DE68927144T2 - Impfstoff gegen Bordetella pertussis - Google Patents
Impfstoff gegen Bordetella pertussisInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff zum Schutz gegen Keuchhusten, der ein Protein umfaßt, das von einer das B. pertussis-Toxin codierenden Sequenz codiert wird, die eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, die eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 umfaßt.
- Keuchhusten oder Pertussis ist eine hochinfektiöse Krankheit, die hauptsächlich Kinder befällt. Neben respiratorischen Komplikationen kann der Keuchhusten auch Nervenschäden und eine hohe Mortalität zur Folge haben, insbesondere bei Kindern in sozial und wirtschaftlich schwachen Gruppen und bei Neugeborenen ohne mütterliche Antikörper gegen Pertussis. Das Pertussis auslösende Agens ist ein gramnegatives kokkoides Kurzstäbchen ("Coccobacillus"), das als Bordetella pertussis bekannt ist. Die Bakterien dringen in den Respirationstrakt ein und induzieren einen toxischen Zustand, der auch nach dem Verschwinden der Bakterien noch anhält.
- Es besteht immer noch Bedarf an wirksamen und sicheren Impfstoffen gegen Infektionen, die durch B. pertussis verursacht werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine das B. pertussis- Toxin codierende Sequenz, die eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 (nachstehend "Trp-26") umfaßt und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen inaktivierte S1-Enzymaktivität bei dem Protein zur Folge hat, das von der das B. pertussis-Toxin codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das Protein die Fähigkeit behalten hat, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden. Diese Erfindung betrifft außerdem ein rekombinantes DNA-Molekül, das die erfindungsgemäße codierende Sequenz enthält.
- In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Plasmid bereitgestellt, das die erfindungsgemäße codierende Sequenz umfaßt. Dieses Plasmid enthält vorzugsweise die vorstehende codierende Sequenz in funktioneller Verbindung mit geeigneten Expressions-Kontrollsequenzen. Mit "geeigneten Expressions-Kontrollsequenzen" sind die Sequenzen gemeint, die für die Expression der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz durch eine geeignete Wirtszelle, in welche das erfindungsgemäße Plasmid eingeführt ist, erforderlich sind. Solche Expressions-Kontrollsequenzen sind dem Fachmann bekannt.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer transformierten Wirtszelle, umfassend die Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Plasmid.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Plasmid transformiert ist. Die Wirtszelle kann in einem geeigneten Kulturmedium wachsen und die erfindungsgemäße codierende Sequenz exprimieren.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Proteins, umfassend die Züchtung des erfindungsgemäßen transformierten Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und die Isolierung des auf diese Weise hergestellten Proteins. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Protein, das von der codierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung codiert wird.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Impfstoff zur Stimulierung von Schutz gegen Keuchhusten, wobei der Impfstoff eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des erfindungsgemäßen Proteins umfaßt. Der Impfstoff kann das Protein alleine oder zusammen mit anderen Antigenen und/oder Adjuvantien umfassen. Mit dem Begriff "immunprotektive Menge" ist eine Menge eines beliebigen Proteins der vorliegenden Erfindung gemeint, die eine ausreichende protektive Immunantwort gegen Pertussis induzieren kann, nachdem eine solche Menge des Proteins an einen menschlichen Wirt verabreicht wurde.
- Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Impfung eines Menschen gegen Keuchhusten bereit, umfassend die Verabreichung des Impfstoffes der vorliegenden Erfindung an den Menschen.
- Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, das von einer die Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz codiert wird, die eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 (nachstehend "Trp-26") umfaßt und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen inaktivierte S1-Enzymaktivität bei dem Protein zur Folge hat, das von der die Aminosäuresequenz des B. pertussis-Toxin-Operons codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das Protein die Fähigkeit behalten hat, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden, wobei ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Behandlung einer die Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz, die durch Isolierung aus nativer B. pertussis- DNA oder durch synthetische oder rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde und eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß die die S1- Untereinheit codierende Sequenz nicht bereits eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 umfaßt, durch positionsgerichtete ("site-directed") Mutagenese mit einem Tryptophan modifizierenden chemischen Reagens oder durch Photooxidation zur Erzeugung einer Modifikation oder Deletion des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26, Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem Plasmid, das die resultierende codierende Sequenz enthält, Züchtung des Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins, (ii) Substitution oder Deletion des Tryptophanrestes an der Position 26 der S1-Untereinheit einer die Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz, die durch Isolierung aus nativer B. pertussis-DNA oder durch synthetische oder rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde und eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, durch eine andere Aminosäure, Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem Plasmid, das die resultierende codierende Sequenz enthält, Züchtung des Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins, oder (iii) Herstellung der codierenden Sequenz durch synthetische Verfahren und Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem die codierende Sequenz enthaltenden Plasmid, Züchtung des Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins. Diese Erfindung betrifft außerdem das Protein, das durch ein solches Verfahren erzeugt wird, einen Impfstoff zur Stimulation von Schutz gegen Keuchhusten, wobei der Impfstoff eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des Proteins umfaßt, und ein Verfahren zur Impfung eines Menschen gegen einen späteren Keuchhusten, umfassend die Verabreichung des Impfstoffes an den Menschen.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein B. pertussis-Stamm, bei dem das chromosomale Pertussis-Toxin-Gen inaktiviert ist, wobei der Stamm das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung enthält. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Ganzzellen-Impfstoff zur Stimulation von Schutz gegen Keuchhusten, wobei der Impfstoff eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des erfindungsgemäßen Stammes umfaßt. Der Impfstoff kann den Stamm alleine oder zusammen mit anderen Antigenen und/oder Adjuvantien umfassen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Impfung eines Menschen gegen einen späteren Keuchhusten, umfassend die Verabreichung des Impfstoffes an den Menschen.
- Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden genauen Beschreibung der zur Zeit bevorzugten Ausführungsform offenbart.
- Die europäische Patentanmeldung EP-A-0 396 964 (nachstehend Dokument D1) beschreibt Bordetella-Toxin-Mutanten, bei denen u.a. mindestens einer der Reste Trp-26, Glu-129 und Arg- 9 durch eine andere Aminosäure substituiert ist. Eine spezifische, mit PT-261/129G bezeichnete Mutante wird beschrieben, bei der der Trp-26-Rest und der Glu-129-Rest der S1-Untereinheit durch Ile bzw. Gly ersetzt wurden. Dieses Zitat ist für die vorliegende Anmeldung unter Artikel 54(3) EPÜ für alle benannten Staaten relevant.
- C. Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (Mai 1989), 3075-3079, (nachstehend Dokument D2), beschreibt Experimente, wobei die S1-Untereinheit des Pertussis-Toxins durch Deletion oder Substitution an drei Aminosäureresten, Trp-26, Glu-106 und Glu-129, modifiziert wird. Es wurde gezeigt, daß die Modifikationen am Trp-26 und Glu-129 die Enzymaktivität beeinträchtigen. In der Zusammenfassung von D2 wird festgestellt, daß ein Pertussis-Toxin, das eine Deletion oder einen Austausch von Trp-26, Glu-129 oder von beiden Resten in der S1-Untereinheit enthält, keine toxischen Aktivitäten aufweisen sollte, ohne daß die Reaktivität mit protektiven Antikörpern verloren geht.
- Aufgrund der Dokumente D1 und D2 ist die vorliegende Erfindung gemäß den beiliegenden Patentansprüchen so eingeschränkt, daß, wenn zusätzlich zur Modifikation des Tryptophanrestes an der Position 26 außerdem eine Modifikation eines weiteren Aminosäurerestes in der S1 codierenden Sequenz enthalten ist, dann die zusätzliche Modifikation keine Deletion oder Substitution des Glutaminsäurerestes an der Position 129 umfaßt, und daß, wenn der Tryptophanrest an der Position 26 der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz durch Isoleucin substituiert ist, die zusätzliche Modifikation keine Substitution des Asparaginsäurerestes an der Aminosäureposition 11 durch Serin, keine Substitution des Argininrestes an der Aminosäureposition 9 durch Lysin oder Glycin, keine Substitution des Phenylalaninrestes an der Position 50 durch Glutaminsäure, keine Substitution des Argininrestes an der Position 13 durch Leucin, keine Substitution des Aparaginsäurerestes an der Position 1 durch Glutaminsäure, keine Substitution des Glutaminsäurerestes an der Position 39 durch Glycin, keine Substitution des Tyrosinrestes an der Position 130 durch Glycin, keine Substitution des Glycinrestes an der Position 86 durch Glutaminsäure, keine Substitution des Isoleucinrestes an der Position 88 durch Glutaminsäure, keine Substitution des Tyrosinrestes an der Position 89 durch Serin, keine Substitution des Tyrosinrestes an der Position 8 durch Asparaginsäure oder keine Substitution des Threoninrestes an der Position 53 durch Isoleucin einschließt.
- Diese Einschränkungen beziehen sich auf alle nachstehend erwähnten "Doppelmutanten".
- Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß eine Modifikation des natürlich vorkommenden Aminosäurerestes Tryptophan an der Position 26 der S1-Untereinheit der das Pertussis-Toxin codierenden Sequenz die Toxizität des Pertussis- Toxins stark herabsetzt, während seine Fähigkeit erhalten bleibt, eine protektive Immunantwort zu induzieren.
- Das Pertussis-Toxin ist ein Protein-Exotoxin von B. pertussis, das in der Pathogenese von Keuchhusten eine entscheidende Rolle spielt, vermutlich ist es das wichtigste protektive Antigen von B. pertussis [vgl. A. A. Weiss et al., Ann. Rev. Microbiol. 40 (1986), 661]. Das Pertussis-Toxin ist ein hexameres Protein, das aus fünf unterschiedlichen Untereinheiten zusammengesetzt ist, die entsprechend ihren Molekulargewichten in abnehmender Größe mit S1 bis S5 bezeichnet werden [vgl. M. Tamura et al., Biochem. 21 (1982), 5516]. Das Pertussis-Toxin zeigt die Struktur eines A-B-Modells, wobei das B-Oligomer (Untereinheiten S2 bis S5) für die Bindung des Toxins an seinen Rezeptor in den Membranen der Zielzellen verantwortlich ist und das A-Protomer (S1-Untereinheit) die Enzymaktivität enthält.
