DE69416673T2

DE69416673T2 - Kontakt-vermitteltes hämolysin regulator

Info

Publication number: DE69416673T2
Application number: DE69416673T
Authority: DE
Inventors: C. Harold King; Mundayoor Sathish; Thomas M. Shinnick
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Government of the United States of America
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Government of the United States of America
Priority date: 1993-05-24
Filing date: 1994-05-24
Publication date: 1999-09-16
Anticipated expiration: 2014-05-25
Also published as: EP0700440A1; ATE176927T1; AU7045294A; AU684798B2; EP0700440B1; WO1994028137A1; CA2163438A1; DE69416673D1; US5731151A; JPH09501308A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, die ein Hämolysin-Protein kodiert, sowie eine Nukleinsäure, die einen positiven Regulator der Hämolyse kodiert.

STAND DER TECHNIK

Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation sind gegenwärtig oder waren schon einmal weltweit über 2 Milliarden Menschen mit Mycobacterium tuberculosis infiziert, und Tuberkulose verursacht jährlich über 3,5 Millionen Todesfälle (1). Die Epidemie des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) hat den epidemiologischen Stand der Tuberkulose verschlimmert (2), und ein beachtlicher Teil der neuerlichen Zunahme der Tuberkulosefälle in entwickelten Ländern kann auf die gesteigerte Anfälligkeit der AIDS-Patienten für diese Krankheit zurückgeführt werden (3). M. tuberculosis ist ein intrazelluläres Pathogen, das sich innerhalb der Zellen des Immunsystems des Wirtes und in erster Linie in den Makrophagen vermehrt (4). Man vermutet, daß die Aufnahme des Bazillus in die Makrophagen durch den Bestandteil des Komplementsystems C3 und den Komplement-Rezeptor vermittelt wird (5). Nach dem Eindringen in die Zelle hemmt M. tuberculosis die Fusion von Phagosomen und Lysosomen (6, 7) und die Acidifizierung des Phagosoms (8). M. tuberculosis vermehrt sich dann in der nichtfusionierten Vakuole (9). Schließlich lösen sich die mit Bazillen schwer befrachteten Makrophagen auf und setzen die Bazillen frei. Studien über andere bakterielle Pathogene haben gezeigt, daß lösliche und membrangebundene Zytolysine wichtige Virulenzfaktoren darstellen. Beispielsweise sind alpha-Hämolysin exprimierende Stämme von Escherichia coli in Tiermodellen zehnmal bis tausendmal virulenter als Stämme, die kein alpha-Hämolysin enthalten (10). In ähnlicher Weise zeigen Stämme von Bordetella pertussis, die kein Adenylatcyclase/Hämolysin aufweisen, eine verminderte Virulenz in Mausmodellen (11); dieser Phänotyp kann jedoch durch Komplementation in trans mit einem das Adenylatcyclase/Hämolysin exprimierenden Plasmid umgekehrt werden (12). Zytolysine spielen ebenfalls eine wichtige Rolle hinsichtlich der Fähigkeit von intrazellulären bakteriellen Pathogenen, in die Wirtszellen einzudringen, sich dort zu replizieren und die Zellen zu verlassen (13, 14, 15). Das lösliche Zytolysin von Listeria monocytogenes, Listeriolysin-O, wird für das intrazelluläre Wachstum dieses Organismus in Makrophagen benötigt (16, 17, 18). Die Expression von Listeriolysin-O in Bacillus subtilis ermöglicht es diesem nicht-pathogenen Organismus, aus dem Phagosom auszubrechen und sich innerhalb der Makrophagen zu vermehren (19). Ein membrangebundenes Zytolysin wird mit dem Ausbruch aus den Phagosomen und dem intrazellulären Wachstum von Shigella flexneri in Verbindung gebracht (20), und vor kurzem wurde gezeigt, daß das Zytolysin von Shigella, nicht aber das Zytolysin von Listeria, den Zelltod der Makrophagen durch Apoptose induziert (21). Die hämolytische Aktivität von M. tuberculosis ist jedoch bisher nicht untersucht worden, und zwar zum Teil aufgrund einzigartiger Schwierigkeiten bei der Kultivierung dieser Zellen. Insbesondere setzen diese Organismen organische Moleküle frei, die im Kulturmedium verbleiben und die Bildung von Zellklumpen herbeiführen; ein Phänomen, das den Wissenschaftlern auf diesem Gebiet bekannt ist. Hämolyse-Tests mit diesem Organismus wären daher in der Praxis schwierig. Ferner ist ein Zusammenhang zwischen Hämolysinen und Virulenz von M. tuberculosis in der Literatur bisher nicht beschrieben worden.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der grundlegenden und unerwarteten Entdeckung, daß virulente Stämme von M, tuberculosis, anders als avirulente Stämme, hämolytische Aktivität besitzen. Diese Entdeckung wird zu dem seit langem erwarteten Verständnis des Infektionsmechanismus dieses Organismus beitragen und dabei helfen, entscheidende Mittel zur Behandlung und Vorbeugung der Infektion mit M. tuberculosis und zur Vermeidung der von diesem Organismus verursachten Todesfälle bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung beruht ebenfalls auf der Entdeckung eines Gens von E. coli, das nach seiner Einbau in einen von mehreren unterschiedlichen bakteriellen Organismen die Hämolyse reguliert. Dieses Gen kann daher dazu verwendet werden, Impfstämme gegen M. tuberculosis bereitzustellen, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit, eine zellvermittelte Immunität hervorzurufen, stark verbessert sind. Angesichts der großen Anzahl an mit M. tuberculosis infizierten Menschen und der vernichtenden Wirkungen der Infektion besteht ein starker Bedarf an derartigen Impfstoffen. Die bisherigen Impfstoffe, wie etwa der Stamm M. bovis BCG, erreichten nur einen begrenzten Erfolg, weil der Schutz gegen Tuberkulose nach der Impfung mit der Zeit abnimmt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte doppelstrangige Nukleinsäure bereit, die die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz umfaßt. Diese Sequenz stellt einen von E. coli stammenden Hämolysin-Regulator dar. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein von der vorstehenden Nukleinsäure kodiertes Protein oder einen biologisch aktiven Teil desselben bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Impfstoff bereit, der einen Wirt mit einem Vektor umfaßt, der eine isolierte doppelsträngige Nukleinsäure beinhaltet, die die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz umfaßt.
