfahren zur indirekten Detektion von B. burgdorferi durch einen Assay für eine spezifische Antikörperproduktion als Antwort auf die Infektion in der zuvor erwähnten Anmeldung von Bergström et al. und in der US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/487 716 (Simpson & Schwan; veröffentlicht am 18. Juli 1990) offenbart.
Coleman et al., J. Infect. Dis. 155: 756-65 (1987) offenbaren auch die Herstellung von B. burgdorferi-Fraktionen durch Behandeln vollständiger Spirochaeten mit denaturierendem SDS-Detergens, wodurch eine protoplasmati scher Zylinder (das Bakterium befreit von der Proteinschicht)-Fraktion erhalten wurde, die nach weiterer Behandlung als ein Antigen verwendet werden kann.
Wilske et al., Fourth International Conference on Lyme-Borreliosis (1990), berichten über die Identifizierung von immundominanten Borreliae-Proteinen, die für die Diagnose von Lyme-Borreliosis nützlich sein sollen. Diese Forscher ziehen den Schluss, dass zwei Proteine, pC und p100, besonders wichtig sind in dem Masse, dass sie jeweils eine Indikation von frühen und späten Stadien der Krankheit bereitstellen.
DE 39 42 728 offenbart ein pC-Protein, das aus dem B. burgdorferi-Stamm pKo extrahiert wurde, wie auch die teilweise Aminosäuresequenz des Proteins und die mögliche Verwendung des pC-Proteins als Impfstoff.
WO 91/09870 offenbart die Aminosäuresequenzen eines pC-Proteins wie auch die mögliche Verwendung des Proteins oder von Fragmenten hiervon als Impfstoff.
Obwohl verschiedene Antigene bekannt sind, kann die Schutzwirksamkeit nicht aus der Fähigkeit des Antigens vorhergesagt werden, zu einer Immunantwort im Verlauf einer natürlichen oder experimentellen Infektion zu führen. Zum Beispiel induziert die 41kd-Geissel eine Immunoantwort, schützt aber nicht. Siehe Simon et al., Immunology Today 12: 11-16 (1991). Ähnlich vermag das 94kd-Protein keinen Schutz zu bieten, wie unten in Beispiel 3 berichtet wird. Tatsächlich hat die Anmelderin beobachtet, dass Antigene, die Schutz bieten, relativ selten sind. Folglich ist ein grosser Teil der Immunantwort durch Antigene bedingt, die für den Schutz nicht relevant sind. Umgekehrt können manche potentiell schützende Antigene beim Herbeiführen einer entsprechenden Immunantwort versagen. Daher kann die Nützlichkeit als eine Impfstoffkomponente nicht aus der Fähigkeit eines Antigens geschlossen werden, eine Antikörper-Antwort herbeizuführen.
Daher besteht ein Bedarf an kontinuierlicher Forschung über die Entwicklung eines geeigneten Impfstoffs gegen Lyme-Borreliosis. Von Interesse ist diesbezüglich US-PS 4 721 617 (Johnson), die einen Impfstoff gegen Lyme-Borreliosis offenbart, der ganze B. burgdorferi-Zellen umfasst, die durch Lyophilisierung inaktiviert worden sind. Auf Grundlage der Rückgewinnung des Pathogens aus der Niere und der Milz zeigt Johnson eine von der Dosierung abhängige Verminderung in der Infektionsanfälligkeit von immunisierten Hamstern durch einen virulenten B. burgdorferi-Stamm. Die Wirkung war jedoch kurzlebig, und die Tiere waren 90 Tage nach der Impfung unzureichend geschützt.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 418 827 (Simon et al.) beschreibt einen Impfstoff gegen B. burgdorferi, insbesondere gegen die Stämme B31 und ZS7, der monoklonale Antikörper umfasst, die das 31kd ospA-Protein erkennen. Gemäss der zuvor erwähnten europäischen Anmeldung von Simon et al. inhibiert die passive Immunisierung von SCID-Mäusen mit diesen Antikörpern die Entwicklung von Borrelia-induzierten Symptomen. (Der Schutz wird definiert als Widerstandsfähigkeit gegen die Infektion und gegen die Entwicklung von Arthritis.) Die europäische Anmeldung offenbart auch die Expression in E. coli eines rekombinanten β-Galactosidase/ospA-Fusionsproteins. Die offenbarten monoklonalen Antikörper werden durch Immunisierung mit ganzen Bakterienzellen oder mit den rekombinanten Antigenproteinen erzeugt.
Fikrig et al., Science 250: 553-56 (1990) dokumentiert den passiven Schutz von Mäusen (C3H/HeJ) mit polyklonalen Seren gegen abgetötetes B. burgdorferi oder ospA-exprimierendes E. coli, oder mit einem ospA-spezifischen monoklonalen Antikörper. Die Forscher zeigen auch, dass Mäuse aktiv nach der Immunisierung mit einem gereinigten, rekombinanten ospA/Glutathion S-Transferase-Fusionsprotein geschützt wurden. Der Schutz wurde bezüglich der Fähigkeit des Immunogens gemessen, die Infektion zu verhindern und die histopathologischen Anzeichen der Krankheit ausser Kraft zu setzen.
Bergström et al. (WO 90/04411) schlagen auch die Möglichkeit vor, dass immunogen aktive B. burgdorferi-Fraktionen in Impfstoffen verwendet werden könnten. Es werden jedoch keine Daten bereitgestellt, um entweder die Immunogenität oder die Schutzwirksamkeit der offenbarten Fraktionen zu demonstrieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
Es ist daher ein erfindungsgemässes Ziel, einen wirksamen Impfstoff gegen Lyme-Borreliose in Säugern und ein Verfahren zum Impfen von Säugern gegen Lyme-Borreliose bereitzustellen.
Durch Erreichen dieser und weiterer Ziele ist gemäss einem Aspekt der Erfindung ein Vakzin gegen Lyme Borreliose, gekennzeichnet dadurch, dass es ein Immunogen umfasst, bereitgestellt worden, das eine Mischung von unterschiedlichen serologischen Formen von nicht-denaturiertem B. burgdorferi-pC in homogener Form, einer pC-Variante oder einem pC-Mimetikum ist, wobei das Material eine Struktur aufweist, die nativem pC ausreichend ähnlich ist, um die Herstellung von Schutzantikörpern zu induzieren, und (b) einen physiologisch annehmbaren Träger hierfür umfasst, wobei das Immunogen in einer ausreichenden Menge vorliegt, um eine Immun antwort herbeizuführen, die einen anfälligen Säuger gegen Lyme-Borreliosis schützt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Immunogen weiterhi_n ein Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid. Die Menge liegt im Bereich von 1 bis 100 μγ pro Immunogen pro Dosis.
Es wird auch ein Verfahren zur Reinigung von B. burgdorferi-Proteinen bereitgestellt, umfassend die Schritte (a) Zerstören einer B. burgdorferi-Zelle und Fraktionieren der zerstörten Zelle in Membran- und cytoplasmatische Komponenten; (b) Resuspendieren der Membrankomponente in einem nicht-denaturierenden Detergens, wodurch ein solubilisiertes Protein und nicht-solubilisiertes Material hergestellt wird, und anschliessend Trennen des solubilisierten Proteins von dem nicht-solubilisierten Material; (c) Unterwerfen des solubilisierten Proteins einer Ionenaustauschchromatografie, um Proteinfraktionen herzustellen; und (d) Prüfen der Proteinfraktionen, um solche Fraktionen zu identifizieren, die Proteine enthalten, die von Interesse sind. Im Anschluss an Schritt (d) dieses Verfahrens kann entweder eine Hydroxylapatitchromatografie und/oder eine Affinitätschromatografie mit immobilisiertem Metall durchgeführt werden, um die Proteine, die von Interesse sind, aufzukonzentrieren und weiterzureinigen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse der elektrophoretischen Analyse von Antigenen zeigt, die aus Orth-1 unter Verwendung durch die hier beschriebenen Verfahren gereinigt worden sind.
2 ist eine Fotografie, die ein SDS-PAGE von B. burgdorferi-Zellen zeigt, die mit Trypsin (Spuren 2, 6 und 10), Proteinase K (Spuren 3, 7 und 11) oder ohne Proteasen (Spuren 1, 5 und 9) inkubiert wurden, im Vergleich mit dem gereinigten pC-Protein (Spuren 4 und 8). Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden durch Goldfärbung mit Aurodye (Spuren 1 bis 4), durch Western Blotting mit einem pC-spezifischen monoklonalen Antikörper (Mab35, Spuren 5 bis 8) und durch Fluorografie für Lipoproteine (³H-Palmitinsäurelabeling, Spuren 9 bis 11) charakterisiert.
GENAUE BESCHREIBUNG:
Obwohl verschiedene unterschiedliche B. burgdorferi-Antigene identifiziert und in unterschiedlichem Masse charakterisiert worden sind, ist das pC-Protein bislang nicht als ein Schutzmittel gegen Lyme-Borreliose erkannt worden. Ein Schlüsselaspekt dieser Entdeckung war die Erkenntnis, dass es für eine optimale Schutzwirkung notwendig sein würde, pC-Protein so nah wie möglich an der ursprünglichen Konformation zu halten. Ein neues Verfahren zur Herstellung von homogenem pC-Protein ist daher entwickelt worden, welches die native Konfiguration des Proteins im wesentlichen unbeeinträchtigt lässt, was die Verwendung von pC als Immunogen gegen Lyme-Borreliosis ermöglicht. Dieses nicht-denaturierende Reinigungsverfahren ist anwendbar für die Herstellung von Borrelia-Antigenen für die Verwendung in der Detektion von Lyme-Borreliose.
Die Schutzwirkung von nicht-denaturiertem pC-Protein wird leicht in der Wüstenspringmaus gezeigt, das heute als überlegenes Tiermodell für die Beurteilung der Wirksamkeit eines gegebenen Antigens, wie z.B. pC, bei der Entwicklung von Schutzantikörpern gegen Lyme-Borreliose anerkannt ist. Nichtsdestotrotz wurde gefunden, dass die Wüstenspringmaus besonders geeignet für solche Bewertungen ist, teilweise weil Borreliosis in den Wüstenspringmäusen der Krankheit im Menschen in verschiedenen wichtigen Aspekten ähnelt. Sowohl in der Wüstenspringmaus wie im Menschen:

