DE68918189T2 - Neisseria-Vakzine. - Google Patents

Description

• Diese Erfindung wurde mit staatlicher Förderung unter der Beihilfe-Nr. A1-10615 der National Institutes of Health durchgeführt. Die Regierung kann bestimmte Rechte an dieser Erfindung besitzen.
• Diese Erfindung betrifft Neisseria-Mutanten, die zur Herstellung von Impfstoffen verwendet werden können. Diese Erfindung betrifft insbesondere Neisseria-Mutanten, die Mutationen in einem Gen eines der Hauptproteine der außeren Membran enthalten, so daß keine durch dieses Gen codierte, immunologisch wirksame Polypeptide produziert werden. Die Erfindung betrifft insbesondere Mutantenstämme von Neisseria gonorrhoeae, die eine Mutation im PIII-Gen aufweisen, und Mutantenstämme von Neisseria meningitidis, die eine Mutation im Klasse 4-Gen aufweisen, und davon abgeleitete Impfstoffe.
• Zur Gattung Neisseria gehören zwei Arten gramnegativer, Fieber hervorrufender Kokken, die für Menschen pathogen sind: Der Meningokokkus, Neisseria meningitidis, der Ursache der zerebrospinalen Hirnhautentzündung, auch als Meningokokken-Hirnhautentzündung bezeichnet, und der Gonokokkus, Neisseria gonorrhoeae, der Ursache der Geschlechtskrankheit Tripper.
• Neisseria gonorrhoeae ist ein aerober Diplokokkus, der Glucose, jedoch keine Maltose, abbaut, ein Kennzeichen, das zur Unterscheidung der verschiedenen Arten von Meningokokken verwendet werden kann. Die Gonokokken zeigen vier Kolonieformen (T1 - T4). Frische, virulent bleibende Isolate aus klinischen Proben wachsen in kleinen Kolonien (T1 und T2). Wiederholtes nicht-selektierendes Subkultivieren liefert größere Kolonien (T3 und T4), von denen durch Impfung männlicher Versuchspersonen gezeigt werden konnte, daß sie nicht-virulent waren.
• Bisher ist die Entwicklung von Impfstoffen durch einige technische Probleme behindert worden, unter anderem durch Schwierigkeiten bei der Züchtung, durch einen Mangel an leicht verfügbaren und aussagefähigen Tiermodellen, die Unfähigkeit zur Klassifizierung der Organismen mit üblichen serologischen Verfahren und den unzureichenden Schutz von Menschen nach der Verabreichung von Impfstoffen aus vollständigen bakteriellen Zellen.
• Zelloberflächenmoleküle werden in Impfstoffzusammensetzungen bevorzugt verwendet und sind bei Bakterien im allgemeinen und bei Neisseria im besonderen eingehend untersucht worden.
Impfstoffe auf Pilinbasis
• Pili sind proteinartige, filamentöse Strukturen, die mit der Zellwand von infektiösen Neisseria-Stämmen assoziiert sind. Während der Infektion bilden sich Bakterienkolonien an den Schleimhäuten des Wirts, wobei die Bindung der Bakterien an die Oberfläche der Schleimhaut durch die Pili vermittelt wird. Man nimmt an, daß die Anti-Pilin-Antikörper gegen eine Infektion schützen, indem sie mit den Pili reagieren und die Bindung der Bakterien an die Zielstellen der Membran verhindern. Ferner stimuliert die "Umhüllung" durch den Antikörper (d. h. die Zuführung zur Phagozytose) die Entfernung der Bakterien durch phagozytische Zellen des Bluts. Die US- Patente 4,461,838 und 4,696,986 betreffen kristalline Strukturen und Strukturen aus einzelnen Stäbchen, die von den Pili der Typ 1 und 2-Neisseria gonorrhoeae stammen, Verfahren zu ihrer Herstellung und die Verwendung eines derartigen Materials in Impfstoffen.
• Einer der größten Mängel von Impfstoffen auf Pilinbasis ist die hohe antigene Variabilität des Pilin-Proteins, wobei Antikörper, die gegen einen Stamm gebildet werden, nicht notwendigerweise mit weiteren Stämmen reagieren. Die US-Patente 4,584,195 und 4,622,223 und die PCT-Anmeldung Nr. PCT/US85/00565 versuchen dieses Problem zu lösen, indem sie als Impfstoff Bestandteile und Fragmente der Pilin-Proteine verwenden, die konservierte Aminosäuresequenzen umfassen, so daß die dagegen gebildeten Antiseren durch eine breitere Reaktivität gekennzeichnet sind.
• FR-A 2308377 offenbart die biochemische Charakterisierung von Pilin-GC aus N. gonorrhoeae-T2-Kulturen, das bei der Herstellung von Antiseren und in diagnostischen Verfahren zum Nachweis von anti-N. gonorrhoeae-Antikörpern verwendet werden soll.
Protein I (PI)-Impfstoffe
• Protein I wird in den Membranen sämtlicher Gonokokken gefunden und ist üblicherweise in größten Mengen vorhanden. Das Protein wurde gereinigt und wirkt nach der Insertion in künstliche Doppelschichten als eine für Anionen selektive Pore. Es gibt anscheinend 10 bis 20 serotypisch unterscheidbare PI-Varianten, es wird jedoch durch jeden Stamm nur ein PI exprimiert. Ferner stehen bestimmte PI-Varianten mit einer entzündlichen Erkrankung des Beckens (P. I. D.) und weitere Varianten mit einer verstreuten Gonokokken- Infektion (D. G. I.) in spezifischem Zusammenhang. Daher wurde PI als ein Bestandteil des Impfstoffs verwendet.
• Die US-Patente 4,203,971 und 4,239,749 betreffen Verfahren zur Trennung von PI aus den Lipopolysacchariden der äußeren Membran, von denen gezeigt werden konnte, daß sie toxische Eigenschaften aufweisen, und die Verwendung des "entgifteten" Produkts als Impfstoff. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 83301813.8 weist auf einige Mängel der vorstehend beschriebenen Patente hin, beispielsweise auf niedrige Ausbeuten und eine geringe Löslichkeit, wodurch die Herstellung von wirksamen Impfstoffen erschwert wird. Die Europäische Anmeldung offenbart ein verbessertes Reinigungsprotokoll, wodurch ein Protein I-Präparat erhalten wird, das eine Löslichkeit von 5 bis 10 mg/ml aufweist. Wie beschrieben, enthält der Impfstoff auch kleine Mengen der Proteine II und III sowie nachweisbare Spuren von LPS (3,5 bis 4,0 %). Wie nachstehend genauer erläutert ist, können diese Verunreinigungen, obgleich sie nur in geringen Mengen vorhanden sind, die Wirksamkeit von PI-Impfstoffen sehr nachteilig beeinflussen.
• WO 89/04873 offenbart die Clonierung eines Neisseria gonorrhoea-PIB-Gens, wobei von PIA abgeleitete Oligonucleotide verwendet wurden. PIA-codierende Oligonucleotide und die Entwicklung von Impfstoffen, die PIA-, PIB- oder chimere PIA/PIB-Moleküle enthalten, werden ebenfalls beschrieben. In J. Cell. Biochem. Ergänzungsband 12b, 32, Abs. F320, wird die Entwicklung von Antikörpern gegen PI mit geringen PIII- Verunreinigungen beschrieben. Es wurde gezeigt, daß die Präsentierung von PI in Liposomen vorteilhaft ist, da das Immunserum eine antibakterielle Aktivität aufweist, die größer ist als die in Prä-Immunseren oder die in Seren, die mit Aluminiumsulfat als Adjuvantien erzeugt werden.
Protein II (PII)-Impfstoffe
• Wenn die Kolonien der Gonokokken mit Licht beobachtet werden, das direkt vom "Substage"-Spiegel eines Koloniemikroskops reflektiert wird, zeigen sie eine unterschiedliche Lichtundurchlässigkeit: einige erscheinen transparent wie Wassertropfen, andere undurchsichtig wie mattes Glas und weitere Kolonien liegen in ihrem Aussehen dazwischen. Gonokokken verändern sich mit großer, auf 10&supmin;³ pro Zellteilung geschätzten Häufigkeit vom transparenten zum undurchsichtigen Phänotyp (oder umgekehrt). Die Veränderung zur undurchsichtigen Form erfolgt gleichzeitig mit dem Erwerb von einem oder mehreren weiteren Proteinen der äußeren Membran im Molekulargewichtsbereich von 24 000 bis 30 000. Diese Proteine zeigen ein Hitze-abhängiges Verhalten, d. h., ihr relatives Molekulargewicht in der SDS- PAGE verändert sich, je nachdem wie stark sie vor der Elektrophorese erhitzt wurden. Die optische Eigenschaft der Lichtundurchlässigkeit geht auf die Tatsache zurück, daß die Gonokokken innerhalb der Kolonie aneinander haften, und diese Haftungszonen zwischen den äußeren Membranen werden durch die undurchsichtigen Proteine vermittelt. Dies zeigt an, daß Protein II an einen Bestandteil der Nachbarzelle bindet. Diese Rezeptor-Ligand-Beziehung ist bisher nicht definiert worden. Es soll erwähnt werden, daß bei der sorgfältigen Untersuchung der Kolonievarlanten eines einzelnen Stamms sechs verschiedene lichtundurchlässige Proteine unterschieden werden können.
• Obwohl bekannt ist, daß Protein II für Antikörper leicht zugänglich ist, gibt es sehr wenige Informationen über die möglichen antibakteriellen Wirkungen der anti- Protein II-Antikörper. Die bisher nur begrenzt verfügbaren serologischen Daten zeigen, daß diese Proteine serologisch spezifisch sind, der Grad der Kreuzreaktivität zwischen ihnen im nativen Zustand wurde bisher jedoch nicht näher beschrieben. Aufgrund der starken Variabilität dieser Proteinklasse sank das Interesse an ihrer Verwendung als Impfstoff. Das Potential des Proteins II als Impfstoff kann erst abgeschätzt werden, wenn seine Funktion (oder wahrscheinlicher multiplen Funktionen) in der Pathogenese geklärt ist.
