DE69434778T2

DE69434778T2 - Rekombinanter vektor mit gensequenz von lipoproteine zur nukleotidefrequenzen expression

Info

Publication number: DE69434778T2
Application number: DE69434778T
Authority: DE
Inventors: Raymond Hamers; Pierre Cornelis
Original assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Vrije Universiteit Brussel VUB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1994-08-02
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2014-08-03
Also published as: ATE331795T1; FR2708622B1; AU722138B2; US6130085A; EP0712414B1; WO1995004079A1; EP0712414A1; DE69434778D1; AU7497494A; JPH09503649A; CA2168426A1; FR2708622A1

Description

Die Erfindung betrifft einen rekombinanten Vektor, der eine Sequenz eines Gens für die Struktur eines Lipoproteins (Lipoproteinstruktur) zur Expression von Nukleotidsequenzen enthält.
Eine der Aufgaben der Erfindung ist es, neue Mittel bereitzustellen, um durch gentechnische Verfahren Proteine, Polypeptide oder Peptide in Form von Produkten herzustellen (möglicherweise als Fusionsprodukte), die geeignet sind, auf der Stufe der äußeren Membran der Zelle, die sie herstellt, präsentiert zu werden. In anderen Worten liefert die Erfindung Vektoren zur Expression extrazellulärer Proteine, die in der Membran der Zellen verankert sind, durch rekombinante Zellen.
Im Stand der Technik kennt man verschiedene Vektoren, die es erlauben, in rekombinanten zellulären Wirten Aminosäuresequenzen zu exprimieren, und die gegebenenfalls die Bereitstellung dieser Proteine an der Oberfläche des zellulären Wirts erlauben. Man hat zum Beispiel im Stand der Technik Plasmide oder Phagen zu Hilfe genommen, um Polypeptide in gram-negativen Bakterien zu exprimieren und an ihrer Oberfläche zu präsentieren.
So haben Francisco J.A. et al. (Bio/Technology, Bd. 11, April 1993, S. 491–495) in E. coli eine Exoglucanase in Form eines Hybridproteins (Fusionsproteins) mit der Transmembrandomäne des Proteins OmpA exprimiert, das natürlicherweise in der äußeren Membran von E. coli enthalten ist, wobei sie selbst mit den ersten neun Aminosäuren des hauptsächlichen Lipoproteins von E. coli (immer noch Braun-Lipoprotein (Lpp) genannt, exprimiert auf der Stufe der äußeren Membran) fusioniert ist. Gemäß Francisco et al. ist das so erhaltene Fusionsprotein an der Oberfläche der äußeren Membran von E. coli verankert.
Francisco et al. nahmen ein Fusionsprodukt zu Hilfe, das die Präsentation der Exoglucanase auf der Oberfläche von E. coli im Schoß dieser Hybridkonstruktion erlaubt.
Andere Autoren, Fuchs P. et al. (Bio/Technology, Bd. 9, Dezember 1991, S. 1369–1372) haben die Expression eines Fusionsproteins in E. coli beschrieben, das durch die variablen Domänen der schweren Ketten und der leichten Ketten eines Antikörpers gebildet ist, fusioniert mit dem Lipoprotein, das an Peptidoglycane (PAL) von E. coli assoziiert ist. Um ein Fusionsprodukt zu erhalten, das auf der Oberfläche von E. coli-Zellen zugänglich ist, wurde eine Exportsequenz einer Pektinlyase verwendet, und das N-terminale Cystein des PAL wurde in Glycin umgewandelt, was damit das Anlagern von Lipiden der äußeren Zellmembran an das normalerweise im PAL vorhandene Cystein verhindert.
Die Lipoproteine, die durch Fuchs et al. gemäß der vorstehend erwähnten Veröffentlichung eingesetzt wurden, sind Lipoproteine, die zur Cytoplasmamembran der Zelle gehören. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben sich für andere Lipoproteine interessiert, besonders für Lipoproteinstrukturen, die zum Braun-Lipoprotein von E. coli analog sind, insoweit sie die Fähigkeit besitzen, sich einerseits an die äußere Zellmembran und andererseits in bestimmten Fällen an Peptidoglycane anzulagern.
Diese Lipoproteine wurden im Rahmen der Erfindung verwendet, um rekombinante Vektoren herzustellen, die besonders zur Expression und zum Export von Aminosäuresequenzen an die Oberfläche der äußeren Membran von rekombinanten Zellen bestimmt sind.
Bevorzugt ist das verwendete Lipoprotein kein Lipoprotein von E. coli.
Die Erfindung hat zur Aufgabe einen rekombinanten Vektor für die Klonierung und/oder die Expression und/oder den Transfer in einen zellulären Wirt einer heterologen Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass er an einer für seine Replikation nicht essentiellen Stelle das Gen umfasst, das für ein von den Lipoproteinen von E. coli verschiedenes Lipoprotein kodiert, oder einen Teil dieses Gens, der für die Kontrolle der Expression dieses Lipoproteins und seiner Präsentation auf der Oberfläche der äußeren Zellmembran des Wirts notwendigen Elemente enthält, wobei die heterologe Nukleotidsequenz geeignet ist, in das Gen oder den Teil des Gens, der das Lipoprotein kodiert, eingefügt zu werden, unter Bedingungen, die die Expression dieser heterologen Sequenz und die Präsentation des erhaltenen Polypeptids auf der Oberfläche des zellulären Wirts erlauben.
Unter dem Begriff „heterologe Nukleotidsequenz" versteht man jede Nukleotidsequenz, die nicht natürlicherweise im nicht-rekombinierten Vektor enthalten ist, der zum Herstellen der erfindungsgemäßen Vektoren verwendet wird.
Die Größe der Nukleotidsequenz kann beträchtlich variieren, von einigen Nukleotiden (z. B. 9) bis zu mehreren Hunderten Nukleotiden, z. B. bis zu 1 kb oder 2 kb.
In anderen Worten kann die im Vektor enthaltene Nukleotidsequenz Proteine kodieren, die ein Molekulargewicht haben, das bis zu etwa 100 kDa variieren kann.
Die heterologe Nukleotidsequenz ist vorzugsweise auf der Stufe des N-terminalen Teils des reifen Lpp-Proteins eingeführt, z. B. 3 bis 4 Aminosäuren nach dem N-terminalen Ende.
Vorzugsweise ist die Lipoproteinstruktur, von der nachstehend die Rede ist, eine Lipoproteinstruktur eines Bakteriums.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor enthält ein Lipoprotein, das Lipoproteinstruktur genannt wird, im Gegensatz zum Lipoprotein PAL von E. coli.
Vorzugsweise handelt es sich um ein Lipoprotein eines gram-negativen Bakteriums.
Das Gen, das dieses Lipoprotein kodiert, ist vorzugsweise in seiner Gesamtheit in den Vektor eingeführt. Jedoch kann man gleichermaßen nur einen Teil oder mehrere Teile dieses Gens verwenden, so lange die notwendigen Elemente zur Kontrolle der Expression des Lipoproteins und seiner Präsentation auf der Oberfläche der äußeren Zellmembran des zellulären Wirts, der durch den erfindungsgemäßen Vektor modifiziert ist, in der Konstruktion vorhanden sind. Insbesondere wird man einen Teil des Gens zu Hilfe nehmen, der ein Lipoprotein kodiert, das das enthält, was man die „Lipoprotein-Box" nennt (Milton J. et al., CRC Press (1993) International Standard Book Number 0-8493-6740-9, Kapitel 6, S. 163–181). Diese Region entspricht einer Carboxy-terminalen Region, die in der Signalsequenz des Lipoproteins vorhanden ist.
Das Gen oder der Teil des Gens, das/der ein Lipoprotein kodiert, wird in den erfindungsgemäßen Vektor in einer Weise eingefügt, dass dieses Gen oder dieser Teil des Gens zusätzlich eine heterologe Nukleotidsequenz enthalten kann, die in dem Lipoprotein in einer Weise vorhanden ist, dass sie exprimiert und auf der Oberfläche der Zellmembran eines Wirts, bei dem man vorher den rekombinanten Vektor eingeführt hat, exprimiert und präsentiert wird.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist der rekombinante Vektor dadurch gekennzeichnet, dass das Gen, das die Lipoproteinstruktur oder den Teil des Genes kodiert, durch die Insertion einer heterologen Nukleotidsequenz modifiziert ist.
Diese Insertion kann daher nach dem Einführen des Gens des Lipoproteins oder eines Teils dieses Gens in einen gegebenen Vektor durchgeführt werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann man gleichermaßen eine heterologe Nukleotidsequenz in das Lipoprotein-Gen oder einen Teil dieses Gens einführen, und anschließend diese rekombinante Sequenz in den Vektor einführen, der ausgewählt wurde, um einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor zu konstruieren.
Vorteilhafterweise ist der rekombinante Vektor ein Plasmid.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist das Lipoprotein, von dem man das Gen oder einen Teil des Gens verwendet, ein heterologes Protein in Bezug auf den zellulären Wirt, der den Vektor enthält.
In anderen Worten, dieses spezifische Lipoprotein ist nicht natürlicherweise in dem zellulären Wirt vorhanden, der zur Expression und/oder der Klonierung des erfindungsgemäßen rekombinanten Vektors gewählt wird. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass der gewählte zelluläre Wirt natürlicherweise ein anderes Lipoprotein exprimiert.
Bevorzugt ist das Gen, das das Lipoprotein oder einen Teil dieses Gens kodiert, das verwendet wird, um den erfindungsgemäßen Vektor herzustellen, das Gen, das das hauptsächliche Lipoprotein der äußeren Membran eines Bakteriums der Gattung Pseudomonas kodiert. Bevorzugterweise ist das Bakterium ein Bakterium des Typs Pseudomonas aeruignosa.
Andere Lipoproteine können gleichermaßen in dieser Hinsicht verwendet werden, es werden die Braun-Lipoproteine und insbesondere die von S. marcescens erwähnt (Nakamurak et al. PNAS, USA 77 (1980) 1369), E. amylovora (Yamagata H. et al., J. Biol. Chem., 256_(1981) 2194), M. morganii (Huang Y.X. et al., J. Biol. Chem., 258 (1983) 8139), P. mirabilis (Ching G. et al., J. Biol. Chem., 261 (1986) 4600); es kann sich gleichermaßen um andere Proteine von gram-negativen Bakterien, und insbesondere die folgenden handeln: Pullulanase aus K. penumoniae (Chapon C. et al., „Structure of two divergent promoters in front of the gene encoding pullulanase in Klebsiella pneumoniae and positively regulated", J. Bacteriol., 164 (1985) 639), K. aerogenes (Katsuragi N. et al., „Entire nucleotide sequence of pullulanase gene of K. aerogenes WVO", J. Bacteriol., 169 (1987) 2301), Pul S aus K. pneumoniae (d'Enfert C. et al., „K. pneumoniae puIS gene encodes an outer membrane lipoprotein required for pullulanase secretion", J. Bacteriol. 171 (1989) 3673), Chitobiase aus V. harveyi (Soto-Gil R. et al. „Diacetylchitobiase of V. harveyi", J. Biol. Chem., 264 (1989) 14778), β-1,4-Endoglucanase aus P. solanacearum (Huang J. et al. „Excretion of the eft gene product of P. solanacearum", J. Bacteriol., 171 (1989) 3767), Pal und Pcp aus H. influenzae (Deich R. "Cloning of genes encoding a 15,000 Dalton peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein and an antigenically related 15,000 Dalton protein from H. influenzae", J. Bacteriol. 170 (1988) 489), Cytochrom-Untereinheit aus Rps. Viridis (Weyer K., „The cytochrome subunit of the photosynthetic reaction center from Rps. Viridis is a lipoprotein", Biochemistry, 26 (1987) 2909).
