DE69919692T2

DE69919692T2 - Verabreichungssystem für Impstoffe basierend auf Gonokokkenblebosomen

Info

Publication number: DE69919692T2
Application number: DE69919692T
Authority: DE
Inventors: C. Daniel STEIN; K. Charles STOVER
Original assignee: University of Maryland Baltimore; University of Maryland College Park
Current assignee: University of Maryland Baltimore; University of Maryland College Park
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: WO1999059625A1; US6180111B1; EP1077719A1; CA2332829A1; EP1077719B1; US20020187160A1; CA2332829C; ES2228042T3; EP1077719A4; ATE274352T1; AU3889399A; DE69919692D1; JP2002515455A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Blebosomen umfassende Zusammensetzungen bereit, die ein immungenetisches Polypeptid ausdrücken, das für eine Krankheit spezifisch ist, Verfahren zur Herstellung derselben, Verfahren zum Ermitteln von Antikörpern, die für die immungenetischen Polypeptide spezifisch sind, und Verfahren zum Immunisieren eines Tieres unter Verwendung der Blebosomen.
Diskussion des Standes der Technik
Immunisierung ist ein Hauptansatz zur Verbesserung der Gesundheit von Kleinkindern und jungen Kindern. Ungeachtet der Verfügbarkeit einer Vielzahl erfolgreicher Impfstoffe gegen die meisten üblichen Kinderkrankheiten bleiben infizierende Krankheiten eine vorrangige Ursache für den Tod von Kindern. Signifikante Probleme, die existierenden Impfstoffen innewohnen, umfassen die Notwendigkeit für wiederholte Immunisierungen und die Ineffektivität aktueller Impfstofflieferungssysteme für ein breites Spektrum von Krankheiten.
Die Anzahl erfolgreicher Ansätze zur Impfstoffentwicklung ist nahezu so groß wie die Anzahl von infizierenden Wirkstoffen. Mit fortschreitender Technik ist es möglich geworden, auf molekularem Niveau die Natur des schützenden Immunogens zu definieren. In den zurückliegenden Jahren sind azellulare Impfstoffe das Verfahren der Wahl geworden für die Impfstoffentwicklung, weil sie mit Untereinheiten einer Vielzahl von Pa thogenen (d. h., Multikomponentenimpfstoffen) verabreicht werden können, und weil sie das Potential für eine verringerte Anzahl ungünstiger Reaktionen aufweisen. Untereinheitimpfstoffe sind zusammengesetzt aus definierten gereinigten, schützenden Antigenen aus pathogenen Mikroorganismen.
Womöglich das beste Erfolgsbeispiel mit Untereinheitimpfstoffen ist der aktuelle Impfstoff, der die Krankheit verhindert, die durch H. Influenzae verursacht wird. Ein konjugierter Impfstoff, der aus H. Influenzae-Polyribosyl-Ribitol-Phosphat (PRP) besteht, kapsulares Polysaccharid, konjugiert an einen äußeren Membranproteinkomplex (OMPC) von N. Meningitis, hat sich als sicher und effektiv erwiesen zur Erzeugung von Schutzimmunreaktionen bei Kindern im Alter von zwei Monaten. Kovalentes Koppeln von PRP an OMPC führt zu einem Konjugat, das effektiv Trägeraktivierung beschleunigt und außerdem ein unlösliches partikelförmiges Antigen bereitstellt, das Lipooligosaccharid (LOS) enthält, die förderliche Aktivität aufweisen. Dieser Impfstoff ist weitverbreitet als sicher und effektiv akzeptiert im Hinblick auf die Reduzierung des Auftretens von Morbidität und Mortalität, die mit den Krankheiten verbunden sind, die durch H. Influenzae (Stover, C. K. et al., Nature 351: 456–460, 1991; Husson, R. N. et al., J. Bacteriol. 172: 519–524, 1990; Jacobs, W. R. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 155: 153–160, 1990; Jacobs, W. R. et al., Nature 327: 532–535, 1987) ausgelöst werden.
Obwohl einige erstaunliche Erfolge aufgetreten sind, befindet sich aktuell eine kleine Anzahl von Untereinheitimpfstoffen im Einsatz. Voraussichtlich der am stärksten entmutigende Grund, der den Einsatz von Untereinheitimpfstoffen erschwert, ist das Problem der Antigenlieferung. Für eine optimale Antigenlieferung muss das Antigen demjenigen Antigen zugeführt werden, das Zellen in seinem biologischen Kontext aufweist, oder demjenigen Antigen, das durch Phagozyten problemlos erkannt und aufgenommen werden muss. Die meisten Antigene besitzen dreidimensionale Strukturen, die für Parasit-Wirtzellenwechselwirkungen wichtig sind, und zahlreiche dieser Strukturen gehen während der Antigenreinigung verloren.
Ein Ansatz, der verfolgt wurde, um die meisten Probleme zu vereiteln, die mit der Untereinheitimpfstoffherstellung verbunden sind, betrifft die Entwicklung lebender rekombinanter Impfstoffvehikel auf Grundlage abgeschwächter Viren und Bakterien, die genetisch entwickelt worden sind, um Schutzantigenen in vivo auszudrücken (d. h., rekombinante Formen des Impfstoffvirus, Adenovirus, Salmonella und Mycobakterium Tuberkulosis Typhus Bonivur var. Bacille-Calmette-Cuerin oder BCG) (Snapper, S. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6987–6991, 1988; Jackett, P. S. et al., J. Clin. Micro. 26: 2313–2318, 1988; Lamb, J. R. et al., Rev. Infect. Dis. 11: S443–S447, 1989; Shinnick, T. M. et al., Infect. Immun. 56: 446–451, 1988).
Lebende Impfstoffe erbringen Vorteile insofern, als das Antigen im Kontext einer von Natur aus immunen Form ausgedrückt ist; das lebende Lieferungssystem repliziert und verbleibt im dem Wirt unter Restimulierung des Wirtimmunsystems und es macht die Notwendigkeit für Mehrfachdosen unnötig; lebende Vektorsysteme eliminieren die Notwendigkeit zur Reinigung des Antigens und sind weniger teuer in der Herstellung; lebende Vektoren können so ausgelegt werden, dass sie mehrere Antigene liefern unter Reduzierung der Anzahl von Malen, mit denen ein Lebewesen geimpft werden muss.
Forscher, die Escherichia Coli und Salmonella als lebende Impfstoffvehikel entwickelt haben, exportieren Vektoren unter Verwendung von Flagella, Fimbriae oder größeren äußeren Membranproteinen (OmpA und LamB) als Träger zum Exportieren von Schutzepitopen auf die Oberfläche des bakteriellen Impfstoffvehikels (Stover, C. K. et al., Infect. Immun. 58; 1360–1475, 1990; Thole, J. E. R. et al., Infect. Immun. 55: 1466–1475, 1988). Der Ansatz, Epitopen in diese Oberflächen zu impfen, ist begrenzt einsetzbar, da lediglich kleine Epitopen eingeführt werden können, und die Epitopen im Kontext mit einem fremden Protein präsentiert werden, das die Fähigkeit begrenzt, seine native Konformation einzunehmen.
Um Impfstoffe gegen Pathogene zu entwickeln, die für die Impfstofflieferung rekalzitrierend sind, und/oder um die Unzulänglichkeiten kommerziell erhältlicher Impfstoffe auf Grund einer Unternutzung zu überwinden, müssen neue Verfahren zur Antigenpräsentation entwickelt werden, die weniger Immunisierungen erlauben und/oder weniger Nebenwirkungen in Bezug auf den Impfstoff haben. Ein neues Impfstofflieferungssystem ist in dieser Anmeldung erläutert und basiert auf Neisseria Gonorrhoeae als Wirt, ein Bakterium, das in natürlicher Weise seine Außenmembran in leicht isolierbare immunisierende Pusteln umwandelt.
Bei N. Gonorrhoeae handelt es sich um ein menschliches Pathogen von Mukosaloberflächen. Bei N. Gonorrhoeae handelt es sich um ein Gram-negatives Bakterium mit welliger Außenmembran, die als doppelschichtige Struktur erscheint (Abgehandelt in: The Gonococcus, P. B. Roberts (Ed.), Wiley, New York). Das Chromosom des Gonococcus enthält ungefähr 2,1 × 10⁶ Nukleotidpaare. Während der Logphase bilden die Gonokokken Zellwandpusteln, die erzeugt werden durch Keimen der Außen membran (Schorr, J. B. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press Vaccines 91: 387–392, 1991). Diese Pusteln sind kugelförmig und von einer membranartigen Doppelschichtstruktur umgeben. Von Neisseria abgeleitete Pusteln besitzen eine dreidimensionale Liposomenstruktur und stellen Immunstimulation (Fördern der Aktivitäten) für Antigene bereit, die mit ihnen kovalent verbunden sind (Brandt, M. E. et al., Infect. Immun. 58: 983–991, 1989). Proteinprofile von Gonokokkenpusteln ähneln stark solchen Proteinen, die in der Außenmembran der Gonokokken zu sehen sind (Melchers, F. et al., J. Erp. Med. 142: 473–483, 1975). Gonokokkenpusteln enthalten auf ihren Oberflächen Proteine I (Pistor, S. und G. Hobom, Wochenschr. 66: 110, 1988), II (Bakker, D. et al., Microb. Path. 8: 343–352, 1990) und H8 (Charbit, A. et al., EMBO 5(11): 3029–3037, 1986). Außerdem enthalten sie Gonokokkenlipooligosaccharid (LOS).
Viel Arbeit ist in die Charakterisierung der Zelloberflächenantigene des Gonococcus gesteckt worden und zahlreiche. der Gene, die Proteinantigene codieren, sind geklont worden und ihre DNA-Sequenzen sind bestimmt worden (Vodkin, M. H. und Williams, J. C., J. Bact. 170: 1227–1234, 1988; Young, D. L. et al., Infect. Immun. 54(1): 177–183, 1986; Young, D. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4267–4270, 1998; Newton, S. M. et al., Sciene 24: 70–244, 1989). Untersuchungen der Biosynthese und der Genetik, die der Biosynthese von jeder der LOS-Komponenten unterliegen, sind weit genug gediehen für eine erfolgreiche Konstruktion von Stammkulturen mit definierter LOS-Struktur und stabiler Zelloberfläche. Neisseria-Mutanten, die für LOS und andere Zelloberflächenproteine defizient sind, sind gut beschrieben und können problemlos hergestellt werden. Gonokokkenpusteln können ein fach isoliert werden und Vektoren für die Genmanipulationen von Neisseria existieren bereits.
Blebosomen sind vorteilhaft im Vergleich zu Liposomen als Träger von Antigenen. Liposomen werden künstlich hergestellt und interessierende Proteine werden entweder in ihnen eingeschlossen oder chemisch auf ihrer Oberfläche konjugiert. Die Blebosomen der vorliegenden Erfindung erfordern keine spezielle Behandlung und Proteine werden durch native Enzyme in natürlicher Weise gefaltet und können zugeschnitten werden, um innerhalb und außerhalb der Pusteln ausgedrückt zu werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Impfstofflieferungssystem bereit, aufweisend zugeschnittene N. Gonorrhoeae, wobei das Bakterium sämtliche heterologen Zielantigene ausdrückt und auf ihre Außenmembran richtet. Die Außenmembran mit dem Antigenprotein wird in natürlicher Weise in Gonokokkenpusteln während des Zellwachstums abgestreift. Der resultierend Zielantigenmembranpustelkomplex bzw. das Blebosom ist problemlos isolierbar und stellt einen nicht lebenden, jedoch immunisierenden zellenartigen Partikel dar, der genutzt werden kann, um eine Schutzimmunreaktion auszulösen.
