FR2859218A1 - Microvesicules de membrane externe marquees, leur procede de production et leurs utilisations - Google Patents
Microvesicules de membrane externe marquees, leur procede de production et leurs utilisations Download PDFInfo
- Publication number
- FR2859218A1 FR2859218A1 FR0350455A FR0350455A FR2859218A1 FR 2859218 A1 FR2859218 A1 FR 2859218A1 FR 0350455 A FR0350455 A FR 0350455A FR 0350455 A FR0350455 A FR 0350455A FR 2859218 A1 FR2859218 A1 FR 2859218A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- microvesicles
- microvesicle
- protein
- signature
- detectable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 29
- 238000012800 visualization Methods 0.000 title claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 title 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000008133 Iron-Binding Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010035210 Iron-Binding Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000350158 Prioria balsamifera Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- -1 Texas Red-X succinimidyl ester Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108010064846 tertiary amine N-oxide reductase Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000701988 Escherichia virus T5 Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- RHTNTTODYGNRSP-UHFFFAOYSA-N Tolazoline hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=CC=CC=1CC1=NCCN1 RHTNTTODYGNRSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- UGKDIUIOSMUOAW-UHFFFAOYSA-N iron nickel Chemical group [Fe].[Ni] UGKDIUIOSMUOAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
- A61K51/1203—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules in a form not provided for by groups A61K51/1206 - A61K51/1296, e.g. cells, cell fragments, viruses, virus capsides, ghosts, red blood cells, viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
- A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention a pour objet des microvésicules de membrane externe, de diamètre inférieur à 250 nanomètres, formées par une seule membrane, et comprenant un marqueur ou une signature détectable, notamment par fluorescence, par des techniques type RPE ou par mesure de radioactivité, ledit marqueur ou signature se trouvant soit au niveau intravésiculaire, soit au niveau de la membrane. L'invention a également pour objet un procédé de production desdites microvésicules de membrane externe marquées, et l'utilisation desdites microvésicules comme outil de diagnostic ou de vectorisation, comme outil de ciblage de molécules d' intérêt thérapeutique ou de diagnostic, ou encore comme outil de mesure de l'impact d'un principe actif sur l'intégrité de la membrane de la microvésicule.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
MICROVESICULES DE MEMBRANE EXTERNE MARQUEES,
LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet des microvésicules de membrane externe marquées, leur procédé de production et leurs utilisations.
LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention a pour objet des microvésicules de membrane externe marquées, leur procédé de production et leurs utilisations.
Les microvésicules membranaires sont des protrusions de la membrane externe de bactéries à Gram négatif, qui se détachent de la cellule pour s'échapper dans le milieu. Ces microvésicules sont des compartiments de forme sphérique. L'invention s'intéresse particulièrement aux microvésicules de taille inférieure à environ 250 nm.
Certains micro-organismes produisent naturellement ces microvésicules, sans qu'il soit nécessaire d'apporter une quelconque stimulation. Ces microvésicules sont longtemps passées inaperçues, du fait qu'elles sont de très faible taille et que les techniques d'analyse ne permettaient pas de les identifier. Aujourd'hui encore, les techniques d'analyse à mettre en #uvre pour identifier ces microvésicules, en particulier la microscopie électronique utilisant ou non les techniques d'immunomarquages sont lourdes et coûteuses.
Les microvésicules de membrane externe sont connues de l'art antérieur, et citées notamment par Beveridge, Journal of Bacteriology, Aug 1999, Vol. 181, N 16 pp.
4725-4733, ou encore par Bernadac et al. Journal of Bacteriology . Sep 1998 Vol. 180, N 18 pp. 4872-4878.
Les microvésicules de membrane externe sont notamment utilisées pour élaborer des vaccins. EP 1248647 décrit un vaccin à partir de microvésicules de membrane externe contre les maladies causées par la Neisseria meningitidis
<Desc/Clms Page number 2>
Serogroup B. W097/05899 décrit un vaccin utilisant des microvésicules de membrane externe comme vecteur d'un antigène associé à la surface de la microvésicule. W097/05899 décrit également une composition pharmaceutique comprenant des vésicules membranaires d'un ou plusieurs microorganismes comprenant des enzymes et ayant des effets bactéricides. Les microvésicules utilisées dans cette demande de brevet sont soit des microvésicules naturelles, de tailles comprises entre 10-200 nm, soit des vésicules de nature différentes et de plus grande taille, comprenant de la membrane externe, de la membrane cytoplasmique ou plasmatique et du cytoplasme.
L'utilisation de ces vésicules de taille plus importante est dictée par les difficultés de visualisation et de suivi des microvésicules naturelles, mais elle présente de nombreux inconvénients : en premier lieu, il est difficile d'assurer que ces vésicules sont homogènes et toutes de même nature ; par ailleurs, certaines vésicules contiennent du cytoplasme, et donc, statistiquement, certaines au moins d'entre elles contiennent de l'ADN cytoplasmique. L'utilisation de ce type de vésicules présente donc un risque de transmission d'ADN non souhaitée et difficilement contrôlable.