Um die Insertion oder die Kontrolle der Insertion der heterologen Nukleotidsequenz in das Gen oder den Teil des Gens des Lipoproteins zu erleichtern, können eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen in dieses Gen oder diesen Teil des Gens eingeführt werden, mit Hilfe z. B. eines Multi-Adapters (Polylinker).
Bevorzugt sind die Restriktionsschnittstellen des Multi-Adapters einzigartig in Bezug auf die Schnittstellen, die natürlicherweise im Vektor vor der Rekombination vorhanden sind und in Bezug auf die Schnittstellen, die im Gen oder dem Teil des Gens, das das Lipoprotein kodiert, vorhanden sind.
Nach der Art des Vektors, der gewählt wird, um den erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor herzustellen, und insbesondere des Promotors, der die Expression der Sequenz kontrolliert, kann die Expression der heterologen Nukleotidsequenz konstitutiv sein oder im Gegensatz dazu z. B. durch Metalle und insbesondere durch Zink oder durch Induktoren wie IPTG induzierbar sein.
Des Weiteren kann ein erfindungsgemäßer Vektor in rekombinanten Zellen in einer permanenten oder vorübergehenden Weise vorhanden sein. In dieser Hinsicht kann die heterologe Sequenz in der Wirtszelle unter Vermittlung des erfindungsgemäßen Vektors in der Form eines Plasmids beibehalten werden. Sie kann gemäß einer Alternative im Gegensatz dazu in die Chromosomen der Wirtszelle integriert sein.
Die vorliegende Anmeldung hat insbesondere zur Aufgabe das Plasmid pLPI34, das bei der Sammlung BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms) beim LMBP (Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie) am 27. Juli 1993 unter der Nummer LMBP2916 hinterlegt wurde.
Andere besonders bevorzugte Vektoren zur Ausführung der Erfindung sind die Vektoren pLPI35 und pLIP36, die in Bezug auf die Vektoren pLPI34 durch die Insertion eines Polylinkers modifiziert sind.
Andere besonders bevorzugte Vektoren sind die Vektoren pVUB-1 und pVUB-2.
Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor stellt ein Mittel dar, um in einem zellulären Wirt Antigene oder in einer allgemeineren Weise Aminosäuresequenzen jeglichen Ursprungs und jeglicher Struktur oder Funktion herzustellen.
Die Fähigkeit des erfindungsgemäßen rekombinanten Vektors, die Aminosäuresequenz, die durch die heterologe Nukleotidsequenz kodiert wird, in einer an der äußeren Zellmembran des zellulären Wirts präsentierten Form zu exprimieren, erlaubt es leicht, die so erhaltene Aminosäuresequenz zu reinigen. Außerdem ist es möglich, die rekombinanten Zellen, besonders die rekombinanten Bakterien, die an ihrer Oberfläche die Aminosäuresequenz exprimieren, die durch die heterologe Sequenz kodiert ist, direkt zu verwenden, ohne eine vorherige Lyse der Wirtszellen zu Hilfe zu nehmen. Dies ist besonders interessant im Fall einer Verwendung von Wirtszellen in Lebendvakzinen.
Insbesondere kann der erfindungsgemäße rekombinante Vektor verwendet werden, um Aminosäuresequenzen zu exprimieren, die eine oder mehrere antigene Determinanten oder ein oder mehrere Haptene enthalten.
Im Allgemeinen erlaubt ein solcher Vektor die Expression eines jeglichen Peptids, Polypeptids, oder jeglichen rekombinanten Proteins. Dieses Peptid, Polypeptid oder dieses Protein wird in Form eines Fusionsprodukts mit dem Lipoprotein oder einem Teil des Lipoproteins, von dem die kodierende Sequenz im rekombinanten Vektor vorhanden ist, exprimiert.
Vorteilhafterweise kann man den erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor verwenden, um eine heterologe Sequenz zu exprimieren, die ein Epitop vom T-Typ eines Antigens, das durch ein pathogenes Mittel bestimmt ist, kodiert. Solche pathogenen Mittel können Bakterien, Viren, Parasiten oder in einer interessierenden Weise jedes Mittel, gegen das man eine Impfwirkung hervorrufende oder therapeutische Aktivität sucht, sein.
Vorteilhafterweise kodiert die heterologe Nukleotidsequenz, die im Vektor enthalten ist, ein T-Epitop eines gegebenen Antigens und ein B-Epitop desselben Antigens oder eines anderen Antigens eines pathogenen Organismus, gegen den man eine Immunisierung sucht.
Aus dem Blickwinkel einer der erfindungsgemäßen Anwendungen, d.h. die Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen, beinhalten die Peptide, Polypeptide oder Fusionsproteine (allgemeiner Fusionsproteine genannt) eines oder mehrere Antigene und/oder eine oder mehrere antigene Determinanten eines pathogenen Mittels wie z. B. eines Parasiten, einer Bakterie oder eines Virus, besonders eines Virus wie dem von Heptatitis A, B oder C, eines HIV-Virus und z. B. Antigene der Hülle von HIV.
Nicht limitierende Beispiele sind im nachstehenden experimentellen Teil gegeben.
Gemäß einer anderen speziellen Ausführungsform der Erfindung enthält der Vektor eine heterologe Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Antikörpers kodiert. Eine solche Sequenz kann eine Aminosäuresequenz einer schweren Kette oder einer leichten Kette eines Antikörpers mit vier Ketten sein, oder noch vorteilhafter eine Sequenz, die einen nicht-pathologischen Antikörper kodiert, der ausschließlich aus schweren Ketten gebildet ist.
In dieser Hinsicht wird Bezug genommen auf die Veröffentlichung von Hamers et al., Nature, Bd. 363, 3. Juni 1993, S. 446–448, die den Erhalt und die Charakterisierung solcher Antikörper beschreibt.
Eine Aufgabe der Erfindung ist gleichermaßen eine rekombinante Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor modifiziert ist. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung exprimiert diese Wirtszelle nicht natürlicherweise das Lipoprotein, das durch das Gen oder den Teil des Gens, das/der im Vektor enthalten ist. Eine solche Wirtszelle ist z. B. ein gram-negatives Bakterium und besonders ein Stamm von E. coli oder ein Stamm von Alcaligenes eutrophus.
Der Vektor, der durch Nukleotidsequenzen modifiziert ist, die einen Antikörper kodieren, kann z. B. in eine Wirtszelle eingeführt werden, insbesondere in ein Bakterium, das dann die Fähigkeit besitzt, Antikörper herzustellen, die auf der Oberfläche des Wirts präsentiert werden, wobei die rekombinanten Zellen auch z. B. als Adsorbans zur Reinigung von Antigenen verwendet werden können.
Eine Aufgabe der Erfindung ist gleichermaßen ein rekombinantes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Expressionsprodukt durch einen vorstehend definierten zellulären Wirt, ein Gen oder einen Teil eines Gens eines Lipoproteins und um eine heterologe Nukleotidsequenz handelt.
Ein erfindungsgemäßes rekombinantes Protein ist ein Fusionsprotein zwischen einem Lipoprotein, ausgewählt aus Lipoproteinen, die von denen von E. coli verschieden sind und/oder einem Teil eines solchen Lipoproteins und einer bestimmten Aminosäuresequenz.
Dieses rekombinante Protein hat, wenn es eine oder mehrere antigene Determinanten enthält, die Eigenschaft, in vivo die Herstellung von Antikörpern zu erlauben, die gegen die antigenen Determinanten gerichtet sind, die von der oben definierten heterologen Nukleotidsequenz kodiert werden, ohne dass diese Herstellung durch die Gegenwart des Trägermoleküls, in diesem Fall das Lipoprotein, gestört wird.
Daneben zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass das bereitgestellte Fusionsprotein in vivo die Herstellung eines Antikörpers gegen das Antigen, das von der heterologen Sequenz kodiert wird, erlaubt, ohne dass es notwendig ist, zur verabreichten Zusammensetzung ein Adjuvans zuzufügen.
Aufgabe der Erfindung sind daher immunogene Zusammensetzungen, die als aktiven Wirkstoff rekombinante Proteine wie vorstehend definiert umfassen, die eine oder mehrere antigene Determinanten tragett, gegen die man Antikörper zu erhalten sucht.
Andere immunogene Zusammensetzungen umfassen die erfindungsgemäßen rekombinanten zellulären Wirte.
Die Erfindung zielt außerdem auf polyklonale oder monoklonale Antikörper ab, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein erfindungsgemäßes rekombinantes Protein oder Fusionspolypeptid erkennen, das zum einen Teil die Sequenz, die das Gen oder einen Teil des Gens des Lipoproteins kodiert, und zum anderen Teil die Aminosäuresequenz, die von der heterologen Nukleotidsequenz kodiert wird, umfassen.
Spezielle erfindungsgemäße monoklonale Antikörper sind insbesondere dadurch charakterisiert, dass sie die Sequenz erkennen, die durch das Gen oder einen Teil des Gens des Lipoproteins kodiert wird, und dass sie das vorstehend definierte Fusionspolypeptid nicht erkennen, das zum einen die Sequenz, die durch das Gen oder einen Teil des Gens des Lipoproteins kodiert wird, und zum anderen die Aminosäuresequenz, die durch die heterologe Nukleotidsequenz kodiert wird, umfasst.
Ein besonders interessanter Antikörper ist der Antikörper KF9, der vom Hybridom KF9 hergestellt wird, das bei der ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures Salisbury, Vereinigtes Königreich) unter der Nummer 93073008 am 30. Juli 1993 hinterlegt wurde. Dieser Antikörper hat den sehr interessanten Vorteil, das Lipoprotein, das durch den Vektor exprimiert wird, zu erkennen und dieses Lipoprotein oder einen Teil des Lipoproteins nicht zu erkennen, wenn es/er durch ein Insert modifiziert ist, das einer heterologen Nukleotidsequenz einer größeren Größe als der eines Multi-Adaptors entspricht. Daher kann dieser Antikörper z. B. verwendet werden, um nach der Expression erfindungsgemäßer Polypeptide zu screenen.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung erscheinen in den folgenden Beispielen und Figuren.
1:

Konstruktion der Vektoren pLPI35 und pLPI36

pLPI35 und pLPI36 sind Vektoren mit geringer Kopienzahl, die die konstitutive Expression des Lipoproteins, von dem die kodierende Sequenz durch Zufügen eines Polylinkers im Leserahmen modifiziert wurde, erlauben.
Das Plasmid pLPI1 stammt vom Vektor pKT240 ab. Er enthält ein SalI-Fragment des Lipoproteins von P. aeruginosa, das eine Größe von 2,94 kb hat, kloniert in die XhoI-Schnittstelle des Vektors.
Die erste Stufe der Konstruktion geht vom ursprünglichen Plasmid pLPI1 aus, das man mit SstI geschnitten hat und mit Bal31 verdaut hat, um fortschreitend DNA in beiden Richtungen beginnend von der SstI-Schnittstelle zu entfernen (unter den Bedingungen, die in „Molecular Cloning – A laboratory manual second edition" – Sambrook et al (1989) beschrieben sind).
Ein Klon, der stets das Lipoprotein von P. aeruginosa herstellen würde, wurde durch positive Reaktion mit einem monoklonalen Anti-Lipoprotein-Antiserum ausgewählt.
Nach Erhalt der Plasmidkarte wurde pLPI34 dargestellt. pLPI34 hat 2 kb DNA und die folgenden Restriktionschnittstellen verloren: EcoRI, HpaI, NruI, SphI (2x), SstIl, SstI. Das Plasmid pLPI34 enthält eine einzigartige Schnittstelle für SphI gegen Ende des Leserahmens des Lipoprotein-Gens (OprI).
Schritt 2 besteht aus dem Klonieren eines Polylinkers mit überhängenden SphI-Enden, der die Schnittstellen HpaI (stumpfe Enden), EcoRI und BtglII enthält. Die Plasmide pLPI35 und pLPI36 enthalten den Polylinker in beiden Orientierungen. Der Polylinker wurde so entworfen, dass er nicht den Leserahmen unterbricht, egal wie die Orientierung des Inserts ist.
Die zwei Plasmide erlauben die Insertion von DNA-Fragmenten, die durch die folgenden Enzyme geschnitten sind: BglII, BamHI, Sau3A und MboI (in der BglII-Schnittstelle), EcoRI und egal welches Fragment mit stumpfen Enden (in der HpaI-Schnittstelle). Sie treten in einer geringen Kopienzahl auf (4 bis 5) und sind konjugativ, d.h. sie können durch Konjugation auf andere gram-negative Bakterien übertragen werden.
Die Expression des Lipoproteins ist in diesen Vektoren konstitutiv.
Ein monoklonaler Antikörper, KF9, erkennt immer das Lipoprotein, das durch pLPI36 hergestellt wird, aber er reagiert nicht mehr, wenn ein Fragment in die vorstehend genannten Klonierungsstellen insertiert wurde.
Die Expression des Fusionsproteins zwischen dem Lipoprotein und dem Insert ist konstitutiv dank des eigenen Promotors des Lipoproteins.
2:

Konstruktion der Vektoren pVUB-1 und pVUB-2.

Der Expressionsvektor pKK233-2 (Pharmacia) wurde verwendet: seine EcoRI-Schnittstelle wurde durch Restriktion beseitigt, dann wurde eine Auffüllung mit dem Klenow-Fragment und eine Ligation bewirkt.
Das daraus resultierende Plasmid, pKK233*, wurde anschließend durch NcoI geschnitten, mit Klenow behandelt, und mit einem durch PCR ampflifizierten Fragment ligiert, das dem gesamten offenen Leserahmen (ORF) des modifizierten Lipoprotein-Gens von pLPI35 oder pLIP36 (lpp35 und lpp36, siehe Schritt 2) entspricht. Dies ergab die zwei Vektoren pVUB-1 und pVUB-2.
In diesen Vektoren mit hoher Kopienzahl wird die Expression des Lipoproteins durch IPTG kontrolliert. Um eine Expression vor der Induktion zu vermeiden, werden die Kulturen bevorzugt in B-Medium + Glucose oder in M9-Medium + Glucose durchgeführt.
Die Sequenzen der Polylinker, die verwendet wurden, um die Vektoren pVUB-1 und pVUB-2 zu konstruieren, werden in den 2F und 2G gezeigt.
3:

Kodierende Sequenz und Aminosäuresequenz, die dem hauptsächlichen Lipoprotein der Membran von Pseudomonas aeruginosa entsprechen.

4:

(A) Rekombinante Klone von E. coli JM 109, modifiziert durch den Vektor pVUB-1, der ein Fragment der DNA E. stR1 eines Antigens von Emeria stiedae enthält. Nachweis der positiven Klone durch radioaktive Hybridisierung mit der Sonde E. stR1.
(B) Markieren mit Immunogold und Elektronenmikroskopie von E. coli JE5513 (lpp-), transformiert mit dem Plasmid pLPI34, das das Gen des Lipoproteins von P. aeruginosa enthält. Die Zellen haben mit AcM FA2.5 und Goldpartikeln (10 nm), gekoppelt mit Protein A, reagiert (Vergrößerung 45.000 x).

5:

DNA-Extrakt des rekombinanten Klons E. coli JM 109, modifiziert durch den Vektor pVUB-1, der das E.stR1-Fragments eines Antigens von E. stiedae enthält. Visualisierung des DNA-Extrakts auf einem 1–2%-Agarosegel. 1 = Marker λpst1 2 = pVUB.1 (nicht verdaut) 3 = pVUB.1 (verdaut durch EcoRI) 4 = pVUB.1/E.stR1 (nicht verdaut) 5 = pVUB.1/E.stR1 (verdaut durch EcoRI)

6:

(A) Western-Blot-Analyse, um das Fusionsprotein nachzuweisen; durch Reaktion mit einem FA 2.5 Antikörper, gerichtet gegen das Lipoprotein. 1 = Marker 2 = pVUB-1 3 = pVUB-1/E.stR1
(B) Auftrennung der membranhaltigen und zytoplasmatischen Fraktionen der Proteinextrakte von pVUB.1 und pVUB.1/E.stR1 auf einem 17,5% SDS-PAGE-Gel.
(C) Western-Blot der membranhaltigen und zytoplasmatischen Fraktionen der Proteinextrakte von pVUB.1 und pVUB.1/E.stR1: Screenen mit dem monoklonalen FA2.5 (Anti-Lipoprotein)

7:

(A) Inmunfluoreszenz mit anti-S2b-Kaninchenserum, das vorher an E. coli JM109, transformiert mit dem Plasmid pLPI35, adsorbiert ist. (A) E. coli JM 109 mit pLPI35 (B) Klon F3: E. coli JM 109, transformiert mit der Fusion pLPI35-S2b. Die Sequenz S2b enthält T- und B-Epitope.
(B) Immunfluoreszenz mit anti-S2b-Kaninchenserum, das vorher an E. coli JM109, transformiert mit dem Plasmid pVUB1, adsorbiert ist. (A) E. coli JM109 mit pVUB1, nicht induziert (B) Klon F3: E. coli JM 109, transformiert mit der Fusion pVUB1, induziert durch IPTG.
(C) Immunfluoreszenz mit anti-S2b-Kaninchenserum, vorher adsorbiert mit E. coli JM109, transformiert mit dem Plasmid pVUB1. (A) Klon D10 = E. coli JM 109 mit der Fusion pVUB1-S2b, nicht induziert; (B) Klon D10 = E. coli JM 109, transformiert mit der Fusion pVUB1-S2b, induziert mit IPTG. Die Sequenz S2b enthält B- und T-Epitope.

8:

– Insert, das das T-Epitop S2b von Hepatitis B kodiert, kloniert in die Schnittstelle EcoRI des lpp von P. aeruignosa.
– Klonierungsstrategie des T-Epitops S2b in die Vektoren pVUB-1 und pVUB-2.

9:

Sequenzierung des Polylinkers in gegensätzlicher Orientierung für pVUB-1 und pVUB-2. Die Restriktionsschnittstellen des Polylinkers sind durch die Buchstaben H = HpaI, E = EcoRI und B = BglII angezeigt.

10:

Profil des Proteins und Herstellung des Lipoproteins, ausgehend von der Präparation der äußeren Membran, durch Färbung mit Coomassie-Blau (a, b und c) und durch Western-Blot (d und e) unter Verwendung des FA 2.5 anti-lpp-Antikörpers.

11:

Primärstruktur des Gens PcLEMA; C43 und C159 sind die cDNA-Fragmente, die durch die monoklonalen Antikörper erkannt werden; C 159 wird zum Subklonieren in pVUB-1 verwendet.

12:

Restriktionskarte des Vektors Lambda gtl1.

13:

Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel von mit EcoRI verdauten Plasmiden: pVUB1 (Bande 1), pVUB1-650 bp PcLEMA (Bande 3), pVUB2 (Bande 4), pVUB2-650 bp PcLEMA (Bande 5), und durch PstI verdauter Lambda als Marker-Standard (Bande 1).

14:

Profil der Proteine und Herstellung von Lpp ausgehend von Zubereitungen äußerer Membranen, gefärbt mit Coomassie-Blau (a, b, c) und im Western-Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers FA2.5 gegen das Lpp.

Zubereitung äußerer Membranen (a) von pVUB1 (Banden 2, 3, 4 und 5) und pVUB2 (Banden 6, 7, 8 und 9); in Abwesenheit von Induktion, Induktion durch IPTG während einer Stunde (Banden 3 und 7), 3 Stunden (Banden 4 und 8), 6 Stunden (Banden 5 und 9).
Zubereitungen äußerer Membranen von pVUB1 und pVUB2 (c); in Abwesenheit von Induktion (Bande 2), Induktion durch IPTG während 3 Stunden mit Zugabe von FeCl₃ 5 μM (Bande 3), 10 μM (Bande 4), 25 μM (Bande 5), 50 μM (Bande 6), 100 μM (Bande 7). Bande 1 entspricht dem Marker-Standard.
15:

Western-Blot-Analyse von pLPI35 oder pVUB1, fusioniert mit dem Ag PcLEMA, nachgewiesen durch Acm FA2.5, gerichtet gegen lpp (a) und AcM32 gegen pcLEMA (b).

