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Vogel-Mycoplasma-Antigen, sein Gen, das Gen enthaltender
rekombinanter Vektor und damit hergestellter Impfstoff
Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft Antigen-Proteine von
Mycoplasma gallisepticum, mit welchem Vögel infiziert sind;
rekombinante Vektoren, in welche Gene integriert sind, die
die Antigen-Proteine codieren; Wirtsorganismen, welche mit
den Vektoren transformiert wurden sowie Vogel-Impfstoffe
gegen Mycoplasma gallisepticum-Infektionen unter Verwendung
der Antigen-Proteine.
Hintergrund
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Die Erkrankung nach Mycoplasma gallisepticum-Infektion,
welches eine der schwerwiegendsten Infektionen von Vögeln wie
Hühnern usw. ist, ist bei Hühnern durch die chronische
Beeinträchtigung der Atemwege, begleitet von einer Entzündung
des Luftsackes charakterisiert. Wenn Hühner mit Mycoplasma
gallisepticum infiziert sind, sind die Legerate und die
Ausbrütungsrate der Eier, welche von den infizierten Hühnern
produziert wurden, stark reduziert. Als Ergebnis nimmt der
Versand von Eiern und Eierlegenden Hühnern derart ab, dass
ein beträchtlicher wirtschaftlicher Verlust verursacht wird.
Zusätzlich induziert die Mycoplasma gallisepticum-Infektion
eine Verringerung der Immunität, derart daß Hühner anfällig
dafür werden, an anderen infektiösen Erkrankungen zu leiden,
wobei eine Komplikation durch schwere infektiöse Erkrankungen
verursacht wird. Darüber hinaus ist Mycoplasma gallisepticum
dafür bekannt, ein Pathogen für die Nebenhöhlenentzündung in
Truthähnen zu sein.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits
Proteine gefunden, welche mit Antiseren gegen Mycoplasma
gallisepticum reagieren (Japanische Patentanmeldung mit der
Offenlegungs-Nr. 2-111795 und EP-A-0345021). Es wird
erwartet, dass diese Proteine für die Verwendung als
Impfstoffe zur Verhinderung von Mycoplasma gallisepticum-
Infektionen zweckmäßig sind, um jedoch wirkungsvollere
Impfstoffe herzustellen, ist es wünschenswert, Proteine
bereitzustellen, welche eine höhere Aktivität besitzen.
Offenbarung der Erfindung
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Als ein Ergebnis von intensiven Untersuchungen, um
wirkungsvollere Impfstoffe zur Verhinderung von Mycoplasma
gallisepticum-Infektionen zu erhalten, haben die Erfinder der
vorliegenden Erfindung TMG-1 von den Proteinen ausgewählt,
welche in der Japanischen Patentanmeldung mit der
Offenlegungs-Nr. 2-111795 und EP-A-0345021, wie oben,
offenbart sind. Es wurde dann herausgefunden, dass die Zugabe
eines Proteins von etwa 11 Kilodalton zu TMG-1 die
Antigenität von Mycoplasma gallisepticum beträchtlich
erhöhte, Antiseren, welche unter Verwendung des Zusatz-
Produkts als Antigen induziert wurden, das Wachstum von
Mycoplasma gallisepticum verhindern, und dass von dem
vorstehend beschriebenen Protein erwartet werden kann, dass
es als Vogel-Impfstoff zur Verhinderung von Mycoplasma
gallisepticum-Infektionen verwendet werden kann, und auch zur
Diagnose von Mycoplasma gallisepticum-Infektionen zur
Verwendung für Vögel, zweckmäßig ist. Damit ist die
vorliegende Erfindung vervollständigt worden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt eine Karte der Restriktionsenzym-
Spaltstellen eines DNA-Fragments, welches für die
Rekombination in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
kann.
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Fig. 2 zeigt veranschaulichend das Verfahren zur
Clonierung der TTM-1-DNA in den M13-Phagen.
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Fig. 3 zeigt veranschaulichend das Verfahren zur
Herstellung einer ortsspezifischen Mutante, welche unter
Verwendung künstlich synthetisierter Oligonucleotid-Primer
hergestellt wurde.
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Fig. 4 zeigt veranschaulichend das Verfahren zur
Herstellung des Plasmids pMTTMIE, welches das Protein TTMG-1
exprimiert, das durch TTM-1' codiert wird.
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Die beste Möglichkeit, die Erfindung durchzuführen
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Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung
wird ein Protein bereitgestellt, welches eine Antigen-
Antikörper-Reaktion mit Mycoplasma gallisepticum-Truthahn-
Antiseren verursacht und ein Molekulargewicht von etwa 40
Kilodalton (hierin nachfolgend als Kd abgekürzt) besitzt,
welches durch die DNA-Sequenz codiert wird, die eine Karte
für Restriktionsenzym-Schnittstellen hat, wie in Fig. 1
gezeigt. Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, welche die
Aminosäuresequenz codiert. Gemäß einem dritten Aspekt der
vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor
bereitgestellt, der die DNA enthält, und eine Wirtszelle, die
mit dem rekombinanten Vektor transformiert oder transfiziert
wurde.
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Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung
wird ein Vogel-Impfstoff zur Verhinderung von Mycoplasma
gallisepticum-Infektionen bereitgestellt, welcher das Protein
als eine wirkungsvolle Komponente enthält.
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Das bedeutet, dass in dem ersten Aspekt der vorliegenden
Erfindung das Protein dasjenige Protein ist, welches mit
Seren, die mit Mycoplasma gallisepticum immunisiert oder
infiziert wurden, eine Antigen-Antikörper-Reaktion verursacht
und ein Molekulargewicht von etwa 40 Kd besitzt, welches
durch die DNA-Sequenz codiert wird, die eine Karte für
Restriktionsenzym-Schnittstellen hat, wie in Fig. 1 gezeigt.