- Nun wurde gefunden, daß aufgrund der Trp-26-Modifikation der S1-Untereinheit, die in der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz enthalten ist, die codierende Sequenz ein Protein codiert, das eine im wesentlichen inaktivierte Enzymaktivität der S1-Untereinheit aufweist. Die normale Enzymaktivität der S1-Untereinheit trägt zur Toxizität verschiedener B. pertussis-Impfstoffe bei, die Pertussis-Toxin oder S1-Untereinheit- Protein enthalten. Die Enzymaktivität umfaßt die NAD-Glykohydrolyse oder den ADP-Ribosyltransfer. Der erfindungsgemäße Impfstoff weist somit keine solchen Toxizitäts-Probleme auf. Trotzdem kann ein Protein, das von der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz stammt und eine solche Inaktivierung der Enzymaktivität der S1-Untereinheit umfaßt, noch durch Antikörper gegen das Pertussis-Toxin erkannt werden.
- Die vorliegende Erfindung beschreibt also eine die Aminosäuresequenz des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz, die eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 (nachstehend "Trp-26") umfaßt und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen inaktivierte Enzymaktivität der S1-Untereinheit bei dem Protein zur Folge hat, das von der das B. pertussis-Toxin codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das Protein die Fähigkeit behält, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden. Diese Erfindung beschreibt auch ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend die erfindungsgemäße codierende Sequenz und außerdem die die Aminosäuresequenz des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz der vorliegende Erfindung, wobei das erfindungsgemäße rekombinante DNA-Molekül weitere DNA-Sequenzen enthalten kann, einschließlich z.B. ein regulatorisches Element, einen oder mehrere Selektionsmarker und Replikations- und Erhaltungs- Funktionen.
- Mit der Bezeichnung "B. pertussis-Toxin codierende Sequenz", die in der Beschreibung der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz verwendet wird, ist das vollständige B. pertussis-Toxin-Operon oder ein beliebiges funktionelles verkürztes Fragment davon gemeint, das eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation am Trp-26 umfaßt und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen inaktivierte Enzymaktivität der S1-Untereinheit bei dem Protein zur Folge hat, das von der das B. pertussis-Toxin codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das Protein die Fähigkeit behält, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden. Mit der Bezeichnung "B. pertussis-Toxin codierende Sequenz", die in der Beschreibung der erfindungsgemaßen codierenden Sequenz verwendet wird, ist außerdem eine ein funktionelles Fusionsprotein codierende Sequenz gemeint, umfassend (i) die das vollständige B. pertussis-Toxin codierende Sequenz oder ein beliebiges verkürztes funktionelles Fragment davon, das eine vollständige oder verkürzte, die S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, und (ii) eine ein anderes Protein codierende Sequenz, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation am Trp-26 umfaßt und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen inaktivierte Enzymaktivität der S1-Untereinheit bei dem Protein zur Folge hat, das von der das B. pertussis-Toxin codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das Protein die Fähigkeit behält, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden. Mit der Bezeichnung "funktionell" ist eine das B. pertussis-Toxin codierende Sequenz gemeint, die ein Protein codiert, das entweder von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin ausreichend gut erkannt werden kann, so daß es in einem diagnostischen Test auf B. pertussis nützlich ist, und/oder das eine ausreichende protektive Immunantwort gegen Pertussis induzieren kann, nachdem eine immunprotektive Menge eines solchen Proteins an einen menschlichen Wirt verabreicht wurde.
- Vorzugsweise ist die das B. pertussis-Toxin codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung eine verkürzte Version des B. pertussis-Toxin-Operons, umfassend nur die die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz oder einen verkürzten Anteil davon. Andere bevorzugte Ausführungsformen der die Aminosäuresequenz des B. pertussis- Toxins codierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung umfassen das vollständige B. pertussis-Operon oder die codierende Sequenz einer beliebigen Untereinheit davon entweder alleine oder zusammen mit einer oder mehreren anderen Untereinheiten.
- Die Nucleotidsequenz der codierenden Sequenz des vollständigen B. pertussis-Toxin-Operons wurde bereits bestimmt. Vgl. z.B. Keith et al., US-Patentanmeldung, Serien-Nr. (USSN) 843 727, angemeldet am 26. März 1986, deren gesamte Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Außerdem kann eine DNA, die die das Pertussis-Toxin codierende Sequenz enthält, aus einem beliebigen, allgemein verfügbaren B. pertussis-Stamm isoliert werden. Z.B. sind verschiedene Stämme von B. pertussis aus kommerziellen Hinterlegungsstellen allgemein verfügbar, z.B. von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Die Isolierung kann nach dem Verfahren von Keith et al., USSN 843 727, a.a.O., oder durch ein beliebiges anderes herkömmliches Verfahren durchgeführt werden.
- Die Modifikation des Trp-26-Restes des S1-Untereinheit- Anteils der codierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, wobei herkömmliche Techniken verwendet werden.
- Z.B. besteht ein Verfahren zur Veränderung des Trp-26- Restes in der Verwendung eines den Tryptophanrest (Trp) modifizierenden chemischen Reagens, wie z.B. 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid (HNBB). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde die katalytische Domäne für die NAD-Glykohydrolase- und die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität der Pertussis-Toxin-S1-Untereinheit, z.B. die Aminosäurereste 2 bis 187 der S1-Untereinheit, aus einem E. coli-Stamm gereinigt, der das diese katalytische Domäne codierende Gen exprimiert. Dieses gereinigte Polypeptid wurde mit einem Tryptophan modifizierenden chemischen Reagens (HNBB) behandelt, um eine Modifikation des Trp-26-Restes zu erzeugen. Beim anschließenden Test des aus der HNBB-Behandlung resultierenden Polypeptids auf seine S1-Enzymaktivitäten, zeigte sich, daß es keine solchen Aktivitäten mehr aufwies, d.h. sowohl die NAD-Glykohydrolase- Aktivität als auch die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität waren verschwunden, dies wurde durch herkömmliche Testverfahren bestimmt.
- Weitere Tryptophan modifizierende chemische Reagenzien, die zur Durchführung der Modifikation des Trp-26-Restes eingesetzt werden können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, N-Bromsuccinimid (vgl., z.B., Spande, T. F., und Withop, B., Meth. Enzymol. 11 (1967), 522), H&sub2;O&sub2;, Perameisensäure, Sulfenylhalide (vgl., z.B., Seolfone, E., Fontana, A., und Roccki, R., Biochemistry 7 (1968), 971), 2-Nitrophenylsulfenylchlorid, 2,4-Dinitrophenylsulfenylchlorid und 2-Acetoxy- 5-nitrobenzylchlorid.
- Ferner kann eine Photooxidation als Verfahren zur Modifikation des Trp-26-Restes der S1-Untereinheit eingesetzt werden (vgl., z.B., Spikes, J. D., und Straight, R., Ann. Rev., Phys. Chem. 18 (1967), 409).
- Eine andere Möglichkeit zur Modifikation des Trp-26-Restes der S1-Untereinheit umfaßt die Deletion oder Substitution des Codons für diesen Rest in dem die S1-Untereinheit codierenden Gen durch herkömmliche positionsgerichtete Mutagenese. Ein Beispiel der Durchführung der positionsgerichteten Mutagenese bei einem exemplarischen Konstrukt der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz in Form eines S1-Untereinheit-Gens wird in Beispiel 5 beschrieben. Z.B. wurde die die S1-Untereinheit codierende Sequenz in einem M13-Vektor subcloniert, so daß die Expression dieser Sequenz in einem mit dem rekombinanten M13- Vektor transformierten E. coli durchgeführt werden konnte. Der Trp-26-Rest wurde sodann durch positionsgerichtete Mutagenese deletiert oder durch Threonin (Thr) ersetzt. Andere Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung können von einem Fachmann nach herkömmlichen Verfahren entworfen werden, so daß die positionsgerichtete Mutagenese an der Trp-26-Stelle durchgeführt werden kann.
- Ein anderes Verfahren zur Modifikation der den Tryptophanrest an der Position 26 der S1-Untereinheit codierenden Sequenz zur Erzeugung der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz umfaßt die Deletion des Trp-26-Restes und seine Substitution durch Threonin (Thr) durch herkömmliche gentechnische Verfahren oder die Substitution an dieser Stelle durch andere geeignete Aminosäurereste. Andere für die Substitution geeignete Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Glutamin (Gln), Tyrosin (Tyr) und Phenylalanin (Phe). Ein Wechsel von Trp-26 zu Gln ist ein eher konservativer Austausch, wenn man die Sekundärstruktur-Merkmale betrachtet. Ein Austausch von Trp zu Tyr kann die intermediären Polaritätseigenschaften aufrechterhalten, während bei einem Austausch von Trp zu Phe der aromatischen Ring erhalten bleibt. Das modifizierte Molekül sollte dem natürlichen Molekül so ähnlich wie möglich sein, aus diesem Grund bevorzugt man eine sehr ähnliche Sekundärstruktur, ein sehr ähnliches Hydrophobieprofil und eine sehr ähnliche Verteilung der aromatischen Aminosäuren. Jede beliebige andere Aminosäuresubstitution kann ins Auge gefaßt werden, mit der Maßgabe, daß die Substitution die Erzeugung einer codierenden Sequenz zur Folge hat, die ein Protein mit im wesentlichen inaktivierter S1-Enzymaktivität und Erhaltung der Erkennung durch Antikörper gegen B. pertussis-Toxin codiert.
- Die die Aminosäuresequenz codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung kann auch (a) synthetisch unter Verwendung herkömmlicher Techniken der DNA-Synthese oder (b) durch andere chemische Modifikationsverfahren unter Verwendung herkömmlicher chemischer Modifikationstechniken hergestellt werden.
- Außerdem kann die codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung durch Einsatz herkömmlicher gentechnischer Verfahren in Form einer beliebigen verkürzten Version des Pertussis-Toxin-Operons, enthaltend die Trp-26-Modifikation, oder in Form einer verkürzten Version der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz, enthaltend nur die Codons für die Aminosäuren 2 bis 187 der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz, umfassend die Trp-26-Modifikation, vorliegen; oder in einer anderen Ausführungsform kann die codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung einen beliebigen verkürzten Anteil der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz, umfassend die Trp-26-Modifikation, enthalten.