Die freien Pustel- oder Hyperpustelstammkulturen ermöglichen die notwendige Produktion großer Mengen von Blebosomen zur Verwendung in einem Impfstoff. Um einen Impfstoff auf Grundlage von Gonokokkenpusteln kommerziell herzustellen, muss möglich sein, große Mengen an Blebosomen zu erzeugen. Obwohl sämtliche Gonokokkenstammkulturen Pusteln erzeugen, neigt die Ausbeute dazu, niedrig und zur Verwendung als Impfstoffliefersystem ungeeignet zu sein. Eine Stammkultur, die Hyperpusteln bildet, führt zu der erforderlichen hohen Ausbeute an Pusteln für eine wirtschaftliche Herstellung eines Impf stoffs. Eine derartige Hyperpustelstammkultur ist in der Literatur bislang noch nicht beschrieben worden. Es besteht deshalb ein Bedarf an einer Stammkultur aus N. Gonorrhoeae, die in der Lage ist, Hyperpusteln zu bilden, um in wirtschaftlicher Weise Blebosomenmengen herzustellen, die die Zielantigene in ausreichender Menge zur Nutzung als Impfstoffliefersystem bilden.
ZUSAMMNFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf einen Mutanten der N. Gonorrhoeae-Stammkultur WR302 gerichtet, die bezüglich eines unbekannten Wachstumsparameters zu wünschen übrig lässt. Dieser Nachteil führt dazu, dass der Gonococcus anormal wächst und seine Außenmembran mit sehr hoher Frequenz abstreift bzw. Hyperpusteln bildet. Diese Stammkultur erzeugt viel mehr Außenmembranvesikeln (Pusteln bzw. Blebs, vorliegend als Pusteln bezeichnet) als andere Stammkulturen, und die Pusteln lassen sich durch Elektronenmikroskopie problemlos sichtbar machen.
Die vorliegende Anmeldung offenbart außerdem die Herstellung anderer N. Gonorrhoeae-Stammkulturen mit dem Hyperpustelbildungsphenotyp unter Verwendung einer nicht selektiven Spot- bzw. Flecktransformationstechnik. Diese Technik erlaubt eine problemlose Identifizierung von Transformanten von N. Gonorrhoeae in Abwesenheit von selektivem Druck. Die Technik umfasst den Schritt, eine begrenzte Anzahl von Zellen mit einer Überschussmenge an DNA zu mischen, das Gemisch auf die Oberfläche einer Agarplatte fleckenweise zu verteilen, das Gemisch zu inkubieren und die transformierten Zellen zu selektieren und erneut in Streifen anzuordnen (Re-Streaking). Die Hyperpustelbildungsstammkulturen werden bezüglich ihrer Ex pression von Lipooligosaccharid (LOS) geändert. Die Transformanten können phenotypisch auf Grundlage ihrer Akquisition einer neuen monoklonalen Antikörperreaktivität und der Diffusion von Pusteln außerhalb der Kolonie identifiziert werden.
Unter Verwendung der Flecktransformationstechnik, die vorstehend erläutert ist, für Stammkulturen von N. Gonorrhoeae mit unterschiedlichen Mutationen und/oder solche, die bereits Gene für unterschiedliche Antigene besitzen, können Hyperpustelbildungsstammkulturen von N. Gonorrhoeae erzeugt werden, die Antigene für unterschiedliche Krankheiten ausdrücken. Blebosomen, die von diesen Hyperpustel bildenden Stammkulturen gesammelt werden, können verwendet werden, um einen Impfstoff zur Immunisierung in Bezug auf diese Krankheiten zu erzeugen. In dieser Weise hergestellte Impfstoffe haben den Vorteil in Bezug auf Vollzellenimpfstoffe, weil die Antigene in Abwesenheiten anderer Zellkomponenten vorliegen. Außerdem werden die Antigene in einer natürlichen biologischen Membran versammelt, wodurch das Antigen eine native Konformation bilden kann, wodurch viel stärker imitiert wird, was im natürlichen Organismus angetroffen wird.
Diese Blebosomen können in diagnostischen Untersuchungen verwendet werden, wobei die Anwesenheit von Antikörpern in Bezug auf die Krankheit in Proben aus einem Patienten ermittelt werden, von dem ausgegangen wird, dass er die Krankheit hat.
Blebosomen können außerdem als Liefersysteme für andere biologisch hergestellten Moleküle verwendet werden, wie etwa chemotherapeutische Mittel zur Verwendung in der Chemotherapie oder Immunverstärker/-unterdrücker.
Die Blebosomen können außerdem dazu verwendet werden, die Reinigung von Membranproteinen in Bezug auf Gonococcus (entweder natürlich oder künstlich hergestellt) zu fördern. Blebosomen sind für Außenmembranproteine des Gonococcus signifikant angereichert, weil in den meisten Zellen zytoplasmische Bestandteile nicht vorliegen. Die Isolation von Blebosomen stellt dann eine signifikante Reinigung dieser Gonokokkenmembranproteine dar. In ähnlicher Weise können Blebosomen für Proteine angereichert werden, die künstlich hergestellt wurden, um in dem Blebosom ausgedrückt zu werden, beispielsweise ein Rezeptorprotein, und die eine signifikante Verbesserung bei der Förderung der Herstellung und Reinigung dieser Proteine bieten.
Die vorliegende Anmeldung erläutert deshalb eine Hyperpustelbildungsstammkultur von Neisseria Gonorrhoeae, die große Mengen von Pusteln erzeugt, die für die Herstellung von Blebosomen nützlich sind, die spezifische Antigene zur Verwendung als Impfstofflieferungs- bzw. -fördervehikel oder als diagnostisches Mittel enthalten.
Die vorliegende Anmeldung erläutert außerdem ein Verfahren für die Herstellung von Hyperpustelbildungsstammkulturen aus N. Gonorrhoeae.
Die vorliegende Anmeldung erläutert ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen eines erwünschten Proteins in gereinigter Form, wobei das Verfahren vorsieht, das erwünschte Gen in eine Hyperpustelbildungsstammkultur aus N. Gonorrhoeae derart einzuführen, dass das Protein in Blebosomen ausgedrückt wird, und das Isolieren von Blebosomen.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Impfstofffördersystem zu schaffen, das die Blebosomen umfasst, die ein Antigen ausdrücken, das für die Krankheit spezifisch ist, um Immunität in Bezug auf die Krankheit bereit zu stellen.
ZEICHNUNGEN
Diese sowie weitere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung erschließen sich aus der nachfolgenden Beschreibung, den anliegenden Ansprüchen und der anliegenden Zeichnung; in dieser zeigen:
1 ein Immunoblot der Hyperpusteln bildenden N. Gonorrhoeae;
2 Partialrestriktionstabellen unter Darstellung von Delektionen, die konstruiert sind für S. NgoI, II, IV, V und VII R/M-Systemklone. Pfeile bezeichnen die vorgesagten offenen Methyltransferase (M)- und Restriktionsendonuklease (R)-Leserahmen. Die schwarzen Kästen bezeichnen die Bereiche auf jedem Klon. Restriktionsstellenabkürzungen lauten B, BgII; C, ClaI; D, DraI; E, EcoRI; H. HindIII; Hp, HpaI; N, NcoIII; P, PstI; R, RsaI; S, SalI; Sm, SmaI; Sp, SphI; Ss, SSpI; St, StyI; Su, Sau3aI; U, Gonokokkenaufnahmesequenz und X, XhoI.
3 die Flecktransformationstechnik;
4 ein Autoradiogramm von Southern-Blots unter Bestätigung des Einbaus von R/M-Beseitigungen in das Chromoson. Die erste Bahn von jedem Satz ist DANN aus FA 19 und die zweite Bahn bildet JUG029. Satz 1, NgoI-Beseitigung (mit PstI-XhoI-Teil von pLJPC30 sondiert); Satz 2, NgoII-Beseitigung (mit pLV155 sondiert); Satz 3, NgoIV-Beseitigung (mit pCBB49.0 sondiert); Satz 4, NgoV-Beseitigung (mit pJM5 sondiert); Satz 5, NgoVII-Beseitigung (mit pF,63 sondiert). Die DNAs werden dargestellt mit Satz 1, DraI; Satz 2, Sau3AI; Satz 3, SspI; Satz 4, RsaI, Satz 5, EcoRI + HindIII;
5 eine Untersuchung auf das Fehlen von S; NgoI, II, IV, V und VII MTase-Aktivität in der Stammkultur JUG029. Die erste Bahn von jedem Satz ist DNA, isoliert aus FA 19, und die zweite Bahn aus JUG029. Jeder Satz wird mit seinem Isoschizomer (oder einem Enzym mit einer Überlappungserkennungssequenz) dargestellt. Satz 1, HaeII (NgoI); Satz 2, HaeIII (NgoII); Satz 3, NgoMI (NgoIV); Satz 4, BamHI (NgoV); Satz 5, Fnu4HI (NgoVII). Bei der Bahn M handelt es sich um einen Lambda-HindIII-Markierer;
6 PCR-Markierer, die verwendet werden, die p6- und pspA-Gene zu verstärken. 6A zeigt die Markierer, die verwendet werden, das p6-Gen zu verstärken. 6B zeigt die Markierer, die verwendet werden, das pspA-Gen zu verstärken;
7 Plasmidtabellen von pLEE20, enthaltend die p6- und pspA-Einfügungen. 7A zeigt pLEE20-p6, das ungefähr 6,6 kb beträgt. Das p6-Gen besitzt seine eigene Lipoproteinsequenz und wird aus seinem eigenen ATG übertragen. Erm = Erythromycin^®. 7B zeigt pLEE20-pspA. PspA wird ebenfalls aus seinem eigenen ATG übertragen bzw. übersetzt;
8 Coomassie-Blau gefärbtes SDS-Page-Gel. A#8, #18 und #19 sind pLEE20-p6-Klone;
9 einen Western-Blot des SDS-Page-Gels von 8.
BESCHREIBUNG Hyperpustelbildungsstammkulturen
Die vorliegende Erfindung kann Hyperpusteln bildende N. Gonorrhoeae als Impfstoff verwenden. "Hyperpusteln bilden" bedeutet, wie vorliegend verwendet, dass die Mutantenstammkultur stärker Pusteln bildet als die Elternstammkultur, aus der sie gewonnen wird. Üblicherweise bilden Hyperpusteln bildende Mutanten um 10% stärker Pusteln als ihre Elternstammkulturen, bevorzugt stärker als 20%, stärker bevorzugt stärker als 30%.
Der Hyperpusteln bildende N. Gonorrhoeae kann so wie in den nachfolgenden Beispielen erläutert zubereitet und ausgewählt werden. Beispielsweise können zwei Ansätze genutzt werden, um eine Hyperpustel bildende Stammkultur zu erzeugen. Der präziseste Ansatz besteht darin, die genetische Basis dieser Mutation zu identifizieren und das Gen zu klonen.
Der zweite Ansatz besteht in dem nicht selektiven Flecktransformationsverfahren, das in den nachfolgenden Beispielen erläutert ist. Kurz gesagt wird Chromosonen-DNA aus der Hyperpusteln bildenden Stammkultur genutzt, um eine Stammkultur vom wilden Typ zu transformieren. Der Hyperpusteln bildende Phenotyp lässt sich problemlos identifizieren, weil Stammkulturen, die Hyperpusteln bilden, mit LOS-spezifischen monoklonalen Antikörpern 2-1-L8 und 1B2 auf Kolonieflecken beispielsweise reagieren. Der monoklonale Antikörper 2-1-L8 kann bezogen werden von Dr. Wendel Zollinger, Walter Reed Army Institute for Research, Washington DC. Der Antikörper 1B2 kann als ATCC Accession Nr. 2199 erhalten werden von der American type Culture Collection.