Spezifische Beispiele beinhalten ein Protein, welches eine
Aminosäuresequenz besitzt wie in Sequenz Nr. 1 gezeigt, ein
Fusionsprotein, welches die Aminosäuresequenz am C-terminalen
Ende hat und an dem N-terminalen Ende davon von Bakterien
abstammende Enzym-Proteine wie β-Galactosidase, β-Lactamase,
etc. enthält.
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Das Protein kann durch Verwendung der Wirtszelle, die
durch den rekombinanten Vektor transformiert oder
transfiziert wurde, welcher mit dem dritten Aspekt der
Erfindung bedacht ist, erhalten werden. Der vorstehend
beschriebene rekombinante Vektor kann durch Aufnahme des DNA-
Fragments, welches den dritten Aspekt der Erfindung
darstellt, in einen Expressionsvektor auf herkömmliche Art
und Weise erhalten werden.
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Quellen, um das DNA-Fragment zu erhalten, kann jede
erdenkliche Quelle sein, solange sie zu Mycoplasma
gallisepticum gehört. Spezifische Beispiele beinhalten den
S6-Stamm (ATCC 15302), PG31 (ATCC 19610) und ähnliche. Ein
spezifisches Beispiel für das DNA-Fragment, welches für die
Rekombination verwendet wurde, ist ein DNA-Fragment, welches
eine Karte für Restriktionsenzym-Schnittstellen hat, wie in
Fig. 1 gezeigt (z. B., das DNA-Fragment, welches in Fig. 2
gezeigt ist).
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Die Nucleotid-Sequenz von 202 bis 988 des Fragments,
welches die DNA-Sequenz besitzt, die durch Sequenz Nr. 1
gezeigt ist, ist die gleiche wie diejenige des Proteins TMG-
1, welche in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung
Nr. 2-111795 beschrieben wurde. Die Nucleotide 985 bis 987,
welche einem Terminations-Codon des Gens, welches dieses TMG-
1 codiert, entsprechen, sind derart modifiziert, dass sie in
dem Wirt nicht als Terminations-Codon translatiert werden,
und weiterhin ist die DNA-Sequenz von 999 bis 1387
hinzugefügt worden. TGA von 1048 bis 1050 ist ebenfalls
derart modifiziert, dass es nicht als Terminations-Codon
translatiert wird.
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NNN in der DNA-Sequenz ist nicht besonders
eingeschränkt, außer dass es nach Expression kein
Terminations-Codon darstellt. Im natürlich vorkommenden
Mycoplasma gallisepticum wird jedoch erwartet, dass TGA in
Tryptophan translatiert wird (J. Bacteriology, 172(1), 504-
506 (1990)). Aus diesem Grund wird bevorzugt, NNN in eine
Basenfolge zu modifizieren, die auch in den Wirtszellen als
Tryptophan translatiert wird, z. B. in TGG.
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Der Vektor, welcher verwendet wird, um den rekombinanten
Vektor zu konstruieren, ist nicht besonders eingeschränkt,
spezifische Beispiele dafür beinhalten aber Plasmide wie
pUC8, pUC9, pUC10, pUC11, pUC18, pUC19, pBR322, pBR325,
pBR327, pDR540, pDR720 und ähnliche; Phagen wie den λgt11,
λgt10, λEMBL3, λEMBL4, Charon 4A und ähnliche.
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Das Verfahren zur Inserierung des vorstehend beschriebenen
DNA-Fragments in diese Vektoren, um die rekombinanten
Vektorenherzustellen, kann auf eine Art und Weise
durchgeführt werden, die für einen Durchschnittsfachmann gut
bekannt ist. Der Vektor wird z. B. mit einem
Restriktionsenzym gespalten und direkt mit den vorstehend
beschriebenen DNA-Fragmenten unter der Kontrolle einer
geeigneten regulatorischen Sequenz zur Expression ligiert.
Als regulatorische Sequenzen, die für die Expression
verwendet werden könnten, können nachfolgende bedacht werden,
z. B. Lac-Promotor-Operator, trp-Promotor, tac-Promotor, lpp-
Promotor, PL-Promotor, amyE-Promotor, Ga17-Promotor, PGK-
Promotor, ADH-Promotor, etc.
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Bei der Herstellung des rekombinanten Vektors zum Zweck
der Expression dieser Proteine, welche von Mycoplasma
abstammen, sind die Verfahren zur Herstellung eines
rekombinanten Vektors durch einmalige Aufnahme des vorstehend
erwähnten DNA-Fragments in einen geeigneten Vektor, gefolgt
von seiner Subclonierung, einem Fachmann gut bekannt. Diese
subclonierten DNA-Fragmente werden mit einem geeigneten
Restriktionsenzym ausgeschnitten und mit den vorstehen
erwähnten regulatorischen Sequenzen zur Expression ligiert,
um den rekombinanten Vektor herzustellen, der in der Lage
ist, das Protein zu produzieren.
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Der Vektor, der für die Subclonierung verwendet wird,
ist nicht kritisch, spezifische Beispiele beinhalten aber
Plasmide wie pUC8, pUC9, pUC10, pUC11, pUC18, pUC19, pBR322,
pBR325, pBR327, pDR540, pDR720, pUB110, pIJ702, YEp13, YEp24,
YCp19, pAc373, pAcYM1, und ähnliche. Dann kann eine Vielzahl
geeigneter Wirtszellen mit dem erhaltenen rekombinanten
Vektor transformiert werden, um den Mikroorganismus zu
erhalten, der das Protein herstellen kann, welches die
Antigenität besitzt und welches von Mycoplasma gallisepticum
abstammt, oder ein Fusionsprotein, welches die gleiche
Aminosäuresequenz enthält.