- Zusätzlich kann die codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung in Form einer Doppelmutante vorliegen, d.h. einer codierenden Sequenz, die in der S1-Untereinheit sowohl eine Trp-26-Modifikation als auch eine Modifikation eines anderen Aminosäurerestes enthält, mit der Maßgabe, daß das von der codierenden Sequenz codierte Protein die Fähigkeit behält, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden. Es ist so zu verstehen, daß solche "Doppelmutanten", die im Umfang der Erfindung liegen, angesichts des Standes der Technik eingeschränkt sind (vgl. den vorstehenden Abschnitt Stand der Technik und die beigefügten Patentansprüche). Vorzugsweise zeigt das von einer solchen codierenden Sequenz codierte Protein außerdem eine Abnahme der Enzymaktivität der S1-Untereinheit. Beispiele von solchen zusätzlichen Modifikationen, die in geeigneten Fällen verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die Modifikation des Histidinrestes an der Aminosäureposition 35 der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz (His-35); die Modifikation des Argininrestes an der Aminosäureposition 9 der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz (Arg-9) und die Modifikation des Serinrestes an der Aminosäureposition 40 der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz (Ser-40).
- Darüberhinaus kann die erfindungsgemäße codierende Sequenz in Form einer ein Fusionsprotein codierenden Sequenz vorliegen, umfassend die die Aminosäuresequenz des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz, fusioniert mit mindestens einer anderen codierenden Sequenz, wie z.B., nicht jedoch darauf beschränkt, einer von Pertussis-Toxin stammenden codierenden Sequenz und/oder einer nicht von Pertussis-Toxin stammenden codierenden Sequenz. Z.B. kann das Fusionsprotein die Gesamtheit oder einen Teil der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz umfassen, einschließlich die Trp-26-Modifikation, fusioniert mit der Gesamtheit oder einem Teil der die S2-Untereinheit codierenden Sequenz und/oder der die S3-Untereinheit codierenden Sequenz und/oder der die S4-Untereinheit codierenden Sequenz und/oder der die S5-Untereinheit codierenden Sequenz. Das Fusionsprotein kann auch die Gesamtheit oder einen Teil der die S1-Untereinheit codierenden Sequenz umfassen, einschließlich die Trp-26-Modifikation, fusioniert mit anderen Antigenen von B. pertussis oder anderen Antigenen, wie z.B., jedoch nicht darauf beschränkt, Diphtherie-Antigenen und/oder Tetanus-Antigenen und/oder Haemophilus influenza-Antigenen. Ein Beispiel einer ein Fusionsprotein codierenden Sequenz der vorliegenden Erfindung ist das in den Beispielen beschriebene Fusionsprotein, das die folgende Sequenz umfaßt: Sequenz:
- Andere codierende Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die in Form eines Fusionsproteins vorliegen, können vom Fachmann nach herkömmlichen Verfahren entworfen und hergestellt werden.
- Außerdem kann das vorstehende Trp-26-modifizierte verkürzte S1-Fragment mit anderen Sequenzen des Wildtyp-Pertussis-Toxin-Operons assoziiert sein, wie z.B. mit einer beliebigen anderen der die S2- bis 55-Untereinheiten codierenden Sequenzen alleine oder zusammen mit einer oder mehreren der die S2- bis S5-Untereinheiten codierenden Sequenzen. In einer anderen Ausführungsform kann eine vollständige, das B. pertussis-Toxin codierende Sequenz hergestellt werden, die (a) das vorstehende Trp-26-modifizierte verkürzte S1-Fragment anstelle des natürlich vorkommenden S1-Cistrons oder (b) ein vollständiges S1-Untereinheit-Cistron, das nur die Trp-26-Modifikation umfaßt, oder ein beliebiges anderes Fragment, das eine solche Trp-26-Modifikation umfaßt, zusammen mit anderen Komponenten enthält.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Plasmid transformiert ist. Die Wirtszelle kann in einem geeigneten Kulturmedium wachsen und die erfindungsgemäße codierende Sequenz exprimieren. Die Wirtszelle wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt, d.h. durch Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit dem erfindungsgemäßen Plasmid. Die Transformation wird durch Verwendung herkömmlicher Transformationstechniken durchgeführt. Die am stärksten bevorzugten Wirtszellen umfassen Zellen, die zur Art E. coli und zur Gattung Bordetella gehören. Andere Wirtszellen, die geeignet sein können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Säugerzellen, Insektenzellen, andere Bakterienzellen und Hefezellen. Diese Erfindung ist somit nicht auf spezifische Wirtszellen beschränkt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, das von der erfindungsgemäßen codierenden Sequenz codiert wird, umfassend die Züchtung des transformierten Wirtes der vorliegenden Erfindung in geeigneten Kulturmedien und die Isolierung des Proteins. Mit "geeigneten Kulturmedien" sind die Medien gemeint, in denen der transformierte Wirt wachsen kann und in denen der transformierte Wirt die erfindungsgemäße codierende Sequenz in einer isolierbaren Menge exprimieren kann. Der Fachmann wird verstehen, daß die Auswahl geeigneter Kulturmedien von der verwendeten Wirtszelle abhängt. Die Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins wird aus dem Kulturlysat des Wirtes oder, falls geeignet, direkt aus dem Kulturmedium des Wirtes durchgeführt, wobei herkömmliche Techniken der Proteinisolierung zur Anwendung kommen.
- Somit besteht angesichts der vorstehenden Beschreibung eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung des Proteins, das von einer die Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz codiert wird, die eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 (nachstehend "Trp-26") umfaßt und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen inaktivierte S1-Enzymaktivität bei dem Protein zur Folge hat, das von der die Aminosäuresequenz des B. pertussis- Toxin-Operons codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das Protein die Fähigkeit behalten hat, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Behandlung einer die Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz, die durch Isolierung aus nativer B. pertussis-DNA oder durch synthetische oder rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde und eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß die die S1-Untereinheit codie rende Sequenz nicht bereits eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 enthält, durch positionsgerichtete Mutagenese, mit einem Tryptophan modifizierenden chemischen Reagens oder durch Photooxidation zur Erzeugung einer Modifikation oder Deletion des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26, Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem Plasmid, das die resultierende codierende Sequenz enthält, Züchtung der Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins, (ii) Substitution oder Deletion des Tryptophanrestes an der Position 26 der S1-Untereinheit einer die Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz, die durch Isolierung aus nativer B. pertussis-DNA oder durch synthetische oder rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde und eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, durch eine andere Aminosäure, Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem Plasmid, das die resultierende codierende Sequenz enthält, Züchtung des Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins, oder (iii) Herstellung der codierenden Sequenz durch synthetische Verfahren und Transformation einer gewünschten Wirtszelle mit einem die resultierende codierende Sequenz enthaltenden Plasmid, Züchtung des Wirtes in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung des auf diese Weise produzierten Proteins. Diese Erfindung betrifft außerdem das Protein, das durch ein solches Verfahren erzeugt wird, einen Impfstoff zur Stimulation von Schutz gegen Keuchhusten, wobei der Impfstoff eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des Proteins umfaßt, und ein Verfahren zur Impfung eines Menschen gegen einen späteren Keuchhusten, umfassend die Verabreichung des Impfstoffes.
- Die Erfindung umfaßt auch einen Impfstoff, der eine Immunität gegen Pertussis induzieren kann. Der Impfstoff beinhaltet eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des erfindungsgemäßen Proteins, unabhängig vom Verfahren zur Herstellung des Proteins. Der Impfstoff enthält vorzugsweise 5 bis 25 µg des erfindungsgemäßen Proteins, er ist jedoch nicht auf diese Mengen beschränkt.
- Außerdem können andere Antigene, die bekanntermaßen wünschenswerterweise zusammen mit dem Pertussis-Toxin verabreicht werden, in den Impfstoffen enthalten sein. Solche zusätzlichen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte zusätzliche Komponenten umfassen Tetanustoxoid und/oder Diphtherietoxoid, außerdem filamentöses Hämagglutinin (FHA) und/oder ein beliebiges anderes protektives Antigen von B. pertussis.
- Die Bereitstellung eines solchen Impfstoffes führt somit zu einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, d.h. einem Verfahren zur Immunisierung eines Menschen gegen Pertussis, umfassend die Verabreichung des Impfstoffes der vorliegenden Erfindung an den Menschen.
- Der erfindungsgemäße Impfstoff kann über einen geeigneten Weg verabreicht werden, wobei eine immunprotektive Menge des Proteins der vorliegenden Erfindung auf den Wirt übertragen wird. Vorzugsweise wird der Impfstoff jedoch auf parenteralem Weg intramuskulär oder tief subkutan verabreicht. Auch andere Verabreichungsarten können angewendet werden, sofern gewünscht, wie z.B. die orale Verabreichung oder eine Verabreichung über andere parenterale Routen, d.h. intradermal, intranasal oder intravenös.
- Der erfindungsgemäße Impfstoff kann als pharmazeutische Zusammensetzung hergestellt werden, enthaltend eine immunprotektive, nicht-toxische Menge des erfindungsgemäßen Proteins in einem nicht-toxischen und sterilen pharmazeutisch verträglichen Träger. Wenn der Impfstoff parenteral verabreicht wird, kann das erfindungsgemäße Protein gegebenenfalls mit einem herkömmlichen Adjuvans gemischt oder daran absorbiert werden, wobei das Adjuvans als unspezifisches Irritans zum Anziehen oder zur Verstärkung einer Immunantwort eingesetzt wird. Solche Adjuvantien umfassen, u.a., Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Muramyldipeptid und Saponine, wie z.B. Quil A. In einem anderen Beispiel der Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes kann das erfindungsgemäße Protein in Mikropartikel, wie z.B. Liposomen, eingekapselt werden. In einem weiteren Beispiel zur Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes kann das erfindungsgemäße Protein zusammen mit einem immunstimulierenden Makromolekül oder einem Tetanustoxoid verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine wäßrige Suspension oder Lösung, die das erfindungsgemäße Protein enthält und vorzugsweise auf den physiologischen pH-Wert gepuffert ist, für die orale Aufnahme zubereitet werden.