Die Extraktion der gesamten Proteine (a) in Abwesenheit einer Induktion von pVUB1 (Band 2), pLPI 35-650 bp PcLEMA (Bande 3), mit Induktion durch IPTG des pVUB1-650 bp PcLEMA während 30 min (Bande 4 und 5), während 3 Stunden (Banden 5 und 8), 6 Stunden (Banden 6 und 9), Induktion durch IPTG des pVUB1 während 3 Stunden (Bande 10).
Die Extraktion der gesamten Proteine (b) in Abwesenheit einer Induktion des pVUB1 (Bande 2), mit Induktion durch IPTG des pVUB1 (Bande 3), pLPI35-650 bp PcLEMA (Bande 4), mit Induktion durch IPTG des pVUB1-650 bp PcLEMA während 30 min (Bande 5), 3 Stunden (Banden 6 und 7), 6 Stunden (Bande 7). Bande 1 entspricht dem Marker-Standard.
16:

(A) SDS-PAGE der gesamten Proteine der äußeren Membran. 1. pVUB2, induziert während 5 Stunden 2. pC7-Gen gp63 von leishmania major, kloniert in pVUB2, induziert während 5 Stunden
(B) Western-Blot der gesamten Proteine der äußeren Membran, getestet mit einem monoklonalen FA2.5-anti-Lipoprotein-Antikörper. 1. pVUB2 nach Induktion während 5 Stunden (der Pfeil zeigt das modifizierte Lipoprotein an). 2. pC7 nach Induktion während 5 Stunden (der Pfeil zeigt das Fusionsprotein an).

17:
Herstellung von Antikörpern mit dem Coccidiose-Protein. Die Herstellung von Antikörpern wurde nach Immunisierung von vier Gruppen von Mäusen gemäß dem folgenden Protokoll getestet:

Gruppe 1: 10 μg an β-gal-Coccidiose in PBS, intraperitoneal
Gruppe 2: 10 μg an β-gal-Coccidiose + CFA, intraperitoneal
Gruppe 3: 10 μg an lpp-Coccidiose in PBS, intraperitoneal
Gruppe 4: 10 μg an lpp-Coccidiose + CFA, intraperitoneal

Die Ergebnisse sind die folgenden:

– Rauten: präimmunes Serum
– Quadrate: Mittelwert der vier Seren von Gruppe 1
– Kreise: Mittelwert der vier Seren von Gruppe 2
– Kreuze: Mittelwert der vier Seren von Gruppe 3
– Dreiecke: Mittelwert der vier Seren von Gruppe 4

