DE69131014T2

DE69131014T2 - Rekombinante avirulente salmonella antifruchtbarkeitsimpfstoffe

Info

Publication number: DE69131014T2
Application number: DE69131014T
Authority: DE
Inventors: Roy Curtiss; Kenneth Tung
Original assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1990-11-21
Filing date: 1991-11-20
Publication date: 1999-10-07
Anticipated expiration: 2011-11-21
Also published as: DE69131014D1; IL100121A; ES2133311T3; EP0558631A4; ATE177787T1; EP0558631B1; US5656488A; AU9094191A; WO1992009684A1; CA2096529A1; CA2096529C; EP0558631A1

Description

HINWEIS AUF REGIERUNGSBEIHILFE:

Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter den Beihilfe-Nrn. RO1 DE06 66 9, verliehen von den National Institutes of Health, und CSA-90-071 gemacht, vergeben durch das Contraceptive Research and Development Program (CONRAD). Die Regierung hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.

TECHNISCHES GEBIET:

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Antifruchtbarkeits- Impfstoffzusammensetzungen und Verfahren, die dieselben verwenden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung avirulenter Mikroben zur Übertragung Gameten-spezifischer Antigene.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

Es ist seit langem bekannt, dass Männer und Frauen mit signifikanten Antikörpertitern gegen menschliches Sperma häufig unfruchtbar sind oder eine reduzierte Fruchtbarkeit ohne andere Krankheitseffekte aufweisen (Ingerslev und Ingerslev, 1989; Chen und Jones, 1981; Menge et al. 1982; Bronson et al. 1984). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Immunisierung von männlichen und weiblichen Tieren mit Extrakten aus Vollsperma Unfruchtbarkeit induzieren kann (Kummerfeld und Foote, 1976; Munoz und Metz, 1978; Tung et al. 1979; Menge et al. 1979). Primakoff et al (1988a) verwendeten einen monoklonalen Antikörper zur Reinigung eines Sperma-spezifischen Meerschweinchen-Oberflächenantigens, PHG-20, und konnten zeigen, dass die Injektion dieses gereinigten Antigens in entweder männliche oder weibliche Meerschweinchen eine lang andauernde Immunität gegen Befruchtung induzierte (1988b) In früheren Untersuchungen wurde gezeigt, dass dieser monoklonale Antikörper mit einem Sperma-Adhesin reagierte, um seine Wechselwirkung mit der Zona pellucida des Eies zu blockieren, einem wesentlichen Schritt zur Befruchtung (Primakoff et al. 1985).
Es wurde gefunden, dass eine Anzahl anderer monoklonaler Antikörper, hergestellt aus ejakuliertem menschlichen Sperma oder hergestellt aus Sperma anderer Arten, mit menschlichem Sperma kreuzreagiert. Manche reagieren mit Komponenten des Spermaplasmas, und andere erkennen Antigene testikulären Ursprungs. Von monoklonalen Antikörpern, die menschliches Sperma immobilisieren oder agglutinieren können oder die Spermabindung und das Eindringen Zona-freier Hamstereizellen inhibieren können, wurde berichtet. Gegenwärtig sind verschiedene menschliche Sperma-Antigene bekannt, wie das Mr 95.000-Antigen von Moore (Moore et al. 1987); das vom S36-37 mAbs (HSA-63) erkannte 55 kDa-Antigen von Lee (Liu et al. 1990); und die menschlichen Homologen der 95 kDa- und 56 kDa-Spermarezeptoren für ZP-3 (definiert in Mäusen von Saling und Bliel und Wasserman (Bliel, 1990; Leyton und Saling, 1989)). Ebenfalls von Interesse ist das FA-1-Antigen von Maus und Mensch, das teilweise von Naz charakterisiert wurde (Naz, 1988), und das 24 kDa-Antigen aus Ratten- und menschlichen Hoden, charakterisiert von Shaha (Shaha et al. 1990). Die Antigene von Moore und Lee ebenso wie das SP-10-Immunogen (unten beschrieben) wurden zu "primären Impfstoffkandidaten" (Anderson et al. 1987) von der Einsatzgruppe für Impfstoffe zur Fruchtbarkeitsregulierung der World Health Organisation Taskforce on Vaccines for Fertility Regulation bestimmt.
Das Sperma-spezifische Antigen, Milchsäure-Dehydrogenase-C (LDH-C), wurde gereinigt, charakterisiert und zur Immunisierung und Inhibierung der Fruchtbarkeit von Kaninchen (Goldberg, 1973), Mäusen (Lerum und Goldberg, 1974) und Pavianen (Goldberg et al. 1981) verwendet. Das Sperma-spezifische LDH-C hat eine Substrat-Spezifizität, die anders als für Muskel- und Herz- LDH ist, und kann verzweigtkettige Ketosäuren als Substrate, wie α-Ketoisovalerat (Blanco et al. 1976), ebenso wie Lactat als Substrat verwenden. Das LDH-C liegt im Cytosol und den Mitochondrien von Sperma vor (Montamat et al. 1988), aber liegt ebenfalls auf der Oberfläche von Samenzellen vor (Erickson et al. 1975), wodurch es eine Grundlage für die Effektivität der Immunisierung gegen LDH-C bei der Blockierung der Fruchtbarkeit bereitstellt. Kürzlich haben Goldberg und Mitarbeiter die cDNA für die menschliche Hoden-spezifische Lactatdehydrogenase kloniert und ihre antigenischen Bereiche charakterisiert (Millan et al. 1987; Hogrefe et al. 1987; Goldberg, 1987; Hogrefe et al 1989).
LDH-X, ein Isozym von LDH, das nur in männlichen Keimzellen gefunden wird, ist eines der am besten charakterisierten menschlichen Sperma-Antigene. Es wurde kristallisiert, und Aminosäure-Sequenzdaten sind erhältlich (Goldberg, 1972). Sowohl auto- als auch iso-immunogenische Reaktionen auf LDH-X wurden bei Mäusen und Kaninchen festgestellt (Goldberg, 1972), obwohl es kein hochwirksames Autoantigen beim Menschen zu sein scheint (Goldberg, 1973). Unfruchtbarkeit wurde bei Pavianen beobachtet, die sowohl systemisch oder lokal (intrauterin) mit LDH-X geimpft wurden (Samuel et al. 1978).
Wright et al (1989) haben λgt11-Klone identifiziert, die das menschliche Sperma-spezifische intraakrosomale Protein-Antigen SP-10 exprimieren. Dieses Antigen liegt im Sperma höherer Primaten und von Schweinen vor (Herr et al. 1989b). Laut Identifizierung durch die Reaktivität mit einem monoklonalen Antikörper MHS-10 (Homyk et al. 1989) hat das SP-10-Antigen ein Molekulargewicht von 28,3 kDa. Das SP-10-Antigen befindet sich nicht auf der Spermaoberfläche bis nach der Akrosomreaktion, sondern es kann zu diesem Punkt sein, dass eine Antikörperwechselwirkung mit dem freigelegten SP-10 die Wechselwirkung zwischen Sperma und Zona pellucida inhibieren würde, was zu einer Befruchtung führt (Herr et al. 1989b).
Ein SP-10-Fusionsprotein, kodiert durch 640 Nukleotide, das einen immunogenischen Anteil des SP-10-Moleküls, verknüpft als Fusionsprotein, mit einem Anteil bakterieller β-Galactosidase überbrückt, wurde auf Immunitätserzeugung hin bei Kaninchen untersucht. Die Kaninchen erzeugten polyklonale Antikörper, die mit aus menschlichem Sperma extrahiertem, nativen SP-10 reagierten. Diese Antikörper färbten das menschliche Sperma-Akrosom. Die Kaninchen erlitten keinerlei Krankheitseffekte aus der Impfung (D.C. Benjamin et al. 1985).
Zusätzlich wird die Produktion von Immunglobulin A, vermutlich sekretorischem IgA (sIgA), die Fähigkeit von Sperma blockieren, den Zervikalschleim zu durchdringen (Kremer und Jager, 1980) ebenso wie die Wechselwirkungen zwischen Sperma und Zona pellucida zu inhibieren, die am Befruchtungsprozess beteiligt sind (Dor et al. 1981; Bronson et al. 1982a, 1982b). Ein Verfahren zur Immunisierung, das eine sIgA-Reaktion stimulieren würde, zusätzlich zu humoralen und zellulären Immunreaktionen, würde deshalb höchst wünschenswert sein.
Das Eizellen-spezifische Zona pellucida-Antigen, ZP-3, ist ein solches Antigen, das eine sIgA-Reaktion induzieren könnte, die in einer Beschichtung der Zona pellucida mit sIgA resultieren und somit die Befruchtung durch Sperma verhindern würde. ZP-3 ist einzigartig für die reifenden und reifen Eizellen und ist wichtig bei der Spermabindung und Induzierung der Akrosomreaktion (Wasserman, 1987). Mit Zona pellucida vom Schwein oder ZP-3 immunisierte Kaninchen, Hunde und Affen wiesen eine abnormale Eierstockfunktion und einen Verlust an Follikeln auf (Wood et al. 1981; Mahi- Brown et al. 1982). Jedoch induziert die parenterale Immunisierung von Mäusen (Miller et al. 1989) mit einem ZP-3 B-Zellen-Epitop, das an Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin fusioniert ist, eine vollständige und reversible Unfruchtbarkeit in Schweizer Mäusen ("Swiss mice"), aber eine Eierstock-Autoimmunkrankheit und vollständige, nicht-reversible Unfruchtbarkeit bei weiblichen B6AF1-Mäusen (Tung et al. 1991). Seit kurzem ist es möglich, die Epitope an mäuse-/rattenartigem ZP-3, die die reversible Unfruchtbarkeits-Immunreaktion induzieren, von demjenigen zu separieren, welches Autoimmun-Eierstockentzündung induziert (Tung et al. 1991). Die Verwendung eines solchen Peptids in einem Impfstoff könnte eine effektive Methode zur Blockierung der Befruchtung ohne nachteilige Konsequenzen bereitstellen.
Keines der obigen Antigene wurde jedoch an einen Probanden unter Verwendung avirulenter Trägermikroben verabreicht. Für bestimmte avirulente Trägermikroben, die fremde Antigene einschliessen, wurde gezeigt, dass sie sekretorische, humorale und zelluläre Immunitäten induzieren. Diese Stämme werden entwickelt durch die Einführung von Mutationen, die die Bakterien dazu bringen, dass sie im wesentlichen unfähig zur Produktion funktionaler Proteine sind, die notwendig zum Überleben in einem Wirt sind. Das heisst, diese avirulenten Stämme überleben nicht in einer Weise oder für eine Dauer, die eine Beeinflussung oder einen Krankheitszustand im Wirt verursachen würde. Solche Mutanten sind offenbart in EP-A-315 682 (veröffentlicht am 17. Mai 1989), PCT WO88/09669 (veröffentlicht am 15. Dezember 1988) und in Curtiss und Kelly, 1987. Repräsentativ sind Mutanten von Salmonella spp., die Deletionsmutationen tragen, die die Fähigkeit des Bakteriums zur Synthese von Adenylatcyclase (ATP-Pyrophosphatlyase (cyclisierend) EC 4.6.1.1) (cya) und des cyclischen AMP-Rezeptorproteins (crp) beeinträchtigen. Zusätzlich eliminiert die Entfernung des 91 kb Virulenzplasmids von S. typhimurium (Jones et al. 1982) effektiv die Virulenz und Letalität als Folge von Oralimpfung.
Mutanten, die entweder eine Punktmutation oder Deletion des Gens tragen, das β-Aspartatsemialdehyddehydrogenase (asd) kodiert, wurden ebenfalls entwickelt. Dieses Enzym wird im Mesodiamino-Pimelinsäure-(DAP)-Syntheseweg gefunden. DAP ist eine wesentliche Komponente von Peptidoglycan, welches der bakteriellen Zellwand Form und Steifigkeit verleiht. Bakterien, die asd-Mutationen tragen, können nur in sorgfältig kontrollierten Laborumgebungen überleben. Somit kann ein rekombinanter Vektor, der sowohl asd (einen Asd&spplus;-Vektor) als auch das interessierende Antigen kodiert, in eine Asd&supmin;-Trägerzelle plaziert werden. Nur diejenigen Zellen, die das gewünschte Antigen kodieren, werden überleben. Die Verwendung einer solchen Träger mikrobe zur Übertragung eines Sperma-spezifischen Antigens könnte in einer effektiven Methode zur Geburtenkontrolle resultieren.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, dass bestimmte avirulente Mikroben, die Derivate eines pathogenen Mikroorganismus sind und die zur Besiedlung eines lymphoretikularen Gewebes fähig sind, als Träger für Sperma-spezifische und Eizellen-spezifische Antigene dienen können.
Solche Mikroben sind nützlich in Antifruchtbarkeitsimpfstoffen. Diese Impfstoffe stellen eine effektive Methode zur Empfängnisverhütung bei einem Probanden bereit, an den sie verabreicht werden.
Entsprechend ist eine Ausführungsform der Erfindung eine avirulente Mikrobe, die ein rekombinantes Expressionssystem einschliesst, welches wenigstens ein Gameten-spezifisches Antigen kodiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Impfstoffzusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge der avirulenten Mikrobe in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen fehlt der avirulenten Mikrobe ein funktionierendes natives chromosomales Gen, das β-Aspartatsemialdehyddehydrogenase (asd) kodiert, und sie umfasst ferner ein rekombinantes Gen, das ein funktionales asd-Polypeptid kodiert. Das rekombinante Gen ist an ein oder mehrere Gene geknüpft, die ein oder mehrere Gametenspezifische Antigene kodieren, insbesondere LDH-C, SP-10 und/oder ZP-3 oder Epitope davon. Die avirulente Mikrobe schliesst ebenfalls ein mutiertes cya-Gen ein, so dass die Mikrobe im wesentlichen unfähig zur Herstellung von funktioneller Adenylatcyclase ist, ebenso wie ein mutiertes crp-Gen, was die Mikrobe im wesentlichen unfähig zur Herstellung von funktionellem cyclischen AMP-Rezeptorprotein macht.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf eine Methode zur Induzierung eines Antifruchtbarkeitszustands in einem Wirbeltier gerichtet. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge der obigen Impfstoffzusammensetzung an den Probanden.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet hinsichtlich der vorliegenden Offenbarung leicht ersichtlich sein.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN:

Fig. 1 stellt die cDNA-Sequenz des SP-10-kodierenden Bereichs und flankierende Sequenzen in den λgt11-Klonen SP-10-5 und SP-10-10 dar (Wright et al. 1989). 5' bis zum Beginn der SP-10-5-Sequenz am Nukleotid 61 ist eine EcoRI-Hexanukleotidsequenz, und 3' bis zur SP-10-10-Sequenz am Basenpaar 1091 ist eine EcoRI-GAATTC-Hexanukleotid-Erkennungssequenz. Die SP-10-10-Sequenz hat eine interne, Im-Rahmen-Deletion von 57 Basenpaaren, angegeben durch eckige Klammern. Die von Restriktionsenzymen, die in der Konstruktion verwendet werden, erkannten Stellen sind angegeben. Der Pfeil kennzeichnet den Bereich zur Spaltung der Signalsequenz.
Fig. 2 ist ein Diagramm des Asd&spplus;-Klonierungsvektors pYA292.
Fig. 3 ist ein Diagramm des Asd&spplus;-Klonierungsvektors pYA810. Der Vektor enthält den trc-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, den rrnB- Transkriptionsterminator und den p15a-Vervielfältigungsursprung. Eine Klonierung in die multiple Klonierungsstelle erlaubt die Expression unter Kontrolle des trc-Promotors.
Fig. 4 stellt die Nukleotidsequenz Ptrc und die multiple Klonierungsstelle in pYA810 dar.
Fig. 5 ist ein Diagramm des Asd&spplus;-Vektors pYA3042, der das Gen enthält, das das menschliche Sperma-spezifische LDH-C kodiert, angetrieben durch den trc-Promotor von pYA810. Die Figur zeigt die acht Aminosäuren, die an das LDH-C-Gen angefügt sind (in Fettdruck, erhalten aus pHum-LDH-C, das in die SmaI-HindIII-Stellen von pYA810 insertiert ist.
Fig. 6 stellt das lacIq-Repressorplasmid pYA232 dar, das das lacIq- Gen auf einem pSC101-Replikon enthält, was die kontrollierte Expression des Konstrukts unter der Kontrolle von Ptrc und verwandten Promotoren auf dem p15A-Replikon erlaubt, das im ausgeglichen-tödlichen Wirts-Vektorsystem verwendet wird.
Fig. 7 ist ein Diagramm des Plasmids pKKHC4, das einen offenen Leserahmen mit 966 Basenpaaren enthält, der menschliches Sperma-spezifisches LDH-C kodiert.
Fig. 8 ist ein Diagramm des Plasmids pYA3054 mit dem LDH-C-Gen, das als 1,1 kb EcoRI-HindIII-Fragment aus pKKHC4 in die EcoRI-HindIII-Stelle von pYA810 kloniert ist.
Fig. 9 ist ein Diagramm des Plasmids pYA3048. 9A zeigt das LT-B-Gen, das in die BamHI- bis PstI-Stelle von pYA810 kloniert ist. Ein 38 Bp Linker liegt am 3'-Ende des LT-B-Gens vor, um einzigartige BamHI-, MluI- und ApaLI-Stellen zu ergeben. 9B zeigt die multiplen Klonierungsstellen am C-terminalen Ende der LT-B-Sequenz in pYA3048. Asn ist die C-terminale Aminosäure in LT-B. Das * zeigt die zwei Stopp-Kodons, jedes in unterschiedlichen Leserahmen.
Fig. 10 stellt die pYA3095- und pYA3090-LT-B- und -LDH-C-Coexpressionskonstrukte und die Konstruktion davon dar.
Fig. 11 zeigt die Konstruktion eines menschlichen LT-B-LDH-C-Fusionsplasmids unter Verwendung von pKKHC4 und pYA3082.
Fig. 12 stellt die Konstruktion der MBP-LDH-C-Fusion dar und zeigt die N-terminalen Bereiche des pMAL-cNOT-Vektors und des pKKHC4 LDH-C-Gens mit der Addition dreier Aminosäuren an LDH-C im Anschluss an die Spaltung mit Faktor Xa.
Fig. 13 zeigt die Anzahl koloniebildender Einheiten (KBE) von rekombinanter Salmonella, die aus Mäusen gewonnenes LDH-C exprimiert, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Fig. 14 zeigt die Konstruktion von pYASP-10-5&spplus;. Die nicht-SP-10 spezifizierte Aminosäuresequenz 3' bis zur EcoRI-Stelle kann eliminiert werden, um pYASP-10-5ter durch Insertion eines Polynukleotids zu ergeben, das zwei Aspartatreste angibt, gefolgt von einem Terminierungskodon.
Fig. 15 zeigt die Konstruktion von pYASP-10ter.
Fig. 16 zeigt die Konstruktion von pYALT-B-SP-10.
Fig. 17 stellt die Konstruktion einer LT-B-ZP3-Fusion dar und zeigt den kodierenden Bereich des mäuse-/rattenartigen ZP3-Klons pZP3.3 ebenso wie den toxischen Epitopbereich und das synthetische Oligomer. Die Zahlen unterhalb der Restriktionsstellen zeigen die relative Position in Basenpaaren (Bp) innerhalb ZP3, die Zahlen oberhalb der erweiterten Stelle zeigen die Aminosäurepositionen (AA) an.
Fig. 18 zeigt das cytoplasmatische pYA3111 LT-B-ZP3-Fusionskonstrukt, das durch Ligieren der verschmolzenen synthetischen 50 Bp Oligomere in die MluI-Stelle von pYA3082 erhalten wird.
Fig. 19 stellt das periplasmatische LT-B-ZP3-Proteinfusionskonstrukt dar, pYA3112, erhalten durch Ligieren des ClaI-PstI-Fragments von pYA3111 in die ClaI-PstI-Stelle von pYA3048.
Fig. 20 stellt den asd&spplus;-Expressionsvektor pYA3098 dar, der in der Konstruktion von pYASP-10Nter und pYASP-10Cter verwendet wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:

Falls nicht anders angegeben, wird die Durchführung der vorliegenden Erfindung herkömmliche Techniken der Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie einsetzen, die innerhalb des Könnens der Technik sind. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt. Siehe z. B. Sambrock et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Bände 1-3; DNA Cloning (1985), Bände I und II, D.N. Glover (Herausgeber); Nucleic Acid Hybridization (1984), B.D. Hames et al (Herausgeber); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods in Enzymology (die Reihe), Academic Press, Inc.; Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses (1987), R.L. Rodriguez et al (Herausgeber), Butterworths; und J.H. Miller et al. Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory.
Alle hier genannten Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, seien sie vorhergehend oder nachfolgend, sind hier durch Verweis eingeführt.