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Der hierin geeignete Wirt kann derart ausgewählt werden,
dass man die Anpassungsfähigkeit an den Expressionsvektor,
die Stabilität der Produkte, etc. berücksichtigt. Spezifische
Beispiele sind die Art Escherichia (z. B. Escherichia coli),
die Gattung Bacillus (z. B. Bacillus subtilis, Bacillus
sphericus, etc.), Actinomyces, Saccharomyces, Insektenzellen,
Fadenwürmer, etc. Der mit einem geeigneten Expressionsvektor
transformierte Wirt kann unter dem Fachmann gut bekannten,
geeigneten Bedingungen gezüchtet und vermehrt werden.
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Um das Protein zu produzieren, können Bedingungen
ausgewählt werden, welche die Expression-fördernde Wirkung
der regulatorischen Sequenz induzieren. Spezifischer können
im Fall des Lac-Promotor-Operators solche Bedingungen durch
Hinzugabe einer geeigneten Menge von Isopropylthio-β-D-
Galactopyranosid in die Kulturbrühe geschaffen werden.
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Der Vogel-Impfstoff für Mycoplasma gallisepticum-Infektionen
aus dem derart erhaltenen Wirt, welcher im vierten Aspekt der
Erfindung bedacht ist, kann durch eine Modifikation
herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Der Wirt kann
unter Bedingungen gezüchtet werden, die im Allgemeinen für
die Züchtung von Mikroorganismen dieses Typs verwendet
werden. Im Falle von E. coli können die Bakterien in LB-Medium
bei 37ºC unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden. Nach
der Züchtung kann das erfindungsgemäße Protein, als deren
erster Aspekt, durch Verfahren wie Chromatographie, Fällung
durch Aussalzen, Dichtegradienten-Zentrifugation und
ähnliche, die einem Fachmann gut bekannt sind und je nach
Bedarf ausgewählt werden können, aufgereinigt werden. Das
somit erhaltene Protein kann als ein Impfstoff verwendet
werden. Alternativ dazu können die transformierten
Wirtszellen inaktiviert werden und die inaktivierten
Wirtszellen können als Impfstoff verwendet werden. In diesem
Fall wird die Inaktivierung auf eine herkömmliche Art und
Weise durchgeführt, nachdem die Züchtung des Wirtes beendet
ist. Die Inaktivierung kann durch Erhitzen erzielt werden, es
ist jedoch einfacher, einen Inaktivator zur Kulturbrühe
hinzuzugeben. Als Inaktivator können Merzonin, β-
Propiolacton, Tyrosin, Salicylsäure, Kristall-Violett,
Benzoesäure, Benzetoniumchlorid, Polymyxin, Gramicidin,
Formalin, Phenol etc. verwendet werden. Falls notwendig und
erwünscht, kann der inaktivierten Kulturbrühe eine geeignete
Menge an Adjuvans hinzugefügt werden. Das inaktivierte
Produkt wird dann mit einem Siphon oder unter Verwendung von
Zentrifugation etc. abgetrennt. Als Adjuvans werden
Aluminiumhydroxid-Gel, Aluminiumphosphat-Gel,
Calciumphosphat-Gel, Alaun, etc. eingesetzt. Das inaktivierte
Produkt, welches derart abgetrennt wurde, wird mit
Phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, etc. auf eine
geeignete Konzentration eingestellt. Wenn notwendig und
gewünscht wird ein Antiseptikum hinzugegeben. Beispiele für
diese Antiseptika, welche verwendet werden können, beinhalten
Merzonin, β-Propiolacton, Tyrosin, Salicylsäure, Kristall-
Violett, Benzoesäure, Benzetoniumchlorid, Polymyxin,
Gramicidin, Formalin, Phenol etc.
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Um die immunogene Aktivität weiter zu verstärken, können
auch Adjuvantien zu dem erhaltenen Impfstoff hinzugegeben
werden. Das Adjuvans wird im Allgemeinen in einem Volumen von
1-99 in Bezug auf 100 Volumenanteile des Impfstoffs
eingesetzt.
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Wenn der Impfstoff verwendet wird, kann er auf
herkömmliche Art und Weise mit Verdünnungsmitteln,
Verdickungsmitteln, etc. vermischt werden. Der Impfstoff
zeigt die Wirkung in einer Dosis von mindesten 1 ug antigener
Proteinmasse pro kg Gewicht. Die obere Begrenzung ist nicht
kritisch, außer wenn die Dosis akute Toxizität zeigt. Die
Dosis kann derart bestimmt werden, dass sie günstig ist, z.
B. unter solchen Bedingungen, dass der neutralisierende
Antikörper-Titer (log&sub1;&sub0;) 1,0 bis 2,0 beträgt. Für Hühner wurde
bei einer Dosis von 5 mg antigene Proteinmasse pro kg Gewicht
keine Toxizität festgestellt.
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Der Vogel-Impfstoff gegen Myconlasma gallisepticum-
Infektion, welcher in der vorliegenden Erfindung erhalten
wird, wird intramuskulär, subkutan oder intrakutan, etc. in
Vögel überimpft. Der Impfstoff kann für die Immunisierung
auch in den respiratorischen Trakt gesprüht werden.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung, besitzen die Proteine
höhere Antigenität als diejenigen, die aus dem Stand der
Technik erhalten wurden und wirkungsvoll bereitgestellt
werden können. Die ausgezeichneten Peptide sind als
Impfstoffe und Vogel-Diagnostika für die Mycoplasma
gallisepticum-Infektion wirkungsvoll.