- Vorzugsweise liegt der erfindungsgemäße Impfstoff in einer pharmazeutischen Zubereitung in Einheitsdosierungsformen vor. Die geeignete therapeutisch wirksame Dosis kann durch den Fachmann einfach bestimmt werden. Die wirksame Menge des im erfindungsgemäßen Impfstoff enthaltenen Proteins kann im Bereich der wirksamen Mengen des Antigens in herkömmlichen azellulären oder Komponenten-B. pertussis-Impfstoffen liegen, d.h. 5 bis 25 µg Protein. Diese Dosis kann gegebenenfalls mit verschiedenen Mengen des filamentösen Hämagglutinins (FHA) (etwa 10 bis 25 µg) und/oder Agglutinogenen oder anderen Antigenen versetzt werden. Es ist jedoch so zu verstehen, daß der spezifische Dosisspiegel für einen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, einschließlich Alter, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht und Ernährung des Patienten; Verabreichungszeitpunkt; Verabreichungsweg; synergistische Effekte mit beliebigen anderen verabreichten Arzneistoffen; und gewünschter Grad des Schutzes. Selbstverständlich kann die Verabreichung in geeigneten Abständen wiederholt werden, falls nötig. Vorzugsweise werden drei Dosen mit drei bis 12 Monaten Abstand zwischen den einzelnen Dosen verabreicht, gegebenenfalls mit einer späteren Booster-Dosis.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein B. pertussis-Stamm, bei dem das chromosomale Pertussis-Toxin-Gen inaktiviert ist, wobei der Stamm das rekombinante DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung enthält. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Ganzellen-Impfstoff zur Stimulierung von Schutz gegen Keuchhusten, wobei der Impfstoff eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des erfindungsgemäßen Stammes umfaßt. Der Impfstoff kann den Stamm alleine oder zusammen mit anderen Antigenen und/oder Adjuvantien umfassen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Impfung eines Menschen gegen einen späteren Keuchhusten, umfassend die Verabreichung des Impfstoffes an den Menschen. Ein beliebiger Stamm von B. pertussis, der das chromosomale Pertussis-Gen enthält, kann als Ausgangsmaterial zur Herstellung des erfindungsgemäßen Stammes verwendet werden. Zahlreiche geeignete Stämme von B. pertussis sind von verschiedenen Hinterlegungsstellen allgemein verfügbar, z.B. der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Die Zubereitung des Stammes kann nach herkömmlichen Techniken durchgeführt werden. Z.B. wird zur Zubereitung des erfindungsgemäßen Stammes das chromosomale Pertussis-Toxin-Gen durch herkömmliche Techniken, wie z.B. durch Deletion, Punkt- oder Insertionsmutation, inaktiviert und das rekombinante DNA- Molekül der vorliegenden Erfindung durch herkömmliche Techniken in den Stamm transformiert. Vorzugsweise wird ein B. pertussis-Stamm verwendet, bei dem das chromosomale Toxin-Gen deletiert ist, anstatt daß es durch Punkt- oder Insertionsmutationen inaktiviert ist. Die Inaktivierung des Gens durch Punkt- oder Insertionsmutationen führt nicht zur Entfernung der DNA-Sequenzen, die das Potential besitzen, in vivo mit der das mutierte Pertussis-Toxin codierenden DNA auf einem sich autonom replizierenden Plasmid zu rekombinieren. Dagegen kann eine solche Rekombination bei einer Deletionsmutante des Pertussis-Toxin-Gens nicht stattfinden. Der resultierende B. pertussis-Stamm wird sodann mit dem rekombinanten DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung transformiert, wodurch der erfindungsgemäße Stamm entsteht. Vorzugsweise ist das rekombinante DNA-Molekül im Plasmid der vorliegenden Erfindung enthalten. Das rekombinante DNA-Molekül kann in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut werden, oder es kann, sofern es in Form eines Plasmids vorliegt, als Episom erhalten bleiben. Nachdem das rekombinante DNA-Molekül eingeführt wurde, kann der resultierende B. pertussis-Stamm zur Produktion des mutierten Pertussis-Toxin-Proteins der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Stamm nach Einführung des rekombinanten DNA-Moleküls nun zur Herstellung eines Ganzzellen-Impfstoffes gegen Pertussis verwendet werden. Die Herstellung eines solchen Ganzzellen-Impfstoffes wird mittels herkömmlicher Techniken durchgeführt.
- Die Bereitstellung eines Impfstoffes führt somit zu einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung, d.h. einem Verfahren zur Immunisierung eines Menschen gegen Pertussis, umfassend die Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffes an den Menschen.
- Der erfindungsgemäße Impfstoff kann über einen geeigneten Weg verabreicht werden, wobei eine immunprotektive Menge des Stammes der vorliegenden Erfindung auf den Wirt übertragen wird. Vorzugsweise wird der Impfstoff jedoch auf parenteralem Weg intramuskulär oder tief subkutan verabreicht. Auch andere Verabreichungsarten können angewendet werden, sofern gewünscht, wie z.B. die orale Verabreichung oder eine Verabreichung über andere parenterale Routen, d.h. intradermal, intranasal oder intravenös.
- Die geeignete immunprotektive und nicht-toxische Dosis des Impf stoffes kann durch den Fachmann einfach bestimmt werden., d.h. die geeignete immunprotektive und nicht-toxische Menge des Stammes der vorliegenden Erfindung, der im erfindungsgemäßen Impfstoff enthalten ist, kann im Bereich der wirksamen Mengen des Antigens in herkömmlichen B. pertussis- Ganzzellen-Impfstoffen liegen. Diese Dosis kann gegebenenfalls mit verschiedenen Mengen des filamentösen Hämagglutinins (FHA) (etwa 10 bis 25 µg) und/oder Agglutinogenen oder anderen Antigenen versetzt werden. Es ist jedoch so zu verstehen, daß der spezifische Dosisspiegel für einen bestimmten Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängt, einschließlich Alter, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht und Ernährung des Patienten; Verabreichungszeitpunkt; Verabreichungsweg; synergistische Effekte mit beliebigen anderen verabreichten Arzneistoffen; und gewünschter Grad des Schutzes. Selbstverständlich kann die Verabreichung in geeigneten Abständen wiederholt werden, falls nötig. Vorzugsweise werden drei Dosen mit drei bis 12 Monaten Abstand zwischen den einzelnen Dosen verabreicht, gegebenenfalls wird eine spätere Booster-Dosis angeschlossen.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der codierenden Sequenz, des Vektors, des transformierten Wirtes und des Proteins der vorliegenden Erfindung; die antigene Aktivität des Proteins; und die Herstellung des erfindungsgemäßen Impfstoffes. Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken.
- In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben. Die zur DNA-Manipulation verwendeten Enzyme wurden von Boehringer (Mannheim, BRD) und Amersham (Amersham, GB) bezogen und gemäß den Anweisungen des Herstellers eingesetzt.
- In den folgenden Beispielen können die nachstehenden Abkürzungen verwendet werden.
- YT-Medium: 8 Gramm/Liter (g/l) Trypton, 5 g/l NaCl, 5 g/l Hefeextrakt.
- Tris-HCL, 1 M Vorratslösung: 121,1 g/l Trizma-Base + HCl, bis der pH-Wert den gewünschten Wert erreicht (Beispiel 7,5).
- LB-Medium (pH 7,5): Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l.
- Plasmid pPTX42, das in Locht, C., et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 3251, beschrieben wird, wurde mit Sau3a in Fragmente gespalten. Die Fragmente wurden durch Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese (PAGE) gemäß dem Verfahren von Maniatis et al., Molecular doning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, (1982), aufgetrennt. Ein Fragment mit 560 Basenpaaren (bp) wurde gereinigt und in die replikative Form von M13mp18 integriert, das vorher mit BamHI gespalten worden war. M13mp18 wird in Messing, J. Methods Enzymol. 101 (1983), 20-78, beschrieben und wurde von Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland, erhalten. E. coli TG1-Zellen, bezogen von Amersham, International PLC, Amersham, GB, wurden mit der replikativen Form der rekombinanten Phagen gemäß der Technik von Maniatis et al., a.a.O., transformiert. Nach der Transformation und der Inkubation über Nacht wurden die Phagen durch DNA-Sequenzierung nach dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467, daraufhin untersucht, ob die 560 bp-Insertion vorlag.
- Ein Phage, der die 560 bp-Insertion enthielt, wurde gereinigt und mit pRIT20001 bezeichnet. Die Bestimmung zeigte, daß das von pRIT20001 codierte S1-Untereinheit-verwandete Protein mit rS1d identisch war, dem S1-Untereinheit-verwandten Protein, das von PTXS11 codiert wird, wie in Locht et al., Infect. Immun. 55 (1987), 2546, beschrieben, dessen gesamte Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. In diesem Konstrukt, d.h., pRIT20001, sind die sechs aminoterminalen Aminosäuren die ersten sechs Aminosäuren der beta-Galactosidase. Sie werden von fünf Aminosäuren gefolgt, die von der Polylinker-Sequenz im donierungsvektor M13mp18 codiert werden, dahinter liegen die Reste 2 bis 187 der die S1-Untereinheit des Pertussis-Toxins codierenden Sequenz. Schließlich wird ein Leu-Rest durch den Polylinker codiert und ein Stop-Codon bereitgestellt.
- 1,5 ml einer Übernacht-Kultur von E. coli TG1-Zellen wurden in 100 ml YT-Medium geimpft und danach mit 10 µl pRIT20001, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, oder mit M13mp18-Phagenvorratslösung infiziert. Die infizierten Zellen wurden unter fortgesetztem Schütteln bei 37ºC so lange gezüchtet, bis die optische Dichte (OD) den Wert 0,3 erreichte. Sodann wurde Isopropyl-beta-D-galactopyranosid (IPTG) zu den Zellen bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und das Wachstum 4 bis 5 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, in 3 ml Lysepuffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM NaCl) resuspendiert und mittels zwei Passagen durch eine French-Press-Zelle lysiert. Das Lysat wurde durch 40-minütige Zentrifugation bei 12 000 x g fraktioniert.