(1) ist die Infektion multisystemisch, beeinträchtigt eine Vielzahl von Organen, wie z.B. die Haut, die Gelenke, das Nervensystem, die Milz, das Herz, die Blase und die Niere;
(2) kann die Krankheit chronisch sein. B. burgdorferi ist aus Wüstenspringmäusen nach mehr als 1 Jahr nach der Exposition gewonnen worden;
(3) kann sich ein Anschwellen der Gelenke, das an Arthritis erinnert, in der Wüstenspringmaus wie im Menschen entwickeln; und
(4) gibt es eine ähnliche humorale Immunantwort in bezug auf die Spezifität und die zeitliche Entwicklung der Antwort. Zum Beispiel ist entdeckt worden, dass infizierte Wüstenspringmäuse und Menschen immunologisch wenig, wenn überhaupt, auf ospA- und ospB-Proteine reagieren. Im Gegensatz zu Mäusen sind ospA- und ospB-Antikörper in Wüstenspringmäusen und Menschen selten.

Impfstoff:
Eine erfindungsgemässe Ausführungsform betrifft einen Impfstoff gegen Lyme-Borreliosis, wobei das Immunogen die Mischung unterschiedlicher Formen von nicht-denaturiertem pC-Protein von B. burgdorferi umfasst. Das pC-Protein ist ein Zelloberflächenprotein, wie durch proteolytische Verdauung desselben aus intakten B. burgdorferi-Zellen demonstriert. Es ist weiterhin gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 24kd, obwohl pC aus verschiedenen Stämmen eine Heterogenität bezüglich des Molekulargewichts und eine serologische Heterogenität zeigen kann. Mittels der herkömmlichen Hybridommethode sind 11 monoklonale Antikörper (B. burgdorferi monoklonale Antikörper 22, 28, 29, 34 bis 39 einschliesslich, 42 und 45) hergestellt worden, die pC aus dem B. burgdorferi-Stamm Orth-1 und mehreren weiteren Stämmen binden.
Zudem sind die vollständige DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz für das B. burgdorferi pC-Protein, das in den Schutzuntersuchungen verwendet wird, wie folgt:
Das erfindungsgemässe pC-Protein umfasst eine Mischung von verschiedenen serologischen Formen von natürlich auftretendem pC-Protein. Zusätzlich zu dem aus B. burgdorferi-Zellen erhaltenen pC-Protein, wie hiernach beschrieben, können rekombinantes pC, Varianten des natürlich vorkommenden Moleküls ("pC-Varianten") und "Mimetika" – Verbindungen mit Mimotopen, die die pC-Epitope nachahmen – verwendet werden.
Die Kategorie der pC-Varianten schliesst z.B. Oligopeptide und Polypeptide ein, die den immunogenen Teilen des pC-Moleküls und jeglichen nicht-proteinartigen immunogenen Teilen des pC-Moleküls entsprechen. So soll eine Variante ein Polypeptid einschliessen, das homolog ist zu dem natürlichen pC-Molekül und seine hervorstechenden immunologischen Merkmale beibehält. Diesbezüglich suggeriert "Homologie" zwischen zwei Sequenzen eine Ähnlichkeit, die fast eine Identität ist, die bezeichnend ist für eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten. Zum Beispiel ist ein Polypeptid "homolog" zu pC, wenn es eine Aminosäuresequenz enthält, die einem Epitop entspricht, das durch pC-spezifische Antikörper oder T-Zellen erkannt wird. Eine solche Sequenz kann nur einige wenige Aminosäuren lang sein und kann eine lineare Determinante sein oder eine, die entsteht, wenn Aminosäuren aus getrennten Teilen einer linearen Sequenz räumlich übereinandergelegt werden nach der Proteinfaltung oder nach Modifizieren der kovalenten Bindungen. Die Aminosäuresequenzen, die antigene Determinanten zum Zweck dieser Erfindung sind, können z.B. durch eine monoklonale Mapping-Analysetechnik, die im Stand der Technik bekannt ist, ermittelt werden. Siehe Regenmortel, Immunology Today 10: 266-72 (1989) und Berzofsky et al., Immunological Reviews 98: 9-52 (1987). Das Prüfen dieser Art von Ähnlichkeit kann auch über eine kompetitive Inhibitionsuntersuchung im Fall von Antikörpern oder durch T-Zellproliferation bewirkt werden.
Polypeptide, die gemäss diesen Kriterien als pC-Varianten bezeichnet werden, können erfindungsgemäss durch herkömmliche genetische Umkehrtechniken hergestellt werden, mit anderen Worten durch Design einer genetischen Sequenz auf Grundlage einer Aminosäuresequenz oder durch herkömmliche genetische Splicetechniken. Zum Beispiel können pC-Varianten durch Techniken hergestellt werden, die bindungsbezogene Mutagenese oder oligonukleotidbezogene Mutagenese einschliessen. Siehe z.B. "Mutagenesis of Cloned DNA", Current Protocols in Molecular Biology, 8.0.3. et seq. (Ausubel et al., Herausgeber, 1989; "Ausubel").
Andere pC-Varianten im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die einem Teil von pC entsprechen, oder die einen Teil von pC umfassen, aber nicht mit dem natürlichen Molekül übereinstimmen, und die die immunogene Aktivität von pC zeigen, wenn sie alleine oder alternativ mit einem Träger verbunden präsentiert werden. Eine pC-Variante dieser Art könnte ein tatsächliches Fragment des natürlichen Moleküls darstellen oder könnte ein Polypeptid sein, was de novo oder rekombinant synthetisiert wurde.
Um in der rekombinanten Expression von pC oder einer pC-Variante verwendet zu werden, würde ein Polynukleotidmolekül, das ein solches Molekül kodiert, vorzugsweise eine Nukleotidsequenz umfassen, die der gewünschten Aminosäuresequenz entspricht, die für den Wirt der Wahl in bezug auf Kodonverwendung, Beginn der Translation und Expression von kommerziell nützlichen Mengen von pC oder einer gewünschten pC-Variante optimiert ist. Zudem sollte ein Vektor, der für die Transformation des gewählten Gastorganismus mit einem solchen Polynukleotidmolekül ausgewählt wird, eine wirksame Beibehaltung und Transkription der das Polypeptid kodierenden Sequenz erlauben. Das kodierende Polynukleotidmolekül kann ein chimäres Protein kodieren; d.h. es kann eine Nukleotidsequenz aufweisen, die einen immunologischen Teil des pC-Moleküls kodiert, der praktikabel mit einer Kodiersequenz für einen Nicht-pC-Teil, wie z.B. einem Signalpeptid für die Wirtszelle, verbunden ist.