La présente invention remédie aux inconvénients cidessus et propose des microvésicules de membrane externe qui sont marquées, ce qui permet de les visualiser rapidement et à moindre coût, par exemple avec l'analyse directe d'une culture bactérienne par microscopie de fluorescence, en évitant d'avoir recours aux techniques nettement plus lourdes et onéreuses de microscopie électronique ou de purification, et qui peuvent être produites massivement.
<Desc/Clms Page number 3>
Les microvésicules selon l'invention sont formées d'une seule membrane, la membrane externe. A ce jour, toutes les expériences réalisées par les inventeurs sur Escherichia coli montrent qu'aucun matériel cytoplasmique ne se retrouve dans les microvésicules selon l'invention.
Les microvésicules selon l'invention ne contiennent donc que du matériel intermembranaire, en particulier périplasmique pour les bactéries à gram négatif. Les microvésicules de l'invention présentent de ce fait l'avantage d'être homogènes entre elles, et d' assurer la non-transmission de matériel génétique d'origine cytoplasmique. Par ailleurs, les microvésicules selon l'invention contiennent un seul compartiment contenant des protéines dans un état oxydé, donc plus aptes à l'utilisation.
L'invention a donc pour objet de proposer des microvésicules détectables, alors même que leur taille est très faible.
Plus particulièrement, la présente invention a pour objet une ou des microvésicules de membrane externe, de diamètre inférieur à 250 nanomètres, formée avec une seule membrane, et comprenant un marqueur ou une signature détectable, notamment par fluorescence, par des techniques type RPE ou par mesure de radioactivité, qui se trouve soit au niveau intravésiculaire, soit au niveau de la membrane.
Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, cette signature est une protéine intravésiculaire détectable, de préférence fluorescente. De nombreuses protéines fluorescentes sont appropriées. A titre d'exemple, on peut citer la Green Fluorescent Protein.
Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, cette signature intravésiculaire est une protéine qui fixe
<Desc/Clms Page number 4>
un cofacteur détectable. De nombreux cofacteurs sont susceptibles d'être fixés par les protéines adéquates.
Parmi les cofacteurs convenables, on cite notamment les cofacteurs détectables par RPE. A titre d'exemple, on peut citer comme protéine liée à un cofacteur détectable les protéines du système d'oxydo-réduction et pour Escherichia coli, la triméthylamine N-oxide reductase (TorA). D'autres protéines à cofacteurs d'origine bactérienne périplasmiques comme les hydrogénases à centre Nickel-Fer ou des protéines recombinantes peuvent être aussi envisagées. Dans le cas de protéines membranaires réceptrices de fer sous forme ferrique couplé à un sidérophore, ces protéines issues de genre bactériens variés peuvent être surproduites et retrouvées dans les microvésicules purifiées. Ainsi on pourra procéder à un marquage membranaire via le complexe fer (ferrique)-sidérophore.
Cette signature peut encore être issue d'un radiomarquage in vivo ou in vitro, mettant en #uvre les techniques de marquage radioactif connues de l'homme du métier ; la signature peut aussi consister en un marquage fluorescent in vitro, c'est-à-dire un marquage par couplage chimique de sondes fluorescentes commerciales sur des molécules présentes à la surface ou dans les microvésicules. Comme sondes on peut citer le Texas Red-X succinimidyl ester (Molecular Probes) ou l'Oregon Green 488 carboxylic acid succinimidyl ester (Molecular Probes) qui sont des sondes fluorescentes pouvant réagir et se coupler avec les fonctions réactives des molécules comme la fonction amine présente entre autres dans les protéines.
Cette signature peut aussi être un anticorps couplé à un réactif fluorescent. Cet anticorps pourra reconnaître une protéine ou molécule exposée à la surface de la bactérie (voir l'utilisation d'un anticorps anti-Lamb : Lloubes et
<Desc/Clms Page number 5>
al. Research Microbiology Jul-Aug 2001 Vol. 152 N 6 pp.
523-529)
Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, il est envisagé de combiner plusieurs signatures ou marquages, notamment de prévoir de marquer les microvésicules à la fois au niveau intravésiculaire et au niveau de la membrane.
Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, il est envisagé de combiner plusieurs signatures ou marquages, notamment de prévoir de marquer les microvésicules à la fois au niveau intravésiculaire et au niveau de la membrane.
Les microvésicules selon l'invention présentent de nombreux avantages, et peuvent notamment être utilisées comme outils de ciblage. Suivant un mode de réalisation avantageux de l'invention, les microvésicules de l'invention sont associées à des molécules d'intérêt, destinées au ciblage ou à la thérapie, du type comprenant les saccharides et en particulier les oligosaccharides, les protéines et en particulier les enzymes, mais aussi les antibiotiques.