A. Definitionen:

Ein "Antigen" bezeichnet ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, die das Immunsystem eines Wirts stimulieren werden, um eine sekretorische, humorale und/oder zelluläre Antigen-spezifische Reaktion hervorzurufen. Der Begriff wird ebenfalls austauschbar mit "Immunogen" verwendet.
Ein "Gameten-spezifisches Antigen" ist eines, das eine Immunreaktion hervorruft, wie hier definiert, die entweder gegen Eizellen oder Sperma gerichtet ist. Ein "Sperma-spezifisches Antigen" wird eine Immunreaktion hervorrufen, die gegen Sperma gerichtet ist, wohingegen ein "Eizellenspezifisches Antigen" eine Immunreaktion hervorrufen wird, die gegen Eizellen gerichtet ist. Solche Gameten-spezifischen Antigene müssen nicht von den Arten abgeleitet sein, in denen sie verwendet werden, solange sie die gewünschte Immunreaktion hervorrufen können. Beispiele für Gametenspezifische Antigene sind nachfolgend angegeben.
Mit "Induzierung eines Antifruchtbarkeitszustands" ist die Erzeugung einer Immunreaktion in einem Probanden gemeint, so dass die Befruchtung relativ zu den Befruchtungsraten, die normalerweise in einer speziellen Art gefunden werden, entweder gehindert ist oder verhindert wird. Ein solcher Antifruchtbarkeitszustand muss nicht permanent sein, sondern kann reversibel sein. Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch auch irreversible Antifruchtbarkeitszustände (d. h. Sterilität).
Ein "Hapten" ist ein Molekül, das ein oder mehrere Epitope enthält, die nicht selbst das Immunsystem eines Wirts stimulieren, um eine sekretorische, humorale oder zelluläre Reaktion hervorzurufen.
Der Begriff "Epitop" betrifft die Stelle auf einem Antigen oder Hapten, an die ein spezifisches Antikörpermolekül bindet. Der Begriff wird ebenfalls austauschbar mit "antigenischer Determinante" oder "antigenische determinante Stelle " verwendet. Ein Epitop wird normalerweise 3 Aminosäuren einschliessen, die notwendig zur Erkennung in der räumlichen Konfirma tion sind, in üblicherer Weise 5 Aminosäuren, und am üblichsten 8 bis 10 Aminosäuren. Ein "Epitop", wie hier definiert, kann eine Immunreaktion in einem Probanden hervorrufen, an das es verabreicht wird.
Eine "Immunreaktion" auf eine Zusammensetzung oder einen Impfstoff ist die Entwicklung einer zellulären und/oder Antikörper-vermittelten Immunreaktion im Wirt auf die interessierende Zusammensetzung oder den Impfstoff. Gewöhnlich besteht eine solche Reaktion in der Erzeugung von Antikörpern, B-Zellen, Helfer-T-Zellen, Supressor-T-Zellen und/oder cytotoxischen T-Zellen durch den Probanden, die spezifisch auf ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, die in der interessierenden Zusammensetzung oder dem Impfstoff eingeschlossen sind.
Mit "Impfstoffzusammensetzung" ist ein Mittel gemeint, das zur Stimulierung des Immunsystems eines lebenden Organismus verwendet wird, so dass ein Schutz gegen zukünftige Befruchtung bereitgestellt wird. "Immunisierung" bezeichnet den Prozess der Induzierung eines fortgesetzt hohen Spiegels an Antikörper und/oder zellulärer Immunreaktion, worin T-Lymphocyten entweder das Antigen inaktivieren oder andere Zellen (z. B. Phagocyten) aktivieren können, um dieses in einem Organismus zu tun, was gegen ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus zuvor ausgesetzt war. Obwohl der Begriff "Immunsystem" Reaktionen einzelliger Organismen auf die Gegenwart von Fremdkörpern beinhalten kann, z. B. die Interferonerzeugung, ist der Begriff in dieser Anmeldung auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen beschränkt, durch die ein mehrzelliger Organismus Antikörper gegen ein antigenisches Material erzeugt, das die Zellen des Organismus oder die extrazelluläre Flüssigkeit des Organismus befällt. Der so erzeugte Antikörper kann zu jeder der immunologischen Klassen gehören, wie Immunglobuline A, D, E, G oder M.
Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, die die Erzeugung von Immunglobulin A (IgA) stimulieren, da dies das Hauptimmunglobulin ist, das vom sekretorischen System warmblütiger Tiere erzeugt wird. Die meisten Pathogene siedeln auf oder dringen durch eine Schleimhautoberfläche ein. Die Erzeugung von sekretorischem IgA (sIgA) in verschiedenen sekretorischen Drüsen und das Auftreten in den Sekretionen, die die Schleimhautoberflächen der Atemwege, des Magen-Darm-Trakts und des Urogenitalapparats benetzen, kann zur Blockierung der Besiedelung und des Befalls spezifischer Oberflächenantigene dienen, die auf einer Schleimhautoberfläche siedeln und durch sie eindringen. Die Immunreaktion auf Antigene ist gut untersucht, und von ihr wird weithin berichtet. Eine Übersicht der Immunologie ist aufgezeigt in James T. Barret, Textbook of Immunology: 4. Auflage, C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1983).
Eine "therapeutisch wirksame Menge" einer Impfstoffzusammensetzung ist eine Dosis, die ausreichend ist, um die Fruchtbarkeit in einem Probanden, an den die Zusammensetzung verabreicht wird, entweder zu verhindern oder zu reduzieren. Die Dosierungen der vorliegenden Zusammensetzungen, die die Fruchtbarkeit verhindern oder reduzieren können, können hinsichtlich dieser Offenbarung durch den Durchschnittsfachmann bestimmt werden, indem routinemässige Versuche mit entsprechenden Kontrollen durchgeführt werden. Der Vergleich der entsprechenden Behandlungsgruppen mit den Kontrollen wird angeben, ob eine spezielle Dosierung wirksam bei der Verhinderung oder Reduzierung der Fruchtbarkeit in einer kontrollierten Exposition ist. Im allgemeinen wird die wirksame Dosierung in Abhängigkeit vom Verabreichungsmodus variieren. Geeignete Dosen werden weiter unten diskutiert.
Ein "Wirbeltier" ist jedes Mitglied der Unterordnung Vertebrata, einer Hauptgruppe der Ordnung Chordata, die Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere einschliesst, von denen alle durch eine segmentierte knochige oder knorpelartige Wirbelsäule gekennzeichnet sind. Alle Wirbeltiere haben ein funktionales Immunsystem und reagieren auf Antigene durch Erzeugung von Antikörpern.
Ein "Individuum" oder ein "Proband", dem ein Impfstoff der Erfindung verabreicht wird, wird hier so definiert, dass es/er alle Wirbeltiere einschliesst, z. B. Säugetiere, einschliesslich Haustiere und Menschen, verschiedene Vogelarten, einschliesslich Hausvögel, insbesondere diejenigen von landwirtschaftlicher Bedeutung.
Mit "avirulentem Derivat einer Mikrobe" ist ein Organismus gemeint, der im wesentlichen unfähig zur Verursachung von Krankheit in einem Wirt ist, der mit der speziellen avirulenten Mikrobe behandelt wird. Eine avirulente Mikrobe, wie hier verwendet, stammt aus einer pathogenen Mikrobe und kann ein lymphoretikulares Gewebe besiedeln. Mit "pathogen" ist die Fähigkeit zur Verursachung von Krankheit oder Beeinträchtigung der normalen physiologischen Funktionen gemeint. Avirulente Stämme sind unfähig zur Induzierung der gesamten Reihe von Symptomen der Krankheit, die normalerweise mit ihrem virulenten pathogenen Gegenstück verbunden ist. Der Begriff "Mikrobe", wie hier verwendet, schliesst Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze ein. Derivate virulenter Mikroben sind ebenfalls im Erfindungsumfang enthalten. Mit Derivat sind ein sexuell oder asexuell abgeleiteter Abkömmling und Mutanten der avirulenten Stämme gemeint, einschliesslich einzelner oder multipler Basensubstitutionen, -deletionen, -insertionen oder - inversionen.
Eine "Trägermikrobe" ist eine avirulente Mikrobe, wie oben definiert, die ein rekombinantes Gen enthält und exprimiert, dass ein interessierendes Protein kodiert, wie ein Gameten-spezifisches Antigen.
Ein "rekombinantes Gen" ist ein identifizierbares Segment eines Polynukleotids innerhalb eines grösseren Polynukleotidmoleküls, das nicht in Verbindung mit dem grösseren Molekül in der Natur gefunden wird.
Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome Einheit der DNA-Vervielfältigung in vivo funktioniert; d. h. fähig zur Vervielfältigung unter seiner eigenen Kontrolle.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, ein Phage oder ein Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment geknüpft sein kann, um die Vervielfältigung des angeknüpften Segments zu erzeugen.
Eine DNA-"kodierende Sequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in vivo in ein Polypeptid transkribiert und übersetzt wird, wenn sie unter die Kontrolle der entsprechenden Regulationssequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startkodon am 5'-(Amino)-Terminus und ein Translationsstoppkodon am 3'-(Carboxy)-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säugetier-) DNA und selbst synthetische DNA-Sequenzen einschliessen, aber ist nicht darauf beschränkt. Eine Transkriptionsterminierungssequenz wird sich gewöhnlich in der 3'-Position zur kodierenden Sequenz befinden.
Eine "Promotorsequenz" ist ein DNA-Regulierungsbereich, der RNA- Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) kodierenden Sequenz initiieren kann. Für die Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz am 3'-Terminus durch das Translationsstartkodon (ATG) einer kodierenden Sequenz gebunden und dehnt sich stromaufwärts (5'-Richtung) aus, so dass sie die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einschliesst, die zur Initiierung der Transkription in oberhalb des Hintergrunds nachweisbaren Mengen notwendig ist. Innerhalb der Promotorsequenz wird eine Transkriptionsinitiierungsstelle gefunden werden (zweckmässig definiert durch Kartierung mit Nuklease S1), ebenso wie Protein-bindende Domänen (Übereinstimmungssequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren werden häufig, aber nicht immer, "TATA"-Kästen und "CAT"- Kästen enthalten. Prokaryotische Promotoren enthalten Schein-Dalgarno- Sequenzen zusätzlich zu den -10- und -35-Übereinstimmungssequenzen.
DNA-"Kontrollsequenzen" bezeichnen kollektiv Promotorsequenzen, Ribosombindungsstellen, Polyadenylierungssignale, Transkriptionsterminierungssequenzen, Stromaufwärts-Regulierungsdomänen, Verstärker und dergleichen, die kollektiv zur Transkription und Translation einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle beitragen.
Eine kodierende Sequenz ist "funktionsfähig verknüpft an" oder steht "unter der Kontrolle von" Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Promotorsequenz binden und die kodierende Sequenz zu mRNA transkribieren wird, die dann in das Polypeptid übersetzt wird, das durch die kodierende Sequenz kodiert wird.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen" und andere solche Begriffe, die Mikroorganismen betreffen, werden austauschbar verwendet und bezeichnen Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere übertragene DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und schliessen die Abkömmlinge der transfizierten ursprünglichen Zelle ein. Es ist selbstverständlich, dass die Abkömmlinge einer einzelnen Stammzelle nicht notwendigerweise vollständig identisch im genomischen oder Gesamt-DNA-Komplement wie die ursprüngliche Stammzelle zu sein braucht, aufgrund zufälliger oder absichtlicher Mutation. Die Abkömmlinge der Stammzelle, die der Stammzelle ausreichend ähnlich sind, sind durch die relevante Eigenschaft zu kennzeichnen, z. B. die Substitution eines nativen Gens, das ein wesentliches Enzym kodiert, durch ein kloniertes Gen, das an ein strukturelles Gen gebunden ist, das ein gewünschtes Genprodukt kodiert.
Ein "Klon" ist eine Population von Zellen, die aus einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahr durch Zellteilung stammt. Eine "Zelllinie" ist ein Klon einer Embryonalzelle, die zum stetigen Wachstum in vitro für viele Generationen fähig ist.
Eine "Genbibliothek" ist eine Sammlung klonierter Gene, die im allgemeinen viele oder alle der Gene aus einer speziellen Art umfasst. Bibliotheken werden hergestellt durch Behandeln von DNA mit ausgewählten Restriktions-Endonukleasen, gefolgt von Klonierung der Fragmente in einem geeigneten Vektor. Genbibliotheken können durchsucht werden unter Verwendung einer homologen DNA-Sequenz aus einem verwandten Organismus, um den Klon innerhalb der Bibliothek zu identifizieren, der das gewünschte Gen darstellt.
Ein "heterologer" Bereich eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment innerhalb oder angeknüpft an ein anderes DNA-Molekül, das nicht in Verbindung mit dem anderen Molekül in der Natur gefunden wird. Wenn der heterologe Bereich ein bakterielles Gen kodiert, wird das Gen daher gewöhnlich von DNA flankiert sein, die nicht das bakterielle Gen im Genom des ursprünglichen Bakteriums flankiert. Ein anderes Beispiel für die heterologe kodierende Sequenz ist ein Konstrukt, in dem die kodierende Sequenz selbst nicht in der Natur gefunden wird (z. B. synthetische Sequenzen mit Kodons, die sich vom nativen Gen unterscheiden). Eine allelische Variation oder natürlich auftretende Mutationsereignisse führen nicht zu einem heterologen DNA-Bereich, wie hier verwendet.
"Transformation", wie hier verwendet, bezeichnet die Insertion eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, unabhängig vom für die Insertion verwendeten Verfahren, z. B. direkte Aufnahme, Transduktion oder Konjugation. Das exogene Polynukleotid kann als ein Plasmid aufrechterhalten oder alternativ in das Wirtsgenom integriert werden.