Von der jetzigen Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zum Fördern einer Immunantwort gegen Mycobacterium tuberculosis in einer Person bereitgestellt, welches das Verabreichen eines geeigneten Wirtes, beispielsweise M. bovis BCG oder M. smegmatis, an eine Person umfaßt, wobei der Wirt einen Vektor enthält, der eine isolierte doppelstrangige Nukleinsäure beinhaltet, die die in SEQ (D NO: 2 angegebenen kodierenden Sequenzen umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen der immunogenen Wirkungen eines Impfstoffes aus M. bovis BCG in einer Person bereit, das das Einführen eines Vektors, der eine isolierte doppelstrangige Nukleinsäure beinhaltet, die die in SEQ ID NO: 2 angegebenen kodierenden Sequenzen umfaßt, in den Impfstoff aus M. bovis BCG vor der Verabreichung des Impfstoffs an die Person umfaßt. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine doppelstrangige Nukleinsäure bereit, die durch das Protein, das das von SEQ ID NO: 2 kodierte Polypeptid umfaßt, positiv reguliert wird, wobei die Nukleinsäure ein Protein mit Hämolyse-Aktivität kodiert. Bereitgestellt wird ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines virulenten Stammes von Mycobacterium tuberculosis in einer Probe, das
(a) das Identifizieren des Vorhandenseins einer Nukleinsäuresequenz von Mycobacterium tuberculosis in der Probe, und
(b) das Nachweisen der kontakvermittelten hämolytischen Aktivität in der Probe umfaßt, wobei das Vorhandensein von Mycobacterium tuberculosis und die kontaktvermittelte hämolytische Aktivität das Vorhandensein eines virulenten Stammes von Mycobacterium tuberculosis anzeigen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf die nachstehende detaillierte Beschreibung der einzelnen Ausführungsformen und auf die darin enthaltenen Beispiele leichter verständlich.
Wie hier verwendet kann "ein" oder "eine" je nach Zusammenhang, in dem es verwendet wird, ein bzw. eine oder mehrere bedeuten. Die hier aufgeführten Beispiele zeigen, daß der virulente Stamm H37Rv von M. tuberculosis eine zytolytische Aktivität exprimiert, die bei engem Kontakt der Bakterien mit Erythrozyten merklich erhöht wird. Wird ein rekombinanter Klon, der einen die Expression einer zytolytischen Aktivität herbeiführenden genomischen Locus von E. coli enthält, auf verschiedene Organismen wie M. tuberculosis oder M. smegmatis übertragen, so wird ebenfalls eine durch engen Kontakt mit Erythrozyten merklich erhöhbare Expression einer zytolytischen Aktivität herbeigeführt.
Die hier vorgestellten Erkenntnisse deuten daraufhin, daß M. tuberculosis ein kontaktabhängiges Zytolysin exprimiert, das in einem attenuierten Stamm von M. tuberculosis und in einem attenuierten Impfstamm von M. bovis entweder gar nicht oder nicht in nachweisbaren Mengen exprimiert wird. Diese Erkenntnisse zeigen auch, daß E. coli eine kodierende Nukleinsäuresequenz enthält, die nach Transfektion in andere Organismen unter der Kontrolle regulatorischer, mit dem jeweiligen Organismus kompatibler Sequenzen einen hämolytischen Phänotyp in diesen Organismen induziert. Dieses Gen wird deshalb hier als Hämolyse-Regulator bezeichnet. SEQ ID NO: 2 gibt die Sequenz des isolierten Gens von E. coli an, das einen Hämolyse- Regulator kodiert. Es wurde festgestellt, daß dieses Gen ein Protein kodiert, das wie hier beschrieben die Hämolyse in verschiedenen bakteriellen Organismen reguliert. Beispielsweise bewirkt diese Sequenz nach Transfektion in M. tuberculosis, M. smegmatis oder E. coli mit geeigneten regulatorischen Sequenzen, daß der Organismus eine hämolytische Aktivität zeigt. Ausgehend von dieser Entdeckung können verschiedene Therapien zur Behandlung oder Vorbeugung der hämolytischen Aktivität von M. tuberculosis entwickelt werden. Bereitgestellt wird hier eine isolierte doppelstrangige Nukleinsäure, die die in SEQ ID NO: 2 angegebene Nukleinsäuresequenz umfaßt. Darüber hinaus wird sowohl die kodierende als auch die nichtkodierende Nukleinsäuresequenz (d. h. der regulatorische Bereich) dieser Nukleinsäure bereitgestellt. Wie im Sequenzprotokoll bei SEQ ID NO: 2 vermerkt, schließt die nichtkodierende Region der SEQ ID NO: 2 die Nukleotide 1-92, und die kodierende Region die Nukleotide 93-1020 oder Teile davon ein. Bereitgestellt wird ebenfalls das gereinigte, von der Nukleinsäure kodierte Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 3 angegeben wird. Die Erfindung stellt ferner eine isolierte Nukleinsäure bereit, die diese in SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz kodiert. Die Nukleinsäure kann bei Bedarf regulatorische Sequenzen beinhalten, die zwecks Steuerung der Expression dieses Gens mit der kodierenden Sequenz operativ verbunden sind, so daß das Protein beispielsweise von einem das Gen enthaltenden Wirt exprimiert werden kann. "Isoliert" hat hier die Bedeutung "von anderen Nukleinsäuren des Ausgangsorganismus getrennt". Die Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2 ist eine genomische Sequenz und beinhaltet also mindestens einige der verwendeten regulatorischen Sequenzen; zur korrekten Expression des Gens in einem ausgewählten Organismus können jedoch beliebige andere regulatorische Bereiche mit den kodierenden Sequenzen operativ verbunden werden. "Operativ verbunden" bedeutet, daß die Sequenzen derart gekoppelt sind, daß die regulatorischen Bereiche die Expression der kodierenden Region steuern können. Folglich können anstelle des regulatorischen Bereiches von E. coli andere regulatorische Bereiche eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Promotor von E. coli durch einen Promotor von M. tuberculosis wie etwa den bekannten Hitzeschock-Promotor hsp60 ersetzt werden. Weitere verwendbare regulatorische Bereiche dieser Art sind bekannt bzw. können mit herkömmlichen Methoden dieses Bereiches der Technik gefunden werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)).
