JP2011518338A - ボレリア・ブルグドルフェリ（ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のアレイ - Google Patents
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Abstract
ライム病を診断する方法として、サンプルについてボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在を評価する方法を記載する。さらに、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のマイクロアレイについても記載する。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／１２５，０４０号明細書の利益を主張するものである。上記の出願の教示内容についてはすべて参照によって本明細書に援用する。
本出願は、２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／１２５，０４０号明細書の利益を主張するものである。上記の出願の教示内容についてはすべて参照によって本明細書に援用する。
ライム病は北米および欧州で最も多く見られるベクター媒介性疾患で、その分布範囲は拡大しており、発生率も上昇している。ヒトライム病は、ライム病関連ボレリア（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ）種群（ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）に属する、密接に関連するスピロヘータ群の数種が原因で起こる。スピロヘータはマダニ（Ｉｘｏｄｅｓ）属のマダニを介してヒトに伝播される（Ｓｔｅｅｒｅ，Ａ．Ｃ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８９；３２１：５８６−９６）。ヒトライム病は多臓器の（ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍ）進行性の障害であり、最初は皮膚に感染し、初期において感染が二次的に神経系、心臓および関節などの部位に拡大し得ることを特徴とする（Ｍａｓｕｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；４０：５３９−４５；Ｓｔａｎｅｋ，Ｇ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １９９１；１９：２６３−７）。ライム病の正確な診断および処置は、客観的な臨床的異常とＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）への曝露を示す血清学的証拠との相関関係によって決まる。
本発明は、個体由来の被検サンプルについて表１または表２に示す１種または複数種のタンパク質などボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体を評価する方法に関する。この方法は、表１または表２に示すタンパク質またはそのサブセットを含むマイクロアレイなど、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のマイクロアレイの使用を含んでもよい。本発明はさらに、個体におけるライム病を個体由来の被検サンプルについてＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体を評価することにより診断する方法であって、抗体の存在が疾患の診断の指標となる、方法に関する。本発明はさらに、この方法に有用なマイクロアレイなど、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のマイクロアレイに関する。
以下に本発明の典型的な実施形態について記載する。
播種性ライム病の個体の血清には、ある種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体が存在することが発見されている。９０種の細胞エンベロープタンパク質およびそのホモログがコードするタンパク質を含むマイクロアレイを作製した。このマイクロアレイを、既に播種性ライム病と診断された個体の血清にさらした。その結果から、ライム病の個体の血清が、表２に示すものなど特定の細胞エンベロープタンパク質と反応することが示された。特に、個体の血清の多くは表１に示すタンパク質の特定のサブセットと反応した。ライム病でない個体の対照血清では表１または表２のタンパク質と反応したものはなかった。
この発見により、被検サンプルについてボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のタンパク質に対する抗体の存在を評価するための方法およびマイクロアレイが現在使用できるようになっている。こうした抗体の存在はライム病の診断の指標となる。この方法はさらに、ライム病に関する診断剤およびワクチンの有望な候補の同定にも使用できる。
本発明の方法およびマイクロアレイでは、１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質を使用する。ある種の実施形態では、２種以上の細胞エンベロープタンパク質のセットを使用する。代表的なセットとして、表２に示すタンパク質のセットおよび表１に示すタンパク質のセットが挙げられる。細胞エンベロープタンパク質の他の代表的なセットとしては、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質の既知および推定されるすべてのセットが挙げられる。こうしたセットにはさらに、細胞エンベロープタンパク質のホモログおよびパラログを含めてもよい。これ以外のセットとしては、（たとえば表２または表１に示すものから選択される）細胞エンベロープタンパク質の２種以上のセット、３種以上のセット、４種以上のセット、５種以上のセット、６種以上のセット、７種以上のセット、８種以上のセット、または他の群のセットが挙げられる。特定の一実施形態では、セットは、表２に示すタンパク質から本質的になる。別の特定の実施形態では、セットは、表１に示すタンパク質から本質的になる。