Der Hyperpusteln bildende N. Gonorrhoeae wird exemplifiziert durch eine neuartige Stammkultur, die mit WR302^-- bezeichnet ist, einem Derivat einer nicht Hyperpusteln bildenden Stammkultur WR302. WR302 kann bezogen werden von Dr. Daniel Stein. WR302^-- wurde deponiert unter den Bestimmungen der Budapest-Treaty mit der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD am 16. Oktober 1996 unter der Accession Nr. ATCC 55857.
Blebosomen können problemlos isoliert werden aus nicht piliatierten Zellen. Beispielsweise können Blebosomen rückgewonnen werden durch differenzielle Zentrifugation und Filtration.
Alternativ kann Hochgeschwindigkeitszentrifugation eingesetzt werden. Es wird verwiesen auf Buchanan & Arko, 1977, J. Infect. Dis. 135: 879–887 als allgemeine Fundstelle für Pustelisolation.
Blebosomen können bei 4°C vor dem Einsatz gelagert werden oder sie können fixiert werden, wenn die Fixierung nicht signifikant mit der letztendlichen Nützlichkeit des Blebosoms interferiert, entweder als Proteinerzeugungssystem, Diagnosereagenz oder Impfstoffförder- bzw. -liefersystem. Alternativ können N. Gonorrhoeae-Kolonien, die Blebosomen mit dem gewünschten Antigen erzeugen, selbst in Untersuchungen unter Wachsen auf Agar verwendet werden. Die Bakterien können lyophilisiert und zum Gebrauch nach Rekonstruktion gelagert werden.
Verfahren zur Erzeugung von Blebosomen nutzendem Protein
In einer Ausführungsform offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von Protein. Das Gen des gewünschten Proteins kann in den Neisseria unter Ver wendung von Vektoren eingeführt werden, die in der Lage sind, in dem Gonococcus zu replizieren, und die in der Lage sind, in den Gonococcus eingeführt zu werden durch Transformation oder Konjugation.
Das Protein kann entweder auf der Oberfläche oder innerhalb des Blebosoms abhängig von dem Vorliegen oder Nichtvorliegen einer funktionellen Signalsequenz ausgedrückt werden, geklont in unmittelbarer Nähe zu dem gewünschten Protein. Eine geeignete Signalsequenz zum Ausdrücken des gewünschten Proteins auf der Oberfläche des Blebosoms umfasst die H8-Lipoprotein-Signalsequenz, die PIII-Exportsequenz bzw. die PiliaA-Importsequenz.
Blebosomen, die die gewünschten Proteine ausdrücken, können in Übereinstimmung mit vorstehend genannten Verfahren gesammelt werden und entweder direkt oder begleitet von anderen Wirkstoffen nach Wahl genutzt werden. Bevorzugt können die Proteine durch immunologische Prezipitation unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern. gesammelt werden, die für das interessierende Protein spezifisch sind.
Geeignete Proteine für die Expression enthalten Cytokine, wie etwa Interleukine 1-12, und Außenmembranproteine, wie etwa OspA, P6 oder PspA. Mehrere unterschiedliche Antigene bzw. Proteine können gleichzeitig in demselben Gonococcus ausgedrückt werden, falls erwünscht.
Vektoren für genetische Manipulation von Neisseria
Beispiele von Vektoren, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung genutzt werden können, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, pLES2 (Stein et al. 1983, Gene 25: 241– 247) und pLEE10 (Sandlin et al. 1993, Infect. Immun. 61: 3360 –3368).
Verfahren zum Einführen dieser Vektoren und Analysieren der Transformanten sind bekannt und liegen im Geschick des Fachmanns.
Impfstofflieferungssystem, basierend auf Blebosomen
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Blebosomen als Impfstofflieferungssystem in menschlichen und tierischen Subjekten, wobei die tierischen Subjekte Veterinärtiere, Nutztiere und Haustiere umfassen. Die für die vorliegende Erfindung genutzte ideale Stammkultur besitzt bestimmte Eigenschaften, von denen einige die Fähigkeit enthalten, eine. abgebrochene LOS zu erzeugen, um die Adjuvenzfähigkeit des Blebosoms beizubehalten ohne Vorliegen der immundominanten Komponente (Chamberlain et al., Infect. Immun. 57: 2872–2877, 1989); das Nichtvorliegen des PIII-Proteins, das, wenn es in dem Gonokokkenimpfstoff vorliegt, hat sich als eine Immunreaktion stimulierend erwiesen, die mit der immunogenen Aktivität der übrigen Antigene interferiert, die in dem Impfstoff vorhanden sind (Young & Garbe, Res. Microbiol. 142: 55–65, 1991); die Fähigkeit, die Entwicklung von sowohl humoralen wie zellulären Immunreaktionen zu stimulieren und sowohl systemische wie Mukosalimmunität bereitzustellen; die Fähigkeit, problemlos die verschiedenen rekombinanten Proteine aufzuziehen und stabil auszudrücken; und schließlich, und dies ist am wichtigsten, die Fähigkeit, frei Pusteln zu bilden.
Die Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können dazu genutzt werden, eine Schutzimmunreaktion gegenüber Krankhei ten zu entwickeln, die durch Bakterien hervorgerufen werden, wie etwa Clostridium Tetani, Streptococcus Pneumoniae und Borrelia Burgdorferi.
Der in der vorliegenden Erfindung genutzte N. Gonorrhoeae kann so konstruiert werden, dass er jegliches heterologe Gen eines gewünschten Antigens ausdrückt und ausrichtet, das eine Immunreaktion in dem Patienten auslöst.
Der in der vorliegenden Erfindung genutzte N. Gonorrhoeae erzeugt eine große Anzahl von Pusteln mit dem gewünschten Antigen. Die Blebosomen können daraufhin, von bakteriellem Schmutz gereinigt, einem Patienten oder Tier als Impfstoff verabreicht werden mit oder ohne Arzneistoffträger. Alternativ kann das Antigen von dem Blebosom zusätzlich gereinigt werden, um ein Antigen zur Nutzung als Impfstoff bereitzustellen.
Impfstoffe können auch erstellt werden durch Konjugieren des Mutanten Neisseria an Trägern unter Verwendung von zum Stand der Technik gehörenden Techniken. Beispielsweise ist ein Impfstoff, der aus Neisseria abgeleitete Protosomen als chemisch konjugierten Träger für den Hemophilus Influenzae Capsular Polysaccharid verwendet, bereits approbiert worden durch die US Food & Drug Administration für den menschlichen Gebrauch und ist aktuell verfügbar. In ähnlicher Weise können Mutanten der vorliegenden Erfindung ebenfalls an bakteriellen Polysacchariden konjugiert sein.
Impfstoffe können zubereitet werden aus einem oder mehreren immunogenetischen Antigenen oder Blebosomen. Die Zubereitung von Impfstoffen, die immunisierendes Antigen bzw. immunisierende Antigene als aktives Ingredienz verwenden, ist dem Fachmann auf diesem Gebiet der Technik geläufig. Typischerweise werden diese Impfstoff als injizierbare Mittel zubereitet, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; als Feststoffformen, die geeignet sind für eine Auflösung oder Suspension in einer Flüssigkeit vor der Injektion, können ebenfalls zubereitet werden. Die aktiven immunisierenden Ingredienzien werden häufig mit Arzneistoffträgern gemischt, die pharmazeutisch verträglich und kompatibel mit dem aktiven Ingredienz sind. Geeignete Arzneimittelträger sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glyzerol oder dergleichen und Kombinationen hieraus. Falls erwünscht, kann der Impfstoff außerdem geringe Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie etwa Benetzungsmittel, pH-Puffermittel und/oder Adjuvante, die die Effektivität des Impfstoffs verbessern.
Die Impfstoffe werden herkömmlicherweise parenteral durch beispielsweise Injektion, entweder subkutan oder intramuskulär verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Arten der Verabreichung geeignet sind, umfassen Suppositorien und in einigen Fällen orale Formulierungen. Der die Blebosomen oder Antigen (e) enthaltende Impfstoff, der daraus gereinigt ist, kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln, beispielsweise Immunglobulin, verabreicht werden.
Die Impfstoffe können kompatibel mit der Dosisformulierung verabreicht werden, und in einer solchen Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch effektiv ist. Die zu verabreichende Menge, die üblicherweise von 5 Mikrogramm bis 250 Mikrogramm Blebosomen oder Antigen, das daraus gereinigt ist, pro Dosis beträgt, hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, von der Kapazität des Immunsystems des Subjekts, Antikörper zu synthetisieren, und dem gewünschten Schutzgrad. Die präzise Menge des aktiven Ingredienzes, das verabreicht werden muss, hängt von der Beurteilung des Arztes ab und kann für jedes Subjekt eigentümlich sein.
Untersuchungen unter Verwendung von Blebosomen
Die vorliegende Anmeldung beschreibt außerdem ein Verfahren zum Ermitteln des Vorliegens von Antikörpern gegen eine Krankheit in einer Probe. Unter Verwendung einer Standardmethode, die zum Stand der Technik gehört, kann eine diagnostische Untersuchung daraus bestehen, auf einer Oberfläche (d. h., einem massiven Träger) beispielsweise eine Mikrotitrationsplatte oder eine Membran (z. B. eine Nitrozellulosemembran) aufzutragen, wobei das gesamte oder ein Teil eines Blebosoms das spezifische Antigen für die zu ermittelnde Krankheit enthält, wobei es mit einer Probe von einer Person oder einem Tier in Kontakt gebracht wird, von der bzw. dem angenommen wird, dass sie bzw. es die Krankheit hat. Die Anwesenheit eines resultierenden Komplexes, der zwischen dem Blebosom und den Antikörpern gebildet wird, die hierfür spezifisch sind, und zwar in der Probe, können durch eines der bekannten Verfahren ermittelt werden, die zum Stand der Technik gehören, wie etwa Fluoreszenz-Antikörper-Spektroskopie oder – Kolorimetrie. Dieses Verfahren kann beispielsweise zur Diagnose von viralen Krankheiten eingesetzt werden, wie etwa Tollwut oder Hepatitis, bakterielle Krankheiten, wie etwa Salmonella oder Pneumonia, Pilzkrankheiten und Parasitkrankheiten.
Außerdem offenbart die vorliegende Anmeldung einen Diagnosebausatz, der Blebosomen mit dem gewünschten Antigen bzw. den gewünschten Antigenen enthält sowie Hilfsreagenzien, die zum Stand der Technik gehören und geeignet sind zur Verwendung bei der Ermittlung des Vorliegens von Antikörpern in Bezug auf eine Krankheit, wobei die Antikörper in Proben von einem verdächtigen Patienten enthalten sind.
BEISPIELE
Die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele illustrieren die Erfindung mehr im Einzelnen. Die vorgesehenen Beispiele erläutern die Verwendung einer nicht selektiven Flecktransformationstechnik zur Erzeugung von Beseitigungsderivativen. Für einen Fachmann ist es nicht schwierig, die Methode für die Transformation einer N. Gonorrhoeae-Stammkultur in eine Hyperpustel bildenden N. Gonorrhoeae anzuwenden unter Verwendung des Hyperpustel bildenden Phenotyps zur Ermittlung von Transformanten.
Die nachfolgenden Materialien und Methoden wurden in den nachfolgenden Beispielen verwendet.
Stammkultur und Plasmide
Rekombinante Klone, die in dieser Untersuchung verwendet werden, sind bereits erläutert worden (Gunn et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 5653–5660) und in 1 diagrammförmig aufgetragen. Die Stammkultur FA 19 wurde von Dr. W. Shafer, Emory University, bezogen. Der Klarheit wegen ist die für Gonokokken-DNA R/M-Systeme verwendete Nomenklatur, die in dieser Studie herangezogen wurde, in der Tabelle 1 gezeigt.
