DE3855072T2

DE3855072T2 - Gentechnische Detoxifikation des Pertussistoxins

Info

Publication number: DE3855072T2
Application number: DE3855072T
Authority: DE
Inventors: Heather Anne Boux; Stephen Anthony Cockle; Michel Henri Klein; Sheena May Loosmore; Gavin Ross Zealey
Original assignee: Connaught Laboratories Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-24
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2008-11-25
Also published as: EP0688868A1; EP0322115A2; DE3855072T3; ATE135043T1; JPH022383A; EP0322115B1; US5085862A; JP2714068B2; CA1341591C; ES2088778T3; ES2088778T5; GB8727489D0; DE3855072D1; GR3019238T3; EP0322115B2; EP0322115A3

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Entgiftung von Pertussistoxin vermittels der genetischen Veränderung von DNS-Segmenten, welche für einen oder mehrere Aminosäurereste, die für die biologische Wirksamkeit des Toxins von wesentlicher Bedeutung sind, codieren. Sie betrifft auch noch ein Verfahren zur Erzeugung von genetisch abgewandelten Bakterien der Art Bordetella pertussis, welche dieses entgiftete Pertussistoxin produzieren. Sie erstreckt sich auch auf entgiftete Holotoxine, daraus hergestellte Impfstoffe und mutierten TOX-Operons zur Herstellung derartiger Holotoxine.
Der Keuchhusten oder Pertussis stellt eine ernsthafte, höchst ansteckende Erkrankung der Atemwege bei Kindern und jungen Erwachsenen dar, der durch die Infektion mit Bordetella pertussis hervorgerufen wird. Aufgrund der mannigfachen Virulenzfaktoren, die bei diesem Organismus eine Rolle spielen, wird die Pathogenese der Erkrankung immer noch nicht völlig verstanden; dabei wird jedoch ganz allgemein davon ausgegangen, daß die maßgeblichen systemischen Effekte durch das Pertussistoxin (PT) verursacht werden. Dieses Material entfaltet ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten, welche durch Alternativbezeichnungen, wie z. B. lymphozytoseverstärkender Faktor, histaminsensibilisierender Faktor und inselzellaktivierendes Protein, beleuchtet werden. Zahlreiche dieser Effektoren sind mit dessen biochemischer Funktion als Adenosindiphosphat-Ribosyltransferase (ADP-Ribosyltransferase) verknüpft. Die ADP-Ribosylierung bestimmter, an den Guanosintriphosphatakzeptor anbindender Proteine führt zu einem Verlust der Steuerungsmöglichkeit einer Vielzahl von Stoffwechselpfaden, die von dem cyclischen Adinosinmonophosphat und der Phospholipase C eingeschlagen werden. In Abwesenheit eines Proteinakzeptors katalysiert das PT auch die Hydrolyse des Nikotinamidadenindinucleotids (Aktivität der NAD-Glykohydrolase).
Konventionelle Ganzzell-Keuchhustenimpfstoffe enthalten eine Antigenmischung, wobei große Anstrengungen unternommen werden, einen zellfreien Impfstoff mit spezifischen Schutzantigenen zu entwickeln. Das PT stellt das signifikanteste Schutzantigen dar. Andere in Erwägung gezogene Antigene stellen die Agglutinogene und das fadenförmige Hämagglutinin (FHA) dar.
Normalerweise werden das PT und andere Antigene chemisch inaktiviert bzw. toxoid gemacht, indem Reagenzien, wie z. B. Formaldehyd, Glutaraldehyd oder Wasserstoffperoxid, verwendet werden. Diese Betrachtungsweise hat den ernstzunehmenden Nachteil zur Folge, daß eine heikle Balance zwischen zu starker und zu geringer chemischer Modifizierung gesucht werden muß. Falls die Behandlung unzureichend ist, kann die Vakzine eine Resttoxizität aufgrund der Anwesenheit eines kleinen Anteils an unveränderten Virulenzfaktoren einschließlich des PT beibehalten. Im Falle einer zu intensiven Behandlung kann die Vakzine ihre Potenz aufgrund von deren nativen, immunogenen Determinanten, die maskiert oder zerstört werden, verlieren. Im Falle von PT ist dieses Problem ganz besonders ernstzunehmen, da die katalytische Untereinheit vergleichsweise schwer durch die Aldehyde zu inaktivieren ist. Die mögliche Resttoxizität oder Umkehr der toxoid gemachten Ganzzell-Pertussisimpfstoffe wird schon seit vielen Jahren infragegestellt, so daß in Einzelfällen die Möglichkeit größerer neurologischer Schäden zu vermuten sind, die durch den Impfstoff verursacht werden können. Alle zum gegenwärtigen Zeitpunkt in Verwendung oder im Versuchsstadium befindlichen Impfstoffe beruhen auf der Inaktivierung der Antigene durch chemische Maßnahmen, was zu den zuvor erwähnten Problemen führt. Es ist daher offenkundig, daß im Falle der Möglichkeit zum Entwickeln eines inaktivierten Impfstoffs, ohne daß auf das toxoidmachenden Verfahren zurückgegriffen wird, wobei jedoch die ursprüngliche Struktur der immunogenen und schützenden Epitope aufrechterhalten werden soll, ein zusätzliches Maß an Sicherheit und Effizienz erzielt werden könnte. Aus diesem Grund haben die Erfinder das Gen, das für das PT (TOX) codiert, genetisch abgewandelt und Stämme von B. pertussis konstruiert, welche nichttoxische Analoga vom PT ausscheiden.
Bezüglich seines strukturellen Aufbaus gehört das PT zur Familie der bakteriellen ADP-Ribosyltransferasetoxine, welche auch das Diphtherietoxin, das Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa, das Choleratoxin sowie das wärmeempfindliche Toxin aus Escherichia coli mitumfassen. Dieses besteht infolgedessen aus zwei funktionellen Anteilen: einem Teil A, welcher für die enzymatische Aktivität verantwortlich ist, sowie einem Teil B, der an die Wirtszelle anbindet und die Translokation des Teiles A an den Wirkort ermöglicht. In dem PT stellt der Teil A eine diskrete Subeinheit dar, herkömmlicherweise als S1 bezeichnet. Der Teil B stellt ein nichtkovalentes Oligomer aus fünf Polypeptiden dar, die in Form von zwei Dimeren angeordnet sind, wobei die Untereinheiten S2 plus S4 bzw. die Untereinheiten S3 plus S4 mitumfaßt sind, und welche durch eine verknüpfende Untereinheit S5 zusammengehalten werden.
Die Aminosäuresequenz der Untereinheit S1 weist verschiedene interessante Merkmale auf. So gibt es lediglich zwei Cysteinreste, welche eine Disulfidbindung als Kettenüberbrückung bilden, wobei man darüber hinaus noch weiß, daß für die Enzymaktivität des Toxins eine Reduktion stattfinden muß (Moss et al., J.Biol. Chem., 258, Seite 11872, [1983]), was auf die Bedeutung dieser Reste hinweist. In S1 gibt es zwei Tryptophanreste, wobei die Vermutung nahegelegt wird, daß sich die Tryptophanreste in der Nähe an den NAD-Bindungsstellen des Diphtheritoxins und Exotoxins A von P. aeruginosa befinden. Beide in S1 bewahrten Regionen finden sich auch in den Aminosäuresequenzen des choleratoxins und in dem wärmeempfindlichen Toxin aus E. coli (Locht & Keith, Science, 232, Seite 1258, [1986]). Darüber hinaus hat sich herausgestellt, daß die NAD-aktiven Stellen des Diphtherietoxins und des Exotoxins A von P. aeruginosa einen Glutaminsäurerest enthalten (Carrol & Collier, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81, Seite 3307, [1984], sowie Carrol & Collier, J.Biol.Chem., 262, Seite 8707, [1987]).
Wie bereits oben darauf hingewiesen wurde, ist der Teil B des PT für dessen Bindung an die Zellrezeptoren verantwortlich und weist einen Gehalt an zwei Dimeren auf. Es bleibt umstritten, ob jedes Dimer einen Bindungsort aufweist. Die Untereinheiten S2 und S3 sind hinsichtlich der Aminosäuresequenz ähnlich, wobei Studien der Bindungsverhältnisse ergeben haben, daß die Lysin- und/oder Tyrosinreste von S3 insbesondere in der Interaktion des Toxins mit seinem Rezeptor eine Rolle spielen (Nogimori et al., Biochem., 25, Seite 1355, [1986] sowie Armstrong & Peppler, Infect.Immun., S5, Seite 1294, [1987]).
Die ortsspezifische Mutagenese des Diphtherietoxins und des Exotoxins A von P. aeruginosa an den mit NAD in Aktion tretenden Glutaminsäureresten führte zu einer signifikanten Verminderung der ADP-Ribosyltransferasewirksamkeit (Tweten et al., J.Biol.Chem., 260, Seite 10392, [1984]; Douglas & Collier, J.Bacteriol., 169, Seite 4967, [1987]). Vollständige, (stumpf) abgetrennte Formen von S1 und S2 wurden in E. coli (Locht et al., Infect.Immun., 55, Seite 2546, [1987]) exprimiert. Es wurden Mutationen des TOX-Operons, hervorgerufen durch die Transposoneinfügung (insertion), Genabtrennung oder Einfügung von Linkern (insertion) durch allelen Austausch in das Chromosom von B. pertussis (Black et al., Ann.Sclavo, 175, [1986] sowie Black & Falkow, Infect.Immun., 55, Seite 2465, [1987]) eingeführt. Über biologische und immunprotektive Eigenschaften vollständig zusammengestellter Rekombinantholotoxine, welche durch die ortsspezifische Mutagenese der funktionellen Aminosäurereste entgiftet worden sind, wurde bisher nicht berichtet. Die erfindungsgemäße Aufgabe besteht nun darin, derartige PT-Analoga zur Aufnahme in einem sicheren und wirksamen Keuchhustenimpfstoff zu erzeugen.
Zur Austestung der Wirksamkeit und Toxizität der Substanzen, welche als Anwärter für einen Schutzimpfstoff infragekommen könnten, gibt es eine Reihe von in vivo- und in vitro-Testverfahren. Der Standardtest für die Wirksamkeit besteht in dem Mäuseschutztest, welcher die intracerebrale Provozierung mit lebenden B. pertussis-Keimen mitumfaßt. Neuere Impfstofftestungen beruhen auf der Messung der Produktion von neutralisierenden Antikörpern. Einen herkömmlichen Toxizitätstest stellt der CHO-Zell-Verklumpungs-(Cluster)-Test (Chinahamster-Ovar) dar, der sowohl die ADP-Ribosyltransferase als auch die Bindungsfähigkeit des Toxins demonstriert (Burns et al., Infect. Immun., 55, Seite 24, [1987]). Einen direkten Test der enzymatischen Aktivität des PT stellt die Ribosylierung von ADP des Rindertransducins dar (Walkins et al., J.Biol.Chem., 260, Seite 13478 [1985]).
Erfindungsgemäß wird ein neues Verfahren zur Entgiftung von PT geschaffen, das die Nachteile der chemischen Verfahren des Standes der Technik nicht aufweist und somit auf diese Weise ein entgiftetes PT zur Verfügung gestellt wird, das seine immunologischen Eigenschaften, ohne die Eigenschaft unerwünschter Nebenwirkungen beibehält. Gemäß einer ersten erfindungsgemäßen Ausgestaltung werden Aminosäurereste des Toxins von grundsätzlicher Bedeutung im Hinblick auf ihre funktionellen und toxischen Aktivitäten identifiziert. Einer oder mehrere dieser Reste werden nacheinander entfernt oder durch die ortsspezifische Mutagenese des isolierten Toxingens ersetzt. Das mutierte, aus diesen Behandlungsschritten entstandene Toxinoperon wird im Anschluß daran an die Stelle des nativen Gens im Organismus gesetzt, welches auf diese Weise das nichttoxische Analogon des Toxins unter normalen Wachstumsbedingungen hervorbringt. Auf diese Art und Weise läßt sich aufgrund der dreidimensionalen Struktur und infolge der Immunogenizität der Analogform des PT- Toxins selbst ein befriedigender Schutz gegen die ernstzunehmenden Symptome des Keuchhustens zur Verfügung stellen, obschon andere Bestandteile zur Gewährleistung der Resistenz gegenüber der bakteriellen Infektion selbst erforderlich sein können.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird deshalb ein Pertussisholotoxin zur Verfügung gestellt, das durch ein Gen codiert wurde, welches durch die ortsspezifische Mutagenese wenigstens eines Codons, das mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich mindestens eines Restes aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens einer funktionellen Aminosäure und die genetische Entgiftung des Holotoxins bis auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften zu bewirken.
Unter dem vorliegend verwendeten Ausdruck "genetisch entgiftet" wird ein Pertussistoxinmutant verstanden, der eine Resttoxizität von etwa 1% oder weniger, vorzugsweise weniger als etwa 0,5% im Vergleich zu jenem des nativen Toxins aufweist. Die Resttoxizität wird durch den CHO-Zellverklumpungstest und die Aktivität der ADP-Ribosyltransferase bestimmt.
Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines immunprotektiven genetisch entgifteten Mutanten des Pertussisholotoxins geschaffen, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: (a) Identifizieren mindestens eines Restes einer funktionellen Aminosäure des Toxins, das für sich alleine oder zusammengenommen (mit den übrigen Resten) dem Holotoxin die Toxizität verleiht; (b) Bewerkstelligen der ortsspezifischen (site-directed) Mutagenese zum Entfernen oder Austausch einer Nukleotidsequenz, die für mindestens diesen einen Aminosäurerest einschließlich mindestens einen solchen aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; codiert sowie zur Produktion eines mutierten TOX-Operons; (c) Einbau des mutierten TOX-Operons in einen Bordetella-Organismus zur Produktion eines transformierten Organismus; sowie (d) Kultivieren des transformierten Organismus zur Produktion von genetisch entgiftetem Holotoxin mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften in Abwesenheit von Toxin des Wildtypus.