Beispiel 1. Konstruktion von rekombinanten Vektoren, die das Lipoprotein von P. aeruginosa enthalten
MATERIALIEN UND METHODEN
a. Konstruktion von Vektoren, die das Lipoprotein tragen
Ein Vektor pLPI, der durch Insertion einer Nukleotidsequenz SalI von 2,94 kb des Gens OprI, das das Lipoprotein von P. aeruginosa kodiert, in die XhoI-Schnittstelle des Vektors pKT240 erhalten wurde, wurde verwendet. pLPI1 (Cornelis P. et al. Molecular Microbiology (1989) 3(3) 421–428) enthält damit den offenen Leserahmen der Sequenz, der das Lipoprotein von Pseudomonas aeruignosa kodiert.
Am Anfang wurden die nicht gewünschten Restriktionsschnittstellen, die auf dem Plasmid, das den offenen Leserahmen des Lipoproteins trägt, vorhanden sind, durch Verdau mit dem Enzym Bal31 beseitigt. Da es sich um das Plasmid pLPI1 handelt, wurde. ein Schnitt durch das Restriktionsenzym Sst1 vor dem kontrollierten Verdau durch Bal31 ausgeführt. Der Verdau führte zum Erhalt des pLPI34, das sich von pLPI1 durch die Beseitigung einer bestimmten Anzahl von ausgewählten Restriktionsschnittstellen unterscheidet. Insbesondere wurden die einzigartigen Schnittstellen EcoRI und HpaI sowie die zwei SphI-Schnittstellen des Vektors beseitigt.
Anschließend wurden Oligonukleotide definiert, die Restriktionsschnittstellen beinhalten, die weder im anfänglichen Plasmid noch im offenen Leserahmen des Lipoproteins vorhanden waren. Diese Multi-Adaptor-Oligonukleotide, auch Polylinker genannt, wurden in Festphase unter Verwendung der Phosphoramidit-Technik, in Form von zwei komplementären Oligonukleotiden, in einem Applied Biochemicals-Synthesizer synthetisiert.
Danach wurde die Hybridisierung der zwei Oligonukleotide und die Ligation mit dem durch das Enzym SphI geschnittenen Vektor ausgeführt. Es wurden schließlich zwei Vektoren pLPI35 und pLPI36 erhalten, gemäß der Orientierung des insertierten Polylinkers.
Die Klonierung des Polylinkers wurde anschließend durch Restriktionsanalyse des Fragments des Lipoproteins, das vorher durch PCR amplifiziert wurde, überprüft. Die Überprüfung der Herstellung eines vollständigen Lipoproteins in der äußeren Membran nach Transformation gegebener Zellen durch den Vektor wurde durch Western-Blot ausgeführt.
Ein anderer Vektor, der ausgehend vom Plasmid pKK233-2 (Aman E. et al., 1985, Gene 40: 183–190) konstruiert wurde, wurde verwendet.
Zu Beginn wurde die EcoRI-Schnittstelle des Expressionsvektors pKK233-2 (Pharmacia) beseitigt, indem der Vektor durch das Enzym EcoRI verdaut wurde, dann mit einem Klenow-Fragment aufgefüllt und religiert wurde.
Auf diese Weise wurde der Vektor pKK233* erhalten, in den Fragmente kloniert wurden, die das Lipoprotein kodieren, modifiziert durch die Polylinker, die ausgehend von pLPI35 und pLPI36 erhalten wurden, wobei diese Fragmente vorher durch PCR amplifiziert wurden. Die Primer, die für die PCR-Reaktion verwendet wurden, entsprachen dem Anfang und dem Ende der Sequenz des offenen Leserahmens (open reading frame), wie beschrieben durch De VosD et al., J. Gen. Microbiol. 139 (1993) 2215–2223. Der zweite verwendete Primer enthielt nicht die zwei Stopp-Codons des Gens oprI. Die Klonierung wurde durch Ligation stumpfer Enden in der NcoI-Schnittstelle, die vorher mit einem Klenow-Fragment aufgefüllt worden war, ausgeführt, stromabwärts der Ribosomen-Bindestelle und des tac-Promotors.
Die Klonierung des Fragments wurde durch Restriktionsanalyse der erhaltenen Plasmide pVUB-1 und pVUB-2 überprüft.
Eine Überprüfung der Möglichkeit, die Expression des Lipoproteins zu induzieren, wurde nach Induktion durch IPTG ausgeführt.
b. Anzucht von ASFV, Reiniung des Virus und Extraktion der DNA
Das Virus ASFV/L60 wurde in Makrophagen aus Schwein kultiviert, dann gewonnen und durch Zentrifugation konzentriert. Das Virus wurde anschließend durch Zentrifugation in diskontinuierlichen Sucrosegradienten gereinigt. Eine Extraktion der DNA des Virus wurde mit Hilfe von Proteinase K und Phenolbehandlungen ausgeführt.
Eine Restriktion der gereinigten DNA durch das Enzym EcoRI bestätigte den Ursprung der DNA.
c. Klonierung der DNA von ASFV in Vektoren, die das Lipoprotein enthalten
Die DNA des ASFV-Virus wurde mit Sau3A geschnitten (| GATC) oder HaeIII (GG | CC). Die Plasmide pLPI35 und pLPI36 wurden gleichermaßen mit dem Enzym BglII (kompatibel mit den Fragmenten von Sau3A) oder mit HpaI (überlappende Enden, zur Ligation mit den HaeIII-Fragmenten) geschnitten.
Anschließend wurde die Ligation und die Transformation der Wirtszellen ausgeführt.
Die 2000 erhaltenen Klone wurden auf Mikrotitrationsplatten verteilt und repliziert.
Die Klone wurden einer Kolonie-Hybridisierung mit den Sau3A-Fragmenten aus ASFV, markiert mit Dioxigenin (Boehringer Mannheim) unterzogen, und die markierten Klone wurden durch Lichterscheinung unter Verwendung des AMPPD-Substrats der Phosphatase nachgewiesen.
Die positiven Klone wurden anschließend mit zwei monoklonalen Antikörpern gegen das Lipoprotein getestet, wobei der eine mit den Klonen reagiert, die ein Insert im lpp enthalten, und der andere nicht mit dem Fusionsprotein reagiert (lpp modifiziert durch das Insert).
Die Proteine der äußeren Membran der interessantesten Klone wurden präpariert und durch SDS-PAGE und Western-Blot mit einem monoklonalen Antikörper, der das Fusionsprotein erkennt, analysiert.
Um die immunproliferative Antwort zu testen, wurden äußere Membranen von E. coli, die kein lpp exprimieren (lpp-) und von E. coli, das durch die Plasmide pLPI35 und pLPI36 modifiziert wurde, sowie Klone, die die Fusion lpp-ASFV herstellen, präpariert.
d. Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen das Lipoprotein
FI-Mäuse wurden durch Injektionen von Präparationen von äußeren Membranen von Pseudomonas aeruginosa in komplettem Freund'schem Adjuvans immunisiert. Diese Injektionen wurden in die Pfotenballen der Mäuse ausgeführt. 9 Tage später wurde eine Fusion der Lymphozyten, die bei den immunisierten Mäusen entnommen wurden, mit Zellen des Myeloms NSO ausgeführt. 10 bis 14 Tage nach dieser Fusion wurden die Hybridome durch ELISA auf Mikrotitrationsplatten getestet, auf denen man äußere Membranen von P. aeruginosa aufgetragen hatte. Die positiven Klone wurden durch einen ELISA-Test mit äußeren Membranen von E. coli (pKT240 lpp-) und von E. coli (pLPI1 lpp+) untersucht.
Die Klonierung von Hybridomen mit einer anti-lpp-Aktivität wurde durch serielle Verdünnung und Expansion ausgeführt. Anschließend wurden die Klone in Mäusen wachsen gelassen. Die Bestimmung der Art des erkannten Epitops wurde ausgeführt, indem Deletionen im Lipoprotein-Gen durch Verdau mit Bal31 geschaffen wurden.
Ein Nachweistest der Reaktion der verschiedenen monoklonalen Antikörper, die durch diese Hybridome hergestellt werden, wurde mit den verschiedenen Derivaten des Lipoproteins, darin eingeschlossen die Fusionsproteine, durchgeführt. Die interessantesten monoklonalen Antikörper wurden anschließend gereinigt.
ERGEBNISSE
a. Entwicklung von rekombinanten Vektoren die das Lipoprotein von P aeruginosa enthalten
Ein erster Satz Klonierungsvektoren wurde mit dem Gen des Lipoproteins (lpp) von P. aeruginosa, kloniert in einen Vektor mit geringer Kopienzahl, das Plasmid pKT240, entwickelt. Nach Beseitigung bestimmter Restriktionsschnittstellen des Vektors durch Verdau mit Bal 31 wurden Polylinker in Form von Oligonukleotiden definiert, die einzigartige Restriktionsschnittstellen zum Klonieren im Hinblick auf eine Insertion im selben Leserahmen wie der des Lipoproteins enthalten, und unter Bedingungen, die es erlauben, dass die Struktur des Proteins in keiner signifikanten Weise geändert wird.
Die Polylinker, die SphI-Erweiterungen enthalten, wurden in die einzigartige SphI-Restriktionsschnittstelle eingeführt, die nahe am Ende des offenen Leserahmens des lpp (ORF) vorhanden ist. Dieser offene Leserahmen enthält 250 bp. Die verschiedenen erhaltenen Vektoren, die sich abhängig von ihren Restriktionsschnittstellen unterscheiden, waren die folgenden:
pLPI35: HpaI, EcoRI, BglII.
pLPI36: BglII, EcoRI, HpaI.
pLPI37: XhoI, SacI, XbaI, ClaI, BglII, XmaI, SmaI.
pLPI38: SmaI, XmaI, BglII, ClaI, XbaI, SacI, XhoI.
In diesen Vektoren konnte ein vollständiges Lipoprotein in konstitutiver Weise unter der Kontrolle seines eigenen Promotors exprimiert werden.
Dieses Lipoprotein war, wie das native Lipoprotein, in der äußeren Membran von E. coli-Zellen vorhanden, die als Wirte benutzt wurden, wie durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Western-Blot-Tests mit monoklonalen anti-Lpp-Antikörpern gezeigt.
Um eine kontrollierte Expression des Proteins möglich zu machen, wurde ein Klon mit dem Expressionsvektor pKK233-2 ausgeführt. Zunächst wurde die EcoRI-Schnittstelle dieses Vektors durch Verdau mit EcoRI, Wiederauffüllen mit einem Klenow-Fragment und Religation beseitigt. Das Fragment, das den offenen Leserahmen der Plasmide pLPI35 und pLPI36 enthält, wurde durch PCR amplifiziert und in die NcoI-Restriktionsschnittstelle des modifizierten Plasmids pKK233-2, die vorher mit Klenow-Fragment aufgefüllt wurde, stromabwärts des tac-Promotors subkloniert. Die folgenden Vektoren wurden erhalten:
pVUB-1: HpaI, EcoRI, BglII
pVUB-2: BglII, EcoRI, HpaI.
Das LB-Medium erlaubt die Induktion der Expression des lpp, da es Hefeextrakt enthält, dessen Zusammensetzung von einer Art ist, das Laktoseoperon zu induzieren (in dem es wie IPTG an den lacI-Repressor bindet). Es ist auch bevorzugt, in definiertem Medium zu arbeiten, egal welcher Art (CAA, M9, etc...). Der Zusatz von Glucose erlaubt zusätzlich, eine katabolische Repression auszuüben. Es ist übrigens unmöglich, Transformanten von pVUB1 und pVUB2 in LB-Medium + Ampicillin (Ap) zu erhalten, da diese Tranformanten nur in LB-Medium + Glucose + Ap oder im M9-Medium + Ap oder CAA + Ap erhalten werden. Dagegen können bestimmte Klone, die ein Insert enthalten, durch direkte Transformation in LB-Medium (geringere Toxizität) erhalten werden.
Im LB-Kulturmedium war die Expression in Abwesenheit von IPTG nicht unterdrückt und führte zum Zelltod.
b. Anzucht und Reinigung von ASFV-L60 und Extraktion der DNA des Virus
Mit dem Virus infizierte Makrophagenkulturen wurden verwendet, um 10¹⁰ CPE₅₀ von ASFV-L60 zu sammeln. Insoweit als der mittlere Titer an infizierten Makrophagen in der Kultur 10⁶ CPE₅₀/ml war, musste man das Äquivalent von 10 Litern Überstand sammeln, um genug Virus zu haben. Die Überstände wurden getrennt gesammelt und zentrifugiert, um den Virus in Form von Pellets zu erhalten.
Das Virus wurde durch Zentrifugation in Gegenwart von diskontinuierlichen Sucrosegradienten gereinigt und einer Behandlung mit DNAse unterzogen, um Schweine-DNA zu beseitigen. Die Bande, die das Virus enthielt, wurde gewonnen, zentrifugiert und gewaschen.
Die virale DNA wurde durch eine Behandlung mit Proteinase K und Phenolextraktion extrahiert. Die DNA des ASFV wurde durch Agarosegelelektrophorese in Form einer einzelnen Bande von ungefähr 200 kb sichtbar gemacht, während man gleichermaßen eine DNA mit geringem Molekulargewicht (resistent gegenüber RNase) in Form einer Wolke im unteren Teil des Gels beobachtete, die vermutlich durch DNAse abgebauter Schweine-DNA entsprach.
Das Restriktionsprofil mit EcoRI erlaubte es, diskrete Banden zu sehen, die dem Profil entsprechen, das vorher für DNA von ASFV/L60 beobachtet wurde. Ähnlichkeiten wurden auch mit den Profilen beobachtet, die für DNA von ASFV publiziert worden waren, obwohl Unterschiede festgestellt werden konnten.
c. Klonierung von ASFV-Fragmenten in pLPI35 und pLPI36
Die DNA von ASFV wurde mit Sau3A geschnitten und in zwei Vektoren, die das lpp enthalten, pLPI35 und pLPI36, die vorher mit BglII geschnitten wurden, ligiert. Ein anderer Teil der DNA des ASFV wurde mit HaeIII geschnitten und mit seinen stumpfen Enden mit denselben Vektoren ligiert, die vorher mit HpaI geschnitten wurden.
Nach Ligation und Transformation wurden ungefähr 2.000 Klone auf Mikrotitrationsplatten verteilt und repliziert, dann mit Sau3A-Fragmenten von ASFV, die mit Dioxigenin markiert sind, in Gegenwart eines Überschusses geschnittener, nicht markierter Schweine-DNA hybridisiert.
45 positive Klone wurden nachgewiesen und 12 davon wurden ausgewählt. Die äußeren Membranen wurden präpariert, und die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden entweder mit Coomassie Blau gefärbt oder auf Nitrocellulose gelegt, um einen Immunnachweis auszuführen. Zwei Klone stellten große Fusionsproteine her, einer stellte ein Protein von 25 kDa und ein anderer ein Protein von 70 kDa her.
Eine PCR-Amplifikation dieser zwei Klone zeigte die Gegenwart eines insertierten Fragments von 0,8 kb für den Klon, der das 25 kDa-Protein herstellt, und von 2,5 kb für den Klon, der das große Fusionsprotein herstellt.
d. Erhalt und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen das Lipoprotein von P. aeruginosa
Mehr als 20 erhaltene Hybridome zeigten eine spezifische Reaktion mit dem Lipoprotein von P. aeruignosa ohne Kreuzreaktion mit den Lipoproteinen von Enterobakterien. Eine Analyse der Epitope wurde mit Lipoproteinen ausgeführt, die fortschreitend an ihrem C-terminalen Ende trunkiert waren (nach Verdau des Plasmids pLPI34 mit SphI, dann Verdau durch Bal31, Religation und Transformation der Wirtszellen). Dies erlaubte es, aufzuzeigen, dass bestimmte Antikörper ein N-terminales Epitop nachwiesen, während andere mit einem C-terminalen Epitop reagierten.
Einer der monoklonalen Antikörper, KF9, erkannte einzig das Lipoprotein von pLPI36, das durch die Insertion von 10 Aminosäuren, entsprechend dem Polylinker, modifiziert war, aber er erkannte nicht die Derivate des Plasmids, die längere Insertionen enthielten.
Dieser monoklonale Antikörper zeigte sich damit als interessant für die Anwendung zum Screenen von Klonen, um die Gegenwart von insertierten Sequenzen nachzuweisen. Zwei andere monoklonale Antikörper, QB2 und FA2.5, konnten die Fusionsproteine nachweisen.
DISKUSSION
Man konnte damit zeigen, dass es möglich ist, das Lipoprotein-Gen von Pseudomonas aeruginosa als Antigen für die Expression von ausgewählten Aminosäuresequenzen an der Oberfläche von rekombinanten Zellen zu verwenden. Das Einführen von Polylinkern, die verschiedene Restriktionsschnittstellen enthalten, kann gleichermaßen auf der Stufe der Sequenz, die das lpp kodiert, ausgeführt werden, ohne das Expressionsniveau oder die Lokalisierung des Proteins in der äußeren Zellmembran zu verändern.
Zwei Arten von Vektoren wurden entwickelt, wobei eine erste Klasse eine konstitutive Expression erlaubt, und eine zweite Klasse zur kontrollierten Expression des Fusionsproteins, das ausgehend von lpp selbst erhalten wird, das durch Insertion einer bestimmten Sequenz modifiziert ist, führt. Bestimmte monoklonale Antikörper erleichtern das Screenen der Rekombinanten und zeigen keine Reaktion mit den Klonen, die die Insertion der gewählten Aminosäuresequenz im Lipoprotein-Gen haben, oder im Gegensatz dazu andere Antikörper, die einen Nachweis der Fusionsproteine erlauben.
Beispiel 2. Isolierung und Charakterisierung eines rekombinanten Klons, der ein Antigen von Eimeria stiedae (Coccidiose kodiert
Einführung
Die Coccidiose ist eine Krankheit, die beim Huhn und beim Kaninchen durch einen protozoischen Parasiten der Gattung Eimeria hervorgerufen wird, die allgemein die Zellen des Verdauungstrakts und der assoziierten Drüsen befällt.
Diese Krankheit führt zu enormen wirtschaftlichen Konsequenzen in der Kleintierzuchtindustrie.
Die medizinische Prophylaxe besteht zur Zeit in der systematischen Verwendung von coccidiostatischen Erzeugnissen in der Nahrung der jungen Tiere, aber wichtige sekundäre Probleme sind bekannt, insbesondere auf Grund einer Entwicklung von Eimeria-Stämmen, die gegenüber Medikamenten resistent sind.
Daher wurde besondere Aufmerksamkeit auf die Ausführung neuer Verfahren im Kampf gegen die Coccidose gerichtet. Diese Aufmerksamkeit orientierte sich mehr und mehr auf die Immunprophylaxe, die dem Studium biologischer Impfstoffe zur Kontrolle dieser Parasiten entspricht.
Die folgenden Ergebnisse beziehen sich auf die Art Eimeria stiedae, eine pathogene Art beim Kaninchen.
Von 9 Arten, die den Verdauungstrakt infizieren, ist Eimeria stiedae die einzige Art, die sich in den Gallengängen entwickelt.
In dieser Leberkrankheit ist die Leber beträchtlich hypertrophiert und ihre Oberfläche ist durch weißlichen Knotenbildungen verschiedener Größe gekennzeichnet.
Verfahrensweise und Ergebnisse
1. Parasit
Diese Studie bestand als erstes im Infizieren von Kaninchen im Alter von 5 Wochen mit sporulierten Oocysten von E. stiedae. Drei Wochen nach der Infektion wurden die Oocysten ausgehend von der Leber und den Gallengängen isoliert.
2. Extraktion von DNA von E. stiedae
Die DNA von E. stiedae wurde ausgehend von Sporozoiten extrahiert.
Zu Beginn wurden Oocysten ausgehend von der Leber und den Gallengängen der durch E. stiedae infizierten Kaninchen (2.10⁸ Oocysten/ml) isoliert.
Die Oocysten wurden anschließend gewaschen und in 2% Kaliumdichromat bei Raumtemperatur für eine Dauer von 48 h platziert, um eine Sporulation zu erhalten.
Die sporulierten Oocysten wurden anschließend bis zum Verschwinden des Kaliumdichromats gewaschen, und in PES zerkleinert:
NaCl: 8 g
KCl: 0,2 g
Na₂HPO₄H₂O: 2,07 g
KH₂PO₄: 0,24 g
Diese Zerkleinerung wurde mechanisch mithilfe eines „Potters" gemacht, um die Freisetzung der Sporocysten zu erlauben.
Die Sporocysten wurden in 0,25% Trypsin und 0,1% Glycodeoxycholsäure inkubiert, um die Freisetzung der Sporozoiten zu erlauben.
Die Inkubation wurde in einem Wasserbad bei 41°C während 1 h unter Schütteln ausgeführt. Anschließend wurde während 10 Minuten bei 3.000 upm zentrifugiert, und das Pellet, das die Sporozoiten enthält, gewonnen.
Die isolierten Sporozoiten wurden lysiert mit:
10 mM Tris pH8
25 mM EDTA
100 mM NaCl
1% SDS
Dann wurde Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/m1 zugefügt.
Anschließend wurde eine Inkubation in einem Wasserbad bei 37°C während 3 h ausgeführt, gefolgt von der aufeinander folgenden Zugabe von:

– 1 Volumen Phenol, dann Zentrifugation bei Raumtemperatur während 10 Minuten (2 x);
– 2 Volumen 100% Ethanol

Dann wurde das Präzipitat bei –70°C während 30 Minuten platziert.
Es wurde 15 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert, dann das Pellet mit 80% Ethanol gewaschen, getrocknet, und in TE pH 8 aufgelöst:
10 mM Tris
1 mM EDTA.
Die Konzentration der erhaltenen DNA wurde durch die optische Dichte bei 600 nm bestimmt.
3. Konstruktion einer genomischen Bibliothek
Eine Bibliothek von genomischer DNA wurde im Insertions- und Expressionsvektor Lambda gt11 konstruiert (Restriktionsschnittstelle EcoRI). Das anti-Sporozoiten-Serum von Kaninchen wurde verwendet, um die Bibliothek zu screenen und um die Rekombinanten, die die Antigene von E. stiedae exprimieren, zu identifizieren.
Ein positiver Klon wurde isoliert. Die Extraktion der DNA, die im rekombinanten Phagen enthalten war, erlaubte es, ein Insert von 1,2 kb zu identifizieren (E. stR1).
4. Herstellung des (3-Galactosidase-Fusionsproteins
Die Herstellung des rekombinanten Antigens wurde ausgehend von lysogenen Lambda gt11 ausgeführt.
Das Fusionsprotein konnte direkt durch Elektrophorese auf einem SDS-PAGE-Gel gereinigt werden.
Das erhaltene Protein (Schätzung nach dem Gel) besteht aus 138 kd, wovon 22 kd einem Teil des Proteins des Parasiten entsprechen.
5. Antiserum
Zur Herstellung des spezifischen Antiserums des rekombinanten Antigens E. stR1 wurden SPF-Kaninchen (frei von spezifischen pathogenen Mitteln oder „specific pathogen free") vom INRA, Frankreich, in dreiwöchigen Intervallen mit drei Dosen von 100 μg elektroeluiertem Fusionsprotein immunisiert.
Die erste Dosis wurde mit komplettem Freund'schem Adjuvans und die folgenden Dosen mit unvollständigem Freund'schem Adjuvans in eine Emulsion gebracht. Das Serum wurde 10 Tage nach der letzten Immunisierung erhalten. Dieses Serum wurde mit indirekter Immunfluoreszenz gegen getrocknete Sporozoiten auf Objektträgern und mit Western-Blot gegen ein rohes Sporozoitenlysat getestet.
– Immunfluoreszenz
Der Test ergab eine positive Reaktion des Serums auf der Stufe der Oberfläche des Parasiten E. stiedae; aber gegenüber lebenden Sporozoiten ist die Reaktion negativ. Dies zeigt, dass das Antigen nicht auf der Oberfläche des Parasiten präsentiert wird.
– Western-Blot
Der Test wurde mit einem rohen Sporozoitenlysat von drei verschiedenen Arten ausgeführt:

– Stiedae: Coccidiose in der Leber
– Magna: Coccidiose im Verdauungstrakt
– Intestinalis: Coccidiose im Verdauungstrakt zeigt, dass das Antiserum (SPF und E. stR1) ein vorherrschendes Protein von 40 kd erkennt.

Ein Serum, das vor der Immunisierung erhalten wurde, wurde als Negativkontrolle verwendet.
Gegen die nicht-sporulierten Oocystenextrakte von E. stiedae reagierte das Antiserum (SPF und E. stR1) gleichermaßen mit einer Bande von 40 kd.
Dies erklärt, dass das Antigen nicht im beobachteten Sporozoiten-Stadium des Parasiten synthetisiert wird, weil es schon in den nicht-sporulierten Oocysten vorhanden ist.
6. Sequenz des DNA-Fragments E. stR₁
Die Insertion des E. stR1-DNA-Fragments wurde verwendet, um das Plasmid pUC18 zu transformieren, und der Klon wurde sequenziert, nachdem eine Klonierung zur Deletion des genomischen Fragments mit dem Enzym Exonuclease III ausgeführt wurde.
Die Sequenz wurde gemäß dem Verfahren von Sanger ausgeführt.
Die Sequenz dieses Fragments von 1,2 kb ergab einen offenen Leserahmen von 741 Nukleotiden, der an der EcoRI-Schnittstelle beginnt.
Dies ist eine Sequenz, die keine repetitiven Nukleotide aufweist.
Das abgeleitete Protein hat eine Länge von 247 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 27,5 kd.
Die Größe des Fusionsproteins, das durch diesen Klon hergestellt wird, zeigt, dass 62% des gesamten 1,2-kb-Inserts für das Parasitenprotein kodieren.
7. Klonierung in den Vektor pVUB-1
Um das interessierende Protein zu amplifizieren, wurde das genomische EstR1-DNA-Fragment in den neuen Expressionsvektor pVUB-1 kloniert.
Dieser Vektor hat die Eigenschaft, das Antigen als Fusionsprotein mit dem Lipoprotein von Pseudomonas aeruginosa zu exprimieren.
Der Leserahmen des Vektors pVUB-1 ist mit der EcoRI-Schnittstelle des lambda-gt11-Phagen kompatibel, daher wurde die Klonierung im Inneren der einzigartigen EcoRI-Schnittstelle ausgeführt.
Nach Transformation der E. coli-Bakterien, Stamm 109, wurden die rekombinanten Klone durch Hybridisierung ausgewählt, und ein positiver Klon wurde isoliert (4). Die Analyse dieser Klone wurde durch eine Plasmid-DNA-Extraktion und durch Western-Blot mit Immunnachweis ausgeführt.
– Extraktion von Plasmid-DNA
Die DNA, ein Extrakt des positiven rekombinanten Klons, wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut, um das 1,2-kb-Insert sichtbar zu machen (5).
– Western-Blot
Die Induktion der Expression des Fusionsproteins im Plasmid pVUB-1 wurde durch Zugabe in das Kulturmedium in Gegenwart von IPTG bewirkt.
Die Western-Blot-Analyse erlaubte es, die Reaktion des Fusionsproteins mit dem monoklonalen FA2.5-Antikörper, der gegen das Lipoprotein gerichtet ist, zu überprüfen. Das nachgewiesene Fusionsprotein hat ein Molekulargewicht von 30 bis 35 kd (6).
Schlussfolegrung
Die Ergebnisse der Immunnachweis-Versuche mit den Antiseren SPF und E. stR1 gegen rohe Extrakte von Sporozoiten der verschiedenen getesteten Arten (stiedae, magna, intestinalis und tenella: die am meisten pathogene Art vom Huhn) zeigten das Vorhandensein von Kreuzreaktionen zwischen diesen Arten der Gattung Eimeria.
Ein Vorteil, der sich aus der Verwendung des Vektors pVUB-1 ergibt, wäre die Möglichkeit, das Protein in ausreichender Menge zu reinigen, um zu erlauben, die immunologische und beschützende Aktivität des Antigens zu testen.
Um diesen Test auszuführen, wird das rekombinante Protein, das für ein Antigen der untersuchten Art Emeria stiedae kodiert, amplifiziert und für Impftests verwendet.
Diese Tests erlauben es, zu wissen, ob ein solcher „Impfstoff" Antigene enthalten könnte, die den verschiedenen Arten gemein sind, und ob man durch dasselbe einen beschützenden Effekt beim Kaninchen erhalten könnte.
Der Test betrifft drei verschiedene Arten:

– Eimeria stiedae
– Eimeria magma
– Eimeria intestinalis

Die untersuchten Parameter sind:

– Gewichtszunahme des Tieres
– Umsetzung der Nahrung
– Die Prozentzahl der Abstoßung von Oocysten durch die Exkremente.