• J. Exp. Med. 159 (1984), 452-462, liefert einen Beitrag zur Klärung der Funktion von mit Lichtundurchlässigkeit assoziierten Proteinen und außerdem zur biochemischen Charakterisierung des PII-Proteins und seine immunologische Analyse in Kaninchen, die durch verschiedene Reaktionsmuster gekennzeichnet ist, was die Annahme zuläßt, daß eine innerhalb der verschiedenen Stämme gemeinsame Domäne maskiert oder versteckt und eine variable Region extensiv auf der Bakterienoberfläche exponiert ist.
Protein III (PIII)-Impfstoffe
• Es ist gezeigt worden, daß sämtliche untersuchten Gonokokkenstämme in der äußeren Membran ein Protein aufweisen, das nicht durch Hitze modifizierbar ist, und das in Abwesenheit eines Reduktionsmittels in der SDS-PAGE mit einem Molekulargewicht von 30 000, nach der Reduktion jedoch mit einem Molekulargewicht von 31 000 wandert. Dieses Protein, das als Protein III bezeichnet wird, scheint bei allen, ein identisches Protein aufweisenden Stämmen, wie durch eine Peptidanalyse nachgewiesen wurde, nicht variabel zu sein. Ein Hybridom ist cloniert worden, das einen Antikörper produziert, der mit dem in der Membran vorkommenden Protein III reagiert, wodurch angezeigt wird, daß auf der Oberfläche mindestens eine antigene Determinante exponiert ist (J. Swanson et al., Infect. Immunity 38 (1982), 668-672). Untersuchungen mittels In vivo-Quervernetzungen haben gezeigt, daß Protein III mit dem trimeren Proteinkomplex eng assoziiert ist (R. L. McDade et al., J. Bacteriol. 141 (1980), 1183-1191).
• J. Exp. Med. 165 (1987), 471-482, beschreibt die Analyse des clonierten PIII-Gens von N. Gonorrhoeae. Die Identifizierung der Nucleotid- und davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen und ein Vergleich mit anderen Membranständigen Proteinen zeigen eine starke Homologie mit dem carboxyterminalen Bereich der enterobakteriellen Omp-A- Proteine.
• Aufgrund seiner Häufigkeit und Konstanz wurde PIII anfänglich als möglicher Impfstoff in Erwägung gezogen, kürzliche Untersuchungen stellten jedoch die Nützlichkeit von PIII als Impfstoff ernsthaft in Frage. Beispielsweise beschreiben P. A. Rice et al. (J. Exp. Med. 164 (1986), 1735-1748), daß aufgrund der Wirkung der anti-PIII-IgG- Antikörper das Abtöten der Serum-resistenten Neisseria durch Immunseren blockiert wird. Aufgrund der Erzeugung dieser blockierenden Antikörper hilft PIII ziemlich paradoxerweise dem Gonokokkus, sich vor dem Angriff durch Antikörper gegen andere Oberflächenantigene zu schützen. Da es technisch sehr schwierig ist, PIII aus den Gonokokken-Membranantigen-Präparaten zu entfernen, weisen Impfungen mit PI, wenn überhaupt, eine verminderte Schutzwirkung auf. (P. Arminson, Abst. Ann. Meeting American Society for Mikrobiology 118 (1987)).
Weitere Impfstoffe auf Antigenbasis
• Das US-Patent 4,220,638 und die verwandte Europäische Anmeldung Nr. 78 40 0245.3 beschreiben die Isolierung und Verwendung eines makromolekularen Aggregats als Impfstoff. Das Aggregat ist dadurch gekennzeichnet, daß es von der Zelloberfläche von Neisseria stammt, ein Molekulargewicht von 9,2 x 10&sup6; und 5 für 80 Gew.-% des Komplexes verantwortliche Hauptbestandteile aufweist. Eine Komponente weist ein Molekulargewicht (27 000) auf, das im Bereich von dem für PIII (30 000) beschriebenen ist.
• US-Patent 4,330,623 betrifft ein Verfahren zur Solubilisierung von Gonokokken-Antigenen, beispielsweise des vorstehend beschriebenen makromolekularen Komplexes, durch Behandlung mit Trypsin.
• Das Lipopolysaccharid (LPS) des Gonokokkus (wie das vom Meningokokkus) besteht nur aus kurzen Oligosacchariden, die an einen Lipid A-Anteil gebunden sind. Zu den nachgewiesenen Zuckern gehören KDO, Glucose, Galactose, Heptose, Glucosamin und Galactosamin. Untersuchungen über die antigenen Eigenschaften von LPS zeigen, daß es allen Gonokokken gemeinsame Determinanten gibt, die unter Verwendung von einem in Hühnern erzeugten Antiserum (R. Wallace et al., Can. J. Microbio. 117 (1978), 124-132) oder monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden können. Es gibt jedoch auch serologische Determinanten von LPS, die die Klassifizierung der verschiedenen Gonokokkenstämme in sechs Arten ermöglichen (M. Apicella et al., Infect. Immun. 126 (1979), 870- 74).
• US-Patent 4,681,761 und WO 87/2678 betreffen Verfahren zur Reinigung des Eisen-regulierten Hauptproteins (MIRP) von N. gonorrhoeae und seine Verwendung als Impfstoff
• Das US-Patent 4,351,761 offenbart die Reinigung und Eigenschaften des als "L-Antigen" bezeichneten Antigens von Neisseria gonorrhoeae und seine Verwendung in einem diagnostischen Test, in dem anti-N. gonorrhoeae-Antikörper in menschlichen Seren nachgewiesen werden.
• US-Patent 4,707,543 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines entgifteten Polysaccharid-Proteinkomplexes der äußeren Membran und seine Verwendung als Impfstoff.
• Die Europäische Patentanmeldung Nr. 85 20 1657.5 betrifft eine Impfstoffzusammensetzung, in der die antigene Aktivität des Proteins durch Formulierung eines absorbierten Antigen-Detergens-Komplexes verbessert wird.
• In einer alternativen Vorgehensweise sind immunologische, mit den Pilin-Rezeptoren auf den Epithelzellen reagierende Reagenzien untersucht worden, wie durch die Europäischen Patentanmeldungen mit den Nrn. 83 85 0077.5 und 86 40 1916.1 offenbart wurde.
• W.M. McShan et al. (Infection and Immunity 55 (12) (1987), 3017-3022) beschreiben die Clonierung und die Expression von genetischer Information, die von einem Serum- resistenten Stamm von Gonokokkus stammt, der die Serum- resistenz auf einen Serum-empfindlichen Stamm überträgt. Die DNA codiert ein Protein, daß die Anlagerung eines blockierenden Antikörpers an die Zelloberfläche vermitteln kann. Dieser blockierende Antikörper behindert die Komplement-vermittelte bakterizide Antikörperaktivität. Obwohl ähnlich in der Größe ist das Protein, wie der Vergleich deutlich zeigt, als Antigen mit PIII nicht verwandt.
• J. M. Koomey et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (12) (1982), 7881-7885) beschreiben die Clonierung und Expression eines Gonokokkengens (IgA1-Protease) in E. coli. Der Artikel beschreibt ebenfalls die Deletion eines Teils des clonierten Gens und die Insertion eines Markergens. Die erhaltene DNA kann das clonierte Genprodukt nicht exprimieren. Diese DNA wird anschließend zur Transformation von normalen Gonokokken verwendet, um Mutantenstämme zu erhalten, in denen das defekte Gen durch ein doppeltes Crossingover-Ereignis in das bakterielle Chromosom integriert wurde. Infect. Immun. 55 (1987), 3017-3022, beschreibt die Clonierung eines DNA-Fragments des Serum-resistenten Stamms JC1 von Neisseria gonorrhoeae, der durch Einführung in den Serum-empfindlichen Stamm F62 die Serumresistenz überträgt. Die Deletionsanalyse zeigte, daß ein 29 kD-Protein für die Etablierung der Serumresistenz verantwortlich ist. Das 29 kD-Protein unterscheidet sich immunologisch vom PIII-Protein.
• Chem. Abstr. 109 (1988), 506, Abs. 52803c, beschreibt die Verwendung der äußeren Membranproteine (Proteosomen) der Meningokokken zur Verbesserung der Immunantworten gegen synthetische Malaria-CS-Peptide.
• US-A-3577527 offenbart die Herstellung von antigenen Extrakten von N. meningitidis-Stämmen, die in verschiedenen Arten, unter anderem in Menschen, immunogen sind.
• Schließlich gibt es zahlreiche Patente, die die Diagnose von Neisseria betreffen. Vgl. beispielsweise die US-Patente 4,208,480, 4,241,045, 4,446,230, 4,497,900 und 4,659,658.
• Die Erfindung betrifft neue Neisseria-Mutanten und die Verwendung derartiger Stämme zur Herstellung eines verbesserten Impfstoffs zur Verhinderung von Gonokokken- und Meningokokken-Infektionen. Die Erfindung betrifft insbesondere N. gonorrhoeae-Stämme, in denen das Protein III-Gen (PIII) inaktiviert worden ist, oder N. meningitidis-Stämme, in denen das Klasse 4-Gen inaktiviert worden ist. PIII ist ein stark konserviertes, als Antigen stabiles Protein der äußeren Membran von Gonokokkus. Obwohl PIII anscheinend als ein aktiver Bestandteil in einem Impfstoff sehr geeignet ist, wurde gezeigt, daß die als Antwort auf PIII gebildeten Antikörper in Wirklichkeit die bakterizide Aktivität des Immunserums gegen Gonokokken hemmen. Diese sogenannten blockierenden Antikörper begrenzen die Wirksamkeit der im Stand der Technik bekannten, aus Bestandteilen der äußeren Membran hergestellten Impfstoffe ernsthaft, da eine als Antigen signifikante Menge von PIII, selbst in relativ reinen Antigenpräparaten, gemeinsam mit dem gewünschten Antigen gereinigt wird. Die Entwicklung eines Stamms, der kein immunologisch funktionelles PIII produzieren kann, liefert eine nützliche Quelle für weitere Antigene der äußeren Membran ohne das Problem der PIII-Verunreinigung.