Parmi les molécules d'intérêt, l'invention s'intéresse en particulier à associer aux microvésicules marquées des molécules d'adressages, des protéines pouvant être cibles de récepteurs cellulaires notamment des toxines, des récepteurs spécifiques notamment du type de celui permettant l'entrée de l'ADN décrit par Lambert et al. Molecular Microbiology Nov 1998 Vol 30 N 4 pp.761-765, ou des anticorps notamment de type scFv exposés à la surface de la membrane externe. Ces protéines d'intérêt seraient présentes sur la cellule bactérienne utilisée pour le procédé selon l'invention. La préparation d'une telle bactérie est réalisable conformément aux procédés décrits dans Francisco et al. (Production and fluorescenceactivated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. ) Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Nov 15;90(22):10444-10448.
Francisco et Georgiou (The expression of recombinant
<Desc/Clms Page number 6>
proteins on the external surface of Escherichia coli.) Biotechnological applications. Ann N Y Acad Sci. 1994 Nov 30;745:372-382. Earhart (Use of an Lpp-OmpA fusion vehicle for bacterial surface display.) Methods Enzymol.
2000;326:506-516.
Suivant un autre mode de réalisation, qui peut être combiné avec le précédent, les microvésicules de l'invention sont combinées à au moins un déterminant exposé à la surface de la microvésicule, par exemple le lipopolysaccharide (LPS) présent à la surface des bactéries et aussi des microvésicules, et qui joue un rôle dans la réponse inflammatoire (Chen et al., J Cell Biochem. Aug 2003 Vol. 89, N .6 pp 1206-1214) ; l'enterotoxine issue des bactéries Escherichia coli pathogènes, qui est aussi retrouvée à la surface des microvésicules (Horstman et Khuehn J Biol Chem. Sep 2002 Vol. 277 N 36 pp. 32538-32545) ; la cytotoxine VacA d' Hélicobacter pylori, qui est aussi retrouvée active dans les microvésicules formées par cet organisme (Keenan et Allardyce, Dec 2000, Eur J Gastroenterol Hepatol. Vol. 12 N 12 pp. 1267-1273).
Suivant une variante avantageuse de l'invention, la microvésicule marquée ou non contient un fragment d'acide nucléique, qui a été introduit in vitro, et peut ainsi servir de transport à une information génétique destinée à une cible particulière. Dans ce cas, on purifie des microvésicules contenant la protéine membranaire FhuA (surproduite à partir d'un plasmide). Cette protéine permettra l'entrée de l'ADN du phage T5 (Lambert et al.
Molecular Microbiology Nov 1998 Vol 30 N 4 pp.761-765). Ainsi des gènes d'intérêt pourront être clonés dans l'ADN de ce phage. Cette variante est particulièrement destinée
<Desc/Clms Page number 7>
aux situations où les microvésicules selon l'invention sont utilisées en thérapie génique.
L'invention a également pour objet un procédé de production de microvésicules marquées caractérisé en ce que : (a) on introduit ou l'on produit ou l'on repère une signature détectable, dans une cellule d'origine bactérienne sauvage ou mutée, productrice de microvésicules, (b) on cultive ladite bactérie en milieu solide ou en milieu liquide.
Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, la cellule est une souche bactérienne sélectionnée parmi les mutants tol, pal ou lpp ou parmi les genres bactériens qui produisent des microvésicules.
Sont adaptées pour la réalisation du procédé selon l'invention les bactéries pathogènes présentant ces caractéristiques, du type, mais non exclusivement, Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori...
Dans le cas où la signature est protéique ou associée à une protéine, la cellule et en particulier la souche bactérienne utilisée dans le procédé selon l'invention doit posséder un système d'exportation ou avoir la capacité naturelle d'exporter la signature présente dans le cytoplasme, vers la membrane externe ou vers le périplasme. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie utilisée pour la production des microvésicules selon l'invention possède un système Tol-Pal nonfonctionnel ; avantageusement, la bactérie est sélectionnée
<Desc/Clms Page number 8>
parmi les mutants tol, pal ou 1pp ou parmi les genres bactériens producteurs de microvésicules.
Dans le cas où cette signature est une protéine repliée, notamment une protéine fluorescente ou liée à un cofacteur détectable, la cellule et en particulier la bactérie doit posséder un système d'exportation de protéines repliées ou permettre naturellement une telle exportation. Avantageusement, la bactérie utilisée dans le procédé selon l'invention possède le système TAT (Tween Arginine Translocation) d'exportation.
Suivant un premier mode de réalisation de l'invention, l'on introduit dans une cellule d'origine bactérienne un plasmide qui permet la production d'une signature détectable. Avantageusement, ce plasmide comprend un gène codant pour une protéine marquée, par exemple une protéine fluorescente.
Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, l'on marque, notamment en utilisant des radiomarquages in vitro ou des marquages avec des sondes fluorescentes, ou l'on détecte sans marquage préalable, les composants naturels de la membrane externe ou du contenu intravésiculaire, sans qu'il soit nécessaire d'introduire un plasmide. Ce composant naturel peut être un cofacteur fixé par une protéine.
Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, on effectue préalablement à la culture cellulaire, une étape destinée à induire une production plus massive de microvésicules. Cette étape consiste par exemple à déstabiliser l'intégrité de la membrane externe, notamment par la production périplasmique de séquences protéiques déstabilisatrices. Ces séquences peuvent être des protéines chimères, de type protéine autofluorescenteprotéine déstabilisatrice de l'intégrité de la membrane
<Desc/Clms Page number 9>
externe ou des protéines co-produites avec la protéine détectable dans la même bactérie. De telles séquences déstabilisatrices de l'intégrité membranaire permettant la production de microvésicules ont été décrites par Bouveret et al. Biochimie. May-Jun 2002 Vol. 84 N 5-6 pp.413-421.
Suivant un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend une étape de purification qui intervient après l'étape de culture cellulaire. Cette étape de purification consiste en premier lieu à éliminer toutes les bactéries, de manière à récupérer les microvésicules. En second lieu, une étape permet notamment de concentrer les microvésicules mais aussi de les suspendre dans un tampon de choix. Selon l'invention, on est aussi capable de fournir une production uniforme de microvésicules ayant un diamètre d'environ 40 nm.
Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé comprend en outre une étape de mesure quantitative ou qualitative du marquage des microvésicules, et en particulier quand la signature est une protéine fluorescente, une étape de mesure de la fluorescence des microvésicules marquées. Cette mesure permet de vérifier la production, et de la quantifier.
Un autre objet de l'invention est d'utiliser les microvésicules en suivant et en quantifiant in vivo leur production. Ce suivi permet d'étudier le devenir des vésicules in vivo, en particulier leur devenir au contact d'autres bactéries ou cellules. Pour cette application, les microvésicules portant des déterminants naturels ou artificiels exposés seront de grande importance pour le ciblage. Les microvésicules selon l'invention sont utiles comme outil de ciblage de molécules d'intérêt thérapeutique ou de diagnostic, en particulier pour mesurer l'impact d'un principe actif ou d'une molécule active.
<Desc/Clms Page number 10>
L'invention a également pour objet l'utilisation des microvésicules marquées selon l'invention, en particulier de microvésicules contenant un fragment d'acide nucléique, comme outil de vectorisation.
Une autre utilisation selon l'invention comprend l'utilisation des microvésicules marquées pour l'identification d'un agent actif, principe actif ou molécule active sur une bactérie, caractérisé en ce que l'on stimule la production de microvésicules de ladite bactérie, notamment par un agent de stimulation, et on identifie ledit agent par visualisation des microvésicules marquées. La simplicité de la détection et l'efficacité de la technique développée par la présente invention permet l'analyse par les techniques de criblage à haut débit où, sur des plaques multipuits. Ainsi, des cultures bactériennes seraient traitées par chacun des composés issus de chimiothèques. Les surnageants obtenus après centrifugation des cultures seraient analysés par microscopie de fluorescence automatisés. La présence de points fluorescents et la quantité de ces points étant liés à l'activité du composé testé.
L'invention sera plus explicite au vu des exemples qui suivent, qui illustrent non limitativement l'invention.
Exemple Unique
Deux conditions de culture ont été utilisées:
Conditions de production en milieu liquide. Les cellules tolA (Bernadac et al., 1998, J Bacteriol. 180, 4872-4878) transformées par le plasmide RR-GFP (Santini et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276,8159-8164) sont cultivées en milieu riche (Luria-Bertani ou LB) en
Deux conditions de culture ont été utilisées:
Conditions de production en milieu liquide. Les cellules tolA (Bernadac et al., 1998, J Bacteriol. 180, 4872-4878) transformées par le plasmide RR-GFP (Santini et al., 2001, Journal of Biological Chemistry, 276,8159-8164) sont cultivées en milieu riche (Luria-Bertani ou LB) en
<Desc/Clms Page number 11>
anaérobiose et en présence de glucose (0,4 %). Après 4 heures d'incubation à 37 C, la culture est centrifugée et le surnageant est enlevé. Les cellules sont ensuite lavées en milieu minimum puis reprises dans le même milieu minimum (milieu M9 contenant du saccharose comme source de carbone, supplémenté avec les 20 acides aminés) contenant 0,2 % de L-arabinose pour permettre l'induction de l'expression de la GFP pendant une incubation de 2 heures à 30 C.
Conditions de production en milieu solide. Les cellules tolA transformées par le plasmide RR-GFP ont été cultivées sur support solide en milieu LB-agar en présence de glucose 0,4 % (conditions de répression de la GFP) puis ensemensées sur milieu LB-agar contenant de l'arabinose (0,1 %, conditions d'induction de la GFP) et incubées une nuit (environ 16 heures) à 30 C.