Um ein DNA-Segment zu isolieren, das ein pC-Molekül kodiert, kann die gesamte B. burgdorferi-DNA präpariert werden gemäss veröffentlichten Verfahren. Siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, N.Y. 1982); Baess, Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Teil B) 82: 780-84 (1974). Die so erhaltene DNA kann teilweise mit einem Restriktionsenzym verdaut werden, wobei eine mehr oder weniger zufällige Mischung von Genomfragmenten bereitgestellt wird; ein Enzym, das ein Tetranukleotid erkennt, wie z.B. Sau3A (MboI) ist für diesen Zweck geeignet. Die Fragmente von solch einer Teilverdauung können dann nach der Grösse fraktioniert werden, z.B. durch Sucrosegradientenzentrifugation (siehe Maniatis, oben) oder durch Gelelektrophorese mit gepulstem Feld (siehe Anad, Trends in Genetics, November 1996, Seiten 278-83), wobei Fragmente einer Länge entsprechend der das pC-Molekül kodierenden DNA bereitgestellt werden.
Gemäss bekannten Verfahren, z.B. in Ausubel bei 5.0.1.ff beschrieben, können die ausgewählten Fragmente in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden. Eine so erhaltene DNA kann z.B. an der BamHI-Stelle des pUC18-Kloniervektors eingebaut werden. Unter anderem chimäre Plasmide und Phagen, die durch Verbinden der nach der Grösse ausgewählten Fragmente mit dem Kloniervektor hergestellt werden, können dann in E. coli oder andere Wirtszellen transformiert werden, die danach bezüglich der Expression des kodierten Proteins gescreent werden. Eine Vielzahl von Verfahren kann für das Screening der Bibliotheken verwendet werden, um einen Klon, der das pC-Gen enthält, zu identifizieren. Diese Verfahren schliessen das Screening mit einer Hybridisierungsprobe ein, die spezifisch ist für pC, wie z.B. eine Oligonukleotidprobe, oder das Screening bezüglich der pC-Antigenexpression unter Verwendung eines pC-spezifischen immunologischen Rea genzes. Das letztere Verfahren kann beispielsweise durch Immunblotting einer Bibliothek mit Anti-pC-monoklonalen Antikörpern oder mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, das aus mit gereinigtem pC immunisierten Tieren hergestellt wird, verwirklicht werden. Wenn einmal ein Klon mit pC-kodierender DNA in der Bibliothek identifiziert wird, kann die DNA isoliert werden, der Bereich, der das pC-Protein kodiert, kann vollständig charakterisiert werden (wie durch Sequenzieren), und danach kann die DNA verwendet werden, um pC-Expressionsvektoren herzustellen, die für die Herstellung von pC-aktivem Protein geeignet sind.
Um ein wirksames Immunogen bereitzustellen, sollte, wie zuvor erwähnt, die Struktur des rekombinant exprimierten pC-Proteins ausreichend ähnlich der des nativen (nicht-denaturierten) pCs sein, so dass das Protein die Herstellung von Schutzantikörpern induziert. Diesbezüglich ist es bevorzugt, die pC-kodierende DNA in einer solchen Weise zu exprimieren, dass intrazelluläre Proteolyse und Aggregation der Expressionsprodukte in denaturierter Form vermieden werden. Eine Weise, dieses Probleme zu vermeiden, ist die rekombinante Herstellung von pC in einem Wirtsvektorsystem, das die Sekretion von pC aus der Wirtszelle vorzugsweise direkt in das Kulturmedium bereitstellt. Ein solches System wird durch Bacillus subtilis bereitgestellt. Ein geeigneter Sekretionsvektor kann für Bacillus subtilis durch Verbinden der B. amyloliquefaciens α-Amylase-Signalsequenz (siehe Young et al., Nucleic Acid Res. 11: 237-49 (1983)) an den Bacillus-Plasmidvektor pUB110, wie von Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162: 176-82 (1985) beschrieben, aufgebaut werden. Gemäss diesem Ansatz wird die Kodiersequenz für das Fremdprotein stromabwärts von dem Promotor, der Ribosombindungsstelle und der Signalsequenz für α-Amylase kloniert. Die Transkription und Translation von pC ist unter Kontrolle des α-Amylasepromotors und der Translationsmaschinerie in diesem Konstrukt, und die Sekretion von pC aus der Wirtszelle wird durch die α-Amylasesignalsequenz bereitgestellt. Ähnliche Vektoren für die Verwendung in Hefe sind beschrieben worden, und die Expressionssekretion von pC in Hefe unter Verwendung dieser Vektoren konnte erzielt werden.
Ein weiterer Ansatz für die Expression von pC in einem Wirtsvektorsystem, das Proteolyse, Aggregation und Denaturierung vermeidet, ist die Verwendung von Vaccinavirus als Vektor, der in einer Vielzahl von Säugerwirtszellen, die für die Vaccinainfektion anfällig sind, exprimieren kann. Dieser Ansatz würde die Herstellung eines von einem rekombinanten Vaccinavirus abgeleiteten Vektors mit sich bringen, indem das pC-Gen unter Kontrolle eines Promotors, neben Translations- und Sekretionssignalen, gebracht wird, der für die Expression des pC-Proteins in einem vaccinainfizierten Wirt geeignet ist. Wie in US-PS 4 603 112 beschrieben, würde das Plasmid auch in 5'-Richtung zu den Transkriptionskontrollbereichen und in 3'-Richtung zu dem 3'-Ende und den Polyadenylierungssignalen Flankiersequenzen umfassen, die einer homologen Rekombination in einem wilden Vaccinagenom förderlich sind. Wenn ein Konstrukt dieser Art in eine mit Vaccina infizierte Wirtszelle eingeführt wird, leiten die Flankiersequenzen die Rekombination zwischen dem Plasmidvektor und dem Vaccinavirus mit dem Ergebnis ein, dass eine klonierte Struktursequenz (hier kodiertes pC) ein Teil von dem Vaccinavirus wird und mit ihm sich vermehrt und exprimiert wird. Vorzugsweise enthält der Bereich zwischen den Flankiersequenzen einen auswählbaren Marker, so dass bei Vorliegen von Selektionsmedium nur solche Zellen überleben werden, die das rekombinierte Vaccinavirus (und im vorliegenden Zusammenhang die Sequenz, die ein pC-aktives Polypeptid) enthalten.
Ein rekombinanter Vaccinastamm, der auf diese Weise hergestellt wird, kann für die Infektion von Säugerzellen, wie z.B. Verozellen oder CV1-Zellen, verwendet werden, die für ein fermentatives Wachstum in hoher Dichte geeignet sind. Das in diesen Zellen während der Fermentierung exprimierte pC-aktive Protein wird in das Fermentationsmedium ausgeschieden werden, aus dem es über herkömmliche Verfahren gereinigt werden würde.