• Die hier beschriebene Erfindung weist mehrere Ausführungsformen auf. Die Erfindung betrifft Mutantenstämme der Gattung Neisseria, die kein Protein produzieren können, das die Bildung von blockierenden Antikörpern induziert oder mit diesen Antikörpern immunologisch reagiert. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Impfstoff, der eine immunologisch wirksame Menge des PI- Antigens enthält, das von einem Neisseria-Stamm gewonnen wurde, der kein immunologisch funktionelles PIII-ähnliches Protein produzieren kann, wobei er mit einem physiologisch verträglichen Excipienten vermischt wird. In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein PI-Antigen, das im wesentlichen von PIII-ähnlichem Protein frei ist und von einem Neisseria-Stamm, der kein PIII-ähnliches Protein produzieren kann, erhalten wird. In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Neisseria-Antigens, das zur Impfstoffherstellung geeignet ist und die Schritte der Züchtung dieses Mutantenstamms von Neisseria und die Isolierung eines Zelloberflächenantigens davon umfaßt. In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung dieses, das PI-Antigen umfassenden Impfstoffs zur Immunisierung eines Säugers gegen eine Neisseria- Infektion. In einer letzten Ausführungsform liefert die Erfindung einen Impfstoff, der dieses PI-Antigen als Proteosompräparat enthält.
• Figur 1 zeigt ein Diagramm der Schritte zur Herstellung der Plasmidkonstruktion I.
• Figur 2 zeigt ein Diagramm der Schritte zur Herstellung der Plasmidkonstruktion II.
• Diese Erfindung betrifft eine neue Klasse von Neisseria-Mutanten, die durch die Tatsache gekennzeichnet sind, daß sie keine immunologisch wirksamen, PIII-ähnlichen Moleküle produzieren können. Diese Mutanten-Klasse ist als Quelle des antigenen Materials zur Verwendung in Impfstoffen gegen Neisseria besonders nützlich.
• Wie hier verwendet, haben die nachstehenden Begriffe die folgenden Bedeutungen:
Nucleotid
• - Eine monomere Einheit aus DNA oder RNA, die aus einer Zuckereinheit (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff-enthaltenden heterozyklischen Base besteht. Die Base ist über das glykosidische Kohlenstoffatom (1'- Kohlenstoffatom der Pentose) an die Zuckereinheit gebunden, und die Kombination von Base und Zucker wird als Nucleosid bezeichnet. Die Base kennzeichnet das Nucleosid. Die vier DNA-Basen sind Adenin ("A"), Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und Uracil ("U").
DNA-Sequenz
• - Eine lineare Anordnung von Nucleotiden, die über Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'- Kohlenstoffatomen der benachbarten Pentosen miteinander verbunden sind.
Codon
• - Eine DNA-Sequenz aus drei Nucleotiden (einem Triplett), die durch eine mRNA eine Aminosäure, ein Translationsstartsignal oder ein Translationsterminationssignal codiert. Die DNA-Nucleotidtripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG codieren beispielsweise die Aminosäure Leucin ("Leu"), TAG, TAA und TGA sind Translationsstopsignale und ATG ist ein Translationsstartsignal.
Leseraster
• - Die Gruppierung der Codons während der Translation der mRNA in Aminosäuresequenzen. Während der Translation muß das richtige Leseraster eingehalten werden. Die DNA-Sequenz GCTGGTTGTAAG kann theoretisch beispielsweise in drei Leserastern oder Phasen exprimiert werden, wobei jeweils eine andere Aminosäuresequenz geliefert wird:
• GCT GGT TGT AAG - Ala-Gly-Cys-Lys
• G CTG GTT GTA AG - Leu-Val-Val
• GC TGG TTG TAA G - Trp-Leu- (Stop)
• Allerdings codiert nur eines der vorstehend beschriebenen Leseraster die richtige genetische Information. Das Translationsstartsignal wird durch das Ribosom und zusätzliche Initiationsfaktoren erkannt, um das richtige Leseraster einzuhalten.
Polypeptid
• - Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die über Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und den Carboxylgruppen der benachbarten Aminosäuren miteinander verbunden sind.
Genom
• - Die gesamte DNA einer Zelle oder eines Virus. Es schließt unter anderem die Strukturgene ein, die einzelne Polypeptide codieren, sowie regulatorische Sequenzen, beispielsweise Operator-, Promotor-, ribosomale Bindungs- und Interaktionssequenzen, wobei beispielsweise die Shine- Dalgarno-Sequenzen eingeschlossen sind.
Strukturen
• - Eine DNA-Sequenz, die als Matrize oder Messenger-RNA ("mRNA") eine Aminosäuresequenz codiert, die für ein bestimmtes Polypeptid kennzeichnend ist. An Strukturgenen können auch primär RNAs gebildet werden, beispielsweise Transfer-RNAs (tRNAs) oder ribosomale RNAs (rRNAs).
Transkription
• - Der Vorgang, in dem von einem Strukturgen RNA gebildet wird.
Translation
• - Der Vorgang, in dem von mRNA ein Polypeptid gebildet wird.
Expression
• - Der Vorgang, in dem, ausgehend von einem Strukturgen, ein Produkt gebildet wird. Bei einem Proteinprodukt ist es eine Kombination von Transkription und Translation.
Plasmid
• - Eine nichtchromosomale, doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replikon" umfaßt, so daß das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert wird. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingeführt wird, können sich die Merkmale des Organismus aufgrund der DNA des Plasmids verändern oder transformiert werden. Ein Plasmid, das das Tetracyclinresistenzgen (Tet ) trägt, transformiert beispielsweise eine zuvor Tetracyclin-empfindliche Zelle in eine, die dagegen resistent ist. Eine mit einem Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformante" bezeichnet.
Phage oder Bacteriophage
• - Bakterienvirus, von dem viele aus DNA-Sequenzen bestehen, die in eine Proteinhülle oder einen Proteinmantel ("Capsid") eingekapselt sind.
Clonierungsvehikel
• - Ein in einer Wirtszelle replizierbares Plasmid, Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die durch eine oder wenige Endonukleaseerkennungsstellen gekennzeichnet ist, an denen derartige DNA-Sequenzen in einer vorherbestimmbaren Weise ohne erkennbaren Verlust einer essentiellen biologischen Funktion der DNA, z. B. der Replikation, Produktion des Hüllproteins oder dem Verlust des Promotors oder der Bindungsstellen, gespalten werden können, und die einen Marker enthalten, der zur Identifizierung von transformierten Zellen verwendet werden kann, z. B. eine Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz. Ein Clonierungsvehikel wird oft als Vektor bezeichnet.
Clonieren
• - Das Verfahren zum Erhalt einer Population des Organismus oder der DNA-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer derartigen Sequenz stammen, durch asexuelle Reproduktion oder DNA-Replikation.
Rekombinantes DNA-Molekül
• - Ein Molekül, das aus an den Enden verknüpften DNA-Segmenten aus verschiedenen Genomen besteht, die die Fähigkeit zur Infektion einiger Wirtszellen aufweisen und darin beibehalten werden können.
Expressionskontrollsequenz
• - Eine Nucleotidsequenz, die die Expression von Strukturgenen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen funktionell verbunden ist. Beispiele dafür sind das lac-System, die Hauptoperator- und -promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregion des fd- Hüllproteins und weitere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren kontrollieren.
Mutation
• - Eine vererbbare Veränderung der genetischen Information eines Organismus.
Mutante
• - Ein Organismus, der eine Mutation enthält. Er exprimiert üblicherweise einen unterscheidbaren Phänotyp, wenn er mit einem Standardreferenzstamm der Art, zu der der Organismus gehört, oder mit einer Wildtyp-Population dieses Organismus verglichen wird.
PIII-ähnliche Proteine
• - Jedes auf der Zelloberfläche von Neisseria vorkommende Protein, das, wie das PIII von N. gonorrhoeae, die Fähigkeit zur Induktion und/oder immunologischen Reaktion mit blockierenden Antikörpern besitzt, wie z. B. das Klasse 4-Protein von N. meningitidis.
Immunologisch wirksam oder als Antigen bedeutsam