本発明の一実施形態では、個体の被検サンプルについてＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在を評価する 「被検サンプル」とは、個体の血液、血清、脳脊髄液または他の適当な生物学的液体サンプルである。本方法では、当該技術分野において確立された通常の方法を用いて、被検サンプルについて１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在を評価する。特定の一実施形態では、細胞エンベロープタンパク質のマイクロアレイを用いて評価を行う。ある種の方法では、たとえば下記のようなマイクロアレイ、または本明細書に記載するような細胞エンベロープタンパク質または細胞エンベロープタンパク質のセットを個体の被検サンプルにさらし、その結果得られるタンパク質に対する抗体（被検サンプルに存在する場合）のあらゆる結合を評価する。１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対して抗体の結合が存在すれば、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞表面タンパク質に対する抗体の存在が示唆される。こうした抗体の存在は、被検サンプルを採取した個体のライム病の診断の指標となる。
本発明はまた、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質のマイクロアレイに関する。一実施形態では、マイクロアレイは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の既知および推定されるすべての細胞エンベロープタンパク質から本質的になる。別の実施形態では、マイクロアレイは、表２に示すセットタンパク質など、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の既知および推定されるすべての細胞エンベロープタンパク質のサブセットを含む。さらなる実施形態では、マイクロアレイは、表２に示すタンパク質のサブセット（たとえば表１に示すタンパク質のセット）を含む。他の実施形態では、他のマイクロアレイは、表２に示す２種以上、４種以上、６種以上、８種以上、または他の群の細胞エンベロープタンパク質のセットなど、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質の様々なサブセットを含む。特定の一実施形態では、マイクロアレイは、表２に示すタンパク質から本質的になる。別の特定の実施形態では、マイクロアレイは、表１に示すタンパク質から本質的になる。
本発明の他の実施形態では、次にこうした方法を、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞表面タンパク質をライム病の診断検査薬を開発するための有望な候補として評価するために、さらにはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞表面タンパク質をライム病の予防ワクチンを開発するための有望な候補として評価するために使用してもよい。こうした方法はどちらも、（たとえば上記のようなマイクロアレイにおいて）本明細書に記載するような細胞表面タンパク質のセットなど、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞表面タンパク質を、ライム病であることが分かっている１つまたは複数の個体の血清にさらし、次いで血清由来の抗体が結合するタンパク質を判定する。たとえば、実施例に記載されているようにＣｙ５蛍光強度／Ｃｙ３蛍光強度の比を使用してもよい。ライム血清と陰性対照との反応性の比の平均値に３倍の標準偏差を加えた値よりも大きいタンパク質であればどれも、ライム血清に存在する抗体とＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）タンパク質との相互作用が顕著であることが示される。こうしたタンパク質は、（たとえば上述の方法における）ライム病の診断検査薬および本明細書に記載するようなマイクロアレイに使用できるタンパク質であり、さらに有望なワクチン候補として使用することもできる。
また、ライム病の個体の血清と反応する、本明細書に示した細胞エンベロープタンパク質（たとえば表１および／または表２に示す）は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症に対するワクチンの免疫源としても有用である。このため、本発明はさらに、動物またはヒトにおけるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症のワクチン接種、および／または、その処置に使用できる医薬組成物に関する。特定の実施形態では、医薬組成物は、表１または表２に示すものなどボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）細胞エンベロープタンパク質、またはそうした細胞エンベロープタンパク質から得られるタンパク質（たとえば挿入、欠失または他の変化などの変異を持つ細胞エンベロープタンパク質、または教示内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第６，２４８，５６２号明細書；同第７，００８，６２５号明細書；同第７，０６０，２８１号明細書；および同第７，１７９，４４８号明細書に記載のものなどキメラタンパク質の一部を形成する細胞エンベロープタンパク質）を含む。また、この医薬組成物は、生理学的に許容されるキャリア、賦形剤および／またはアジュバントと共に投与してもよい。好適なアジュバントは、当該技術分野において周知であり（たとえば教示内容全体を参照によって本明細書に援用する国際公開第９６／４０２９０号パンフレットを参照）、たとえば、処置される動物においてタンパク質の免疫原性、効力または半減期を向上させるのに使用することができる。