Les cellules récoltées du milieu solide (grattage de colonies sur boîte de Pétri et suspension en tampon TN: Tris-HCl pH8. 0, NaCl 100mM) ou du milieu liquide sont centrifugées à basse vitesse pour faire sédimenter les bactéries. Le surnageant contenant les vésicules de membrane externe est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions, puis filtré 2 fois sur filtre de 0,2 mm pour éviter tout risque de contamination par des bactéries ou des débris membranaires. Deux conditions de purification de vésicules sont utilisées :
Soit les vésicules contenues dans les surnageants sont directement sédimentées par ultracentrifugation (45 min à 250 000 g moyen). Après lavage rapide du culot en tampon TN (et nouvelle ultracentrifugation) celui-ci est resuspendu dans le tampon TN (VesC).
Soit les vésicules contenues dans les surnageants sont directement sédimentées par ultracentrifugation (45 min à 250 000 g moyen). Après lavage rapide du culot en tampon TN (et nouvelle ultracentrifugation) celui-ci est resuspendu dans le tampon TN (VesC).
Soit le surnageant est déposé à la surface d'un gradient formé de trois couches de densité : 1,08,3ml (15
<Desc/Clms Page number 12>
%), 1,16, 2 ml (30 %) et 1,24, 1 ml (45 %) (% OptiprepTM) . Après ultracentrifugation 1 heure à 30 000 rpm (SW41Ti) les fractions de 2 ml du gradient sont récupérées (VesG).
Nous avons choisi de mesurer la quantité de GFP par dosage spectrofluorimétrique et de suivre l'activité blactamase par dosage enzymatique (utilisant un substrat chromogène de cephalosporine, CENTATM).
Tous les résultats ont été exprimés en unité arbitraire utilisant pour référence (100) les mesures effectuées sur le contenu périplasmique des cellules productrices (obtenu après choc osmotique). L'analyse du contenu intravésiculaire est réalisée sur le culot de vésicules remis en suspension (VesC) ainsi que sur les microvésicules obtenues dans la fraction de densité 1,24 (VesG) .
Afin de doser l'activité b-lactamase à l'intérieur de microvésicules membranaires et d'éviter de suivre la diffusion du substrat à travers la membrane, nous avons recherché la concentration minimale en détergent nécessaire pour solubiliser la membrane externe des microvésicules (tests réalisés par microscopie optique avec des vésicules fluorescentes). Ainsi le détergent Triton X100 a été ajouté à 0,02% dans toutes les expériences de dosage enzymatique.
D'autre part nous avons mesuré l'effet des concentrations d'optiprepTM sur l'activité de la blactamase et tenu compte d'une faible inhibition dans l'expression de nos résultats quand celui-ci était présent : ces mesures sont reportées dans le tableau I cidessous, dans lequel les valeurs sont ramenées a la valeur
<Desc/Clms Page number 13>
100 qui correspond au dosage du contenu périplasmique des bactéries. VesC et VesG correspondent respectivement aux microvésicules purifiées par ultracentrifugation et par gradient de sédimentation respectivement.
<tb>
<tb> b-lactamase <SEP> GFP
<tb> Milieu <SEP> Liquide
<tb> VesC <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb> VesG <SEP> 0,8 <SEP> 2,8 <SEP>
<tb> Milieu <SEP> solide
<tb> VesC <SEP> 3,1 <SEP> 5,4
<tb> VesG <SEP> 1,5 <SEP> 2,3 <SEP>
<tb>
<tb> b-lactamase <SEP> GFP
<tb> Milieu <SEP> Liquide
<tb> VesC <SEP> 0,2 <SEP> 0,5
<tb> VesG <SEP> 0,8 <SEP> 2,8 <SEP>
<tb> Milieu <SEP> solide
<tb> VesC <SEP> 3,1 <SEP> 5,4
<tb> VesG <SEP> 1,5 <SEP> 2,3 <SEP>
<tb>
Tableau I . dosage de la b-lactamase par mesure enzymatique et dosage de la GFP par mesure de fluorescence.
Le marquage fluorescent selon l'invention est donc particulièrement efficace. Les inventeurs ont même constaté que, de manière inattendue, le marquage obtenu en mettant en #uvre le procédé de l'invention avec une protéine fluorescente, est plus fort que celui d'une protéine périplasmique naturelle. Ainsi les microvésicules sont directement et facilement détectables par microscopie optique de fluorescence. Leur observation directe serait impossible en absence de fluorescence de par la petite taille des microvésicules. De plus, cette détection confirme la présence de microvésicules étanches qui renferment de la GFP dans un état concentré.
Claims (31)
1) Microvésicule de membrane externe de bactéries caractérisée en ce que son diamètre est inférieur à 250 nanomètres, qu'elle est formée par une seule membrane, et qu'elle comprend une signature détectable.