B. Allgemeine Methoden:

Diese Erfindung betrifft mikrobielle Impfstoffe, die Gameten-spezifische Antigene enthalten, die in einem Probanden, an den sie verabreicht werden, die Befruchtung reduzieren oder eliminieren können. Verschiedene Sperma-spezifische Antigene sind bekannt, wie PHG-20, SP-10, LDH-C, LDH-X, das M&sub1; 95.000-Antigen von Moore, das 55 kDa-Antigen von Lee, das von S36-37 mAbs erkannt wird (HSA-63), menschliche Homologe der 95 kDa- und 56 kDa-Spermarezeptoren für ZP-3, FA-1 und das von Shaha charakterisierte 24 kDa-Antigen (alle oben beschrieben), und FA-1 (Naz 1987, 1988), und finden in der vorliegenden Erfindung Verwendung. Die Nukleotidsequenz für SP-10 ist in Fig. 1 dargestellt. Ferner wurde die cDNA für die menschliche Hoden-spezifische Milchsäuredehydrogenase kloniert und ihre antigenischen Stellen charakterisiert (Millan et al. 1987; Hogrefe et al. 1987; Goldberg, 1987; Hogrefe et al. 1989). In ähnlicher Weise sind Eizellen-spezifische Antigene bekannt, wie die Zona pellucida-Antigene, ZP-1, ZP-2 und ZP-3, und Epitope innerhalb ZP-3 identifiziert (Tung et al. 1991).
Eines oder mehrere der Gene, die diese und andere Gameten-spezifische Antigene kodieren, können zur Übertragung an einen geeigneten Probanden in avirulente Mikroben eingeführt werden. Die gesamte DNA-Sequenz, die das spezielle Gameten-spezifische Antigen kodiert, braucht nicht im mikrobiellen Träger vorliegen, solange ein Gen, das wenigstens ein Epitop kodiert, so eingeschlossen ist, dass eine Immunreaktion in einem Probanden hervorgerufen wird, dem der mikrobielle Impfstoff verabreicht wird. Bezüglich ZP-3, falls ein reversibler Antifruchtbarkeitszustand erwünscht ist, ist es tatsächlich bevorzugt, die antigenische Determinante, die zur Induzierung von Autoimmunpathologie verantwortlich ist (das in Fig. 17 gezeigte pathogene Epitop), aus dem Protein zu deletieren und einen Probanden mit dem übrigen Protein oder mit Epitopen zu immunisieren, von denen gezeigt wurde, dass sie die Unfruchtbarkeits-Immunreaktion induzieren. Solche Epitope wurden identifiziert (Fig. 17 und Tung et al. 1991). Der Einschluss des pathogenen Bereichs von ZP-3 in einem Antifruchtbarkeitsimpfstoff wird eine Verwendung finden, wenn eine permanente Sterilisation gewünscht ist.
Andere Gameten-spezifische Antigene werden ebenfalls in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden und können leicht unter Verwendung wohlbekannter Techniken auf diesem Gebiet identifiziert werden. Die Gene, die diese Antigene kodieren, können in eine Trägermikrobe insertiert werden, wie weiter unten beschrieben, und die transformierte Mikrobe kann in einem Impfstoff verwendet werden, um die Befruchtung in einem Empfänger-Wirt zu reduzieren oder zu eliminieren.
Speziell können Gameten-spezifische Antigene identifiziert und hergestellt und die sie spezifizierenden Gene kloniert werden. Zuerst können cDNA-Bibliotheken hergestellt werden unter Verwendung von cDNA, die aus mRNA, isoliert aus Hoden- oder Eierstockgewebe, erzeugt wird, und Rohzubereitungen können verwendet werden, um Antikörper heranzuziehen, die wiederum zur rekombinanten Expressionsdurchmusterung verwendet werden können. Somit können Klone, die mit diesen Antikörpern reaktive Proteine exprimieren, identifiziert und diese Proteine weiter charakterisiert werden.
Die individuellen rekombinanten cDNA-Klone, die Proteine exprimieren, die mit Antiseren gegen menschliche Gameten-spezifische antigene reagieren, können in einen geeigneten Plasmidexpressionsvektor subkloniert werden, um das Protein-Antigen überzuproduzieren. Das Antigen kann dann unter Verwendung herkömmlicher Proteinreinigungsverfahren im Anschluss an die Freisetzung des Protein-Antigens aus rekombinanten E. coli-Zellen gereinigt werden. Antiseren gegen das Protein können hergestellt werden durch Injektion von Antigen in eine Maus aus Gründen der Effizienz, oder in ein Kaninchen, wenn grössere Mengen von Antiseren erwünscht sind. In Anfangsdurchmusterungen werden diese Antiseren verwendet, um Protein-Antigene durch Western-Blot-Analyse in menschlichen Gameten nach Trennung auf SDS-Polyacrylamid-Gelen zu identifizieren. Auf diese Weise ist es möglich zu bestimmen, ob die klonierte cDNA die gesamte kodierende Sequenz für das Antigen spezifiziert und ein Produkt mit einer Grösse produziert, wie es aus Gameten isoliert wird. Natürlich werden Anpassungen zur Glykosylierung des im Gameten vorliegenden Proteins erforderlich sein. Diese Analyse wird ebenfalls die Anzahl unabhängiger Klone aufdecken, die individuelle Antigene spezifizieren, und wird die Gruppierung von cDNA-Klonen ermöglichen, die Teile des gleichen Protein-Antigens spezifizieren.
Eine wichtige und wesentliche Analyse beinhaltet die Bestimmung, ob die gegen das durch den rekombinanten Organismus erzeugte Antigen herangezogenen Antiseren mit anderem menschlichen Gewebe reagieren oder nicht. Dies ist wichtig, da die Gegenwart eines Antigens in jedem von Gameten unterschiedlichem Gewebe und insbesondere in Embryonalgewebe nicht akzeptierbar wäre. Mit anderen Worten ist es von äusserster Wichtigkeit, dass das im rekombinanten avirulenten Impfstoffkonstrukt zur oralen Immunisierung des Menschen zu exprimierende Gameten-spezifische Antigen keine Antikörper induziert, die mit menschlichem Gewebe wechselwirken und insbesondere nicht mit irgendwelchen Geweben in einem befruchteten Ei oder im Embryo reagieren.
Es ist möglich, dass die oben erzeugten cDNA-Bibliotheken nicht aus mRNAs stammen, die bei der Spezifizierung aller der einzigartigen antigenischen Komponenten beteiligt sind, die in menschlichen Gameten vorliegen. Aus diesem Grund kann ein unterschiedlicher Ansatz gemacht werden, um DNA- Sequenzen zu erhalten, die diese Gameten-spezifischen Antigene kodieren. Dies beinhaltet die biochemische Reinigung individueller Antigene.
Die isolierten Proteine können durch jedes der verschiedenen Verfahren sequenziert werden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Zum Beispiel können die Aminosäuresequenzen der betreffenden Proteine aus den gereinigten Proteinen durch wiederholte Zyklen des Edman-Abbaus, gefolgt von Aminosäureanalyse durch HPLC bestimmt werden. Andere Verfahren der Aminosäuresequenzierung sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt.
Die durch das obige Verfahren bestimmten Aminosäuresequenzen können verwendet werden, um Oligonukleotidsonden zu entwickeln, die die Kodonen für einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenzen enthalten, die verwendet werden können, um DNA-Bibliotheken auf Gene zu durchmustern, die die betreffenden Proteine kodieren. Die Grundstrategien zur Herstellung von Oligonukleotidsonden und DNA-Bibliotheken ebenso wie ihre Durchmusterung durch Nukleinsäurehybridisierung sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt. Siehe z. B. DNA Cloning: Band I, oben; Nucleic Acid Hybridization, oben; Oligonucleotide Synthesis, oben; Sambrook et al. oben.
Zuerst wird eine DNA-Bibliothek hergestellt. Sobald die Bibliothek aufgebaut ist, werden die Oligonukleotide zur Sondierung der Bibliothek hergestellt und verwendet, um das Gen zu isolieren, das das Gameten-spezifische Antigen kodiert. Die Oligonukleotide werden durch jedes geeignete Verfahren synthetisiert. Die besonderen, ausgewählten Nukleotidsequenzen werden so gewählt, dass sie den Kodonen entsprechen, die eine bekannte Aminosäuresequenz aus dem gewünschten Gameten-spezifischen Antigen kodieren. Da der genetische Code degeneriert ist, wird es häufig notwendig sein, verschiedene Oligonukleotide zu synthetisieren, um alle oder eine vernünftige Anzahl der möglichen Nukleotidsequenzen abzudecken, die einen speziellen Bereich des Proteins kodieren. Daher ist es bei der Auswahl eines Bereichs, auf dem die Sonden beruhen sollen, im allgemeinen bevorzugt, dass der Bereich keine Aminosäuren enthält, deren Kodonen hoch degeneriert sind. Unter bestimmten Umständen kann es der Fachmann wünschenswert finden, Sonden herzustellen, die relativ lang sind und/oder Bereiche der Aminosäuresequenz umfassen, die einen hohen Grad an Redundanz in entsprechenden Nukleinsäuresequenzen haben, insbesondere falls dieser längere und/oder redundante Bereich hoch charakteristisch für das interessierende Protein ist. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, zwei Sonden (oder Sätze von Sonden), jeweils für unterschiedliche Bereiche des Gens, in einem einzelnen Hybridisierungsexperiment zu verwenden. Die automatisierte Oligonukleotidsynthese hat die Herstellung grosser Familien von Sonden relativ unkompliziert gemacht. Obwohl die genaue Länge der eingesetzte Sonde nicht kritisch ist, ist es auf diesem Gebiet allgemein anerkannt, dass Sonden mit etwa 14 bis etwa 20 Basenpaaren gewöhnlich effektiv sind. Längere Sonden mit etwa 25 bis etwa 60 Basenpaaren werden ebenfalls verwendet.
Die ausgewählten Oligonukleotidsonden werden mit einem Marker markiert, wie einem Radionukleotid oder Biotin, wobei Standardverfahren verwendet werden. Der markierte Satz von Sonden wird dann im Durchmusterungsschritt verwendet, der daraus besteht, dass man die einsträngige ("single stranded", ss) Sonde mit isolierter ssDNA aus der Bibliothek gemäss Standardtechniken hybridisieren lässt. Entweder zwingende oder fakultative Hybridisierungsbedingungen könnten geeignet sein, abhängig von verschieden Faktoren, wie der Länge der Sonde und ob die Sonde aus der gleichen Art wie die Bibliothek oder einer evulationsmässig nahen oder entfernten Art stammt. Die Auswahl der geeigneten Bedingungen liegt innerhalb der Fähigkeiten auf diesem Gebiet. Siehe allgemein Nucleic Acid Hybridization, oben. Das Haupterfordernis ist, dass die Hybridisierungsbedingungen von ausreichender Schärfe sind, so dass eine selektive Hybridisierung auftritt; d. h. die Hybridisierung beruht auf einem ausreichenden Mass an Nukleinsäure- Homologie (z. B. wenigstens etwa 75%), im Gegensatz zur nicht-spezifischen Bindung. Sobald ein Klon aus der durchmusterten Bibliothek durch positive Hybridisierung identifiziert wurde, kann durch Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt werden, dass die spezielle Bibliotheksinsertion ein Gen für das gewünschte Protein enthält.
Alternativ können DNA-Sequenzen, die das interessierende Antigen kodieren, vielmehr synthetisch hergestellt als kloniert werden. Die DNA- Sequenz kann mit den geeigneten Kodonen für die spezielle Gameten-spezifische Aminosäuresequenz entwickelt werden. Im allgemeinen wird man bevorzugte Kodonen für den beabsichtigten Wirt auswählen, falls die Sequenz zur Expression verwendet werden wird. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengesetzt, die durch Standardverfahren hergestellt und zu einer vollständigen kodierenden Sequenz zusammengefügt werden. Siehe z. B. Edge, Nature (1981) 292 : 756; Nambair et al. Science (1984) 223 : 1299; Jay et al. J. Biol. Chem. (1984) 259 : 6311.
Sobald eine kodierende Sequenz für das gewünschte Protein hergestellt oder isoliert wurde, kann sie in jeden geeigneten Vektor oder ein Replikon kloniert werden. Vielzählige Klonierungsvektoren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors ist eine Frage des Beliebens. Beispiele für rekombinante DNA-Vektoren zum Klonieren und Wirtszellen, die sie transformieren können, schliessen ein: den Bakteriophagen lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (gram-negative Bakterien), pGV1106 (gram-negative Bakterien), pLAFR1 (gram-negative Bakterien), pME290 (nicht-E. coli gram-negative Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) und Rinder-Papillomavirus (Säugetierzellen). Siehe allgemein DNA Cloning: Bände I und II, oben; Sambrook et al. oben; B. Perbal, oben.
Die kodierende Sequenz für das interessierende Gameten-spezifische Protein kann unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosom-bindenden Stelle (zur bakteriellen Expression) und gegebenenfalls eines Operators gestellt werden (hier kollektiv als "Kontroll"-Elemente bezeichnet), so dass die DNA-Sequenz, die das Protein kodiert, in RNA in der Wirtszelle transkribiert wird, die durch einen Vektor transformiert wird, der diese Expressionskonstruktion enthält. Die kodierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leitsequenz enthalten oder nicht. Die Gameten-spezifischen Antigene der vorliegenden Erfindung können z. B. unter Verwendung eines nativen Promotors oder anderer wohlbekannter Promotoren exprimiert werden, die in gram-negativen Bakterien funktionieren, wie die tac- oder trc-Promotoren.
Die Gameten-spezifischen Antigene, wenn sie in einer Trägermikrobe vorliegen, können unter der Kontrolle eines Promotors exprimiert werden, der nur die Expression in vivo im immunisierten Wirt erlaubt. Falls die Erzeugung des Proteins im Volumen erwünscht ist, ausserhalb des beabsichtigten Empfängers, zusätzlich zu den Kontrollsequenzen, kann es jedoch wünschenswert sein, Regulationssequenzen hinzuzufügen, die eine Regulierung der Expression der Antigensequenzen relativ zum Wachstum der Wirtszelle erlauben. Regulationssequenzen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, und Beispiele schliessen diejenigen ein, die die Expression eines Gens verursachen, das als Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Impuls ein- oder ausgeschaltet werden soll, einschliesslich der Gegenwart einer Regulationsverbindung. Andere Arten von Regulationselementen können ebenfalls im Vektor zugegen sein, z. B. Verstärkungssequenzen.
Die betreffenden Proteine können ebenfalls in Form von Fusionsproteinen exprimiert werden, worin eine heterologe Aminosäuresequenz entweder am C-terminalen oder N-terminalen Ende des Fusionsproteins exprimiert wird. Siehe z. B. US-PSen 4 431 739, 4 425 437. Zum Beispiel kann die Sequenz, die das gewünschte Antigen kodiert, mit Sequenzen fusioniert werden, die ein Hilfspeptid spezifizieren, das geeignete antigenische Determinanten enthält, um die sekretorische Immunreaktion gegen das interessierende Antigen zu verstärken. Spezifische Beispiele für solche Hilfspeptide schliessen die B-Untereinheit des wärmeempfindlichen Toxins, das von Darmgift erzeugendem E. coli hergestellt wird (LT-B), und die Choleratoxin B-Untereinheit (CT-B) ein (Elson, 1988; Holmgren et al. 1988). Vektoren wurden entwickelt, die diese Peptide konstitutiv exprimieren und multiple Klonierungsstellen besitzen, um die Fusion von Nukleotidsequenzen zu erlauben, die gewünschte Antigene entweder am C-terminalen oder N-terminalen Ende der Hilfssequenzen kodieren (siehe Fig. 9A, 9B und 11).
Ein Expressionsvektor wird so konstruiert, dass sich die spezielle kodierende Sequenz im Vektor befindet, wobei die entsprechenden Regulationssequenzen, die Positionierung und Orientierung der kodierenden Sequenz bezüglich der Kontrollsequenzen so ist, dass die kodierende Sequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert wird (d. h. RNA-Polymerase, die an das DNA-Molekül an den Kontrollsequenzen bindet, transkribiert die kodierende Sequenz). Eine Modifizierung der Sequenzen, die das spezielle interessierende Antigen kodieren, kann erwünscht sein, um dieses Ende zu erreichen. Zum Beispiel kann es in manchen Fällen notwendig sein, die Sequenz so zu modifizieren, dass sie an die Kontrollsequenzen mit der entsprechenden Orientierung geknüpft ist; d. h. um den Leserahmen beizubehalten. Die Kontrollsequenzen und anderen Regulationssequenzen können vor der Insertion in einen Vektor an die kodierende Sequenz ligiert werden, wie die oben beschriebenen Klonierungsvektoren. Alternativ kann die kodierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden, der schon die Kontrollsequenzen und eine entsprechende Restriktionsstelle enthält.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, Leitsequenzen hinzuzufügen, die die Sekretion des Polypeptids aus dem Wirtsorganismus verursachen, falls vorhanden mit anschliessender Abspaltung des sekretorischen Signals. Leitsequenzen können durch den bakteriellen Wirt in einer posttranslationalen Verarbeitung entfernt werden. Siehe z. B. US-PSen 4 431 739, 4 425 437, 4 338 397. Es kann ebenfalls wünschenswert sein, Mutanten oder Analoga des interessierenden Antigens zu erzeugen. Mutanten oder Analoga können durch die Deletion eines Bereichs der das Antigen kodierenden Sequenz, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution eines oder mehrerer Nukleotide innerhalb der Sequenz hergestellt werden. Zum Beispiel können Proteine, die zur Immunisierung eines Wirts verwendet werden, Epitope, die Helferzellen stimulieren, ebenso wie Epitope, die Suppressorzellen stimulieren, enthalten. Daher würde eine Deletion oder Modifizierung dieser letzteren Nukleotide wünschenswert sein. Techniken zur Modifizierung von Nukleotidsequenzen, wie die stellengerichtete Mutagenese, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt. Siehe z. B. Sambrook et al. oben; DNA Cloning, Bände I und II, oben; Nucleic Acid Hybridization, oben.
Eine Anzahl von prokaryotischen Expressionsvektoren sind auf diesem Gebiet bekannt. Siehe z. B. US-PSen 4 440 859, 4 436 815, 4 431 740, 4 431 739, 4 428 941, 4 425 437, 4 418 149, 4 411 994, 4 366 246, 4 342 832; siehe ebenfalls GB-A-2 121 054, GB-A-2 008 123, GB-A-2 007 675; und EP-A-103 395.
In Abhängigkeit vom ausgewählten Expressionssystem und Wirt werden die erfindungsgemässen Gameten-spezifischen Antigene erzeugt durch Heranziehen von Wirtszellen, die durch einen oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert werden, unter Bedingungen, unter denen denen das interessierende Protein exprimiert wird. Das spezielle Protein kann aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt werden, um die Immunreaktion der immunisierten Tiere zu überwachen. Falls das Expressionssystem das Protein in die Wachstumsmedien absondert, kann das Protein direkt aus den Medien gereinigt werden. Falls das Protein in den periplasmatischen Raum transportiert wird, kann es durch osmotischen Kälteschock in das Medium freigesetzt werden, eine auf diesem Gebiet wohlbekannte Technik. Falls das Protein nicht zum periplasmatischen Raum abgesondert oder transportiert wird, wird es aus Zelllysaten isoliert. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und Gewinnungsmethoden liegen innerhalb des Fachwissens auf diesem Gebiet.
Die erfindungsgemässen Proteine oder ihre Fragmente können zur Erzeugung von Antikörpern, sowohl polyklonaler als auch monoklonaler, verwendet werden. Falls polyklonale Antikörper gewünscht sind, wird ein ausgewählter Vogel oder ein Säugetier (z. B. Huhn, Truthahn, Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd etc.) mit einem erfindungsgemässen Antigen oder seinem Fragment oder einem mutierten Antigen immunisiert. Serum aus dem immunisierten Tier wird aufgefangen und gemäss bekannten Verfahren behandelt. Falls Serum, das polyklonale Antikörper gegen das interessierende Protein enthält, Antikörper gegen andere Antigene enthält, können die polyklonalen Antikörper durch Immunaffinitätschromatografie unter Verwendung bekannter Verfahren gereinigt werden.
Monoklonale Antikörper gegen Proteine der vorliegenden Erfindung und gegen Fragmente davon können ebenfalls leicht durch den Fachmann erzeugt werden. Die allgemeine Methodik zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Hybridomen ist wohlbekannt. Unsterbliche Antikörper-erzeugende Zelllinien können durch Zellfusion und ebenfalls durch andere Techniken geschaffen werden, wie direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogenischer DNA oder Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus. Siehe z. B. M. Schreier et al. Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al. Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennet et al. Monoclonal Antibodies (1980); siehe ebenfalls US-PSen 4 341 761, 4 399 121, 4 427 783, 4 444 887, 4 452 570, 4 466 917, 4 472 500, 4 491 632 und 4 493 890. Auswahlen von monoklonalen Antikörpern, die gegen das interessierende Antigen erzeugt wurden, oder Fragmente davon können auf verschiedene Eigenschaften hin durchmustert werden; d. h. auf Isotyp- oder Epitop- Affinität etc.. Monoklonale Antikörper sind nützlich bei der Reinigung der Antigene, gegen die sie gerichtet sind, unter Verwendung von Immunaffinitätstechniken.
Die erfindungsgemässen Gameten-spezifischen Antigene, erzeugt wie oben beschrieben, können verwendet werden, um Probanden zur Erzeugung eines Antifruchtbarkeitszustands zu immunisieren. Avirulente Trägermikroben werden verwendet, um die vorliegenden Antigene zu verabreichen. Dieses Verabreichungsverfahren ist besonders geeignet, da entsprechende Trägermikroben die Produktion von sIgA stimulieren können. Die Produktion von sIgA in verschiedenen sekretorischen Drüsen und das Auftreten in den Sekretionen, die die Schleimhautoberflächen der Atemwege, des Magen-Darm- Trakts und des Urogenitalapparats benetzen, kann dazu dienen, die Besiedelung und das Eindringen spezifischer Oberflächenantigene zu blockieren, die auf einer Schleimhautoberfläche siedeln und durch sie hindurchgelangen. Anti-Gameten-s1gA-Produktion im Genitaltrakt blockiert die Fähigkeit von Sperma, die Zervikalschleimhaut zu durchdringen (Kramer und Jager, 1980), und verhindert ebenfalls Sperma-Zona pellucida-Wechselwirkungen, die am Befruchtungsprozess beteiligt sind (Dor et al. 1981; Bronson et al. 1982ab).
Rekombinante Plasmide, die ein oder mehrere Gene für die Gametenspezifischen Antigene enthalten, können in einen von mehreren avirulenten Stämmen von Bakterien eingeführt werden, die Mutationen für Gene enthalten, die für das Langzeit-Überleben im Zielwirt notwendig sind. Nützliche avirulente Mikroben schliessen ein, aber sind nicht beschränkt auf Mutanten- Derivate von Salmonella- und E. coli-Salmonella-Hybriden. Bevorzugte Mikroben sind Mitglieder der Gattung Salmonella, wie S. typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, S. gallinarum, S. pullorum, S. enteritidis, S. choleraesuis, S. arizona oder S. dublin. Avirulente Derivate von S. typhimurium und S. enteritidis finden eine breite Verwendung unter vielen Wirten. Avirulente Derivate von S. gallinarum, S. pullorum und S. arizona können besonders nützlich zur Immunisierung von Vogelarten sein, wohingegen S. thyphimurium, S. typhi und S. paratyphi bevorzugt zur Verwendung beim Menschen sind. S. choleraesuis wird bevorzugt zur Immunisierung des Schweins verwendet, während S. dublin Verwendung bei Rindern findet. Die Schaffung solcher Mutanten ist in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 251 304 und in Curtiss und Kelly, 1987, beschrieben.
Besonders nützlich sind die oben beschriebenen cya-, crp- und asd- Mutanten, die im wesentlichen unfähig zur Erzeugung des entsprechenden funktionalen Proteins in einem Wirt sind, indem das Wachstum beeinträchtigt ist. Andere avirulente Mikroben werden jedoch ebenfalls Verwendung innerhalb der vorliegenden Erfindung finden. Solche avirulenten Mikroben schliessen diejenigen mit aroA-, aroC-, aroD-, qalE-, phoP-, cdt-, ompR- und htrA-Mutationen ein. Falls Asd&supmin;-Mutanten verwendet werden, wird das interessierende Gameten-spezifische Antigen auf die Trägermikrobe unter Verwendung eines Vektors übertragen, der sowohl das Gameten-spezifische Antigen als auch asd kodiert. So werden nur diejenigen Trägermikroben überleben, die das gewünschte Gameten-spezifische Antigen enthalten, und diese Mikroben können zur weiteren Verwendung ausgewählt werden. Fig. 2 stellt eine Karte von pYA292 Asd&spplus; dar, einem Vektor, in den ein Gen kloniert werden kann, das das gewünschte Gameten-spezifische Antigen kodiert. Dieser Vektor kann dann in eine Asd-Trägermikrobe übertragen werden. Die Expression des rekombinanten Gens, das das gewünschte Antigen kodiert, kann abhängig sein von einer mit dem asd-Gen verknüpften Kontrollsequenz. Diese Verknüpfung kann aus der Orientierung der zwei Gene im Vektor resultieren, so dass beide Gene z. B. unter der Kontrolle der gleichen Kontrollelemente sein können, d. h. des gleichen Promotors und Operators.
Die cya-Mutanten und/oder crp-Mutanten können ferner in einem zum crp-Gen, das die Virulenz von Salmonella ausmacht, benachbarten Gen mutiert werden, bevorzugt durch eine Deletion. Eine Mutation in diesem Gen, dem cdt-Gen, vermindert die Fähigkeit der Bakterien, effektiv tiefe Gewebe zu besiedeln, z. B. die Milz. Wenn ein Plasmid mit dem crp&spplus;-Gen in einen Stamm mit dem Δ(crp-cdt) plaziert wird, behält es seine Avirulenz und Immunitätserzeugung bei, so dass es einen Phänotyp ähnlich zu cya- und crp-Mutanten aufweist. Mutanten mit der Δ(crp-cdt)-Mutation, die ein crp&spplus;-Gen auf einem Plasmid enthalten, behalten die normale Fähigkeit zur Besiedlung des Darmkanals und GALT bei, aber weisen eine verminderte Fähigkeit zur Besiedlung tieferer Gewebe auf. In den Beispielen ist die ursprüngliche Δ(crp-cdt)- Mutation in χ3622 isoliert, das ebenfalls die arqD- und cysG-Gene deletiert hat, was Anforderungen für Arginin und Cystein zum Wachstum auferlegt; diese Allelmutante wurde Δ(crp-cysG)-10 genannt. Eine zweite Mutante, die eine kürzere Deletion enthält, wurde isoliert, die keine Arginin-Anforderung auferlegte; sie ist in χ3931 vorhanden und wurde Δ(crp-cysG)-14 genannt.
Die Einführung der beschriebenen Mutationen in eine spezielle Mikrobe kann erreicht werden durch Verwendung von Transposonen, um die Mutationen aus anderen mutierten Stämmen in den interessierenden Stamm zu übertragen. Transposonen können an vielen Punkten zum bakteriellen Chromosom hinzugefügt werden. Die Eigenschaften der Transposoneninsertion und -deletion wurden in Kleckner et al (1977), J. Mol. Biol. 116 : 125, beschrieben. Zum Beispiel kann das Transposon Tn10, das die Resistenz gegen Tetracyclin (und Empfindlichkeit gegenüber Fusarinsäure) verleiht, verwendet werden, um Δcya- und Δcrp-Mutationen in einer Vielzahl von bakteriellen Arten zu schaffen, einschliesslich z. B. E. coli und S. typhimurium. Verfahren zur Schaffung und zum Nachweis dieser Mutanten in S. typhimurium sind beschrieben in EP-A-315 682, und eine Methode ist ebenfalls in den nachfolgenden Beispielen angegeben. Unter Verwendung von Tn10 können diese Mutationen in verschiedene Isolate von Salmonella transponiert werden, bevorzugt diejenigen, die hoch pathogen sind.
Die Schaffung bakterieller Mutanten kann ebenfalls erreicht werden unter Verwendung anderer Techniken, die auf diesem Gebiet bekannt sind. Diese Techniken schliessen z. B. Standardtechniken der Mutagenese und/oder die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken ein. Die gewünschten Mutanten werden dann auf der Grundlage der phänotypischen Eigenschaften ausgewählt, von denen einige unten in den Beispielen beschrieben sind. Methoden zur Konstruktion von Vektoren mit diesen Eigenschaften sind vollständiger in der gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 251 304 und der gemeinsamen, gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 07/612 001, eingereicht am 9. November 1990, diskutiert.
Um eine bevorzugte Immunreaktion zu stimulieren, ist die direkte Einführung der Mikrobe oder des Genprodukts in den Darm oder den Bronchus bevorzugt, wie durch orale Verabreichung, intranasale Verabreichung, Magensondierung oder in Form von Aerosolen, ebenso wie Luftsackimpfung (nur bei Vögeln) und intratracheale Impfung. Andere geeignete Verfahren schliessen die Verabreichung über die Bindehaut, um die Harder-Drüse zu erreichen, und die intramammäre Impfung ein. Andere Verfahren zur Verabreichung des Impfstoffs, wie intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion, sind ebenfalls möglich und werden prinzipiell verwendet, um eine sekundäre Immunreaktion zu stimulieren, wie weiter unten beschrieben.
Wenn Trägermikroben, die die Gameten-spezifischen Antigene exprimieren, an den Menschen oder andere Säugetiere verabreicht werden, werden sie im allgemeinen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger vorliegen. Zum Beispiel können die Trägermikroben magensaftresistent umhüllt oder mit einer geeigneten, gelatineartigen Substanz verkapselt sein, die auf diesem Gebiet bekannt ist (Cryz und Glück, 1990, in G. Woodrow und Mr. Levine, New Generation Vaccine, Marcel Dekker, New York, Seiten 921-932).
Sobald die Trägermikrobe im Tier vorliegt, muss das Antigen für das Immunsystem des Tieres zugänglich werden. Dies kann erreicht werden, wenn die Trägermikrobe stirbt, so dass die Antigenmoleküle freigesetzt werden. Natürlich ist die Verwendung "undichter" avirulenter Mutanten ebenfalls möglich, die den Inhalt des Zellplasmas (Periplasmas) ohne Lyse freisetzen. Alternativ kann ein Gen ausgewählt werden, das die Erzeugung eines Antigens kontrolliert, das der äusseren Umgebung durch die Trägerzelle vor dem Tod der Zelle verfügbar gemacht wird.
Die Antigene können ebenfalls als Aerosole oder intranasal verabreicht werden. Intranasale Formulierungen für menschliche Probanden werden gewöhnlich Träger einschliessen, die weder eine Reizung der Nasenschleimhaut noch eine wesentliche Störung der Ziliarfunktion verursachen. Verdünnungsmittel, wie Wasser, wässrige Salzlösung oder andere bekannte Substanzen, können mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Die nasalen Formulierungen können ebenfalls Konservierungsmittel enthalten, wie Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid, aber sind nicht auf diese beschränkt. Ein Tensid kann vorhanden sein, um die Absorption der vorliegenden Proteine durch die Nasenschleimhaut zu erhöhen.
Die Injektion des Gameten-spezifischen Antigens kann ebenfalls zusammen mit vorhergehender oraler, intranasaler, Magen- oder Aerosolimmunisierung erfolgen. Eine solche parenterale Immunisierung kann als ein Verstärker zur Erhöhung der Expression der sekretorischen Immunreaktion dienen, sobald das sekretorische Immunsystem für das Gameten-spezifische Genprodukt durch Immunisierung mit der Trägermikrobe, die das Gameten-spezifische Genprodukt exprimiert, stimuliert wurde. Die erhöhte Reaktion ist bekannt als eine sekundäre, Verstärkungs-("Booster") oder anamnesische Reaktion und resultiert in einem verlängerten Immunschutz des Wirts. Verstärkungsimmunisierungen können mehrere Male mit vorteilhaften Ergebnissen wiederholt werden.
Wenn die Impfstoffe als Injektionen hergestellt werden, wie für Verstärker, können sie entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen zubereitet werden; feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in flüssigen Trägern vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann ebenfalls emulgiert oder der Wirkstoff in Liposomträgern verkapselt werden. Der immunitätserzeugende Wirkstoff wird häufig mit Trägern vermischt, die Zusatzstoffe enthalten, die pharmazeutisch akzeptabel und kompatibel mit dem Wirkstoff sind. Geeignete Träger sind z. B. Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Falls erwünscht, kann der Träger zusätzlich geringe Mengen an Hilfsstoffen, wie Benetzungs- oder Emulgiermitteln, pH-Puffermitteln oder Adjuvantien, enthalten, die die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöhen. Adjuvantien können z. B. Muramyldipeptide, Avridin, Aluminiumhydroxid, Öle, Saponine und andere auf diesem Gebiet bekannte Substanzen einschliessen. Eigentliche Verfahren zur Herstellung solcher Arzneiformen sind bekannt oder werden dem Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich sein. Siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 15. Auflage, 1975. Die zu verabreichende Zusammensetzung oder Formulierung wird in jedem Fall eine Menge des Proteins enthalten, die angemessen zum Erreichen des gewünschten immunisierten Zustands im behandelten Individuum ist.
Die zu verabreichende Menge des Antigens hängt vom zu behandelnden Probanden, der Fähigkeit des Immunsystems des Probanden, Antikörper zu synthetisieren, und dem Grad des gewünschten Schutzes ab. Effektive Dosierungen können leicht durch den Durchschnittsfachmann auf dem Wege routinemässiger Untersuchungen gefunden werden, die Dosis-Antwort-Kurven ergeben. Der Proband wird durch Verabreichung des speziellen Antigens oder Fragments davon oder Analogons davon in wenigstens einer Dosis immunisiert. Typische Dosen unter Verwendung der Trägermikrobe liegen im Bereich von 1 · 10&sup6; bis 1 · 10¹&sup0; rekombinanten avirulenten Bakterien pro immunisiertem Proband. Dem Probanden können zunehmende Mengen oder Mehrfachdosierungen nach Bedarf verabreicht werden, um einen Immunitätszustand gegen das Gameten-spezifische Antigen aufrechtzuerhalten.
Es kann wünschenswert sein, mehr als ein Gameten-spezifisches Antigen gleichzeitig oder nacheinander zu verabreichen. Dies kann erreicht werden, indem entweder ein avirulenter Träger verabreicht wird, der Gene enthält, die für mehr als ein Gameten-spezifisches Antigen kodieren, oder durch Verabreichung verschiedener Trägerorganismen.
Die obige Offenbarung beschreibt allgemein die vorliegende Erfindung. Ein vollständigeres Verständnis kann erhalten werden durch Verweis auf die folgenden spezifischen Beispiele, die allein für erläuternde Zwecke angegeben sind und nicht zur Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise beabsichtigt sind.