Medien und Puffer
Sämtliche N. Gonorrhoeae-Stammkulturen wurden in einer GCP-Brühe (Difco; Detroit, MI) zusammen mit Kelloggs Supplementen (Kellogg et al., 1963, J. Bacteriol. 85: 1275–1279) sowie Natriumbikarbonat (0,042) oder auf GCK-Agar zum Wachsen gebracht. E. Coli-Kulturen wurden in einer LB-Brühe bzw. auf LB-Platten (Miller, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) zum Wachsen gebracht. Falls erforderlich, wurde Ampicilin (35 μg/ml), Kanaycin (30 μg/ml) bzw. Chloramphenicol (35 μg/ml) dem Wachstumsmedium zugesetzt. Nalidixsäure (1 μg/ml) bzw. Erythromycin (2 μg/ml) wurden, falls erforderlich, dem N. Gonorrhoeae-Wachstumsmedium zugesetzt.
Chemikalien, Reagenzien und Enzyme
Die Chemikalien waren von Analysequalität oder einer höheren Qualität und sie worden erworben von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Restriktionsendonukleasen wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) bzw. Promega (Madison, MI) erworben und mit den gelieferten Puffern in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers verwendet.
Genetische Transformationen
E. Coli-Transformationen wurden über die standardmäßige CaCl₂-Prozedur (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). M13mp18- und M13mp19-Replikativformen wurden in JM101 über die standardmäßige CaCl₂-Prozedur transformiert und in einem 3 ml-Overlay ausplattiert, das 0,03 mM IPTG, 1 mg X-gal und 100 μl einer Übernacht-JM101-Kultur enthielt. N. Gonorrhoeae wurde durch eines der beiden Verfahren bzw. Methoden transformiert. Piliatierte Zellen wurden auf ungefähr 1 × 10⁸ Zellen/ml in einer GCP-Brühe resuspendiert, die 10 mM MgCl₂, 1X Kelloggs und 0,042 NaHCO₃ enthielt. Die Zellen plus DNA (1 μg) wurden un ter Rühren für drei Stunden bei 37°C vor Ausplattieren auf einem geeigneten Medium gerührt. In dem zweiten Verfahren bzw. der zweiten Methode, das bzw. die als Flecktransformationstechnik bezeichnet wird, wurden piliatierte Zellen resuspendiert, um Trübheit zu modifizieren (Klett = 35), und zwar in GCP plus 10 mM MgCl₂. Diese Kultur wurde verdünnt auf 10^–5 und 10^–6 (in GCP + MgCl₂) und 10 μl von jeder Verdünnung wurde gemischt mit DNA (100 ng der liniarisierten bzw. supergewickelten Form), und das DNA-Zellengemisch wurde auf Agarplatten fleckenförmig aufgetragen. Nach einer Übernachtinkubation wurden individuelle Kolonien innerhalb des Flecks zur Isolation mehrmals gepickt und in Streifenform gebracht. Einzelne isolierte Kolonien wurden daraufhin für das gewünschte generische Make-up gescreened.
Ermittlung der ENase-/MTase-Aktivität
Kommerziell erhältliche ENasen, die dieselbe Stelle wie die Gonokokkenenzyme (Isoschizomere) erkennen, wurden genutzt, um zu ermitteln, ob ein Klon ein funktionelles MTase-Gen getragen hat. Ein Klon, der eine funktionelle MTase trägt, sollte resistent sein gegenüber Spaltung einer entsprechenden Nase bzw. eines entsprechenden Isoschizomers. Sämtliche Systeme mit Ausnahme von S.NgoVII weisen Isoschizomere auf, die die Ermittlung durch diese Methode ermöglichen. Kein perfektes Isoschizomer ist für das S.NgoVII-System [5'-GC(G/C)GC-3'] bekannt; die MTase schützt jedoch gegenüber R.HaeIII (5'-GGCC-3')-Digerierung, wenn auf ihre Erkennungssequenz eine Zytosin folgt oder wenn ihr ein Guanin vorausgeht, und wenn sie die geeignete Base in der variablen Stellung aufweist. Die S.NgoVII-MTase schützt außerdem gegenüber Digerierung an ungefähr der Hälfte der oder sämtlichen Fnu4HI-Stellen (5'-GCNGC-3').
Methylase-Aktivität wurde ebenfalls ermittelt mit der Stammkultur AP1-200-9 (Piekarowicz et al., 1991, Nucl. Acids Res 19: 1831–1835). Diese Stammkultur enthält ein temperaturempfindliches mcrB-Allel, das, wenn es durch methylierte DNA bei der zulässigen Temperatur aktiviert wird, DNA-Beschädigung hervorruft. DNA-Beschädigung induziert daraufhin eine chromosomale dinD::lacZ-Fusion. Zellen wurden mit Plasmiden transformiert, die ein potentielles MTase-Gen enthalten, und über Nacht bei 42°C aufgewachsen wurden auf LB + Amp (100 μg/ml) + X-gal (35 μg/ml)-Platten. Die Platten wurden daraufhin für drei Stunden auf 30°C gebracht und daraufhin bei 42°C reinkubiert. Eine ein Plasmid enthaltende Kolonie mit einem funktionalen MTase-Gen aktiviert die dinD::lacZ-Fusion und führt zu einer blauen Kolonie.
Das Vorliegen von ENase-Aktivität wurde ermittelt durch eine oder mehrere der folgenden Methoden: (i) Reduktion von EOP der Lambdaphage, (ii) Reduktion des Transformationswirkungsgrads von pFT180 bzw. (iii) Proteinisolationstechniken. Die Lambdaphage, die von DH5αMCR geerntet wurde, wurde verwendet, um DH5αMCR zu infizieren durch Beherbergen des Vektors alleine oder eines mutmaßlichen ENase-Codierungsklons. Eine Reduktion von EOP wurde verwendet als Maß für due ENase-Aktivität. Das Plasmid pFT180 (isoliert aus DH5αMCR) wurde genutzt, um DH5αMCR zu transformieren, das einen mutmaßlichen ENase-Clon enthält, und DH5αMCR, das den Vektor alleine enthält. Eine Reduktion der Transformationsfrequenz des Experiments als Funktion der Kontrolle wurde als Bestätigung der ENase-Aktivität verwendet. ENasen wurden von E. Coli gereinigt, das ENase-Gene über FPLC enthält, und zwar durch das Verfahren von Piekarowicz et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 5957–5972.
Southern-Blot-Analyse
Digerierte Chromosomen-DNAs wurden auf 1%igen TBE-Agarose-Gelen Elektrophorese unterworfen, auf Gen-Screen-Membranen (DuPont, Wilmington, DE) unter Verwendung der Alkalitransfermethode von Reed und Mann übertragen (1985, Nucl. Acids Res. 13: 7207–7221) und auf der Membrane durch UV-Beleuchtung (1,5 J/sq.cm) fixiert. Hybridisierung und Visualisierung von Blots wurde bewirkt unter Verwendung von Lumi-Phos und dem Genius-Bausatz (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sämtliche der Schritte folgten dem Protokoll des Herstellers mit Ausnahme von Folgendem: Membranen wurden gewaschen mit 1 × SSC, 0,1% SDS und 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C; 1%ige, nicht fette Trinkmilch wurde als Blockademittel verwendet und in der Hybridisierungslösung; der Anti-Digoxigenin-Antikörper wurde verdünnt mit einem Verhältnis 1 : 10000 anstelle von 1 : 5000. Kolonie-Blots wurden durchgeführt mit der Methode von Sambrook et al. (1989).
Konstruktion von pUP1-1
Zwei Markierer wurden getempert, phosphoriliert und ligiert in BamHI-digestiertes pUC19. Die Einführung dieser getemperten Markierer in pUC19 wurde durch DNA-Sequenzen bestätigt. Die Sequenz der Mehrfachklonierungsstelle in diesem Vektor beträgt:
.In der vorstehend genannten Sequenz ist die Markierersequenz unterstrichen und die Gonokokken-Aufnahmesequenz ist fett gedruckt. Dieser Markierer weist in sich selbst eine EcoRI-Stelle auf; die Digerierung mit EcoRI führt deshalb zu einem Verlust der halben Mehrfachklonierungsstelle, jedoch nicht der Gonokokken-Aufnahmesequenz.
DNA-Sequenzierungen/DNA-Sequenzanalyse
Gene, die die Enzyme von S.NgoI, II und VII-R/M-Systeme codieren, wurden sequenziert mit der Sanger-Dideoxy-Technik unter Verwendung des Sequenaee-Bausatzes (US Biochemicals, Cleveland, OH). DNA wurde sequenziert unter Verwendung einer Kombination von einsträngigen M13-Klonen und doppelsträngigen Plasmidklonen. Doppelsträngige Matrizen wurden denaturiert vor dem Kennzeichnen bzw. Markieren durch folgendes Protokoll. Einer Denaturierungslösung (2 μl N NaOH, 2 mM EDTA) wurde 1 μg Plasmid-DNA in einem Endvolumen von 22 μl zugesetzt. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 6 μl 1 M Tris (pH 4,5) zugesetzt und die DNA wurde prezipitiert. Markierer, bezogen von der University of Maryland Biopolymer Laboratory bzw. des Walter Reed Army Institute for Research, wurden bei Sequenzieren von S.NgoI, II, VII und VIII-Genen verwendet. Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem 4%igen Polyacrylamid, 8 M Harnstoffbeladungsgel in einer LKB-Sequenzierungsvorrichtung elektrophorisiert.
DNA-Sequenzen wurden analysiert unter Nutzung der Computerprogramme GENEPRO (Riverside Scientific, Seattle, WA) und PC/GENE (Intelligenetics).
Konstruktion von R/M-Beseitigungsmutationen
S.NgoII
Der S.NoII-Klon, pLV 155, wurde mit NcoI und HpaI verdaut bzw. digeriert, und das NcoI-Ende wurde aufgefüllt mit Kle now. Dieses Reaktionsgemisch wurde verdünnt, ligatiert und die DNA wurde in die Stammkultur DH5αMCP transformiert. Ein Transformant wurde identifiziert, der einen Klon enthält, dem das 1272 bp NcoI-HpaI-Fragment (pLV 156) fehlt. Dieser Klon besitzt keine MTase- und Enase-Aktivitäten, wie durch Sensibilität gegenüber HaeIII-Digerierung demonstriert, sowie eine Log-Sechs-Erhöhung des Wirkungsgrads des Ausplattierens von des Lambdaphagen auf E. Coli, enthaltend diese Plasmide (Daten nicht gezeigt). Die Stammkultur FA 19 wurde mit diesem Plasmid über die Flecktechnik transformiert und die resultierenden Kolonien wurden abgenommen und wachsen gelassen, um das natürlich auftretende 4.2 Kb-Plasmid (kryptisches Plasmid) zu isolieren, das in den meisten Gonococci (kryptisches Plasmid) gefunden wird. Eine Stammkultur wurde identifiziert, deren kryptisches Plasmid empfänglich war für HaeIII-Digerierung (als JUG025 bezeichnet).
S.NgoV
Der S.NgoV-Klon, pJM5, wurde vollständig mit SspI digeriert und relegiert, wodurch ein 722-bp-Bereich beseitigt wurde, der das MTase-Gen und das putative ENase-Gen überlappt. Dieses Plasmid, pJM10, war nunmehr sensitiv in Bezug auf eine Digerierung mit BamHI unter Demonstration des Verlustes von MTase-Aktivität (Daten nicht gezeigt). Das Plasmid pJM10 wurde verwendet, um eine N. Gonorrhoeae-Stammkultur JUG025 zu transformieren. Da das kryptische Gonokokken-Plasmid keinerlei S.NgoV-Stellen enthält, wurden Transformanten, die diese Beseitigung in das Chromosom eingebaut hatten, identifiziert durch Ausbleiben von Hybridisierung in das Plasmid pUCV51, das eines der beseitigten bzw. belöschten SspI-Fragmente enthält. Mehrere Kolonien wurden identifiziert, die an dieses Plasmid nicht hybridisieren. Eine Stammkultur wurde gewählt für eine weitere Untersuchung und mit JUG026 bezeichnet.