• - Eine Proteinmenge (i), die die Bildung von blockierenden Antikörpern in einem immunisierten Säuger induzieren und/oder (ii) mit einem blockierenden Antikörper immunologisch reagieren kann.
Blockierender Antikörper
• - Ein Antikörper, der durch Bindung an ein Antigen die Anlagerung anderer Antikörper oder Zellen mit Antigenrezeptoren blockiert oder anders die Funktion der anderen Antikörper oder Zellen hemmt.
• Zur Vereinfachung der Beschreibung der Erfindung wird in der nachstehenden Erläuterung das PIII-Protein von N. gonorrhoeae als Beispiel verwendet, die Beschreibung ist jedoch auch auf jedes PIII-ähnliche Protein, beispielsweise auf das Klasse 4-Protein von N. meningitidis, anwendbar.
• Diese Erfindung löst die vorstehend beschriebenen Probleme bei der Abtrennung von PIII aus von Zellmembranmaterial stammenden Antigenpräparaten durch Bereitstellung eines mutierten Stamms, der genetisch kein immunologisch wirksames PIII produzieren kann. Je nach der jeweils erzeugten Mutante können eine kleine Menge PIII oder Fragmente davon produziert werden. Derartige Produktionsmengen sind akzeptabel, wenn die PIII-Menge nicht immunologisch wirksam, d. h., als Antigen signifikant, ist. Es wird davon ausgegangen, daß derartige Stämme im wesentlichen kein PIII produzieren können. Es ist ferner zu berücksichtigen, daß nicht das gesamte PIII-Protein für eine antigene Wirkung erforderlich ist, das heißt, es können PIII-Fragmente existieren, die als Antigen wirksam sind, und diese werden des öfteren als antigene Determinanten oder Epitope erwähnt. Daher können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die übrigen Teile des PIII-Gens ohne besondere Folgen exprimiert werden, wenn die Epitope, die die blockierenden Antikörper induzieren und/oder mit ihnen reagieren, entfernt oder unwirksam gemacht werden.
• Mehrere verschiedene Typen von Mutationen können einen Mutantenstamm entstehen lassen, der im wesentlichen kein als Antigen signifikantes PIII produzieren kann, und sind in dieser Erfindung berücksichtigt.
• Punktmutationen, die durch die Substitution eines einzelnen Nucleotids in der DNA gekennzeichnet sind (sogenannte Transitions- oder Transversionsmutationen), können eine Veränderung des genetischen "Sinns" eines Codons bewirken, wodurch die Insertion einer anderen Aminosäure in die Proteinkette (als "Missense"-Mutation bezeichnet) bewirkt wird. Wenn die ausgetauschte Aminosäure an einer kritischen, für die Bindung des blockierenden Antikörpers erforderlichen Stelle ist, wird ein immunologisch unwirksames PIII-Protein erhalten. Alternativ könnte die Veränderung des Nucleotids einen der 61 "Sinn"-Codons in einen der drei Terminatorcodons umwandeln (als "Nonsense"-Mutation bezeichnet). Wenn die Position der "Nonsense"-Mutation stromaufwärts einer kritischen Epitopregion ist, dann wird die Proteinsynthese vor Erreichen dieser Region beendet, wobei ein verkürztes Proteinprodukt, dem das erforderliche Epitop fehlt, erhalten wird. Es können außerdem Punktmutationen erzeugt werden, die eine Addition oder Deletion von einzelnen Nucleotiden (im Gegensatz zur Substitution von einzelnen Nucleotiden) betreffen. Diese +1/-1-Ereignisse verändern das Leseraster der genetischen Botschaft, wodurch aus jeder Information stromabwärts der Rasterverschiebung genetischer Unsinn entsteht. Entsprechend den vorstehend beschriebenen "Nonsense"-Mutationen, bei denen Rasterverschiebungen durch Mutationen stromaufwärts eines kritischen Epitops auftreten, enthält das Translationsprodukt nicht die richtige Aminosäuresequenz, da diese Region nicht im Raster gelesen wird. Obwohl durch Punktmutationen selbstverständlich auch Mutanten mit den erforderlichen Eigenschaften erzeugt werden können, d. h., mit der Unfähigkeit zur Produktion von als Antigen wirksamem PIII, ist die Punktmutation nicht der am meisten bevorzugte Mechanismus zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Mutanten, da möglicherweise das richtige Nucleotid resubstituiert (Reversion) oder die Mutation intergen oder extragen unterdrückt werden kann.
• Alternativ kann das gesamte PIII-Gen dder zumindest ein signifikanter Teil davon deletiert werden. Die codierende Sequenz des PIII-Gens kann auch durch Insertion eines Teils einer exogenen DNA in die Sequenz unterbrochen werden. Ferner kann eine Kombination beider Verfahren verwendet werden, z. B. Deletion eines Teils des PIII-Gens und dessen Substitution durch einen Teil einer exogenen DNA.
• Wenn die Mutation zu einer erkennbaren Veränderung des Phänotyps führt, dann können die gewünschten "PIII-losen" Stämme ungeachtet des zur Erzeugung der gewünschten PIII-Mutante verwendeten Verfahrens einfach gewonnen werden. Wenn jedoch kein deutlich veränderter Phänotyp mit dem Fehlen eines immunologisch wirksamen PIII verbunden ist, dann müssen kompliziertere Verfahren verwendet werden. Da Antikörper gegen PIII verfügbar sind, kann beispielsweise durch ein Filtrationsanreicherungsprotokoll auf "PIII-lose" Stämme selektiert werden.
• Da die Funktion von PIII nicht bekannt war, konnte in diesem Fall der Phänotyp der "PIII-losen" Stämme nicht a priori vorhergesagt werden. Da angenommen wurde, daß PIII ein Hauptbestandteil der Zellmembran ist, war es ferner wahrscheinlich, daß Mutanten, denen PIII fehlte, keine funktionelle Zellmembran synthetisieren konnten, und die Mutation daher für die Zelle ein letales Ereignis sein würde. Es war daher überraschend, daß "PIII-lose" Stämme überhaupt gewonnen werden konnten.
• Wie hier nachstehend erläutert wird, kann ein exogenes Markergen eingeführt werden, um die Abwesenheit des PIII-Gens anzuzeigen. Es ist jedes Verfahren zur Induktion und Gewinnung von PIII-Mutanten akzeptabel, wenn die gewonnenen Stämme keine als Antigen wirksamen PIII-Mengen produzieren können.
• Die Bedeutung der Erfindung kann besser verstanden werden, wenn auf ein bestimmtes Beispiel Bezug genommen wird, das die Erzeugung und die Gewinnung einer PIII-Mutante durch Insertion eines Markergens betrifft. Die Schritte können, wie nachstehend beschrieben, skizziert werden: Bereitstellung eines clonierten PIII-Gens, Bereitstellung eines Markersgens, Einführung des Markergens in das PIII-Gen und die Transformation von N. gonorrhoeae, um einen Stamm zu erhalten, der kein immunologisch wirksames PIII produzieren kann.
• Unter Bezugnahme auf die Figuren 1 und 2 gibt die nachstehende Beschreibung einen genauen Überblick über die Verfahren zur Erzeugung eines Mutantenstamms von Neisseria, der im wesentlichen kein immunologisch wirksames PIII produzieren kann.
Clonierung des PIII-Gens
• Verfahren zur Clonierung des PIII-Gens sind von Gotschlich et al. (J. Exp. Med. 164 (1986), 868-881) beschrieben worden, wobei der vollständige Inhalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
• Der E. coli-Stamm Y1089, der mit λgt 11 lysogenisiert worden war, wurde in einem 500 ml NZCYM-Medium in einer 2,8 Liter-Fernbachflasche bis zu einer bei 500 nm gemessenen OD von 0,800 gezüchtet. Die Kultur wurde über einer offenen Flamme auf 44ºC erhitzt, weitere 2 Std. bei 37ºC inkubiert und die Organismen durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden in 10 ml X-Verdünnungspuffer (SM-Lösung) suspendiert, 500 ul Chloroform und 100 ug Desoxyribonuclease zugesetzt und die Suspension 20 Minuten inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation mit 2 500 g entfernt, das Pellet in 5 ml SM-Lösung resuspendiert und erneut zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde wiederholt, und die aus den vereinigten Überständen isolierten Phagen wurden durch Sedimentation mit einer anschließenden Flotation in CsCl-Lösungen gereinigt.
• Die genomische DNA wurde aus dem Gonokokkenstamm R10 gewonnen. 500 ug DNA wurden mit EcoRI-Methylase behandelt. Die DNA wurde mit Ultraschall gespalten und anschließend zur Erzeugung von glatten Enden mit Mungbean-Nuclease behandelt. Etwa 30 ug dieser DNA wurden durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert und die Fraktion mit 600 bis 2 300 bp elektroeluiert. Das Material wurde mit EcoRI-Linkern ligiert, die unter Verwendung einer Polynucleotidkinase phosphoryliert worden waren. Nach der Ligierung wurde die DNA umfassend mit EcoRI gespalten und kleine Nucleotide durch Sperminausfällung von der DNA getrennt, wonach auf einer 1 ml-Säule aus Sephacryl 200 chromatographiert wurde.