HINTERLEGUNGEN DER FÜR DIE AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG NÜTZLICHEN STÄMME:

Eine Hinterlegung biologisch reiner Kulturen der folgenden Stämme wurde durchgeführt bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. Die angegebene Eingangsnummer wurde zugeteilt nach erfolgreicher Untersuchung der Lebensfähigkeit, und die erforderlichen Gebühren wurden gezahlt. Zugang zu den Kulturen steht während der Anhängigkeit der Patentanmeldung demjenigen zur Verfügung, der vom Bevollmächtigten dazu bestimmt ist, dass er gemäss 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 dazu befugt ist. Jede Einschränkung der Verfügbarkeit der Kulturen für die Öffentlichkeit wird nach Erteilung eines Patents, das auf der Anmeldung beruht, unwiderruflich entfernt. Ferner werden die benannten Hinterlegungen für einen Zeitraum von 30 (dreissig) Jahren vom Zeitpunkt der Hinterlegung oder für 5 (fünf) Jahre nach dem letzten Antrag auf Hinterlegung aufrechterhalten; oder für die durchsetzbare Laufzeit des US-Patents, je nachdem, welcher Zeitraum länger ist. Sollte eine Kultur nicht lebensfähig sein oder unabsichtlich zerstört werden oder, im Fall von plasmidhaltigen Stämmen, ihr Plasmid verlieren, wird sie durch eine lebensfähige Kultur (Kulturen) der gleichen taxonomischen Beschreibung ersetzt werden. Die hier genannten hinterlegten Materialien sind allein der Zweckmässigkeit wegen beabsichtigt und nicht erforderlich zur Ausführung der vorliegenden Erfindung hinsichtlich dieser Beschreibung, und zusätzlich werden diese Materialien durch Verweis hierin eingeführt.

BEISPIELE:

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung avirulenter Mikroben durch die Einführung von Deletionsmutationen, die die cAMP-Synthese beeinflussen, und unter Verwendung und Identifizierung von Stämmen mit Mutationen, die die Stabilität des Phänotyps, die vollständige Avirulenz und eine hohe Immunitätserzeugung verleihen.
Bakterienstämme: Die verwendeten Stämme Escherichia coli und Salmonella typhimurium sind in Tabelle 1.A. und B. aufgeführt. Sie wurden als eingefrorene Kulturen aufbewahrt, suspendiert in 1% Bacto-pepton, das 5% Glycerin enthält, und schockgefroren in Trockeneis-Ethanol zur Lagerung als Doppel bei -70ºC, und ebenfalls suspendiert in 1% Bacto-penton, das 50% Glycerin enthält, zur Lagerung bei -20ºC zur routinemässigen Verwendung.
Medien: Komplexe Medien zur routinemässigen Kultivierung waren L- Bouillon (Lennox, Virology 1 : 190-206 (1965)) und Luria-Bouillon (Luria und Burrous, J. Bacteriol. 74 : 461-476 (1957)). Difco-Agar wurde zur Luria- Nährbouillon mit 1,2% für Basisagar und 0,65% für weichen Agar hinzugegeben. Penassay-Agar wurde zur routinemässigen Zählung von Bakterien verwendet. Fermentierung wurde ausgewertet durch Ergänzung von MacConkey- Basisagar oder Eosin-Methylenblau-Agar (Curtiss, Genetics 58 : 9-54 (1968)) mit einer 1%-igen Endkonzentration eines entsprechenden Kohlehydrats.
Synthetische Medien waren Minimalflüssigkeit ("minimal liquid", ML) und Minimalagar (MA), ergänzt mit Nährstoffen in optimalen Mengen, wie zuvor beschrieben (Curtiss, J. Bacteriol. 89 : 28-40 (1965)). Gepufferte Salzlösung mit Gelatine ("buffered saline with gelatine", BSG) (Curtiss, 1965 oben) wurde routinemässig als Verdünnungsmittel verwendet.
Transduktion: Der Bakteriophage P22HTint wurde routinemässig zur Transduktion unter Verwendung von Standardmethoden verwendet (Davis et al. "A Man. for Genet. Eng.-Adv.Bacteriol Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1979)). Eine Kultur des Donorstammes über Nacht wurde in vorgewärmter Luria-Bouillon 1 : 20 verdünnt, für 60 Minuten unter Schütteln bei 37ºC herangezogen und dann mit P22HTint mit einer Multiplizität von 0,01 infiziert. Die Infektionsmischung wurde über Nacht für ca. 15 Stunden geschüttelt, mit Chloroform versetzt und zusätzliche 10 Minuten bei 37ºC geschüttelt, und die Suspension wurde zur Entfernung von Bakterientrümmern zentrifugiert (Sorvall RC5C, SS-34 Rotor, 7000 U/min. 10 Minuten). Die den Phagen enthaltende überstehende Flüssigkeit (ca. 10¹&sup0;/ml) wurde bei 4ºC über Chloroform gelagert. Tetracyclin wurde auf eine Konzentration von 12,5 ug/ml verwendet, um zur Transduktion von Tn10-Insertionen und Tn10-induzierten Mutationen auszuwählen.
Auswahl von Fusarinsäure zum Verlust von Tn10: Die von Maloy und Nunn (J. Bacteriol. 145 : 1110-1112 (1981)) beschriebenen Medien und Methoden wurden verwendet. Stämme mit Tn10-induzierten Mutationen wurden über Nacht in L-Bouillon, die 12,5 mg Tetracyclin/ml enthielt, bei 37ºC auf ca. 5 · 10&sup8; KBE/ml herangezogen. Die Kulturen wurden dann 1 : 40 in vorgewärmter L-Bouillon ohne Tetracyclin verdünnt und bei 37ºC auf einen Titer von ca. 2 · 10&sup9; KBE/ml durchlüftet. Geeignete Mengen an Zellen (d. h. 10&sup7;-10&sup8;), verdünnt in BSG, wurden auf fusarinsäurehaltiges Medium aufgezogen und bei 37ºC für 48 Stunden inkubiert. Fusarinsäureresistente Isolate wurden auf dem gleichen selektiven Medium gereinigt. Einzelne Isolate wurden ausgelesen, herangezogen und auf Tetracyclinempfindlichkeit auf Penassay-Agar mit und ohne 12,5 ug Tetracyclin/ml getestet.
Mäuse: Weibliche BALB/c-Mäuse (6 bis 8 Wochen alt) (Sasco, Omaha, NB) wurden für Infektiosität- und/oder Immunisierungsexperimente verwendet. Die Tiere wurden für eine Woche in einem isolierten Raum gehalten, bevor sie in den Experimenten verwendet wurden. Die Experimentalmäuse wurden in mit Nalgene-Filter bedeckte Käfige mit Gitterböden gesetzt. Nahrung und Wasser wurden nach belieben gegeben. Der Tierraum wurde auf 22 bis 23ºC bei einer Dauer von 12 Stunden Beleuchtung gehalten.
Tierinfektiosität: Die Virulenz von S. typhimurium-Stämmen wurde im Anschluss an perorale (p.o.) oder intraperitoneale (i. p.) Impfung bestimmt. Die Bakterien zur Impfung in den Mäusen wurden über Nacht als Standkulturen bei 37ºC in L-Bouillon herangezogen. Diese Kulturen wurden 1 : 50 in vorgewärmter L-Bouillon verdünnt und bei 37ºC für ca. 4 Stunden auf ein OD&sub6;&sub0;&sub0; von ca. 0,8 bis 1,0 durchlüftet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren in einem GSA-Rotor bei 7000 U/min für 10 Minuten bei 4ºC in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge 50-fach konzentriert, gefolgt von Suspension in BSG. Geeignete Verdünnungen wurden auf Penassay-Agar zur Titerbestimmung und auf MacConkey-Agar mit 1% Maltose zur Verifizierung des Cya/Crp-Phänotyps aufgezogen. Für alle p.o.-Impfungen mit S. typhimurium wurde den Mäusen für 4 Stunden vor der Infizierung Futter und Wasser vorenthalten. Ihnen wurden dann 30 ml 10% (G/V) Natriumbicarbonat unter Verwendung eines Pipetman P200 gegeben, 10 bis 15 Minuten vor der p.o.-Fütterung mit 20 ul von in BSG suspendiertem S. typhimurium unter Verwendung eines Pipetman P20. Futter und Wasser wurden 30 Minuten nach der Oralimpfung wieder angeboten. Morbidität und Mortalität der Mäuse wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen beobachtet. Die intraperitoneale Impfung von nicht nüchtern gehaltenen BALB/c-Mäusen wurde durchgeführt unter Verwendung einer 26-Gauge 3/8" Nadel, um 100 ul von in BSG verdünnter S. typhimurium-Bakteriensuspension zu übertragen. Morbidität und Mortalität der Mäuse wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen beobachtet.
Auswertung der schützenden Immunität: In Anfangsexperimenten wurde jede Maus, die die Infizierung mit einer S. typhimurium-Stammmutante für 30 Tage überlebte, am Tag 31 der 10³-10&sup4;-fachen LD&sub5;&sub0;-Dosis des mäusevirulenten S. typhimurium-Elternstammes vom Wildtyp auf dem p.o.-Weg ausgesetzt. Anschliessend wurden Gruppen von Mäusen mit verschiedenen Dosen virulenter Mutanten peroral immunisiert und dann verschiedenen Dosen von virulenten Stammzellen vom Wildtyp zu unterschiedlichen Zeiten nach der Anfangsimmunisierung ausgesetzt. Morbidität und Mortalität wurden während des Experiments und für wenigstens 30 Tage nach Exposition mit dem Elternteil vom Wildtyp beobachtet.
Isolierung von S. typhimurium-Stämmen mit Δcya-12- und Δcrp-11- Mutationen: Der Maus-ausgeschiedene, virulente S. typhimurium-SL1344-Stamm χ3339 vom Wildtyp wurde genetisch modifiziert, wie unten beschrieben, wobei klassische genetische Methoden ähnlich den von Curtiss und Kelly, 1987, beschriebenen verwendet wurden. Die Strategie bestand aus der Transduktion der ursprünglichen crp-773::Tn10-Mutation aus PP1037 und der ursprünglichen cya::Tn10-Mutation aus PP1002 in den hochvirulenten und invasiven S. typhimurium-SL1344-Stamm χ3339 und der Durchmusterung zahlreicher unabhängiger fusarinsäureresistenter, tetracyclinempfindlicher Deletionsmutanten auf vollständige Avirulenz und höchste Immunitätserzeugung in Mäusen, ebenso wie auf die grösste genotypische Stabilität.
Die Transduktion der Tn10-Insertionen in die crp- und cya-Gene wurde erleichtert, indem zuerst ein Lysat des Bakteriophagen P22HTint mit hohem Titer auf dem S. typhimurium-Stamm PP1037, der die crp-773::Tn10-Mutation enthielt, und ein anderes Lysat auf dem S. typhimurium-Stamm PP1002, der die cya::Tn10-Mutation enthielt, hergestellt wurde. Die resultierenden P22HTint-Lysate wurden anschliessend verwendet, um das empfangende S. typhimurium χ3339 bei einer Multiplizität von 0,3 zu infizieren, um es auf Tetracyclinresistenz bei Durchmusterung auf einen Maltose-negativen Phänotyp zu transduzieren. Die Phagen-Bakterien-Infektionsmischungen wurden für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, bevor 100 ul-Proben auf MacConkey-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) ausgebreitet wurden, der 1% Maltose enthielt (Endkonzentration) und mit 12,5 ug Tetracyclin/ml ergänzt war. Nach ca. 26 Stunden Inkubierung bei 37ºC wurden eine tetracyclinresistente Maltose-negative Kolonie, die aus der P22HTint (PP1037) → χ3339-Infektion resultierte, und eine tetracyclinresistente Maltose-negative Kolonie, die aus der P22HTint (PP1002) → χ3339-Infektion resultierte, in 0,5 ml BSG ausgelesen und auf die gleichen selektiven Medien gestrichelt. Die resultierenden χ3339-Derivate wurden χ3604 (cya::Tn10) und χ3605 (crp-773::Tn10) genannt (Tabelle 1.A.) TABELLE 1. Bakterienstämme
Die Stämme χ3604 und χ3605 wurden in L-Bouillon + 12,5 ug Tetracyclin/ml herangezogen, und 100 ul-Proben jedes Stammes, verdünnt 1 : 10 in gepufferter Salzsäure mit Gelatine (BSG), wurden auf 10 Platten mit fusarinsäurehaltigem (FA) Medium ausgebreitet (Maloy und Nunn, 1981). Die Platten wurden bei 37ºC für ca. 36 Stunden inkubiert. Fünf fusarinsäureresistente Kolonien aus jeder Platte wurden in 0,5 ml BSG ausgelesen und auf FA-Medium gereinigt. Gereinigte fusarinsäureresistente Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen und bei 37ºC bis zur Trübung herangezogen und auf Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit) überprüft. Ein tetracyclinempfindliches Derivat wurde aus jeder der 10 Aufzüge auf FA-Medium ausgewählt und in Hinsicht auf vollständiges LPS (durch P22HTint-Empfindlichkeit), Auxotrophie oder Prototrophie, Stabilität der Gendeletion und Umkehrung der Tetracyclinresistenz charakterisiert. Dieses Verfahren resultierte in 10 unabhängig isolierten Δcya-Mutanten aus χ3604 und 10 unabhängig isolierten Δcrp-Mutanten aus χ3605.
Genetische Stabilität der avirulenten Mutanten. Als Lebendimpfstoffe oral zu verabreichende Stämme müssen eine vollständige Stabilität hinsichtlich sowohl ihrer Avirulenz als auch ihrer immunitätserzeugenden Attribute aufweisen. Wenn 50-fach konzentrierte Kulturen und verschiedene Verdünnungen (ca. 10&sup9;, 10&sup7;, 10&sup5;, 10³ KBE/Platte) jeder der 10 unabhängigen Δcya- Mutanten und jeder der 10 unabhängigen Δcrp-Mutanten auf Minimalagarmedien (ergänzt mit 22 ug Cystein/ml und 22 ug Arginin/ml), das 0,5% Maltose, Melibiose, Xylose, Glycerin oder Rhamnose enthielt, welche nicht deren Wachstum unterstützen sollten, aufgezogen wurde, wurden keine Revertanten und Mutanten nachgewiesen. Ein Satz doppelter Platten wurde UV-bestrahlt (5 J/m²/s) und im Dunkeln bei 37ºC inkubiert. Der andere Satz Platten wurde bei 37ºC bei Beleuchtung inkubiert. Nach einer Wachstumsperiode von 48 Stunden wurden keine Revertanten und Mutanten nachgewiesen. Es wurde ebenfalls eine Untersuchung durchgeführt, ob tetracyclinresistente Revertanten/Mutanten aus den fusarinsäureresistenten Δcya- und Δcrp-Mutanten mit höheren Häufigkeiten gewonnen werden konnten als sie für den tetracyclinempfindlichen Elternstamm von Wildtyp beobachtet werden konnten. In allen Fällen wurden solche tetracyclinresistenten Revertanten/Mutanten nicht beobachtet.
Virulenz und Immunitätserzeugung von Δcrp- und Δcya-Mutanten. Die resultierenden 10 Δcrp- und 10 Δcya-Mutanten wurden in BALB/c-Mäusen durch perorale Impfung durchmustert, um die niedrigste Virulenz und Krankheitssymptomatologie zu bestimmen, wie sie durch das Erscheinungsbild des Fells (schlecht gegenüber glatt), den Appetit und die Aktivität (hoch oder niedrig) sichtbar werden. Fünf Mäuse pro Gruppe wurden p.o. mit ca. 10&sup9; KBE jeder der unabhängigen cya- oder crp-Deletionsmutanten geimpft. Die Tiere wurden beruhend auf den obigen Kriterien beurteilt, und am Tag 30 des Experiments wurden die Überlebenden 10&sup8; KBE des virulenten Elternstamms χ3339 vom Wildtyp ausgesetzt. In drei der zwanzig mit den cya- oder crp- Deletionsmutanten infizierten Gruppen überlebten fünf von fünf Mäusen die Erstinfektion mit den Δcya-12-, Δcrp-11- und Δcrp-10-Mutanten und waren ebenfalls vollständig geschützt gegen 10&sup4; LD&sub5;&sub0;-Dosen der Wildtyp-Exposition. Insbesondere eine Gruppe, die Δcrp-10-Mutante, war unerreicht in Avirulenz, Immunitätserzeugung und Stabilität. Nach Wiederholung dieser Experimente schienen die Mäuse niemals durch irgendeine p.o. oder i.p. gegebene Dosis der Δcrp-10-Mutante beeinflusst zu sein (siehe Beispiel 3, Tabelle 6).
Eigenschaften der ausgewählten Mutantenstämme. χ3615, χ3622 und χ3623 mit den Δcya-12-, Δcrp-10- bzw. Δcrp-11-Mutationen wurden als am wenigsten virulent, am höchsten immunitätserzeugend und phänotypisch und genotypisch äusserst stabil beurteilt. Die Daten über die phänotypischen Eigenschaften dieser Stämme sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 3 stellt Daten über die Avirulenz und Immunitätserzeugung dieser Stämme im Vergleich mit den Ergebnissen mit dem virulenten Ursprung vom Wildtyp χ3339 und den Stämmen χ3604 und χ3605 mit den cya::Tn10- bzw. crp-773::Tn10-Mutationen dar. Zusätzlich zum Histidin-Erfordernis, das aufgrund der hisG-Mutation im Ursprung χ3339 besteht, stellte die Δcrp-10-Mutation für χ3622 Anforderungen bezüglich der Aminosäuren Arginin und Cystein. Die Grundlagen für diese Beobachtung und weitere Analyse der Eigenschaften der Δcrp-10-Mutation sind in Beispiel 3 angegeben. TABELLE 2 Phänotypische Eigenschaften von S. typhimurium-Δcya- und -Δcrp-Stämmen
a Bacteriophage P22HTint S = empfindlich; R = resistent
b Fermentierung auf MacConkey-Basisagarmedium und API 20E und Wachstum auf MA + 0,5% Kohlenstoffquelle TABELLE 3 Virulenz und Immunitätserzeugung von S. typhimurium cya::Tn10-, crp::Tn10 Δcya-12-, Δcrp-10- und Δcrp-11-Mutanten in BALB/c-Mäusen