S.NgoIV
Der S.NgoIV-Klon, pCBB49.1, wurde vollständig mit BglI und teilweise mit SspI digeriert. Das BglI-Ende wurde mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft und die DNA wurde ligatiert. Beim Screenen von Transformanten wurde ein Klon identifiziert, der das 200 bp BglI-SspI-Fragment verloren hat (pCBB49.17). Dieser Klon besaß weder MTase- noch ENase-Aktivitäten (Daten nicht gezeigt). Ein NotI-Fragment, enthaltend die gesamte Einführung von pCBB49.17, wurde geklont in ein p[Bluescript SK-. A KpnI-SacI-Fragment dieses Klons, das wiederum die gesamte Einführung enthält und geklont war in das Plasmid pUP1-1 zur Erzeugung des Plasmids pUP49.17. Dieser Schritt war erforderlich, weil keine Gonokokken-Aufnahmesequenz auf diesem Klon identifiziert worden war. Die Stammkultur JUG026 wurde mit diesem Konstrukt über die Flecktechnik transformiert. Mehrere Kolonien wurden auf- bzw. abgenommen und wachsen gelassen und kryptisches Plasmid wurde aus diesen Kulturen isoliert. Eine Stammkultur, JUG027, wurde identifiziert, die kryptisches Plasmid enthält, das empfänglich ist für NgoMI-Digerierung.
S.NgoVII
Der S.NgoVII-Klon, pE63, wurde mit SalI (der 5'-Erweiterung, in die Klenow gefüllt ist) digeriert. Diese DNA wurde teilweise mit SspI digeriert (in dem Vektor existiert eine (einzige) SspI-Stelle). Die DNA wurde ligatiert und ein Klon ohne ENase- und MTase-Aktivitäten wurde identifiziert, dem das 1159 bp SalI-SspI-Fragment (pE640) fehlt (Daten nicht ge zeigt). Plasmid pE640 wurde ligatiert mit Plasmid pUP1-1, und ein EcoRI-Markierer bzw. Dimer für beide Plasmide wurde identifiziert (pPUF7). Die Stammkultur JUG027 wurde mit dem Plasmid pPUP7 transformiert und die Transformanten, die die Beseitigung enthalten, wurden über Kolonie-Blots als Hybridisierung an das Plasmid pE641 fehlend (das das entfernte SalI-SspI-Fragment enthält) identifiziert. Die resultierende Stammkultur wurde mit JUG028 bezeichnet.
S.NgoI
Der S.NgoI-Klon, pUPK30, wurde mit DraI digeriert. In der Einfügung existieren drei DraI-Stellen und keine existiert im Plasmidvektor (pK18). Der Klon, der eine teilweise (652 bp) DraI-Beseitigung enthält, wurde identifiziert und mit dem Namen pUPK32 bezeichnet. Diesem Klon fehlt MTase- und Enase-Aktivität, wie durch Sensitivität gegenüber HaeII- Digerierung demonstiert, sowie eine Log-drei-Verringerung des Wirkungsgrads beim Aufplattieren des Lambdaphagen auf E. Koli, diese Plasmide enthaltend (Daten nicht gezeigt). Die Stammkultur JUG028 wurde mit pUPK32 transformiert und potentielle Transformanten wurden für den Einbau der Beseitigung gescreend durch Sondieren von Kolonie-Blots mit einem Plasmid, das das 652 bp DraI-Fragment enthält. Mehrere Kolonien wurden identifiziert, die nicht an die Sonde hybridisieren. Die für die weitere Analyse herausgenommene Kolonie wurde mit JUG029 bezeichnet.
Ergebnisse
Analyse von R/M-Genklonen
Rekombinante Klone, die DNA-MTasen von S.NgoI-, II-, IV-, V- und VII-Systemen codieren, sind bereits berichtet worden (Gunn et al., 1992; Sullivan und Saunders, 1988; Stein et al., 1995). Die Spezifikationen dieser Systeme sind in der Tabelle 1 gezeigt. Zwei dieser rekombinanten Klone, die S.NgoII und S.NgoIV R/M-Systeme codieren, sind charakterisiert und sequenziert worden (Sullivan und Saunders, 1988; Stein et al., 1992). Der Ausdruck von MTase-Genen der S.NgoI-II-, IV- und V-Systeme von rekombinanten Plasmiden wurde verifiziert durch Demonstrieren des Widerstands dieser Plasmide gegenüber Digerierung mit einem Isoschizomer des Systems, das untersucht wurde. Die Ermittlung einer Beseitigung des NgoVII R/M-Systems erfolgt indirekt, weil für diese Enzyme keine perfekten Isoschizomere vorliegen. Das Enzym Fnu4HI erkennt die Sequenz GGNCC. Dies bedeutet, dass 1/2 der Fnu4HI-Stellen durch M.NgoVII geschützt wird. Der Verlust des M.NgoVII von bzw. aus dem Gonococcus resultiert dazu, dass mehr Stellen durch dieses Enzym festgehalten sind (cleaved). Wenn Chromosomen-DNA aus einer Stammkultur, der M.NgoVII fehlt, mit Fnu4HI digeriert wird, weisen die resultierenden Bänder üblicherweise ein niedrigeres Molekulargewicht auf.
Der Ort dieser Methylase-Gene auf diesen Plasmiden wurde ermittelt durch Testen der Fähigkeit der verschiedenen Beseitigungsunterklone, ein positives Signal in einer DNA-Methylase-Testerstammkultur zu induzieren (Piekarowicz et al., 1991). Das Vorliegen eines funktionalen ENase-Gens wurde durch zumindest eine der folgenden Prozeduren ermittelt: Demonstrieren einer Verringerung des Wirkungsgrads von Plaquing des Phagenlambdas durch E. Coli-Zellen, die den Klon enthalten; durch Aufzeigen der Fähigkeit von Zellen, die den Klon enthalten, das Transformieren von DNA zu beschränken; oder durch Isolieren von Proteinen mit ENase-Aktivität aus Zellen, die die Plasmide enthalten. Unter Nutzung von zumindest einer dieser Untersuchungsformen für jedes System waren wir in der Lage, sowohl ENase- wie MTase-Aktivität in Klonen zu ermitteln, die NgoI, II, IV und VII codieren, sowie MTase-, jedoch keine ENase-Aktivität für den NgoV-Klon (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung der Beseitigungs- und Unterklon-Analyse haben wir die DNA lokalisiert, die diese Gene codiert (siehe 1 im Hinblick auf Restriktionstabellen). Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass, obwohl es dem NgoV-Klon an ENase-Aktivität mangelt, er ein partielles ORF stromabwärts von dem MTase-Gen enthält, und dieses ORF war ähnlich positioniert in Bezug auf das ENase-Gen in den übrigen R/M-Systemen. Wir gehen davon aus, dass diese ORF die NgoV-ENase darstellt.
Konstruktion von Plasmidbeseitigungen und Identifikation von Gonokokkentransformanten, die Chromosomenbeseitigungen enthalten.
Um eine Gonokokkenstammkultur mit defizientem R/M mittels Transformationstechnik zu konstruieren, muss die Transformations-DNA eine Gonokokkenaufnahmesequenz enthalten. Da keine Gonokokkenaufnahmesequenz in der DNA-Sequenz unserer Klone identifiziert wurde, die die NgoIV- und NgoVII-R/M-Systeme codierten (Daten nicht gezeigt), wurde ein Plasmidvektor konstruiert (pUP1-1), der eine Gonokokkenaufnahmesequenz enthält. Dieser war begleitet vom Einfügen eines Verknüpfers bzw. Linker, enthaltend diese Sequenz, in die BamHI-Stelle von pUC19. Da pUC19 in den Gonococcus nicht repliziert, gehen die Beseitigungen entweder verloren aus der Zelle oder dringen in das Chromosom über homologe Rekombination ein, wenn die interessierenden DNA-Beseitigungen in dieses Plasmid ge klont und daraufhin durch Transformation in den Gonococcus eingeführt werden.
Da auf unserer Seite der Wunsch bestand, mehrere bzw. mehrfache Gene zu unterbrechen bzw. zu zerreißen, erwies sich eine Inaktivierung des gewünschten Gens durch Einführung eines selektierbaren Markierers als nicht praktikabel. Information aus der Begrenzungstabellierung wurde verwendet, um Beseitigungen zu konstruieren, die die verknüpften MTase- und ENase-Gene der S.NgoI-, II-, VI-, V- und VII-Systeme überlappen. 1 zeigt die DNA-Einfügungen von jedem Plasmidklon und diejenigen Segmente, die auf jeder Einfügung gelöscht wurden. Diese Beseitigungen waren spezifisch für die vorgesagten ENase- und MTase-ORFs und rangierten in einer Größe von 1,8 Kb (NgoII) bis 200 bp (NgoIV). Sämtliche Beseitigungen waren so konstruiert, dass zumindest 100 bp von Gonokokken-DNA die Beseitigungen flankierten. Hierbei handelt es sich um die minimale Größe, die für eine effiziente Rekombination mit homologen Bereichen des Chromosoms erforderlich ist (DCS, nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Da keine Auswahl für eine erfolgreiche Rekombination dieser Deletionen bzw. Beseitigungen auf den Chromosomen bestand, wurde folgende Technik eingesetzt, um Transformanten zu identifizieren, die die gewünschte Beseitigung erfassten. Die Prozedur beruht auf der Tatsache, dass sämtliche Gonokokkenzellen dahingehend kompetent sind, extrazellulare DNA aufzunehmen. Aus diesem Grund sollten sämtliche Zellen die transformierende DNA erfassen, wenn eine begrenzte Anzahl von Zellen mit einer Überschussmenge an DNA inkubiert wird. Die Chance einer Identifizierung eines Transformanten, der die Beseitigung erfasst, ist ausschließlich begrenzt durch den Wirkungsgrad des Gonococcus in Bezug auf eine Inkorporation bzw. eines Einbaus der Beseitigung in sein Chromosom. Pilialierte Zellen wurden von einer Platte entnommen und in GCP-Brühe plus 10 mM MgCl₂ resuspendiert, um die Trübheit zu moderieren bzw. zu mäßigen (Klett = 35). Die Zellen wurden in GCP + MgCl₂ verwirbelt und verdünnt. Zehnfache Verdünnungen der Zellen wurden zubereitet, ein 10 μl-Aliquot von jeder Verdünnung wurde mit ungefähr 0,1–0,5 μg DNA gemischt und das DNA-Zellen-Gemisch wurde auf der Oberfläche einer Agarplatte flächenförmig aufgetragen. Nach Inkubation über Nacht wurden isolierte Kolonien innerhalb des Flecks entnommen und erneut in Streifen verlegt. Eine einzige Kolonie wurde erneut in Streifen verlegt, und zwar zumindest zweimal oder häufiger vor dem Testen von Kolonien auf den Einbau der Deletion bzw. Beseitigung. Dies ist aus zwei Gründen erforderlich: (i) Eine Zelle kann sich geteilt haben, bevor die DNA erfasst wird, was in einer gemischten Population von Zellen resultiert: Solchen, die die Deletion in ihr Chromosom rekombiniert haben, und solche, die dies nicht getan haben; und (ii) ein piliierter Gonokokkenklumpen und die meisten Kolonien werden von einer einzigen Zelle nicht erhalten. Unter Verwendung dieser Technik wurde eine N. Gonorrhoeae-Stammkultur FA19 erfolgreich mit jedem Deletionskonstrukt transformiert. Diese Transformationstechnik funktioniert gut und zumindest 20% der in jedem Experiment untersuchten Kolonien führten zu einer Erfassung der gewünschten Deletion bzw. Beseitigung.