Zusätzlich wird hier die mit einem Reportergen operativ verbundene nichtkodierende Region der Nukleinsäure der SEQ ID NO: 2 bereitgestellt. Derartige Reportergene sowie die Verfahren zur Herstellung der operativen Verbindung sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele für derartige Reportergene schließen das β-gal-Gen, das LacZ-Gen und das Luciferase-Gen ein. Derartige Konstrukte können zum Screening nach Verbindungen verwendet werden, die die Expression dieses Gens hemmen oder verstärken. Folglich kann das Konstrukt aus Reporter und regulatorischem Bereich zum Schreening auf Verbindungen verwendet werden, die an die regulatorischen Bereiche des Gens für die Hämolyse-Regulation binden. Derartige Screenings können problemlos nach herkömmlichen Screeningverfahren zur Auffindung der Expression eines ausgewählten Reportergens durchgeführt werden, z. B. zum Nachweis des Vorhandenseins des Reportergen-Produkts.
Bereitgestellt wird hier ebenfalls eine doppelstrangige Nukleinsäure, die ein Protein kodiert, das Hämolyse-Aktivität besitzt und von dem hier beschriebenen positiven Hämolyse-Regulator positiv reguliert wird. Die Hämolyse-Aktivität kann durch Anwendung des hier beschriebenen Hämolyse-Tests getestet werden. "Positiv reguliert" hat hier die Bedeutung, daß das Vorhandensein des Regulators die Expression der hämolytischen Aktivität des Hämolysin-Proteins verstärkt.
Zusätzlich stellt die Erfindung auch eine Nukleinsäure bereit, die einen Hämolysin- Regulator kodiert, der zu dem hier beschriebenen Hämolysin-Regulator homolog ist. Eine derartige homologe Nukleinsäuresequenz kann beispielsweise zum simultanen Nachweis verwandter Stämme oder als Grundlage für eine Mehrfachschutzimpfung verwendet werden. Beispielsweise deuten die Ergebnisse einer "Southern-Blot"-Analyse darauf hin, daß zumindest in M. smegmatis, M. tuberculosis H37Ra, E. coli und M. bovis ein Hämolysin-Homolog existiert. Da diese avirulenten Bakterien bei dem Hämolyse- Test der Erfindung keine zytolytische Aktivität zeigen, wird dieses Hämolysin-Gen entweder nicht oder nicht in nachweisbaren Mengen exprimiert, oder das Gen ist derart mutiert, daß sein Genprodukt keine hämolytische Aktivität mehr aufweist. Derartige homologe Hämolysin-Regulatoren können unter Anwendung der hier angegebenen Verfahren oder durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung von Primern und Sonden isoliert werden, die vom Sequenzprotokoll abgeleitet sind.
Eine Nukleinsäure, die mit der Nukleinsäure selektiv hybridisiert, die diesen positiven Hämolyse-Regulator kodiert, wird ebenfalls betrachtet. Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck "selektiv hybridisiert", daß die Nukleinsäure mit ihrer Ziel-Nukleinsäure (d. h. ihrer komplementären Nukleinsäure) unter geeigneten stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisiert, und zwar durch Komplementarität beider Sequenzen eher als durch zufällige, nicht spezifische und nicht selektive Hybridisierung. Anders ausgedrückt: Die bei der Hybridisierung verwendeten Nukleinsäuresequenzen sind in bezug auf die Zielsequenz einzigartig, so daß unter geeigneten stringenten Hybridisierungsbedingungen der Nachweis der Zielsequenz exklusive unter anderen Nukleinsäuren möglich ist. Die geeigneten stringenten Bedingungen werden naturgemäß je nach Länge der Nukleinsäuren variieren. Folglich wird eine Nukleinsäure, die mit einer das Antigen kodierenden Nukleinsäuresequenz selektiv hybridisiert, unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure für ein anderes Antigen nicht selektiv hybridisieren und umgekehrt. Die Erfindung liefert Beispiele für diese Nukleinsäuren, so daß der Grad der Komplementarität, der zur Unterscheidung zwischen unter stringenten Bedingungen selektiv hybridisierenden und nicht selektiv hybridisierenden Nukleinsäuren erforderlich ist, für jede Nukleinsäure eindeutig bestimmt werden kann.