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症のワクチン接種、および／または、その処置に使用する医薬組成物については、当該技術分野において周知のワクチン調製法を用いて調製すればよい。たとえば、本明細書に記載の細胞エンベロープタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分離用電気泳動、選択的沈殿、またはこれらの組み合わせなど既知の技法により、単離および／または精製することができる。調製された細胞エンベロープタンパク質は、細胞エンベロープタンパク質が好適な濃度になるように本明細書に記載するような好適な他の試薬と混合してもよい。細胞エンベロープタンパク質の用量は様々であり、たとえば処置対象の哺乳動物、ヒトなどの動物の年齢、体重および／または身体状態によって異なる。最適な用量は、好適な動物モデルを用いた通常の最適化法により判定すればよい。
ワクチンとして使用する医薬組成物の投与は、任意の好適な手法により行うことができる。医薬組成物の投与に好適な技法としては、たとえば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射などの注射；たとえば本発明の細胞エンベロープタンパク質を含む点鼻薬を鼻粘膜に適用する粘膜投与；経口投与；およびＤＮＡ免疫化があるが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、（たとえば上記のようなマイクロアレイにおいて）本明細書に記載の細胞エンベロープタンパク質を含む診断キットに関する。キットはさらに、細胞エンベロープタンパク質と、たとえば利用者により提供された宿主サンプルなどのサンプル中に存在する抗体との抗体−抗原複合体を検出するための試薬を含む。
晩期ライム病患者の免疫血清により認識されるボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の細胞エンベロープタンパク質を判定するため、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１株の注釈付けゲノム配列に記載の９０種の細胞表層遺伝子（ｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｅｎｅｓ）およびそのホモログがコードするタンパク質（たとえばＦｒａｓｅｒ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３９０（６６６０）：５８０−６を参照）を含むマイクロアレイを開発した。（さらにＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０００７８９．１、ＡＥ０００７８６．１、ＡＥ００１５８０．１、ＡＥ００１５７５．１、ＡＥ０００７９０．１、ＡＥ００１５７６．１、ＡＥ０００７８８．１、ＡＥ０００７８４．１、ＡＥ００１５７８．１、ＡＥ０００７８７．１、ＡＥ００１５７７．１、ＡＥ０００７８３．１、ＡＥ００１５８２．１、ＡＥ００１５７９．１、ＡＥ０００７８５．１、ＡＥ０００７９３．１、ＡＥ００１５８１．１、ＡＥ０００７９２．１、ＡＥ０００７９１．１、ＡＥ０００７９４．１、ＡＥ００１５８３．１およびＡＥ００１５８４．１を参照されたい。これらの受託番号の教示についてはその全体を本明細書に援用する。）
材料および方法
血清サンプル。血清は、Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬｙｍｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒで行われた多施設臨床試験に参加した患者から採取した。この血清サンプルは各被検体から個別に採取し、血清サンプルはすべて、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから事前に承認を得て、確立されたガイドラインの下で医師が判定した患者から採取した。サンプルは全体で晩期ライム病（ライム関節炎または神経ボレリア症）の患者１３例の血清を含み、どれもＥＬＩＺＡによるＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）抗体検査で陽性を示した。正常対照血清については健常ドナー４例から採取した。
血清サンプル。血清は、Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＬｙｍｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒで行われた多施設臨床試験に参加した患者から採取した。この血清サンプルは各被検体から個別に採取し、血清サンプルはすべて、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから事前に承認を得て、確立されたガイドラインの下で医師が判定した患者から採取した。サンプルは全体で晩期ライム病（ライム関節炎または神経ボレリア症）の患者１３例の血清を含み、どれもＥＬＩＺＡによるＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）抗体検査で陽性を示した。正常対照血清については健常ドナー４例から採取した。