• 50 ng der zu inserierenden DNA und 2 ug Vektor wurden mit T4-Ligase ligiert, einer λ-Verpackungsmischung zugesetzt und der Titer festgestellt. Die Bank wurde auf drei großen Petrischalen vermehrt und stammte schätzungsweise von 4,6 x 10&sup5; Plaques, von denen 54 % Insertionen enthielten, wie die Abwesenheit von β-Galactosidaseaktivität zeigte.
• PI wurde aus dem Gonokokkenstamm 120176-2 gewonnen und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet. Das erhaltene Serum wurde durch eine Affinitätssäule geleitet, die aus gereinigtem PI bestand, das kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose gebunden war, und mit 100 mM Glycin-HCl-Puffer, der 0,1 % Triton X-100 enthielt, bei einem pH-Wert von 2,3 eluiert. Ein immunologisches Screenen wurde durchgeführt, indem man 10&sup5; Plaques 2,5 Std. bei 42ºC wachsen ließ, anschließend ein trockenes, zuvor mit 10 mM IPTG imprägniertes Nitrozellulosefilter auflegte, 2 Std. bei 37ºC inkubierte und die Filter dreimal 10 Minuten in Blockierungspuffer (10 mM Tris-HCl, das 0,5 M NaCl und 0,5 % Tween 20 enthielt, bei einem pH-Wert von 7,5) wusch. Die Filter wurden über Nacht in mit Blockierungspuffer verdünntem Antiserum inkubiert, dreimal gewaschen, 2 Std. mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Antiimmunglobulin inkubiert, dreimal mit Blockierungspuffer gewaschen, einmal mit 50 mM Trizma-Base mit 3 mM MgCl&sub2; gewaschen und anschließend mit dem Substrat der alkalischen Phosphatase, das in dem Trizma-Basenpuffer gelöst war, bei 37ºC inkubiert.
• Phagen aus durch immunologische Aktivität identifizierten Plaques wurden gereinigt und zur Infektion des Stamms Y1089 zur Produktion der Lysogene verwendet. Diese wurden zur Produktion des Phagen induziert, indem die Inkubationstemperatur auf 44ºC erhöht wurde, und anschließend mit IPTG zur Antigenproduktion induziert. Eine SDS-PAGE wurde mit Zellen, die in dem SDS-enthaltenden Auftragspuffer lysiert worden waren, durchgeführt. Es wurde ein elektrophoretischer Transfer auf Nitrozellulose oder auf Durapore- Membranen durchgeführt und die Western-Blots, wie vorstehend beschrieben, mit Sonden immunologisch oder unter Verwendung von radioaktiv-markiertem Protein A (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) abgesucht. Die Antikörper wurden durch Affinitätschromatographie aus Kaninchenserum unter Verwendung der an Nitrozellulose fixierten Produkte von Plaques gereinigt. Dichte Rasen von Plaques ( 50 000) wurden 2,5 Std. bei 42ºC auf E. coli Y1090 gezüchtet, darauf ein IPTG-enthaltendes Nitrozellulosefilter gelegt und 2 Std. bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden, wie vorstehend beschrieben, mit Blockierungspuffer gewaschen, 4 Std. mit 50 ul Serum, das mit Blockierungspuffer auf 5 ml verdünnt war, umgesetzt, dreimal mit Blockierungspuffer und einmal mit 150 mM NaCl gewaschen. Die Antikörper wurden 15 Min. mit 5 ml 150 mM Glycin-HCl bei einem pH-Wert von 2,3 eluiert. Das Eluat wurde sofort neutralisiert und für Western-Blots verwendet.
• DNA-Hybridisierungsanalysen wurden gemäß dem Verfahren von Meinkoth und Wahl (Anal. Biochem. 138 (1984), 267-284) durchgeführt und stringente Waschbedingungen verwendet (1 x SSC bei 69ºC).
• Es wurde gezeigt, daß ein durch das vorstehend beschriebene Verfahren isolierter Clon (Clon 33) das PIII-Gen enthielt, und seine DNA-Sequenz bestimmt. Gotschlich et al. (J. Exp. Med. 165 (1987), 471-492), wobei der gesamte Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Eine Probe dieses Clons als Lysogen in E. coli wurde am 28. Juni 1988 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 53786.
Konstruktion eines PIII-Gens, das eine Markergen-Insertion enthält
• Die übliche Vorgehensweise war die Clonierung eines Markergens in eine einzelne XbaI-Stelle am Nucleotid 601 im PIII-Gen. Sämtliche rekombinanten DNA-Manipulationen wurden gemäß den von Maniatis et al. ("Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)) beschriebenen Protokollen durchgeführt, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben.
• Es ist selbstverständlich jedes Markergen geeignet, sofern es auf die ein derartiges Gen enthaltende Zelle einen erkennbaren Phänotyp überträgt, wobei als Beispiele dafür, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eine Antibiotika- Resistenz oder -Empfindlichkeit, Farb- oder morphologische Veränderung, Enzymaktivität, Auxotrophie oder Befreiung von derselben genannt werden können.
Konstruktion I
• Diese Konstruktion weist die Insertion eines β- Lactamase-Markers in die einzige XbaI-Stelle auf. Der λgt11- Clon 33 wurde mit EcoRI behandelt, um die Insertion zu entfernen. Diese Insertion wurde mit dem mit EcoRI gespaltenen Plasmidvektor pMOB45 (ATCC-Nr. 37106) ligiert, Tetracyclinresistente, jedoch Chloramphenicol-sensitive Clone selektiert und das Plasmid hergestellt. pMOB45 wurde als Vektor gewählt, da es kein β-Lactamasegen und keine XbaI-Stellen enthielt. Die Clone wurden durch die Herstellung von Plasmiden und die Charakterisierung durch EcoRI-Spaltung identifiziert. Ein bestimmtes Isolat mit der Bezeichnung pMOB45/33-2 wurde für weitere Konstruktionen verwendet.
• Das β-Lactamasegen wurde in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt. Das Gonokokken-Plasmid pFA3 (L. Mayer et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 1498) wurde durch das von Ish-Horowicz (Nucl. Acid. Res. 9 (1981), 2989) beschriebene alkalische Lyseverfahren gereinigt. Die β- Lactamase liegt auf einem 2,2 kb BamHI-Fragment, das durch Restriktionsenzymspaltung, Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution des Restriktionsenzymfragments isoliert wurde.
• Das β-Lactamasegen wurde, wie nachstehend beschrieben, in das PIII-Gen cloniert. Etwa 2,5 ug pMOB45/33-2 wurden mit XbaI gespalten und das Enzym nach der Spaltung durch 10-minütiges Erhitzen auf 70ºC inaktiviert. Etwa 1 mg gereinigtes β-Lactamasegen wurde zugesetzt und anschließend die durch die Restriktionsenzymspaltungen entstandenen 5'-überstehenden Enden zum Erhalt von glatten Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase aufgefüllt. Die Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert, in kompetente Zellen des E. coli-Stamms HB101 (ATCC-Nr. 33694) transformiert und auf ein Tetracyclin- und Carbenicillin- enthaltendes Selektionsmedium gegeben. Zwölf Kolonien wurden selektiert, aus vier dieser Kolonien Plasmide isoliert und diese jeweils mit A bis D bezeichnet. Eine Restriktionskartierung durch EcoRI-Spaltung zeigte, daß die Plasmide A, C und D die erwarteten Fragmente bildeten. Um die Orientierung des β-Lactamasegens in der Konstruktion zu ermitteln, wurde eine Restriktionskartierung mit PstI und PvuI durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten, daß die Plasmide A und C die gleichen Restriktionsfragmente bildeten, während man von Plasmid D ein anderes Muster erhielt, wodurch gezeigt wurde, daß das β-Lactamasegen in beiden Orientierungen cloniert worden war. Die Plasmide C und D wurden in größeren Mengen hergestellt (Ish-Horowicz, a. a. O.) und anschließend durch CsCl-Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation weiter gereinigt. Aliquots von etwa 5 mg wurden unter Verwendung von HaeIII-Methylase gemäß des vom Hersteller (New England Biolabs Inc.) empfohlenen Protokolls methyliert. Dieser Schritt wurde durchgeführt, um die DNA vor einem der Restriktionsenzyme des Gonokokkus zu schützen, das ein Isoschizomer von HaeIII ist (A. Torres et al., J. Clin. Micro 20 (1984), 687-690). Schließlich wurde das Plasmid mit EcoRI gespalten, um das modifizierte Gonokokken- DNA-Fragment freizusetzen, und die DNA zur Transformation kompetenter Gonokokken vom Stamm F62 verwendet.
• Die Transformation wurde durchgeführt, indem etwa 5 x 10&sup7; kompetente Gonokokken in einer 1 mM MgCl&sub2; enthaltenden Gonokokkenbrühe mit 2 ug eines wie vorstehend beschrieben hergestellten Plasmids C oder D 60 Min. in einem Volumen von 1 ml inkubiert wurden. 3 ml frisches Medium wurden zugesetzt und die Kultur weitere 6 Std. gezüchtet. Unterschiedliche Verdünnungen der Kultur wurden anschließend auf GC-Agar (J. Swanson, Infect. Immun. 10 (1978), 320) plattiert, der einen Ampicillin-Konzentrationsgradienten enthielt. Der Gradient wurde etabliert, indem der Mitte der Platte 50 ml einer 1 mg/ml-Ampicillinlösung zugesetzt und nach einigen Minuten dieser Tropfen mit einem sterilen Glasstab in einer Kreisbewegung über die Platte verteilt wurde. In den folgenden 48 Std. wurden Kolonien, die am Rande der durch den Antibiotikagradienten verursachten Hemmungszone gut wuchsen, selektiert und auf einem 3 ug/ml Ampicillin enthaltenden GC- Medium vermehrt. Diese Isolate wurden durch das Nitrozellulose-Disk-Verfahren auf die Produktion von β-Lactamase getestet. Eine einzelne β-Lactamase produzierende Kolonie wurde aus dem Transformationsgemisch, dem Plasmid D zugesetzt worden war, isoliert, und dieser Gonokokkenstamm erhielt die Bezeichnung 2D.