Zwei Verfahren wurden genutzt, um zu verifizieren, dass die gewünschte Beseitigung in das Chromosom eingeführt bzw. eingebaut wurde. Chromosomen-DNA wurde isoliert aus potentiellen Transformanten und inkubiert mit Isoschizomer des Systems, das beseitigt bzw. deletiert wurde. Eine erfolgreiche Digerierung dieser DNA zeigte einen Verlust von MTase-Funktion an und demonstriert, dass die Beseitigung eingebaut worden ist. Um zu verifizieren, dass der Funktionsverlust auf der Beseitigung und nicht auf einer Inaktivierung durch Einfügung beruht, haben wir Kolonie-Blots potentieller Transformanten mit einem Teil des DNA-Fragments untersucht, das aus dem Plasmidklon gelöscht bzw. beseitigt worden ist. Kolonien, die nicht an der Sonde hybridisiert sind, müssen die Deletion bzw. Beseitigung eingebaut haben. Sämtliche der Kolonien, die darauf getestet wurden, dass sie die Methylase nicht länger ausdrücken, die untersucht wurde, führten zu einer Bindung der bzw. an der methylasespezifischen Sonde.
Ein Southern-Blot wurde durchgeführt, um Digerierungen von FA19 und der JUG029 zu vergleichen (derjenigen Stammkultur, die Beseitigungen von NgoI-, II-, IV-, V- und VII-R/M-Systemen enthält). Jeder Satz wurde mit den geeigneten Enzymen digeriert, elektrophorisiert und geblottet. Die Membran wurde in Streifen geschnitten und jeder Streifen wurde mit DNA sondiert, die den beseitigten Bereich in jedem der fünf R/M-Systeme quert bzw. durchsetzt. Der Satz 1 wurde mit DraI digeriert und mit dem PstI-XhoI-Fragment von pUPC30 sondiert. Chromosomen-DNA aus. JUG029 zeigte ein Fehlen des 652-bp-DraI-Fragments. Im Satz 2 wurde das NgoII-System untersucht. JUG029 zeigte ein Fehlen des 1414-bp-Sau3AI-Bands, das die Beseitigung bzw. Löschung überspannt. Das zweite Hybridisierungsband war größer als das FA19-Band. Eine nachfolgende Analyse von Southern-Blots von Chromosomen-DNA, digeriert mit anderen Enzymen, demonstrierte, dass sich die Beseitigung weiter stromaufwärts von der NcoI-Stelle erstreckt (Daten nicht gezeigt). Das NgoIV-System wurde im Satz 3 untersucht. SspI-digerierte Chromosomen-DNA zeigte den erwarteten Verlust des 400-bp-SspI-Fragments und die nachfolgende Vergrößerung von 250 bp des größten SspI-Fragments. Im Satz 4 wurde Chro mosomen-DNA mit RsaI digeriert, um die NgoV-Beseitigung zu bestätigen. Die Deletions- bzw. Beseitigungsstammkultur enthält nicht die 452-bp- und 684-bp-Fragmente auf Grund des Verlusts der RsaI-Stellen in den Positionen 1075 und 1527. Die erwartete Größenzunahme des größten Fragments kann ebenfalls beobachtet werden. Der Satz 5 untersuchte die NgoVII-Beseitigung. Chromosomen-DNA wurde mit EcoRI + HindIII digeriert. Das hybridisierende EcoRI-HindIII-Fragment ist 1,2 Kb kleiner als dasjenige von FA19.
Um den Verlust an biologischer MTase-Aktivität der fünf R/M-Systeme zu demonstrieren, die in JUG029 gelöscht bzw. beseitigt wurden, wurde Chromosomen-DNA isoliert und inkubiert mit den Isoschizomeren der Systeme, die beseitigt wurden. Eine erfolgreiche Digerierung der Chromosomen-DNA würde den Funktionsverlust der MTase anzeigen. Während FA19-Chromosomen-DNA mit Isoschizomeren von NgoI, II, IV und V undigeriert bleibt, scheint es so zu sein, dass sich die JUG029-Digerierung dem Ende nähert. Beim Analysieren des NgoVII-Systems ergibt sich, dass die Chromosomen-DNA, isoliert aus JUG029, mit größerem Ausmaß digeriert wird als Chromosomen-DNA, die aus FA19 isoliert wird. Zusammenfassend demonstrieren diese Daten, dass die geeigneten Beseitigungen bzw. Deletionen sämtliche erfolgreich in das Chromosom eingeführt bzw. eingebaut wurden, und dass JUG029 den geeigneten Methylationsdefektivphenotyp besitzt.
Vergleich der Transformationsfrequenz von FA19 mit JUG029
Um zu ermitteln, ob der Verlust von fünf ENasen den Gonococcus zugänglicher für eine Transformation mit DNA machen würde, die in E. Coli ausgebreitet wird, wurden JUG029 und FA19 mit pSY6 und pRDL2 transformiert. Das Plasmid pSY6 enthält DNA, die eine Mutanten-DNA-Gyrase codiert (Stein et al., 1991). Wenn diese Mutation in das Chromosom eingeführt wird, werden Zellen resistent gegenüber Nalidixsäure. Eine Transformation mit diesem Plasmid sollte durch die endogenen ENasen nicht beeinträchtigt werden, weil bei Nalidixsäure beständige Transformanten als Rekombination zwischen der linearisierten Plasmid-DNA und dem Wirt-Chromosom auftreten. Die in der Tabelle 2 aufgeführten Daten zeigen, dass die Transformationsfrequenz für Nal^® mit pSY6 ähnlich war für beide Stammkulturen (1,8 × 10^–4 für FA19 gegenüber 1,7 × 10^–4 für JUG029).
Tabelle 2 Untersuchung einer In-Vivo-Restriktion durch FA19 und JUG029
Damit das Plasmid erfolgreich den Gonococcus transformieren kann, muss es rezirkularisiert werden und ein funktionelles Plasmid bilden. Das Plasmid pRDL2, ein pLEE20-Derivat, das ein 456-bp-Gonokokken-DNA-Fragment trägt, das eine Kopie der Aufnahmesequenzen enthält, kann in E. Coli oder N. Gonorrhoeae zum Wachsen gebracht werden. Sowohl methyliertes (aus N. Gonorrhoeae) wie nicht methyliertes (aus E. Coli) stammendes pRDL2 kann deshalb in den Transformationsuntersuchungen genutzt werden. Methyliertes pRDL2 sollte nicht auf die Transformation des Gonococcus beschränkt sein; vielmehr kann nicht methyliertes pRDL2 einer Wirtbeschränkung unterworfen sein. Die Plasmidtransformationsfrequenzen unter Verwendung von methyliertem pRDL2 waren ähnlich für FA19 und JUG029 (2,2 × 10^–6 bzw. 4,1 × 10^–6). Die Transformation mit nicht methyliertem pRDL2 resultierte in wenigen Transformanten in JUG029 (1,5 × 10^–8), jedoch in keinen in FA19 (< 1,6 × 10^–9). Diese Daten demonstrieren, dass, obwohl JUG029 noch in der Lage ist, DNA-Transformation zu beschränken, eine messbare Reduzierung seiner Restriktionsfähigkeiten nicht ermittelbar ist. Dies zeigt an, dass zumindest einige der verbleibenden ENasen in der Lage sind, an der wirtvermittelten Restriktion teilzunehmen.
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Beispiel 2
Materialien und Methoden
Bakterienstammkulturen. N. Gonorrhoeae F62 wurde bezogen von P. Frederick Sparling (Unversity of North Carolina, Chapel Hill, NC). E. Coli DH5 MCR wurde bezogen von Bethesda Research Laboratories (Bethesda, MD). Gonokokken wurden in GCP-Brühe aufgezogen, ergänzt durch Kelloggs Lösung (White, L. A., D. S. Kellogg, Jr., 1965, Appl. Micro. 13: 171–174) und 0,042 Natriumbikarbonat sowie GCK-Agar enthaltendes Erythromycin (2 μg/ml), Vancomycin (3 μg/ml), Colistin (7,5 μg/ml) und Nystatin (1,25 Einheiten/ml), soweit erforderlich. E. Coli DH5 MCR wurde aufgezogen in L-Brühe bzw. LB-Agar, enthaltend Ampicillin (30 μg/ml), Kanamycin (30 μg/ml), Erythromycin (300 μg/ml) und x-Gal (35 μg/ml), soweit erforderlich.
Chemikalien, Reagenzien und Enzyme. Restriktionsenzyme und T4-DNA-Legase wurden käuflich erworben von New England Biolabs (Beverly, MA). Chemikalien, die verwendet wurden für Transformationsuntersuchungen, waren von Reagenzqualität oder höherer Qualität und wurden erworben von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), soweit nicht anderweitig spezifiziert.
DNA-Manipulationen. Plasmid-DNA wurde isoliert durch die Alkalilysis-Prozedur und gereinigt auf Cäsiumchloridethidiumbromidgradienten (Birnboim & Doly, 1979, Nucl. Acids. Res. 7: 1513–1523). Plasmid-DNA wurde in E. Coli unter Verwendung des CaCl₂-Transformationsverfahrens (Sambrook et al., 1989, In Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Presws, Cold Spring Harbor, NY) eingeführt bzw. eingebaut.
DNA-Sequenzierung. DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden durchgeführt durch die Sanger-Dideoxy-Methode (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74: 5463–5467) unter Verwendung des Sequenase-Version II-Sequenzierungsbausatzes (United States Biochemicals, Cleveland, OH) und -[359] DATP (New England Nuclear, DuPont, Boston, MA). PCR-Sequenzierung wurde direkt auf den PCR-Erzeugnissen durchgeführt, angeleitet unter Verwendung des CircumVent-Thermozyklus-Dideoxy-DNA-Sequenzierungsbausatzes (New England Biolabs, Beverly, MA). Sequenzierungserzeugnisse wurden getrennt auf einem 4%igen Acrylamidgel einer Größe von 55 cm × 0,2 mm (7 M urea in 2X TBE-Buffer (100 mM Tris, 0,083 M Borsäure, 1 mM EDTA)) mit einem 0,6 mm Keil (maximale Dicke) in den letzten 10 cm. Die Gele wurden fixiert, getrocknet und auf einen XOMAT-Röntgenstrahlfilm (Kodak) für 36 Stunden belichtet.
Polymerasekettenreaktion. PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des GeneAmp-PCR-Bausatzes von Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT) unter den empfohlenen Bedingungen. Die 100 l-Reaktion wurde durchgeführt mit einer Minute Denaturierung bei 94°C, gefolgt von einer Minute Tempern bei 50°C und einer Minute Verlängerung bei 72°C für insgesamt 30 Zyklen. Markierer wurden in dieser Untersuchung sowohl für beide PCR verwendet und eine Sequenzanalyse wurde mit MedImmune durchgeführt. Die Sequenz der verwendeten Markierer zur Verstärkung von H.8RS1 war folgende: H.8-5', CCCTGAATTCAAATCATACTGAATTAT (SEQ ID NO: 3); H.8-3', CCGATCAGTTCAAACTGC (SEQ ID NO: 4). Die Sequenz der verwendeten Markierer zum Hinzufügen der SphI-Stellen in H.8 war GGCTGCATGCGGCGGAG und CCGCCGCATGCAGCCAAG (SEQ ID NO: 5). Die Sequenz der verwendeten Markierer zur Verstärkung von ospA lautete: OspA-5', ATTCCAGTCGACAAGCAAAATGTTAGCAGC (SEQ ID NO: 6); OspA-3', ATTCCAGCATGCTTATTTTAAAGCGTTTTTAATTTC (SEQ ID NO: 7).