Es wird auch ein TOX-Operon geschaffen, das für ein Mutantenpertussisholotoxin codiert, wobei dieses TOX-Operon durch die ortsspezifische (site-directed) Mutagenese mindestens eines Codons mutiert wurde, das für mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich wenigstens einer solchen aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens einer funktionellen Aminosäure und die genetische Entgiftung des Holotoxins bis auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften zu bewirken.
Es wird ferner ein Bordetella-Stamm geschaffen, der dadurch charakterisiert ist, daß er ein mutiertes TOX-Operon aufweist, welches durch die ortsspezifische (sitedirected) Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens einer Nukleotidsequenz gebildet wurde, die für mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich mindestens einer solchen aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU129 innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens der einen funktionellen Aminosäure zu erzielen, sowie dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Fähigkeit der Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Pertussisholotoxinmutanten mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger in Abwesenheit des Toxins vom Wildtypus besitzt.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird ein Impfstoff gegen Bordetella pertussis geschaffen, der einen immunprotektiven Mutanten des obigen genetisch entgifteten Pertussisholotoxins enthält.
Gemäß einer zweiten erfindungsgemäßen Ausgestaltung werden mehrere Orte innerhalb des nativen Holotoxins mutiert.
In entsprechender Weise wird gemäß der zweiten erfindungsgemäßen Ausgestaltung ein Mutantenpertussisholotoxin geschaffen, das durch ein TOX-Operon codiert worden ist, welches durch eine ortsspezifische Mutagenese von mindestens zwei Codons mutiert wurde, wobei jedes dieser Codons eine funktionelle Aminosäure innerhalb des nativen Pertussisholotoxins zur Entfernung oder zum Austausch von mindestens zwei dieser funktionellen Aminosäuren zur genetischen Entgiftung des Holotoxins auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften codiert.
Vorzugsweise stellen diese Mehrfachaminosäuren (S1) GLU¹²&sup9; TYR¹³&sup0; dar und sind durch (S1) GLY¹²&sup9;PHE¹³&sup0; ausgetauscht, oder sie liegen in Form von (S1) GLU¹²&sup9;/(S3) TYR&sup9;²LYS&sup9;³ vor und sind durch (S1) GLY¹²&sup9;(S3) ASN&sup9;²ARG&sup9;³ ausgetauscht.
Das Mutantenholotoxin ist vorzugsweise durch eine Resttoxizität von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins und vorzugsweise durch eine verringerte Histaminsensibilität gekennzeichnet.
Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird auch ein Impfstoff gegen Keuchhusten geschaffen, der ein Mutantenholotoxin gemäß der obenstehenden Beschreibung im Hinblick auf die zweite erfindungsgemäße Ausgestaltung oder ein Toxoid davon enthält, und ein physiologisch annehmbarer Träger dafür.
Gemäß einer dritten erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird ein Konjugatimpfstoff zur Verfügung gestellt, der durch ein aktives Konjugat gekennzeichnet ist, das ein Mutantenholotoxin gemäß der ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Ausgestaltung aufweist, wobei die Konjugation über ein Hapten, Polysaccharid oder Polypeptid zur Provozierung einer Immunantwort auf einen Antigendeterminanten des Haptens, Polysaccharids oder Polypeptids erfolgt ist.
Gemäß dieser erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Mutantenholotoxins geschaffen, das die folgenden Schritte umfaßt Identifizieren mindestens eines funktionellen Aminosäurerestes des Holotoxins, welches alleine oder zusammen (mit den übrigen Resten) dem Holotoxin die Toxizität verleiht; Durchführen der ortsspezifischen Mutagenese zum Entfernen oder Austausch einer Nukleotidsequenz, die für mindestens einen Aminosäurerest einschließlich mindestens eines solchen aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; codiert sowie zur Produktion eines mutierten Holotoxin-Operons; Einführen des mutierten Holotoxin-Operons in einen Bordetella-Tox&supmin;-Organismus zur Erzeugung eines transformierten Organismus sowie Kultivieren des transformierten Organismus zur Gewinnung von immunprotektivem, genetisch entgifteten Holotoxin in Abwesenheit des Toxins vom Wildtypus.
In die Erfindung ist auch ein Bordetella-Stamm eingeschlossen, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein mutiertes TOX-Operon aufweist, das durch die ortsspezifische (site-directed) Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens einer Nukleotidsequenz gebildet wurde, die für mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich mindestens einer solchen aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens der einen funktionellen Aminosäure zu erzielen, sowie dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Fähigkeit der Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Pertussisholotoxinmutanten mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger in Abwesenheit des Toxins vom Wildtypus besitzt. In spezieller Weise sind der Stamm B. pertussis S-3122-2-3, der Stamm B. pertussis 2962-2-1 oder der Stamm B. pertussis S-2962-1-2 mit den ATCC-Hinterlegungsnummern 53833, 53836 und 53837 in der jeweiligen Reihenfolge mit eingeschlossen.
Gemäß der zweiten erfindungsgemäßen Ausgestaltung wird ein Verfahren zur Herstellung eines immunprotektiven, genetisch entgifteten Mutantenpertussisholotoxins geschaffen, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: (a) Identifizieren mindestens zweier Aminosäurereste des Toxins, die alleine oder zusammen dem Holotoxin die Toxizität verleihen; (b) Durchführen der ortsspezifischen Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens zweier Codons, wobei diese jeweils für eine funktionelle Aminosäure innerhalb des nativen Pertussisholotoxins zum Entfernen oder dem Austausch mindestens zweier funktioneller Aminosäuren und für die Produktion eines mutierten TOX-Operons codieren; (c) Einführen des mutierten TOX-Operons in einen Tox&supmin;-Bordetella-Organismus zur Gewinnung eines transformierten Organismus; sowie (d) Kultivieren des transformierten Organismus zur Gewinnung von genetisch entgiftetem Holotoxin mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften in Abwesenheit von Toxin des Wildtypus.
Es wird auch ein TOX-Operon geschaffen, das für ein Mutantenpertussisholotoxin codiert, wobei das TOX-Operon durch die ortsspezifische Mutagenese von mindestens zwei Codons mutiert wurde, welche jeweils eine funktionelle Aminosäure innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codieren, um das Entfernen oder den Austausch dieser mindestens zwei funktionellen Aminosäuren und die genetische Entgiftung des Holotoxins bis auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften zu bewirken.
Die zweite erfindungsgemäße Ausgestaltung schließt auch einen Bordetellastamm ein, der dadurch gekennzeichnet, daß ist, daß er ein mutiertes Toxinoperon aufweist, das durch die ortsspezifische Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens zweier Nukleotidsequenzen gebildet wurde, die für einen funktionellen Aminosäurerest innerhalb des Pertussisholotoxins zum Entfernen oder Austausch mindestens zweier funktioneller Aminosäuren codieren, und welcher ferner noch dadurch gekennzeichnet ist, daß er die Fähigkeit zur Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutantenpertussisholotoxins mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger in Abwesenheit des Toxins vom Wildtypus aufweist.
Die Erfindung wird weiter beschrieben und durch Beispiele unter Hinweis auf die beigefügten Zeichnungen erläutert, in denen die Abbildungen Folgendes darstellen:
Die Abb. 1 zeigt die durch das automatische Sequenzieren von radioaktiv markierten Peptiden A und B aus der Untereinheit S1 erhaltenen Aminosäuresequenzen, die mit den Resten aus der reifen Einheit S1 verglichen sind;
Abb. 2 zeigt die Strukturen verschiedener TOX-Klone dar, welche aus Chromosomenbanken erhalten wurden;
Abb. 3 zeigt die Konstruktion von Subklonen mit einem Gehalt an dem TOX-Gen aus dem genomischen Klon λ gtll 15-4-1, wobei das TOX-Gen in den Mehrfachklonungsort von pUC8 : 2 mit einem Gehalt an Orten Bgl II sowie Xba I eingefügt worden war;
Abb. 4 zeigt die Konstruktion von Subklonen aus dem TOX-Gen, die für die Sequenzierung des Operons benutzt werden. In (a) ist die Restriktionskarte des TOX-Gens und der Proteinuntereinheiten dargestellt, wobei die Klone aus pUC8 : 2/TOX-Klon J-169-1 abgeleitet worden waren und die Gene der Untereinheiten in M13mp18, M13mp19 oder pUC8 : 2 subkloniert waren, wie aus der Darstellung ersichtlich ist; dabei sind in (b) Klone der Region 5' aus pUC8 : 2, S1 in M13mp18- und S1 in M13mp19-Klone beschrieben; darin werden in (c) die Klone von S2 in M13mp18 sowie M13mp19 sowie in (e) die Klone von S3 und die Region 3' in M13mp18 sowie pUC8 : 2 gezeigt;
Abb. 5 zeigt die Nukleotidsequenz und die strukturellen Gentranslationsprodukte von dem TOX-Gen aus B. pertussis 10536;
Abb. 6 stellt die Konstruktion von TOX- oder TOX-Analoga-Genen in dem Breitspektrumwirtsplasmid pRK404 (Ditta et al., Plasmid, 13, Seite 149, [1985]) dar. In (a) und (b) ist die Konstruktion der primären TOX-Analoga-Gene in pRK404 aus den mutierten und nativen Genen dargestellt, wogegen in (c) eine typische Konstruktion eines "gekreuzten" Mutanten aus zwei mutierten S1-Genen aufgezeigt ist;
Abb. 7 zeigt die Entwicklung eines "Suizid"-Plasmids in Form eines Plasmids, das zur Konjugatübertragung, jedoch nicht zur Replikation befähigt ist und das auf dem pRK404 und pMK2004 (Kahn et al., Methods in Enzymology, 68, Seite 278 [1979]) für die nichthomologe Rekombinierung basiert (die Plasmide enthalten auch ein von Tn5 abgeleitetes Kanamycinresistenzgen 3' aus den TOX-Genen oder TOX-Analoga-Genen);
Abb. 8 zeigt das Klonen der 5'- und 3'-flankierenden Region des TOX-Gens. (a) zeigt die Konstruktion des Anteils 5' des TOX in pUC8 : 2 aus dem λ Charon-Klon Ch421; (b) repräsentiert die Konstruktion des Anteils 3' des TOX in pUC8 : 2 aus λ Ch 111, und (c) zeigt die Erzeugung eines pUC8 : 2-Klons mit einem Gehalt an TOX und seinen 5'- und 3'-flankierenden Regionen;
Abb. 9 stellt die Konstruktion von Plasmiden für die Eliminierung des TOX-Operons aus dem Chromosom von B. pertussis mittels der homologen Rekombinierung dar; und
Abb. 10 schließlich zeigt die Konstruktion von Plasmiden für den Wiedereinbau von TOX-Analoga- Genen in das Genom von B. pertussis durch die homologe Rekombinierung, wobei die Endplasmide auf dem Suizidplasmid basieren, welches in der Abb. 7 wiedergegeben ist und das Tetracyclinresistenzgen aus pRK404 enthalten, das sich an der Stelle 3' am TOX-Analog-Gen befindet.
Es konnte aufgezeigt werden, daß die TOX-Operons aus verschiedenen Stämmen von B. pertussis bezüglich ihrer Sequenz nahezu identisch sind (Nicosia et al., Proc.Nat. Acad.Sci., USA, 83, Seite 4631, [1986]; Locht & Keith, Science, 232, Seite 1258, [1986]). Der TOX-Ort wird hier als ein DNS-Fragment definiert, das an der EcoR I-Spaltungsstelle beginnt, welche die 5'-flankierende Sequenz, die Promotor-Region, die Strukturgene für sämtliche PT-Untereinheiten und eine 3'-flankierende Sequenz codiert. Das TOX-Gen aus B. pertussis 10536, welcher den von den Erfindern verwendeten Stamm bildet, wurde kloniert und sequenziert. Es hat sich herausgestellt, daß dessen Nukleinsäuresequenz gegenüber den anderen publizierten Sequenzen in höchstem Mäße homolog ist und vier außergewöhnliche Basendifferenzunterschiede abwärts von dem G von der als Base 1 definierten EcoR I-Stelle aufweist. Die vollständigen Nukleotid- und entsprechenden Aminosäuresequenzen der Strukturgene sind in der Abb. 5 dargestellt.
Die Plasmid-DNS des Klons J-169-1 mit einem Gehalt an einem TOX-Gen aus Bordetella pertussis 10536, welches in das pUC8 : 2 als ein 4,6 kb EcoR I, BamHI-Fragment kloniert worden war, wurde an der US- Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen (ATCC) in Rockville, Maryland, USA, gemäß den Vereinbarungen des Budapester Vertrags vom 24. November 1988 unter der Hinterlegungs-Nr. 40518 deponiert.