"Stringente Hybridisierungsbedingungen" bezeichnet die in einem Hybridisierungsprotokoll angegebenen Waschungsbedingungen. In der Regel sollte als Waschungsbedingungen eine Kombination aus Temperatur und Salzkonzentration ausgewählt werden, bei denen die Denaturierungstemperatur etwa 5-20ºC unter der berechneten Tm des untersuchten Hybrids liegt. Die Temperatur- und Salzkonzentrationsbedingungen werden problemlos in Vorversuchen empirisch ermittelt, bei denen auf Filtern immobilisierte Proben einer Referenz-DNA mit der betreffenden Sonde oder mit der das Protein kodierenden betreffenden Nukleinsäure hybridisiert und dann unter unterschiedlich stringenten Bedingungen gewaschen werden. Beispielsweise können Hybridisierungen mit Oligonukleotid-Sonden, die kürzer als 18 Nukleotide sind, bei 5-10ºC unterhalb der geschätzten Tm in 6 · SSPE durchgeführt werden und die Waschung erfolgt dann in 2 · SSPE bei der gleichen Temperatur (siehe z. B. Sambrook et al.). Die Tm eines derartigen Oligonukleotids kann dadurch geschätzt werden, daß man 2ºC für jedes A- oder T-Nukleotid und 4ºC für jedes G- oder C-Nukleotid rechnet. Eine Sonde mit 18 Nukleotiden und 50% G + C hätte also eine geschätzte Tm von etwa 54ºC.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mindestens eine 80%ige Homologie zu den kodierenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2 aufweisen, die von der Degeneration des genetischen Codes nicht betroffen sind, d. h. zu den Nukleotiden in der kodierenden Sequenz, die keine "wobble"-Nukleotide sind (in der Regel ist das "wobble"-Nukleotid das dritte Nukleotid eines Codons). Vorzugsweise weisen die Nukleinsäuren eine 90%ige, besonders bevorzugt eine 95%ige, oder ganz besonders bevorzugt eine 99%ige Homologie zu den kodierenden Nukleotiden der SEQ ID NO: 2 auf, die von der Degeneration des genetischen Codes nicht betroffen sind. Die Nukleinsäuren können eine Länge von mindestens 18, 50, 100, 150, 200, 300, 500, 750 oder 1000 Nukleotiden haben.
Eine derartige Nukleinsäure kann ebenfalls einen Primer oder eine Sonde umfassen, der bzw. die beispielsweise mit einem der beiden Nukleinsäurestränge hybridisiert und in Amplifizierungsverfahren oder zum Nachweis des Mikroorganismus verwendet werden kann. Eine derartige Nukleinsäure kann beispielsweise auch bei einer hemmenden Antisinn-Therapie zur Bindung an die von dem kodierenden DNA-Strang transkribierten mRNA-Moleküle und zum Verhindern der Translation verwendet werden, wodurch die Hämolyse gehemmt wird. Zusätzlich kann die selektiv hybridisierende Nukleinsäure die Länge der vollständigen kodierenden Region aufweisen und ein im wesentlichen ähnliches Protein mit Hämolysin-aktivierender Aktivität kodieren. Die Sequenzen derartiger Nukleinsäuren können der genomischen Nukleotidsequenz und der beabsichtigten Verwendung der betreffenden Nukleinsäure entsprechend ausgewählt werden.
Bereitgestellt wird ebenfalls eine Nukleinsäure, die mit der doppelstrangigen Nukleinsäure, die das Hämolysin kodiert, selektiv hybridisiert. Diese Nukleinsäure kann also wie hier definiert mit einem der Stränge der das Hämolysin kodierenden Nukleinsäure hybridisieren und zur Hemmung der hämolytischen Aktivität oder als Primer, Sonde oder zur Antisinn-Bindung an die von der Nukleinsäure transkribierte mRNA oder zum Nachweis des Vorhandenseins von M. tuberculosis verwendet werden. Diese Nukleinsäure von M. tuberculosis kann problemlos identifiziert werden, beispielsweise durch Amplifizierung homologer Sequenzen mittels PCR unter Verwendung von einem (oder mehreren) degenerierten Primer(n) (Sadaie, Y. et al. Gene, 98: 101-105 (1991); Scaramuzzi, C.D., CurrentGenetics, 22: 421-427 (1992)) und unter Verwendung von beispielsweise einer weiteren Zytolysin-Sequenz.
Eine beliebige Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung in einem Vektor wird ebenfalls bereitgestellt. Ein derartiger Vektor kann die Nukleinsäure sowie zusätzliche Nukleinsäuresequenzen mit verschiedenen Funktionen beinhalten, beispielsweise Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen, Sequenzen, die die Replikation des Vektors ermöglichen, Marker-Gene sowie andere im Stand der Technik bekannte und herkömmlich verwendete Eigenschaften (siehe z. B. Sambrook et al.). Typische Vektoren schließen verschiedene Plasmide, Cosmide und virale Konstrukte ein. Die Nukleinsäuren können mit Hilfe herkömmlicher, im Stand der Technik bekannter Methoden in die Vektoren eingebaut werden. Auch Fragmente der Nukleinsäuren, die mit bekannten herkömmlichen Techniken, beispielsweise rekombinanten Methoden oder Synthesemethoden, erzeugt werden, können in Vektoren eingebaut werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren können in einem Wirt enthalten sein, insbesondere in einem Wirt, der das Protein exprimieren kann.
Dem Fachmann sind viele Expressionsvektoren für E. coli bekannt, die zur Expression des Antigens verwendbar sind. Andere zur Expression geeignete mikrobielle Wirtsorganismen schließen Bazillen wie Bacillus subtilus sowie andere Enterobakterien wie Salmonella, Serratia und verschiedene Pseudomonas-Arten ein. Für diese prokaryotischen Wirtsorganismen können ebenfalls Expressionsvektoren hergestellt werden, die typischerweise die Expression steuernde Sequenzen enthalten, die mit der Wirtszelle kompatibel sind. Zusätzlich wird eine beliebige Anzahl an Promotoren aus einer Reihe gut bekannter Promotoren enthalten sein. Die DNA-Sequenzen können in Wirtsorganismen erst dann exprimiert werden, wenn die Sequenzen mit einer die Expression steuernden Sequenz operativ verbunden sind, d. h. derart positioniert, daß ihre Funktionsfähigkeit gewährleistet ist. Typischerweise sind diese Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen replizierbar, und zwar entweder als Episome oder als integraler Bestandteil der chromosomalen DNA des Wirtes. Gewöhnlich können die Expressionsvektoren Selektionsmarker enthalten, z. B. Tetracyclin-Resistenz oder Hygromycin-Resistenz, die den Nachweis und/oder die Selektion der mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformierten Zellen ermöglichen (siehe z. B. US-Patent 4 704 362).