[Beispiele]
Beispiel 1
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Ernten des Polypeptid-Gens TTM-1, welches in Mycoplasma
gallisepticum exprimiert wird:
(1) Herstellung von genomischer DNA von Mycoplasma
gallisepticum
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Der Mycoplasma gallisepticum 56-Stamm wurde bei 37ºC
für 3 bis 5 Tage in flüssigem Medium, welches durch Zusatz
von 20% Pferdeserum, 5% Hefe-Extrakt, 1% Glucose und einer
Spur von Phenolrot als ein pH-Indikator zu 100 ml PPLO-Brühe
als basales Medium hergestellt wurde, gezüchtet. Mit
zunehmender Vermehrung von Mycoplasma qallisepticum
erniedrigte sich der pH-Wert der Kulturbrühe. Zu dem
Zeitpunkt, wenn die Farbe des pH-Indikators, der in der
Kulturbrühe enthalten war, von rot nach gelb umschlug, wurde
die Inkubation beendet. Das Kulturmedium wurde bei 8.000 g 20
Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die
Zellen wurden dann in 1/10 des Volumens an PBS, bezogen auf
das Volumen des Kulturmediums suspendiert. Die Suspension
wurde nochmals bei 1000 UpM 20 Minuten zentrifugiert, um die
Zellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen wurden in 2,7 ml
PBS resuspendiert und SDS wurde in einer Konzentration von 1
% dazugegeben. Ferner wurden 10 ug RNase zum Gemisch
zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37ºC inkubiert,
um die Lyse zu verursachen.
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Das Lysat wurde dreimal mit einem gleichen Volumen
Phenol extrahiert und dann dreimal mit Ethylether. Der
Extrakt wurde mit Ethanol ausgefällt, wobei 200 gg genomische
DNA von Mycoplasma gallisepticum erhalten wurden.
(2) Genomische Southern-Hybidisierung von Mycoplasma
gallisepticum unter Verwendung des TM-1-Gens als
Sonde
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Nachdem 1 ug der in (1) erhaltenen Mycoplasma
gallisepticum DNA mit XbaI gespalten wurde, wurde das
Spaltprodukt mit 0,6% niedrigschmelzender Agarose einer
Gelelektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde
das Gel für 10 Minuten in eine alkalische denaturierende
Lösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) eingetaucht, um die DNA zu
denaturieren und weiterhin für 10 Minuten in eine
neutralisierende Lösung (3 M Natriumacetat, pH 5,5)
eingetaucht, um zu neutralisieren. Nach der Neutralisierung
wurde die DNA in 6-facher SSC-Lösung (0,7 M NaCl, 0,07 M
Natriumcitrat, pH 7,5) auf eine Nylonmembran übertragen. Nach
Trocknen an der Luft, wurde die Membran für 2 Stunden bei 80º
C erhitzt. 4-fach konzentrierter SET (0,6 M NaCl, 0,08 M
Tris-HCl, 4 mM EDTA, pH 7,81, 10-fach konzentrierte Denhardt-
Lösung, 0,1% SDS, 0,1% Na&sub4;P&sub2;O&sub7;, 50 ug/ml denaturierte
Heringssperma-DNA und pUM-1-Insert-DNA (TM-1-Gen: siehe
Japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 2-111795), welche
auf herkömmliche Art und Weise markiert worden war, wurden
zugegeben, um die Hybridisierung bei 68ºC für 14 Stunden zu
veranlassen. Die Nylonmembran wurde auf einen Röntgenfilm
aufgelegt. Die Autoradiographie ergab, dass die
Hybridisierung mit einem Fragment von etwa 3, 4 kbp auftrat.
(3) Clonierung des XbaI-gespaltenen Fragments von etwa
3,4 kbp in den pUC-19 und Kolonie-Hybridisierung
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Nachdem 4 ug der in Beispiel 1 (1) erhaltenen Mycoplasma
gallisepticum DNA mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten
worden war, wurde das Spaltprodukt mit 0,6%
niedrigschmelzender Agarose einer Gelelektrophorese
unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde ein Fragment von
etwa 3,4 kbp gewonnen. Das Fragment wurde durch Ligase mit
dem pUC-19, der durch Behandlung mit XbaI gespalten worden
war, ligiert und der kompetente E. coli-Stamm TG1 wurde
transformiert. Die Transformanten wurden 15 Stunden in LB-
Agar-Medium, welches 0,003%
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-(3-Dgalactopyranosid, 0,03 mM Isopropylthio-β-D-galactopyranosid
und 40 ug/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Auf dem Agar-
Medium gewachsene weiße Kolonien wurden auf eine Nylonmembran
transferiert, gefolgt von einer Hybridisierung auf eine
ähnliche Art und Weise wie in (2) vorstehend. Die
Autoradiographie ergab, dass die Clonierung erfolgt war und
das Plasmid wurde pUTTM1 genannt.
(4) Bestimmung der vollständigen Nucleotidsequenz von
TTM-1
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Die Sequenz des inserierten DNA-Fragments wurde durch
die Didesoxy-Methode von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 74, 5463 (1977)) bestimmt, wobei der in (3)
vorstehend hergestellte pUTTM-1 verwendet wurde. Die
Nucleotidsequenz ist durch die Sequenz Nr. 1 gezeigt (wobei
vorgesehen ist, dass NNN in der Sequenz jeweils TGA
bedeutet). Es wurde berichtet, dass das TGA-Codon in der
Gattung Mycoplasma nicht als Translations-Terminations-Codon
sondern als Tryptophan abgelesen wird. Hinsichtlich der
Sequenz wurde davon ausgegangen, dass das Molekulargewicht
des durch TTM-1 codierten Proteins etwa 40 Kd beträgt.