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von avirulenten Mikroben durch die Einführung der Deletionsmutationen, die die cAMP-Synthese und - Verwendung beeinflussen, und die Charakterisierung von Stämmen mit zwei Deletionsmutationen hinsichtlich der Stabilität des Phänotyps, der vollständigen Avirulenz und der hohen Immunitätserzeugung.
Bakterienstämme. Die verwendeten Escherichia coli- und Salmonella typhimurium-Stämme sind in Tabelle 1.A. und B. aufgeführt. Die Aufbewahrung und Lagerung dieser Stämme sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Medien. Komplexe Medien zur routinemässigen Kultivierung, Zählung und Identifizierung von Bakterien sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Transduktion und Fusarinsäureselektion für den Verlust von Tn10. Die Medien und Methoden sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Tierinfektiosität und Auswertung der Schutzimmunität. Die Virulenz und Immunitätserzeugung von S. typhimurium-Stämmen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Konstruktion von S. typhimurium-Stämmen mit Δcya-12- und Δcrp-11- Deletionsmutationen. Die besten Impfstoffstämme hinsichtlich der Wirksamkeit resultieren möglicherweise aus der Abschwächung hochvirulenter Stämme, die wesentliche Siedelungsfähigkeit und Befallfähigkeit zeigen. Die Kriterien zur Selektion dieser hochpathogenen S. typhimurium-Stämme vom Wildtyp, wie SL1344 (χ3339), UK-1 (χ3761) und 798, schlossen niedrige LD&sub5;&sub0;-Werte (siehe Tabelle 4) in Virulenz-Assays der Maus, antibiotische Empfindlichkeit, Besitz des Virulenzplasmids, Einfachheit der genetischen Manipulation (Bakteriophage P22HTint- oder P1-Empfindlichkeit, Transformierbarkeit und Einfachheit der Aufnahme mobilisierter Plasmide) und Colicinempfindlichkeit ein.
Die virulenten S. typhimurium-Stämme vom Wildtyp SL1344 (χ3339), 798 und UK-1 (χ3761) wurden genetisch modifiziert, wie unten beschrieben, unter Verwendung klassischer genetischer Methoden, die ähnlich denjenigen sind, die in Curtiss und Kelly, 1987, beschrieben sind. Die Strategie besteht aus der Mobilisierung der Deletionen der crp- und cya-Gene, die in S. typhimurium SL1344 isoliert und charakterisiert wurden (wie in Beispiel 1 beschrieben), durch Plazieren des Transposons Tn10 (das die Tetracyclinresistenz kodiert) in die Nähe der Δcya-12- oder Δcrp-11-Mutation und Transduzieren der verbundenen Erbanlagen in die hochvirulenten S. typhimurium- Stämme UK-1 (χ3761), 798 und SL1344 (χ3339) über P22HTint-vermittelte Transduktion mit Selektion für Tetracyclinresistenz und Durchmusterung auf einen Maltose-negativen Phänotyp. Das an Δcrp-11 gebundende zhc-1431::Tn10 und das an Δcya-12 gebundene zid-62::Tn10 wurden für diesen Zweck verwendet. Keine Insertion allein beeinflusst die Virulenz von S. typhimurium.
Die Transduktion der Gendeletionen mit den verbundenen Transposonen wurde erleichtert, indem zuerst ein Lysat des Bakteriophagen P22HTint mit hohem Titer auf dem S. typhimurium-Stamm χ3773, der die Δcrp-11- und zhc-1431::Tn10-Mutationen enthielt, und ein anderes Lysat auf dem S. typhimurium-Stamm χ3711, der die Δcya-12- und zid-62::Tn10-Mutationen enthielt, hergestellt wurden. Die resultierenden P22HTint-Lysate wurden dann verwendet, um die Erbanlagen in die Wildtyp-Empfängerstämme χ3339, 798 und χ3761 zu transduzieren.
Auf S. typhimurium χ3773 (Δcrp-11 zhc-1431::Tn10) vermehrtes P22HTint wurde verwendet, um die virulenten Stämme auf Tetracyclinresistenz mit Durchmusterung für Mal&supmin; zu transduzieren. Die Phagen-Bakterien-Infektionsmischungen wurden für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, bevor 100 ul-Proben auf MacConkey-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) ausgebreitet wurden, der 1% Maltose (Endkonzentration) enthielt, ergänzt mit 12,5 ug Tetracyclin/ml. Nach ca. 26 Stunden Inkubierung bei 37ºC wurden tetracyclinresistente Mal&supmin;-Transduktanden ausgelesen und auf dem gleichen Medium gereinigt. Das resultierende 798-Derivat wurde als χ3825 bezeichnet und das UK-1-Derivat wurde als χ3828 bezeichnet. Die Stämme χ3773, χ3825 und χ3828 haben den Genotyp Δcrp-11 zhc-1431::Tn10 (Tabelle 1.B.). Diese Stämme wurden in L-Bouillon + 12,5 ug Tetracyclin/ml herangezogen, und jeder wurde 1 : 10 in gepufferter Salzsäure mit Gelatine (BSG) verdünnt, 100 ul von jedem wurden auf fusarinsäurehaltigem (FA) Medium (Maloy und Nunn, 1981) ausgebreitet, und die Platten wurden ca. 36 Stunden bei 37ºC inkubiert. Fusarmsäureresistente Kolonien jedes Stammes wurden in 0,5 ml BSG ausgelesen und auf FA-Medium gereinigt. Gereinigte fusarinsäureresistente Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen und bei 37ºC bis zur Trübung herangezogen und auf Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit) in Gegenwart von vollständigem LPS und Auxotrophie überprüft. Die neuen Stämme wurden als χ3876 (798) und χ3954 (UK-1) bezeichnet, die beide den Genotyp Δcrp-11 [zhc-1431::Tn10] und χ3623 haben (SL1344 Δcrp-11 wurde ursprünglich wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert) (Tabelle 1.B.).
Da der Phänotyp der Cya&supmin;- und Crp&supmin;-Mutanten der gleiche ist (Mal&supmin;, Stl&supmin;, Mtl&supmin; etc.), wurde das Plasmid pSD110, das das klonierte crp&spplus;-Gen trägt und die Ampicillinresistenz verleiht (Schroeder und Dobrogosz, J. Bacteriol. 167 : 616-622 (1986)), verwendet, um temporär die Δcrp-Mutation im Chromosom zu vervollständigen, was die Identifizierung der Δcya-Mutation ermöglicht, wenn sie über Transduktion eingeführt wird. In L-Bouillon herangezogene Kulturen von χ3623, χ3876 und χ3954 wurden mit auf S. typhimurium χ3670, das das Plasmid pSD110 enthält, vermehrtem P22HTint transduziert (Tabelle 1.B.). Die Auswahl wurde durchgeführt auf MacConkey-Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml. Nach 26 Stunden wurde eine ampicillinresistente Mal&spplus;-Kolonie jedes Stammes ausgelesen und auf MacConkey-Agar + 1% Maltoseagar + 100 ug Ampicillin/ml gereinigt und als χ3938 (798) und χ3961 (UK-1), die beide den Genotyp Δcrp-11 Δzhc-1431::Tn10] pSD110&spplus; haben, und als χ3774 (SL1344) bezeichnet, das den Genotyp Δcrp-11 pSD110&spplus; hat.
Die Stämme χ3774, χ3938 und χ3961 wurden in L-Bouillon + 100 ug Ampicillin/ml herangezogen und wurden jeweils unabhängig mit auf χ3711 vermehrtem P22HTint transduziert, um die verknüpften Δcya-12- und zid-62::Tn10- Mutationen einzuführen. Die Transduktionsmischungen wurden auf MacConkey- Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml aufgezogen. Ampicillinresistente (pSD110&spplus;), tetracyclinresistente (zid-62::Tn10), Mal&supmin;- (Δcya)-Kolonien wurden ausgelesen und auf MacConkey- Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml gereinigt. Gereinigte Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen, bis zur Trübung herangezogen und die Stämme auf vollständiges LPS und Auxotrophie überprüft. Die resultierenden Stämme wurden als χ3978 (798) und χ3962 (UK-1), die beide den Genotyp Δcrp-11 Δ[zhc-1431::Tn10] pSD110&spplus; Δcya-12 zid-62::Tn10 haben, und χ3936 (SL1344) bezeichnet, das den Genotyp Δcrp-11 pSD110&spplus; Δcya-12 zid-62::Tn10 hat. Kulturen von χ3936, χ3978 und χ3962 wurden in L-Bouillon + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml bis zur Trübung herangezogen, 1 : 10 in BSG verdünnt, und 100 ul-Proben jeder Kultur wurden auf fusarinsäurehaltigem Medium ausgebreitet und ca. 36 Stunden bei 37ºC inkubiert. Fusarinsäureresistente Kolonien jedes Stammes wurden ausgelesen und auf FA-Medium gereinigt. Gereinigte FA-resistente Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen, bis zur Trübung herangezogen und dann auf den Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit), vollständiges LPS und Auxotrophie überprüft. Das pSD110-Plasmid ging gewöhnlich spontan aus den Stämmen während dieses Verfahrens verloren, was in einer Ampicillinempfindlichkeit resultierte, ausgenommen das SL1344-Derivat, das zwei Schritte zur Eliminierung von pSD110 beinhaltete. Die Endstämme wurden als χ4039 (798) und χ3985 (UK-1), die beide den Genotyp Δcrp-11 Δ[zhc-1431::Tn10] Δcya-12 Δ[zid-62::Tn10] haben, und als χ3939 (SL1344) bezeichnet, das den Genotyp Δcrp-11 Δcya-12 Δ[zid-62::Tn10] (Tabelle 1.B.).
Genotypische und phänotypische Stabilität der avirulenten Mutanten. Die Verfahren zur Bestimmung der Stabilität der Erbanlagen sind wie in Beispiel 1 beschrieben. Alle genotypischen und phänotypischen Anlagen aufgrund der Δcya-Δcrp-Mutationen waren vollständig stabil, ausgenommen die Bewegungsfähigkeit. Obwohl die Synthese funktioneller Geisseln und das Aufzeigen von Bewegungsfähigkeit von den Wildtyp-cya- und -crp-Genfunktionen abhängt, kann eine Suppressormutation im cfs- ("constitutive flagellar synthesis", aufbauende Geisselsynthese) Gen leicht selektiert werden, um zu verursachen, dass die Geisselsynthese und Bewegungsfähigkeit unabhängig von den cya- und crp-Genfunktionen ist. In den S. typhimurium-Δcya-Δcrp-Stämmen wurden bewegungsfähige Varianten während des Stamm-Konstruktionsverfahrens leicht ausgewählt. Da Immunität gegenüber flagellaren Antigenen schützend sein kann, wurden bewegungsfähige Varianten aller Impfstoffstämme ausgewählt.
Die S. typhimurium-Gruppe B O-Antigensynthese wurde bestätigt durch Objektträger-Agglutination mit Antiseren (Difco Laboratories, Detroit, MI) und durch P22HTint-Bakteriophagen-Empfindlichkeit durch die Luria-Weichagar-Überschichtungstechnik.
Die Fermentierung von Zuckern und das Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen der Doppelmutantenstämme waren identisch zu den Stämmen mit nur Δcya oder Δcrp, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Die Phänotypen beruhten wie erwartet auf den veröffentlichten Berichten über das Erfordernis für cyclisches AMP und das cyclische AMP-Rezeptorprotein für Katabolismusaktivitäten.
In jedem Schritt in der Konstruktion im Anschluss an die Auswahl eines fusarinsäureresistenten, tetracyclinempfindlichen Derivats wurde eine Untersuchung durchgeführt, ob tetracyclinresistente Revertanten/Mutanten mit höheren Häufigkeiten gewonnen werden konnten als sie für den tetracyclinempfindlichen Elternstamm vom Wildtyp beobachtet werden konnten. In allen Fällen wurden solche tetracyclinresistenten Revertanten/Mutanten nicht beobachtet.
Virulenz der Mutantenstämme für Mäuse. Vorläufige Informationen über die Virulenz von S. typhimurium-Mutantenstämmen wurden erhalten durch perorale Infizierung individueller Mäuse mit 10&sup8; Mutantenzellen und Aufzeichnung der Morbidität und Mortalität. Tabelle 4 stellt die Daten über die Morbidität und Mortalität von Mäusen dar, die peroral mit den S. typhimurium-Elternstämmen vom Wildtyp und den Δcya-12-Δcrp-11-Derivaten χ3985 und χ4039 infiziert wurden. TABELLE 4 Virulenz von S. typhimurium Δcya-12-, Δcrp-11-, Δcya-12- und Δcrp-11-Stämmen nach Impfung von BALB/c-Mäusen mit S. typhimurium Δcya-12- und/oder Δcrp-11-Stämmen
aGesund - keine sichtbaren Anzeichen von Krankheit; mässig - mässig krank; krank - sichtbar krank
bi.p. - Zellen wurden in 0,5 ml 5% Magenmucin vom Schwein übertragen
Wirksamkeit der Immunisierung mit avirulenten Mutanten. Tabelle 5 stellt Daten über die Fähigkeit der S. typhimurium Δcya-Δcrp-Mutanten χ3985 und χ4039 dar, Immunität auf anschliessende perorale Exposition mit 10&sup4;- fachen LD&sub5;&sub0;-Dosen von vollständig virulenten S. typhimurium-Wildtyp-Zellen zu induzieren. Unter diesen Hochdosis-Expositionen zeigen viele der Mäuse mässige Krankheit mit abnehmender Futteraufnahme, ausgenommen mit χ4039 immunisierte Mäuse, die gesund blieben und normal frassen und wuchsen. TABELLE 5 Wirksamkeit der Immunisierung mit avirulenten S. typhimurium Δcya-12- und/oder Δcrp-11-Mutanten zum Schutz gegen Exposition mit virulenten Elternstämmen vom Wildtyp

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt die Isolierung einer avirulenten Mikrobe, die eine Deletionsmutation besitzt, die das crp-Gen und ein benachbartes Gen umfasst, das ebenfalls die Virulenz von Salmonella bestimmt.
Bakterienstämme. Die verwendeten Escherichia coli- und Salmonella typhimurium-Stämme sind in Tabelle 1.A. und B. aufgeführt. Die Aufbewahrung und Lagerung dieser Stämme sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Medien. Komplex Medien zur routinemässigen Kultivierung, Zählung und Identifizierung der Bakterien sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Transduktion und Fusarinsäureselektion für Verlust von Tn10. Die Medien und Methoden sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Tierinfektiosität und Auswertung der schützenden Immunität. Die Virulenz und Immunitätserzeugung der S. typhimurium-Stämme wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Isolierung eines S. typhimurium-Stammes mit der Δcrp-10-Mutation. Wie in Beispiel 1 beschrieben, verlieh eine von zehn in χ3605 isolierten Δcrp- Mutationen eine Auxotrophie für Arginin (aufgrund der Deletion von arqD) und Cystein (aufgrund der Deletion von cysG). Die Mutation im S. typhimurium SL1344-Stamm χ3622 wurde ursprünglich als Δcrp-10 bezeichnet, aber wird jetzt wegen der Auxotrophie für Cystein als Δ[crp-cysG]-10 bezeichnet. Eine Gruppe von fünf oral mit 10&sup9; χ3622-Zellen infizierten BALB/c-Mäusen blieb gesund und war völlig unbeeinflusst (Tabelle 3). Ferner erhielten diese Mäuse eine hochgradige Immunität auf orale Exposition mit 10&sup8; χ3339- Stammzellen (Tabelle 3).
Eine Reihe von Stämmen wurde konstruiert, um unabhängig jede der phänotypischen Eigenschaften von χ3622 auszuwerten. Das Plasmid pSD110, das das klonierte crp&spplus;-Gen trägt und Ampicillinresistenz verleiht (Schroeder und Dobrogosz, J. Bacteriol. 167 : 616-622 (1986)), wurde verwendet, um die Δcrp-Mutation im Chromosom zu vervollständigen. Eine L-Bouillonkultur von χ3622 wurde mit auf S. typhimurium χ3670, das das Plasmid pSD110 enthält, vermehrtem P22HTint transduziert. Die Selektion wurde durchgeführt auf MacConkey-Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml. Nach 26 Stunden wurde eine ampicillinresistente Mal&spplus;-Kolonie ausgelesen und auf MacConkey-Agar + 1% Maltoseagar + 100 ug Ampicillin/ml gereinigt und als χ3706 bezeichnet. χ3706 wurde peroral an Mäuse verabreicht und aus der Milz erneut isoliert. Der vom Tier ausgeschiedene Stamm wurde als χ3737 bezeichnet. Zwei andere crp-Mutanten, χ3605 (crp-773::Tn10) und χ3623 (Δcrp-11), die nicht die auxotrophen Arg&supmin;- oder Cys&supmin;-Anlagen verleihen, wurden ebenfalls mit dem pSP110-Plasmid durch Transduktion vervollständigt und als χ3731 bzw. χ3774 bezeichnet. S. typhimurium-Stämme, die unabhängig cysG- und arq-Mutationen tragen, wurden konstruiert und als χ3910 (cysG::Tn10), χ4063 und χ4071 (arq::Tn10) bezeichnet.
Zwei andere hochpathogene S. typhimurium-Stämme wurden zur Abschwächung durch Einführung der Δcrp-10-Mutation ausgewählt, χ3761 (UK-1) und 798 sind virulente befallende Stämme, die aus einem sterbenden Pferd bzw. Schwein isoliert wurden, mit LD&sub5;&sub0;-Werten in Mäusen von ca. 1 · 10&sup5; KBE. Die Transduktion von Δcrp-10 mit dem verknüpften Transposon zhc-1431::Tn10 wurde erleichtert, indem zuerst ein Lysat des Bakteriophagen P22HTint mit hohem Titer auf dem S. typhimurium-Stamm χ3712 hergestellt wurde (siehe Tabelle 1.B.). Das Phagenlysat wurde dann verwendet, um die Erbanlagen in die Empfängerstämme vom Wildtyp χ3761 und 798 zu transduzieren. Tetracyclinresistente Kolonien wurden ausgewählt und auf die Mal&supmin;-, Arg&supmin;- und Cys&supmin; -Phänotypen durchmustert, und das resultierende 798-Derivat wurde als χ4246 und das χ3761- (UK-1) Derivat als χ4248 bezeichnet (Tabelle 1).
Die crp-Mutation wurde durch Einführung von pSD110, das das crp&spplus;- Allel vom Wildtyp trägt, in χ4246 und χ4248 vervollständigt. In L-Bouillon herangezogene Kulturen von χ4246 und χ4248 wurden mit auf S. typhimurium χ3670, das das Plasmid pSD110 enthält, vermehrtem P22HTint transduziert (Tabelle 1). Die Auswahl wurde auf einem MacConkey-Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml getroffen. Nach 26 Stunden wurde eine Ampicillin-Mal&spplus;-Kolonie jedes Stammes ausgelesen und auf dem gleichen Medium gereinigt und als χ4247 (798) und χ4262 (UK-1) bezeichnet, die beide den Genotyp pSD110&spplus;/Δcrp-10 zhc-1431::Tn10 haben.
Virulenz von S. typhimurium χ3622, χ3731, χ3737, χ3774, χ3910, χ4063 und χ4071. Tabelle 6 stellt Daten über die Morbidität und Mortalität von peroral mit den S. typhimurium-Stämmen χ3622, χ3731, χ3737, χ3774, χ3910, χ4063 und χ4071 infizierten Mäusen dar. Der Stamm χ3737 war vollständig avirulent für Mäuse, die das 10&sup4;-fache der LD&sub5;&sub0;-Dosis für den χ3339- Elternstamm vom Wildtyp erhielten. Während des 30-tägigen Beobachtungszeitraums schienen die Mäuse niemals krank zu sein. Als Kontrolle für dieses Experiment wurde die crp-773::Tn10-Mutation in χ3605 durch pSD110 zum Wildtyp Crp&spplus;-Phänotyp (χ3731) vervollständigt, und Mäuse wurden infiziert und starben. Dosen von ca. 1 · 10&sup5; KBE töteten 4 von 5 Mäusen, die p.o. mit χ3731 und χ3774 (pSD110&spplus;/Δcrp-11] geimpft waren. Um die Virulenz der Stämme mit den Cys&supmin;- und Arg&supmin;-Phänotypen unabhängig zu untersuchen, wurden die Stämme χ3910 (cysG::Tn10), χ4063 (arq::Tn10) und χ4071 (arq::Tn10) p.o. an BALB/c-Mäuse verabreicht. χ3910, χ4063 und χ4071 töteten die Mäuse, wenn ähnliche oder niedrigere Dosen p.o. verabreicht wurden. Deshalb bestand die mit der Δ[crp-cysG]-10-Mutation verbundene Avirulenz nicht allein aufgrund der Deletion des crp-Gens und wurde nicht durch Deletion von einem der arqD- oder cysG-Loci verliehen. Vielmehr muss ein anderes, für die S. typhimurium-Virulenz notwendiges Gen im Bereich des Chromosoms in der Nähe des crp-Gens lokalisiert sein. TABELLE 6 Virulenz von S. typhimurium SL1344 Δ[crp-cysG]-10-, Crp&spplus;/crp::Tn10- und Crp&spplus;/Δ[crp-cysG]-10-, arq::Tn10-, cysG::Tn10-Mutanten in BALB/c-Mäusen 30 Tage nach peroraler Impfung
a der gestorbenen Tiere
b gesund - keine sichtbaren Krankheitszeichen; mässig - mässig krank, schlecht - sichtbar krank
Wirksamkeit der Immunisierung mit χ3622, χ3737, χ4247 und χ4262. Die Daten über die Fähigkeit von χ3522, χ3737, χ4247 und χ4262, Immunität auf anschliessende p.o. oder i.p. Exposition mit den 10&sup4;-fachen LD&sub5;&sub0;-Dosen von vollständig virulenten S. typhimurium-Zellen vom Wildtyp zu induzieren, sind in Tabelle 7 dargestellt. Alle Mäuse, denen übermässige Dosen des Elternstammes vom Wildtyp gegeben wurde, erschienen niemals krank während der 30-tägigen Dauer des Experiments. Deshalb deletiert die Δ[crp-cysG]-10- Mutation wenigstens zwei Gene, von denen beide S. typhimurium vollständig avirulent und hoch immunitätserzeugend machen. TABELLE 7 Wirksamkeit der Immunisierung mit avirulenten S. typhimurium Δ[crp-cysG]-10-Mutanten zum Schutz gegen Exposition mit virulenten Elternstämmen vom Wildtyp
Isolierung des S. typhimurium-Stammes mit der Δcrp-14-Mutation. Da ein ungenaues Ausschneiden von crp-773::Tn10 die Deletion von Genen erzeugte, die sich von arqD bis cysG erstrecken, wurde eine andere Strategie entwickelt, um die Position des Gens zu lokalisieren, das die Avirulenz im zu crp benachbarten Bereich verleiht. Zwanzig unabhängige Deletionsmutanten von χ3910 (cysG::Tn10) wurden auf fusarinsäurehaltigem Medium ausgewählt und auf Tetracyclinempfindlichkeit und Maltose-negativen Phänotyp durchmustert. Eines von zwanzig fusarinsäureresistenten Derivaten von χ3910 hatte den Genotyp Δ[crp-cysG]-14 und verlieh Auxotrophie für Histidin und Cystein, aber nicht für Arginin. Dieser als χ3931 bezeichnete Stamm wurde mit einem auf χ3670 herangezogenen P22HTint-Lysat transduziert, um pSD110 einzuführen, das das crp&spplus;-Gen vom Wildtyp trägt. Ein ampicillinresistenter, Maltose-positiver Transduktand wurde ausgelesen und auf dem gleichen Medium gereinigt, und der resultierende Stamm wurde als χ3955 bezeichnet.
Virulenz von S. typhimurium pSD110&spplus;/Δ[crp-cysG]-14 χ3955. Tabelle 7 zeigt die Morbidität und Mortalität von peroral mit S. typhimurium χ3955 infizierten Mäusen. Der Stamm χ3955 war vollständig avirulent für Mäuse, die ca. 10&sup9; KBE erhielten. Die Mäuse erschienen niemals krank während des 30-tägigen Zeitraums.
Wirksamkeit der Immunisierung mit χ3955. Tabelle 7 zeigt die Fähigkeit von χ3955, eine Immunität gegen anschliessende p.o. Exposition mit der 10&sup4;-fachen LD&sub5;&sub0;-Dosis von vollständig virulenten S. typhimurium-Zellen vom Wildtyp zu induzieren. Mäuse, denen übermässige Dosen des Elternstammes gegeben wurde, erschienen niemals krank während der 30-tägigen Dauer des Experiments.
Besiedelung des Darmtrakts, von GALT und Milz durch χ3622 (Δ[crp- cysG]-10) und χ3737 (pSD110&spplus; Δ[crp-cysG]-10, relativ zum Wildtyp-Stamm χ3339. S. typhimurium χ3622 und χ3737 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben herangezogen und zur Oralimpfung von 8 Wochen alten weiblichen BALB/c- Mäusen hergestellt. Die Tiere wurden 1, 3, 5 und 7 Tage nach der p.o. Impfung mit 9,4 · 10&sup8; KBE (χ3622), 1,2 · 10&sup9; KBE (χ3737) oder 1,1 · 10&sup9; KBE (χ3339) getötet. Drei Mäuse pro Gruppe wurden zufällig ausgewählt und getötet, und Gewebeproben wurden entnommen. Die Milz, Peyer-Haufen, ein 10 cm-Abschnitt des Ileums und der Dünndarminhalt von jeder Maus wurden in Polypropylenröhrchen mit BSG gegeben, mit einem Brinkmann-Gewebehomogenisator homogenisiert und auf Eis gegeben. Unverdünnte oder verdünnte Proben (100 ul) wurden direkt auf MacConkey-Agar + 1% Lactose + 50 ug Streptomycin/ml (χ3339 und χ3737) und MacConkey-Agar + 1% Maltose + 50 ug Strep tomycin/ml (χ3622) aufgezogen, und die Platten wurden für 26 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Titer in den jeweiligen Geweben wurden für jeden Zeitraum bestimmt und das geometrische Mittel für 3 Mäuse pro Gruppe zu jedem Zeitpunkt der Probenentnahme berechnet.
Die zusätzliche abschwächende Mutation in χ3622, die noch im Crp&spplus;- (pSD110&spplus;)-Derivat χ3737 vorhanden ist, vermindert sehr stark die Fähigkeit, effektiv tiefe Gewebe zu besiedeln. Das verantwortliche Gen, das durch die Δ[crp-cysG]-10-Mutation deletiert wird, wurde deshalb als Cdt&supmin; bezeichnet. Der Cdt&supmin;-Phänotyp von χ3622 und χ3737 manifestiert sich ebenfalls durch die Abwesenheit jeglicher Milzvergrösserung, die im Anschluss an p.o. Impfung von Mäusen mit S. typhimuriumm χ3623 beobachtet wird, das die Δcrp-11- Mutation aufweist, oder mit verschiedenen anderen Stämmen mit kombinierten Δcrp- und Δcya-Mutationen (Curtiss und Kelly, 1987). Der Stamm χ3737 wuchs schneller als χ3622. Die zusätzlich abschwächende Mutation in χ3622 vermindert nicht die Wachstumsgeschwindigkeit wie es die crp-Mutation tut.
Auf der Grundlage der Isolierung und Analyse der Deletionsmutationen für die gezeigten Phänotypen wird geschlossen, dass die Reihenfolge der Gene im S. typhimurium-Chromosom arqD crp cdt cysG ist.
Es ist ersichtlich, dass der Einschluss der Δ[crp-cysG]-10- oder Δ[crp-cysG]-14-Mutationen, die ebenfalls Δcdt-Mutationen sind, die Sicherheit von abgeschwächten Salmonella-Lebendimpfstoffstämmen erhöhen würde, während ihre Immunitätserzeugung nicht vermindert wird. Dies könnte insbesondere wichtig für Wirt-angepasste invasive Salmonella-Arten sein, wie S. typhi, S. paratyphi A (S. schottmuelleri), S. paratyphi B (S. hirshfeldii), S. paratyphi C (die den Menschen infizieren), S. choleraesuis (infiziert Schweine), S. dublin (infiziert Rinder), S. gallinarum und S. pullorum (infizieren beide Geflügel), ebenso wie nicht-wirtspezifische invasive Salmonella-Arten, wie S. typhimurium und S. enteritidis.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von avirulenten Mikroben durch die Einführung von Deletionsmutationen, die die cAMP-Synthese und - Verwendung beeinflussen, und eines benachbarten Gens, das ebenfalls die Virulenz von Salmonella bestimmt, indem die Besiedelung von tiefen Geweben beeinflusst wird, und die Charakterisierung von Stämmen mit zwei Deletionsmutationen hinsichtlich Stabilität des Phänotyps, vollständige Avirulenz und hohe Immunitätserzeugung.
Bakterienstämme. Die verwendeten Escherichia coli- und Salmonella typhimurium-Stämme sind in Tabelle 1.A. und B. aufgeführt. Die Aufbewahrung und Lagerung dieser Stämme sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Medien. Komplexe Medien zur routinemässigen Kultivierung, Zählung und Identifizierung von Bakterien sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Transduktion und Fusarinsäureselektion für Verlust von Tn10. Die Medien und Methoden sind wie in Beispiel 1 beschrieben.
Konstruktion von S. typhimurium-Stämmen mit Δcya-12- und Δ[crp-cysG]-10-Deletionsmutationen. Die besten Impfstoffstämme hinsichtlich der Wirksamkeit resultieren wahrscheinlich aus der Abschwächung hochvirulenter Stämme, die wesentliche Besiedelungsfähigkeit und Ausbreitungsfähigkeit zeigen. Die Kriterien zur Auswahl dieser hochpathogenen S. typhimurium-Stämme vom Wildtyp, wie SL1344 (χ3339), UK-1 (χ3761) und 798, wurden in Beispiel 2 beschrieben.
Die virulenten S. typhimurium-Stämme vom Wildtyp SL1344, 798 und UK-1 wurden genetisch modifiziert, wie nachfolgend beschrieben, unter Verwendung klassischer genetischer Methoden, die ähnlich denjenigen sind, die in Curtiss und Kelly, 1987, beschrieben sind. Die Strategie besteht aus der Mobilisierung von Deletionen von crp- und cya-Genen, die in S. typhimurium SL1344 isoliert und charakterisiert wurden (wie in Beispiel 1 beschrieben), durch Plazieren des Transposons Tn10 (das Tetracyclinresistenz kodiert) in die Nähe der Δcya-12- oder Δ[crp-cysG]-10-Mutation und Transduzieren der verknüpften Anlagen in die hochvirulenten S. typhimurium-Stämme UK-1 (χ3761), 798 und SL1344 (χ3339) über P22HTint-vermittelte Transduktion mit Selektion für Tetracyclinresistenz und Durchmusterung für einen Maltosenegativen Phänotyp. Das an Δ[crp-cysG]-10 gebundene zhc-1431::Tn10 und das an Δcya-12 gebundene zid-62::Tn10 wurden für diesen Zweck verwendet. Keine der Insertionen allein beeinflusst die Virulenz von S. typhimurium.
Transduktion der Gendeletionen mit dem verknüpften Transposon wurde erleichtert, indem zuerst ein Lysat des Bakteriophagen P22HTint mit hohem Titer auf dem S. typhimurium-Stamm χ3712, der die Δ[crp-cysG]-10- und zhc-1431::Tn10-Mutationen enthält, und ein anderes Lysat auf dem S. typhimurium-Stamm χ3711 hergestellt wurde, der die Δcya-12- und zid-62::Tn10-Mutationen enthält. Die resultierenden P22HTint-Lysate wurden dann verwendet, um die Erbanlagen in die Empfängerstämme vom Wildtyp χ3339, 798 und χ3761 zu transduzieren.
Auf S. typhimurium χ3712 (Δ[crp-cysG]-10 zhc-1431::Tn10) vermehrtes P22HTint wurde verwendet, um die virulenten Stämme auf Tetracyclinresistenz mit Durchmusterung für Mal&supmin; zu transduzieren. Die Phagen-Bakterien-Infektionsmischungen wurden für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, bevor 100 ul- Proben auf MacConkey-Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) ausgebreitet wurden, der 1% Maltose (Endkonzentration) enthält, ergänzt mit 12,5 ug Tetracyclin/ml. Nach ca. 26 Stunden Inkubierung bei 37ºC wurden tetracyclinresistente Mal&supmin;-Transduktanden ausgelesen und auf dem gleichen Medium gereinigt. Das resultierende 798-Derivat wurde als χ3777 bezeichnet, und das UK-1-Derivat wurde als χ3779 bezeichnet. Die Stämme χ3712, χ3777 und χ3779 haben alle den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 zhc-1431::Tn10 (Tabelle 1.B.). χ3777 und χ3779 wurden in L-Bouillon + 12,5 ug Tetracyclin/ml herangezogen, und jedes wurde 1 : 10 in gepufferter Salzlösung mit Gelatine (BSG) verdünnt, 100 ul von jedem wurden auf fusarinsäurehaltiges (FA)-Medium (Maloy und Nunn, 1981) ausgebreitet, und die Platten wurden ca. 36 Stunden bei 37ºC inkubiert. Fusarinsäureresistente Kolonien jedes Stammes wurden in 0,5 ml BSG ausgelesen und auf FA-Medium gereinigt. Gereinigte fusarinsäureresistente Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen und bei 37ºC bis zur Trübung herangezogen und auf Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit), Gegenwart von vollständigen LPS und Auxotrophie überprüft. Die neuen Stämme wurden als χ3784 (UK-1) und χ3806 (798) bezeichnet, die beide den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 Δ[zhc-1431::Tn10] haben. χ3622 (SL1344 Δ[crp-cysG]-10) wurde ursprünglich isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben (Tabelle 1.B.).
Da der Phänotyp von Cya&supmin;- und Crp&supmin;-Mutanten der gleiche ist (Mal&supmin; Stl&supmin;, Mtl&supmin; etc.), wurde das Plasmid pSD110, das das klonierte crp&spplus;-Gen trägt und Ampicillinresistenz verleiht (Schroeder und Dobrogosz, J. Bacteriol. 167 : 616-622 (1986)), verwendet, um die Δcrp-Mutation im Chromosom temporär zu vervollständigen, was die Identifizierung der Δcya- Mutation ermöglicht, wenn sie über Transduktion eingeführt wird. In L-Bouillon herangezogene Kulturen von χ3622, χ3784 und χ3806 wurden mit auf S. typhimurium χ3670, das das Plasmid pSD110 enthält, vermehrtem P22HTint transduziert (Tabelle 1). Die Auswahl wurde durchgeführt auf MacConkey-Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml. Nach 26 Stunden wurde eine ampicillinresistente Mal&spplus;-Kolonie jedes Stammes ausgelesen und auf MacConkey-Agar + 1% Maltose-Agar + 100 ug Ampicillin/ml gereinigt und als χ3901 (798) und χ3945 (UK-1), die beide den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 Δ[zhc-1431::Tn10] pSD110&spplus; haben, und als χ3706 (SL1344) bezeichnet, das den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 pSD110&spplus; hat.
Die Stämme χ3706, χ3901 und χ3945 wurden in L-Bouillon + 100 ug Ampicillin/ml herangezogen und wurden jeweils unabhängig mit auf χ3711 vermehr tem P22HTint transduziert, um die verknüpften Δcya-12- und zid-62::Tn10- Mutationen einzuführen. Die Transduktionsmischungen wurden auf MacConkey- Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml aufgezogen. Ampicillinresistente (pSD110&spplus;), tetracyclinresistente (zid-62::Tn10), Mal&supmin;-(Δcya)-Kolonien wurden ausgelesen und auf MacConkey- Agar + 1% Maltose + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml gereinigt. Gereinigte Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen, bis zur Trübung herangezogen und die Stämme auf vollständiges LPS und Auxotrophie überprüft. Die resultierenden Stämme wurden als χ3902 (798) und χ3956 (UK-1), die beide den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 Δ[zhc-1431::Tn10] pSD110&spplus; Δcya-12 zid-62::Tn10 haben, und als χ3722 (SL1344) bezeichnet, das den Genotyp Δ(crp-cysG]-10 pSD110&spplus; Δcya-12 zid-62::Tn10 hat. Kulturen von χ3722, χ3902 und χ3956 wurden in L-Bouillon + 100 ug Ampicillin/ml + 12,5 ug Tetracyclin/ml bis zur Trübung herangezogen, 1 : 10 in BSG verdünnt, und 100 ul- Proben jeder Kultur wurden auf fusarinsäurehaltigem Medium ausgebreitet und ca. 36 Stunden bei 37ºC inkubiert. Fusarinsäureresistente Kolonien jedes Stammes wurden ausgelesen und auf FA-Medium gereinigt. Gereinigte FA-resistente Kolonien wurden in L-Bouillon ausgelesen, bis zur Trübung herangezogen und dann auf Verlust von Tn10 (Tetracyclinempfindlichkeit), vollständiges LPS und Auxotrophie überprüft. Das pSD110-Plasmid ging gewöhnlich spontan aus den Stämmen während dieses Verfahrens verloren, was in einer Ampicillinempfindlichkeit resultierte, ausgenommen die SL1344- und UK-1- Derivate, die zwei Schritte zur Eliminierung von pSD110 beinhalteten. Die Endstämme wurden als χ3958 (UK-1) und χ4038 (798), die beide den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 Δ[zhc-1431::Tn10] Δcya-12 Δ[zid-62::Tn10] haben, und als χ3724 (SL1344) bezeichnet, das den Genotyp Δ[crp-cysG]-10 Δcya-12 Δ[zid-62::Tn10] hat (Tabelle 1.B.).
Genotypische und phänotypische Stabilität der avirulenten Mutanten. Die Methoden zur Bestimmung der Stabilität der Erbanlagen sind wie in Beispiel 1 beschrieben. Alle genotypischen und phänotypischen Anlagen aufgrund der Δcya- Δcrp-Mutationen waren vollständig stabil, ausgenommen die Bewegungsfähigkeit. Obwohl die Synthese funktioneller Geisseln und das Aufzeigen voh Bewegungsfähigkeit von den Wildtyp-cya- und -crp-Genfunktionen abhängig ist, kann eine Suppressormutation im cfs- (aufbauende Geisselsynthese) Gen leicht ausgewählt werden, um zu verursachen, dass die Geisselsynthese und Bewegungsfähigkeit von den cya- und crp-Genfunktionen unabhängig sind. In den S. typhimurium-Δcya-Δcrp-Stämmen wurden die bewegungsfähigen Varianten während des Stammkonstruktionsverfahrens auf ein fache Weise ausgewählt. Da Immunität gegenüber flagellaren Antigenen schützend sein kann, wurden bewegungsfähige Varianten aller Impfstoffstämme ausgewählt.
Die S. typhimurium-Gruppe B O-Antigen-Synthese wurde durch Objektträger-Agglutination mit Antiseren (Difco Laboratories, Detroit, MI) und durch P22HTint-Bakteriophagenempfindlichkeit durch die Luria-Weichagar- Überschichtungstechnik bestätigt.
Die Fermentierung von Zuckern und das Wachstum auf verschiedenen Kohlenstoffquellen der Doppelmutantenstämme waren identisch zu den Stämmen mit nur Δcya oder Δcrp, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Die Phänotypen beruhten wie erwartet auf den veröffentlichten Berichten über die Anforderung für cyclisches AMP und das cyclische AMP-Rezeptorprotein für Katabolismusaktivitäten.
In jedem Schritt in der Konstruktion im Anschluss an die Selektion eines fusarinsäureresistenten tetracyclinempfindlichen Derivats wurde eine Untersuchung durchgeführt, ob tetracyclinresistente Revertanten/Mutanten in höheren Häufigkeiten gewonnen werden konnten als sie für den tetracyclinempfindlichen Elternstamm vom Wildtyp beobachtet werden konnten. In allen Fällen wurden solche tetracyclinresistenten Revertanten/Mutanten nicht beobachtet.