- Die Überstandfraktion wurde sodann durch Western-Blot gemäß dem Verfahren von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350-4354, daraufhin untersucht, ob das S1-verwandte Protein vorlag, außerdem wurde dieses mit einem monodonalen Antikörper gegen S1, B2F8, nachgewiesen [vgl. Marchitto, K. S., et al., Infect. Immun. 55 (1987), 1309], zur Verfügung gestellt von Dr. J. M. Keith, Laboratory of Pathobiology, NIAID, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana. Die Überstandfraktionen von Zellen, die mit M13mp18 infiziert waren, enthielten kein Protein, das spezifisch von dem monodonalen Antikörper B2F8 erkannt wurde. Dagegen enthielten die Überstandfraktionen von Zellen, die mit pRIT20001 infiziert waren, ein Protein mit etwa 22 000 Dalton, das im Western-Blot mit dem monodonalen Antikörper B2F8 reagierte. Dieses Protein verhielt sich im Western-Blot mit dem monoclonalen Antikörper B2F8 genauso wie das von pTXS11 codierte S1- Untereinheit-verwandte Protein rS1d [vgl. Locht, C., et al., Infect. Immun., (1987), a.a.O.].
- Die in Beispiel 2 beschriebene Überstandfraktion wurde auf das Vorliegen von spezifischen Enzymaktivitäten des S1-Untereinheit-verwandten Proteins untersucht. Die Höhe dieser Aktiviäten wurde mit den Aktivitäten von rS1d verglichen, das aus pTXS11 enthaltenden E. coli-Zellen partiell gereinigt worden war. In dem Nicotinamidadenindinucleotid (NAD)-Glykohydrolase-Test, der in Locht et al., Infect. Immun., (1987), a.a.O., beschrieben wird, wurde die Freisetzung von Nicotinamid aus NAD gemessen, die durch das partiell gereinigte rS1d katalysiert wird. 1 µg dieses partiell gereinigten rS1d katalysierte nach drei Stunden Umsetzung bei 30ºC unter den Testbedingungen, die in Locht et al., Infect. Immun., (1987), a.a.O., beschrieben werden, die Freisetzung von 1200 pMol Nicotinamid. Die Überstandfraktion von TG1-Zellen, die mit M13mp18 infiziert waren, enthielt keine signifikante NAD-Glykohydrolase-Aktivität, ferner unterschieden sich die gemessenen Werte von freigesetztem Nicotinamid nicht von den Hintergrund-Werten. Dagegen katalysierten 25 µl der Überstandfraktion von E. coli TG1-Zellen, die mit pRIT20001 infiziert waren, nach drei Stunden Inkubation unter den gleichen Bedingungen die Freisetzung von 300 pMol Nicotinamid aus NAD. Die wesentliche Reduktion der Enzymaktivität beim Überstand von mit pRIT20001 infizierten E. coli-Zellen beruht darauf, daß in den rohen E. coli-Zellextrakten ein Inhibitor vorliegt (C. Locht, unveröffentlichte Beobachtung).
- Außerdem wurde die Fähigkeit des partiell gereinigten rS1d und der Überstandfraktionen von mit pRIT20001 infizierten E. coli-Zellen und von mit M13mp18 infizierten TG1-Zellen untersucht, die S1-spezifische Adenosindiphosphat (ADP)-Ribosylierung des 41 000 Dalton-großen Signal-übertragenden GTP-bindenden Proteins Gi in CHO-Zellmembranen zu katalysieren. Dieser Test wird auch in Locht et al., Infect. Immun., (1987), a.a.O., beschrieben. Wenn das partiell gereinigte rS1d oder Pertussis-Toxin in Gegenwart von radioaktiv markiertem NAD und Membranen von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) unter den von Locht et al. beschriebenen Bedingungen inkubiert wurde und die Reaktionsprodukte durch Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) analysiert und autoradiographiert wurden, konnte eine spezifische Markierung des 41 000 Dalton großen Gi-Proteins nachgewiesen werden. Keine Markierung des Gi-Proteins trat auf, wenn rS1d oder Pertussis-Toxin durch den Lyse-Puffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM NaCl) oder durch die Überstandfraktion von mit M13mp18 infizierten E. coli-Zellen ersetzt wurde. Im Gegensatz dazu war die Überstandfraktion von mit pRIT20001 infizierten Zellen (enthaltend das Protein, das von einer eine verkürzte S1-Untereinheit codierenden Sequenz codiert wird) befähigt, den Einbau von radioaktiv markierter ADP-Ribose in das 41 000 Dalton große Gi- Protein zu katalysieren.
- Das enzymatisch aktive S1-verwandte Protein, das von pRIT20001 codiert und gemäß Beispiel 2 hergestellt wird, enthält nur einen einzigen Trp-Rest, der an Position 26 des reifen S1-Proteins, d.h. 15 Reste stromaufwärts des Cystein- Restes von Position 41, liegt.
- Das gemäß Beispiel 2 hergestellte S1-Untereinheit-verwandte Protein wurde partiell gereinigt und mit einem 1000-fachen molaren Überschuß von 2-Hydroxy-5-Nitrobenzylbromid (HNBB), gelöst in trockenem Aceton, inkubiert. HNBB modifiziert Trpytophan-Reste durch Derivatisierung. Die Umsetzung wurde in einem 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 4,0), der 2 M Harnstoff enthielt, zwei Stunden bei 2500 durchgeführt. Anschließend wurde die Lösung 15 Stunden bei 400 gegen 0,1 M Natriumphosphat (pH 4,0) dialysiert. Parallel dazu wurde das gemäß Beispiel 2 hergestellte S1-Untereinheit-verwandte Protein genauso behandelt, mit der Ausnahme, daß im Reaktionsgemisch kein HNBB vorlag.
- Das gemäß Beispiel 2 hergestellte S1-Untereinheit-verwandte Protein und außerdem das gereinigte, mit HNBB behandelte und das nicht mit HNBB behandelte S1-Untereinheit-verwandte Protein, hergestellt wie vorstehend beschrieben, nachstehend als "unbehandeltes S1-Untereinheit-verwandtes Protein", "mit HNBB behandeltes S1-Untereinheit-verwandtes Protein" bzw. "nicht mit HNBB behandeltes S1-Untereinheit-verwandtes Protein" bezeichnet, wurden sodann auf ihre Fähigkeit hin analysiert, die NAD-Glykohydrolyse und den ADP-Ribosyltransfer auf Gi in CHO-Zellmembranen unter Verwendung von Testbedingungen, wie in Locht et al., Infect. Immun., (1987), a.a.O., beschrieben, zu katalysieren. Unbehandeltes S1-Untereinheit-verwandtes Protein und nicht mit HNBB behandeltes S1-Untereinheit-verwandtes Protein zeigten eine NAD-Glykohydrolase-Aktivität in konzentrationsabhängiger Art und Weise. Eine nur unwesentliche NAD-Glykohydrolase-Aktivität konnte nachgewiesen werden, wenn das mit HNBB behandelte S1-Untereinheit-verwandte Protein getestet wurde, ferner war die Aktivität auf etwa 5 % reduziert, wenn eine niedrigere Konzentration, d.h. 1 µg, des mit HNBB behandelten S1-Untereinheit-verwandten Proteins getestet wurde. Beim Test von 0,5 und 1,0 µg unbehandeltem, mit HNBB behandeltem und nicht mit HNBB behandeltem S1-Untereinheitverwandtem Protein auf eine ADP-Ribosyltransferase-Aktivität gegenüber dem Gi-Protein in CHO-Zellmembranen zeigten nur das unbehandelte S1-Untereinheit-verwandte Protein und das nicht mit HNBB behandelte S1-Untereinheit-verwandte Protein bei beiden Konzentrationen eine Gi-spezfische ADP-Ribosylierungs- Aktivität. Keine Gi-ADP-Ribosyltransferase-Aktivität konnte bei beiden Konzentrationen des mit HNBB behandelten S1- Untereinheit-verwandten Proteins nachgewiesen werden.
- Einzelsträngige DNA von Phage pRIT20001, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde gereinigt und einer Oligonucleotid-gesteuerten positionsgerichteten Mutagenese unter Verwendung des "Oligonucleotide-directed in vitro Mutagenesis System", erhältlich von Amersham International PLC , Amersham, GB, Code RPN2322, unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen unterzogen. Das Oligonucleotid, das verwendet wurde, um spezifisch das den Tryptophanrest an der Aminosäureposition 26 codierende Codon TGG des rS1d-Gens in pRIT220001 zu deletieren, wies die Sequenz 5' CGTTGTTTCCCGCCGTGAAT 3' auf. Das Oligonucleotid, das verwendet wurde, um spezifisch das den Tryptophanrest an der Aminosäureposition 26 codierende Codon TGG des S1- Gens in pRIT20001 zu verändern, wies die Sequenz 5' CGTTGTTTCCGGTCGCCGTGAAT 3' auf.
- Die Mutanten-Kandidaten wurden durch differenzierende Hybridisierung mit den mutagenen Oligonudeotiden nach der Technik von Wallace, in Suggs, Developmental Biology Using Purified Genes, Hrsg. D. Brown, NY, Academic Press, durchgemustert. Anschließend wurden die Mutationen durch DNA-Sequenzierung nach der Technik von Sanger et al., (1977), a.a.O., verifiziert. Ein Kandidat, der mit pRIT20002 bezeichnet wurde und die Trp-26-Deletionsmutation enthielt, wurde doniert und weiter daraufhin untersucht, ob er die Fähigkeit aufwies, das Trp-26-modifizierte S1-Gen zu exprimieren, wie im nachstehenden Beispiel 6 beschrieben. Ein Kandidat, der mit pRIT20008 bezeichnet wurde und die Substitutionsmutation von Trp-26 zu Thr enthielt, wurde doniert und weiter daraufhin untersucht, ob er die Fähigkeit aufwies, das Trp-26-modifizierte S1-verwandte Gen zu exprimieren, wie im nachstehenden Beispiel 6 beschrieben.