Das T in der Stellung 315 ist im Hinblick auf den Stamm 10536 außergewöhnlich, wobei es bei dem Gen S1 in den Positionen 710, 1200 und 1202 drei Unterschiede gibt, die zu zwei ungewöhnlichen Aminosäuren, nämlich Glutaminsäure und Valin, an den jeweiligen Stellen 34 und 198 der reifen Sequenz S1 führen. Die Toxingene von B. parapertussis und B. bronchiseptica werden aufgrund der Mehrfachmutationen in deren Promotorregionen nicht exprimiert (Arico & Rappuoli, J.Bacteriol., 169, Seite 2849, [1987]). Dadurch wurde die Verwendung von B. parapertussis als Wirt für die Expression von mutierten Toxingenen für Austestungszwecke ermöglicht.
Die Erfinder konnten aufzeigen, daß der Ersatz einer einzigen Aminosäure in S1, insbesondere an dem aktiven Ort der NAD-Hydrolyse (in der Position 129), in der Tat die Aktivität der ADP-Ribosyltransferase des PT aufhebt. Es mag jedoch wünschenswert sein, an verschiedenen Orten des Holotoxins Änderungen vorzunehmen, um eine vollständige Sicherheit zu gewährleisten. Dementsprechend erfolgt die erfindungsgemäße Anwendung auf spezielle einzelne Mutationen in dem Teil A oder Mehrfachmutationen an beiden oder einem von beiden Teilen A und B des Toxins zur Eliminierung der Toxizität und dem Wiedereinbau dieser Mutationen in das Genom der Tox&supmin;-Stämme von Bordetella.
Es wurden von den Erfindern eine Anzahl von Strategien angewendet, die Regionen des Toxins zu bestimmen, welche möglicherweise mit dessen biologischen Wirkungen in enger Verknüpfung stehen und deshalb mögliche Orte für die genetische Manipulation aufweisen könnten, um das Pertussistoxinmolekül gentechnologisch zu entgiften.
Das PT wurde aus dem Überstand der Kultur von B. pertussis (Stamm 10536) hergestellt. Die Rohlösung wurde durch Ultrafiltrierung eingeengt und über eine Affinitätssäule mit Fetuin-Agarose zur Adsorption von PT laufengelassen. Das PT wurde aus der gewaschenen Säule unter Verwendung von Kaliumthiocyanat eluiert und in ein Phosphat/Kochsalz-Medium dialysiert. In dieser Stufe betrug die Reinheit 90-95%, welche durch die Gelelektrophorese mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE) analytisch bestimmt wurde. Eine größere Menge an Verunreinigungen lag in Form von FHA vor. Die weitere Reinigung wurde durch die Chromatographie über eine Säule mit Hydroxyapatit unter Gewinnung eines Materials einer Reinheit von > 99% erzielt.
Die Interaktionsstelle der Untereinheit S1 mit NAD wurde durch die lichtinduzierte Quervernetzung des NAD mit dem isolierten und gereinigten S1 unter Verwendung von [¹&sup4;C]NAD bestimmt, wobei die Markierung entweder an der Nikotinamidcarbonsäuregruppe oder an dem Adeninanteil erfolgte. Die absorptive Radiomarkierung an das Protein erfolgte effizient ausgehend von dem Nikotinamidanteil. Das Protein wurde im Anschluß daran mit Trypsin zerlegt und auf einer HPLC-Säule unter Gewinnung zweier größerer radioaktiver Peptide chromatographiert. Nach der Reinigung der beiden mit Trypsin zerlegten Peptide wurde die Sequenzierung durchgeführt, welche ergab, daß die ersten 15 Reste den Resten 118-132 der gereiften Einheit S1 entsprachen. Bei beiden Peptiden stand die Radioaktivität mit einer nichtidentifizierten Aminosäure an entsprechender Stelle 129 in dem gereiften S1 in Zusammenhang. An keiner anderen Stelle wurde Radioaktivität festgestellt. Damit ist erwiesen, daß GLU¹²&sup9; die Stelle der lichtinduzierten Quervernetzung des NAD darstellt und aus diesem Grund aller Wahrscheinlichkeit nach ein wichtiger Bestandteil des Ortes der Nikotinamidinteraktion ist. In signifikanter Weise stellen die Orte der Verknüpfung bei dem Diphtherietoxin und dem Exotoxin A von P. aeruginosa ebenfalls Glutaminsäurereste dar, wobei die Sequenz der drei Aminosäuren an der Stelle GLU¹²&sup9; von S1 beginnt und den analogen Sequenzen anderer bakterieller Toxine ähnelt.
Aus B. pertussis (Stamm 10536) wurde chromosomale DNS hergestellt und mit dem Restriktionsenzym EcoR I in einer derartigen Art und Weise verdaut, daß Fragmente in einem Größenbereich von einigen hundert Basen bis zu einigen tausend Basen erhalten wurden. Die DNS-Fragmente wurden mit der DNS λ gtll, welche mit EcoR I zerlegt und dephosphoryliert worden war, verknüpft (ligiert). Die DNS wurde dann in Phagenpartikel eingeschleust und in E. coli Y1090 als genomische Genbibliothek von λ gtll B. pertussis aufbewahrt. Alternativ wurde die chromosomale DNS von B. pertussis durch das Restriktionsenzym Sau3A I zur Erzielung sehr großer DNS-Fragmente zerlegt, die mit durch BamH I aufgespaltener DNS von λ-Charon 35 ligiert waren. Die DNS wurde dann in Phagenpartikel verpackt und in E.coli LE392 als genomische Genbibliothek von λ Charon 35 B. pertussis aufbewahrt.
Diese genomischen Genbibliotheken wurden plattiert und die Phagenzonen auf Nitrocellulosefilter verbracht. Die Filter wurden mittels der DNS-Hybridisierung unter Verwendung einer für die Untereinheit PT S4 spezifischen Oligonukleotidprobe analysiert. Positive Zonen wurden durch zwei angeschlossene Gänge unter Plattieren und Hydrisieren weiter gereinigt. Aus den positiven Zonen wurde Phagen-DNS herauspräpariert und der Zerlegung durch Restriktionsenzym(e) sowie der Southern-Bloting-Analyse unterzogen. Die Klone mit einem Gehalt an dem vollständigen Toxin-Operon (TOX) 4,6 kb EcoR I oder Anteile davon wurden charakterisiert, wobei unterschiedliche 5'- oder 3'-flankierende Regionen vorhanden waren. Das TOX-Gen wurde zur Sequenzanalyse und weiteren gentechnologischen Bearbeitung subkloniert. Die Sequenzierung wurde unter Benutzung des Didesoxy-Kettenterminierungsverfahrens durchgeführt, wobei die Ergebnisse für vier neue Basen in dem TOX-Gen 10536 im Vergleich zu den veröffentlichten Sequenzen sprachen.
Die Subklone der Gene S1 oder S3 in dem Phagen M13 wurden einer ortsspezifischen in vitro-Mutagenese unter Benutzung der Phosphorthioat-Methode unterzogen. Die einzelsträngige DNS aus diesen Klonen wurde mit Oligonukleotid-Primern (Starter-DNS), die jeweils in spezieller Weise für die Mutation oder das Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren speziell ausgelegt war, miteinander vereinigt (annealed). Die Mutagenese wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Testkits durchgeführt. Die Mutationen wurden durch die Sequenzierung der einzelsträngigen Phagen-DNS überprüft. Die mutierten Gene der Untereinheiten wurden mit dem verbleibenden Anteil des Operons zur Konstruktion der mutierten Holotoxingene in dem Breitspektrum-Wirtsplasmid pRK404, das in E. coli JM109 aufgehoben worden war, rekombiniert.
Zur Charakterisierung der Holotoxinanaloga wurden diese Plasmide auf einen gegenüber Streptomycin spontan resistenten Stamm von B. parapertussis durch die Konjugierung auf einer festen Oberfläche unter Benutzung von pRK2013 als Helferplasmid übertragen. Die Kolonien wurden auf tetracyclinhaltigen Bordet- Gengou-Blutplatten selektiert. Die mutierten Gene wurden auch in das Chromosom von P.parapertussis durch die konjugierende Übertragung eines Suizidplasmids integriert. Der Einbau geschah entweder randomisiert oder direkt mittels der homologen Rekombination unter Benutzung der flankierenden Regionen des TOX-Operons von B. pertussis. Die Abb. 7 zeigt die Konstruktion eines Suizidplasmids mit einem Gehalt an Mutanten für die randomisierte Rekombination.
In einem modifizierten Stainer-Scholte-Medium mit einem Gehalt an Methyl-β-cyclodextrin wurden Flüssigkulturen in Schüttelflaschen (10 ml bis 2L) oder in Fermentern (20L bis 50L) gezogen. Das Ausmaß der Expression der Holotoxinanaloga in dem Überstand der Kultur wurde durch den enzymgestützten Immunsorptionstest (ELISA) bestimmt, wobei sich herausstellte, daß dieser mit der Mutation variiert. Die verbleibende Toxizität der Analoga wurde durch den CHO-Zellverklumpungstest gemessen.
Eine Anzahl von PT-Analoga wurde von 2L- bis zu 50L-Kulturen von rekombinierten Stämmen von B. pertussis nach den Verfahren gereinigt, wie sie im Detail für das native PT beschrieben sind. Die Aktivität der ADP-Ribosyltransferase dieser Mutanten wurden als das Ausmaß des Einbaus von Radioaktivität in das Rindertransducin aus NAD, welches mit [³²P] markiert war, gemessen. In der untenstehenden Tabelle 1a sind die erzeugten PT-Mutanten aufgelistet, wobei in der darunter befindlichen Tabelle 1b deren Resttoxizität sowie die enzymatische Aktivität zusammengefaßt sind.
Ausgewählte gereinigte Mutanten wurden an der Maus bezüglich der akuten Toxizität, der Histaminsensibilisierungswirkung und -potenz mittels des Standardtests der intrazerebralen Provokation an der Maus ausgetestet. Diese Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 2 dargestellt; diese zeigen auf, daß die PT- Analoga eine merklich herabgesetzte akute Toxizität und Histaminsensibilisierungswirkung sowie eine immunprotektive Wirkung bei dem Mäusewirkpotenztest besitzen.
Die immunologischen Eigenschaften der PT-Analoga wurden ferner anhand der epitopen Kartierung sowie durch die Analyse der Antikörperantwort bei der Maus untersucht. Verschiedene monoklonale Antikörper (MAbs), welche für individuelle Untereinheiten oder Dimere des PT spezifisch sind, wurden hergestellt, um mittels ELISA zu untersuchen, ob die durch diese Antikörper definierten Epitope durch die Mutationen betroffen waren. Das durch MAb PS21 erkannte Epitop S1 ist von besonderer Bedeutung, da es bei der Maus immundominant ist und dessen Antikörper bei dem Mäusetest zur intrezerebralen Provokation einen passiven Schutz verleiht. Die Beibehaltung dieses Epitops bei den PT-Analoga ist in der Tabelle 1b angegeben.
Die Untersuchungen zur Immunogenizität bei der Maus wurden bei drei gereinigten PT-Mutanten durchgeführt. Die Immunseren wurden auf deren Fähigkeit zur Hemmung der durch PT hervorgerufenen CHO- Zellverklumpung (Tabelle 3 unten) sowie für deren Anti-PT-, Anti-S1- und Anti-B-Oligomer-Antikörpertiter durch indirekten ELISA (Tabelle 4 unten) ausgetestet.
Zur Erzeugung eines Stammes von B. pertussis mit der Fähigkeit zur Expression eines mutierten TOX-Gens, das zur Herstellung des Impfstoffes geeignet ist, wurde das endogene TOX-Operon durch die homologe Rekombination unter Einsatz der Elektroporation linearer DNS aus B. pertussis mit einem Gehalt an 5'- und 3'-flankierenden Regionen aus dem TOX-Ort herausgelöst. Anschließend wurden ausgewählte Mutantengene in den TOX-Ort des Chromosoms von B. pertussis wieder eingesetzt. Die mutierte TOX-Gene enthaltenden Klone wurden kultiviert und der Kulturüberstand bezüglich des Ausmaßes der Expression von PT-Analoga und deren Resttoxizität, wie im vorstehenden beschrieben, ausgetestet. Diese Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 5 aufgezeigt.
Bestimmte Stämme von Bordetella pertussis, bei denen das TOX-Gen vollständig entfernt oder durch gewisse Klone ersetzt worden war, wurden bei ATCC am 23. November 1988 nach den Regelungen des Budapester Vertrages wie folgt hinterlegt: Stamm Modifizierung AATCC-Hinterlegungsnummer B. pertussis
Der TOX -Stamm stellt einen neuen Stamm von Bordetella pertussis dar, aus welchem das Toxin-Operon entfernt wurde und bei dem Fremd-DNS abwesend und welches dazu befähigt ist, in Abwesenheit von Antibiotika zur Produktion von Antigenen von B. pertussis, welche von Pertussistoxin frei sind, kultiviert zu werden.
Jeder transformierte Stamm stellt einen Stamm von Bordetella pertussis dar, worin das Toxin-Operon durch ein Mutantengen ersetzt worden ist, das durch die ortsspezifische Mutagenese von mindestens einem Codon gebildet wird, das mindestens einen speziellen für die Toxizität des Pertussistoxins verantwortlichen Aminosäurerest codiert.
Die vorliegend dargestellten Werte zeigen auf, daß von den Erfindern eine Reihe von Pertussistoxinanalogaproduziert wurden, die eine wesentliche Verminderung der Aktivitäten sowohl bei der CHO-Zellverklumpung als auch bei den Enzymen (0,1 bis 1% im Vergleich zur Aktivität des Wildtyps) aufweisen. Eine große Anzahl dieser Analoga hat auch ein immundominantes Epitop S1 beibehalten, das von einem protektiven monoklonalen Antikörper erkannt wird. Darüber hinaus wurde aufgezeigt, daß bestimmte PT-Analoga Mäuse gegen die Frovozierung durch virulentes B. pertussis bei einer Dosierung, welche eine minimale Toxizität zeigt, schützen. Obschon die Mehrzahl dieser Ergebnisse durch die Verwendung von PT-Analoga erhalten wurden, die von B. parapertussis ausgeschieden wurden, ist augenscheinlich, daß äquivalente Produkte durch die gentechnologische Behandlung von B. pertussis selbst erhalten werden. Die vorliegende Offenbarung gibt sowohl eine Anzahl von entgifteten immunogenen Formen des Pertussistoxins wieder, welche für die Aufnahme in einen neuen Keuchhustenimpfstoff in Betracht kommen würden, als auch ein Verfahren zu deren Herstellung in B. pertussis.