BEISPIEL 5

Konstruktion von rekombinanter avirulenter Salmonella, die menschliches LDH-C exprimiert.

A. pYA3042

pYA810 (Fig. 3) ist ein asd&spplus;-klonierender Vektor, der zur Verwendung mit avirulenten Δcya-Δcrp-Δasd-Salmonella-Impfstoffstämmen geeignet ist. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pYA292 (Fig. 2). Die multiple Klonierungsstelle in pYA810 (Fig. 4) bietet mehrere Strategien zur Einführung klonierter Sequenzen, deren Expression unter der Kontrolle des konstitutiv exprimierenden trc-Promotors stehen wird. Ein repräsentatives rekombinantes Plasmid, das unter Verwendung von pYA810 konstruiert wurde, ist pYA3042 (Fig. 5). Dieses Plasmid enthält die menschliche Sperma-spezifische LDH-C- Sequenz und wurde als eine Proteinfusion konstruiert, die durch den trc- Promotor von pYA810 getrieben wird. Die Insertion wurde als ein SmaI-HindIII-Fragment aus pHUM-LDH-C erhalten und in die SmaI-HindIII- Stelle von pYA810 insertiert. pYA3042 wurde ursprünglich isoliert durch Transformieren der oben beschriebenen ligierten Fragmente in χ6212 (Δ(arqF-lacZYA)U169 qlnV44 λ&supmin; φ80d/lacZΔM15 qyrA96 recA1 relA1 endA1 Δzhf-z:Tn10 hsdR17), das pYA232 enthält (Fig. 6), welches den lacIq- Repressor auf einem pSC101-Replikon bereitstellt. Es wurde durch Western- Blot-Analyse gezeigt, dass zwei Klone in diesem E. coli-Wirt, die Insertionen der entsprechenden Grösse (1 kb) in der korrekten Orientierung enthalten, ein Protein erzeugen, das mit gegen Maus-LDH-C herangezogenen polyklonalen Antiseren reagiert, mit der Massgabe, dass die Stämme in Gegenwart des Induktors IPTG herangezogen wurden, um die lacIq-Repression des trc-Promotors zu überwinden. Einer dieser als pYA3042 bezeichneten isolierten rekombinanten Klone (Fig. 5) wurde dann direkt in den Δcya-Δcrp- Δasd-S. typhimurium-Stamm χ3987 durch Elektroporation eingeführt. Western- Blot-Analyse bestätigte erneut die Erzeugung eines Proteins, das mit den polyklonalen Antimaus-LDH-C-Antiseren reagiert. Ein solches immunologisch reaktives Protein war in χ3987, das den Klonierungsvektor pYA810 allein enthält, nicht nachweisbar.

B. pYA3054

pKKHC4 (Fig. 7 und LeVan und Goldberg, 1991) ist ein Plasmid, das einen offenen Leserahmen mit 966 Basenpaaren enthält, der menschliches Sperma-spezifisches LDH-C kodiert. Die LDH-C-cDNA wurde aus einer menschlichen λgt11-Hoden-cDNA-Expressionsbibliothek durch Durchmusterung mit Kaninchen-Antiseren und monoklonalen Antikörpern gegen Maus-LDH-C&sub4; kloniert (Millan et al. 1987). Der offene Leserahmen wurde in die XmaI- Stelle von pKK233-3 (Pharmacia) durch Verdauung mit HincII und DraI und Ligierung der XmaI-Linker an beide Enden kloniert.
Das Fragment, das das LDH-C-Gen enthält, wurde erhalten als ein 1,1 kb EcoRI-HindIII-Fragment im Anschluss an teilweise EcoRI- und vollständige HindIII-Verdauung von pKKHC4. Dieses Fragment wurde dann in die EcoRI-HindIII-Stellen von pYA810 mit Expression von LDH-C und ohne zusätzliche Aminosäuren insertiert, getrieben durch den trc-Promotor, wie in Fig. 8 gezeigt. Der LDH-C-Klon pYA3054, der als Folge der Elektroporation der Ligierungsmischung in den E. coli-Wirt χ6212 erhalten wurde (pYA232, Spezifizierung von LacIq (Fig. 6)), erzeugte eine Bande von ca. 35 kDa als Folge von IPTG-Induktion, die mit Kaninchen-LDH-C- (mäuseartig) Antiseren auf Western reagierte, während sie ein funktional aktives LDH-C- Tetramer erzeugte, wie durch LDH-Assays auf nicht-denaturierenden Acrylamidgelen bestimmt. Dieser funktionale pYA3054-LDH-C-Klon wurde dann direkt durch Elektroporation in χ3987 (Δcya Δcrp Δasd) eingeführt, um einen S. typhimurium-Impfstoffstamm zu erzeugen, der in der aufbauenden Expression von LDH-C resultierte.
Vor der Immunisierung von Mäusen mit diesem Stamm wurden Phänotyp, Wachstumsgeschwindigkeit und Plasmidstabilität relativ zum Impfstoffstamm mit dem Vektor allein, χ3987(pYA810), verglichen. Sowohl χ3987(pYA810) als auch χ3987(pYA3054) wurden auf Phagen P22-Empfindlichkeit (glattes LPS), Wachstum auf definiertem Medium (Prototrophie), Unfähigkeit zur Fermentierung von Maltose (Δcya Δcrp Mal&supmin;-Phenotyp), Plasmidgehalt (Gegenwart von 90 kb-Virulenzplasmid und 4,4 kb pYA3054) und Tetracyclinempfindlichkeit (Tcs, das kein lacIq-Repressorplasmid pYA232 anzeigt) untersucht. Isolierte Elektroporanten für sowohl den Vektor pYA810 als auch den LDH-C-Klon pYA3054, die den korrekten Phänotyp P22s, Prot, Mal&supmin;, Tcs aufwiesen, wurden auf Wachstumsrate in Lenox-Bouillon und strukturelle und aufspaltende Plasmidstabilität in Lenox-Bouillon + Diaminopimelinsäure (DAP 50 ug/ml) für 60 Generationen überprüft. Die aufspaltende und strukturelle Plasmidstabilität von sowohl pYA810 als auch pYA3054 wurden nach ca. 60 Generationen Wachstum in DAP-haltiger Lenox-Bouillon ohne Durchlüftung bestimmt, sowohl durch Plasmid-DNA-Analyse auf Agarosegelen als auch durch funktionalen LDH- Protein-Gel-Assay. Diese Untersuchungen ergaben, dass 10/10 Isolaten von χ3987 (pYA3054) ein 4,4 kb-Plasmid enthielten und aktives LDH-C erzeugten, während aufgezogene Kopie-Kolonien aus LA + DAP (50 ug/ml) auf LA ergaben, dass 99,2% der χ3987-(pYA3054) und mehr als 99,3% der χ3987-(pYA810) Population ein Asd&spplus;-Plasmid enthielten. Auf der Grundlage dieser Information wurde festgelegt, dass χ3987 (pYA3054) zur Impfung von Mäusen akzeptabel ist.
Das pYA3054-Konstrukt kann nun in andere Δcya Δcrp Δasd-Impfstoffstämme eingeführt werden, wie die oben beschriebenen aus S. typhi stammenden, um menschliche Wirtsspezifität zu verleihen. Zusätzliche Konstrukte, die LDH-C (menschlich) in höheren oder niedrigeren Gehalten erzeugen, als periplasmatische oder Oberflächenkomponenten oder an die B-Untereinheit des labilen Toxins (LT) fusioniert, das durch Darmgift erzeugendes E. coli spezifiziert ist, können nach Bedarf für Vergleiche hergestellt werden.

BEISPIEL 6

Konstruktion von rekombinanter avirulenter, menschliches LDH-C exprimierender Salmonella mit der E. coli hitzelabilen Toxin B-Untereinheit (LT-B)

A. pYA3095 und pYA3097

Zwei Konstrukte, die sowohl LDH-C als auch LT-B exprimieren, würden als Coexpressionskonstrukte unter Verwendung des LT-B-Vektors pYA3048 hergestellt (nachfolgend beschrieben). Die B-Untereinheit von LT-B dient als oraler Hilfsstoff und bindet ebenfalls an Agarose und GM-1-Gangliosid und erleichtert somit die Reinigung der daran fusionierten Proteine.
pYA3048 (Fig. 9A) ist ein Derivat von pYA810, das die LT-B-Sequenz einschliesst und einen multiplen Klonierungsbereich plus zwei Translations- Terminierungskodonen in unterschiedlichen Leserahmen (Fig. 9B) am Terminus von LT-B besitzt.
pYA3095 wurde unter Verwendung von pKKHC4 und pYA3048 konstruiert, wie in Fig. 10 dargestellt. Die Konstruktion resultierte im LDH-C-Gen aus pKKHC4 mit dem tac-Promotor stromabwärts des LT-B-Gens mit seinem trc- Promotor. Obwohl dieser Klon zuerst nicht das Wachstum des E. coli-Wirts zu behindern schien, der den lacIq-Repressor auf pYA232 (Fig. 6), χ6212(pYA232), enthielt, wurde nach Induktion mit 0,5 mM IPTG ein schwaches Wachstum beobachtet. Schwaches Wachstum wurde ebenfalls beobachtet, wenn dieser Klon durch Elektroporation in χ3987 eingeführt wurde. Bei der Durchführung von Westerns zur Bestimmung, ob sowohl LT-B als auch LDH-C durch χ3987(pYA3095) erzeugt würden, konnten nur niedrige Gehalte von LT-B nachgewiesen werden.
Ein alternatives Konstrukt, pYA3097, wurde hergestellt, wie in Fig. 10 dargestellt. Dieses Plasmid wurde durch Insertieren des 1,6 kb BqlII-Fragments von pYA3054, das den LDH-C kodierenden Bereich mit dem trc- Promotor und dem 5S T1T2-Terminator enthält, in eine BqlII-Stelle von pYA3048 konstruiert. Das Plasmid pYA3097, erhalten aus dieser Ligierung, resultierte in LDH-C mit dem gegen den Uhrzeigersinn orientierten trc- Promotor. Dieser Klon erschien nicht nachteilig bei Induktion mit IPTG. Bei Übertragung in χ3987 waren die Wachstumsraten langsamer und Rekombinationsereignisse fanden frühzeitig in den Abspaltungs-Stabilitätstests statt, wobei der LDH-C-Anteil des Klons eliminiert wurde. Diese LDH- Isolate wurden hervorstechend in der Population und stellten mehr als 90% der Population dar, auf der Grundlage von Aktivitäts-Assays und Plasmidgrössenanalyse von 10 Isolaten.