2) Microvésicule selon la revendication 1, caractérisée en ce que les bactéries sont des bactéries à Gram-négatif,
3) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la signature détectable se trouve soit au niveau intravésiculaire, soit au niveau de la membrane.
4) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite signature est détactable par fluorescence, par des techniques type RPE ou par mesure de radioactivité.
5) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle ne contient que du matériel intermembranaire, notamment périplasmique.
6) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite signature est une protéine intravésiculaire détectable, de préférence fluorescente.
7) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 6, caractérisée en ce que ladite signature est une protéine détectable, notamment par RPE, du type protéine intravésiculaire qui fixe un cofacteur ou protéine membranaire réceptrice de fer sous forme ferrique couplé à un sidérophore.
8) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite signature est issue d'un radiomarquage in vivo ou in vitro.
<Desc/Clms Page number 15>
9) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit marqueur est une sonde fluorescente.
10) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite microvésicule est associée à au moins une molécule d'intérêt, du type comprenant les oligosaccharides, les protéines et notamment les enzymes, les antibiotiques.
11) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite microvésicule est combinée à au moins un déterminant exposé à la surface de la microvésicule.
12) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite microvésicule est associée à au moins un déterminant d'adressage.
13) Microvésicule selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle contient un fragment d'acide nucléique introduit in vitro.
14) Procédé de production de microvésicules marquées caractérisé en ce que : (a) on introduit ou l'on produit ou l'on repère une signature détectable, dans une cellule d'origine bactérienne sauvage ou mutée, productrice de microvésicules, (b) on cultive ladite bactérie en milieu solide ou en milieu liquide.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que lorsque la signature est une protéine intravésiculaire détectable ou une protéine qui fixe un cofacteur détectable, ladite cellule possède un système d'exportation de protéines repliées.
<Desc/Clms Page number 16>
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que ladite bactérie est sélectionnée parmi les mutants tol, pal ou Ipp.
17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'on introduit dans une cellule d'origine bactérienne un plasmide qui permet la production d'une signature détectable.
18) Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit plasmide contient un gène codant pour une protéine fluorescente.
19) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que l'on marque, notamment par radiomarquage, ou l'on détecte sans marquage préalable les composants naturels de la membrane externe ou du contenu intravésiculaire, sans qu'il soit nécessaire d'introduire un plasmide, notamment en utilisant des radiomarquages in vitro ou des marquages avec des sondes fluorescentes.
20) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit composant naturel est un cofacteur fixé par une protéine.
21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 20, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape préalable d'exportation de séquences protéiques induisant la déstabilisation de l'intégrité membranaire et la production de microvésicules de membrane externe.
22) Procédé selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites séquences protéiques déstabilisatrices pourront être des protéines chimères, de type protéine autofluorescente-protéine déstabilisatrice de l'intégrité de la membrane externe ou des protéines co-produites avec la protéine détectable dans la même bactérie.
<Desc/Clms Page number 17>
23) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 22, caractérisé en ce que ledit procédé comprend en outre une étape de purification des microvésicules.
24) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 23, caractérisé en ce que l'on purifie des microvésicules contenant la protéine membranaire FhuA puis l'on introduit in vitro dans la microvésicule, marquée ou non, un fragment d'acide nucléique.
25) Procédé selon l'une quelconque des revendications 14 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de mesure quantitative et/ou qualitative du marquage des microvésicules.
26) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ladite signature est une protéine fluorescente, et que ledit procédé comprend une étape de mesure de la fluorescence des microvésicules marquées.
27) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans la préparation d'une composition pour la détection in vivo desdites vésicules, et notamment pour le suivi de leur devenir au contact d'autres bactéries ou cellules.
28) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, en particulier de microvésicules contenant un fragment d'acide nucléique, dans la préparation d'une composition pour la vectorisation.
29) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans la préparation d'une composition pour le ciblage de molécules d'intérêt thérapeutique ou de diagnostic.
30) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 en vue de mesurer l'impact d'un principe actif ou d'une
<Desc/Clms Page number 18>
molécule active, notamment du type enzyme ou détergent, sur l'intégrité de la membrane de la microvésicule.