Konjugation. Plasmide wurden in Gonokokkenkultur F62 eingeführt durch Konjugation mit E. Coli S17-1 (Nassif, X., D. Puaoi und M. So. 1991. Transposition of TN1545-3 in the pathogenic Neisseriae: a genetic tool für mutagenesis. J. Bact. 173: 2147–2154). Konjugationen wurden durchgeführt durch Filteranpassung und sie wurden für drei Stunden andauern gelassen. Um Gonokokkentranskonjuganten auszuwählen, wurden die Zellen auf dem Filter in GCP-Brühe resuspendiert und auf GCK ausplattiert, enthaltend Erythromycin, Vancomycin, Nystatin und Colistin.
Blebosomenisolation
Western blotting. Blebosomenlysate (ungefähr ug des gesamten Proteins) wurden analysiert durch SDS-PAGE und den Western Blot mit dem OspA-spezifischen mAB H5332 (Green, B. A., T. Quinn-Dey und G. W. Zlotnick, 1987, Biologic activities of antibody to a peptidoglycan-asociated lipoprotein of Haemophilus influenzae against multiple clinical isolates of H. influenzae type b, Infect. Immun. 55: 2878). Die Expression von OspA wurde verglichen mit gereinigtem OspA-Lipoprotein, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. L. Erdile (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA). Proteinbänder, die mit H5332 reagieren, wurden visualisiert nach Inkubation mit einem sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Maus-IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase) unter Verwendung des verbesserten Chemilumineszenzermittlungs-(ECL)systems (Amersham Corp., Arlington Heights, IL), in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers.
Triton-X-114-Fraktionierung. Blebosomen wurden in PBS suspendiert, durch Sonication bzw. Beschallung zerrissen und bei 4°C durch Zusetzen von Triton X-114 (TX114) zu 2% (Volumen/Volumen) solubilisiert bzw. in Lösung gebracht. Unlösliches Material (Zellenwand angereicherte Fraktion) wurde sedimentiert durch Zentrifugation bei 100.000 xg und der Überstand wurde einer Detergenzphasenpartitionierung unterworfen (Bordier, C. 1981, Phase separation of integral membrane proteins in Triton X-114 solution, J. Biol. Chem. 265: 1604). Nach kurzem Erwärmen (37°C) der TX114-Lösung wurde eine Trennung von wässrigen und Detergenzphasen erzielt durch kurze Zentrifugation. Die beiden Phasen wurden dreimal zurückextrahiert und Proteine in jeweiligen Proben wurden durch das Zusetzen von neun Volumina Aceton prezipitiert. Ein Anteil von jedem Kulturüberstand wurde SDS-PAGE unterworfen, zu Nitrozellulose transferiert und mit Anti-OspA mAb H5332geblottet.
Immunisierungsfähigkeit von Blebosomenkonstrukten. Austrocknungsprodukt bzw. Sear wurde gesammelt aus der Schwanzvene von immunisierten Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Immunisierung und für jede Gruppe von Mäusen gepooled zur Überwachung von Antikörperreaktionen durch ELISA. Eine ELISA-Platte (Immunolon 4) wurde mit 50 μl ganzer Borrelia (Stammkultur 31) überzogen und im Karbonatpuffer (pH 9,6) mit 10 μg/ml oder unter Temperatur über Nacht bei 4°C suspendiert. Die Antigenlösung wurde daraufhin entfernt und Platten wurden inkubiert mit Blockadelösung (0,5% BSA und 0,5% nicht fette Trockenmilch) in PBS mit 0,1% Tween-20 (PBS-T20) für eine Stunde bei Raumtemperatur. Zweifache serielle Verdünnungen von Serum, startend mit 1/200, wurde in Blockadelösung bereitgestellt und 50 μl jeder Verdünnung wurde Duplikationsquellen der Antigen-beschichteten Platte zugesetzt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde wurden die Platten mit PBS-T20 gewaschen und inkubiert mit 50 μl 1 : 1000 PBS-T20-Verdünnung von Peroxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG- (Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) -Sekundärkörper für eine Stunde. Farbe wurde entwickelt mit 2,2'-Azino-dif[3-Ethyl-Benzthiazolin-Sulfonat] Substratreagenz [Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc.) und gemessen mittels Absorptionsvermögen bei 405 nm auf einem ELISA- Lesegerät (dynatech). Endpunkt-Titer wurden definiert als die höchste Verdünnung, bei der die A405-Werte doppelt so groß waren wie die Werte für normale Maus-Seren, verdünnt auf äquivalente Konzentrationen.
Anfechtunguntersuchungen. Anfechtungdosen wurden hergeleitet durch Expansion einer einzigen Kolonie der Low-Passage-B. Burgdorferi sh.2-Stammkultur (Schwan, T. G., W. Burgdorfer, M. E. Crumpf und R. H. Karstens, 1988, The urinary bladder, a consistent source of Borrelia burgdorferi in experimentally infected white-footed mice (Peromyscus leucopus), J. Cliun. Microbiol.) Immunisierte Mäuse und Kontrollmäuse wurden intradamal an der Schwanzwurzel mit 10⁴ Spirocheten abgefragt. Dies ergab ungefähr 100 ID₅₀ Einheiten der B. Burgdorferi Sh. 2-Stammkultur. Mäuse wurden 13 Tage nach der Anfechtung getötet und Blasen- und Tibiotarsal-Gelenkgewebe wurden entnommen und kultiviert in BSK-II-Medium, wie vorstehend erläutert (Erdile, L. F., M. Brandt, D. J. Warakomski, G. J. Westrack, A. Sadziene, A. G. Barbour und J. P. Mays, 1993, Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA, Infect. Immu. 61: 81). Kulturen wurden über 14 Tage durch Phasenkontrastmikroskopie auf Anwesenheit von Spirocheten überwacht. Das Vorliegen von ein mehr Spirocheten pro 20 Hochleistungsfeldern in jeder Kultur wurde als positive Infizierung gewertet.
Ergebnisse
Konstruktion von Neisseria Gonorrhoeae ausdrückendem OspA. N. Gonorrhoeae erzeugt ein Lipoprotein, H.8, als eines seiner normalen Außenmembranproteine. Um zu ermitteln, ob die Möglichkeit bestand, dieses Protein in der Außenmembran des Gonococcus zum Überausdruck zu bringen, wurde die Gen-Codierung dieses Proteins geklont auf ein Plasmid hoher Kopieranzahl, pLEE20. Die DNA-Sequenz, die dieses Protein codiert, wurde verstärkt über das PCR von der N. Gonorrhoeae-Stammkultur F62, basierend auf Sequenzinformation, die veröffentlicht ist für die Stammkultur R10 (Baehret al., 19, Mol. Microbiol. 3: 49–55). Markierer wurden derart entworfen, dass DNA-Sequenzen 5' eine EcoRI-Stelle enthielten, während DNA-Sequenzen 3' des Gens eine HinDIII-Stelle enthielten. Die verstärkte DNA wurde digeriert und in pLEE20 eingeführt, das mit EcoRI digeriert und teilweise digeriert wurde mit HinDIII. Die ligierte DNA wurde eingeführt in Escherichia Coli DH5 MCR und Erythromycin-beständige Transformanten, enthalten das Amplikon, wurden identifiziert. Die DNA-Sequenz wurde ermittelt aus einem dieser Klone, um zu verifizieren, dass die verstärkte DNA H.8 codiert hatte. Die Daten zeigten an, dass die geklonten Gene H.8 waren (Daten nicht gezeigt).
Das H.8-Codierungskonstrukt wurde eingeführt in die E. Coli-Stammkultur S17-2 durch Transformation. Diese Stammkultur wurde genutzt, um das pLEE20-H.8 in N. Gonorrhoeae F62 über Konjugation zu mobilisieren. Transkonjugante wurden ausgewählt auf Thayer-Martin-Medium, ergänzt durch Erythromycin. SDS-PAGE-Profile von F62 (pLEE20-H.8) zeigten an, dass diese Stammkultur mehr H.8 zum Ausdruck brachte als in Stammkulturen vom Wildtyp entdeckt wurden. Diese Experimente demonstrieren, dass Lipoproteine im Gonococcus zum Überausdruck gebracht werden können.
Um sicherzustellen, dass N. Gonorrhoeae in der Lage sein würde, die Borrelia-OspA-Signalsequenz korrekt zu verarbeiten, wurde das Protein als Fusionsprotein ausgedrückt. Um diese Funktion zu bewerkstelligen, wurde eine SphI-Stelle in die H.8-Sequenz an einer Stelle eingeführt, die dem Zystein ent spricht, das als Lipitationssignal dient. Das DNA-Sequenzcodierende OspA wurde verstärkt ausgehend von pTRH44 (Bergstromet al., 1989, Mol. Microbiol. 3: 479–486) durch PCR. Markierer bzw. Markierstoffe wurden derart erstellt, dass eine SphI-Stelle an einem Ort eingeführt wurde, der dem Zystein entspricht, das in OspA lipitiert ist. Der Markierer, der dem 3'-Ende des Gens entspricht, enthält außerdem eine SphI-Stelle. Das Amplikon und der Klonierungsvektor wurden mit SphI digeriert, ligatiert und in E. Coli DH5 MCR eingeführt. Plasmide, enthaltend die Einfügung, wurde identifiziert und die DNA-Sequenz des Konstrukts wurde verifiziert durch DNA-Sequenzanalyse. Dieses Plasmid wurde in E. Coli S17-2 eingeführt und daraufhin in den Gonococcus über Konjugation, wie vorstehend erläutert.
Bewertung und Lokalisierung. Die in Blebosomen ausgedrückte Menge an OspA wurde quantifiziert unter Verwendung einer quantitativen Western-Untersuchung, demnach die Pegel des Bindungsvorgangs eines Anti-OspA mAb an Blebosomen verglichen wurde mit dem Bindungsvorgang an gereinigtem OspA. Das Ergebnis dieser Analyse legte nahe, dass OspA ungefähr 0,2% des gesamten Blebosomenproteins wiedergibt.
Um festzustellen, ob Expression des OspA-Gens ausgehend dem Lipoproteinexpressionsvektor zu einer Lipitacylierung rekombinantem OspA geführt hat, wurde Blebosomen einer Triton-X-114-Detergenzphasenpartionierungsanalyse unterworfen, um auf Membran assoziierte Lipoproteine anzureichern (Bordier, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1604; Radolf et al., 1988, Infect. Immun. 56: 490). Die Expression des OspA-Proteins in Verbindung mit der H8-Lipitierungssignalsequenz resultierte in einem Produkt, das ausschließlich in der detergenzlöslichen Fraktion lokalisiert war, die hochgradig angereichert war für lipophi le Proteine. Diese Feststellung zeigt an, dass eine Fusion der H8-Signalsequenz mit OspA in einem Produkt resultierte, das effizient exportiert worden war und in der Blebosomenmembran posttranslationell modifiziert worden war.
Immunisierungsuntersuchungen. Eine Platte mit fünf unterschiedlichen Maus-Stammkulturen wurde analysiert auf Anti-OspA-Antikörperreaktionen folgend auf eine Immunisierung mit OspA-ausdrückenden Blebosomen (Größe sdlfdjasllkfj). Die Ergebnisse legen nahe, dass sowohl der Endotoxin-beständige Ort wie weitere Orte Immunreaktionen gegenüber OspA-ausdrückenden Blebosomen kontrollieren können. Die C3H/HejLPS-hyperreaktive Stammkultur erzeugte deutliche Anti-OspA-Reaktionen, folgend auf eine Verstärkung mit OspA-Blebosomen, während die betreffende C3HeB/Fej-LPS-reaktive Stammkultur diese Reaktion nicht zeigte, was eine Einbeziehung des Endotoxinwiderstandsorts in Reaktion auf Blebosomen nahe legt. Außerdem erzeugten mehrere Stammkulturen unterschiedliche Reaktionen auf Blebosomenausgedrücktes OspA, obwohl sie sämtliche das Lps-Allel trugen, wodurch die Einbeziehung von nicht-Lps-assoziierten Orten in dieses Phänomen nahegelegt ist. Damit erzeugten BALB/c-Mäuse deutliche OspA-Reaktionen folgend auf eine Verstärkung mit OspA-Pusteln, während SJL/J und C57BL/6 diese Reaktion nicht zeigten.