Ein Vektor, der eine beliebige der hier beschriebenen Nukleinsäuren umfaßt, in einem Wirt wird hier bereitgestellt. Ein solcher "Wirt" kann ein beliebiger Organismus sein, der in der Lage ist, den Vektor im Organismus zu halten. Vorzugsweise ist der Wirt ein zur Expression der Nukleinsäure geeigneter Wirt. Besonders nützliche Wirtsorganismen sind herkömmlicherweise zu Impfzwecken verwendete attenuierte Organismen wie etwa M. bovis BCG sowie mit dem virulenten M. tuberculosis eng verwandte Bakterien wie M. smegmatis und andere Bakterien, die Kopien des Vektors halten würden, beispielsweise E. coli. Der Vektor kann durch Anwendung einer herkömmlichen für den jeweiligen Vektor-Typ geeigneten Methode, beispielsweise durch Transfektion, Transformation, Elektroporation oder Mikroinjektion problemlos in den Wirt eingeführt werden (siehe Sambrook et al.).
Ein besonders nützlicher Wirt beinhaltet einen Vektor, in dem eine den vorliegenden Hämolysin-Regulator kodierende Nukleinsäure eingefügt ist. SEQ ID NO: 2 stellt die genomische Sequenz einer beispielhaft angegebenen, den Hämolyse-Regulator kodierenden Nukleinsäure dar, die wie hier beschrieben und im Stand der Technik bekannt durch herkömmliche Verfahren in einen beliebigen für den ausgewählten Wirt geeigneten Vektor eingefügt werden kann. Es kann jedoch auch jede beliebig ausgewählte Nukleinsäuresequenz verwendet werden, die das Regulator-Protein kodiert. Beispielsweise können die kodierenden Sequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes verändert sein. Ferner können die regulatorischen Sequenzen je nach ausgewähltem Wirt geändert werden, um regulatorische Sequenzen auszuwählen, die die Expression des Gens in dem betreffenden Wirt ermöglichen. Die Wirtsorganismen können wie hier beschrieben ausgewählt werden. M. bovis BCG, ein Impfstamm von Mycobacterium, kann ein besonders nützlicher Wirt sein. Ein M. bovis BCG, der als Wirt die kodierenden Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen enthält, kann zum Hervorrufen einer Immunantwort in einer Person besonders nützlich sein. Durch herkömmliche Immunantwort-Tests können ausgewählte Wirte und Vektoren auf ihre Fähigkeit, eine Immunantwort zu fördern, problemlos getestet werden. Der Wirt kann in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten sein.
Jedes Gen kann als abgeschlossene, zusammenhängende Sequenz oder als zwei oder mehrere, aufgrund dazwischenliegender Sequenzen oder ähnlichem nicht zusammenhängende Sequenzen vorliegen, die dennoch in vivo transkribiert werden, wodurch letztendlich ein Protein biologisch synthetisiert wird, das im wesentlichen dem vorstehend beschriebenen Protein entspricht. Derartige Modifikationen können beabsichtigt sein und sich beispielsweise aus ortsgerichteten Mutationen ergeben. Derartige Modifikationen können neutral sein und redundante Codons ergeben, die die native Aminosäuresequenz spezifizieren, oder es können auch solche Modifikationen sein, die zwar zu einer faktischen Änderung der Aminosäuresequenz führen können, wobei diese Änderung aber keine oder nur eine vernachlässigbare Wirkung auf die Proteinaktivität hat. Die Erhaltung der Aktivität kann mit den hier beschriebenen Verfahren problemlos überprüft werden. Derartige Modifikationen können Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen einschließen. Es ist gut bekannt, daß im Genom eines Individuums vorhandene Gene für ein besonderes Polypeptid einzeln oder in mehreren Kopien auftreten können. Solche mehrfach vorhandenen Gene können identisch sein oder bestimmte Modifikationen, darunter Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen aufweisen, dennoch kodieren alle diese Gene Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche Aktivität besitzen. Der Begriff "Nukleinsäure, die ein Protein kodiert" kann sich also auf ein oder mehrere Gene in einem bestimmten Individuum beziehen. Ferner können zwischen den einzelnen Organismen gewisse Unterschiede in den Nukleotidsequenzen auftreten, die Allele genannt werden. Derartige allelische Unterschiede können zu Unterschieden in der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids führen, kodiert wird jedoch stets ein Protein mit positiver Hämolyse-regulierender Aktivität oder Hämolyse-Aktivität. Modifikationen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind insoweit ebenfalls betrachtet, als die wesentliche Struktur und die Funktion des von den Nukleinsäuren kodierten Polypeptids erhalten bleiben. In ähnlicher Weise können als Primer oder Sonden verwendete Fragmente Substitutionen aufweisen, solange eine hinreichende Anzahl an komplementären Basen vorhanden ist, um eine spezifische, selektive Hybridisierung zu gewährleisten, die wie hier beschrieben die Unterscheidung dieses Gens von anderen Nukleinsäuren erlaubt (Kunkel et al. Methods Enzymot 154: 367 (1987)).
Zusätzlich wird mit dieser Erfindung ein gereinigtes Protein bereitgestellt, das das Polypeptid mit der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosäuresequenz oder einen biologisch aktiven Teil davon umfaßt. Modifikationen der angegebenen Aminosäuresequenz, beispielsweise Aminosäuresubstitutionen, können wie im Stand der Technik bekannt vorgenommen werden, soweit die biologische Aktivität des Proteins erhalten bleibt. Die Aktivität dieses Proteins besteht in der positiven Regulierung der Hämolyse und kann durch die hier beschriebenen Verfahren problemlos nachgewiesen werden. "Gereinigt" bedeutet, daß das Protein von anderen Proteinen des Ausgangsorganismus getrennt wird. "Biologisch aktiver Teil davon" steht für ein Fragment dieses Proteins, das jedoch dessen biologische Aktivität bei der positiven Regulierung der Hämolyse noch entfaltet, was problemlos ermittelt werden kann. Wie nachstehend dargelegt können Peptidfragmente durch Routineverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zusätzlich können typische in der Zelle auftretende Modifikationen der Aminosäuren, wie etwa Glycosylierung oder Acetylierung, vorgenommen werden.