BEISPIELE

Über die Verfahren zur molekularen Gentechnologie, der Eiweißbiochemie und Fermentierung sowie der Hybridomtechnik, die zwar verwendet werden,jedoch nicht ausdrücklich in dieser Offenbarung und den vorliegenden Beispielen beschrieben sind, wird in breitem Umfange in der wissenschaftlichen Literatur berichtet, wobei diese den Fachleuten durchaus geläufig sind.

Beispiel I

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung und Reinigung von PT.
Der Kulturüberstand von B. pertussis (Stamm 10536) wurde 20-50fach durch die Ultrafiltration über eine Membran angereichert, die bei einem Molekulargewicht von 10.000 oder 20.000 abtrennte, wobei ein Millipore-Pellicon-Kassettensystem zur Verwendung gelangte. Das Toxin wurde aus Rohkonzentraten vermittels des Durchtritts durch eine Affinitätssäule mit Fetuin-Agarose adsorbiert, die mit 1 M Kaliumphosphat und 10 mM NaCl bei einem pH-Wert von 7,5 equilibriert war. Das Volumen des Adsorbens betrug typischerweise 1 ml pro mg Toxin. Die beladene Säule wurde mit 100 mMol Kaliumphosphat und 1 M NaCl bei einem pH-Wert von 7,5 gewaschen und im Anschluß daran mit demselben Puffer mit einem Gehalt an 3 M Kaliumthiocyanat zur Desorption des Toxins eluiert. Die gepoolten Fraktionen wurden gegen 50 mMol Tris-HCl und 200 mM NaCl mit einem Gehalt an 10 Vol.-% Glycerin (V/V) bei einem pH-Wert von 8,0 zur Entfernung des Thiocyanats dialysiert, wonach gegen 50 mMTris-HCl und 200 mM NaCl mit einem Gehalt an 50 Vol.-% Glycerin (V/V) bei einem pH-Wert von 8,0 zum Ermöglichen der Produktlagerung bei -200ºC dialysiert wurde. Die Ausbeute wurde durch ELISA bestimmt und betrug typischerweise 90-95%. Die Reinheit wurde mittels SDS-PAGE bestimmt und betrug 90-95%, wobei der größere Teil der Verunreinigungen in Form von EHA vorlag. Das aufbewahrte Toxin wurde für die weitere Reinigung fünffach mit Wasser verdünnt und damit eine Hydroxyapatitsäule mit einem Volumen von 1 ml pro mg Toxin beladen, welche mit 10 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 8,0 equilibriert worden war. Die Säule wurde mit 30 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 8,0 gewaschen und anschließend mit 100 oder 200 mM Kaliumphosphat zur Desorption des Toxins eluiert. Die gepoolten Fraktionen wurden gegen 100 mM Kaliumphosphat mit einem Gehalt an 50 Vol.-% Glycerin (V/V) bei einem pH-Wert von 8,0 dialysiert. Die Ausbeute betrug typischerweise 90-95%, wobei die Reinheit anhand von SDS-PAGE > 99% betrug.

Beispiel 11

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung der PT-Untereinheit S1.
Das PT wurde an Fetuin-Agarose gemäß der Beschreibung in Beispiel I adsorbiert, wonach die Säule mit CHAPS-Puffer (500 mM Harnstoff, 50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl und 1% Gew./Vol. an CHAPS-(3-[(3- cholamidopropyi)-dimethylammonium]-1-propansulfonat) bei einem pH-Wert von 7,5 gewaschen wurde. Die Säule wurde mit dem gleichen Medium, enthaltend 500 µM Adenosintriphosphat (ATP), eluiert. Die Untereinheit S1 machte sich als scharfer Peak am Säulenvolumen bemerkbar. Die gepoolten Fraktionen wurden durch eine reine Säule mit Fetuin-Agarose, die mit CHAPS/ATP-Puffer zur Entfernung des restlichen B-Oligomers equilibriert war, laufengelassen, wonach gegen 100 mM Kaliumphosphat mit einem 50%igen Gehalt an Glycerin (V/V) bei einem pH-Wert von 8,0 für die Lagerung bei -20ºC dialysiert wurde. Dann wurde S1 durch die Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4-Säule anhand des Vergleichs der integrierten Peakfläche zu einem PT-Standard quantitativ bestimmt. Die Ausbeute betrug in typischer Weise lediglich 20-25%, jedoch war das Produkt von anderen Untereinheiten frei, wie durch SDS-PAGE und die Umkehrphasen-HPLC demonstriert wurde.

Beispiel III

Dieses Beispiel erläutert die Lichtvernetzung von NAD mit der Untereinheit S1.
In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden wurden die Reaktionsgemische (100 µl) mit einem Gehalt an 50 µg/ml an S1, 10 mM Dithiothreitol sowie 50 µM NAD in CHAPS-Puffer verbracht, wobei die Mikrotiterplatte in Eis gepackt, 30 Minuten lang vorinkubiert und anschließend bei einer Wellenlänge von 254 nm für jeweils einen Zeitraum bis zu drei Stunden in einer Entfernung von 5 cm mit einer 9 W-Quecksilberlampe bestrahlt wurde. Die Proben wurden im Anschluß daran auf die verbliebene Aktivität der NAD-Glycohydrolase ausgetestet. Die Enzymaktivität von S1 war nach einer 2-stündigen Bestrahlung völlig verschwunden, wogegen das Ausmaß der Photoinaktivierung bei gleichen Bedingungen, jedoch in Abwesenheit von NAD, lediglich 40% betrug. Dieses Ergebnis erwies, daß NAD-abhängige, photochemische Abläufe stattgefunden hatten. Zur Erkennung des Teils des NAD-Moleküls, das mit dem Protein interagiert hatte, sowie des Ausmaßes an Quervernetzung wurde S1 unter identischen Bedingungen mit [Carbonyl-¹&sup4;C]NAD oder [Adenin-¹&sup4;C]NAD bestrahlt. Es wurden in Intervallen bis zu 3 Stunden aliquote Teile entnommen und mit Trichloressigsäure (TCA) [10% Gew./Vol.] behandelt. Das ausgefällte Protein wurde durch Filtrieren aufgefangen, mit frischer TCA (10% Gew./Vol.) gewaschen und in einem Szintillationszählgerät ausgezahlt. Die Ergebnisse zeigten an, daß die radioaktiven Marker besser aus dem Nikotinamid-Molekülteil als aus dem Adenin-Molekülteil aus eingebaut wurden und daß das Ausmaß des Einbaus 0,75 Mol Marker pro Mol Protein betrug.

Beispiel IV

Gemäß diesem Beispiel wird der Ort der Lichtvernetzung an der Untereinheit S1 identifiziert.
Es wurden die Reaktionsgemische (3 ml) mit einem Gehalt an 100 µg/ml an S1, 10 µM Dithiothreitol sowie 50 µM [Carbonyl-¹&sup4;C]NAD in CHAPS-Puffer in eine Petrischale auf Eis so verbracht, daß eine Schicht von 1 mm Dicke entstand, wonach die Bestrahlung bei 254 nm für einen Zeitraum von 2 Stunden unter vorsichtigem Rühren mit einem Magnetrührer erfolgte. Die Lösung wurde mit Stickstoff entlüftet, mit Dithiothreitol weiter reduziert und mit 4-Vinylpyridin S-alkyliert, um die Oxidation der Thiolgruppen zu vermeiden. Das Reaktionsgemisch wurde intensiv gegen 10 mM Essigsäure dialysiert und das radioaktiv markierte Protein nach dem Ausfällen mit 20%iger TCA (Gew./ Vol.) gesammelt.
Das ausgefällte Protein (1 mg) wurde in 2 M Harnstoff, 200 mM Ammoniumbicarbonat (500 µg/ml) wieder aufgelöst und mit 50 µg/ml Trypsin 20 Stunden lang bei 37ºC enzymatisch zerlegt. Das Gemisch wurde angesäuert und auf einer Vydac C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-HPLC-Säule mit 25 cm Länge (1·) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0-50% Acetonitril in 10 mM Trifiuoressigsäure (TFA) fraktioniert. Die Fraktionen wurden durch Szintillationsauszählung überprüft, wobei sich das Erscheinen zwei größerer radioaktiver Peptide, mit A und B bezeichnet, herausstellte, die für 50% der eluierten Radioaktivität verantwortlich sind. Der Peptidpool wurde gefriergetrocknet, in 10 mM TFA und 6M Guanidinchlorid nochmals aufgelöst und auf einer Vydac CI8-Säule unter Verwendung eines 20-30%igen Acetonnitrilgradienten in 10 mM TFA aufgetrennt. Jedes Peptid wurde ferner bis zur Homogenität auf derselben Säule durch die Verwendung eines Acetonitrilgradienten in 20 mM Ammoniumacetat bei einem pH-Wert von 6,5 gereinigt, wonach die Lösungen bis zur Trockne evaporiert wurden. Die jeweils spezifische Radioaktivität stimmte mit nur einer markierten Stelle pro Molekül überein.
Die beiden Peptide wurden durch den automatisierten Edman-Abbau sequenziert. Ein Teil der ausgetretenen sequenzierten Menge wurde für die Überwachung der Radioaktivität abgezweigt. Die Ergebnisse sind in der Abb. 1 dargestellt. Bis zum 15. Zyklus ergaben die Sequenzen Übereinstimmung und entsprachen eindeutig den Resten 118-132 an reifer S1. Bei beiden Peptiden stand die Radioaktivität in Zusammenhang mit einer nicht identifizierten Aminosäure, die beim Zyklus 12 freigesetzt wurde, und der Position 129 in der reifen S1 entsprach. Jenseits des 15. Zyklus wurde keine Radioaktivität mehr gemessen. Auf diese Weise konnte erhärtet werden, daß GLU¹²&sup9; den Ort der Quervernetzung gebildet hat, welcher daher sehr wahrscheinlich eine bedeutende Rolle des Geschehens am Nikotinamid-Ort spielt.

Beispiel V

Gemäß diesem Beispiel wird die Herstellung von chromosomaler DNS von B. pertussis erläutert.
In einem modifizierten Stainer-Scholte-Medium wurden 2 l B. pertussis (Stamm 10536) in Form von 16·125 ml aliquoten Teilen unter Verwendung eines Inoculums von 4 ml mit jeweils abgeschlossenen Wachstum pro jeweilige Flasche kultiviert. Dieses Medium besteht aus 5 g/l L-Prolin, 2,5 g/l NaCl, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g/l KCl, 0,1 g/l MgCl · 6H&sub2;O, 1,5 g/l Tris, 10 g/l Casaminosäuren, 2 g/l Methyl-β-Cyclodextrin, 0,02 g/l CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 10 g/l Mononatriumglutamat, 0,004% L-Cystein, 0,001% FeSO&sub4; · 7H&sub2;O, 0,004% Niacin, 0,015% Glutathion sowie 0,04% Ascorbinsäure bei einem pH-Wert von 7,6. Die Proben wurden in Flaschen mit 500 ml Inhalt auf einem Schüttelgerät bei 35-36ºC, 150 Upm 16,5 Stunden bis zur logarithmischen Phase kultiviert. Die Zellen wurden in aliquoten Anteilen von jeweils 500 ml bei 5.000 g eine Stunde lang bei 4ºC abgeschleudert. Die aliquoten Teile wurden jeweils mit 25 ml TE-Puffer (10 mM Tris · HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) gewaschen und anschließend in 20 ml TE wieder aufgeschwemmt und bei -70ºC eingefroren. Ein Pellet wurde in 90 ml TE wieder aufgeschwemmt und 500 µg/ml Pronase hinzugefügt. SDS wurde bis zu einer Menge von 1% hinzugegeben und die Probe bei 37ºC 21,5 Stunden unter Gewinnung eines klaren Lysats inkubiert. Das Lysat wurde mit 1 Vol. Tris · HCl, das mit Phenol gesättigt war, bei einem pH-Wert von 7,5 bei Raumtemperatur 2 Stunden lang unter leichtem Rühren extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 2.800 g 15 Minuten lang bei 20ºC abgetrennt und die wäßrige Phase in ähnlicher Weise mit 1 Vol. des Gemisches aus Phenol und Chloroform im Verhältnis 1 : 1 extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 2.100 g 10 Minuten lang bei 20ºC abgetrennt, und die wäßrige Phase mit Chloroform 2 Stunden lang, wie oben beschrieben, extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 1.600 g 5 Minuten lang bei 20ºC abgetrennt und die wäßrige Phase bei 4ºC gegen 2 Liter 1 M NaCl 24 Stunden lang bei einmaligem Pufferwechsel dialysiert, wonach die Dialyse 48 Stunden lang bei einmaligem Pufferwechsel gegen 2 l TE erfolgte.