Beispiel 2
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(1) Herstellung von TTM-1', derart modifiziert, dass
das TTM-1-codierte Protein TTMG-1 an der Stelle TGA
nicht als Translations-Terminations-Codon abgelesen
wird (TGA → TGG).
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2-1 Clonierung von TTM-1-DNA in den Phagen M13 (Fig. 2)
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pUTTM-1 aus 1-(3) wurde mit den Restriktionsenzymen SacI
und EcoRI gespalten und das Spaltprodukt wurde dann mit 0,8%
niedrigschmelzender Agarose einer Gelelektrophorese
unterzogen. Ein 1,1 kbp-Fragment, welches das 5'-Ende von
TTM-1 enthielt, wurde durch Behandlung mit Phenol-Chloroform
und Ausfällen mit Ethanol gewonnen, gefolgt von einer
Ligierung mit dem Fragment, welches durch Spaltung des Phagen
M13mp11 mit SacI und E. coli erhalten wurde. Das
Reaktionsgemisch wurde bei einer m.o.i. (moiety of infection;
infektiöse Menge) von 0,1 mit einer Lösung gemischt, welche
durch Züchtung von E. coli TG1 bei 37ºC für 24 Stunden
erhalten wurde, wobei IPTG in einer Endkonzentration von 100
mM dazugegeben wurde und weiterhin das IPTG mit X-gal in
einer Konzentration von 2% ergänzt wurde. Das resultierende
Gemisch wurde auf Soft-Agar überimpft und festwerden
gelassen. Dann wurde die Inkubation bei 37ºC für 24 Stunden
durchgeführt. Unter den ausgebildeten Phagen-Plaques wurde
der rekombinante Phage TTM-1 N, der das 1,1 kbp-DNA-Fragnent
von TTM-1 enthielt, von den Phagen gesammelt, deren Farbe
sich nicht auf blau veränderten.
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Ebenso wurde pUTTM-1 mit EcoRI und EcoRV gespalten. Nach
Elektrophorese in 0,8% niedrigschmelzender Agarose, wurde
ein 0,4 kbp-Fragment, welches das 3-Ende von TTM-1 enthielt,
aus dem Gel gewonnen. Durch Behandlung mit Phenol-Chloroform
und Ausfällen mit Ethanol wurde das DNA-Fragment gewonnen.
Der M13mp10-Phage wurde mit dem durch Spaltung mit EcoRI und
EcoRV erhaltenen Fragment unter Verwendung von Ligase
ligiert. Das Reaktionsgemisch wurde behandelt wie bei der
Clonierung des 1 kbp-DNA-Fragments. Damit wurde der
rekombinante Phage TTM-1C erhalten, welcher das 0,4 kbp-DNA-
Fragment von TTM-1 enthielt.
(2) Herstellung von einzelsträngiger DNA von jedem
rekombinanten Phagen
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Die beiden rekombinanten Phagen, welche in (1)
vorstehend erhalten wurden, wurden in einer m.o.i. von
jeweils 0,1 dem E. coli-Stamm TG1 zugegeben, welcher bei 37º
C in 100 ml 2 · YT-Medium vermehrt wurde. Nach Schütteln der
Kultur für 5 Stunden bei 37ºC wurde eine Zentrifugation bei
5000 g für 30 Minuten durchgeführt, wobei der zellfreie
Überstand erhalten wurde. Ein 0,2-faches Volumen eines
Polyethylenglykol/Natriumchlorid-Gemischs (20%
Polyethylenglykol #6000, 2,5 M NaCl) wurde zu dem Überstand zugegeben.
Nach Absetzen bei 4ºC für 1 Stunde wurde das Gemisch 20
Minuten bei 5000 g zentrifugiert, um die Praezipitate zu
gewinnen. Die Praezipitate wurden in 500-1 TE-Puffer (10 mM
Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst. Nach Extraktion mit
Phenol-Chloroform wurde von jedem rekombinanten Phagen die
einzelsträngige DNA durch Ethanol-Fällung gewonnen.
(3) Herstellung von ortsspezifischen Mutanten unter
Verwendung von künstlich synthetisierten
Oligonucleotiden als Primer (Fig. 3)
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Wenn die so erhaltene DNA in der Form in E. coli
eingebracht und exprimiert wird, wie sie vorliegt, wird die
Stelle, die der Sequenz NNN der Nucleotide entspricht, welche
durch Sequenz-Nr. 1 gezeigt sind, als Terminations-Codon
erkannt, da dieser Bereich TGA entspricht. Damit werden die
Sequenzen, die diesem Bereich nachfolgen, nicht translatiert.
Deshalb wurden, um das Nucleotid Adenin, welches dem dritten
Nucleotid des Codons NNN entspricht, zu Guanin zu
modifizieren, die folgenden beiden Oligonucleotide
synthetisiert, um den TGA-Bereich als Methionin zu
translatieren.