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の培養およびＤＮＡの単離。２１種の既知の環状および線状プラスミド全部を含む、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の継代初期のＢ３１株を全ゲノムＤＮＡの供給源として使用した（Ｘｕ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２００３；３５：２６９−７８）。スピロヘータを完全なＢａｒｂｏｕｒ−Ｓｔｏｅｎｎｅｒ−Ｋｅｌｌｙ（ＢＳＫ−Ｈ）培地で対数期中期まで３４℃で培養した。Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ５００ ＤＮＡ精製カラムを用いてＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ゲノムＤＮＡを対数期後期のＢ３１から単離した（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９０；１：１５９−６８）。この解析ではさらに、ヒト患者から回収され、ＯｓｐＣ系統群（ｐｈｙｌｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）（以下ＯｓｐＣ型という）に型別されたＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）分離株も使用した。この株については、既に記載されている（Ａｔｔｉｅ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎ．Ｅｖｏ．２００７；７：１−１２）。
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のリポタンパク質遺伝子のＰＣＲ増幅。Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１のゲノム配列から設計された遺伝子特異的プライマーを用いて、ＯＲＦをコードする約９０種の推定細胞膜タンパク質を増幅した。異なる制限部位を有する２つのＯＲＦ特異的プライマー対を含む５０μｌのＰＣＲ反応液中で１０ｎｇのゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、Ｔ７系発現ベクターｐＥＴ−３０（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。また、このベクターは、ニッケル−セファロースカラムによる精製に役立つＮ末端ポリ（Ｈｉｓ）親和性タグを発現タンパク質に与える。５’プライマー（５’−ＡＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＣ＋１５ＭＥＲのＯＲＦ特異的配列）（配列番号１）はＮｃｏＩ部位（太字）を含んでいた。３’プライマー（５’−ＧＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧ＋１５ｍｅｒのＯＲＦ特異的）（配列番号２）はＮｏｔ１認識配列（太字）を含んでいた。発現タンパク質の溶解性を高めるため、プライマーセットは、膜アンカリングシグナル配列がなくてもコード領域を増幅するように設計した（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９０；１：１５９−６８）。ＰＣＲ増幅は、本出願人らが以前に記載した条件によりＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてストリンジェントな条件下で行った（Ｘｕ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２００３；３５：２６９−７８）。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により可視化した。定量のため、この産物を精製して（ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）、蛍光定量法により定量した。さらに、本出願人らが以前特徴付けを行ったヒト分離株（Ａｔｔｉｅ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｇｅｎ．Ｅｖｏ．２００７；７：１−１２）からいくつかの種類のＯｓｐＣ型の代表的なものを上記のように増幅した。本試験の対象となったＯｓｐＣ型は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｈ型、Ｉ型、Ｊ型、Ｋ型およびＵ型であった。
ｐＥＴ−３０ベクターに定方向にクローニングできるように、増幅産物をＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、タンパク質にＮ末端Ｈｉｓタグが付加されるようにｐＥＴ−３０のＮｃｏＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入した。ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＣ５コンピテント細胞に形質転換し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐｅｒｆｅｃｔｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ ９６ ＶＡＣ Ｄｉｒｅｃｔ Ｂｉｎｄ Ｋｉｔを用いてプラスミドを精製した。
タンパク質の発現および精製。発現のため、精製したプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１／ＤＥ３コンピテント細胞に形質転換した。Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎプロトコルを用いて、Ｎ末端ポリ（Ｈｉｓ）親和性タグを含むボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）タンパク質を発現させた（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．２００５；４１：２０７−３４）。誘導された細胞を遠心分離により回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔに再懸濁した。遠心分離により清澄化した後、上清を回収し（ｓａｖｅｄ）（可溶性タンパク質）、細胞ペレットを８Ｍの尿素を含むＨｉｓ−結合緩衝液に再懸濁した（不溶性タンパク質）。上清およびペレットのアリコートをどちらもＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。