Beispiel VI

In diesem Beispiel wird die Gewinnung von Genbanken mit B. pertussis erläutert.

1) λ gtll EcoR I-Bank

Zur Gewinnung eines Satzes angedauter DNS-Fragmente wurden 10 µg DNS von B. pertussis mit 10 Einheiten EcoR I in Anwesenheit von 100 mM Tris · HCl bei einem pH-Wert von 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA, 1 µg/ml RNAse A bei unterschiedlicher Zeitdauer enzymatisch zerlegt. Nach dem Ablauf von jeweils ¼, ½, 1, 2, 4 und 8 Stunden wurde die Probe auf eine Temperatur von 0ºC gebracht und EDTA bis zu einer Menge von 20 mM zur Beendigung der Reaktion hinzugefügt. Die Proben wurden gepoolt und mittels eines 10-40%igen Saccharosegradienten in TNE (20 mM Tris · HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 1 M NaCl) bei 85.000 g 20 Stunden lang bei 20ºC abgetrennt. Der Gradient wurde am Anfang beginnend in Form von 24 aliquoten Teilen (0,5 ml) fraktioniert, zu denen jeweils aliquote Anteile von 1ml absoluten Ethanols zur Ausfällung der DNS hinzugefügt wurden. Die Proben wurden 30 Minuten lang auf Trockeneis inkubiert und anschließend bei 12.000 g 5 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Die Pellets wurden mit &sup7;&sup5;&sup0;u¹ 70%igem Ethanol gewaschen, auf Trockeneis 5 Minuten lang inkubiert, bei 12.000 g 5 Minuten lang zentrifugiert und anschließend getrocknet. Jedes Pellet wurde in 25 µl sterilem Wasser wieder aufgeschwemmt, wonach jeweils aliquote Teile von 5 µl jeder alternierenden Fraktion der Agarosegelelektrophorese zur Fragmentgrößenbestimmung unterzogen wurden. Die DNS enthaltenden Proben, welche eine Größe von annäherungsweise 0,5 kb bis zu 9 kb aufwiesen, wurden gepoolt. Die TNA aus B. pertussis, die in einer Menge von 0,4 µg gepoolt und mit EcoR I enzymatisch zerlegt war, wurde mit der durch EcoR I verdauten, dephosphorylierten λ gtll-DNS (0,5 µg) vereinigt und in Phagenpartikel unter Benutzung eines im Handel erhältlichen Reagentiensatzes eingeschleust. Die Phagenbibliothek wurde in E. coli-Zellen Y1090 vermehrt und zu annäherungsweise 10¹&sup0; Plaquebildenden Einheiten (pfu)/µg an λ gtll-DNS titriert. Die Bibliothek wurde auf 4·10¹&sup0; pfu/ml im Hinblick auf Testklone erweitert. Die Erweiterung erfolgte auf Platten durch die Kultivierung von Zellen in jeweils einem Medium mit einem Gehalt an 0,2% Maltose bis zur Sättigung über Nacht, wonach 10&sup4; bis 10&sup5; pfu pro Bibliothek auf 0,6 ml Zellen hinzugefügt wurden und dem Phagen Zeit gegeben wurde, 15 Minuten lang bei 37ºC an die Zellen zu adsorbieren. Die Probe wurde mit Weichagar vermischt, plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Schicht aus Weichagar, Zellen und Phage wurde von den zusammenfließenden Plattierungen abgekratzt, welche mit 4 ml SMG-Puffer (0,4 M NaCl, 10 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris · HCl, pH 7,5, 0,01% Gelatine) gewaschen wurden. Die Waschflüssigkeiten und das Phagenagar wurden miteinander vereinigt 100 u¹ Chloroform hinzugefügt und das Gemisch bei 37ºC 15 Minuten lang unter leichtem Rühren inkubiert. Die Probe wurde bei 4.000 g und 4ºC 10 Minuten lang zweimal zur Gewinnung eines klaren Überstandes zentrifugiert. Dann wurde Chloroform bis zu einer Endkonzentration von 0,3% hinzugegeben und die Bank bei 4ºC gelagert.

2) λ Charon 35 Sau3A 1-Bibliothek

Es wurden 3 · 166 µg DNS vom B. pertussis mit Sau3A I (3 · 220 Einheiten) in Anwesenheit von 10 mM Tris · HCl bei einem pH von 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA jeweils 1 Minute, 2 Minuten oder 3 Minuten zur Gewinnung sehr großer DNS-Fragmente enzymatisch zerlegt. Nach jeder Reaktion wurde jeweils EDTA bis zu einer Menge von 20 mMol hinzugefügt, wonach 2,5 Volumina absoluten Ethanols zum Ausfallen der DNS, wie obenstehend beschrieben, hinzugesetzt wurden. Die DNS wurde in TNE wieder aufgeschwemmt und mittels eines 10-30%igen Saccharosegradienten in TNE, wie obenstehend beschrieben, abgetrennt. Die Fraktionen wurden, wie vorstehend angegeben, behandelt und die Größe der DNS-Fragmente durch die Agarosegelelektrophorese sichtbar gemacht. Die λ Charon 35-DNS (2 · 50 µg) wurde zur Herstellung einer Ringform vor der Verdauung mit BamH 1(2 · 20 Einheiten) in Anwesenheit von 150 mM NaCl, 6 mM Tris · HCl, einem pH-Wert von 7,9, 6 mM MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA zur Entfernung der Stuffer-Fragmente verdaut. Die lambda-Arme wurden durch Pelletisieren über einem 8-20%igen Kaliumacetatgradienten bei 85.000 g 16 Stunden lang bei 32ºC gereinigt. Die durch Sau3A I enzymatisch zerlegte DNS wurde mit den lambda-Armen bei 6ºC 72 Stunden lang ligiert und anschließend in den Phagen unter Benutzung eines handelsüblichen Reagentiensatzes eingeschleust. Die Phagenbibliothek wurde in Zellen von E. coli LE392 vermehrt und bei annäherungsweise 1 · 10&sup5; pfu/µg an lambda-Armen titriert. Die Bibliothek wurde auf 1-2 · 10¹&sup0; pfu/ml für Testzwecke, wie obenstehend beschrieben, erweitert.

Beispiel VII

In diesem Beispiel wird das Austesten der Bibliotheken vom B. pertussis erläutert.

1) Genbank von λ gtll

Es wurde eine Oligonukleotidprobe mit 30 Basen auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des Gens, das für die PT-Untereinheit S4 codiert, synthetisiert. Die DNS wurde aus Harnstoff-/Acrylamid-Gelen durch die UV-Erkennung und Ionenaustauscherchromatographie mittels der Whatman-Cellulose DE52 gereinigt. Die Sequenz des Oligonukleotids stellte sich als 5'GTAGCCATGAAGCCGTATGAAGTCACCCCG3' heraus, die für die Aminosäuren 16-25 des reifen Proteins S4 codiert. Das Oligonukleotid wurde in einem Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 10 µg DNS, 25 µCi [α-³²P]ATP, 4 Einheiten Polynukleotidkinase in Anwesenheit von 50 mM Tris · HCl, pH 9,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 5% Glycerin durch die Inkubierung bei 37ºC für eine Zeitdauer von 15 Minuten an dem 5'-Ende markiert. Dann wurde ATP bis zu einer Menge von 1,5 mM hinzugefügt und die Inkubierung 1,75 Stunden lang bei 37ºC fortgesetzt. Als Träger wurden 10 µg tRNS hinzugegeben und die markierte DNS von dem freien ATP auf einer Sephadex G50-Säule (superfein) mit 0,1 M Triethylammoniumbicarbonat bei einem pH-Wert von 7,6 eluiert. Die Peakfraktionen wurden gepoolt und bis zur Trockne lyophilisiert. Das Pellet wurde mit sterilem Wasser gewaschen, nochmals gefriergetrocknet und im Anschluß daran in einem Mengenverhältnis von annäherungsweise 0,1 µg/ml wieder aufgeschwemmt.
Anschließend wurden aliquote Anteile der λ gtll-Genbank vom B. pertussis auf einen Rasen von Y1090 auf NZCYM-Platten mit einem Gehalt an 0,2% Maltose plattiert. Die entnommenen Plaques wurden auf Nitrocellulosefilter verbracht, welche nacheinander mit denaturierender Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) 1 Minute lang und anschließend mit neutralisierender Lösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris · HCl, pH 8,0) 5 Minuten lang behandelt und dann kurz in 2 · SSPE (0,36 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 2 mM EDTA) gespült wurden, bevor sie im Vakuum 2 Stunden lang zum Fixieren der DNS bei 80ºC "gebacken" wurden. Die Nitrocellulosefllter wurden dann nacheinander in einem Prähybridisierungspuffer mit 5 · SSC (0,57 M NaCl, 75 mM Natriumcitrat, pH 7,5), 5 · Denhardt's-Gemisch (0,1% Ficoll 400, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% BSA), 0,1% SDS, 100 µg/ml DNS aus Heringssperma 2 Stunden lang bei 45ºC inkubiert. Der Prähybridisierungspuffer wurde dann entfernt und frischer Puffer mit einem Gehalt an 10&sup7; cpm [³²P]- markierter Oligonukleotidprobe hinzugefügt. Die Hybridisierung wurde bei 45ºC 16 Stunden lang durchgeführt. Die radioaktive Lösung wurde entfernt und die Filter kurz zweimal bei Raumtemperatur mit 5 · SSC sowie 0,1% SDS zum Entfernen von ungebundenem Probenmaterial gespült. Die Filter wurden dann nochmals zweimal mit 5 · SSC, 0,1% SDS1 Stunde lang bei 50ºC gewaschen und im Anschluß daran mit Luft getrocknet und der Autoradiographie unterworfen.
Die Plaques enthaltenden Platten wurden mit ihren Autoradiogrammen ausgerichtet und mutmaßliche positive Plaques wurden noch zwei Reinigungszyklen auf den Platten unterzogen. Ein Klon (λ gtll-15-4-1) wurde für die exakte Überprüfung durch den Southern-Blotting-Test ausgewählt.

2) λ Charon 35 genomische Genbibliothek

Aliquote Anteile der genomischen Genbibliothek von λ Charon 35 von B. pertussis wurden auf einem Rasen von LE392 auf NZCYM-Platten mit einem Gehalt an 0,2% Maltose plattiert. Das Abheben der Plaques, die Hybridisierung und die Waschprotokolle wurden, wie beschrieben, ausgeführt. Die positiven Plaques wurden erneut zweimal auf den Platten gereinigt, wonach verschiedene Klone von λ Ch 35 111, 121, 411, 421 und 431 mittels der Southern-Blotting-Analyse überprüft wurden.

Beispiel VIII

In diesem Beispiel wird die Analyse der Genomklone erläutert.