Es wird hier ebenfalls ein Protein, das von einer Nukleinsäure, die von dem erfinderischen Hämolysin-Regulator positiv reguliert wird, kodiert wird, oder ein hämolytisch aktiver Teil davon bereitgestellt. Dieses Protein hat hämolytische Aktivität. Die dieses Protein kodierende Nukleinsäure kann von dem obigen positiven Hämolyse- Regulator positiv reguliert werden; so zeigen Untersuchungen, bei denen die den positiven Regulator kodierende Nukleinsäure Zellen zugegeben wird, die anscheinend ein nicht exprimiertes Hämolyse-Strukturgen enthalten und normalerweise keine hämolytische Aktivität aufweisen, daß die Zellen anschließend hämolytische Aktivität aufweisen.
Das vollständige Protein sowie ein beliebiges Fragment desselben, das dessen vorstehend beschriebene biologische Aktivität noch entfaltet, kommen hier in Betracht. Als "biologisch aktiver Teil" eines beliebigen Proteins kommen hier ebenfalls Fragmente in Betracht, die noch biologische Aktivitäten wie etwa Immunogenität oder Immunreaktivität entfalten, was wie nachstehend dargelegt durch herkömmliche, im Stand der Technik bekannte Verfahren ermittelt werden kann. Ein "hämolytisch aktiver Teil" eines Proteins behält die Hämolysefunktion, was durch die hier bereitgestellten Verfahren problemlos getestet werden kann.
Ein immunreaktives Fragment eines der hier bereitgestellten Proteine wird als eine von der Aminosäuresequenz des Proteins abgeleitete Aminosäuresequenz mit mindestens etwa 5 aufeinanderfolgende Aminosäuren definiert. Derartige Fragmente können beispielsweise durch mechanische oder chemische Spaltung des vollständigen Proteins erzeugt werden; in einem weiteren Beispiel können sie rekombinante Proteine sein, die durch Klonierung der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuren in einem Expressionssystem erhalten werden, welches das Protein oder Fragmente desselben produzieren kann. Die Aktivität derartiger Fragmente kann durch Anwendung der nachstehend in den Beispielen beschriebenen Verfahren ermittelt werden. Die Polypeptid-Fragmente der vorliegenden Erfindung können auch rekombinante Peptide sein; erhalten werden diese Peptide durch Klonierung der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuren in einem Expressionssystem, welches das Antigen- Polypeptid oder Fragmente desselben produzieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine immunogene Menge des Hämolysin- Proteins dieser Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Träger bereit. Die immunogene Menge für die jeweilige Person, der das Protein verabreicht werden soll, kann durch herkömmliche Methoden problemlos ermittelt werden. Wurde die Aminosäuresequenz jedes Proteins von der DNA-Sequenz abgeleitet, so ist es möglich, durch Anwendung herkömmlicher Peptidsynthesemethoden und/oder rekombinanter Methoden Peptidfragmente zu synthetisieren, die zu den immunreaktiven Bereichen des Proteins homolog sind, und diese Fragmente durch Einschluß (inclusion), Deletion oder Modifikation bestimmter Aminosäurereste in den abgeleiteten Sequenzen zu modifizieren. Folglich ist die Synthese und Reinigung einer außerordentlich großen Anzahl an von der ursprünglichen Proteinsequenz abgeleiteten Peptiden möglich. Die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Polypeptide können einen immunreaktiven Teil enthalten, der mit Sequenzen gekoppelt ist, die dafür vorgesehen sind, eine zusätzliche Eigenschaft wie etwa Solubilität zu verleihen. Zur Bereitstellung zusätzlicher Eigenschaften können die Aminosäuresequenzen ferner Sequenzen beinhalten, bei denen eine oder mehrere Aminosäure(n) durch eine andere Aminosäure substituiert wurde(n); beispielsweise können Aminosäuren, die eine Disulfidbindung bilden können, entfernt oder hinzugefügt werden, es kann die biologische Lebensdauer erhöht und die enzymatische Aktivität oder die Wechselwirkungen mit der Magensäure geändert werden. In jedem Fall muß das Peptid eine bioaktive Eigenschaft besitzen, wie etwa Hämolysin-Regulation, Hämolyse, Immunreaktivität, Immunogenität, usw. Zur Bestimmung ihrer Immunogenität und Spezifität können die auf diese Weise erhaltenen gereinigten Polypeptid-Fragmente getestet werden. Kurz beschrieben wird ein mutmaßlich immunologisch spezifisches Fragment in verschiedenen Konzentrationen angesetzt und einem Tier verabreicht; anschließend wird die Immunantwort (d. h. die Antikörperproduktion oder die zellvermittelte Immunität) eines Tieres auf die verschiedenen Konzentrationen bestimmt. Die verabreichte Antigen- Menge hängt vom Versuchsobjekt (z. B. ein Mensch oder ein Meerschweinchen), von seinem Zustand, seiner Größe usw. ab. Ein auf diese Weise mit dem Antigen geimpftes Tier kann dann zum Testen der potentiellen Impfwirkung des jeweiligen immunogenen Fragments dem Bakterium ausgesetzt werden. Die Spezifität eines mutmaßlich immunogenen Fragments kann dadurch bestätigt werden, daß man Sera, andere Körperflüssigkeiten oder Lymphozyten des geimpften Tiers auf Kreuzreaktivität mit anderen eng verwandten Bakterien testet.