ＲｏｂｏＰｏｐ Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて天然条件下（可溶性タンパク質）、あるいは、強い変性条件下（不溶性タンパク質）で、Ｎ末端ポリＨｉｓタグ付きタンパク質をニッケル−セファロースカラムで精製した。このキットは、濾過を用いた９６ウェルフォーマットＨｉｓ・Ｔａｇ融合タンパク質精製用に設計されている。
タンパク質濃度については、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）がタンパク質と反応したときの吸光度の変化を測定して判定した。タンパク質純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。
マイクロアレイ。マイクロアレイについては、Ｍｉｃｒｏｃａｓｔｅｒ ８−ｐｉｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｐｒｉｎｔｅｒを用いてタンパク質をニトロセルロースコーティングＦＡＳＴスライドガラスにプリントした。アレイの各スライドには、バックグラウンド測定用に固定化したＢＳＡスポットが１０個、および陰性対照として使用される固定化したヒトリパーゼタンパク質のＨｉｓタグ付きｈＧＳ２のスポットが８個含まれていた。プロテオームチップを、Ｆａｓｔ Ｐａｋプロテインアレイキットを用いてＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）感染患者（ＥＬＩＳＡによりＢｂ陽性）由来の血清でプローブした。簡単に説明すると、最初にプロテインアレイ−ブロッキング緩衝液で各スライドを４℃で一晩ブロッキングし、その後一次抗体（ヒト血清および定量用マウス抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ）のインキュベーションを２時間行った。抗体はＣｙ５コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡおよびＣｙ３コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧで可視化し、スライドを十分に洗浄してから、Ａｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ ４２００Ａマイクロアレイスキャナーでスキャンし、生データを取り込み、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ画像解析ソフトウェアで解析した。サンプル間のばらつきを最小限に抑えるため、ＰＭＴゲインを全アレイで等しく１．０に調整し、出力設定を５０％とした。包括的なバックグラウンド減算（ｇｌｏｂａｌ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）法を用いて、各スライドのＢＳＡ強度の平均値により各スポットからバックグラウンドを差し引いた。
データ解析。ヒト血清を用いたアレイから得られたデータの解析に際しては、スポットの蛍光強度の中央値が１０００を超える場合、およびスポットのＳＮＲ（信号対雑音比）が４を超える場合にスポットを陽性と見なし、その後の比率分析の対象とした。次いで各タンパク質のＣｙ５強度／Ｃｙ３強度（タンパク質／Ｈｉｓ−ｔａｇ）比を算出した。実験はすべて２回行い、各タンパク質のＣｙ５／Ｃｙ３比を平均した。いずれかのタンパク質の比がライム血清とＧＳ２陰性対照との反応性の比の平均値に３倍の標準偏差を加えた値を超える場合、ライム血清中に存在する抗体と固定化したＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）タンパク質との間の相互作用が有意であることが示唆される。
結果および考察
Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）膜結合タンパク質の大部分はリポタンパク質であり、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の全コード量（ｔｏｔａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）の８％超に相当する（Ｂｅｅｒｍａｎｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２６７：８９７−９０５）。こうした膜結合タンパク質は、抗原および炎症メディエーターとして重要であるため（Ｒａｄｏｌｆ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１５４：２８６６−７７）、有望なワクチン標的として大きな関心が向けられている。ライム病におけるヒト免疫応答で重要な抗原を同定するため、プロテインマイクロアレイを用いて９０種のボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）細胞エンベロープタンパク質を持つライム患者の血清抗体の反応性を調べた。
Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）膜結合タンパク質の大部分はリポタンパク質であり、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の全コード量（ｔｏｔａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）の８％超に相当する（Ｂｅｅｒｍａｎｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２６７：８９７−９０５）。こうした膜結合タンパク質は、抗原および炎症メディエーターとして重要であるため（Ｒａｄｏｌｆ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１５４：２８６６−７７）、有望なワクチン標的として大きな関心が向けられている。ライム病におけるヒト免疫応答で重要な抗原を同定するため、プロテインマイクロアレイを用いて９０種のボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）細胞エンベロープタンパク質を持つライム患者の血清抗体の反応性を調べた。