1) Herstellung der Phagen-DNS

Es wurde 11(2 · 500 ml) der Phagenkultur hergestellt. Die Zellen LE392 oder Y1090 wurden über Nacht in einem 0,2% Maltose enthaltenden Medium kultiviert. Die Menge an 10¹&sup0;-Zellen wurde bei 4.400 g 5 Minuten lang bei 4ºC abgeschleudert und das so erhaltene Pellet in 1 ml SMG-Puffer wieder aufgeschwemmt. Der Phagenvorrat (1,2 · 108 pfu) wurde zu dem Gemisch hinzugefügt und bei 37ºC 15 Minuten lang zur Absorption des Phagen an die Zelle inkubiert. Das Gemisch aus Phagen und Zellen wurde in 500 ml Medium inokuliert und die Kultur kräftig bei 37ºC bis zum Beginn der Lyse (4 bis 4,5 Stunden) geschüttelt. Es wurden 10 ml Chloroform hinzugefügt und das Schütteln bei 37ºC für weitere 15 Minuten zur Vervollständigung der Lyse fortgesetzt. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und DNase I sowie DNase-freie RNase A (jeweils 1 µg/ml) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur hinzugesetzt. Die Zellbruchstücke wurden bei 3.500 g 20 Minuten lang pelletiert, wonach 29,2 g NaCl sowie 50 g Polyethylenglykol (PEG 6000) zu 500 ml des Überstandes hinzugefügt wurden. Die Probe wurde leicht bei Raumtemperatur zum Auflösen der Feststoffe gerührt und anschließend bei 0ºC 1 bis 2 Stunden lang zum Auswählen der Phagen inkubiert. Die Phagen wurden durch Zentrifugieren bei 4.400 g bei 4ºC 20 Minuten lang abgeerntetund anschließend in 8 ml TM-Puffer (50 mM Tris · HCl, pH 7,5, 10 mMMgSO&sub4;) wieder aufgeschwemmt. Das Extrahieren mit 8 ml Chloroform zur Entfernung des PEG's ergab einen klaren Überstand, der für einen Stufengradienten von 5% und 40% Glycerin in TM-Puffer eingesetzt und bei 154.000 g bei 4ºC eine Stunde lang abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde unter Zurücklassen eines Phagenpellets, der in 0,5 ml TM-Puffer wieder aufgeschwemmt wurde, beseitigt. Es wurde DNase I bis zu einer Menge von 5 µg/ml hinzugegeben, wobei auch ein Zusatz von RNase A bis auf 50 µg/ml erfolgte, wonach die Probe bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert wurde. Dann wurde EDTA bis zu einer Menge von 20 mM, Pronase bis zu 0,5 mg/ml sowie SDS bis zu 0,5% hinzugesetzt und die Probe weiter bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Die Probe wurde unter milden Bedingungen einmal jeweils mit Phenol, Phenol und Chloroform im Verhältnis von 1 : 1 sowie Chloroform extrahiert und die Phagen-DNS mit Ethanol ausgefällt.

2) Ergebnisse

Der von der EcoR I gtll-Bibliothek abgeleitete Klon 15-4-1 enthielt nach dem Befund anhand der Southern- Blotting-Analyse das 4,6 kb Fragment von EcoR I, welches für das vollständige TOX-Gen einschließlich der schmalen 5' und 3'-flankierenden Regionen codiert.
Die Klone λ Charon 35 sind nach dem vorliegenden Befund nahe miteinander verwandt. Einige Klone enthielten das vollständige TOX-Operon einschließlich der flankierenden Regionen in jeder Orientierung zueinander, und andere schlossen nicht die vollständige TOX-Region ein.
Die Klonkarten 15-4-1, Ch 111, Ch 121/411, Ch 431 und Ch 421 sind in der Abb. 2 dargestellt.

Beispiel IX

In diesem Beispiel wird die Konstruktion der Plasmide auf Basis von pUC erläutert, welche das Pertussistoxinoperon (TOX) oder Anteile davon enthalten.
Die Phagen-DNS aus dem Klon 15-4-1 λ gtll wurde gemäß der Beschreibung hergestellt und mit der Restriktionsendonuklease EcoR I unter Benutzung von Standardverfahren enzymatisch zerlegt. Die DNS wurde durch die Gelelektrophorese in einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Das Band 4,6 kb wurde durch die UV-Beleuchtung des mit Ethidiumbromid imprägnierten Gels identifiziert und herausgeschnitten. Die DNS wurde mittels einer Gefrier-/Auftau-Methode unter Verwendung von 0,3 M Natriumacetat bei einem pH-Wert von 7,0 extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNS aus pUC8 : 2, einem Derivat von pUC8, das zwei spezielle Orte für die Restriktion für Bgl II und Xba I an dessen Mehrfachklonierungsstelle enthielt, wurde mit EcoR I enzymatisch zerlegt. Die linearisierte DNS wurde mittels Standardmethoden unter Verwendung von alkalischer Kälberphosphatase (CAP) dephosphoryliert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.
Die Vektor-DNS von pUC8 : 2 und die TOX-DNS, die von 15-4-1 abgeleitet war, wurden nach einer Standardreaktion miteinander vereint und das Legierungsgemisch zur Transformierung kompetenter JM109- Zellen anhand von Standardverfahren weiterverwendet. Die daraus resultierenden Kolonien wurden mittels eines schnellen DNS-Ausleseverfahrens analysiert, wobei zwei Klone für die großmaßstäbliche Herstellung der Plasmid-DNS ausgewählt wurden. Diese Klone, nämlich J-I69-1 und J-169-2 unterschieden sich lediglich in der Orientierung der Einfügung von TOX. Die Konstruktion dieser Klone wird in der Abb. 3 erläutert.

Beispiel X

In diesem Beispiel wird die Sequenzierung des TOX-Operons erläutert.

1) Benutzte Klone

Der Klon J-169-1 wurde als Quelle für alle Sequenzierungsklone verwendet. Das TOX-Operon wurde in fünf annäherungsweise gleiche DNS-Segmente aufgeteilt und gemäß der Erläuterung in den Abb. 4a, b, c, d und e in M13mp18, M13mp19 oder pUC8 : 2 subkloniert.

2) Herstellung der Proben

Die M13-Klone wurden in E. coli JM101 gehalten, während die DNS zum Sequenzieren aus einzelnen Plaques auf homogenen Platten gewonnen wurde. Eine gesättigte Kultur von JM101 wurde mit frischem Medium im Verhältnis von 1 : 50 verdünnt und mit einem einzigen Plaque infiziert. Die Kultur wurde unter kräftigem Schütteln bei 37ºC 6 Stunden lang gezogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand mit einem Viertelvolumen aus 20%igem PEG 6000, 2,5 M NaCl zur Ausfällung der Phagen behandelt.
Die Suspension wurde abzentrifugiert und das Phagenpellet in TE wieder aufgeschwemmt, anschließend unter milden Bedingungen zweimal mit Phenol, Phenol und Chloroform im Verhältnis 1 : 1 und Chloroform extrahiert. Die Phagen-DNS wurde mit Natriumacetat und Ethanol ausgefällt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Die DNS wurde in sterilem Wasser bis zu einer Konzentration von etwa 1 µg/ml für die Sequenzierung wieder aufgeschwemmt.
Die Sequenzierungsprimer von annäherungsweise 17-20 Basen wurden in einer Syntheseapparatur ABI 380A für DNS unter Verwendung der Phosphoramiditchemie synthetisiert und gemäß obenstehender Beschreibung gereinigt.

3) Sequenzierung

Das Didesoxy-Kettenabbruch-(Terminations)-Verfahren nach Sänger wurde für alle Sequenzierungsreaktionen benutzt, wobei entweder die Polymerase nach Klenow oder das Enzym Sequenase T7 eingesetzt wurden.

4) Ergebnisse

Das vollständige TOX-Operon gemäß der obenstehenden Definition wurde sequenziert und das Ergebnis mit den publizierten Sequenzen verglichen. Es bestand eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit der TOX- Sequenz des Stammes BP 165, wie von Nicosia et al. berichtet wurde, jedoch mit Ausnahme von vier Basenunterschieden. Das T in der Stellung 315 in der 5'-flankierenden Region ist für den Stamm 10536 von B. pertussis ungewöhnlich. Die drei anderen Substitutionen befinden sich in der für S1 codierenden Region an den Stellen 710, 1200 und 1202, die auf zwei ungewöhnliche Aminosäuren, nämlich GLU³&sup4; und VAL¹&sup9;&sup8; hinauslaufen. Die Nukleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sind in der Abb. 5 dargestellt.

Beispiel XI

In diesem Beispiel wird die Mutagenese des TOX-Gens erläutert.

1) Benutzte Klone

Für die Mutationen in dem Gen S1 wurde der Klon 52403 (M13mp18/S1) benutzt, wogegen für die Mutationen in dem Gen S3 der Klon S-2664-5-6 (M13mp18/S3[c]) verwendet wurde. Diese Klone sind in der Abb. 4 dargestellt.

2) Protokoll der Mutagenese

Aus Phagenvorräten, die von einzelnen Plaques auf homogenen Platten gemäß der obenstehenden Beschreibung abgeleitet waren, wurde einsträngige DNS hergestellt. Die mutagenen Primer von geeigneter Sequenz und Länge wurden auf dem DNS-Syntheseapparat ABI 380A synthetisiert.
Für die Mutagenese in vitro wurden handelsübliche Reagentienbestecke benutzt, die auf dem Phosphorthioat-Verfahren beruhen, das von Eckstein entwickelt wurde. Kurz gesagt, das mutagene Oligonukleotid wurde zur einsträngigen Matrize (template) (Wildtyp) vereinigt, wobei die Polymerisierung unter Verwendung von Substraten in Form eines Phosphorthioat-dCTP-Analogons und natürlichem dATP, dGTP und dTTP ausgeführt wurde. Bei der doppelsträngigen DNS wurden die Nukleotid-Phosphordiesterbindungen durch Nci I gespalten ("nicked"), während der native Strang mit der Exonuklease III über den Mutationspunkt hinaus enzymatisch zerlegt wurde. Der Komplementärstrang wurde gegen das Aufspalten dieser Nukleotidbindungen durch Nci I mit Phosphorthioatgruppen geschützt. Der Komplementärstrang diente im Anschluß daran als Matrize (template) in einem zweiten Polymerisationszyklus zur Darstellung der doppelsträngigen DNS mit der Mutation in beiden Strängen. Diese DNS wurde in E. coli vermehrt und die Mutation durch Sequenzierung bestätigt.
Es wurden 35 Primärmutationen erzeugt, wobei 14 zusätzliche durch die Konstruktion von deren Kreuzungen untereinander hergeleitet wurden. Die Effizienz der Mutation variierte mit dem gewünschten Austausch. Es wurden eine Abänderung von 1 bis 6 Basen und Eliminierungen von bis zu 15 aufeinanderfolgenden Basen erreicht. Die Austauschraten der erhaltenen Aminosäureauswechselungen sind in der Tabelle 1a zusammengefaßt.

Beispiel XII

In diesem Beispiel wird die Konstruktion von Plasmiden zur Expression von mutierten TOX-Genen in B. parapertussis sowie die Charakterisierung der produzierten PT-Analoga beschrieben.

1) Replizierende Plasmide

Für die Rekonstruktion des TOX-Operons, das die gewünschte Mutation in pRK404 enthielt, wurde die replizierende Form der DNS aus M13-Klonen benutzt. Das Plasmid pRK404 stellt ein Derivat von pRK290 dar, ein konjugierendes Plasmid der Familie pRK2 der Inkompatibilitätsgruppe P-1. Seine Größe beträgt 10,6 kb und weist ein Tetracyclinresistenzgen (TetR) sowie eine Mehrfachklonierungsstelle aus pUC8 auf. In der Abb. 6 werden die Konstruktionsschemata für das Wiedereinfügen der S1- und S3-Primärmutationen in das Operon dargestellt, wobei die daraus entstandenen Klone in der a wiedergegeben sind. Die Kreuzmutationen in S1 wurden unter Verwendung von internen Restriktionsorten, in spezieller Weise die ungewöhnliche Sal I-Stelle erzeugt. Ein allgemeines Schema für die Kreuzmutationen in S1 wird auch in der Abb. 6 gezeigt, wobei die daraus resultierenden Klone in der Tabelle 1a wiedergegeben sind.

2) Suizidplasmide

Ein konjugierendes, aber nicht replizierendes Plasmid wurde für die randomisierte Integrierung von TOX oder von mutiertem TOX in das Chromosom der Bordetella-Art entwickelt. Die Abb. 7 zeigt die Konstruktion dieser Klone.
In B. pertussis wurden Plasmide der in (1) und (2) oben beschriebenen Typen durch Konjugation eingeschleust. Die daraus erhaltenen Stämme wurden in Schüttelflaschen oder in einem Fermenter kultiviert und der Überstand der Kultur im Hinblick auf die Konzentration des Toxin-Analogons mittels ELISA überprüft, wie folgt:
Es wurden Mikrotiterplatten mit Fetuin (2 µg/ml) in 0,05 M Kaliumkarbonat, pH 9,6 bei 4ºC über Nacht in einer feuchten Umgebung überzogen. Die Platten wurden anschließend zweimal mit Delbecco's PBS mit einem Gehalt an 0,1 Gew./Vol. Tween-20 gewaschen und dann getrocknet. Proben des Überstands oder des PT vom Wildtyp wurden reihenweise verdünnt und in den Mulden hinzugefügt, wonach die Platten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und im Anschluß daran gewaschen wurden. Gebundenes PT wurde unter Verwendung von peroxidasekonjugierten, affinitätsgereinigten Anti-PT-Antikörpern vom Kaninchen nachgewiesen.
Die Resttoxizität wurde durch den Zellverklumpungstest CHO zur Bestimmung der Toxizität im Verhältnis zum nativen PT gemessen. Bestimmte PT-Mutanten wurden, wie in bezug auf das native PT im Beispiel 1, gereinigt und deren ADP-Ribosyltransferase-Aktivität ausgetestet. Diese Werte sind in der Tabelle 1b zusammengefaßt. Die Expression des Epitops S1, das vermittels MAb PS21 erkannt war, wurde durch einen modifizierten, indirekten ELISA-Test auf dem jeweiligen Kulturüberstand bestimmt. Die fetuingebundenen PT-Analogen wurden mit PS21 als erstem Antikörper zur Reaktion gebracht und durch einen enzymkonjugierten, affinitätsgereinigten Ziegen-/Anti-Maus-IgG als dem zweiten Antikörper sichtbar gemacht. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Epitops S1, das vermittels MAb PS21 erkannt war, sind aus der Tabelle 1b ersichtlich.