- E. coli TG1-Zellen wurden mit pRIT20002 oder pRIT20008 infiziert, die beide wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt wurden, sodann wurde die Expression der Trp-26-modifizierten S1-Untereinheit-verwandten Gene, die die Deletion des Trp-26- Codons TGG oder seine Substitution durch Codon ACC für Threonin enthielten, durch IPTG induziert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Sodann wurden die Zellen geerntet und lysiert, die Zellysate durch Zentrifugation fraktioniert und die Überstandfraktionen durch Western-Blot und Umsetzung mit dem monoclonalen Antikörper gegen S1, B2F8, daraufhin untersucht, ob das mutierte rS1d vorlag, wobei alle vorstehenden Verfahren durchgeführt wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Die Ergebnisse wurden mit den in Beispiel 2 erhaltenen Ergebnissen verglichen. Die Überstandfraktionen von Zellen, die mit pRIT20001, pRIT20002 oder pRIT20008 infiziert waren, enthielten ein Protein, das bei Western-Blots mit dem monoclonalen Antikörper B2F8 reagierte, wohingegen Überstandfraktionen von Zellen, die mit M13mp18 infiziert waren, kein solches Protein enthielten. Außerdem zeigten die B2F8-reaktiven Proteine in den pRIT20001-, pRIT20002- und pRIT20008-Überständen das gleiche offensichtliche Molekulargewicht wie das partiell gereinigte rS1d, das in Beispiel 3 beschrieben wird. Bei der visuellen Begutachtung der Western-Blots wurde festgestellt, daß pRIT20001, pRIT20002 und pRIT20008 jeweils ungefähr die gleiche Menge der entsprechenden S1-Untereinheit-verwandten Proteine exprimierten.
- Die pRIT20001-, pRIT20002- und pRIT20008-Überstandfraktionen wurden in den in Beispiel 3 beschriebenen Testsystemen bezüglich Aktivitätshöhen von NAD-Glykohydrolase und ADP-Ribosyltransferase verglichen. Während 25 µl der pRIT20001-Überstandfraktion wieder in einer dreistündigen Umsetzung die Freisetzung von 300 pMol Nicotinamid katalysierten, zeigten die pRIT20002- und pRIT20008-Überstandfraktionen Aktivitätshöhen der NAD-Glykohydrolase, die den Überstandfraktionen von mit M13mp18 indizierten Zellen ähnlich waren, d.h im wesentlichen keine NAD-Glykohydrolase-Aktivität. Genauso war zwar die pRIT20001-Überstandfraktion zur Katalyse der ADP-Ribosylierung des Gi-Proteins befähigt, dagegen konnte mit der pRIT20002-Überstandfraktion oder mit der pRIT20008-Überstandfraktion keine solche Aktivität nachgewiesen werden. Somit wiesen die durch pRIT20002 und pRIT20008 codierten S1-Untereinheit-verwandten Proteine im wesentlichen inaktivierte Enzymaktivitäten des S1-Untereinheit-Proteins auf.
- Die pRIT20002- und pRIT20008-Überstandfraktionen, die wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellten wurden, wurden mittels Western-Blot daraufhin untersucht, ob sie die Fähigkeit aufwiesen, mit monodonalen und auch mit polydonalen Antiseren gegen Pertussis-Toxin zu reagieren. Es wurde gefunden, daß polydonale Antikörper gegen Pertussis-Toxin, die von E. Simoen, SmithKline-R.I.T., S. A., Rixensart, Belgien, (SK-RIT), erhalten wurden, und auch mehrere monodonale Antikörper gegen das Pertussis-Toxin, die von M. Francotte (SK-RIT) und J. G. Kenimer (Laboratory of Cellular Physiology, Food and Drug Administration, Bethesda, MD) erhalten wurden, spezifisch mit den von pRIT20002 und pRIT20008 stammenden S1-Untereinheitverwandten Proteinen in den rohen E. coli-Zellüberständen reagierten. Einige der reagierenden monodonalen Antikörper zeigten in Maus-Immunisierungs-Systemen gute Toxin-neutralisierende und schützende Aktivitäten. Dieses Ergebnis zeigt, daß in den von pRIT20002 und pRIT20008 stammenden Proteinen zumindest noch einige protektive Epitope erhalten geblieben sind und daß das Protein in einem Impfstoff gegen Keuchhusten nützlich ist.
- Ein DNA-Fragment mit 4,7 Kilobasenpaaren (kbp), das von T. Cabezon (SK-RIT) erhalten wurde und das das vollständige Pertussis-Toxin-Operon enthielt, wurde in pUC7 integriert, das vorher mit EcoRI gespalten worden war. Diese Integration wurde gemäß dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., durchgeführt. PUC7 wird von J. Vieira und J. Messing, Gene 19 (1982), 259- 268, beschrieben.
- Das resultierende rekombinante Plasmid wurde nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., in kompetente E. coli TG1-Zellen eingeführt. Die transformierten Zellen wurden nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., cloniert und die Clone durch Restriktionsspaltung ihrer Plasmide nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., analysiert. Ein Plasmid, das pRIT13070 genannt wurde und das gesamte Pertussis-Toxin- Operon enthielt, wurde gereinigt und anschließend mit AccI nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., gespalten. Die resultierenden zwei Fragmente wurden durch Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (PAGE) aufgetrennt und das größere Fragment gereinigt und im nächsten Ligierungsschritt verwendet.
- Die replikative Form von pRIT20002 wurde gereinigt und auch mit AccI gespalten. Die resultierenden Fragmente wurden durch PAGE aufgetrennt und das 300 bp-DNA-Fragment, das die Trp-26-Deletion enthielt, gereinigt. Das 300 bp-AccI-Fragment von pRIT20002 wurde sodann nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., in das große AccI-Fragment von pRIT13070 ligiert und das resultierende rekombinante Plasmid nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., in kompetente E. coli TG1-Zellen eingeführt. Nach der Clonierung wurde Plasmid pRIT13071, das das gesamte Pertussis-Toxin-Operon enthielt, nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., isoliert. pRIT13071 enthält die Deletion des Trp-26-Codons im S1-Cistron, ansonsten ist es mit pRIT13070 identisch.
- Das in pRIT13070 enthaltene Trp-26-modifizierte Pertussis-Toxin-Operon kann nun verwendet werden, um die Modifikation in das B. pertussis-Genom einzuführen, indem das vorliegende Wildtyp-Operon gegen das modifizierte Operon durch homologe Rekombination ausgetauscht wird. In einer anderen Ausführungsform kann das modifizierte Operon auch in ein Plasmid integriert werden, das anschließend in eine Bordetella-Zelle oder einen beliebigen anderen geeigneten Wirt transformiert wird, so daß die Expression des durch das Trp-26-modifizierte Operon codierten Proteins stattfindet.
- Solche modifizierten Bordetella-Stämme werden sodann als codierende Sequenz der vorliegenden Erfindung und/oder andere schützende Antigene, z.B. FHA und/oder Agglutinogene, verwendet. Diese Antigene werden sodann zusammen mit geeigneten Adujvantien, wie z.B. Aluminium-Adjuvantien, als Impfstoffe gegen Keuchhusten eingesetzt.
- 5 bis 25 µg des durch pRIT20002 oder pRIT20008 codierten Proteins (Beispiel 6) werden mit einem Aluminium-Adjuvans, z.B. Aluminiumhydroxid, gemischt, wodurch ein Impfstoff in einer Form hergestellt wird, die für die Beimischung zu einer Dosierungsform zur parenteralen Verabreichung geeignet ist.
- Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf die vorstehend in den Beispielen beschriebenen speziellen Ausführungsformen beschränkt. Alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollen somit im Umfang der folgenden Patentansprüche liegen.
- Plasmid pRIT3107, das gemäß dem Verfahren von Beispiel 8 hergestellt wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und das gesamte Pertussis-Toxin-Operon, enthaltend die Deletion des Trp-26-Codons im S1-Cistron, als ein DNA-Fragment mit 4,7 Kilobasenpaaren (kbp) nach dem Verfahren von Maniatis et al., a.a.O., isoliert. Dieses DNA-Fragment mit 4,7 kbp wurde sodann in die einzige EcoRI-Stelle des Plasmids mit niedriger Kopienzahl pLAFRII integriert, wodurch Plasmid pRIT13268 erhalten wurde. Plasmid pLAFRII ist äquivalent zu pLAFRI, beschrieben von Friedman et al., Gene 18 (1982), 289-296, und wurde von Dr. J. J. Mekalanos, Harvard Medical School, Cambridge, Massachusetts, USA, bereitgestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli-Stamm SM10 transformiert, der von Dr. S. Stibitz, US Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland, USA, bereitgestellt wurde. pLAFRII trägt ein Tetracyclin-Resistenzgen, aus diesem Grund wurden SM10-Transformanten auf LB-Medium (Maniatis et al., a.a.O.) selektiert, das 12,5 µg/ml Tetracyclin enthielt (Maniatis et al., a.a.O.). Die Tetracyclin-resistenten Transformanten wurden weiter durch DNA-Sequenzierung (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), a.a.O.) daraufhin untersucht, ob das mutierte Pertussis-Toxin-Gen vorlag. Die Tetracyclin-resistenten SM10-Clone, die das modifizierte Pertussis-Toxin-Gen enthielten, wurden sodann mit Bordetella pertussis-Stamm SK39 konjugiert. Stamm SK39 wird von Knapp und Mekalanos, J. Bacteriol. 170 (1988), 5059-5066, beschrieben und wurde von Dr. J. J. Mekalanos, vorstehend, bereitgestellt. Der SK39-Stamm enthält eine Tn5-Insertion im S1-Cistron des Pertussis-Toxin-Operons im Chromosom. Aufgrund dieser Unterbrechung des Toxin-Gens synthetisiert dieser Stamm kein Pertussis-Toxin. Tetracyclin-resistente B. pertussis SK39-Exkonjugate wurden auf BC-Agar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), angereichert mit 250 ml defibriniertem Schafsblut pro Liter (BG-Medium) und 20 µg/ml Tetracyclin, identifiziert. Die Tetracyclin-resistenten Clone wurden sodann in der modifizierten Stainer-Scholte-Brühe gezüchtet, die von Kloos et al., in C. R. Manclark und J. C. Hill (Hrsg.), International Symposium on Pertussis, US Department of Health, Education, and Welfare, Washington, DC, S. 70- 80, (1979), beschrieben wird. Nach der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Sowohl die Zellen als auch das Kulturmedium wurden sodann durch Western-Blot, wie von Locht et al., Infect. Immun., (1987), a.a.O., beschrieben, daraufhin untersucht, ob das Pertussis-Toxin entweder als eine Zell-assozuerte Form oder frei im Kulturmedium vorlag. Die Ergebnisse zeigen, daß der B. pertussis-Stamm SK39, der das rekombinante Plasmid enthält, Pertussis-Toxin synthetisiert und daß das Toxin in den Kulturüberstand freigesetzt wird, obwohl auch signifikante Mengen des Pertussis-Toxins in einer Zell-assoziierten Form gefunden werden können. Der B. pertussis-Stamm SK39 ohne das rekombinante Plasmid enthielt keine nachweisbaren Mengen des Pertussis-Toxins, weder im Kulturmedium noch in einer mit den Bakterienzellen assoziierten Form. Außerdem sollte beachtet werden, daß der das rekombinante Plasmid enthaltende B. pertussis-Stamm SK39 in einem Ganzzellen-Impfstoff nützlich ist. Ein solcher Impfstoff wird gemäß herkömmlichen Techniken hergestellt.