プロテインマイクロアレイチップを作製するため、各ＯＲＦをＰＣＲ増幅し、Ｔ７発現ベクターｐＥＴ２８ｂに定方向にクローニングした。オーバーナイト発現系（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、配列決定によって確認されたプラスミドを発現させ、発現タンパク質をＨｉｓ樹脂で精製し、ニトロセルロースコーティングＦＡＳＴスライドにプリントした。ＰＣＲ戦略は、各膜タンパク質をＮ末端にシグナル配列を持たない形でサブクローニングするように設計した。予備試験では、全長の遺伝子産物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で過剰発現すると、毒性が認められるようであった。このため、標的タンパク質はあまり高いレベルまで蓄積しなかった。シグナル配列を欠損した切断型のタンパク質はそれぞれ、優れた過剰産生体であることが証明された。（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９０；１：１５９−６８）
ライム病患者１３例由来の血清でアレイをプローブしたところ、アレイ化したタンパク質に対する個々の血清サンプルの反応性は、かなり不均一であることが観察された（表２を参照）。９０種の抗原のうち、１３個の血清サンプルすべてで認識されたのは、唯一ＢＢＰ２８のみであった。３種の抗原ＢＢＮ３９、ＢＢＯ４０およびＢＢＫ５０は、１３サンプルのうちの１２サンプルにより認識された。アレイ化した抗原のうち７６種が少なくとも１個のサンプルにより認識されたとはいえ、６例を超える患者により認識されたのは半数未満であった。最も高い血清反応性を示すアレイ化したタンパク質の間でもかなりの不均一性が認められた。こうした最も高いＣ５／Ｃ３シグナル強度比を示す抗原のうち、抗原ＢＢＡ２５（ＤｂｐＢ）、ＢＢＥ３１（推定Ｐ３５）およびＢＢ０３８３（ｂｍｐＡ）については、認識されたのが個体の半数未満であった。非感染のヒト由来の血清は、アレイ上のどの抗原とも反応しなかった（データ示さず）。
サンプル特異的な反応も存在したが、大部分の血清に共通して認識されるタンパク質のサブセットも存在した。本試験で認められた、最も認識されやすい（ｍｏｓｔ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎｅｎｔ）２５種の抗原を表１に示す。本出願人らが特定した２５種の抗原のいくつかは、ヒトの抗原として既に報告されていた。報告されているのは、哺乳動物の補体阻害因子Ｈに結合するタンパク質をコードするＥｒｐ遺伝子ファミリーの複数のメンバー、および細菌の宿主細胞への付着を促進する接着因子として機能するボレリアの表面リポタンパク質であるデコリン結合タンパク質（ＤｂｐＡ）である（Ｃａｓｊｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００；３５，４９０-５１６；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００；３８：１５６９−７４；ｖｏｎ Ｌａｃｋｕｍ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００５；７３：７３９８−０５；およびＣｉｎｃｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０００；１８３：１１１−４）。さらに晩期播種性血清では、以前に確認された免疫源である輸送タンパク質Ａ（ｅｘｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）（ＢＢＣ０６）、Ｐ３５（ＢＢＪ４１）、Ｐ３７（ＢＢＫ５０）、ＯｓｐＡ（ＢＢＡ１５）およびＯｓｐＣ（ＢＢＢ１９）も認識された（Ｆｉｋｒｉｇ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９９０：２５０：５５３-６；Ｆｕｎｈｇ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９４；６２：３２１３−２１；Ｃｈａｍｐｉｏｎ，Ｃ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９４；６２：２６５３−６１；Ａｇｕｅｒｏ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９６；３４：１−９；Ｎｏｗａｌｋ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００６ Ｊｕｌ；７４：３８６４−７３）。
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）遺伝子ファミリーＰｆａｍ１１３の複数のメンバーは、晩期播種性ヒト血清に対して強い免疫反応性を示した（Ｃａｓｊｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００；３５，４９０-５１６）。このリポタンパク質遺伝子ファミリーはＭｌｐリポタンパク質と呼ばれ、環状プラスミドでも線状プラスミドでも見出され、ＢＢＰ２８、ＢＢＬ２８、ＢＢＯ２８、ＢＢＳ３０、ＢＢＭ２８およびＢＢＮ２８が挙げられる（表１）。ｍｌｐ遺伝子は、抗原性が高い多様なリポタンパク質をコードしており、哺乳動物宿主の感染過程に関わっている可能性がある（Ｐｏｒｃｅｌｌａ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００；６８：４９９２−５００１）。ＢＢＩ４２も同様に、ヒヒ血清に関する以前の試験で免疫原性を持つことが示されており、ヒト血清と高い反応性を示した（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００６ Ｊｕｌ；７４：２０６−３０４）。