Beispiel XIII

In diesem Beispiel wird die Konstruktion von Plasmiden zum Entfernen und Ersatz des endogenen TOX- Operons von B. pertussis erläutert.

I) TOX-flankierende Regionen enthaltende Plasmide

a) 5'-flankierende Region

Die DNS λ Charon 421 wurde zuerst mit Bgl II enzymatisch zerlegt, und ein Fragment 11 kb wurde durch die Agarosegelelektrophorese gereinigt. Das Fragment Bgl II wurde mit Xma I enzymatisch zerlegt und das zuvor mit Xma I gekürzte und dephosphorylierte Band 5 kb in pUC8 : 2 subkloniert. Die Zellen JM109 wurden mit dem Legierungsgemisch zum Erhalt von Kolonien transformiert, die durch die schnelle DNS-Auslesemethode analysiert wurden. Der Klon E. coli J-183-9 enthielt nach dem Befund annäherungsweise 2,9 kb der 5'-flankierenden Region, den TOX-Promotor und die Gene für die Untereinheiten S1 und S2. Die Abb. 8a stellt die Herleitung aus dem Klon J-183-9 dar.

b) 3'-flankierende Region

Die DNS Ch 111 wurde mit Sal I enzymatisch zerlegt, während ein DNS-Fragment von B. pertussis mit annäherungsweise 8 kb über Gel gereinigt wurde. Dieses DNS-Fragment wurde in das zuvor mit Sal I enzymatisch zerlegte und dephosphorylierte pUC8 : 2 eingefügt. Die Transformanten JM109 wurden ausgelesen, wobei der Klon J-219-111-3 nach der Identifizierung einen Teil des S1-Gens, alle verbleibenden Strukturgene und etwa 3,9 kb der 3'-flankierenden Region enthielt. Die Abb. 8b stellt die Konstruktion dieses Klones dar.

c) TOX-Gen mit 5'- und 3'-flankierenden Regionen

Der Klon J-183-9 wurde mit Xba I enzymatisch zerlegt, während das Fragment von annäherungsweise 7 kb mit pUC8 : 2, der 5'-flankierenden Region und der Promotorregion des Gens S1 über Gen gereinigt und dephosporiliert wurde. Die DNS J-219-111-3 wurde mit Xba I enzymatisch zerlegt, während das Fragment mit annäherungsweise 8 kb, welches die Strukturgene für die Untereinheiten S2 bis S5 und die 3'-flankierenden Regionen enthielt, über Gel gereinigt wurde. Diese DNS-Fragmente wurden (ligiert) vereinigt und die JM109- Transformanten zur Gewinnung des Klons J-229-17 ausgelesen. Dieser Klon enthält etwa 2,9 kb an 5'-flankierender Sequenz, das vollständige TOX-Operon und etwa 4 kb der 3'-flankierenden Sequenz. Dessen Konstruktion wird durch die Abb. 8c erläutert.

2) TOX entfernende Plasmide

Das Plasmid S-2832-5 enthält das TetR-Gen aus dem Plasmid pRK404, dessen Konstruktion in der Abb. 9 dargestellt ist. Das TetR-Gen wurde als Restriktionsfragment EcoR I/BamH I in das Plasmid pN01523 zur Gewinnung von pGZ62 kloniert. Das Plasmid pGZ63 enthält die 5'- und 3'- flankierenden Regionen ohne irgendwelche störende DNS. Das Gen-Sandwich S12-TetR aus pGZ62 wurde zwischen die flankierenden Regionen von pGZ63 zur Gewinnung des Plasmids pGZ65 kloniert. Die Konstruktion dieser Plasmide ist in der Abb. 9 zusammengefaßt.

3) Plasmide zur Wiedereinfügung von TOX

Zur Expression mutierter TOX-Gene in TOX&supmin;-Stämmen von B. pertussis wurden konjugierende Suizid-Plasmide des Typs konstruiert, wie er in der Abb. 10 dargestellt ist. Diese enthalten das TOX-Gen, ausgedehnte 5'- und 3'-flankierende Sequenzen und besitzen ein TetR-Gen für die selektierende Klonierung abwärts von den TOX-codierenden Regionen.

Beispiel XIV

Dieses Beispiel erläutert die Entnahme des TOX-Gens aus dem Chromosom von B. pertussis und seine Wiedereinfügung in TOX-Gene, die in vitro mutiert wurden.

1) Transformation von B. pertussis

Durch Elektroporation wurden Stämme von B. pertussis transformiert. Die Zellen wurden in 100 ml des modifizierten Stainer-Scholte-Mediums bis zu einer Dichte von etwa 10&sup9;-Zellen pro ml kultiviert, in einer klinischen Zentrifuge (4.000 g für eine Zeitdauer von 15 Minuten bei 20ºC) abgeerntet, in 25 ml Elektroporationspuffer (0,3 M Saccharose, 1 mM MgCl&sub2;, 7 mM Kaliumphosphat, pH 7,2) gewaschen und in 10 ml der gleichen Flüssigkeit wieder aufgeschwemmt. Die Plasmid-DNS wurde zu 500 µl Zellsuspension hinzugefügt und das Gemisch auf Eis 10 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden einem einfachen Spannungsimpuls von 25 kV/cm, 40 µs bei einem exponentiellen Abfall mit dem Gerät BTX-Transfector 100 unter Verwendung einer Küvetten-Elektrode mit einem Abstand von 0,8 mm unterworfen. Es wurden 3 ml des Mediums hinzugefügt und die Zellen unter Schütteln bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 12.000 g für eine Zeitdauer von 2 Minuten abgeerntet, in 100 µl Medium wieder aufgeschwemmt, auf eine Bordet-Gengou-Platte unter Selektieren mit einem Antibiotikum ausgebreitet und 2 bis 5 Tage lang bei 37ºC inkubiert.

a) Freisetzen und Ersatz des TOX-Operons

B. pertussis str29 stellt ein spontanes streptomycinresistentes Derivat rpsL von B. pertussis 10536 dar. Das Plasmid pGZ65 enthält eine Gen-"Kartusche", die aus dem TetR-Gen pRK404 und dem Gen S12 von E. coli besteht, wobei die Klonierung zwischen den 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen des TOX-Operons stattfand. Dieses Plasmid wurde mit Hind III linearisiert und zur Transformierung von B. pertussis str29 zu TetR verwendet, wobei StrS auf den Ausstoß des TOX-Operons durch die homologe Rekombination hinausläuft. Dieser Stamm, bei dem TOX entfernt war, wurde als 29-8 bestimmt. Zum Ausschneiden der Gen-"Kartusche" S12-TetR wurde der Stamm 29-8 im Anschluß daran mit linearer Plasmid-DNS von pGZ63 transformiert. Das Plasmid pGZ63 besteht aus den TOX-5'- und 3'-flankierenden Sequenzen, enthält jedoch keine störende DNS. Die Transformation mit diesem Plasmid mündete in die Erzeugung von B. pertussis 29-9, welcher einen streptomycinresistenten Stamm darstellt, bei dem das TOX entfernt war; dieser enthält jedoch keine heterologe DNS, die an dem TOX-Ort eingesetzt worden wäre. Dieser Stamm wurde als der Wirt für die Expression von TOX-Genen verwendet, die in vitro mutiert waren. Die Plasmide des in der Abb. 10 gezeigten Typs enthalten eine Gen-Kartusche, die aus einem mutierten TOX-Gen und einem TetR-Gen besteht. Diese Gen-"Kartusche" wurde in das Chromosom vom B. pertussis 29-9 rekombiniert, nachdem das Plasmid in den Stamm durch Konjugation oder Transformation eingeführt worden war. Die Expression des TOX-Gens, die Toxizität der PT- Analoga und die Beibehaltung des Epitops S1, das vermittels MAb PS21 erkannt war, wurden gemäß der obenstehenden Beschreibung bestimmt. In der Tabelle 5 sind die konstruierten rekombinanten Stämme von B. pertussis und die Eigenschaften der ausgeschiedenen PT-Analoga dargestellt.

Beispiel XV

In diesem Beispiel wird die in vivo-Austestung der PT-Mutanten an Mäusen beschrieben.
Die PT-Mutanten wurden aus dem Kulturüberstand und den rekombinanten Stämmen vom B. parapertussis gemäß Beschreibung in dem Beispiel I gereinigt. Diese Proteine wurden den Mäusen in drei verschiedenen Dosierungen zur Austestung der folgenden Merkmale mittels Standardtechniken infiziert: akute Toxizität, Histaminsensibilisierungsaktivität und Wirkpotenz bei dem intrazerebralen Provokationstest bei der Maus. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 wiedergegeben.
Zur Austestung von deren Immonogenizität wurden die PT-Analoga in weibliche BALB/C-Mäuse mit einem Alter von 9 bis 11 Wochen in einer Dosierung von jeweils 2,0 und 0,5 und 0,125 µg injiziert. Am Tag 0 wurde den Mäusen Blut abgenommen und sie wurden immunisiert. Am Tag 23 wurden den Mäusen wiederum Blut entnommen und sie wurden mit demselben Immunogen in kleinen Mengen aufgefrischt ("boosted"), wonach am Tag 37 den Mäusen nochmals Blut entnommen wurde. Die Blutproben (0,4-0,5 ml/Maus) wurden durch orbitale Sinusblutentnahme gesammelt und die erhaltenen Seren bei -20ºC bis zur Durchführung der Untersuchungen aufbewahrt. Die Seren wurden auf deren Fähigkeit zur Neutralisierung mittels des CHO-Zellverklumpungstestes aufgrund der Induktion durch PT untersucht (Tabelle 3), wobei zur Untersuchung der spezifischen Antikörperantworten bei dem Ziegenantigen der indirekte ELISA-Test (Tabelle 4) verwendet wurde. Wie aus den Tabellen 3 und 4 ersichtlich ist, sind die PT-Analoga zur Induktion der neutralisierenden Antikörper und Antworten auf die oligomere Anti-PT, Anti-S1 und Anti-B befähigt.
Zusammengefaßt gesagt, wird durch die vorliegende Offenbarung erfindungsgemäß ein neues Verfahren zur Entgiftung von Pertussis durch die Identifizierung spezifischer funktioneller Stellen am Pertussistoxin und die Produktion rekombinanter Holotoxine durch die ortsspezifische Mutagenese des Toxingens geschaffen. Die so erhältlichen Toxinanaloga werden entgiftet, behalten das immundominante Epitop S1 bei, sind immunogen und stellen einen Schutz gegen die Keuchhustenerkrankung dar. Entsprechende Abänderungen sind innerhalb des erfindungsgemäßen Schutzumfanges möglich. TABELLE 1a Zusammenfassung der in das Pertussistoxin eingeführten Mutationen Mutations-Nr. Mutation Klon-Nr. TABELLE 1a (Fortsetzung) Mutations-Nr. Mutation Klon-Nr.
Die Aminosäurenumerierung entspricht den Stellungen in den nativen Untereinheiten (Abb. 5).
Alle Mutationen sind in der Untereinheit S1, wenn nicht als in S3 (S3) spezifiziert.
II bezeichnet die Verwendung eines alternativen Codons.
Δ bezeichnet einen oder mehrere entnommene Reste.
Der Wildtypus bezieht sich auf PT, das von dem nichtmutierten TOX-Operon in B. parapertussis exprimiert wurde. TABELLE 1b In vitro-Charakterisierung der Pertussistoxin-Analoga, die aus rekombinantem B. parapertussis gewonnen wurden Mutations-Nummer Rest-Toxizität ADPR-Aktivität Epitop S1 TABELLE 1b (Fortsetzung) Mutations-Nummer Rest-Toxizität ADPR-Aktivität Epitop S1
Die Resttoxizität stellt das Verhältnis der offenbaren PT-Konzentration, die durch den CHO-Zellverklumpungstest bestimmt wurde, zur tatsächlichen Konzentration an PT-Mutanten, gemessen durch ELISA, ausgedrückt in Prozenten, dar.
Die ADPR-Aktivität stellt das Ausmaß der ADP-Ribosylierung von Rinder-Transducin dar, das durch ein PT-Analogon katalysiert wurde, und zwar in Relation zu jenem, das durch die gleiche Konzentration an PT vom Wildtyp katalysiert wurde, ausgedrückt in Prozenten.
Das Epitop S1 bezieht sich auf die Expression eines immundominanten Epitops S1, das durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper PS21 erkannt war, und zwar im Vergleich zum PT vom Wildtyp (+++++).
ND bedeutet: nicht bestimmt. Tabelle 2 Biologische Aktivität von PT-Mutanten bei Mäusen Analog Akute Toxizität LD&sub5;&sub0; (µg) HS-Aktivität M.P.T.
Die HS-Aktivität bezeichnet die histaminsensibilisierende Aktivität.
M.P.T. bedeutet den intrazerebralen provozierenden Schutztest bei der Maus.
LD&sub5;&sub0; stellt die Dosis dar, die zum Tod von 50% der Versuchstiere führt.
ED&sub5;&sub0; stellt die Dosis dar, welche zum Schutz von 50% der Versuchstiere führt.
"Nativ" bezeichnet das PT aus B. pertussis 10536. Tabelle 3 Neutralisierungseffekt der Immunseren bei dem PT-induzierten CHO-Zellverklumpungstest Analogon Dosis (µg) Blutentnahme Blutentnahme danach Nr. 1 Nr. 2 Kochsalzlösung
Den Mäusen wurde Blut abgenommen, wonach ihre Immunisierung am Tage 0 erfolgte. Am Tag 23 wurde ihnen nochmals Blut entnommen (Blutentnahme danach: Nr. 1) und sie wurden mit dem Immunogen (zur Erzielung des Boostereffekts) behandelt. Die endgültigen Seren wurden am Tage 37 (Blutentnahme danach Nr. 2) gewonnen.
Die neutralisierende Fähigkeit der Seren ist als die maximale Verdünnung zum Ausdruck gebracht, bei der die PT-induzierte CHO-Zellverklumpung gehemmt wurde. TABELLE 4 Spezielle Antikörpertiter der Immunseren Analogon Dosis (µg) vorherige Blutentnahme Blutentnahme danach Nr. 1 Nr. 2 Kochsalzlösung
Die Immunisierung und die Blutentnahme wurden gemäß Beschreibung in Tabelle 3 vorgenommen.
Die benutzten Antigene waren das PT-Holotoxin, die isolierte Untereinheit S1 und das isolierte Oligomer B.
Die Einheiten stellen den Verdünnungsfaktor dar, der durch 1000 geteilt wurde, so daß ein ELISA- Absorptionswert erhalten wird, der gleich dem zweifachen des Hintergrundes ist.
NR bezeichnet: keine Reaktion mit dem Antigen. TABELLE 5 Die in vitro-Charakterisierung der Pertussistoxin-Analoga aus rekombinantem B. pertussis Mutations-Nummer Klon Rest-Toxizität ADPR-Aktivität Epitop S1
Alle Ausdrücke entsprechen den in den Tabellen 1a und 1b gegebenen Definitionen.
ND bezeichnet: nicht bestimmt.