Polynukleotide, die eine Variante des Polypeptids kodieren, können Sequenzen beinhalten, die die Transkription (Expressionssequenzen) und die Translation der kodierenden Sequenzen ermöglichen, so daß das kodierte Polypeptid-Produkt produziert wird. Der Aufbau derartiger Polynukleotide ist im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise können solche Polynukleotide einen Promotor, eine Terminationsstelle für die Transkription (eine Polyadenylierungsstelle in eukaryotischen Expressionswirtsorganismen), eine Ribosomenbindungsstelle, und fakultativ einen Enhancer zur Verwendung in eukaryotischen Expressionswirtsorganismen oder zur Replikation eines Vektors erforderliche Sequenzen beinhalten. Für jedes beanspruchte Protein wird ebenfalls ein Antikörper, der an einen antigenen Teil des Proteins spezifisch bindet, bereitgestellt. Die Antikörper können an ein einzigartiges Epitop des Antigens spezifisch binden oder auch an Epitope anderer Organismen. Folglich können die Antikörper zum Nachweis eines bestimmten Organismus oder verwandter Organismen verwendet werden. Der Begriff "spezifisch binden" bedeutet, daß ein Antikörper, der an ein Protein spezifisch bindet, im wesentlichen keine Kreuzreaktion mit einem anderen Antigen als dem spezifischen zeigt, das in diesem Fall das Hämolysin positiv regulierende Protein oder das Hämolysin-Protein ist, so daß das gewünschte Antigen nachgewiesen werden kann. Die Antikörper können durch gut bekannte Verfahren, wie sie in Harlow und Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988) beschrieben sind, hergestellt werden. Kurz gesagt wird das gereinigte Protein oder ein antigenes Fragment desselben einem Tier injiziert, wobei Menge und Zeitintervallen zum Auslösen einer Immunantwort hinreichen. Polyklonale Antikörper können unmittelbar gereinigt werden, indem das gesammelte Serum des Tieres durch eine Säule geschickt wird, an die Proteine gebunden wurden, die aus dem gleichen Expressionssystem erhalten wurden und keine Hämolysin-regulatorischen Proteine oder Hämolysin-Proteine sind. Monoklonale Antikörper können nach Gewinnung von Milzzellen des Tieres ebenfalls hergestellt werden. Die Zellen werden anschließend mit einer unsterblichen Zellinie fusioniert und nach Antikörper-Sekretion durchmustert. Die Antikörper können dann zum Screening von DNA-Klonbanken nach das Antigen sekretierenden Zellen verwendet werden. Bei Bedarf können positive Klone sequenziert werden (siehe z. B. Kelly et al., Bio/Technology 10: 163-167, (1992) und Bebbington et al., Bio/Technology 10: 169-175 (1992)).
Der Antikörper kann an ein Substrat gebunden, mit einer nachweisbaren Gruppe markiert, oder sowohl gebunden als auch markiert werden. Die für die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Betracht kommenden nachweisbaren Gruppen schließen beispielsweise fluoreszente, enzymatische und radioaktive Marker ein.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich eine immunogene Menge des Proteins, d. h. eines Antigens in einem pharmazeutisch verträglichen Träger bereit. Diese Zusammensetzung kann das vollständige Antigen, das Antigen auf einem intakten avirulenten Stamm von Mycobacterium, E. coli oder einem anderen Stamm, oder ein für das Antigen spezifisches Epitop beinhalten. Das Antigen kann möglicherweise ebenfalls eine Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen andere Antigene zeigen. Die Zusammensetzung kann dann in einem Verfahren zur Vorbeugung gegen Tuberkulose oder gegen andere Komplikationen der Infektion mit M. tuberculosis verwendet werden. Die immunogenen Mengen des Antigens können durch herkömmliche Verfahren ermittelt werden. Kurz beschrieben wird ein mutmaßliches spezifisch immunreaktives Epitop in verschiedenen Konzentrationen angesetzt und einem Tier verabreicht; sodann wird die Immunantwort (z. B. die Produktion von Antikörpern) der Tiere auf jede Konzentration bestimmt.
Die Wirtsorganismen dieser Erfindung können als Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen, insbesondere wenn der Wirtsorganismus einer Person verabreicht werden soll. Der in der vorliegenden Erfindung beschriebene pharmazeutisch verträgliche Träger kann eine Salzlösung oder andere geeignete Träger umfassen (Arnon, R. (Hrsg.) Synthetic Vaccines 1: 83-92, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1987). Mit der Zusammensetzung dieser Erfindung kann ein Träger verwendet werden. Ein Adjuvans kann ebenfalls Bestandteil des Trägers für den Wirtsorganismus sein; in diesem Fall wird das Adjuvans je nach verwendetem Antigen, Verabreichungsform und Empfänger nach herkömmlichen Kriterien ausgewählt (Arnon, R. (Hrsg.), 1987). Abhängig von dem verwendeten Wirt und dem Empfänger, dem es verabreicht wird, kann die Verabreichung über den oralen oder den sublingualen Weg oder durch Injektion erfolgen. Dem vorstehenden kann entnommen werden, daß der Wirt, der die hier beschriebene Nukleinsäure enthält, als prophylaktische oder therapeutische Maßnahme verwendet werden kann. Folglich stellt die Erfindung Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung der Infektion und der damit verbundenen Krankheiten bereit, bei denen der Wirt mit der beschriebenen Nukleinsäure einer Person verabreicht wird. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Fördern einer Immunantwort gegen Mycobacterium tuberculosis in einer Person bereit, das das Verabreichen eines Wirtes an eine Person umfaßt, wobei der Wirt einen Vektor enthält, der eine isolierte doppelstrangige Nukleinsäure beinhaltet, die die in SEQ ID NO: 2 angegebene kodierende Sequenz umfaßt. Durch die Verabreichung des Wirtes kann die zellvermittelte Immunität sowie die humorale Immunität zum Schutz gegen eine Infektion mit M. tuberculosis angeregt werden. Die Immunantwort ist durch herkömmliche, im Stand der Technik bekannte Methoden nachweisbar. Die Verabreichung kann in der herkömmlichen und im Stand der Technik für übliche Impfstoffe gegen M. tuberculosis wie etwa M. bovis BCG bekannten Weise durchgeführt werden, einschließlich der Verabreichungsart und der Dosierungen.