B. Andere LDH-C/LT-B-Konstrukte

Konstrukte mit einem einzelnen Promotor können wie folgt hergestellt werden. Um eine Operonfusion von LT-B und LDH-C unter der Kontrolle des trc-Promotors zu erzeugen, kann ein synthetischer Primer konstruiert werden, der eine ribosomale Bindungsstelle (RBS) 10 bis 15 Bp vor dem LDH-C-Start enthält. Die Polymerasekettenreaktion kann dann verwendet werden, um den LDH-C kodierenden Bereich mit den entsprechenden BamHI- und PstI-Stellen zur Klonierung in pYA3048 zu erzeugen.
LDH-C/LT-B-Fusionskonstrukte können ebenfalls hergestellt werden wie in Fig. 11 dargestellt. Der 0,9 kb EcoRI- (Mungbohnen-nukleiert)-PstI-LDH-C kodierende Bereich wird aus pYA3054 oder pKKHC4 isoliert und in den MluI- (Klenowed)-PstI-pYA3048- oder -pYA3082-LT-B-Vektor ligiert. Dies liefert eine LT-B-LDH-C-Proteinfusion.

BEISPIEL 7

Konstruktion von rekombinanter avirulenter Salmonella, die mäuseartiges LDH-C exprimiert

Ein mäuseartiger LDH-C-Klon wurde unter Verwendung eines EcoRI- Fragments aus einem mäuseartigen cDNA-Klon konstruiert, der das LDH-C-Gen enthielt. Dieser wurde in pBS (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert, um das Plasmid pBSmLDH zu liefern. Obwohl die Sequenz von mäuseartigem LDH-C bekannt ist, ist sehr wenig über das in die EcoRI-Stelle des Vektors pBS klonierte LDH-C bekannt. Unter der Annahme, dass die Klonierung den Beginn von LDH-C mit einer ribosomalen Bindungsstelle oder in der korrekten Position hinterlässt, um die Verwendung einer externen ribosomalen Bindungsstelle zu erlauben, wurde eine Klonierung durch Isolierung eines ca. 1,3 kb EcoRI-Fragments aus pBSmLDH und dessen Ligierung in die EcoRI-Stelle von pYA810 versucht. Die korrekte Orientierung der LDH-C-Insertion in diesen Klonen wurde durch Verdauung mit PvuII und HindIII bestimmt, um ein Fragment mit ca. 1,0 kb zu liefern; es wurde jedoch kein funktionelles LDH nachgewiesen. Die unbestimmte Natur des 5'-Endes des mäuseartigen LDH-C- Klons erfordert, dass ein Primer auf der Grundlage der erhältlichen Sequenzdaten entwickelt wird, um eine direkte Klonierung von mäuseartigem LDH-C in pYA810 zur Erzeugung von funktionellem LDH-C zu erlauben.

BEISPIEL 8

Reinigung von menschlichem LDH-C

LDH-C kann gereinigt und als Beschichtungsantigen in ELISAs zur Überwachung der Immunreaktion in immunisierten Probanden verwendet werden. LDH-C kann aus jedem dieser Expressionskonstrukte unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden. Jedoch erzeugen einige der Plasmide, die die LT-B-Fusionen an LDH-C enthalten, ein LDH-C, das an LT-B fusioniert bleibt. Entsprechend wurde ein alternatives Konstrukt, das die Isolierung von LDH-C ohne LT-B erlaubt, unter Verwendung von pMAL-Vektoren, geliefert von New England Biolabs, hergestellt (Fig. 12). Dieses System beinhaltet die Fusionierung des interessierenden Proteins an das maltosebindende Protein (MBP), gefolgt von Reinigung des Fusionsproteins auf einer Amylose- Säule und Elution mit freier Maltose.
Das Konstrukt resultierte in einer hohen Ausbeute der MBP-LDH-C- Fusion, ebenso wie eines wesentlichen Anteils des teilweisen Translationsprodukts und MBP allein, die alle an die Amylosesäule binden. Das Konstrukt erzeugt eine MBP-LDH-C-Fusion mit einer Faktor Xa-Stelle in der Nähe des Beginns von LDH-C. (Faktor Xa erkennt die Sequenz Ile-Glu-Gly-Arg, die nicht in menschlichem LDH-C vorhanden ist.) Das Produkt wurde mit Xa abgespalten. Abspaltung mit dieser Protease resultiert in einem LDH-C mit drei zusätzlichen Aminosäuren. Das Verdauungsprodukt wurde dann über eine weitere Amylosesäule geführt. Niedrige Gehalte von LDH-C- und partiellen LDH-C-Produkten wurden isoliert. Deshalb wurde eine MBP-LDH-C-Fusionsmischung als Beschichtungsantigen für ELISAs verwendet. Das Fusionsprotein wurde an ELISA-Platten gebunden und konnte eine maximale Reaktion auf eine 1 : 1000-Verdünnung der Kaninchen-αLDH-C- (mäuseartig) Seren mit einer 10 ug/ml-Konzentration des Fusionsproteins ergeben, während keine Kreuzreaktion mit mäuseartigen αχ3987(pYA810)-Seren nachgewiesen wurde. Entsprechend ist die Fusion geeignet zur Verwendung in ELISAs.
Ein alternatives C-terminales LDH-C-6XHis-Fusionskonstrukt kann hergestellt werden, welches das QIAGEN-Nickel-Bindungssystem zur Isolierung von LDH-C voller Länger verwendet.

BEISPIEL 9

Tierizununisierung

Jedes der obigen rekombinanten Plasmide, die LDH-C exprimieren, kann in andere geeignete avirulente Mikroben eingeführt werden, wie einen Δcya Δcrp Δasd-S. typhimurium-Stamm, der aus einem hochinvasiven S. typhimurium- Stamm abstammt, der zur wirksamen Besiedelung des Darmtrakts fähig ist, insbesondere von GALT. Eine Abschwächung hochinvasiver Stämme resultiert in einem überlegenen Impfstoff bezüglich der erlangten Immunreaktionen. χ4072 und χ3987 sind Beispiele solcher Stämme. In diesen Stämmen wird die Stabilität der Konstrukte ausgewertet durch Heranziehen in einem Medium mit und ohne Diaminopimelinsäure (DAP), und die Menge, Stabilität (durch Einsatz der Puls-Verfolgungs-Methodik) und Ort innerhalb der bakteriellen Zelle von LDH-C wird bestimmt. Es sollte angemerkt werden, dass die Fusionen an LT-B wahrscheinlich durch die cytoplasmatische Membran in das Periplasma transportiert werden. Ausgewählte Rekombinanten können untersucht werden, um zu bestätigen, dass die Plasmide den erwarteten molekularen Aufbau haben, und Proteinextrakte können durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung nativer Gele und Anfärbung auf LDH-Aktivität analysiert werden (Goldberg, 1964). Ein Antikörper gegen LDH-C kann ebenfalls in der Western- Blot-Analyse (Towbin et al. 1979) verwendet werden, was wichtig ist, falls eine Enzymaktivität nicht nachgewiesen wird.
Schliesslich werden die Stämme bis zur logarithmischen Phase in L-Bouillon herangezogen, durch Zentrifugieren sedimentiert, in gepufferter Salzlösung plus Gelatine aufkonzentriert und zur oralen Verabreichung verwendet.

A. Immunisierung von Mäusen

Die LDH-C-Konstrukte wurden in Mäusen getestet, wobei χ3987(pYA3054) das menschliches LDH-C exprimiert, relativ zu χ3987(pYA810), das nur den Vektor enthält, verwendet wurde. Das Experiment ergab die Besiedelungsfähigkeit des Impfstoffstammes, der LDH-C exprimiert, und die Stabilität des Konstrukts in vivo. Der erste Stamm von Mäusen, C57B16, wurde auf der Grundlage von Berichten ausgewählt, dass Mäuse dieser Gewebeverträglichkeitsgruppe gut auf LT-B reagierten, wodurch ein gutes Modell für spätere Vergleiche mit den LT-B- und LDH-C-Konstrukten bereitgestellt wird. Gefrorene Vorräte von χ3987(pYA810) und χ3987(pYA3054), die den richtigen Phänotyp aufwiesen und in den Stabilitätsuntersuchungen verwendet worden waren, wurden eingesetzt, um 2-3 ml-Kulturen in Lenox-Bouillon ohne Durchlüftung bei 37ºC zu beginnen. Diese Kulturen wurden dann 1 : 20 in warme Lenox-Bouillon verdünnt und mit Durchlüftung auf eine optische Dichte von ca. 1,0 ABS600 herangezogen, bevor die Zellen pelletisiert und in gepufferter Kochsalzlösung mit Gelatine resuspendiert wurden. Zwölf weibliche, 8 Wochen alte C57B16-Mäuse wurden gemäss Standardprotokollen mit 1,2 · 10&sup9; koloniebildenden Einheiten (KBE) von χ3987(pYA810) geimpft, während weitere 12 mit 9,6 · 10&sup8; KBE des LDH-C- (menschlich) Impfstoffstammes χ3987(pYA3054) geimpft wurden. 10 Tage nach der Erstimpfung wurde den 6 Mäusen in jeder Gruppe, die für die immunologische Untersuchung ausgewählt waren, eine Verstärkung aus 1,5 · 10&sup9; KBE von χ3987(pYA810) und 8,6 · 10&sup8; KBE von χ3987(pYA3054) gegeben, wobei die für die Verabreichung der Erstimpfung verwendeten Verfahren befolgt wurden. Die Besiedelung beider Stämme wurde verfolgt durch Töten von 3 Mäusen aus jeder Primärimpfgruppe an den Tagen 7 und 14.
Die aus Peyer-Haufen (pp) und Milz (sp) gewonnenen Gesamtzahlen von KBE sind in Fig. 13 und in Tabelle 8 dargestellt, was ergibt, dass χ3987(pYA3054) in geringfügig niedrigeren Zahlen vorhanden war (obwohl ein Tier nicht mit χ3987(pYA3054) am Tag 7 besiedelt war und nicht eingeschlossen wurde). Die Tiere erschienen äusserlich während der Untersuchung gesund, jedoch wiesen die Mäuse, wenn sie am Tag 14 seziert wurden, vergrös serte Milzen und Lebern auf, was vermuten lässt, dass die gegebene Dosis für diesen Stamm von Mäusen höher als erwünscht sein kann. Die strukturelle Stabilität von pYA3054 in vivo wurde bestimmt, indem fünf isolierte Kolonien, erhalten aus drei Milzen aus drei unterschiedlichen Tieren am Tag 14, ausgelesen und auf funktionelle LDH-Aktivität untersucht wurden. Alle 15 durchmusterten Isolate erzeugten funktionales LDH-C gemäss dem LDH- Aktivitätsgel, was anzeigt, dass mehr als 93% der Population, die die Milz erreicht, 14 Tage nach der Oralimpfung LDH-C exprimieren. Während eine Gruppe von Mäusen zur Verfolgung verwendet wurde, wurde die andere Gruppe auf Immunreaktionen durch Auffangen von Seren über retriorbitale Blutentnahmen in einer Woche und Abnahme von Speichel und Vaginalsekretionen in der nächsten Woche mit Beginn von Woche 4 überwacht, im Anschluss an die Erstimmunisierung und weiter bis einschliesslich Woche 8, und danach wurden männliche C57B16-Mäuse zu den Weibchen gesellt (1 Männchen/2 Weibchen).
Die Immunreaktionen beider Gruppen von Mäusen werden durch ELISA für sowohl die IgG- als auch sIgA-Serumreaktion ausgewertet und die Mäuse auf Indikationen einer reduzierten Fruchtbarkeit überwacht. TABELLE 8 Gewinnung von χ3987(pYA810) oder χ3987(pYA3054) aus den Peyer-Haufen und Milzen von schwarzen C57-Mäusen
*Mittelwertdaten, erhalten aus drei Mäusen pro Zeitpunkt
Immunisierung von Kaninchen. Die meisten Studien über die Induzierung einer generalisierten sekretorischen Immunreaktion haben sIgA-Titer im Speichel, Intestinalspülungen, Tränen und manchmal in Milch untersucht. Es wurde nur eine sehr minimale Arbeit über die Erzeugung von sIgA im Fortpflanzungstrakt als eine Konsequenz der Antigenübertragung in den GALT durchgeführt. Um das zu tun, wurden fünf weibliche Kaninchen immunisiert und die sekretorischen und humoralen Immunreaktionen untersucht, wie oben für Mäuse angegeben. Zusätzlich werden Vaginalsekretionen durch Waschung für die Quantifizierung von sIgA gegen LDH-C gesammelt. Diese Experimente sind besonders informativ, da Kaninchen ausgezüchtet sind und manche Unterschiede in der Immunreaktion vorhergesehen werden können, falls es wesentliche Unterschiede in der Immunreaktion auf LDH-C, die von der Gewebeverträglichkeit abhängig sind, und den Immunreaktions-Genotyp gibt. Falls eine solche Variabilität angetroffen wird, wird ein Impfstoff nützlich sein, der verschiedene Sperma-spezifische Antigene exprimiert.

BEISPIEL 10

1. Konstruktion von rekombinanter avirulenter Salmonella, die SP-10 exprimiert

A. Modifizierung des pYA810-Vektors durch stellengerichtete Mutagenese. Die λgt11-Klone SP-10-5 und SP-10-10 (Wright et al. 1989) können aus den λgt11-Vektoren mit EcoRI ausgeschnitten werden (siehe Fig. 1). Die Klonierung der SP-10-5-Sequenz in die EcoRI-Stelle im pYA810-Vektor würde jedoch eine Fusion ausserhalb des Rahmens ergeben und würde Aminosäuren an das N-terminale Ende plazieren, was wahrscheinlich die Sekretion des Proteins über die cytoplasmatische Membran von E. coli und S. typhimurium verringern würde. Daher wird eine NcoI-Stelle (CCATGG) in pYA810 durch stellengerichtete Mutagenese geschaffen, so dass die Sequenz CC ATG CCG GAA TTC, die die Aminosäuren Met Pro Glu Phe kodiert, zu CC ATG GCG GAA TTC geändert wird, welche Met Ala Glu Phe kodiert. Dieser Vektor ist darin nützlich, dass er eine andere verwendbare Klonierungsstelle schafft, da NcoI nicht pYA810 schneidet. Die korrekte Nukleotidsequenz im mutierten pYA810 wird durch Sequenzierung und ebenfalls durch Nachweis der Existenz der neuen NcoI-Stelle unter Beibehaltung der EcoRI- Stelle bestimmt.
B. Konstruktion eines Vektors mit der N-terminalen SP-10-Sequenz. Diese Konstruktion ist als Diagramm in Fig. 14 dargestellt. Der pYA810- NcoI-Vektor wird mit EcoRI abgespalten und das EcoRI-Fragment mit 635 Basenpaaren, das aus dem λgt11-Klon SP-10-5 herausgeschnitten ist (Fig. 1) (d. h. die Basenpaare 62 bis 696) wird durch Ligieren insertiert. Die rekombinanten Konstrukte werden in den recA hsdR Δasd E. coli-Wirt χ6212 transformiert oder durch Elektroporation eingeführt, der ein Plasmidkodiertes lacIq-Gen aufweist, so dass die Expression jeder Sequenz unter der Kontrolle des trc-Promotors von der Gegenwart des Induktors IPTG abhängt. Rekombinante Klone mit der korrekten Orientierung der SP-10-5- Sequenz werden induziert durch Verdauen von DNA mit SmaI (das einmal im Vektor schneidet; siehe Fig. 4) und XhoII (das ca. 40 Bp vom 5'-Ende der SP-10 kodierenden Sequenz mit 635 Basenpaaren ausschneidet (siehe Fig. 1)) und mit SmaI und BclI (welches ca. 45 Bp vom 3'-Ende der SP-10 kodierenden Sequenz ausschneidet (siehe Fig. 1)). Ein Klon mit der korrekten Orientierung wird ausgewählt, und es wird verifiziert, dass kein Protein synthetisiert wird, das mit einem Anti-SP-10-Antikörper reagiert (ein Stopp-Kodon wird nach 8 Aminosäuren erreicht, die zu einem Polypeptid polymerisiert wird; siehe Fig. 15).
DNA aus diesem Plasmid wird dann zur Vervollständigung mit Ncol und teilweise mit EcoRI ausgeschnitten (dies wird manchmal zum Ausschneiden der gerade insertierten SP-10-5-Sequenz führen, aber manchmal nicht; siehe Fig. 10). Der folgende hybridisierte Linker wird zur Mischung hinzugegeben:
5' CATGAACCAG 3'
3' TTGGTCTTAA 5'
Dieser wird an den abgespaltenen Vektor ligiert, was in der Insertion von Kodonen für die Aminosäuren Asparagin und Glutamin nach dem ATG-Met- Kodon resultiert. (Das N-terminale Ende kann basischer gemacht werden, um zu sehen, ob die Sekretion durch Substitution des Lysin-Kodons AAG für entweder das AAC-Asparagin-Kodon oder das CAG-Glutamin-Kodon verbessert wird. In jedem Fall wird die EcoRI-Stelle regeneriert.) Dieses Konstrukt sollte noch immer nicht SP-10-Protein-Antigen synthetisieren, und dies wird betätigt. Das so erzeugte Plasmid wird teilweise mit EcoRI zerschnitten. Die 5'-einsträngigen Extensionen werden durch Nukleasebehandlung entfernt, gefolgt von glattendiger Ligierung zur Deletion von vier Basenpaaren. Die rekombinanten Plasmide werden in den E. coli-Stamm χ6212 transformiert oder durch Elektroporation eingeführt und die Transformanten auf die Erzeugung von SP-10-Antigen durch Kolonie-Immunblotting durchmustert. Die positiven rekombinanten Klone werden auf korrekte Lokalisierung der verschiedenen Restriktionsenzym-Spaltungsstellen analysiert (siehe Fig. 1 und 4). Der einzige Unterschied am N-terminalen Ende im Vergleich zur Aminosäuresequenz von SP-10 ist die Insertion eines Glutamins als dritte Aminosäure. Am C-terminalen Ende gibt es kein direktes Terminierungskodon im Vektor, und somit wird das erzeugte Protein neunundzwanzig zusätzliche Aminosäuren haben, da das erste Transkriptionsstoppsignal im Rahmen in der rrnB-Sequenz im pYA810-Vektor spezifiziert ist. (Dies ist die Ursache für das "+" in der Bezeichnung dieses rekombinanten Vektors pYASP-10-5&spplus;.)
Vorläufige Experimente werden durchgeführt, um zu sehen, wie gut die Zellen mit und ohne IPTG wachsen und ob das rekombinante Plasmid in Gegenwart von DAP selektiv verlorengeht. Es wird ebenfalls bestimmt, ob das SP-10-Protein wirksam zum periplasmatischen Raum transportiert wird, indem Zellen unter Verwendung eines osmotischen Kälteschocks fraktioniert werden. Auf dieser Grundalge wird bestimmt, ob die zusätzliche Aminosäuresequenz am C-terminalen Ende vorteilhaft, schädlich oder neutral ist. Falls schädlich, wird pYASP-10-5&spplus;-DNA mit EcoRI herausgeschnitten und der folgende Linker insertiert:
5' AATTCTGACGATT 3'
3' GACTGCTAATTAA 5'
Dies wird in Kodonen für die C-terminale Aminosäuresequenz Asn, Ser, Asp, Asp resultieren, gefolgt von einem TAA-Terminierungskodon. Das auf diese Weise erzeugte Plasmid wird pyASP-10-5ter genannt.
C. Insertion der C-terminalen SP-10-Sequenz in pYASP-10-5&spplus;. Ein weiterer Weg zur Terminierung der Translation und Eliminierung von nicht- SP-10-Aminosäuresequenzen am C-Terminus ist die Insertion der EcoRI- bis XbaI-SP-10-Sequenz (ca. 162 Basenpaare), erhalten aus dem λgt11-Klon SP-10-10 (siehe Fig. 1). Diese Konstruktion zur Erzeugung von pYASP-10ter ist in Fig. 16 dargestellt. Dieses Fragment wird isoliert und an pYASP-10-5&spplus;-DNA ligiert, die vollständig mit EcoRI und SmaI verdaut wurde. Im Anschluss an die Ligierung wird das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase hinzugegeben, um die Ergänzung zum einsträngigen 5'-Überhang für die XbaI- Stelle auszufüllen, gefolgt von Ligierung an die glattendigen SmaI-Stellen. Dies erzeugt SP-10 voller Länge mit dem C-terminalen Ile-Kodon, gefolgt von einem TAG-Stoppkodon. Das in Gegenwart von IPTG synthetisierte Protein sollte das gleiche wie das SP-10-Protein sein, ausgenommen das zusätzliche Glutamin als dritte Aminosäure. Das Protein wird deshalb 266 Aminosäuren aufweisen.
D. Konstruktion der SP-10-Fusion an LT-B. Das pYASP-10ter-Plasmid (Fig. 16) wird vollständig mit AlwI verdaut und der ausgeschnittene Vektor mit Klenow behandelt, um die AlwI-Stelle am Ende zu glätten, gefolgt von Verdauung mit PstI und Gewinnung des Fragments mit 769 Basenpaaren (siehe Fig. 1). Der LT-B-Fusionsvektor pYA3048 (Fig. 9A) wird mit ApaLI verdaut (Fig. 9B), mit Klenow behandelt, um die Ergänzungen zu den 5'-einsträngigen Überhängen auszufüllen, und dann vollständig mit PstI verdaut. Die zwei Moleküle werden miteinander ligiert und die rekombinanten Moleküle durch Elektroporation in E. coli χ6212 eingeführt. Die Konstruktion des resultierenden Plasmids, pYALT-B-SP-10, ist in Fig. 11 dargestellt. Die Synthese der LT-B-SP-10-Fusion wird von der IPTG-Induktion abhängig sein. Dies wird ausgewertet durch Durchführung einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antiseren gegen sowohl LT-B als auch SP-10. Es wird ebenfalls bestimmt, ob sich das Fusionsprodukt im periplasmatischen Raum befindet, indem Zellfraktionierungsstudien unter Verwendung von osmotischem Kälteschock und Western-Blot-Analyse durchgeführt werden. Falls dies so ist, wird bestimmt, ob die Fusion ein Pentamer im Periplasma bildet. LT-B-Pentamere sind stabil bis 60ºC in 0,1% SDS und reagieren nicht mit Antikörpern auf LT-B-Monomere im Anschluss an SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Das Pentamer LT-B fällt bei 70ºC oder darüber in Gegenwart von 0,1% SDS auseinander, um monomere Moleküle zu ergeben, die nun stark mit den Antiseren gegen die LT-B-Untereinheit reagieren. Daher kann ein Test auf Immunitätserzeugung im Anschluss auf Behandlung bei unterschiedlichen Temperaturen aufzeigen, ob sich Pentamere bilden oder nicht.
E. Charakterisierung der rekombinanten Klone. Eine Vielzahl von Vergleichstests werden mit pYASP-10-5&spplus;, pYASP-10-5ter, pYASP-10ter und pYALT-B-SP-10 in E. coli χ6212 und in den S. typhimurium Δcya-Δcrp-Δasp- Stämmen χ4072 und χ3987 durchgeführt. Die Wachstumsraten werden mit und ohne IPTG untersucht, quantitative Expressionsniveaus unter Verwendung von entweder ELISA oder quantitativer Western-Blot-Analyse unter Einsatz eines Molecular Dynamics-Densitometers bestimmt. Die Lokalisierung des exprimierten Genprodukts wird durch Zellfraktionierung unter Verwendung von osmotischem Kälteschock bestimmt. Die Kulturen werden über einen substantiellen Zeitraum herangezogen, um zu bestimmen, ob es irgendeine genetische Instabilität gibt. Eine Computeranalyse der SP-10-Nukleotidsequenz (Fig. 1) zeigt sowohl extensive direkte Wiederholungen als auch teilweise inverse Wiederholungen. Die direkten Wiederholungen könnten zur Erhöhung oder Verringerung der Länge der kodierenden Sequenzen als eine Konsequenz der Rekombination zwischen Chromosomen-Abkömmlingen während der Plasmidreplikation führen. Falls eine solche genetische Instabilität festgestellt wird, können avirulente recA-Salmonella-Stämme nicht verwendet werden, da recA Salmonella weiter abschwächt. Vielmehr werden Mutanten mit einer recF- Mutation verwendet, da sie die inter- und intraplasmidische Rekombination blockiert (James et al. 1982) und keinen nachteiligen Effekt auf die Viru lenz von Salmonella durch Hyperabschwächung der Impfstoffstämme aufweisen muss.
Es wird bestimmt, ob die Plasmide in Gegenwart oder Abwesenheit von DAP während des Wachstums über 50 bis 100 Generationen beibehalten werden oder nicht. Die Stabilität des Proteins unter Verwendung der Puls-Verfolgungs-Methodik wird ebenfalls bestimmt. Schliesslich wird die Bindung an GM-1-Gangliosid und/oder Agarose für die LT-B-SP-10-Fusion als Verfahren zur Reinigung des Fusionsproteins bestimmt.