Zusätzlich zu natürlichem pC und pC-Varianten umfasst die Erfindung Verbindungen ("Mimetika"), die pC-Epitope nachahmen ("Mimotope"). Ein Beispiel eines Mimetikums ist ein antiidiotyper Antikörper, d.h. ein Antikörper, der durch Immunisieren eines Tieres mit einem Antikörper hergestellt wird, das spezifisch an ein Epitop eines Antigens bindet. Der antiidiotype Antikörper erkennt und entspricht der Bindungsstelle an dem ersten Antikörper. Daher ähnelt die Form seiner Bindungsstelle dem Epitop, das in die Bindungsstelle des ersten Antikörpers passt. Weil ein antiidiotyper Antikörper eine Bindungsstelle aufweist, deren Form dem ursprünglichen Antigen nachempfunden ist, kann es als ein Impfstoff verwendet werden, um Antikörper zu generieren, die mit dem ursprünglichen Antigen reagieren. Siehe Fineberg & Ertl, CRC Critical Reviews in Immunology 7: 269-284 (1987). Geeignete Mimetika könnten durch Screening mit einem pC-Antikörper identifiziert werden, um zu detektieren, welche Verbindungen hieran binden, oder könnten durch Molecular Modelling hergestellt werden. Siehe Morgan et al., "Approaches to the Discovery of Non-Peptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases", Annual Reports in Medicinal Chemistry (Academic Press 1989), Seiten 243ff.
Der erfindungsgemässe Impfstoff ist für die Immunisierung eines anfälligen Säugers, einschliesslich eines Menschen, gegen Lyme-Borreliose. Der Ausdruck "Immunogen" bedeutet ein Antigen, das eine spezifische Immunantwort herbeiführt, die zu einer humoralen oder zellvermittelten Immunität, in diesem Zusammenhang gegenüber einer Infektion mit Borrelia, führt. "Immunität" bezeichnet somit die Fähigkeit eines Individuums, einer Infektion zu widerstehen oder diese leichter zu überwinden im Vergleich mit nicht-immunisierten Individuen, oder die Infektion ohne klinische Beeinträchtigung zu tolerieren.
Das erfindungsgemässe Immunogen kann weiterhin einen physiologisch annehmbaren Träger umfassen. Solche Träger sind in der Technik bekannt und schliessen makromolekulare Träger ein. Beispiele geeigneter Träger in Säugern schliessen Tuberculin PPD, Rinderserumalbumin, Ovalbumin und Keyhole Limpet-Hämocyanin ein. Der Träger sollte vorzugsweise nicht-toxisch und nicht-allergen sein.
Das Immunogen umfasst weiterhin ein Adjuvans, wie z.B. eine Aluminiumverbindung, Wasser und pflanzliche oder Mineralölemulsionen (z.B. Freund'sches Adjuvans), Liposome, ISCOM (immunstimulierender Komplex), wasserlösliche Gläser, Polyanionen (z.B. Poly A:U, Dextransulfat, Lentinan), nicht-toxische Lipopolysaccharidanaloga, Muramyldipeptid und immunmodulierende Substanzen (z.B. Interleukin 1 und 2) oder Kombinationen hiervon. Das bevorzugte Adjuvans ist Aluminiumhydroxid. Die Immunogenität kann in Säugern verstärkt werden, die lebendabgeschwächte bakterielle Vektoren, wie z.B. Salmonellen oder Mycobakterien, oder virale Vektoren, wie z.B. Vaccina, empfangen haben, die ein pC-aktives Polypeptid exprimieren.
Techniken zur Formulierung solcher Immunogene sind in der Technik bekannt. Zum Beispiel kann das erfindungsgemässe Immunogen für die anschliessende Dehydratisierung in einem Träger, wie z.B. Kochsalzlösung oder einer anderen physiologischen Lösung, lyophilisiert werden. In jedem Fall wird der erfindungsgemässe Impfstoff durch Mischen einer immunologisch wirksamen Menge von pC mit dem Träger in einer Menge hergestellt, die zu der gewünschten Konzentration der immunogen wirksamen Komponente des Impfstoffs führt. Die Menge der immunogen wirksamen Komponente in dem Wirkstoff wird von dem zu immunisierenden Säuger abhängen, wie auch von dessen Alter und Gewicht und der Immunogenität der immunogenen Komponente im Impfstoff. So liegt eine Menge der immunogenen Komponente in dem Impfstoff im Bereich von 1 bis 100 μg pro Dosis, und vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 50 μg pro Dosis.
In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform umfasst das Immunogen die Mischung unterschiedlicher Formen von nicht-denaturiertem pC, eine pC-Variante oder ein pC-Mimetikum und ein oder mehrere andere B. burgdorferi-Antigene.
Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Impfstoffs wird so vorgenommen, dass die Beibehaltung der Identität und immunologischen Wirksamkeit der spezifischen Moleküle sichergestellt ist und keine ungewollten mikrobiellen Verunreinigungen eingeführt werden. Die Endprodukte werden unter aseptischen Bedingungen verteilt und gelagert.
Das Verfahren des Immunisierens eines Säugers gegen Lyme-Borreliose umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge des obigen Immunogens an einen Säuger. Die Verabreichung kann durch jede im Stand der Technik bekannte Art erfolgen. Zum Beispiel kann eine geeignete Verabreichungsstrategie das Verabreichen des oben beschriebenen Impfstoffs an Säuger umfassen, von denen bekannt ist, dass sie B. burgdorferi-tragenden Zecken ausgesetzt sind, etwa 6 Monate bis 1 Jahr vor dem Zeitpunkt der bekannten oder vermuteten Aussetzung. Jeder Immunisierungsweg, der in Betracht gezogen werden kann oder zeigen kann, dass eine geeignete Immunantwort herbeigeführt wird, kann erfindungsgemäss verwendet werden, obwohl die parenterale Verabreichung bevorzugt ist. Geeignete Verabreichungsformen schliessen subkutane, intrakutane oder intramuskuläre Injektionen oder Präparate ein, die für die orale, nasale oder rektale Verabreichung geeignet sind.
Reinigungsverfahren:
Weiterhin ist ein neues, nicht-denaturierendes Verfahren zur Reinigung einer Vielzahl von B. burgdorferi-Antigenen aus einer Vielzahl von B. burgdorferi-Stämmen entwickelt worden. Antigene schliessen ospA, ospB, pC, das Flagellarstrukturprotein und Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 21kd, 56kd, 60kd und 63kd ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Verfahren stellen eine Verbesserung gegenüber den Verfahren des Standes der Technik dar, die entweder denaturierend sind, spezifisch nur für einen besonderen Antigentyp sind oder nur eine teilweise Reinigung erzielen. Das bevorzugte Verfahren zur Reinigung umfasst die folgenden Schritte:

(a) Aufbrechen von B. burgdorferi-Zellen und Fraktionierung in "Membran-" und "cytoplasmatische" Komponenten durch Zentrifugieren;
(b) Extraktion der Membranfraktion mit einem nicht-denaturierenden Detergens mit anschliessendem Zentrifugieren, wobei ein Überstand erhalten wird, der solubilisiertes Protein umfasst, und wobei unlösliches Material als ein Pellet entfernt wird; und
(c) Fraktionierung der solubilisierten Antigene durch Ionenaustauschchromatografie (Diethylaminoethyl oder "DEAE"), wobei adsorbierte Antigene mit einem L7aCl-Gradienten eluiert werden.

Das Reinigungsverfahren kann weiterhin die Konzentrierung und weitere Reinigung des Antigens enthalten durch

(a) Hydroxylapatitchromatografie, wobei die adsorbierten Antigene durch Erhöhung des Phosphatgehalts des Puffers eluiert werden; und/oder
(b) Affinitätschromatografie mit immobilisiertem Metall, wobei die Antigene mit Imidazol eluiert werden.

Andere in der Technik bekannte Eluierungsverfahren schliessen die Eluierung durch eine Verminderung des pH-Werts oder durch Erhöhen der Konzentration an Ammoniumchlorid, Histidin oder einer anderen Substanz mit Affinität für das komplexbildende Metall ein.
Das Aufbrechen der Zellen kann durch Zelllyse, durch Schütteln in Suspension in einer Zellmühle mit winzigen Glasperlen, durch Ultraschall oder in einer French-Presse erreicht werden. Alternativ können die Antigene direkt aus der Zelloberfläche des Organismus durch Behandeln der Zelle mit einem Detergens, durch Verändern der ionischen Stärke der Umgebung der Zelle oder durch leichte Temperaturveränderung extrahiert werden. Alternativ kann ein Ausgangsmaterial, das Membranbläschen umfasst, die aus Zellen gezogen werden, verwendet werden.
Die Extraktion der Membranfraktion kann mit einem Detergens erreicht werden, das vorzugsweise eine gute Solubilisierungskraft aufweist, nicht-denaturierend ist und mit der Ionenaustauschchromatografie kompatibel ist. Das bevorzugte Detergens ist das zwitterionische Detergens 3-14 von Calbiochem, obwohl jedes Detergens oder organische Lösungsmittel verwendet werden kann, das die obigen Eigenschaften aufweist. Das Detergens wird typischerweise bei einer Konzentration von 1% (Gew./Vol.) verwendet, aber wäre in verschiedenem Masse im Bereich von 0,01 bis 10% (Gew./Vol.) wirksam. Die Detergensextraktion wird bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C, vorzugsweise bei 37°C, durchgeführt und sollte 10 Minuten bis 8 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde, dauern. Chaotrope Agenzien, wie z.B. Harnstoff, können zusätzlich zu dem Detergens verwendet werden, um den Solubilisierungsprozess zu verbessern.
Die mit Detergens solubilisierten Antigene werden dann durch DEAE-Chromatografie fraktioniert. Vorzugsweise wird ein DEAE-Ionenaustauschharz verwendet, aber andere anionische oder kationische Austauschharze können anstatt oder zusammen mit diesem verwendet werden. Erfindungsgemäss umfasst ein Ionenaustauscherharz eine unlösliche Matrix, an die geladene Gruppen gekoppelt sind. Funktionelle Gruppen, die für Anionenaustaucher verwendet werden, schliessen Aminoethyl (AE)-, Diethylaminoethyl (DEAE)- und quaternäre Aminoethyl (QAE)-Gruppen ein. Kationenaustauscher können Carboxymethyl- (CM), Phosphor- oder Sulfopropyl (SP)-Gruppen aufweisen. Obwohl die Proben auf die Säule in einem Tris-Puffer, enthaltend zwitterionisches Detergens 3-14 (1%) aufgetragen werden, und die Antigene mit einem NaCl-Gradienten eluiert werden, können andere Formulierungen gleichsam wirksam sein.
Die Antigene können durch Binden an Hydroxylapatit gemäss im Stand der Technik bekannte Verfahren aufkonzentriert werden. Eine alternative oder komplementäre Vorgehensweise, durch die Antigene weiter aufkonzentriert/gereinigt werden, ist durch Affinitätschromatografie mit immobilisiertem Metall. Das letztere Verfahren wird gegenüber Hydroxylapatitchromatografie für die Reinigung von pC bevorzugt, da eine bessere Trennung von ospA und B erreicht wird.
Der Vorteil des oben beschriebenen nicht-denaturierenden Reinigungsverfahrens ist, dass die 3-D-Konformation des Proteins beibehalten wird, wodurch alle auf dem nativen Protein gefundenen Antikörperbindungstellen, einschliesslich derer, die für den Schutz eine Rolle spielen, beibehalten werden. Wenn ein Protein denaturiert ist, können die Bindungsstellen teilweise oder vollständig zerstört werden, und die Fähigkeit des Antigens, Antikörper für die antigene Stelle zu induzieren, wird entsprechend herabgesetzt werden. So veränderte Proteine wären daher für die Verwendung in Impfstoffen ungeeignet.
Ein Vorteil des obigen Reinigungsverfahrens gegenüber Ganzzellenverfahren, wie z.B. von Johnson (1988) gelehrt, ist, dass es homogenes Protein herstellt, das frei ist von jeglichen toxischen Komponenten, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer negativen Reaktion vermindert wird. "Homogen" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass mindestens 80% (Gew./Vol.) des Proteins vollständig intaktes pC ist, und fast der gesamte Rest durch pC-Abbauprodukte dargestellt wird. So sind Verunreinigungen in Form von Medienbestandteilen oder anderen Borrelia-Bestandteilen, wenn überhaupt, nur in Spuren vorhanden. Homogenes pC kann mehr als eine serologische Form von pC umfassen.
So ist das Entfernen von nicht-gewollten, potentiell immunogenen Proteinen, die Autoantikörper induzieren könnten und schädliche Autoimmunreaktionen in dem immunisierten Säuger bewirken könnten, möglich. Gleichermassen stellt das oben beschriebene Reinigungsverfahren die Chargenreproduzierbarkeit während der Impfstoffherstellung sicher.
Schutz:
Auf Grundlage der entdeckten Gültigkeit von wüstenspringmäusen als diesbezügliches Tiermodell wurden Experimente durchgeführt, um zu bestätigen, dass Immunität gegen eine B. burgdorferi-Infektion vermittelt werden konnte. Diese Experimente werden unten in Beispiel 3 diskutiert. Obwohl ospA, ospB, pC, 63kd-Aussenoberflächenprotein, 21kd- und 94kd-Proteine aus dem B. burgdorferi-Stamm Orth-1 auch getestet wurden, zeigte nur das pC-Protein ein klares Zeichen einer Schutzwirkung.
Detektionsverfahren:
Durch das obige Reinigungsverfahren hergestellte Antigene sind für die Verwendung in diagnostischen Tests, wie z.B. für die Detektion von Antikörpern gegen B. burgdorferi in Körperflüssigkeiten von Säugern geeignet. Zum Beispiel kann ein nicht-denaturiertes, homogenes Protein, das durch das obige Verfahren hergestellt wurde, mit einer Körperflüssigkeitsprobe so inkubiert werden, das das Vorliegen eines gebundenen Antikörpers als Ergebnis einer solchen Inkubation detektiert wird. Der Ausdruck "Körperflüssigkeit" soll cerebrospinale Flüssigkeit, synoviale Flüssigkeit, Urin, Körperhohlraumflüssigkeit, Blut, Serum, Samen und Speichel einschliessen. Solche Test, obwohl im Stand der Technik bekannt, würden stark durch die Empfindlichkeit und Spezifität der erfindungsgemäss gereinigten Antigene verbessert werden.
Die Erfindung wird detaillierter in den folgenden Beispielen beschrieben, die der Veranschaulichung dienen und keineswegs den erfindungsgemässen Umfang beschränken sollen.
BEISPIEL 1 – Proteinreinigung
Herstellung von Membranfraktionen:
Borrelia burgdorferi-Zellen wurden durch Zentrifugation (7.000 g, 20 Minuten, 4°C) geerntet, und das Zellpellet wurde zweimal mit PBS-5 mM MgCl₂ gewaschen und das Zellnassgewicht wurde bestimmt. Die gewaschenen Zellen wurden dann in 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 (im Verhältnis von 1 g Zellen: 2 ml Puffer) resuspendiert, und die Suspension wurde zu Glasperlen (0,17 bis 0,18 mm Durchmesser, 5 g Perlen für 1 g Zellpaste) in einem Metallbecher hinzugefügt. Die Zellen wurden dann durch Schütteln der Mischung in einer Vibrogen^®-Zellmühle (Modell V14, Bühler) lysiert. 3 Minuten Schüttelzyklen unter Kühlen (4°C) wurden wiederholt, bis die Lyse zu mehr als 99%, wie durch Dunkelfeldmikroskopie bewertet, vollendet war. Das Lysat wurde dann auf einem gesinterten Glasfilter filtriert, um die Glasperlen zu entfernen, und die zurückgehaltenen Perlen wurden mit Puffer gewaschen, um die Ausbeute der bakteriellen Antigene in dem Filtrat zu verbessern.
Das Lysat wurde dann 20 Minuten lang bei 7.500 g bei 4°C zentrifugiert, um eine Rohmembranfraktion herzustellen ("lsp" – Low Speed Pellet). Der Überstand wurde weiterhin 30 Minuten lang bei 100.000 g bei 4°C zentrifugiert, um die zweite Membranfraktion herzustellen ("hsp" – High Speed Pellet). Beide Membranfraktionen wurden zweimal mit 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) unter Verwendung der ursprünglichen Zentrifugierbedingungen gewaschen. Beide Membranfraktionen hätten als Ausgangsmaterial für die Reinigung von pC (oder der anderen Membran-assoziierten Antigene) verwendet werden können, aber die hsp-Fraktion enthielt weniger kontaminierende Proteine.
Membrandetergensextraktion:
Die Membrane wurden auf etwa 10 mg Protein/ml in einem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1% (Gew./Vol.) des zwitterionischen Detergens 3-14 (Serva), resuspendiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurde das unlösliche Material abzentrifugiert (100.000 g, 60 Minuten, 4°C).
DEAE-Ionenaustauschchromatografie:
Die detergenssolubilisierten Antigene wurden durch DEAE-Chromatografie fraktioniert, wie unten beispielhaft angegeben:

Säule: Protein-PAK DEAE 5PW Semi-prep-Säule (21,5 mm Durchmesser, 1500 mm lang) von Waters.
Probe: 20 ml (4 × 5 ml) detergenssolubilisierte Antigenherstellung (10 mg/ml).
Flussrate: 4 ml/min.
Puffer A: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5/1% (Gew./Vol.), zwitterionisch 3-14.
Puffer B: A + 1M NaCl.
Gradient: 0% B in 35 Minuten, 0 bis 30% B in 90 Minuten, 30 bis 65% B in 45 Minuten, 65 bis 100% B in 10 Minuten.

Die Säule wurde mit Puffer A equilibriert und die Antigene mit steigenden Mengen NaCl eluiert. Um die Fraktionen, enthaltend das Antigen von Interesse, zu identifizieren, wurden Aliquots von 8 ml-Fraktionen mit Aceton ausgefällt und die Pellets wurden durch SDS-PAGE und/oder Immunblotting analysiert.
Hydroxylapatitchromatografie:
Mit dem Antigen von Interesse, wie z.B. pC, angereicherte Fraktionen wurden vereint und gegen Puffer C vor Aufgabe auf eine Hydroxylapatitsäule dialysiert. Gebundenes Antigen wurde durch steigende Mengen an Phosphationen, z.B. mit Puffer D, eluiert. So konnten verdünnte Antigenlösungen auf konzentriert werden und eine weitere Trennung des Antigens von Verunreinigungen erzielt werden. Die technischen Spezifikationen dieses Verfahrens sind wie folgt:

Säule: Bio-Gel HPHT-Säule (7,8 mm Durchmesser, 100 mm lang) von Bio-Rad.
Probe: vereinte pC-haltige Fraktionen aus dem vorhergehenden Schritt (z.B. die Fraktionen 20 bis 22) nach Dialyse gegen Puffer C (4 × 5 ml).
Flussrate: 0,5 ml/min.
Puffer C: 10 mM MOPS-NaOH (3-N-Morpholino-propansulfonsäure), pH 6,8/1 mM Na(PO₄)^3–/0,01 mM CaCl₂/1% (Gew./Vol.) zwitterionische 3-14.
Puffer D: C + 400 mM Na(PO₄)^3–.
Gradient: 0% D für 60 Minuten, 0 bis 100% D für 20 Minuten.

Die Fraktionen wurden wie für den Ionenaustausch-Chromatografieschritt analysiert.
Affinitätschromatografie mit immobilisiertem Metall:
Mit Antigen von Interesse angereicherte Fraktionen, wie z.B. pC-Fraktionen aus der DEAE-Ionenaustausch-Chromatografietrennung, wurden vereint und der Puffer eingestellt (z.B. wurde zu den Ionenaustausch-Chromatografiefraktionen, enthaltend das pC-Protein, NaCl zu einer Endkonzentration von 150 mM hinzugefügt). Filtrierte Antigenlösung (0,2 μm) wurde auf die immobilisierte Metallaffinitätschromatografiesäule aufgetragen (zuvor beladen mit Cu⁺⁺, wie durch den Hersteller beschrieben, und mit Puffer A equilibriert), mit Puffer A gewaschen, und das gebundene Antigen wurde mit dem imidazolhaltigen Puffer B eluiert. So konnten verdünnte Antigenkonzentrationen aufkonzentriert und eine weitere Trennung des Antigens von Verunreinigungen erreicht werden.
Die technischen Spezifikationen für dieses Verfahren, wie beispielhaft für das pC-Protein angegeben, sind wie folgt:

Säule: chelatisierende Superose HR 16/5-Säule (16 mm Durchmesser, 50 mm lang) von Pharmacia/LKB.
Probe: vereinte pC-haltige Fraktionen aus der DEAE-Ionenaustauschchromatografie mit zugefügtem NaCl (150 mM).
Puffer A: 20 mM Tris/Acetat, pH 7,5/150 mM NaCl/1% (Gew./Vol.), zwitterionisches Detergens 3-14.
Puffer B: 20 mM Tris/Acetat, pH 7,0/150 mM NaCl/1% (Gew./Vol.), zwitterionisches Detergens 3-14/50 mM Imidazol.
Flussrate: 2 ml/min.
Gradient: A für 30 Minuten, 0 bis 100% B für 40 Minuten.