• Stamm 2D ist ein Pili-tragender Gonokokkenstamm, der normal wächst und kein durch SDS-PAGE nach einer Coomassieblau-Färbung (U. Laemmli, Nature 227 (1970), 680) nachweisbares PIII produziert. Die Abwesenheit des PIII- Proteins wurde ferner durch einen Western-Blot (H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1979), 4350-54) unter Verwendung von sowohl für PIII spezifischem Kaninchen- Antiserum als auch einem monoclonalen anti-PIII Antikörper bestätigt. Die aus dem Stamm 2D isolierte DNA wurde durch DNA-Hybridisierung unter Verwendung einer DNA-Sonde, die entweder für das PIII-Gen oder das β-Lactamasegen spezifisch ist, untersucht. Es wurde gezeigt, daß die das PIII-Gen enthaltenden Restriktionsfragmente 2,2 kb größer waren, was auf die Addition des β-Lactamasegens hinwies, und daß Restriktionsfragmente von gleicher Größe mit der β- Lactamase-Sonde in der vom Stamm 2D, jedoch nicht in der vom parentalen Stamm F62 extrahierten DNA nachweisbar waren. Ferner wurde DNA vom Stamm 2D zur Transformation mehrerer anderer Gonokokkenstämme verwendet, beispielsweise von UUI (E. C. Lynch et al., Biophys. J. 45 (1984), 104-107) und PGH 3-2 (C. C. Brinton et al., "Immunobiology of N. gonorrhoeae", Amer. Soc. for Micro. (1978), 155-178), und immer wurden Mutanten erzeugt, die kein PIII produzieren konnten.
Konstruktion II
• Im allgemeinen den für Konstruktion I skizzierten Verfahren folgend wurde ein zweite Konstruktion durchgeführt, wobei ein Markergen verwendet wurde, das anstelle des β-Lactamasegens eine Erythromycinresistenz übertrug. Dieses als Erm bezeichnete Gen wurde durch Spaltung mit ClaI und HindIII aus dem Bacillus subtilis-Plasmid pIM13 (S. J. Projan et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 5131-5139) isoliert und in den mit den gleichen Restriktionsenzymen gespaltenen Plasmidvektor pHSS6 (H. S. Seifert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 735-739) cloniert. pHSS6/Erm wurde in Brühe gezüchtet, das Plasmid präpariert, anschließend mit ClaI und HindIII gespalten und die überstehenden 5'-Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Die DNA wurde durch Elektrophorese auf niedrig schmelzender Agarose getrennt und die das Erm-Gen enthaltende Bande ausgeschnitten.
• Die EcoRI-Insertion von ggt11-Clon 33 wurde in den Vektor pUC9 (Pharmacia) cloniert. Dieses Plasmid pUC9/33 wurde mit XbaI gespalten und die überstehenden 5'-Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase aufgefüllt. Die DNA wurde durch Elektrophorese auf niedrig schmelzender Agarose getrennt und die DNA-Hauptbande ausgeschnitten. Diese DNA wurde mit dem gereinigten, aufgefüllten Erm-Gen vermischt, wie von Struhl beschrieben (Biotechniques 3 (1985), 452-53) ligiert, zur Transformation-des kompetenten Stamms DH5 verwendet und auf ein 50 ug/ml Carbenicillin und 100 ug/ml Erythromycin enthaltendes LB-Agarmedium gegeben. Einige Clone wurden isoliert und durch Restriktionskartierung mit EcoRI charakterisiert.
• Ein bestimmter Clon mit der Bezeichnung pUC9/PIII/Erm wurde mit EcoRI gespalten, die Insertion mit dem mit EcoRI gespaltenen Vektor pHSS6 ligiert, die Transformanten auf 40 g/ml Kanamycin und 100 ug/ml Erythromycin enthaltenden LB- Platten selektiert, einige Clone isoliert, durch Restriktionskartierung mit EcoRI charakterisiert und das durch Spaltung mit EcoRI aus dem Clon #1 isolierte PIII/Erm-Gen, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
• Das PIII/Erm-Gen wurde in das EcoRI-gespaltene Plasmid pLES2, einen Shuttle-Vektor, der in Gonokokken wachsen kann (D. C. Stein et al., Gene 25 (1983), 241-47), cloniert. Dies wurde durch Ligierung und Transformation in kompetente E. coli und Selektion auf Carbenicillin und Erythromycin enthaltendem LB-Agar durchgeführt. Das Plasmid wurde isoliert und, wie vorstehend beschrieben, mit HaeIII- Methylase methyliert. Die DNA wurde mit EcoRI gespalten, um das PIII/Erm-Fragment (die Gonokokken-DNA, die durch den Antibiotika-Marker unterbrochen ist) freizusetzen, und die DNA zur Transformation von kompetenten F62-Gonokokken, wie vorstehend beschrieben, verwendet. Nach der Transformation und weiteren Züchtung 6 Std. in Flüssigmedium wurden Verdünnungen des Transformationsgemisches auf GC-Agarplatten mit einem Erythromycin-Gradienten, der, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von 50 ul einer 500 ug/ml Erythromycinlösung etabliert worden war, plattiert.
• Nach 48 Std. wuchsen viele Kolonien in der Zone der Antibiotika-Hemmung. Diese wurden abgenommen und auf 0,1 ug/ml Erythromycin enthaltendem GC-Agar vermehrt. Diese Clone wuchsen gut, und es wurde durch einen Western-Blot unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers gezeigt, daß sie kein nachweisbares PIII enthielten.
• Der N. gonorrhoeae-Stamm 2D, der keine als Antigen wirksamen Mengen PIII exprimieren konnte, wurde am 28. Juni 1988 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 53787.
Konstruktion III
• Sowohl das Klasse 4- als auch das PIII-Gen enthalten eine PvuII-Stelle, die der Position der 4. Aminosäure des Signalpeptids entspricht. Beide Gene enthalten außerdem eine einzige ClaI-Stelle 90 Nucleotide nach den Stopcodons der jeweiligen Proteine. pBR322 (überall im Handel und als ATCC 31344 erhältlich) wurde gemäß den Herstellerangaben mit PvuII und ClaI gespalten und anschließend wurde der Vektor erneut ligiert, nachdem die Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase aufgefüllt worden waren. Diese Schritte wurden lediglich durchgeführt, um einen geeigneten Vektor, dem diese beiden Restriktionsstellen fehlten, zu erhalten. (Vgl. Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. (Hrsg.), Greene Publishing Assoc. (1987), S. 3.5.8). Nachdem dieser Vektor verfügbar war, wurde das Klasse 4- bzw. das PIII-Gen in die einzige EcoRI-Stelle cloniert und das erhaltene Plasmid durch Restriktionsenzymkartierung charakterisiert. Anschließend wurden die erhaltenen Plasmide mit PvuII und ClaI gespalten, die Enden mit dem Klenowfragment der DNA-Polymerase repariert und anschließend das ErmC'-Gen vom Bacillus subtilis-Plasmid pIM13, wie vorstehend beschrieben, in dieses Plasmid cloniert. Daher ist das Klasse 4-Gen vom Signalpeptid bis hinter das Stopcodon deletiert und durch diesen mit Erythromycin selektierbaren Marker ersetzt. Diese DNA wurde nach der Charakterisierung durch Restriktionsenzymkartierung zur Transformation des Meningokokkusstamms M1080 verwendet und eine Mutante isoliert, die eine erhöhte Resistenz gegen Erythromycin aufwies und keine nachweisbaren Mengen des Klasse 4-Proteins mehr produzierte. Dieser transformierte Stamm wurde am 27. Juni 1989 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 53924.
• Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wurde die entsprechende PIII-Deletionskonstruktion hergestellt und zur Transformation eines Gonokokkenstamms verwendet, wobei als Ergebnis eine Transformante erhalten wurde, die kein nachweisbares PIII mehr produzierte. Diese Transformante wurde am 27. Juni 1989 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung Neisseria gonorrhoeae F62 delta PIII hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 53925.
Isolierung von Protein I