ＯｓｐＣに対するヒト抗体反応が型特異的であるかどうかを判定するため、組換えＯｓｐ ＣのＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｈ型、Ｉ型、Ｊ型、Ｋ型およびＵ型を作製し、プロテインアレイに抗原として加えた。表１に示すように、ＯｓｐＣ（ＢＢＢ１９）はライム患者１３例の血清のうち９例で高い免疫抗原性を示した。しかしながら、晩期播種性血清においてＯｓｐＣ型特異性に関する証拠は得られなかった。個々の血清サンプル内のどのＯｓｐＣ型も本質的にシグナル強度が等しいことが認識された（表２）。
本試験で特定され、特徴付けられていない新規なＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）抗原の中には、ＢＢＡ１４（リポタンパク質）、ＢＢＧ２３（機能未知タンパク質）、ＢＢ０１０８（リポタンパク質）、ＢＢ０４４２（内膜タンパク質）およびＢＢＱ０３（推定外膜タンパク質）などがある。
表２は、ライム病の個体由来の血清抗体により特定されたタンパク質をすべて示す。
表３は、ライム病患者由来の血清に対して陰性であったＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のアレイ化したタンパク質を示す。
本明細書に引用するすべての特許、公開された出願および参考文献の教示内容は、参照によってその全体を援用する。
本発明について詳細に示し、その典型的な実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱しない範囲で、その形式および細部に関する様々な変更が可能であることを理解するであろう。
Claims (22)
- 個体由来の被検サンプルについてボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在を評価する方法であって、表１に示すタンパク質からなる群から選択される１種または複数種のタンパク質に前記被検サンプルを曝露するステップ、および前記被検サンプルについて前記タンパク質に対する抗体の結合を評価するステップを含む方法。
- 前記個体由来の前記被検サンプルは表１に示すタンパク質それぞれに対する抗体の存在について評価される、請求項１に記載の方法。
- 前記被検サンプルの前記評価は、前記タンパク質を含むマイクロアレイの使用を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記マイクロアレイは表１に示すタンパク質のすべてを含む、請求項１に記載の方法。
- 個体由来の被検サンプルについてボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）の１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在を評価する方法であって、表２に示すタンパク質からなる群から選択される１種または複数種のタンパク質に前記被検サンプルを曝露するステップ、および前記被検サンプルについて前記タンパク質に対する抗体の結合を評価するステップを含む方法。
- 前記個体由来の前記被検サンプルは表２に示すタンパク質それぞれに対する抗体の存在について評価される、請求項５に記載の方法。
- 前記被検サンプルの前記評価は前記タンパク質を含むマイクロアレイの使用を含む、請求項５に記載の方法。
- 前記マイクロアレイは表２に示すタンパク質をすべて含む、請求項５に記載の方法。
- 個体におけるライム病を診断する方法であって、前記個体由来の被検サンプルについて１種または複数種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在を評価するステップを含み、前記抗体の存在がライム病の診断の指標となる方法。
- 細胞エンベロープタンパク質は表１に示すタンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 細胞エンベロープタンパク質は表２に示すタンパク質からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 前記個体由来の前記被検サンプルは、表２に示すタンパク質からなる群から選択される少なくとも２種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在について評価される、請求項９に記載の方法。
- 前記個体由来の前記被検サンプルは、表２に示すタンパク質からなる群から選択される少なくとも４種の細胞エンベロープタンパク質に対する抗体の存在について評価される、請求項９に記載の方法。
- 前記個体由来の前記被検サンプルは表１に示すタンパク質それぞれに対する抗体の存在について評価される、請求項９に記載の方法。
- 前記個体由来の前記被検サンプルは表２に示すタンパク質それぞれに対する抗体の存在について評価される、請求項９に記載の方法。
- 前記被検サンプルの前記評価は前記タンパク質を含むマイクロアレイの使用を含む、請求項９に記載の方法。
- 少なくとも１種のタンパク質はＢＢＰ２８、ＢＢＮ３９、ＢＢＯ４０およびＢＢＫ４０からなる群から選択される遺伝子座のオープンリーディングフレームのタンパク質である、請求項１、５または９のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも１種のタンパク質はＢＢＡ２５、ＢＢＥ３１およびＢＢ０３８３からなる群から選択される遺伝子座のオープンリーディングフレームのタンパク質である、請求項１、５または９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロアレイは表１に示すタンパク質をすべて含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記マイクロアレイは表２に示すタンパク質をすべて含む、請求項１６に記載の方法。
- 表１に示す細胞エンベロープタンパク質を含むマイクロアレイ。
- 表２に示す細胞エンベロープタンパク質を含むマイクロアレイ。
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