Beispiel 3.
Ein Insert von 48 bp, das für das T-Epitop S2b von Hepatitis B und ein B-Epitop kodiert, wurde in die EcoRI-Schnittstelle des Lipoproteins von Pseudomonas aeruginosa kloniert. Das Insert wurde durch Hybridisierung von 2 komplementären Oligonukleotiden gebildet, was einsträngige Überhänge auf jeder Seite hervorrief, die mit den überhängenden Enden nach der Restriktion mit dem Enzym EcoRI kompatibel sind. Das Insert wurde so definiert, dass es erlaubte, den offenen Leserahmen (ORF) des Lipoproteins sowie des Inserts selbst beizubehalten (8).
Die verwendeten Vektoren waren: pVUB1 (ungefähr 5 kb, große Kopienzahl, enthält einen Promotor om tac-Typ (z. B. den trc-Promotor), induzierbar durch IPTG oder durch Lactose und seine Derivate, ampicillinresistent), und pLPI35 (13,5 kb, geringe Kopienzahl, konstitutive Expression des Lipoproteins, Ampicillinresistenz).
Die Transformation der E. coli JM109-Zellen führte zum Erhalt von mehr als 250 Transformanten, ausgewählt auf der Grundlage ihrer Eigenschaften der Ampicillinresistenz. Diese Transformanten wurden einem Screening unterzogen, um die Gegenwart des Epitops durch Kolonie-Blotting unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, gerichtet gegen das S2b-Epitop in Kaninchen, zu untersuchen. Alle Antikörper, die eine Kreuzreaktion zeigten, wurden durch Adsorption gegen ein Zelllysat von E. coli JM 109, transformiert mit pVUB1, entfernt.
Die Sekundärreaktion wurde mit Protein A, gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase, unter Verwendung eines 4-Chlornaphthol-Mediums (frisch zubereitet) und der Hydrogenperoxidase von BIORAD als farbiges Substrat bewirkt.
Von den 277 getesteten Kolonien reagierten 6 klar positiv.
Der Nachweis wurde gleichermaßen durch Immunfluoreszenz ausgeführt.
Beispiel 4: Konstruktion eines Vektors, der das Lipoprotein von Pseudomonas aerugi enthält, unter solchen Bedingungen, dass seine Expression in E. coli kontrolliert werden kann.
1. Konstruktion des Lipoproteins von P. aeruginosa im kontrollierten Expressionsvektor pkk233-2 in E. coli.
Ein Gen, das das Lipoprotein von P. aeruginosa kodiert, wurde in pKT240 kloniert und sequenziert (Cornelis P. et al, 1989). Folglich wurden Derivate dieses Klons konstruiert und in einen Polylinker nahe des C-terminalen Endes des Strukturgens lpp insertiert (d.h. in pLPI35 und pLPI36). pLPI35 und pLPI36 enthalten ein 30-mer-Oligonukleotid mit einer einzigartigen Restriktionsschnittstelle von HpaI, EcoRI und BglII in gegensätzlicher Orientierung, wobei diese Schnittstellen in die SphI-Schnittstelle insertiert worden waren. Dieses Gen enthält seinen eigenen Promotor, was zu einer Überproduktion von lpp in E. coli führt, was eine signifikante Verringerung der Wachstumsrate des Bakteriums verursacht.
Um dieses Problem zu überwinden, wurde die Expression unter Kontrolle des starken trc-Promotors von pKK233-2 in Betracht gezogen. Da das Plasmid den trc-Promotor, die Ribosomen-Bindungsstelle von lac-Z und ein Initiationskodon ATG enthält, konnte daher die Expression des lpp-Gens, das unter der Kontrolle dieses Promotors insertiert wurde, durch Induktion unter Verwendung von IPTG kontrolliert werden.
Da eine einzigartige EcoRI-Schnittstelle in den Polylinker des lpp-Gens eingeführt worden war, musste die EcoRI-Schnittstelle des Vektors pkk233-2 beseitigt werden. Die Beseitigung dieser Schnittstelle wurde durch eine Ligation der stumpfen Enden in einer Weise gefolgt, dass das neue abgeleitete Plasmid pKKD keine EcoRI-Schnittstelle mehr enthält. Ausgehend vom Plasmid pKKD wurde die Konstruktion des Gens der lpp- Struktur, das den Polylinker enthält, in die NcoI-Schnittstelle ligiert, von der die Enden mit Klenow-Fragment zu stumpfen Enden gemacht worden waren. Die rekombinanten Klone pVUB1 und pVUB2 wurden als Derivate von pLPI35 und pLPI36 erhalten.
Die Klonierungsstrategie wird in 8 gezeigt, und die Sequenzierung von pVUB1 und pVUB2, einschließlich des Polylinkers, ist in 9.
Beispiel 5: Expression von lpp in E. coli
Es wurden monoklonale Antikörper gegen das lpp von P. aeruignosa hergestellt. Ihre Charakterisierung zeigte, dass manche unter ihnen Epitope des N-terminalen Teils erkannten (Antikörper FA2.5, pE4.1), und andere ein Epitop nahe des Polylinkers von pVUB2 erkannten (Antikörper KF9). Der Antikörper KF9 erkennt das lpp von pLPI34 und nicht spezifisch das von pLPI36 oder pVU2. Rekombinante Klone, die das Gen des lpp enthalten, wurden einem Screening durch Immunnachweis von Kolonien unterzogen. Die kontrollierte Expression der Vektoren pVUB1 und pVUB2 wurde entweder in einem M9-Medium plus Casaminosäure oder in einem LB-Medium plus 1% Glucose, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, ausgeführt. Die Induktion wurde mit 1 mM IPTG (Endkonzentration) entweder im M9-Medium, das Casaminosäure enthält, oder in LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, ausgeführt. Eine Inkubation wurde bei 37°C während 3 bis 6 Stunden ausgeführt. Um das Proteinprofil zu bestimmen und das lpp-Produkt zu lokalisieren, wurde eine Präparation von äußerer Membran ausgeführt, dann entweder mit Western-Blot oder mit Coomassie-Blaufärbung analysiert. 10 zeigt das Proteinprofil und die Herstellung von lpp durch Nachweis mit dem Antikörper FA2.5. Das Ergebnis zeigt eine starke lpp-Produktion gleichzeitig in freier und in gebundener Form.
Um die Herstellung von lpp zu erhöhen, wurde Eisen (III) zum Kulturmedium zugefügt. Die Überproduktion von lpp stieg signifikant in 50 und 100 μM Eisen-(III)-Zusatz (10).
Beispiel 6: Expression eines Fusionsproteins, das lpp und ein Malaria-Antigen enthält.
Ein Malaria-Antigen, das spezifisch für das Endstadium ist, wurde verwendet. Es wird aus Plasmodium chabaudi erhalten, das für Malaria bei Nagetieren verantwortlich ist, was es erlaubt, ein Modell für Malaria bei der Maus zu definieren (Deleersnijder W. et al, Mol. Biochem. Parasitol. 43 (1990) 231–244). Dieses Antigen ist mit der Membran infizierter Erythrozyten assoziiert und wird PcLEMA genannt. Die Primärstruktur des Gens wird in 11 gezeigt. Es wurden cDNA-Klone, die den C-terminalen Teil enthalten, einem Screening mit einer cDNA-Expressionsbibliothek, die in lambda gt11 konstruiert wurde, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen dieses Antigen, unterzogen. Die Inserts enthalten 650 beziehungsweise 600 bp, in Phase mit dem Gen der β-Galactosidase in der EcoRI-Schnittstelle.
Der Vektor pVUB1 enthält eine EcoRI-Schnittstelle im Polylinker, die mit einer EcoRI-Schnittstelle im Polylinker des β-Galactosidase-Gens des Vektors lambda gt11 kompatibel ist (12). Darum wurde das 650-bp-Insert durch das Enzym EcoRI ausgeschnitten, und direkt entweder in pLPI35 oder in pVUB1 in die EcoRI-Schnittstelle subkloniert. Nach immunologischem Screenen der Kolonien wurden die rekombinanten Klone durch Extraktion des Plasmids (13) und Western-Blot (14) analysiert.
Das Ergebnis zeigt, dass das Fusionsprodukt des lpp mit dem Malaria-Antigen im Vektor pVUB1 für kontrollierte Expression eine höhere Produktausbeute besitzt, verglichen mit der, die erhalten wird, wenn dasselbe Fusionsprotein mit Hilfe des Vektors pLPI35 exprimiert wird. Das Molekulargewicht des Fusionsprodukts ist ungefähr 30 kDa (berechnetes MW) (8 kDa für das lpp und 22 kDa für das 650-bp-Insert), aber die Wanderung in der SDS-PAGE-Elektrophorese wird bei ungefähr 40 kDa nachgewiesen. Dies würde einer ausgedehnten Zone von Tandem-Repetitionen und dem ausgeprägten hydrophilen Charakter des Malaria-Antigens entsprechen.
Beispiel 7: Klonierung und Expression des Oberflächen-Glycoproteins gp63 von Leishmania im Vektor pVUB2, der das Lipoprotein enthält.
1) Klonierung des Gens von gp63
Das gesamte Gen des gp63 von Leishmania major, das auf einem 2,2-kb-EcoRI-Fragment im Vektor Blue Script PBS (Stratagene) vorhanden ist, wurde durch Button und Mac Master beschrieben (1988), J. Exp. Med., 176, 724–729.
Der PBS-Vektor wurde mit EcoRI verdaut und das 2,2-kb-Fragment wurde auf einem 1%-Agarosegel unter Verwendung des Geneclean-Kits gereinigt (BIO 101 Inc., La Jolla, Kalifornien). Das Fragment wurde anschließend in die EcoRI-Schnittstelle von pVUB2 ligiert, die in Phase mit der Sequenz von gp63 war. Der Vektor pVUB2 war schon durch Verdau mit EcoRI hergestellt worden, gefolgt von einer Behandlung mit Phosphatase aus Kalb (calf intestine phosphatase, CIP), um eine Autoligation des Plasmids zu vermeiden. pVUB2 wurde schließlich unter Verwendung eines 1%-Agarosegels mit Hilfe des Genclean-Kits gereinigt. Nach Transformation von E. coli JM 109 wurden die Transformanten durch Restriktionsanalyse analysiert und die Klone, die das 2,2-kb-Fragment enthielten, wurden als Rekombinanten ausgewählt. Die Orientierung des Fragments wurde gleichermaßen durch Restriktionsanalyse analysiert.
2) Expression von rekombinantem gp63
Die Expression des Fusionsproteins durch die rekombinanten Klone wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. Eine Kolonie des Vektors pVUB2, der das gp63 exprimiert, wurde über Nacht in M9-CAA-Medium bei 37°C kultiviert. Die Kultur wurde verdünnt und bei 37°C unter konstanter Bewegung kultiviert, bis eine optische Dichte von 0,3 erhalten wurde, bevor IPTG (Isopropyl B-D-Thiogalactopyranosid) auf 1 mM zugefügt wurde. Nach 5 bis 6 weiteren Stunden bei 37°C wurden die Bakterien durch Zentrifugation gewonnen und das rekombinante Fusionsprotein durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert.
3) Reinigung des Fusionsproteins, das gp63 beinhaltet
Das rekombinante gp63-Protein wurde in einem Liter Kultur nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren exprimiert. Die Proteine, die in der äußeren Membran enthalten waren, wurden präpariert, indem Lysozym und dann eine Ultraschallbehandlung zu Hilfe genommen wurden, und wurden in 25 mM Tris-HCl, pH 8, gelöst. Die Proteine wurden anschließend in einer Probe SDS-Puffer gelöst und durch SDS-PAGE-Elektrophorese auf 6%-igen Gelen aufgetrennt. Die Gele wurden mit 0,06% Coomassie-Blau in Wasser gefärbt und mit Wasser entfärbt. Die Bande, die dem Fusionsprotein entspricht, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und durch Elektroelution gereinigt.
4) Herstellung von Antikörpern gegen rekombinantes gp63
70 μg gp63-Fusionsproteine, die durch Elektroelution gereinigt wurden, wurden auf subkutanem Weg zwei Kaninchen in Abwesenheit von komplettem Freund'schem Adjuvans injiziert. Die Kaninchen wurden zweimal einer Wiederholung mit 60 μg gereinigtem rekombinanten gp63 in 4-wöchigen Intervallen unterzogen. Normale und Immunseren wurden jeweils von den immunisierten Kaninchen vor und eine Woche nach der ersten und der dritten Immunisierung erhalten.
Beispiel 8: Herstellung von Antikörpern
1) mit dem Coccidiose-Protein (Eimeria stiedae):
Das in Beispiel 2 beschriebene Fusionsprotein wurden aus einem 17,5%igen SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten, nach Wanderung der Proteine der äußeren Membran eines E. coli-Klons, der das im Text beschriebene rekombinante Plasmid enthält, und nach Induktion der Kultur durch IPTG. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau (0,06%) verdünnt in Wasser gefärbt. Das Fusionsprotein wurde anschließend nach den Empfehlungen des Herstellers (Bio-Rad) elektroeluiert. Parallel dazu wurde das gleiche Antigen, aber an β-Galactosidase (Klon lambda gt11) fusioniert, hergestellt und elektroeluiert (ausgehend von einem Rohextrakt des E. coli-Klons).
Vier Gruppen von 4 Balb/C-Mäusen wurden durch Immunisierungsexperimente hergestellt:

Gruppe 1: 10 μg β-gal-Coccidiose in PBS, intraperitoneal
Gruppe 2: 10 μg β-gal-Coccidiose + CFA, intraperitoneal
Gruppe 3: 10 μg lpp-Coccidiose in PBS, intraperitoneal
Gruppe 4: 10 μg lpp-Coccidiose + CFA, intraperitoneal

Das injizierte Volumen betrug jedes Mal 150 μl.
Vier Wochen nach der ersten Immunisierung wurde eine zweite Immunisierung, dieses Mal ohne CFA, mit derselben Menge an Protein ausgeführt; eine dritte Immunisierung wurde vier Wochen nach der zweiten, immer ohne CFA, ausgeführt. Zehn Tage nach dieser letzten Immunisierung wurde das Serum der Mäuse entnommen und die Gegenwart von Antikörpern mit ELISA auf Mikrotiterplatten (NUNC), die Rohextrakt von Eimeria stiedae, aus sporulierten Oocysten stammend (10 μg/Vertiefung), enthalten.
Nach Sättigung der Platten mit BSA werden die Seren in verschiedenen Verdünnungen zugefügt, zwei Stunden inkubiert und nach zweimaligem Waschen mit PBS-Tween der sekundäre Antikörper (Ziege-Anti-Maus-Phosphatase) zugefügt, und die Inkubation wird eine Stunde lang fortgesetzt. Nach fünfmaligem Waschen wird das Substrat der Phosphatase (p-Nitrophenylphosphat) zugefügt, und die Platte wird nach einer halben Stunde Inkubation bei Raumtemperatur abgelesen. Die Ergebnisse werden in 17 gezeigt:

2) mit einem Malaria-Antigen von Plasmodium chabaudi:
Die Fusionsproteine, die ausgehend vom Klon pVUB hergestellt und in Beispiel b beschrieben werden, wurden gleichartig eluiert (siehe 1) und mit oder ohne CFA (20 μg Protein) in zwei Kaninchen injiziert. Nach der dritten Injektion nach einem Protokoll identisch zum vorangehenden wurden die Seren entnommen und gegen das Lipoprotein selbst absorbiert. Ein ELISA wurde mit Fusionsprotein lpp-Malaria als Antigen (5 μg/Vertiefung) durchgeführt, als Kontrolle wurde das Protein lpp selbst verwendet.
Die Ergebnisse sind die folgenden:

– keine Reaktion mit lpp
– Serum des ohne Adjuvans immunisierten Kaninchens: 50% Bindung für die Verdünnung 1:1200
– Serum des mit Adjuvans immunisierten Kaninchens: 50% Bindung für die Verdünnung 1:1000.

Beispiel 9: Präsentation eines T-Epitops S2B von Hepatitis B
Das Prinzip ist es, entweder das Fusionsprotein mit dem Lipoprotein während einer halben Stunde gegenüber Antigen-präsentierenden Zellen zu präsentieren (in diesem Fall der Stamm TA3, der eine kontinuierliche B-Linie ist), dann die Zellen zu waschen und sie mit einem T-Hybridom während einer Nacht zu inkubieren, das das T-Epitop S2B erkennt. Wenn die B-Zelle das Epitop dem Hybridom korrekt präsentiert hat, sekretiert dieses seinerseits IL2. Nach Inkubation der aktivierten B-Zellen und des Hybridoms wird der Überstand entnommen und zu CTL-L-Zellen zugefügt, bevor die Proliferation, induziert durch das IL2, durch Einbau von Tritium-markiertem Thymidin gemessen wurde. Als Kontrolle wurde die nicht-präinkubierte B-Linie oder mit verschiedenen Mengen an S2B-Peptid allein (nicht fusioniert) inkubierte B-Linie verwendet.
Ein typisches Experiment wurde nachstehend beschrieben:
Die TA3-Zellen wurden 1,5 Stunden (10⁶ Zellen pro Röhrchen) in Eis präinkubiert.
Sie wurden anschließend viermal in RPMI-Medium plus Penicillin und Streptomycin gewaschen.
Sie wurden anschließend mit verschiedenen Konzentrationen an Antigen präinkubiert:

– (0, 20, 10, 2 μg des durch Elektroelution gereinigten Fusionsproteins)
– (0, 30, 6, 3 μg des reinen Peptids).

Sie wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten zu je 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in 200 μl transferiert.
Nach eineinhalb Stunden Inkubation wurden die Zellen aufs Neue gewaschen, in Vertiefungen von Mikrotiterplatten zu 5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung (in dreifacher Ausführung) transferiert.
Die Zellen des T-Hybridoms (Stamm HB68) wurden anschließend zu 2 × 10⁴ Zellen in die Vertiefungen, die schon die vorinkubierten Zellen enthielten, zugefügt.
Die zwei Zelltypen wurden die ganze Nacht bei 37°C inkubiert.
Die Überstände wurden für einen klassischen Test der Lymphoproliferation von Mäuse-CTL-L-Zellen (die anderen Zellen sind gleichermaßen von der Maus) in Gegenwart von ³H-Thymidin entnommen.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Antigen 0:	2,354 cpm
Antigen S2B-lpp 2 μg:	10,393 cpm
Antigen S2B-lpp 10 μg:	26,832 cpm
Antigen S2B-lpp 20 μg:	44,130 cpm
Antigen S2B 3 μg:	1,438 cpm
Antigen S2B 6 μg:	760 cpm
Antigen S2B 30 μg:	5,035 cpm

Schlussfolgerung
Selbst für eine erhöhte Konzentration an reinem S2B-Peptid (die Tatsache muss berücksichtigt werden, dass auf einer molaren Basis mehr präsentiertes S2B-Antigen als S2B-lpp vorhanden ist), gibt es keine gute Präsentation gegenüber dem T-Hybridom, wohingegen das lpp-Fusionsprotein das Epitop gut präsentiert.

Claims

Rekombinanter Vektor für die Expression einer heterologen Nukleotidsequenz in einem Gram-negativen Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass er in einer für seine Replikation nicht essenziellen Stelle das Gen umfasst, das für ein von den Lipoproteinen von E. coli verschiedenes Lipoprotein kodiert, oder einen Teil dieses Gens, der die für die Kontrolle der Expression dieses Lipoproteins und seine Exposition auf der Oberfläche der äußeren Membran des Gram-negativen Bakteriums notwendigen Elemente enthält, wobei die heterologe Nukleotidsequenz in das Gen oder den Teil des für das Lipoprotein kodierenden Gens in einer Weise eingefügt ist, die die Expression dieser heterologen Sequenz und seine Exposition auf der Oberfläche der äußeren Membran des Gram-negativen Bakteriums erlaubt.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipoprotein eine Lipoproteinstruktur ist.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Plasmid handelt.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipoprotein heterolog im Verhältnis zu dem den Vektor enthaltenden Gram-negativen Bakterium ist.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen oder der Teil des für ein Lipoprotein kodierenden Gens, den er enthält, das Gen ist, das für das Haupt-Lipoprotein der äußeren Membran eines Bakteriums der Gattung Pseudomonas kodiert.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen oder der Teil des für ein Lipoprotein kodierenden Gens, den er enthält, das für das Haupt-Lipoprotein der äußeren Membran von Pseudomonas aeruginosa kodierende Gen ist.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz im Bereich des N-terminalen Teils des Gens oder des Teils des Gens, der für den N-terminalen Teil des Gens reifen Lipoproteins kodiert, eingefügt ist, vorzugsweise 3 bis 4 Aminosäuren folgend dem besagten N-terminalen Ende.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen oder der Teil des für ein Lipoprotein kodierenden Gens mittels der Insertion einer oder mehrerer Restriktionsstellen modifiziert ist, beispielsweise in Form eines Polylinkers.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Polylinker enthaltenen Restriktionsstellen einzig im Verhältnis zu den Stellen sind, die in dem nicht-rekombinierten Vektor oder in dem Gen oder dem Teil des für das Lipoprotein kodierenden Gens enthalten sind.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der heterologen Sequenz konstitutiv ist.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Plasmid pLPI34 handelt, das bei der BCCM (LMBP) unter der Nr. LMBP2916 hinterlegt ist.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Plasmid pLPI35 (so wie in der 1B beschrieben) oder um das Plasmid pLPI36 (so wie in der 1C beschrieben) handelt.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der heterologen Sequenz induziert ist.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Vektor pVUB1 (so wie in der 2B beschrieben) oder um den Vektor pVUB2 (so wie in der 2C beschrieben) handelt.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz, die er enthält, für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine oder mehrere Antigene Determinanten oder ein oder mehrere Haptene enthält.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz, die er enthält, für ein Epitop vom Typ B und/oder für ein Epitop vom Typ T von Antigenen, die von Krankheitserregern bestimmt sind, kodiert.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz, die er enthält, für eine Aminosäuresequenz einer schweren Kette eines Antikörpers oder einer leichten Kette eines Antikörpers kodiert.
Rekombinanter Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz, die er enthält, für einen ausschließlich aus schweren Ketten gebildeten Antikörper kodiert.
Gram-negatives rekombinantes Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass es mittels eines rekombinanten Vektors nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18 modifiziert ist.
Gram-negatives rekombinantes Bakterium nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es das von dem Gen oder dem in dem Vektor enthaltenen Teil des Gens kodierte Lipoprotein natürlicherweise nicht exprimiert.
Gram-negatives Bakterium nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm von E. coli handelt.
Gram-negatives Bakterium nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm von Alcaligenes eutrophus handelt.
Gram-negatives Bakterium nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleotidsequenz, die es enthält, für einen Antikörper oder ein Antikörperfragment kodiert.
Verwendung Gram-negativer Bakterien nach Anspruch 23 als Absorbens für die Reinigung von Antigenen, die die von der heterologen Nukleotidsequenz kodierten Antikörper oder Antikörperfragmente erkennen.
Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als aktiven Wirkstoff ein rekombinantes Gram-negatives Bakterium nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 23 umfasst.