Die pC-haltigen Fraktionen wurden wie in dem Ionenaustausch-Chromatografieschritt identifiziert.
BEISPIEL 2 – Ergebnisse des Reinigungsverfahrens
Die folgenden Antigene, die durch die oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, werden unter Bezugnahme auf 1 charakterisiert:
63kd-Aussenoberflächenprotein (Spur 7)
60kd-Protein (Spur 8)
56kd-Protein (Spur 9)
Flagellarstrukturprotein (Spur 10)
ospB (Spur 11)
ospA (Spur 12)
pC (Spur 13)
21kd-Protein (Spur 14)
Die ersten drei Schritte des Reinigungsverfahrens waren im wesentlichen unabhängig von dem zu reinigenden Protein im wesentlichen identisch, obwohl Modifikationen vorgenommen werden konnten, sofern erforderlich, um die Trennung zu optimieren. Der Hydroxyapatit-Chromatografieschritt, der bei der Reinigung/Aufkonzentrierung des pC-Proteins verwendet wurde, ist weitgehend anwendbar, da fast alle Proteine von Interesse an das Hydroxyapatit in Puffer C binden.
BEISPIEL 3 – Schutzuntersuchungen
Weil während einer aktiven Infektion erworbene Immunität normalerweise einer durch Impfung erworbenen Immunität überlegen ist, wurde eine Gruppe von 10 Wüstenspringmäusen intraperitoneal mit 2 × 10⁷ virulentem B. burgdorferi, Stamm Orth-1, exponiert, um zu zeigen, dass die Schutzimmunität vor Lyme-Borreliose ein realistisches Ziel ist. Diese Dosis wurde rückwirkend als Äquivalent von etwa dem 1.000-fachen der Infektionsdosis geschätzt, die notwendig ist, um 50% der Tiere zu infizieren. Nach 3 Wochen wurden die Tiere 1 Woche lang mit Antibiotika behandelt, um die Infektion zu überwinden. Nach einem Pausenzeitraum von 17 Tagen zur Abklärung der Antibiotika, wurden die Tiere nochmals exponiert, wie oben beschrieben. Nach 2 Wochen wurden die Tiere getötet, und die Blase, die Milz, die Nieren und das Herz wurden kultiviert. Alle diese Tiere waren geschützt, so dass B. burgdorferi nicht in eine der Organkulturen detektiert werden konnte, trotz einer regelmässigen Untersuchung der Kulturen über einen Zeitraum von 8 Wochen. Im Gegensatz hierzu waren 80% der Kontroll-Wüstenspringmäuse, denen die anfängliche "Immunisierungsexposition" nicht gegeben worden war, infiziert. Um die Vergleichbarkeit mit den Testtieren sicherzustellen, sind diese Kontrollen auch mit Antibiotika behandelt worden. Dies bestätigte, dass der Schutz der Untersuchungsgruppe der erworbenen Immunität und nicht dem anhaltenden Vorliegen von Antibiotika in den Geweben zurechenbar war.
In der nächsten Reihe von Experimenten wurde die Schutzkraft der durch die beschriebenen Verfahren aus B. burgdorferi gereinigten Antigene bewertet. Wüstenspringmäuse wurden zweimal intraperitoneal mit einer zweiwöchigen Pause zwischen den Immunisierungen mit 10 μg-Mengen von Antigen mit Aluminiumhydroxid-Adjuvans immunisiert. 2 Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere intraperitoneal zusammen mit einer nicht-immunisierten Kontrollgruppe 2 × 10⁷ virulenten B. burgdorferi-Stamm Orth-1 exponiert. 2 Wochen später wurden die Tiere getötet und die Blase, die Milz, die Nieren und das Herz wurden bezüglich Spirochaeten kultiviert. Die Kulturen wurden regelmässig über 8 Wochen untersucht.
ospA, ospB, pC und das 63kd-Aussenoberflächenprotein, alle von dem exponierten Stamm Orth-1, wurden überprüft. Nur die mit dem pC-Protein immunisierten Tiere zeigten klare Anzeichen einer Schutzwirkung. Obwohl kein absoluter Schutz gezeigt wurde, war die Infektion in den pC-immunisierten Tiere weniger ernst mit weniger infizierten Organen. Das Herz und die Nierenkulturen der immunisierten Tiere waren bezüglich B. burgdorferi negativ, im Vergleich zu einer etwa 50%-igen Infektionsrate in den Kontrollen. Ähnlich war die Infektionsrate in der Milz, die etwa 70 betrug, fast halbiert. Nur in bezug auf das empfindlichste Organ, die Blase, gab es keine beträchtliche Veränderung in der Anzahl der infizierten Kulturen. ospA, ospB und das 63kd-Protein waren total unwirksam. Die Ergebnisse dieser Experimente sind unten in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1

1 Kontrolle oder nicht-immunisierte Wüstenspringmäuse
2 Exponiert mit lebenden B. burgdorferi, Antibiotika-behandelt und wiederum exponiert, um den Schutz zu bewerten, mit anderen Worten "natürliche Immunität".
3 Formalin-abgetötetes B. burgdorferi (zwei 25 μg-Dosen, bezogen auf das Protein)

Ein anschliessendes Experiment wurde gemäss dem gleichen Protokoll wie oben beschrieben durchgeführt, nur dass die Expositionsdosis auf 10⁶-Organismen reduziert war. Nach der Immunisierung stellte pC unzweifelhaft einen Schutz bereit. Im Gegensatz hierzu war kein Beweis eines Schutzes im Anschluss an eine Immunisierung mit ospA-, 21kd- oder den 94kd-Proteinen vorhanden. Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigten alle mit pC immunisierten Wüstenspringmäuse eine Schutzwirkung, während keine der mit ospA-, 21kd- oder 94kd-Proteinen immunisierten Wüstenspringmäuse eine besondere Wirkung zeigten. TABELLE 2