• PI wurde aus dem Stamm 2D, der PIII-minus war, unter Verwendung von Variationen bereits beschriebener Verfahren (M. S. Blake et al., Infect. Immun. 36 (1982), 277), M. S. Blake et al., J. Exp. Med. 159 (1984), 452, und E. J. Lytton et al., J. Exp. Med. 164 (1986), 1749) isoliert. Die Bakterienmutanten wurden durch Zentrifugation geerntet und langsam in einem gleichen Volumen 1,0 M Natriumacetat, das 1 mM 2,3-Dimercaptopropanol enthielt, bei einem pH-Wert von 4,0 resuspendiert. Dieser Suspension wurden 6 Volumina 5 % (Gew./Vol.) N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammoniumpropansulfonat (Zwittergent: Z 3,14) (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, Ca) in 0,5 M CaCl&sub2; zugesetzt und 1 Std. gerührt. Zwei Volumina absolutes Ethanol wurden langsam zugesetzt, um eine Konzentration von 20 % (Vol./Vol.) zu erhalten. Der Niederschlag, der den größten Teil der Nucleinsäuren enthielt, wurde durch 15-minütige Zentrifugation mit 17 000 x g entfernt. Die Ethanolkonzentration im Überstand wurde auf 80 % (Vol./Vol.) erhöht und der erhaltene Niederschlag durch Zentrifugation gewonnen. Dieser PI enthaltende Niederschlag wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA und 5 % Z 3,14 resuspendiert. Das Gemisch wurde 1 Std. gerührt und durch 15-minütige Zentrifugation mit 12 000 x g geklärt. Das lösliche Material wurde auf zwei Säulen (2,6 x 30 cm), die als Tandem verbunden waren, aufgetragen, wobei eine mit DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) und die zweite mit CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia) gefüllt war und beide mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA und 0,05 % Z 3,14 äquilibriert waren. Das Eluat wurde durch Absorption bei 280 nm und SDS-PAGE überwacht. Nach Auftragen der Probe wurden die Säulen mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm die Basislinie erreichte. Der größte Teil von PI floß durch beide Säulen. Der Durchfluß wurde gewonnen und das PI durch Zugabe von absolutem Ethanol zu einer Konzentration von 80 % (Vol./Vol.) ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch 15-minütige Zentrifugation mit 12 000 x g gewonnen. Dieser Niederschlag wurde in 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, zusammen mit 10 mM EDTA und 5 % Z 3,14 gelöst und auf eine Säule (2,6 x 170 cm) aus Sephacryl S-300 (Pharmacia) aufgetragen. Der Elutionspuffer enthielt 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM EDTA und 0,05 % Z 3,14 bei einem pH-Wert von 8,0, und die Fließgeschwindigkeit war 10 ml/Std.. 7,5 ml-Fraktionen wurden auf ihre Absorption bei 280 nm überwacht, gesammelt und durch SDS-PAGE analysiert. Die PI-enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in immunisierenden Präparaten verwendet.
Herstellung des Impfstoffs
• Mit der Herstellung von Impfstoffen, die Peptidsequenzen als aktive Bestandteile enthalten, ist man im Stand der Technik gut vertraut. Üblicherweise werden diese als injizierbare Impfstoffe entweder als Lösungen oder als Suspensionen hergestellt. Feste Formen, die vor der Injektion in Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert werden können, können ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann außerdem emulgiert werden. Der aktive immunogene Bestandteil wird häufig mit Excipienten vermischt, die mit dem aktiven Bestandteil pharmazeutisch verträglich und kompatibel sind. Geeignete Excipienten sind beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliches und Kombinationen davon. Ferner kann der Impfstoff gegebenenfalls geringe Mengen von Hilfssubstanzen, beispielsweise Netzmittel oder Emulgatoren, den pH-Wert puffernde Substanzen oder Adjuvantien, enthalten, die die Wirksamkeit des Impfstoffs erhöhen. Die Impfstoffe werden üblicherweise parenteral, durch Injektion, beispielsweise entweder subcutan oder intramuskulär verabreicht. Beispiele für weitere für andere Verabreichungswege verwendbare Formulierungen sind Zäpfchen und gelegentlich orale Formulierungen. Zäpfchen können als übliche Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkylenglycole oder Triglyceride enthalten. Diese Zäpfchen können beispielsweise aus Gemischen gebildet werden, die 0,5 bis 10 %, vorzugsweise 1 bis 2 %, aktiven Bestandteil enthalten. Orale Formulierungen enthalten übliche Excipienten, beispielsweise pharmazeutisch reines Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumkarbonat etc.. Diese Zusammensetzungen werden als Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, verzögert freisetzende Formulierungen oder Pulver verwendet und enthalten 10 bis 95 %, vorzugsweise 25 bis 70 %, aktiven Bestandteil.
• Die Proteine können im Impfstoff neutral oder als Salz formuliert werden. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Salze sind Salze, die durch Säurezugabe (mit den freien Aminogruppen des Peptids) gebildet werden, und Salze, die mit anorganischen Säuren, beispielsweise mit Chlorwasserstoff- oder Phosphorsäuren, oder solchen organischen Säuren wie Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure etc. gebildet werden. Die mit den freien Carboxylgruppen gebildeten Salze können ferner von anorganischen Basen stammen, beispielsweise von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden, und organischen Basen, wie beispielsweise Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc..
• Die Impfstoffe werden in einer mit der Dosierung der Formulierung verträglichen Weise und in therapeutisch wirksamen und immunogenen Mengen verabreicht. Die verabreichte Menge hängt von der zu behandelnden Person, der Fähigkeit des Immunsystems der behandelten Person zur Synthese von Antikörpern und dem Grad des gewünschten Schutzes ab. Die genauen Mengen des zur Verabreichung erforderlichen aktiven Bestandteils sind vom Arzt festzulegen und sind individuell verschieden. Geeignete Dosierungsbereiche sind jedoch in der Größenordnung von mehreren hundert Mikrogramm aktivem Bestandteil pro Individuum. Geeignete Dosierungspläne für die anfängliche Verabreichung und die Auffrischungsimpfungen variieren ebenfalls, für sie ist jedoch üblicherweise eine anfängliche Verabreichung charakteristisch, wonach im Abstand von einer oder zwei Wochen eine erneute Injektion oder eine weitere Verabreichung folgen.
• In einer anderen Ausführungsform können die PI-enthaltenden Impfstoffe als Liposomen hergestellt werden. Die Liposomen wurden durch eine Variation eines von L. T. Mimms et al., Biochemistry 20 (1981), 833, beschriebenen Verfahrens hergestellt: (1) Das Detergens, in dem das PI gelöst war, wurde gegen D-Octylglucosid (OG) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) ausgetauscht, indem das PI durch Zugabe von Ethanol und 50 mM Natriumacetat zu einer Konzentration von 66,7 % (Vol./Vol.) und durch 10-minütige Zentrifugation dieses Gemisches mit 10 000 x g ausgefällt und der Niederschlag in 10 % (Gew./Vol.) OG in 10 mM Hepes, pH 7,2, resuspendiert wurde, (2) die liposomalen Lipide, synthetisches Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylcholin (PC) (Avanti Inc., Birmingham, AL), das in Chloroform (20 mg/ml) gelöst war, wurden in einem Verhältnis von 4:1 (PE:PC) vermischt und in einer dünnen Schicht an der Innenseite eines mit Säure gereinigten Teströhrchens durch Rotationsverdampfung getrocknet, (3) PI, das in einem Verhältnis von 50:1 (Lipid:PI, (Gew./Gew.)) im OG enthalten war, wurde dem getrockneten PC/PE-Gemisch zugesetzt, wodurch die Lipide gelöst wurden und eine klare Lösung erhalten wurde, (4) die Lösung wurde ausgiebig gegen PBS (pH 7,2) dialysiert, um das OG zu entfernen und die Liposombildung zu induzieren, und (5) die dialysierte Lösung wurde mit Ultraschall (Branson Sonic Water Bath, Plainview, NY) behandelt, um kleine einschichtige Vesikel (SUV) zu bilden.
• Schließlich stellten andere Forscher fest, daß gereinigte Neisseria-Porine immunogen sein können, wenn aus ihnen reine Proteinvesikel - Proteosomen (G. H. Lowell et al., J. Exp. Med. 167 (1988), 658, und Science 240 (1988), 800) gebildet werden. Isoliertes PI aus PIII-minus-Gonokokken wurde ebenfalls zur Herstellung von Proteosomen verwendet, um festzustellen, ob funktionelle Antikörper gegen PI und den lebenden Organismus mit minimalen Zusätzen und Adjuvantien produziert werden können. Das gereinigte PI wurde mit Ethanol (80 % (Vol./Vol.)), wie vorstehend beschrieben, ausgefällt und anschließend in 10 % D-Octylglucosid (Aldrich) in 10 nM Hepes, pH 7,2, resuspendiert. Die Gemische wurden anschließend zweimal gegen 10 mM Phosphatpuffer, pH 8,0, dialysiert. Ein öliges Gemisch wurde erhalten und seine Proteinkonzentration berechnet (Pierce).
• Diese Erfindung betrifft innerhalb ihres Schutzbereichs die Verwendung der "PIII-losen"-Mutanten zur Gewinnung von Proteosomprotein. Daher weisen die erfindungsgemäß gebildeten Proteosomen nicht den Nachteil der Verunreinigung mit PIII auf und werden daher keine unerwünschte immunologische Antwort hervorrufen, wenn sie allein oder als ein Adjuvans mit anderen Antigenen verwendet werden.
• Die verschiedenen Liposom- oder Proteosomimpfstoffe werden zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet, und die induzierte Immunantwort wird gemäß etablierter Verfahren ermittelt (LM. Wetzler et al., Proc. 5th Int'l Path. Neisseria Conf. Sept. 1986, Netherlands, und UCLA- Symposia: Technol. Advances in Vaccine Devel., L. Lasky (Hrsg.) (1988)).