- Unter Verwendung der Verfahren der Beispiele 8 und 10, jedoch unter Verwendung von pRIT20008 anstelle von pRIT20002, wurde Plasmid pRIT13269 erzeugt. pRIT13269 enthält die vollständige codierende Sequenz des Pertussis-Toxins, wobei jedoch Threonin (Thr) anstelle der Tryptophan-Mutation an Aminosäureposition 26 in der S1-codierenden Sequenz steht.
- Gereinigtes Pertussis-Toxin, bezogen von List Biologicals, Campbell, California, USA, und Kulturüberstände des Toxin-synthetisierenden B. pertussis-Stammes Tohama I induzieren in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) morphologische Veränderungen, wie von Hewlett et al., Infect. Immun. 40 (1983), 1198-1203, beschrieben. Andererseits induzierte der Kulturüberstand des B. pertussis-Stammes SK39, der das rekombinante Plasmid mit dem modifizierten Pertussis-Toxin-Gen enthielt, keine nachweisbaren morphologischen Veränderungen in den CHO-Zellen, wodurch gezeigt wird, daß die Deletion des Trp-26-Codons im S1-Untereinheit-Cistron des Pertussis-Toxin-Gens die biologische Aktivität des Pertussis-Toxins drastisch reduziert. Wenn man die Aktivität des mutierten Toxins eher quantitativ verglich, zeigte sich, daß die Mutante in diesem CHO-Zelltest mindestens 500-mal weniger toxisch ist.
- Um eine vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz zu exprimieren, die eine Modifikation des Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26 enthält, wird vorzugsweise ein B. pertussis-Empfängerstamm verwendet, bei dem das chromosomale Toxin-Gen deletiert ist, anstatt daß es durch Punkt- oder Insertionsmutation inaktiviert ist. Die Inaktivierung des Gens durch Punkt- oder Insertionsmutation führt nicht zur Entfernung der DNA-Sequenzen, die das Potential besitzen, in vivo mit der das mutierte Pertussis-Toxin codierenden DNA auf einem sich autonom replizierenden Plasmid zu rekombinieren. Dagegen kann eine solche Rekombination bei einer Deletionsmutante des Pertussis-Toxin-Gens nicht stattfinden. Aus diesem Grund wurden die das Pertussis-Toxin codierenden Sequenzen von B. pertussis-Stamm Tohama I folgendermaßen deletiert. Zuerst wurde der B. pertussis-Stamm Tohama I auf BG-Medium (vorstehend) plattiert, das 400 µg/ml Streptomycin enthielt. Streptomycinresistente Stämme wurden sodann auf BG-Medium (vorstehend) plattiert, das 50 µg/ml Nalidixinsäure enthielt. Die Streptomycin- und Nalidixinsäure-resistenten Stämme von B. pertussis Tohama I wurden für die Konjugationsexperimente verwendet.
- Plasmid pTOX9, beschrieben von Black und Falkow, Infect. Immun. 55 (1987), 2465-2470, und bereitgestellt von Dr. W. J. Black, Stanford University Medical School, Stanford, California, USA, enthält das Pertussis-Toxin-Gen auf einem etwa 10 kbp-großen B. pertussis-DNA-Fragment. pTOX9 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BGlII und anschließend mit der Exonuclease Bal31 gespalten. Nach der Ligierung wurde das deletierte Pertussis-Toxin-Gen auf einem etwa 7 kbp großen ClaI/ClaI-DNA-Fragment aus dem mit Bal31 behandelten pTOX9 isoliert. Alle für die Behandlung von pTOX9 verwendeten Verfahren werden von Maniatis et al., (1982), a.a.O., beschrieben. Das DNA-Fragment mit 7 kbp wurde sodann in die einzige HindIII-Stele von Plasmid pSORTP1 integriert, das von pRTP1, enthaltend ein Gentamycin-Resistenz-Gen, abstammt, von Stibitz et al., Gene 50 (1986), 133-140, beschrieben und von Dr. S. Stibitz, vorstehend, bereitgestellt wurde. Das rekombinante Plasmid wurde in den E. coli-Stamm SM10 (vorstehend) transformiert und durch DNA-Sequenzierung analysiert, um die Deletionsmutante zu identifizieren. E. coli SM10, der das rekombinante Plasmid mit der gewünschten Deletion enthielt, wurde sodann mit dem Streptomycin- und Nalidixinsäure-resistenten Stamm von B. pertussis Tohama 1 konjugiert. Die Exkonjugate, die das rekombinante Plasmid integriert im Genom enthielten, wurden durch ihre Resistenz gegenüber Gentamycin und ihre Sensitivität gegenüber Streptomycin auf BG-Agarplatten (vorstehend) identifiziert. Plasmid PSORTPL enthält das Gen für Resistenz gegenüber Gentamycin und das Gen für die dominante Sensitivität gegenüber Streptomycin, außerdem kann es sich in B. pertussis nicht autonom replizieren. Aus diesem Grund können Gentamycin-resistente, Streptomycin-sensitive B. pertussis-Stämme nur erzeugt werden, wenn das rekombinante Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert wird. Eine solche homologe Rekombination umfaßt möglicherweise die das Toxin-Gen flankierenden Regionen im Chromosom und rekombinanten Plasmid. Die Gentamycin-resistenten Clone wurden sodann auf BG-Platten, enthaltend 400 µg/ml Streptomycin (vorstehend), plattiert, um Streptomycin-resistente B. pertussis-Revertanten zu selektieren. Einige dieser Revertanten traten auf, sie kamen aufgrund einer zweiten homologen Rekombination zwischen dem Chromosom und dem integrierten Plasmid zustande. Die resultierenden Streptomycin-resistenten Stämme wurden daraufhin untersucht, ob sie die Gentamycin-Resistenz verloren hatten. Diese Clone wurden sodann durch Southern-Blot-Hybridisierung, wie von Maniatis et al., (1982), a.a.O., beschrieben, daraufhin untersucht, ob das Pertussis-Toxin-Gen im Chromosom verloren gegangen war. Der resultierende B. pertussis-Stamm (nachstehend als "BPRA" bezeichnet) wird sodann für die Einführung von Plasmiden verwendet, die die mutierten Pertussis Toxin-Gene enthalten, wie z.B. die von pLAFRII stammenden Plasmide, die in Beispiel 10 beschrieben werden, z.B. pRIT13268. Nachdem diese Plasmide eingeführt wurden, wird der resultierende B. pertussis-Stamm BPRA(pRIT13268) zur Produktion des mutierten Pertussis-Toxins verwendet. In einer anderen Ausführungsform ist der resultierende B. pertussis-Stamm nach Einführung der Plasmide in einem Ganzzellen-Impfstoff nützlich. Ein solcher Ganzzellen-Impfstoff wird gemäß herkömmlichen Techniken hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind.
- BPRA, der Bordetella pertussis-Stamm, in dem das Strukturgen des Pertussis-Toxins deletiert war, und der wie in Beispiel 12 beschrieben hergestellt wurde, wurde als Empfängerstamm für die von pLAFRII abstammenden Plasmide verwendet. Plasmid pLAFRII wird in Beispiel 10 beschrieben. Die von pLAFRII abstammenden Plasmide enthielten das Pertussis-Toxin- Gen mit entweder einer Einzel- oder einer Doppelmutation. Die Einzelmutanten enthielten entweder eine Deletion oder eine Substitution von Trp-26. Die genetischen Manipulationen wurden durchgeführt, wobei die klassischen Subclonierungs-Techniken verwendet wurden, wie von Maniatis et al., (1982), a.a.O., beschrieben. Die positionsgerichtete Mutagenese wurde durchgeführt, indem das "Oligonucleotide-directed in vitro Mutagenesis System", bezogen von Amersham International Plc., Amersham, GB, Code RPN2322, verwendet wurde, wie für die Trp-26-Mutation in Beispiel 5 beschrieben. Nach der Mutagenese wurden alle Mutanten vollständig sequenziert, wobei die von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1977), a.a.O., beschriebene Technik der DNA-Sequenzierung verwendet wurde. Die von pLAFRII abstammenden Plasmide, die das Pertussis-Toxin-Gen mit den verschiedenen Mutationen enthielten, wurden in den E. coli- Stamm SM10 transformiert und anschließend mit dem B. pertussis-Empfängerstamm konjugiert, wie im Verfahren von Beispiel 10 beschrieben, mit der Ausnahme, daß der B. pertussis- Empfängerstamm in diesem Fall BPRA ist, der Stamm, bei dem das chromosomale Strukturgen des Pertussis-Toxins deletiert worden war, wie in Beispiel 12 beschrieben. Die B. pertussis-Exkonjuganten wurden durch Western-Blot analysiert, ob das Pertussis- Toxin vorlag, wie in Beispiel 10 beschrieben.
- Die Mutanten-Toxine wurden sodann mit gereinigtem Pertussis-Toxin (bezogen von List Biological Laboratories, Campbell, California), mit dem Wildtyp-Pertussis-Toxin in der Überstandfraktion von B. pertussis Tohama I (vorstehend) und mit der Überstandfraktion des B. pertussis-Stammes, bei dem das chromosomale Toxin-Gen deletiert war, verglichen. Der Vergleich beruhte auf den biologischen Aktivitäten bei CHO-Zellen, wie in Beispiel 11 beschrieben. Es wurde beobachtet, daß 3 ng gereinigtes Pertussis-Toxin eine signifikante cytotoxische Verklumpung ("clustering") der CHO-Zellen bewirkten. Diese morphologischen Veränderungen wurden auch beobachtet, wenn der Kulturüberstand von B. pertussis Tohama I getestet wurde. Im Gegensatz dazu induzierten alle Mutanten-Toxine in Form von Kulturüberständen bei den CHO-Zellen lediglich eine Hintergrund-Toxizität. Beim quantitativen Test wurde abgeschätzt, daß alle Mutanten-Toxine mindestens 500-mal weniger toxisch waren als das Wildtyp-Pertussis-Toxin.