1 Kontrolle oder nicht-immunisierte Wüstenspringmäuse

BEISPIEL 4 – Charakterisierung des pC-Proteins als ein Lipoprotein
In Anwesenheit von ³H-Palmitinsäure kultiviertes B. burgdorferi baut diese radioaktiv markierte Fettsäure in ihre Lipoproteine ein. Diese radiomarkierten Lipoproteine werden durch SDS-PAGE-Elektrophorese getrennt und durch Fluorografie identifiziert. Ein aus dem Stamm Orth-1 identifiziertes Lipoprotein wies das gleiche augenscheinliche Molekulargewicht (ca. 24kd) auf wie das pC-Protein aus diesem Stamm. Wenn ganze, mit ³H-Palmitinsäure radiomarkierte Zellen von B. burgdorferi Orth-1 mit Trypsin behandelt und dann mit SDS-PAGE analysiert wurden, trat ein charakteristisches Doppelband entsprechend dem teilweise verdauten pC-Protein auf. Western Blotting dieses Materials mit pC-spezifischen monoklonalen Antikörpern bestätigte, dass diese Bänder tatsächlich dem pC-Protein entsprechen. Dieses Dublett, das eine Diagnose für das pC-Protein darstellt, wurde auch bei der fluorografischen Analyse des Trypsin-behandelten Materials detektiert. Ein analoges Experiment unter Verwendung von Proteinase K, welches die Menge des zellassoziierten pC-Proteins wesentlich vermindert, führte zu fast dem vollständigen Verlust des 24kd-Lipoproteins. Diese Daten, wie in 2 gezeigt, bestätigen, dass das pC-Protein ein Lipoprotein ist.
Methodologische Details:
Radiomarkierung von B. burgdorferi-Zellen: B. burgdorferi Orth-1-Zellen (3,5 ml Kultur, enthaltend 1,6 × 10⁷ Zellen/ml) wurden in BSK-Medium, ergänzt mit radiomarkierter Palmitinsäure (70 μl ³H-Palmitinsäure, 55 Ci/mmol; 1 mCi/ml), 48 Stunden bei 33°C kultiviert, zweimal mit PBS/5 mM MgCl₂-Puffer gewaschen, und jedes Aliquot wurde in 190 μl PBS/MgCl₂-Puffer resuspendiert.
Proteolytische Verdauung: Zu 190 μl der Zellsuspension wurden 10 μl entweder PBS/MgCl₂ (Kontrolle), 62,5 μg Trypsin in 1 mM HCl oder 62,5 μg Proteinase K in Wasser hinzugefügt. Die Proben wurden durch Schütteln bei 25°C über 50 Minuten (Proteinase K) oder über 100 Minuten inkubiert, wonach 2 μl PMSF (50 mg Phenylmethylsulfonylfluorid/ml in Ethanol) hinzugefügt wurden. Die Zellen wurden pelletisiert (10 Minuten, 8.000 g) und zweimal mit 500 μl PBS/5 mM MgCl₂/0,5 mg/ml PMSF gewaschen, um Verdauungsprodukte zu entfernen.
Analyse der Proben: SDS-PAGE und Western Blotting wurden unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt. Die für die Fluorografie verwendeten Gele wurden 1 Stunde lang in EN³HANCE (NEN) inkubiert, 30 Mi nuten lang mit Wasser gewaschen, bei 65°C 2 Stunden lang getrocknet und unter Verwendung von Hyperfilm MP (Amersham) bei –80°C belichtet.
BEISPIEL 5 – Expression von rekombinantem pC-Protein
DNA wurde aus B. burgdorferi Orth-1 extrahiert, teilweise mit Sau 3A verdaut, grössenfraktioniert und in die BamHI-Stelle von pUC18 kloniert. Das Screening wurde mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsprobe durchgeführt, und das detektierte Gen wurde sequenziert.
Das pC-Gen wurde dann durch PCR durch Klonieren in einen Expressionsvektor amplifiziert.
Die verwendeten PCR-Primer waren:
Primer 1, entsprechend dem Start des offenen pC-Leserahmens (das Startkodon ist hervorgehoben)
5' ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATTA 3'
Primer 2, entsprechend dem Ende des offenen pC-Leserahmens (das Stoppkodon ist hervorgehoben)
5' ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG 3'
Die PCR-Reaktion wurde gemäss den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Vent_R DNA-Polymerase (New England Biolabs) durchgeführt. Verschmelzen der Primer an die Templat-DNA (rekombinantes pUC18-Plasmid mit einem B. burgdorferi-abgeleiteten DNA-Fragment, enthaltend das pC-Gen zusammen mit flankierender DNA) wurde bei 57°C durchgeführt, und die Primer wurden bei 74°C verlängert. Insgesamt 25 jeweils 1 Minute dauernde Zyklen wurden durchgeführt, wonach die Probe auf 50°C über 5 Minuten erwärmt wurde.
Das pC-Protein ist als ein maltosebindendes Protein (MBP)-Fusionsprotein unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Expressionssystems (New England Biolabs) exprimiert worden.
Aufbau des Fusionsplasmids:
Das PCR-amplifizierte pC-Gen wurde stromaufwärts des malE-Gens, das auf den Expressionsvektorplasmiden pMAL-p2 und pMAL-c2 vorliegt, eingefügt (100 ng Plasmid-DNA wurden mit dem Restriktionsenzym Xmn1 verdaut und mit 20 ng des PCR-Produkts, mit anderen Worten des pC-Gens, verbunden). Die ligierte DNA wurde in einen α-komplimentären E. coli-Wirt (z.B. TB1 oder DH5α) transformiert, und Klone, enthaltend das pC-Gen, wurden auf LB-Agar, enthaltend Ampicillin und X-gal, ausgewählt. Der Einbau des pC-Gens in den Kloniervektor, der Ampicillin-Widerstandsfähigkeit verschafft, unterbricht die male-lacZα-Fusion und führt zu einer Veränderung in dem Koloniephenotypen (blau zu weiss) bei den gewählten Testbedingungen. Konstrukte mit dem pC-Gen in der richtigen Orientierung, in bezug auf den tac-Promotor des Vektors, exprimierten ein pC-MBP-Fusionsprotein, wie durch Western Blotting mit pC-spezifischen monoklonalen Antikörpern bestätigt wurde. Das pC-MBP-Fusionsprotein wurde sowohl mit einem Signalpeptid (pMAL-p2) hergestellt, das das Fusionsprotein zu dem Periplasma leitet, und ohne die Signalsequenz, wobei in diesem Fall das Fusionsprotein in dem Cytoplasma verbleibt (pMAL-c2). Die cytoplasmatische Expression war stärker als die periplasmatische Expression, aber die letztere weist den potentiellen Vorteil auf, dass sie lösliche Produkte bereitstellt.
Reinigung von rekombinantem pC:
Rohextrakte, enthaltend das periplasmatisch und cytoplasmatisch exprimierte pC-MBP, wurden wie durch den Hersteller beschrieben hergestellt. Das Fusionsprotein wurde durch Affinitätschromatografie aufgrund der spezifischen Bindung von MBP an ein Amyloseaffinitätsharz gereinigt. Der MBP-Teil wurde von dem pC-MBP-Fusionsprotein abgespalten, wobei das komplette PC-Protein übrigblieb, weil das Fusionsprotein eine einzelne Erkennungsstelle für die Protease Faktor Xa in Nachbarschaft zu dem Start der pC-Aminosäuresequenz enthält. Das in diesem Verfahren freigesetzte MBP wird zusammen mit nicht-gespaltenem Fusionsprotein durch Leiten über das Amyloseharz entfernt (MBP bindet, nicht jedoch pC). Andere, als geeignet bekannte Verfahren für die Reinigung von pC hätten auch verwendet werden können, z.B. Ionenaustauschchromatografie, Hydroxylapatitchromatografie, Affinitätschromatografie mit immobilisiertem Metall.
Gemäss diesem Verfahren ist hergestelltes PC-Protein vollständig. Abschnitte des pC-Proteins (z.B. ohne die vermutliche Leitsequenz) können auch unter Verwendung der geeigneten PCR-Primer hergestellt werden.

Claims

Vakzin gegen Lyme Borreliose, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Immunogen, wobei es sich um eine Mischung unterschiedlicher serologischer Formen von nicht denaturiertem B. burgdorferi pC-Polypeptid in einer effektiven Menge zur Immunisierung eines gegen Lyme Borreliose empfänglichen Säugers handelt, wobei die Menge sich in einem Bereich von 1 bis 100 μg pro Immunogen pro Dosis bewegt, und ein Adjuvans umfasst.
Vakzin gemäß Anspruch 1, umfassend ein oder mehr nicht-pC B. burgdorferi-Antigene.
Vakzin gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Adjuvans Aluminiumhydroxid ist.
Vakzin gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei sich die Menge in einem Bereich von 10 bis 50 μg pro Immunogen pro Dosis bewegt.
Vakzin gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 4, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Vakzin gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5, wobei das Immunogen sich in homogener Form befindet und mindestens 80% (G/V) des strukturell intakten pC-Polypeptids umfasst.
Vakzin gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 6, wobei das pC-Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist, das in transformierten Wirtszellen erzeugt wird.
Vakzin gemäß Anspruch 7, wobei das pC-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die durch eine Polymerase-Kettenreaktion mit dem Oligonukleotidprimerpaar, korrespondierend zu 5' ATG AAA ARG AAT ACA TTA AGT GCG ATA TTA 3' und 5' ATT AAG GTT TTT TTG GAG TTT CTG 3', amplifizierbar ist.
Vakzin gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei das Immunogen durch Ionenaustausch gereinigt wurde.