31) Utilisation des microvésicules marquées selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour l'identification d'un agent actif sur une bactérie, caractérisé en ce que l'on stimule la production de microvésicules de ladite bactérie, notamment par un agent de stimulation, et on identifie ledit agent par visualisation des microvésicules marquées.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0350455A FR2859218A1 (fr) | 2003-08-25 | 2003-08-25 | Microvesicules de membrane externe marquees, leur procede de production et leurs utilisations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0350455A FR2859218A1 (fr) | 2003-08-25 | 2003-08-25 | Microvesicules de membrane externe marquees, leur procede de production et leurs utilisations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2859218A1 true FR2859218A1 (fr) | 2005-03-04 |
Family
ID=34130823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0350455A Pending FR2859218A1 (fr) | 2003-08-25 | 2003-08-25 | Microvesicules de membrane externe marquees, leur procede de production et leurs utilisations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2859218A1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118006515A (zh) * | 2024-04-08 | 2024-05-10 | 中国农业大学 | 一株乳酸乳球菌及其在制备治疗牛乳腺炎的药物中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997005899A2 (fr) * | 1995-08-04 | 1997-02-20 | University Of Guelph | Nouveaux vaccins et nouvelles compositions pharmaceutiques utilisant des vesicules de membrane de micro-organismes et leurs procedes d'elaboration |
| WO1999059625A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | University Of Maryland | Systeme d'apport de vaccin |
| WO2001089535A1 (fr) * | 2000-05-24 | 2001-11-29 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Procede d'introduction et d'expression de genes dans des cellules animales, et vesicules bacteriennes destinees a etre utilisees dans le cadre dudit procede |
-
2003
- 2003-08-25 FR FR0350455A patent/FR2859218A1/fr active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997005899A2 (fr) * | 1995-08-04 | 1997-02-20 | University Of Guelph | Nouveaux vaccins et nouvelles compositions pharmaceutiques utilisant des vesicules de membrane de micro-organismes et leurs procedes d'elaboration |
| WO1999059625A1 (fr) * | 1998-05-19 | 1999-11-25 | University Of Maryland | Systeme d'apport de vaccin |
| WO2001089535A1 (fr) * | 2000-05-24 | 2001-11-29 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Procede d'introduction et d'expression de genes dans des cellules animales, et vesicules bacteriennes destinees a etre utilisees dans le cadre dudit procede |
Non-Patent Citations (18)
| Title |
|---|
| ABSTRACTS OF THE GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR, vol. 102, 2002, 102nd General Meeting of the American Society for Microbiology;Salt Lake City, UT, USA; May 19-23, 2002, 2002, pages 93, ISSN: 1060-2011 * |
| ABSTRACTS OF THE GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR, vol. 103, 2003, 103rd American Society for Microbiology General Meeting;Washington, DC, USA; May 18-22, 2003, 2003, pages B - 420, ISSN: 1060-2011 (ISSN print) * |
| ABSTRACTS OF THE GENERAL MEETING OF THE AMERICAN SOCIETY FOR, vol. 103, 2003, 103rd American Society for Microbiology General Meeting;Washington, DC, USA; May 18-22, 2003, 2003, pages K - 007, ISSN: 1060-2011 (ISSN print) * |
| BERNADAC ALAIN ET AL: "Escherichia coli tol-pal mutants form outer membrane vesicles", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 180, no. 18, September 1998 (1998-09-01), pages 4872 - 4878, XP002208245, ISSN: 0021-9193 * |
| BEVERIDGE TERRY J: "Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 181, no. 16, August 1999 (1999-08-01), pages 4725 - 4733, XP002273740, ISSN: 0021-9193 * |
| DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 2002, BAUMAN S J ET AL: "Characterization of Pseudomonas aeruginosa outer membrane vesicles and their interactions with host cells", XP002273735, Database accession no. PREV200200585020 * |
| DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 2003, FURRER J L ET AL: "Membrane protein P43 (entS) participates in enterobactin release from Escherichia coli.", XP002273738, Database accession no. PREV200300546110 * |
| DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 2003, KESTY N C ET AL: "Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins in gram negative outer membrane vesicles.", XP002273731, Database accession no. PREV200300520145 * |
| DE KEYZER JEANINE ET AL: "Kinetic analysis of the translocation of fluorescent precursor proteins into Escherichia coli membrane vesicles.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 48, 29 November 2002 (2002-11-29), pages 46059 - 46065, XP002273734, ISSN: 0021-9258 * |
| DEMUTH DONALD R ET AL: "Interaction of Actinobacillus actinomycetemcomitans outer membrane vesicles with HL60 cells does not require leukotoxin.", CELLULAR MICROBIOLOGY, vol. 5, no. 2, February 2003 (2003-02-01), pages 111 - 121, XP002273732, ISSN: 1462-5814 (ISSN print) * |