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Sequenz Nr. 2:
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3'-TACGTTCTTCCTGGCAAACCTTACCACTACTT-5'
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und
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Sequenz Nr. 3:
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3'-CTACAAAGAACCTAAATATCA-5'
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Das Oligonucleotid, welches durch die Sequenz Nr. 2
gezeigt ist, wird an die Einzelstrang-DNA von TTM-1 N anlagert
und das Oligonucleotid, welches durch die Sequenz Nr. 3
gezeigt ist, an die einzelsträngige DNA von TTM-1C, wobei die
gewünschte Mutation durch das Verfahren von Fritz Eckstein et
al. (Nucleic Acid Research, 8749-8764, 19985) verursacht
wird. Die somit erhaltenen rekombinanten Phagen wurden mit
TTM-1N' bzw. TTM-1C' bezeichnet. Die DNAs der erhaltenen
Phagen TTM-1N' und TTM-1C' wurden mit den Restriktionsenzymen
Sac T-EcoR I bzw. EcoR I-Bgl II gespalten. Durch
Gelelektrophorese in 0,8% niedrigschmelzender Agarose wurden
die Fragmente von 1, 1 kbp und 0,4 kbp aus dem Agarosegel
extrahiert und durch Ethanolfällung gewonnen. Andererseits
wurde auch das Plasmid pUTTM-1 mit Sac I-Bgl II gespalten.
Das 4,8 kbp Vektor-Fragment wurde durch Gelelektrophorese in
0,8% niedrigschmelzender Agarose extrahiert und durch
Ethanol-Präzipitation gewonnen. Die somit erhaltenen drei
Fragmente wurden durch Ligase ligiert und der kompetente E.
coli-Stamm TG1 wurde transformiert, wobei das Plasmid pUTTM-
1' erhalten wurde, welches TTM-1' mit der Mutation an der
gewünschten Stelle enthält. Eine Sequenzanalyse wurde wie in
1-(4) durchgeführt. Damit wurde bestätigt, dass an der
gewünschten Stelle eine Mutation vorlag.
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Die Restriktionsenzym-Karte des somit erhaltenen Gens,
welches von Mycoplasma gallisepticum abstammt, ist in Fig. 1
gezeigt.
Beispiel 3
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Herstellung des Expressionsplasmids pUTMIE für das
Protein TTMG-1, welches von TTM-l' codiert wird (Fig. 4).
Nach der Spaltung des Plasmid pBMG6T (Japanische
offengelegte Patentanmeldung Nr. 2-111795) mit dem
Restriktionsenzym BamH I wurde eine Behandlung mit der DNA-
Polymerase T und dann die Spaltung mit dem Restriktionsenzym
Ava III durchgeführt. Nach Gelelektrophorese in 0,8%
niedrigschmelzender Agarose wurde eine DNA von etwa 5.000 bp
aus dem Gel gewonnen. Durch Behandlung mit Phenol-Chloroform
und Fällung mit Ethanol wurde ein Fragment gewonnen, welches
den tac-Promotor enthält. Auf der anderen Seite wurde das
Plasmid pUTTM1, welches in (3) erhalten wurde, mit den
Restriktionsenzymen Ava III und EcoR V gespalten. Das
Spaltprodukt wurde einer Gelelektrophorese in 0.8%
niedrigschmelzender Agarose unterzogen. Eine DNA von etwa 600
bp wurde aus dem Gel gewonnen und mit Phenol-Chloroform
behandelt. Durch Ethanolpräzipitation wurde ein Fragment
gewonnen, welches einen Teil der TTM-1 DNA enthält.
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Die beiden Fragmente wurden unter Verwendung von Ligase
ligiert und der kompetente E. coli-Stamm TG1 wurde
transformiert. Die Transformanten wurden 15 Stunden bei 370 C
in LB-Agar-Medium, enthaltend Ampicillin, gezüchtet. Das
Plasmid wurde nach dem Verfahren von Birnboim & Doly [Nucleic
Acis Research, 7, 1513 (1979)] extrahiert, wobei das Plasmid
pTTM1E, welches den tac-Promotor und die TTM-1-DNA enthielt,
hergestellt wurde. Auf der anderen Seite wurde pBMG6T mit dem
Restriktionsenzym BamH I gespalten. Nach Gelelektrophorese in
0,8% niedrigschmelzender Agarose wurde durch
Ethanolpräzipitation ein Fragment von etwa 700 bp gewonnen, welches die
Transkriptions-Terminations-Seguenz enthält. Schließlich
wurde pTTM1E mit dem Restriktionsenzym Bgl II geschnitten,
gefolgt von einer Behandlung mit Phenol und Chloroform. Das
durch Ethanolpräzipitation gewonnen Fragment wurde durch
Ligase mit dem vorher erwähnten Fragment von etwa 700
Bäsenpaaren, welches die Transkriptions-Terminations-Sequenz
enthält, ligiert. Das gewünschte Plasmid wurde auf eine Art
und Weise ausgewählt, die ähnlich der für pTTM1E ist, und mit
pMTTM1E bezeichnet.
Beispiel 4
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Expression des Polypeptids, welches von TTM1E codiert wird
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Nachdem der durch pMTTM1E transformierte E. coli-Stamm
TG1 für 12 Stunden bei 37ºC in LB-Medium, ergänzt mit 50
ul/ml Ampicillin, gezüchtet worden war, wurde 1 ml der
Kulturbrühe entnommen und zu 100 ml LB-Medium, enthaltend 50
ug/ml Ampicillin, hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation
bei 37ºC. Zwei Stunden später wurde
Isopropylthio-13--Dgalactopyranosid in einer Konzentration von 1 mM zugegeben
und die Inkubation wurde bei 37ºC für weitere 12 Stunden
fortgeführt. Nach der Inkubation wurden die E. coli 10
Minuten bei 6000 g zentrifugiert. Nachdem die Zellen
gesammelt waren, wurden die Zellen einer 10%-SDS-PAGE
unterzogen und zwei Stunden bei 50 mA elektrophoretisiert.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant
Blue R-250 gefärbt, wobei eine neue Bande von etwa 40 Kd
nachgewiesen wurde, welche etwa 10% des Gesamt-Zellproteins
betrug. Da das Molekulargewicht des Proteins mit dem
erwarteten Wert übereinstimmte, wurde das Protein, welches
ein Molekulargewicht von etwa 40 Kd hat, als das Protein
identifiziert, welches von TTM-1 codiert wird, und mit TTMG-1
bezeichnet.