Claims (15)

1. Mutantenstamm der Gattung Neisseria, der keine immunologisch wirksamen Mengen eines PIII-ähnlichen Proteins produzieren kann, wobei das PIII-ähnliche Protein ein Protein ist, das auf der Zelloberfläche von Neisseria vorkommt und die Bildung blockierender Antikörper induzieren kann, die init dem PIII-Protein oder dein Klasse 4- Protein reagieren, und/oder das mit den Antikörpern immunologisch reagiert.

2. Mutantenstamm nach Anspruch 1, wobei das PIII-ähnliche Protein ein PIII- oder Klasse 4-Protein ist.

3. Mutantenstamm nach Anspruch 1 oder 2, weiter dadurch gekennzeichnet, daß er zur Art Neisseria gonorrhoeae oder Neisseria meningitidis gehört.

4. Mutantenstamm nach Anspruch 3, weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß er die identifizierenden Eigenschaften von ATCC Nr. 53787, ATCC Nr. 53924 oder ATCC Nr. 53925 hat.

5. Verfahren zur Herstellung eines Neisseria-Antigens, das frei ist von immunologisch wirksamen Mengen eines PIII- ähnlichen Proteins, wobei das PIII-ähnliche Protein ein Protein ist, das auf der Zelloberfläche von Neisseria vorkommt und das die Bildung von blockierenden Antikörpern induzieren kann, die mit dem PIII-Protein oder dem Klasse 4-Protein reagieren, und/oder das mit den Antikörpern immunologisch reagieren kann, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Züchtung des Mutantenstamms nach einem der Ansprüche 1 bis 4, und

(b) Gewinnung des Antigens daraus.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Antigen ein Zelloberflächenantigen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Zelloberflächenantigen ein PI-, PII-, Pilin-, LPS- oder eisenbindendes Protein ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, der ein Neisseria-Antigen enthält, welches frei ist von immunologisch wirksamen Mengen eines PIII-ähnlichen Proteins, wobei das PIII-ähnliche Protein ein Protein ist, das auf der Zelloberfläche von Neisseria vorkommt und die Bildung von blockierenden Antikörpern induzieren kann, die mit dem PIII-Protein oder dem Klasse 4-Protein reagieren können, und/oder das mit den Antikörpern immunologisch reagiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Züchtung des Mutantenstamms nach einem der Ansprüche 1 bis 4,

(b) Gewinnung des Antigens daraus, und

(c) Vermischen einer immunologisch wirksamen Menge des Antigens und eines physiologisch verträglichen Trägers.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Antigen ein Zelloberflächenantigen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Zelloberflächenantigen ein PI-, PII-, Pilin-, LPS- oder eisenbindendes Protein ist.

11. Neisseria PI-Antigen, das:

(a) frei ist von immunologisch wirksamen Mengen eines PIII-ähnlichen Proteins, wobei das PIII-ähnliche Protein ein Protein ist, das auf der Zelloberfläche von Neisseria vorkommt und die Bildung blockierender Antikörper induzieren kann, die mit dem PIII-Protein oder dem Klasse 4-Protein reagieren, und/oder das mit den Antikörpern immunologisch reagiert, und

(b) gemäß dem Verfahren von Anspruch 5 erhalten wird.

12. Impfstoff, umfassend eine immunologisch wirksame Menge des PI-Antigens nach Anspruch 11 im Gemisch mit einem physiologisch verträglichen Excipienten.

13. Impfstoff nach Anspruch 12, wobei der Excipient ein Liposom ist.

14. Impfstoff nach Anspruch 12, wobei der Excipient ein Proteosom ist.

15. Impfstoff nach einem der Ansprüche 12 bis 14 für die Immunisierung eines Tieres oder Menschen gegen Neisseria- Infektionen.