Claims

1. Mutantenpertussisholotoxin, erhalten durch die Expression eines TOX-Operons, das für das Holotoxin codiert, welch ersteres durch die ortsspezifische (site-directed) Mutagenese wenigstens eines Codons, das mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich mindestens einer aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens einer funktionellen Aminosäure und die genetische Entgiftung des Holotoxins bis auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften zu bewirken.

2. Mutantenholotoxin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige Aminosäure in dem nativen Pertussisholotoxin entfernt oder ausgetauscht wird.

3. Mutantenholotoxin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die einzige Aminosäure (S1) GLU¹²&sup9; darstellt und entfernt wird oder durch (S1) GLY¹²&sup9; ersetzt wird.

4. Mutantenholotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Resttoxizität weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins beträgt.

5. Mutantenholotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mutant eine herabgesetzte Histaminsensibilisierungswirknng besitzt.

6. Impfstoff gegen Keuchhusten, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Mutantenholotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.

7. Verfahren zur Herstellung eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutanten vom Pertussisholotoxin, durch die folgenden Schritte gekennzeichnet: (a) Identifizieren mindestens eines Restes einer funktionellen Aminosäure des Toxins, der für sich alleine oder zusammen dem Holotoxin die Toxizität verleiht; (b) Bewerkstelligen der ortsspezifischen (site-directed) Mutagenese zum Entfernen oder Austausch einer Nukleotidsequenz, die für mindestens diesen einen Aminosäurerest einschließlich mindestens einer aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; codiert sowie zur Produktion eines mutierten TOX-Operons; (c) Einbauen des mutierten TOX-Operons in einen Bordetella-Organismus zur Produktion eines transformierten Organismus; sowie (d) Kultivieren des transformierten Organismus zur Produktion von genetisch entgiftetem Holotoxin mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften in Abwesenheit von Toxin des Wildtypus.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die entfernte oder ausgetauschte Nukleotidsequenz für eine einzelne Aminosäure in dem nativen Pertussisholotoxin codiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die einzige Aminosäure (S1) GLU¹²&sup9; darstellt und entfernt oder durch (S1) GLY¹²&sup9; ersetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die entfernte oder ausgetauschte Nukleotidsequenz für mehrere Aminosäuren in dem nativen Pertussisholotoxin codiert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das genetisch entgiftete Holotoxin eine Resttoxizität von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins aufweist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das genetisch entgiftete Holotoxin eine herabgesetzte Histaminsensibilierungswirkung besitzt.

13. TOX-Operon, das für ein Mutantenpertussisholotoxin codiert, wobei dieses TOX-Operon durch die ortsspezifische (site-directed) Mutagenese mindestens eines Codons mutiert wurde, das für mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich wenigstens einer aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens einer funktionellen Aminosäure und die genetische Entgiftung des Holotoxins bis auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften zu bewirken.

14. TOX-Operon nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige Aminosäure in dem nativen Pertussesholotoxin entfernt oder ausgetauscht ist.

15. TOX-Operon nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die einzige Aminosäure (S1) GLU¹²&sup9; darstellt und entfernt oder durch (S1) GLY¹²&sup9; ersetzt ist.

16. TOX-Operon nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Aminosäuren in dem nativen Pertussisholotoxin entfernt oder ausgetauscht sind.

17. TOX-Operon nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Resttoxizität des codierten Mutantenholotoxins von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins zu verzeichnen ist.

18. TOX-Operon nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutantenholotoxin eine herabgesetzte Histaminsensibilisierungswirkung besitzt.

19. Bordetella-Stamm, dadurch gekennzeichnet, daß er ein mutiertes TOX-Operon aufweist, das durch die ortsspezifische (site-directed) Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens einer Nukleotidsequenz gebildet wurde, die für mindestens eine funktionelle Aminosäure einschließlich mindestens einer aus (S1) ARG&sup9;, ARG¹³ und GLU¹²&sup9; innerhalb des nativen Pertussisholotoxins codiert, um das Entfernen oder den Austausch mindestens der einen funktionellen Aminosäure zu erzielen, sowie dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Fähigkeit der Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Pertussisholotoxinmutanten mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger in Abwesenheit des Toxins vom Wildtypus besitzt.

20. Stamm nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine einzige Aminosäure in dem nativen Pertussesholotoxin entfernt oder ausgetauscht ist.

21. Stamm nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die einzige Aminosäure (S1) GLU¹²&sup9; darstellt und entfernt oder durch (S1) GLY¹²&sup9; ersetzt ist.

22. Stamm nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Aminosäuren in dem nativen Pertussisholotoxin entfernt oder ausgetauscht sind.

23. Stamm nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß er die Fältigkeit der Expression eines immunoprotektiven genetisch entgifteten Mutanten von Pertussisholotoxin mit einer Resttoxizität von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins besitzt.

24. Stamm nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm die Fähigkeit zur Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutanten vom Pertussisholotoxin mit herabgesetzter Histaminsensibilisierungswirkung besitzt.

25. Mutantenpertussisholotoxin, das durch ein TOX-Operon codiert worden ist, das durch eine ortsspezifische Mutagenese von mindestens zwei Codons mutiert wurde, wobei jedes dieser Codons eine funktionelle Aminosäure innerhalb des nativen Pertussisholotoxins zur Entfernung oder zum Austausch von mindestens zwei dieser funktionellen Aminosäuren zur genetischen Entgiftung des Holotoxins auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften codiert.

26. Mutantenholotoxin nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Aminosäuren (S1) GLU¹²&sup9; TYR¹³&sup0; darstellen und durch (S1) GLY¹²&sup9; PHE¹³&sup0; ausgetauscht sind, oder (S1) GLU¹²&sup9;/(S3) TYR&sup9;²LYS&sup9;³ sind und durch (S1) GLY¹²&sup9; (S3) ASN&sup9;²ARG&sup9;³ ausgetauscht sind.

27. Mutantenholotoxin nach Anspruch 25 oder 26, gekennzeichnet durch eine Resttoxizität von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins.

28. Mutantenholotoxin nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Mutant eine herabgesetzte Histaminsensibilisierungswirkung besitzt.

29. Impfstoff gegen Keuchhusten, gekennzeichnet durch ein Mutantenholotoxin nach einem der Ansprüche 25 bis 28 oder ein Toxoid davon sowie einen physiologisch akzeptablen Träger hierfür.

30. Konjugatvakzine, gekennzeichnet durch ein aktives Konjugat mit einem Mutantenholotoxin nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 25 bis 28, das mit einem Hapten, Polysaccharid oder Polypeptid zur Provokation einer Immunantwort auf einen antigenen Determinanten des Haptens, Polysaccharids oder Polypeptids konjugiert ist.

31. Verfahren zur Herstellung eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutantenpertussisholotoxins, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Identifizieren mindestens zweier Aminosäurereste des Toxins, die alleine oder zusammen dem Holotoxin die Toxizität verleihen; (b) Durchführen der ortsspezifischen Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens zweier Codons, wobei diese jeweils für eine funktionelle Aminosäure innerhalb des nativen Pertussisholotoxins zum Entfernen oder dem Austausch mindestens zweier funktioneller Aminosäuren und zur Produktion eines mutierten TOX-Operons codieren; (c) Einführen des mutierten TOX-Operons in einen TOX-Bordetella-Organismus zur Gewinnung eines transformierten Organismus; sowie (d) Kultivieren des transformierten Organismus zur Gewinnung von genetisch entgiftetem Holotoxin mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften in Abwesenheit von Toxin des Wildtypus.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Aminosäuren (S1) GLU¹²&sup9; TYR¹³&sup0; darstellen und durch (S1) GLY¹²&sup9; PHE130 ausgetauscht sind, oder (S1) GLU¹²&sup9;/(S3) TYR&sup9;²LYS&sup9;³ sind und durch (S1) GLY¹²&sup9; (S3) ASN&sup9;²ARG&sup9;³ ersetzt sind.

33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß das genetisch entgiftete Holotoxin eine Resttoxizität von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins besitzt.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß das genetisch entgiftete Holotoxin eine herabgesetzte Histaminsensibilisierungswirkung besitzt.

35. TOX-Operon, das für ein Mutantenpertussisholotoxin codiert, wobei das TOX-Operon durch die ortsspezifische Mutagenese von mindestens zwei Codons mutiert wurde, welche jeweils eine funktionelle Aminosäure innerhalb des nativen Pertussisholotoxins zum Entfernen oder Austausch dieser mindestens zwei funktionellen Aminosäuren und zur genetischen Entgiftung des Holotoxins bis auf eine Resttoxizität von 1% oder weniger unter Beibehaltung der immunoprotektiven Eigenschaften codieren.

36. TOX-Operon nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Aminosäuren (S1) GLU¹²&sup9; TYR¹³&sup0; darstellen und durch (S1) GLY¹²&sup9; PHE130 ersetzt wurden, oder (S1) GLU¹²&sup9;/(S3) TYR&sup9;²LYS&sup9;³ darstellen und durch (S1) GLY¹²&sup9; (S3) ASN&sup9;²ARG&sup9;³ ersetzt sind.

37. TOX-Operon nach Anspruch 35 oder 36, gekennzeichnet durch eine Resttoxizität des codierten Mutantenholotoxins von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins.

38. TOX-Operon nach einem der Ansprüche 35 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß das codierte Mutantenholotoxin eine herabgesetzte Histaminsensibilisierungswirkung besitzt.

39. Bordetella-Stamm, dadurch gekennzeichnet, daß er ein mutiertes Toxinoperon aufweist, das durch die ortsspezifische Mutagenese zum Entfernen oder Austausch mindestens zweier Nukleotidsequenzen gebildet ist, die für einen funktionellen Aminosäurerest innerhalb des Pertussisholotoxins zum Entfernen oder Austausch mindestens zweier funktioneller Aminosäuren codieren, welcher ferner noch dadurch gekennzeichnet ist, daß er die Fähigkeit zur Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutantenpertussisholotoxins mit einer Resttoxizität von 1% oder weniger in Abwesenheit des Toxins vom Wildtypus aufweist.

40. Stamm nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Aminosäuren (S1) GLU¹²&sup9; TYR¹³&sup0; darstellen und durch (S1) GLY¹²&sup9; PHE¹³&sup0; ausgetauscht sind, oder (S1) GLU¹²&sup9;/(S3) TYR&sup9;²LYS&sup9;³ darstellen und durch (S1) GLY¹²&sup9; (S3) ASN&sup9;²ARG&sup9;³ ersetzt sind.

41. Stamm nach Anspruch 39 oder 40, gekennzeichnet durch die Fähigkeit zur Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutantenpertussisholotoxins mit einer Resttoxizität von weniger als etwa 0,5% im Vergleich zur Toxizität des nativen Toxins.

42. Stamm nach einem der Ansprüche 39 bis 41, gekennzeichnet durch die Fähigkeit zur Expression eines immunoprotektiven, genetisch entgifteten Mutantenpertussisholotoxins mit einer herabgesetzten Histaminsensibilisierungswirkung.