- Die vorstehende Beschreibung offenbart die Erfindung vollständig, wobei bevorzugte Ausführungsformen enthalten sind. Modifikationen und Verbesserungen der Ausführungsformen, die spezifisch hier beschrieben werden, liegen im Umfang der folgenden Patentansprüche.
Claims (24)
1. Bordetella pertussis-Toxin codierende Sequenz,
enthaltend eine vollständige oder verkürzte, die
Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins
codierende Sequenz, mit der Maßgabe, daß (a) die die S1-
Untereinheit codierende Sequenz eine Modifikation des
Tryptophanrestes an der Aminosäureposition 26
(nachstehend "Trp-26") enthält, und (b) die Trp-26-Modifikation
eine im wesentlichen inaktivierte S1-Enzymaktivität bei
dem Protein zur Folge hat, das von der das B. pertussis-
Toxin codierenden Sequenz codiert wird, wobei aber das
Protein die Fähigkeit behalten hat, von Antikörpern
gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden.
2. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1,
wobei die codierende Sequenz die vollständige, die
Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxin-Operons
codierende Sequenz umfaßt.
3. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1,
wobei die codierende Sequenz ein verkürztes Bordetella
pertussis-Toxin-Operon umfaßt.
4. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1,
wobei die codierende Sequenz nur die die
Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit codierende Sequenz umfaßt.
5. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1,
wobei die codierende Sequenz nur die die
Aminosäuresequenz des verkürzten Anteils der S1-Untereinheit
codierende Sequenz umfaßt.
6. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 5,
wobei die codierende Sequenz nur die die
Aminosäuresequenz
der Aminosäuren 2 bis 187 der S1-Untereinheit
codierende Sequenz umfaßt.
7. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1,
wobei die Sequenz zusätzlich mindestens eine weitere
codierende Sequenz umfaßt.
8. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 7
mit der folgenden codierenden Sequenz:
9. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1,
wobei die codierende Sequenz zusätzlich eine
Modifikation eines weiteren Aminosäurerestes in der die S1-
Untereinheit codierenden Sequenz umfaßt, mit der
Maßgabe, daß das Protein, das von der das B. pertussis-
Toxin codierenden Sequenz codiert wird, die Fähigkeit
zurückbehält, von Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin
erkannt zu werden, daß die zusätzliche Modifikation eine
Deletion oder Substitution des Glutaminsäurerestes an
der Position 129 nicht einschließt, und daß im Falle der
Substitution des Tryptophanrestes an der Position 26 der
die S1-Untereinheit codierenden Sequenz durch Isoleucin,
die zusätzliche Modifikation keine Substitution des
Asparaginsäurerestes an der Aminosäureposition 11 durch
Serin einschließt, keine Substitution des Argininrestes
an der Aminosäureposition 9 durch Lysin oder Glycin,
keine Substitution des Phenylalaninrestes an der
Position 50 durch Glutaminsäure, keine Substitution des
Argininrestes an der Position 13 durch Leucin, keine
Substitution des Asparaginsäurerestes an der Position 1
durch Glutaminsäure, keine Substitution des
Glutaminsäurerestes an der Position 39 durch Glycin, keine
Substitution des Tyrosinrestes an der Position 130 durch
Glycm, keine Substitution des Glycinrestes an der Position
86 durch Glutaminsäure, keine Substitution des
Isoleucinrestes an der Position 88 durch Glutaminsäure, keine
Substitution des Tyrosinrestes an der Position 89 durch
Serin, keine Subtitution des Tyrosinrestes an der
Position 8 durch Asparaginsäure oder keine Substitution des
Threoninrestes an der Position 53 durch Isoleucin.
10. B. pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 9,
wobei die zusätzliche Modifikation am Histidinrest an
der Aminosäureposition 35 der die S1-Untereinheit
codierenden Sequenz (His-35) stattfindet; am Argininrest an
der Aminosäureposition 9 der die S1-Untereinheit
codierenden Sequenz (Arg-9) oder am Serinrest an der
Aminosäureposition 40 der die S1-Untereinheit codierenden
Sequenz (Ser-40).
11. Rekombinantes DNA-Molekül, das die das Bordetella
pertussis-Toxin codierende Sequenz nach Anspruch 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 umfaßt.
12. Rekombinantes DNA-Plasmid, das das rekombinante
DNA-Molekül nach Anspruch 11 in funktioneller Verbindung mit
geeigneten Expressions-Kontrollsequenzen umfaßt.
13. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 12, bei dem die
Modifikation des Tryptophanrestes an Position 26 der die
S1-Untereinheit codierenden Sequenz eine
Deletionsmutation ist.
14. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 12, bei dem die
Modifikation des Tryptophanrestes an der Position 26 der
die S1-Untereinheit codierenden Sequenz eine
Substitutionsmutation ist.
15. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 14, bei dem der
Tryptophanrest an der Position 26 durch Threonin
substituiert ist.
16. Wirtszelle, die mit dem Plasmid nach Anspruch 12
transformiert ist.
17. Wirtszelle nach Anspruch 16, die ein Bordetella
pertussis-Stamm ist, bei dem das Pertussis-Toxin-Operon
deletiert ist.
18. Protein, das von der codierenden Sequenz nach Anspruch
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 codiert wird.
19. Impfstoff zur Stimulierung von Schutz gegen Keuchhusten,
der eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des
Proteins umfaßt, das von dem rekombinanten DNA-Molekül
nach Anspruch 1 codiert wird.
20. Verfahren zur Herstellung einer transformierten
Wirtszelle, das die Transformation einer gewünschten
Wirtszelle mit dem rekombinanten, die codierende Sequenz nach
Anspruch 1 enthaltenden DNA-Plasmid umfaßt.
21. Verfahren zur Produktion des Proteins, das von einer die
Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins
codierenden Sequenz codiert wird, die eine vollständige oder
verkürzte, die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des
B. pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit der
Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende
Sequenz eine Modifikation des Tryptophanrestes an der
Aminosäureposition 26 (nachstehend "Trp-26") enthält, und
(b)
die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen
inaktivierte S1-Enzymaktivität bei dem Protein zur Folge hat,
das von der die Aminosäuresequenz des B. pertussis-
Toxin-Operons codierenden Sequenz codiert wird, wobei
aber das Protein die Fähigkeit behalten hat, von
Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden,
wobei ein solches Verfahren die Züchtung einer mit einem
rekombinanten DNA-Plasmid, das die codierende Sequenz
der rekombinanten DNA nach Anspruch 1 umfaßt,
transformierten Wirtszelle in geeignetem Kulturmedium, und die
Isolierung des so produzierten Proteins umfaßt.
22. Verfahren zur Produktion des Proteins, das von einer die
Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins
codierenden Sequenz codiert wird, enthaltend eine
vollständige oder verkürzte, die Aminosäuresequenz der
S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins codierende Sequenz, mit
der Maßgabe, daß (a) die die S1-Untereinheit codierende
Sequenz eine Modifikation des Tryptophanrestes an der
Aminosäureposition 26 (nachstehend "Trp-26") enthält,
und (b) die Trp-26-Modifikation eine im wesentlichen
inaktivierte S1-Enzymaktivität bei dem Protein zur Folge
hat, das von der die Aminosäuresequenz des B. pertussis-
Toxin-Operons codierenden Sequenz codiert wird, wobei
aber das Protein die Fähigkeit behalten hat, von
Antikörpern gegen das Pertussis-Toxin erkannt zu werden,
wobei ein solches Verfahren die folgenden Schritte umfaßt
(i) Behandlung einer die Aminosäuresequenz des
Bordetella pertussis-Toxins codierenden Sequenz, die
durch Isolierung aus nativer B. pertussis-DNA oder durch
synthetische oder rekombinante DNA-Techniken hergestellt
wurde und eine vollständige oder verkürzte, die
Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B. pertussis-Toxins
codierende Sequenz enthält, mit der Maßgabe, daß die die
S1-Untereinheit codierende Sequenz nicht bereits eine
Modifikation des Tryptophanrestes an der
Aminosäureposition 26 enthält, durch ortsgerichtete Mutagenese mit
einem Tryptophan-modifizierenden chemischen Reagens oder
durch Photooxidation zur Erzeugung einer Modifikation
oder Deletion des Tryptophanrestes an der
Aminosäureposition 26, Transformation einer gewünschten Wirtszelle
mit einem Plasmid, das die erhaltene codierende Sequenz
enthält, Züchtung des Wirts in einem geeigneten
Kulturmedium und Isolierung des so produzierten Proteins, (ii)
Substitution oder Deletion des Tryptophanrestes an der
Position 26 der S1-Untereinheit einer die
Aminosäuresequenz des Bordetella pertussis-Toxins codierenden
Sequenz, die durch Isolierung aus nativer B. pertussis-DNA
oder durch synthetische oder rekombinante DNA-Techniken
hergestellt wurde und eine vollständige oder verkürzte,
die Aminosäuresequenz der S1-Untereinheit des B.
pertussis-Toxins codierende Sequenz enthält, mit einer
anderen Aminosäure, Transformation einer gewünschten
Wirtszelle mit einem Plasmid, das die erhaltene
codierende Sequenz enthält, Züchtung des Wirts in einem
geeigneten Kulturmedium und Isolierung des so produzierten
Proteins, oder (iii) Herstellung einer solchen
codierenden Sequenz durch synthetische Verfahren, Transformation
einer gewünschten Wirtszelle mit einem die resultierende
codierende Sequenz enthaltenden Plasmid, Züchtung des
Wirts in einem geeigneten Kulturmedium und Isolierung
des so produzierten Proteins.
23. B. pertussis-Stamm, der ein inaktiviertes chromosomales
Pertussis-Toxin-Gen enthält, das zusätzlich die
codierende Sequenz nach Anspruch 1 umfaßt.
24. Impfstoff zur Stimulierung von Schutz gegen Keuchhusten,
der eine immunprotektive und nicht-toxische Menge des
Stamms nach Anspruch 23 umfaßt.
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