2. Alternative Konstruktion einer rekombinanten avirulenten Salmonella, die SP-10 exprimiert

A. Konstruktion des Asd+-Vektors, der die N-terminale SP-10-Sequenz spezifiziert

Ein Asd&spplus;-Vektor, pYA3098, mit einer NcoI-Stelle direkt stromabwärts von der Schine-Dalgarno-Sequenz wurde konstruiert (Fig. 20). Dieser Vektor wird die Herstellung einer Reihe von Konstrukten, die das gesamte oder einen Teil des SP-10-Antigens spezifizieren, sehr stark erleichtern. PCR- Vervielfältigung der SP-10-Sequenz, die die N-terminalen 163 Aminosäuren spezifizieren, die mit dem Gly beginnen, das direkt der gewöhnlichen Spaltungsstelle der SP-10-Signalsequenz vorangeht (Fig. 1), wird verwendet. Oligonukleotide werden synthetisiert, um die Synthese dieses Fragments zu stimulieren. Das 5'-Ende ist das Oligonukleotid 5'-GACCATGGGAACATCAAGTCAG-3'. Alle ausser den ersten sieben Nukleotiden, die die NcoI-Stelle umfassen, sind in der kodierenden Sequenz für SP-10 vorhanden. Das Oligonukleotid für das 3'-Ende ist 3'-GTCCACGTGGTTAAAGTTCGCTTAAGGG-5'. Dieses Oligonukleotid enthält eine EcoRI-Stelle am C-terminalen Ende der kodierenden Sequenz. Um die Synthese eines Polypeptids am Ende der SP-10-Sequenz zu verhindern, die nicht aus SP-10 stammt, wird ein Oligonukleotid zwischen den EcoRI- und BamHI-Stelle in pYA3098 insertiert (Fig. 20), um Stoppkodonen in jedem der drei Leserahmen zu haben. Das Oligonukleotid 5'-TTAAGTAGGTAAATAG und sein Komplement 3'-CATCCATTTATCCTAG-5' werden synthetisiert. Nach Hybridisierung wird diese Sequenz in pYA3098 insertiert, das zuvor mit EcoRI und BamHI ausgeschnitten wurde. Dies wird die Insertion von TAG-, TAA- und TAG-Translations-Stoppkodonen in jedem der drei Leserahmen verursachen. Dieser neue Vektor wird als pYA3098Stopp bezeichnet. Die PCR-vervielfältigte SP-10 kodierende Sequenz wird vollständig mit NcoI und EcoRI verdaut und die Insertion in pYA3098Stopp, das mit NcoRI und EcoRI verdaut wurde, ligiert. Der rekombinante Vektor wird in E. coli χ6212, ein Derivat von DH5a mit pYA232, das das lacIq-Gen enthält, durch Elektroporation eingeführt werden. Die Expression des SP-10-Fragments aus dem trc-Promotor im pYA3098Stopp-Vektor (Fig. 20) wird deshalb von der Zugabe von IPTG abhängig sein. Das resultierende Konstrukt sollte ein Polypeptid mit 167n Aminosäuren spezifizieren. Andere Klonierungsstrategien können verwendet werden, wie die Plazierung eines Stoppkodons direkt nach dem in SP-10 vorhandenen Ser. Dieser rekombinante Klon wird als pYASP-10Nter bezeichnet werden. Dieses Fragment von DNA, wenn es in E. coli-Stämmen vorhanden ist, scheint eine hochgradige Produktion des SP-10-Polypeptids zu spezifizieren. Es ist ebenfalls von anderen Studien bekannt, dass diese Sequenz alle Aminosäuresequenzen in den polymorphen Formen von SP-10 enthält, das in menschlichem Sperma gefunden wird.

B. Konstruktion eines Asd&spplus;-Vektors mit der C-terminalen SP-10-Sequenz

Die SP-10-Sequenz enthält eine ApaLI-Stelle am Nukleotid 587 und eine XbaI-Stelle, die mit dem C-terminalen Terminierungskodon TAG überlappt. Die SP-10-Sequenz wird zuerst mit ApaLI abgespalten und der einsträngige Schwanz mit Mungbohnen-Nuklease verdaut. Dies resultiert in einem glatten Ende mit dem ersten Kodon, das Pro spezifiziert. Die DNA wird dann mit XbaI zerschnitten und das Klenow-Fragment aus DNA-Polymerase zum Ausfüllen verwendet, um in einer glattendigen Fragmentendung mit dem TAG-Terminierungskodon zu resultieren. pYA3098 wird vollständig mit NcoI verdaut und das Klenow-Fragment zum Ausfüllen des Komplements zum 5'-endigen überhang verwendet. Die zwei modifizierten DNA-Moleküle werden glattendig ligiert und in χ6212, das pYA232 enthält, durch Elektroporation eingeführt. Das gewünschte Konstrukt mit der korrekten Orientierung sollte ein Produkt mit 119 Aminosäuren spezifizieren, wobei die 118 Aminosäuren im Anschluss an das Anfangs-Met exakt wie von SP-10 spezifiziert sind. Dieses Proteinfragment wird mit vier Aminosäuren mit dem in pYASP-10Nter spezifizierten überlappen. Dieses neue Konstrukt wird pYASP-10Cter genannt werden.

C. Konstruktion von Fusionen zwischen LT-B und dem N-terminalen Anteil von SP-10

Wie oben können die LT-B-Fusionsvektoren pYA3048, das eine Signalsequenz besitzt, so dass das Produkt zum Periplasma transportiert wird, und pYA3082, dem die Signalsequenz fehlt und welches deshalb dazu führen wird, dass das Produkt im Cytoplasma verbleibt, eingesetzt werden. Die Verfahren für beide Vektoren sind die gleichen. Das wie oben beschrieben konstruierte pYASP-10Nter wird mit NcoI zerschnitten, gefolgt von Behandlung mit dem Klenow-Fragment, um die Ergänzung zum 5'-Überhang auszufüllen. Die Sequenz wird dann mit PstI zerschnitten, um die zuvor insertierten Terminierungsstoppkodonen in pYA3098Stopp einzuschliessen. Die pYA3048- und pYA3082- Vektoren werden mit ApaLI abgespalten und durch Mungbohnen-Nuklease verdaut, um in glattendigen Molekülen zu resultieren. Die Vektoren werden vollständig mit PstI zerschnitten. Die Insertion und Vektormoleküle werden miteinander ligiert und in χ6212 eingeführt, das das auf pYA232 enthält. Die Konstrukte werden als pYALT-B-SP-10NterPer und pYALT-B-SP-10NterCyt bezeichnet. Die Fähigkeit, ein Protein zu synthetisieren, das im Anschluss an IPTG-Induktion mit Antikörpern gegen SP-10 und LT-B reagiert, wird untersucht, ebenso wie die Lebensfähigkeit von Zellen, die kontinuierlich in Gegenwart von IPTG herangezogen werden. Das Konstrukt mit der Fusion, die eine stabile, hochgradige Expression bei Stabilität der Plasmidinsertion erlaubt, wird in den anschliessenden Studien verwendet. Falls das Konstrukt mit der Signalsequenz lebensfähig ist, wenn es in Gegenwart von IPTG herangezogen wird, werden osmotischer Kälteschock und Western-Blot-Analyse verwendet, um zu verifizieren, dass die LT-B/SP-10-Fusion im periplasmatischen Raum vorliegt. Es wird dann bestimmt, ob die Fusion ein Pentamer im Periplasma bildet. LT-B-Pentamere sind bis zu 60ºC in 0,1% SDS stabil und reagieren nicht mit Antikörpern gegen LT-B-Monomere im Anschluss an SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Das pentamere LT-B zerfällt bei 70ºC oder darüber in Gegenwart von 0,1% SDS, um monomere Moleküle zu ergeben, die nun leicht mit Antiseren gegen die LT-B-Untereinheit reagieren. Daher kann die Untersuchung der Antigenität im Anschluss an Behandlung bei unterschiedlichen Temperaturen zeigen, ob sich Pentamere bilden oder nicht.

D. Charakterisierung der rekombinanten Klone

Wie oben werden eine Vielzahl von Vergleichsstudien mit den vier beschriebenen Typen von Konstrukten durchgeführt, wenn in E. coli χ6212 vorhanden, das das lacIq-Plasmid pYA232 enthält, und im S. typhimurium Δcya-Δcro-Δads-Stamm χ3987, der kein lacIq-Gen aufweist. Die Wachstumsraten mit und ohne IPTG werden untersucht und die quantitativen Gehalte der SP-10-Synthese unter Verwendung von ELISA und quantitativer Western-Blot- Analyse bestimmt. In Abhängigkeit von den Ergebnissen dieser Tests wird entschieden, ob Vektoren konstruiert werden, die die SP-10Nter- und SP-10Cter-Proteine in das Periplasma von E. coli und S. typhimurium übertragen. Dies kann leicht erreicht werden, indem der LT-B-Fusionsvektor pYA3048 verwendet wird, da es eine sehr zweckmässige SacI-Stelle gibt, die direkt nach der ersten Aminosäure im reifen verarbeiteten LT-B spaltet, wodurch die gesamte LT-B-Signalsequenz intakt hinterlassen wird. Die Konstruktion dieser Rekombinanten unter Verwendung der PCR-Technologie und verschiedener, in existierenden Konstrukten vorhandener Restriktionsstellen ist unkompliziert.
Der Ort des exprimierten Genprodukts wird durch Zellfraktionierung unter Verwendung eines osmotischen Kälteschocks bestimmt. Die Kulturen werden für einen substantiellen Zeitraum herangezogen, um zu bestimmen, ob es irgendeine genetische Instabilität gibt. Eine Computeranalyse der SP-10- Nukleotidsequenz (Fig. 1) zeigt sowohl extensive direkte Wiederholungen als auch teilweise inverse Wiederholungen. Die direkten Wiederholungen könnten zu Erhöhungen oder Abnahmen der Länge der kodierenden Sequenzen als eine Konsequenz der Rekombination zwischen Chromosomen-Abkömmlingen während der Plasmidreplikation führen. Falls eine solche genetische Instabilität nachgewiesen wird, könnten avirulente recA-Salmonella-Stämme nicht verwendet werden, das recA Salmonella weiter abschwächt. Vielmehr wird die Verwendung von Mutanten mit einer recF-Mutation untersucht, da sie die inter- und intraplasmidische Rekombination blockiert.
Es wird bestimmt, ob die Plasmide in Gegenwart oder Abwesenheit von DAP während des Wachstums über 50 bis 100 Generationen beibehalten werden oder nicht. Die Stabilität des Proteins wird unter Verwendung der Puls- Verfolgungs-Methodik untersucht. Schliesslich wird für die LT-B-SP-10- Fusion die Bindung an GM-1-Gangliosid und/oder Agarose zur Reinigung des Fusionsproteins ausgewertet.

3. Reinigung von SP-10

Nach Optimierung des Grades der Erzeugung der LT-B-SP-10-Fusionsproteine in der rekombinanten avirulenten Salmonella werden die Fusionsproteine gereinigt. Um kontaminierendes LPS zu vermeiden, wird das Δcrp Δasd S. typhimurium-LT-2-Derivat χ4153 verwendet, das eine qalE-Mutation aufweist, um den LPS-Kern und O-Antigen-Erzeugung zu eliminieren. Tn10- Insertionen in den Genen für Geisseln und Haare vom Typ I werden ebenfalls in den Stamm eingeführt, um die Kontaminierung der Antigenzubereitung mit Haar- und Geissel-Antigenen zu vermeiden. Osmotischer Kälteschock wird als erster Schritt in der Reinigung des Fusionsproteins eingesetzt. Dies ergibt im allgemeinen eine 15- bis 20-fache Reinigung gegenüber dem gesamten Zellprotein. Es wird entweder eine GM-1-Affinitätssäule (Tayot et al. 1981) oder Agarose (Clements und Finkelstein, 1979) verwendet, in Abhängigkeit davon, was die bessere Affinität und Reversibilität der Anknüpfung an das Fusionsprotein ergibt. Die Reinheit des Fusionsproteins wird während der Entwicklung des Reinigungsprotokolls getestet, wobei die Gesamtproteine durch Standardverfahren und das Fusionsprotein durch quantitatives ELISA gemessen werden. Die gereinigten Fusionsproteine werden zur Langzeitlagerung gefriergetrocknet.

4. Tierimmunisierung

Die Tiere werden, wie oben in Beispiel 9 beschrieben, immunisiert und untersucht.

5. Synthese von SP-10-Sequenzen mit optimaler Kodonenverwendung zur hochgradigen Expression

Es gibt eine besondere Betonung in den Kodonen, die in Genen verwendet wrden, die in E. coli und S. typhimurium stark exprimiert werden, im Gegensatz zu den Kodonen, die in Genen verwendet werden, die in einem geringen Mass exprimiert werden (Ikemura, 1985; Gouy und Gautier, 1982). Eine Computeranalyse der kodierenden Sequenz für SP-10 (Fig. 1) zeigt, dass von den 265 Kodonen acht im wesentlichen niemals in Genen verwendet werden, die in hohem Masse in E. coli exprimiert werden, und 43 andere nur mit Häufigkeiten von 1 bis 4% in hochexpressiven Genen verwendet werden. Daher wird die Oligonukleotidsynthese verwendet, um 40mere bis 50mere mit optimaler Kodonenverwendung zur hochgradigen Expression in E. coli und S. typhimurium zu synthetisieren. Diese Oligomere werden dann an LT-B unter Verwendung eines Derivats von pYA3048 (Fig. 9A und 9B) oder pYA3082 fusioniert. Der Vektor kann entweder mit MluI und PstI oder apaLI und PstI abgespalten werden, so dass das einsträngige Molekül mit enzymatischer Synthese des komplementären Stranges unter Verwendung von Klenow-Fragment- DNA-Polymerase kloniert werden kann. Bevor dies getan wird, ist es jedoch notwendig, die Sequenz zwischen den PstI- und HindIII-Stellen in pYA3048 zu modifizieren (siehe Fig. 9B), um Translationsstoppsignale in jeden der drei Leserahmen zu insertieren. Dieser Vektor wird pYA3048ter genannt werden.
Um die Epitopenkartierung zu erleichtern, wird ein Satz von Konstrukten mit überlappenden Fragmenten hergestellt. Das Ergebnis sind ca. 30 rekombinante Klone, in denen das SP-10-Polypeptid an die LT-B-Sequenz fusioniert ist.
Die Fähigkeit jeder dieser Klone, ein Polypeptid zu spezifizieren, das mit Antiseren gegen SP-10 reagiert, wird analysiert. Antiseren aus vasektomisierten Männchen oder Männchen oder Weibchen mit anderen Fruchtbarkeitsbeeinträchtigungen, die eine immunologische Ursache haben können, werden ebenfalls verwendet.
Epitope, die hochreaktiv mit Antikörpern sind, werden ebenfalls in einem rekombinanten avirulenten S. typhimurium-Impfstoffstamm verwendet, um zu bestimmen, ob sie hoch immunitätserzeugend bei der Hervorrufung der Antikörperreaktion gegen SP-10 oder menschliches Sperma nach der Akrosomreaktion sind.

6. Aufbau einer synthetischen SP-10 kodierenden Sequenz zur maximalen Expression, Stabilität und Immunitätserzeugung

Auf der Grundlage der Ergebnisse der oben beschriebenen Experimente werden ein intaktes SP-10-Molekül oder möglicherweise grössere Segmente davon in den in Abschnitt 4 des obigen Beispiels 10 beschriebenen Klonen zusammengesetzt.
Nach Vervollständigung der Konstruktion dieser Varianten werden die in den Abschnitten 2 und 3 beschriebenen Experimente durchgeführt und das gereinigte SP-10-Molekül zur Zweitimmunisierung und zur quantitativen ELISA-Analyse der Antikörper-Titer auf SP-10 in der menschlichen Population verwendet, einschliesslich von Individuen mit und ohne Beeinträchtigung der Fruchtbarkeitsfunktionen.

BEISPIEL 11

Konstruktion von rekombinanter avirulenter Salmonella, die mäuseartiges ZP3 exprimiert

Eine LT-B-ZP3-Fusion wurde hergestellt, wie in Fig. 17 im Diagramm dargestellt, indem die verschmolzenen synthetischen ZP3-Oligomere mit 50 Bp in die MluI-Stelle von pYA3082 ligiert wurden, um das Plasmid pYA3111 (Fig. 18) zu ergeben. Kolonie-Immunblot-Durchmusterung von ca. 800 Kolonien mit αZP3- (mäuseartig) Seren der Maus zeigte drei positive Klone. Für diese drei Klone wurde auf einem Western bestätigt, dass sie ein Protein mit ca. 14 kMW erzeugen, das mit αZP3 reagierte, und dass sie eine HpaI-Stelle innerhalb der Insertion enthalten. Das ClaI-PstI-Fragment mit ca. 0,3 kb von pYA3111, Fig. 18, das den das ZP3-Peptid kodierenden Bereich enthält, wurde dann in die ClaI-PstI-Stelle von pyA3048 insertiert, um pYA3112 zu ergeben (Fig. 19), welches ein LT-B-ZP3-Fusionsprotein mit einer Signalsequenz mit 22 Aminosäuren liefert. Obwohl beide dieser ZP3-Klone LT-B-Fusionsproteine mit ca. 14 kMW exprimieren, die mit αZP3-Seren der Maus reagieren, kann das LT-B-Fusionsprotein, das die Signalsequenz enthält, nachteilig für das Zellwachstum sein, wenn es vollständig induziert wird. Deshalb wurde pYA3112 in χ3987 mit dem lacIq-Repressorplasmid pYA232 eingeführt. Wenn pYA3112 in Zellen ohne irgendeinen Repressor vorhanden ist, erscheinen lebensfähige Zellen mit Unordnungen der LT-B-ZP3- Fusion, wenn es jedoch in χ3987 mit dem lacIq-Repressor auf pYA232 vorhanden ist, wird die Fusion mit einer Grösse von ca. 14 kDA exprimiert, die ähnlich derjenigen für die LT-B-ZP3-Fusion von pYA3111 ist.
Wie in Fig. 17 angegeben, ist der Bereich von ZP-3, der das immundominante B-Zellen-Epitop ebenso wie das überlappende Epitop enthält, welches eine Autoimmun-Eierstockentzündung in weiblichen B6AF1-Mäusen induziert, innerhalb eines DNA-Fragments enthalten, das bequem durch Verdauung jeder ZP-3-Insertion mit NcoI und Substitution eines Nukleotids, das jede gewünschte Aminosäuresequenz spezifiziert, ersetzt werden kann. Zum Beispiel kann die Sequenz deletiert werden, die die sechs Aminosäuren Asn Ser Ser Ser Ser Gln kodiert. Dieses Konstrukt kann dann wie oben beschrieben verwendet werden.
Die Bestätigung des Phänotyps und der Stabilität werden vor der Impfung von Mäusen mit den ausgewählten Konstrukten durchgeführt.
Die Tierimmunisierung wird wie oben beschrieben erreicht.

GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT:

Die hier bereitgestellten avirulenten Mikroben sind geeignet zur Verwendung in der Zubereitung von Antifruchtbarkeitszusammensetzungen. Diese Zusammensetzungen sind nützlich zur Herabsetzung oder Verhinderung der Fruchtbarkeit in einem Probanden, an den sie verabreicht werden. Die avirulenten Mikroorganismen, die Gene einschliessen, die für Gametenspezifische Antigene kodieren, sind ebenfalls nützlich zur Herstellung von Antikörpern, sowohl monoklonalen als auch polyklonalen, gegen Antigene, die in der avirulenten Mikrobe exprimiert werden.

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Claims

1. Avirulente Mikrobe, umfassend ein rekombinantes Expressionssystem, das wenigstens ein Gameten-spezifisches Antigen kodiert, worin die avirulente Mikrobe aus einem pathogenen Mikroorganismus stammt und zur Besiedelung eines lymphoretikularen Gewebes fähig ist.

2. Avirulente Mikrobe gemäss Anspruch 1, worin der avirulenten Mikrobe ein funktionierendes natives, chromosomales Gen fehlt, das β-Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase (Asd) kodiert, und worin die Mikrobe zusätzlich ein rekombinantes Gen umfasst, das ein funktionelles Asd-Polypeptid kodiert, wobei das rekombinante Gen an ein oder mehrere Gene geknüpft ist, die ein oder mehrere Gameten-spezifische Antigene kodieren.

3. Avirulente Mikrobe gemäss Anspruch 1 oder 2, umfassend ein mutiertes cya-Gen, worin die Mikrobe im wesentlichen unfähig zur Herstellung funktioneller Adenylatcyclase ist.

4. Avirulente Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin die avirulente Mikrobe ein mutiertes crp-Gen umfasst, worin die Mikrobe im wesentlichen unfähig zur Herstellung von funktionellem cyclischen AMP- Rezeptorprotein ist.

5. Avirulente Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Mikrobe ein Mitglied der Gattung Salmonella ist.

6. Avirulente Mikrobe gemäss Anspruch 5, worin die Mikrobe S. typhimurium ist.

7. Avirulente Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Mikrobe ein E. coli-Salmonella-Hybrid ist.

8. Avirulente Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Gameten-spezifische Antigen Milchsäure-Dehydrogenase-C oder ein Peptid, das ein Epitop davon einschliesst, ist.

9. Avirulente Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Gameten-spezifische Antigen SP-10 oder ein Peptid, das ein Epitop davon einschliesst, ist.

10. Avirulente Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Gameten-spezifische Antigen ZP-3 oder ein Peptid, das ein Epitop davon einschliesst, ist.

11. Impfstoffzusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge einer avirulenten Mikrobe gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

12. Verfahren zur Induzierung eines Antifruchtbarkeitszustands in einem Wirbeltier, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Impfstoffzusammensetzung gemäss Anspruch 11 an das Wirbeltier umfasst.