-
Darüber hinaus wurde das Gel, für welches die SDS-PAGE
angewandt wurde, für eine Western Blot-Analyse auf eine
Nitrocellulosemembran transferiert [Towbin et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350 (1979)] und als ein primärer
Antikörper wurde Hühnerserum, welches mit Mycoplasma
qallisepticum immunisiert war, verwendet, wobei eine Bande
von etwa 40 Kd, die mit Coomassie Brilliant Blue R-250
angefärbt wurde, damit reagierte. Somit war bestätigt, dass
TTMG-1 von Mycoplasma gallisepticum abstammt.
Beispiel 5
Aufreinigung von TTMG-1
-
Nachdem die in Beispiel 4 gesammelten E. coli in 10 ml
Dulbecco's PBS suspendiert worden waren, wurde die Suspension
mit einer French-Presse (hergestellt von Otake Seisakusho:
1500 kgf/cm²) behandelt. Dann wurde bei 60.000 g für 30
Minuten eine Zentrifugation durchgeführt und die Präzipitate
wurden gewonnen. Nach dreimaligem Waschen mit KPB (10 mM
Kaliumphosphat-Puffer-Lösung, pH 7,9), welches mit 1% NP-40
ergänzt war, wurden die Präzipitate in PBS, enthaltend 7,5 M
Harnstoff suspendiert. Nach 30 Minuten Zentrifugation bei
60.000 g wurde der Überstand gewonnen. Der Überstand wurde
über einen linearen Dichtegradienten mit einer NaCl-
Konzentration von 0 M bis 1 M unter Verwendung einer QAE-TOYO
PEARL COLUMN (hergestellt von TOSO Co., Ltd.), welche zuvor
mit KPB mit einem pH-Wert von 7, 8, der 6 M Harnstoff enthält,
equilibriert worden war, fraktioniert. Die Fraktion, welche
TTMG-2 enthält, wurde somit bei einer NaCl-Konzentration von
0 M gewonnen. Diese Fraktion wurde über einen linearen
Dichtegradienten mit einer NaCl-Konzentration von 0 M bis 1
M, unter Verwendung einer Red-TOYO PEARL COLUMN (hergestellt
von TOSO Co., Ltd.), welche zuvor mit dem gleichen KPB wie es
für die QAE- TOYO PEARL COLUMN verwendet worden war,
equilibriert worden war, weiter fraktioniert. Die Fraktion,
welche TTMG-1 (etwa 200 ug) enthielt, wurde somit bei einer
NaCl-Konzentration von 0,5 M bis 0,7 M gewonnen.
-
Das so erhaltene TTMG-1 wurde auf eine ähnliche Art und
Weise wie in Beispiel 4 einer SDS-PAGE unterzogen. Nach
Färbung mit Brilliant Blue R-250 wurde die Reinheit mit Hilfe
eines TLC-Scanners (TS-930: Shimadzu Seisakusho Ltd.) auf
einen Wert von etwa 90% bestimmt.
-
Aus der Kulturbrühe von TG1 wurden etwa 200 ug TTMG-1
aufgereinigt.
Beispiel 6
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Wachstumshemmung von Mycoplasma gallisepticum
TTMG-1, welches in Beispiel 5 erhalten wurde, wurde in
Dulbecco's PBS in einer Konzentration von 200 ug/ml gelöst.
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Nachdem 1 ml der Lösung mit einem gleichen Volumen komplettem
Freund'schen Adjuvans oder mit Aluminiumhydroxid-Gel gemischt
worden war, wurde das Gemisch Hühnern im Alter von 8 Wochen
oder älter (Linie-M, SPF: Nihon Seibutsu Kagaku Kenkyusho) in
den rechten Oberschenkel subkutan injiziert. Weitere zwei
Wochen danach wurden zur sekundären Immunisierung den Hühnern
wie bei der ersten Immunisierung jeweils 1 ml des vorstehend
beschriebenen TTMG-1 subkutan verabreicht. Eine Woche danach
wurde aus dem Herz der Hühner das Anti-TTMG-1-Serum gewonnen.
-
Auf der anderen Seite wurde der Mycoplasma
gallisepticum-Stamm S6 zu 10% in PPLO-flüssigem Medium
(modifiziertes Chanock's Medium) überimpft. Nach drei Tagen
Inkubation bei 37ºC wurde die Kulturbrühe durch einen
Membranfilter mit 0,45 um Porengröße geschickt, um die
agglutinierten Zellen zu entfernen. Das Filtrat wurde auf
eine Zellzahl von 10³ CFU/ml (CFU; colony forming units;
Kolonie-bildende Einheiten) mit PPLO-flüssigem Medium
verdünnt, welche für die Bestimmung der Aktivität verwendet
wurden.
-
Die Zell-Lösung wurde in jeweils 400 gl getrennt in ein
sterilisiertes Polypropylen-Röhrchen gefüllt. Zu der Zell-
Lösung wurden jeweils 100 ul Standard-Hühnerserum, TMG-1-
immunisiertes Serum (Japanische offengelegte Patentanmeldung
Nr. 2-111795) und TTMG-1-immunisiertes Serum zugegeben. Durch
Züchtung für 2-5 Tage bei 37ºC wurde der
Wachstumshemmungstest durchgeführt.