| HORSTMAN AMANDA L ET AL: "Bacterial surface association of heat-labile enterotoxin through lipopolysaccharide after secretion via the general secretory pathway", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 277, no. 36, 6 September 2002 (2002-09-06), pages 32538 - 32545, XP002273733, ISSN: 0021-9258 * |
| HORSTMAN AMANDA L ET AL: "Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 17, 28 April 2000 (2000-04-28), pages 12489 - 12496, XP002273736, ISSN: 0021-9258 * |
| KADURUGAMUWA J L ET AL: "DELIVERY OF THE NON-MEMBRANE-PERMEATIVE ANTIBIOTIC GENTAMICIN INTO MAMMALIAN CELLS BY USING SHIGELLA FLEXNERI MEMBRANE VESICLES", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 42, no. 6, June 1998 (1998-06-01), pages 1476 - 1483, XP002947117, ISSN: 0066-4804 * |
| KESTY NICOLE C ET AL: "Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. UNITED STATES 16 JAN 2004, vol. 279, no. 3, 16 January 2004 (2004-01-16), pages 2069 - 2076, XP002273741, ISSN: 0021-9258 * |
| MIDDELDORP J M ET AL: "K-88 MEDIATED BINDING OF ESCHERICHIA-COLI OUTER MEMBRANE FRAGMENTS TO PORCINE INTESTINAL EPITHELIAL CELL BRUSH BORDERS", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 31, no. 1, 1981, pages 42 - 51, XP009027182, ISSN: 0019-9567 * |
| ROOSENBERG JOHN M II ET AL: "Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents", CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 7, no. 2, February 2000 (2000-02-01), pages 159 - 197, XP009027219, ISSN: 0929-8673 * |
| SANTINI CLAIRE-LISE ET AL: "Translocation of jellyfish green fluorescent protein via the Tat system of Escherichia coli and change of its periplasmic localization in response to osmotic up-shock", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 11, 16 March 2001 (2001-03-16), pages 8159 - 8164, XP002273739, ISSN: 0021-9258 * |
| STEPHENS D L ET AL: "ESCHERICHIA COLI PERIPLASMIC PROTEIN FEPB BINDS FERRIENTEROBACTIN", MICROBIOLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, READING, GB, vol. 141, no. 7, 1 July 1995 (1995-07-01), pages 1647 - 1654, XP000603290, ISSN: 1350-0872 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118006515A (zh) * | 2024-04-08 | 2024-05-10 | 中国农业大学 | 一株乳酸乳球菌及其在制备治疗牛乳腺炎的药物中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shen et al. | Engineering of a dual-recognition ratiometric fluorescent nanosensor with a remarkably large stokes shift for accurate tracking of pathogenic bacteria at the single-cell level | |
| Jena et al. | A carbon nanotube optical reporter maps endolysosomal lipid flux | |
| Nißler et al. | Prospects of fluorescent single-chirality carbon nanotube-based biosensors | |
| KR102429381B1 (ko) | 분석물을 막횡단 세공에 전달하는 방법 | |
| JP2021078500A (ja) | 変異体ポア | |
| Kedrov et al. | Elucidating the native architecture of the YidC: ribosome complex | |
| Roier et al. | A basis for vaccine development: Comparative characterization of Haemophilus influenzae outer membrane vesicles | |
| Zhao et al. | A machine vision-assisted Argonaute-mediated fluorescence biosensor for the detection of viable Salmonella in food without convoluted DNA extraction and amplification procedures | |
| D’Agata et al. | Ultrasensitive detection of non-amplified genomic DNA by nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance imaging | |
| EP2869838B1 (fr) | Matrice de biofilm bactérien comme plateforme pour l'administration de protéines | |
| Sangubotla et al. | A facile enzymatic approach for selective detection of γ-aminobutyric acid using corn-derived fluorescent carbon dots | |
| Rangl et al. | Real-time visualization of phospholipid degradation by outer membrane phospholipase A using high-speed atomic force microscopy | |
| Dobhal et al. | Isolation, characterisation and detection of breath-derived extracellular vesicles | |
| Ford et al. | Antigen binding and site-directed labeling of biosilica-immobilized fusion proteins expressed in diatoms | |
| Dewey et al. | Recent advances on applications of single-walled carbon nanotubes as cutting-edge optical nanosensors for biosensing technologies | |
| Li et al. | A novel renewable electrochemical biosensor based on mussel-inspired adhesive protein for the detection of Escherichia coli O157: H7 in food | |
| Kong et al. | Single-stranded DNA binding protein coupled aptasensor with carbon-gold nanoparticle amplification for marine toxins detection assisted by a miniaturized absorbance reader | |
| Henry et al. | RecF protein targeting to post-replication (daughter strand) gaps II: RecF interaction with replisomes | |
| Shan et al. | Dual-mode detection and efficient annihilation of pathogenic bacteria based on the construction of a ratiometric electrochemiluminescent/electrochemical sensor | |
| Marro et al. | Methods to monitor bacterial growth and replicative rates at the single-cell level | |
| FR2859218A1 (fr) | Microvesicules de membrane externe marquees, leur procede de production et leurs utilisations | |
| Dai et al. | Consistency in bacterial extracellular vesicle production: key to their application in human health | |
| Vekshin | Biophysics of mitochondria | |
| EP2255197B1 (fr) | Procede de detection et/ou de quantification et/ou d'identification in vitro de bacteries dans un materiau biologique | |
| Winther et al. | Effect of energy metabolism on protein motility in the bacterial outer membrane |