Anfechtunguntersuchtungen. Die Fähigkeit von OspA-ausdrückenden Blebosomen, Immunschutzreaktionen zu induzieren, wurde untersucht durch Immunisieren von Tieren und Erfassen ihrer Antikörperreaktionen gegenüber OspA und Borrelia-Ganzzellenlysat für zwei Wochen, folgend auf zwei Verstärkungsvorgänge. Die Ergebnisse zeigten, dass sämtliche Tiere, die mit OspA-Pusteln immunisiert waren, erfassbare Anti-OspA-Reaktionen erzeugten, wobei 4/5 der Tiere Titer grö ßer als 1/3200 zeigten. Dieselben vier Tiere zeigten außerdem Reaktivität gegenüber einem Lysat, das aus ganzel Borrelia zubereitet wurde (das fünfte Tier zeigte keine feststellbare Anti-Borrelia-Reaktion). Keines der Tiere, immunisiert mit nicht rekombinierenden Blebosomen, erzeugte erfassbare Anti-OspA- oder Anti-Borrelia-Reaktionen.
Diese Tiere wurde mit lebenden Borrelia abgefragt bzw. diesen ausgesetzt. Zwei Wochen danach immunisierten sämtliche der Tiere mit nicht rekombinierenden Blebosomen, die rückgewinnbare Borrelia in ihren Blasen und tibiotarsalen Gelenken enthielten. Im Gegensatz hierzu wurden rückgewinnbare Borrelia ausschließlich gewonnen aus 1/5 der Tiere, die mit OspA-Blebosomen immunisiert waren. In dieser Gruppe wurden kultivierbare Borrelia ausschließlich gewonnen aus Tieren mit den niedrigsten Anti-OspA-Titern.
Ungefähr 40% der immunisierten Mäuse erreichten Antikörpertiter größer als 1 : 400. 100 der Mäuse mit diesem Antikörpertiter wurden vor der Anfechtung geschützt.
Diskussion
Die Daten in diesem Beispiel demonstrieren die potentielle Nutzung von rekombinanten Gonokokkenblebosomen als Impfstofflieferungssystem. Blebosomen drücken zahlreiche der erwünschten Merkmale sowohl von lebenden wie nicht lebenden Liefersystemen aus: Während sie zahlreiche der Nachteile vermeiden, die mit der Verwendung von lebenden Liefersystemen in jungen oder immunisierungsgeschädigten Lebewesen einhergehen, können sie so zugeschnitten werden, dass sie Antigene im Kontext mit einer biologischen Membran ausdrücken, die problemlos reinig bar ist ohne den Einsatz teurer, potentiell denaturierender Reinigungsprozeduren.
In den hier präsentierten Experimenten wurde ein Fusionsprotein, bestehend aus dem OspA-Antigen von Borrelia Burgdorferi, verknüpft mit der Lipitationssignalsequenz des Neisseria-H8-Oberflächenantigens ausgedrückt. Die Absicht hinter der Konstruktion dieses Fusionsproteins unter Verwendung eines endogenen Lipitationssignals bestand darin, sämtliche potentiellen Probleme zu vermeiden beim Transfer und/oder der Verarbeitung von Fremdsignalen innerhalb von Neisseria. Das lipitierte Oberflächenprotein P6 aus Hemophilus Influenzae ist jedoch ebenfalls erfolgreich ausgedrückt worden unter Kontrolle seiner eigenen Lipitationssignalsequenz unter Demonstration der Lokalisierung dieses Antigens auf der Blebosomenoberfläche in einer Detergenz-löslichen Form, was nahe legt, dass Neisseria geeignet ist, fremde bakterielle Lipitationssignale zu erkennen und zu verarbeiten.
Offensichtlich können mehrere genetische Orte einbezogen werden in die Ermittlungsempfindlichkeit gegenüber Antigenen, präsentiert durch Gonokokkenblebosomen. In einer begrenzten Stammkulturübersicht scheinen sowohl der Lps-Ort wie andere nicht tabellierte Orte die Empfindlichkeit gegenüber OspA zu kontrollieren. Auf Grund der bekannten adjuvanten Eigenschaften, die mit LPS verbunden sind, ist es unter Umständen nicht überraschend, einen Effekt des Lps-Orts auf Immunreaktionen festzustellen, die durch dieses Konstrukt ausgelöst sind.
In den vorliegend erläuterten Experimenten wurde OspA als Testimmunogen verwendet, weil Reaktionen auf dieses Antigen sich als schützend gegenüber einer Anfechtung durch OspA-ausdrückende Borrelia-Isolate 0 erwiesen haben. Nicht sämtli che B. Burgdorferi-Isolate drücken jedoch dieses Antigen 0 aus und einige durch Zecken übertrage Isolate, die anfänglich OspA ausdrücken, haben sich kürzlich als die Expression ausschaltend erwiesen, gefolgt auf eine Blutmahlzeit 0. Andere Borrelia-Antigene in Kombination mit OspA können breitere wirksame Immunreaktionen induzieren als OspA alleine.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen betreffend immunogene Aktivität zeigen, dass IgG-Reaktionen gegenüber Fremd-Lipoprotein induziert werden können, das auf der Oberfläche von Blebosomen ausgedrückt ist. Die Fähigkeit dieser Präparationen, OspA-spezifisches Th bzw. CTL zu induzieren, wurde nicht untersucht. Hohe Pegel an IFN-g und IL-2, jedoch nicht IL-4, sind in Kulturüberständen von Neisserial-Lysatstimulierten Lymphknotenzellen aus Blebosomen-immunisierten Mäusen beobachtet worden und legen nahe, dass Blebosomen starke Thl-Reaktionen stimulieren. Die Möglichkeit, die diese Präparationen CTL-Reaktionen stimulieren, wartet auf das Klonieren von Antigenen, die bekannte CTL-Epitopen in Neisseria codieren. Es ist wahrscheinlich, dass Blebosomen-ausgedrückte Antigene hauptsächlich verarbeitet werden durch einen Endocyt-Pfad und deshalb hauptsächlich im Kontext mit MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden.
Die Blebosomen, die in diesen Studien verwendet wurden, erzeugten Antikörperschutzreaktionen ohne offensichtliche Toxizität. Drei- bis fünffach höhere Dosen als diejenigen, die vorliegend berichtet werden, führten jedoch zu einer signifikanten Toxizität. Fellsträuben ging einher mit Dosen größer 30 mg/Tier und bestimmte Blebosomen-Zubereitungen waren letal in Dosen von 100 mg/Tier und höheren Dosen bei intraperitonealer Verabreichung, insbesondere nach einem Verstärkungsvorgang (Boosting). Diese toxischen Wirkungen wurden nicht verringert durch intranasales Verabreichen des Antigens, oder wenn auf Alaun intraperitonal verabreicht. Zukünftige Experimente werden die Effekte anderer Verabreichungsarten auf die Toxizität untersuchen sowie den Einfluss, die Modulationspegel von LOS auf die Oberfläche des Blebosoms Toxizität von Blebosomen-Zubereitungen hat. In diesem Hinblick ist kürzlich eine Reihe von Neisserial-Mutanten erzeugt worden, die variierende LOS-Pegel auf ihrer Oberfläche ausdrücken. Es wird interessant sein, festzustellen, ob Stammkulturen, die verringerte Mengen an Oberflächen-LOS ausdrücken, Immunwirksamkeit beibehalten bei verringerter Toxizität.
Zusammenfassend sind Gonokokken-Blebosomen, die ein bakterielles Fremdoberflächenprotein ausdrücken, OspA von Borrelia Burgdorferi, in der Lage, Immunreaktionen zu induzieren, die Mäuse vor Borrelianfechtung schützen.
Beispiel 3 Klonierung des P6-Gens von Haemophilus Influenzae
Das P6-Gen von H. Influenzae wurde geklont unter Verwendung von PCR. Kurz gesagt wurden zwei Markierer bzw. Markierstoffe, jeweils flankiert von EcoRI-Stellen, verwendet, um ein Fragment von ungefähr 500 bp zu verstärken (6A). Das verstärkte Fragment wurde in pLEE20 kloniert (7A). Klone wurden analysiert mittels Restriktionsanalyse. Die Einfügung in beiden Orientierungen enthaltende Klone wurden gewonnen. Die Expression wurde analysiert unter zur Reaktion bringen von Kolonien mit polyklonalen Antikörpern, gerichtet auf P6-Protein.
PLEE20-p6 wurde in eine E. Coli-Stammkultur SB17-2 eingeführt. Aus E. Coli gewonnene Plasmide wurden in N. Gonorrhoeae F62 über Konjugation eingeführt. Transkonjugante wurden auf Reaktivität mit Antikörper gescreened und eine Expression wurde verifiziert unter Verwendung von SDS-PAGE (8) und Western-Blot (9).
Beispiel 4 Klonierung des pspA-Gens von Streptococcus Pneumoniae
Das pspA-Gen von S. Pneumoniae wurde geklont unter Verwendung von PCR. Kurz gesagt wurden zwei Markierer bzw. Markierstoffe, jeweils flankiert von EcoRI-Stellen, verwendet, um ein Fragment von ungefähr 1 kb zu verstärken (6B). Das verstärkte Fragment wurde sequenziert und geklont in pLEE20 (7B). Klone wurden analysiert mittels Restriktionsanalyse.
PLEE20-pspA wird in eine E. Coli-Stammkultur SB17-2 eingeführt. Aus E. Coli gewonnene Plasmide werden eingeführt in N. Gonorrhoeae F62 über Konjugation. Transkonjugante werden gescreened auf Reaktivität mit Antikörper und die Expression wird verifiziert unter Verwendung von SDS-PAGE und Western-Blot.
Offensichtlich ist die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die vorstehend angegebenen Lehren zahlreichen Modifikationen und Abwandlungen zugänglich. Es wird bemerkt, dass die Erfindung deshalb im Umfang der anliegenden Ansprüche in anderer Weise in die Praxis umgesetzt werden kann, als dies vorliegend speziell erläutert ist.

Claims

Impfstoff zur Bewirkung von Immunität in einem Lebewesen gegen eine Krankheit, wobei der Impfstoff isolierte Neisseria Gonorrhöen Blebosomes enthält, worin ein immunisierendes Polypeptid speziell für diese Krankheit auf der Oberfläche der Blebesomes anwesend ist, und worin das immunisierende Polypepetid heterolog ist und in einer pharmakologisch wirkungsvollen Dosis in einer pharmazeutisch akzeptablen Darreichungsform anwesend ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lebewesen ein Mensch ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lebewesen ein Tier ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit durch einen Mikroorganismus verursacht worden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit durch ein Bakterium verursacht worden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit durch einen Virus verursacht worden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit durch einen Fungus verursacht worden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit durch ein Protozoon verursacht worden ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Blebesomes vom Typ hyperblebbing Neisseria Gonorrhöen sind.
Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Blebosomes ein Bakterienpolypetid vom Typ Clostridium tetani oder Streptococcus pneumoniae oder Borrelia burgdorferi enthalten.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Blebosomes ein OspA-Polypeptid vom Typ Borrelia burgdorferi enthalten.