-
An den Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 der Inkubation wurden
jeweils 10 ul von jeder Kulturbrühe für den
Wachstumshemmungstest von Mycoplasma gallisepticum gesammelt.
Jede gesammelte Kulturbrühe, welche geerntet wurde, wurde auf
einer Platte aus PPLO-Agar-Medium ausplattiert, gefolgt von
einer Züchtung bei 37ºC für 7 Tage. Die Zellzahl der
entsprechenden Kulturbrühe wurde aus der Anzahl der
gebildeten Kolonien hergeleitet. Die Ergebnisse der
Zellzählung an Tag 3 sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Probe Zellzahl am Tag 3
Die Anzahl an Zellen
-
Standard-Hühner-Serum 1,3 · 10&sup5;
-
Anti-TMG-1-Hühner-Serum 3, 4 · 10&sup6;
-
Anti-TTMG-1-Hühner-Serum 1,8 · 10&sup5;
-
Wenn die zugegebenen Probe Standard-Hühnerserum war oder
die Kulturbrühe mit Pferdeserum ergänzt wurde, konnte kein
Unterschied in der Wachstumsrate von Mycoplasma gallisepticum
festgestellt werden und die Zellzahl erreichte am Tag 3 der
Inkubation den Sättigungsbereich. In der Kulturbrühe, welche
mit Anti-TTMG-1-immunisiertem Hühnerserum, Mycoplasma
gallisepticum-immunisiertem Hühnerserum oder mit Mycoplasma
gallisepticum-infiziertem Hühnerserum ergänzt wurde, war das
Wachstum von Mycoplasma gallisepticum am Tag 3 eindeutig
gehemmt. Die Ergebnisse zeigen, dass das TTMG-1-Protein ein
Antigen ist, welches den Antikörper induzieren kann, der in
der Lage ist, das Wachstum von Mycoplasma gallisepticum
wirkungsvoll zu hemmen.
Beispiel 7
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Die Wirkung in TTMG-1-immunisierten Hühnern, die Infektion
mit Mycoplasma gallisepticum zu verhindern
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Der Mycoplasma gallisepticum-Stamm KP-13 wurde in
PPLOflüssigem Medium gezüchtet, bis eine Konzentration von 1 ·
106 CFU/ml erreicht war. Zwei Wochen nach der zweiten
Auffrischungsimpfung der immunisierten Hühner aus Beispiel 6,
wurde die Zell-Lösung infranasal mit jeweils 0,5 ml in die
Nasenhöhlen überimpft. Vier Tage danach wurden die Hühner
getötet und die Höhlen unterhalb der Augenhöhle bzw. der
Luftsack wurden mit sterilen Baumwoll-Applikatoren
abgewischt. Die Applikatoren wurden jeweils in PPLO-flüssigem
Medium (enthaltend 1% Penicillin und 0,05% Thalliumacetat)
eingetaucht, gefolgt von einer stationären Kultur bei 37ºC
für 168 Stunden. Nach einer stationären Kultur von weiteren
20 ul in 2 ml PPLO-Medium (enthaltend 1% Penicillin und 0,05
% Thalliumacetat) wurde die Anwesenheit oder Abwesenheit der
Bakterien wie in Beispiel 6 nachgewiesen, um die Wirkung, die
Infektion verhindern zu können, zu bestimmen.
-
Die Wirkung, die Infektion verhindern zu können, ist in
Tabelle 2 gezeigt. Das erfindungsgemäße TTMG-1 zeigt in
überimpften Hühnern im Vergleich zu nicht-immunisierten
Hühnern einen bemerkenswerten Effekt, die Infektion
verhindern zu können, was bedeutet, dass das erfindungsgemäße
TTMG-1 eine bemerkenswerte Impfstoff-Wirkung zeigt.
Tabelle 2
Immun-Antigen Gewinnung von Mycoplasma
gallisepticum
Höhlen unterhalb der Augenhöhle
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TTMG-1 5/10
-
keines 4/5
SEQUENZPROTOKOLL
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(1) ALLGEMEINE INFORMATION
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(i) ANMELDER: USA Shuji Saito
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Setsuko Okawa
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Ayumi Fujisawa
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Yoshikazu Iritani
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Shigemi Aoyama
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Außerhalb USA NIPPON ZEON CO., LTD
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SHIONOGI & CO., LTD
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(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VOGEL-MYCOPLASMA-ANTIGEN, SEIN GEN, DAS GEN
ENTHALTENDER REKOMBINANTER VEKTOR UND DAMIT HERGESTELLTER
IMPFSTOFF
-
(2) INFORMATION ÜBER SEQ 1D NO: 1
-
(i) SEQUENZMERKMALE:
-
(A) LÄNGE DER SEQUENZ: 1387 Basenpaare
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(B) ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
-
(E) ART DER SEQUENZ: DNA
(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 1D NO: 1:
-
(3) INFORMATION ÜBER SEQ 1D NO: 2:
-
(i) SEQUENZMERKMALE:
-
(A) LÄNGE DER SEQUENZ: 32 Basenpaare
-
(B) ART DER SEQUENZ: Nucleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
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TACGTTCTTCCTGGCAAACCTTACCACTACTT
-
(4) INFORMATION ÜBER SEQ ID NO: 3:
-
(i) SEQUENZMERKMALE:
-
(A) LÄNGE DER DNA: 21 Basenpaare
-
(B) ART DER DNA: Nucleinsäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
-
CTACAAAGAACCTAAATATCA