Ferner wird hier ein Verfahren zum Erhöhen der Immunogenität eines M. bovis BCG- Impfstoffes in einer Person bereitgestellt, das das Einführen eines Vektors, der eine isolierte doppelstrangige, die kodierende Sequenz der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Sequenz umfassende Nukleinsäure beinhaltet, in den M. bovis BCG-Impfstoff vor der Verabreichung des Impfstoffs an die Person umfaßt. Mit diesem Verfahren kann die Wirkungsdauer der herkömmlichen M. bovis BCG-Impfstoffe durch Anregung der zellvermittelten Immunität erhöht werden. Der verbesserte Impfstoff würde dann wie bei den M. bovis BCG-Impfstoffen üblich in den bekannten Dosierungen verabreicht werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines virulenten Stamms von M. tuberculosis in einer Probe bereit, das das Identifizieren des Vorhandenseins einer Nukleinsäuresequenz von M. tuberculosis in der Probe und das Nachweisen einer kontaktvermittelten hämolytischen Aktivität in der Probe umfaßt. Folglich kann zwischen avirulenten und virulenten Stämmen von M. tuberculosis unterschieden werden. Eine derartige "Probe" kann kultivierte, von der Person direkt erhaltene Isolate beinhalten. Zum Nachweis des Vorhandenseins von Nukleotiden von M. tuberculosis nach einem der verschiedenen dem Fachmann bekannten Verfahren (siehe allgemein Sambrook et al.) kann beispielsweise ein Rohlysat einer Kultur oder eine Sputum-Probe verwendet werden. Beispielsweise kann eine für M. tuberculosis spezifische Nukleinsäure durch Anwendung einer Technik zur Nukleinsäure- Amplifikation nachgewiesen werden, wie etwa mit der Polymerase-Kettenreaktion oder mit der Ligase-Kettenreaktion. Alternativ wird die Nukleinsäure durch direkte Hybridisierung oder durch Feststellung unterschiedlicher Längen für ein Restriktionsfragment nachgewiesen. Zusätzlich können PCR-Primer, die nur mit für M. tuberculosis spezifischen Nukleinsäuren hybridisieren, verwendet werden. Findet eine Amplifikation statt, so ist dies ein Hinweis auf das Vorhandensein einer Nukleinsäure von M. tuberculosis. In einer weiteren Ausführungsform kann zum Nachweis von M. tuberculosis ein Restriktionsfragment einer DNA-Probe beispielsweise durch ddNTp-Sequenzierung nach Sanger oder mit 7-Deaza-2'-deoxyguanosin-5'- triphosphat und Taq-Polymerase direkt sequenziert und mit bekannten einzigartigen Sequenzen verglichen werden. Beispiele für bekannte Sequenzen von M. tuberculosis schließen die IS6110-Insertionssequenz (Care et al., Molecular and Cellular Probes, 5: 73-80 (1991)), die Sequenz der polymorphen Haupttandemwiederholung (major polymorphic tandem repeat, MPTR) (Hermans et al., J. Bact, 174: 4157-4165 (1992)) und das 65 K-Antigen von M. tuberculosis (Shinnick, T.M., J. Bacteriol., 169: 1080-1088 (1987)) ein.
Proben, die DNA von M. tuberculosis enthalten, können durch den hier beschriebenen Hämolyse-Test für Zellproben auf hämolytische Aktivität untersucht werden. Das Vorhandensein einer hämolytischen Aktivität in der Zelle stellt einen Indikator für eine natürliche Expression des Hämolysins in der Zelle, d. h. für einen virulenten Stamm dar. Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen im einzelnen beschrieben; diese Beispiele dienen lediglich als Erläuterung und für den Fachmann sind daraus zahlreiche Modifikationen und Variationen ersichtlich.

BEISPIELE

In dieser Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Zwecks ausführlicherer Beschreibung des Standes der Technik, auf den sich diese Erfindung bezieht, wird hiermit die gesamte Offenbarung dieser Veröffentlichungen durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen.
Polymerase-Kettenreaktion. Es wurden Primer für einen 1,6 kbp langen DNA-Bereich, der im Plasmid pTBLA3 das hpr-Gen flankiert, und für die beschriebene Sequenz der chromosomalen Region von E, coli, die das umuD-Gen enthält (Walker et al., 1985), hergestellt. Die genomische DNA von E. coli und das Plasmid pTBLA3 wurden unter Verwendung von 10 ul Matrix-DNA (20-100 ng) und 90 ul eines Reaktionsgemisches, das wie vom Hersteller der Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) geliefert aus 200 uM von jedem Deoxynukleotidtriphosphat, 1,0 uM von jedem Primer, 2,5 U Taq-Polymerase, 10 mM Tris/HCl-Puffer (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2; und 0,01% Gelatine besteht, amplifiziert. Ein dreistufiger Zyklus mit einem 1,45-minütigen Denaturierungsschritt bei 94ºC, einem 1,45-minütigen Reassoziierungsschritt bei 55ºC und einem 3,00-minütigen Verlängerungsschritt bei 72ºC wurde 35 mal in einem programmierbaren Thermoblock (thermal cycler, Perkin-Elmer Cetus) durchgeführt. Die Größe der DNA-Fragmente wurde wie vorstehend beschrieben in einem Agarose-Gel mit 0,7% TBE bestimmt.
Analyse der Nukleotidsequenz. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des Sequenzierungskits PrismTM Ready Reaction DyeDeoxyTM Terminator und eines DNA-Sequenzierungssystems 373 entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) durchgeführt. Für die Anfangssequenzierung der DNA-Inserts in den Plasmiden pTBLA3 und pTBLA3/S2 wurden Vorwärts- und Rückwärtsprimer für M13 verwendet und aus diesen Sequenzdaten wurden mit einem DNA-Synthetisator (Modell 381 A, Applied Biosystems) in der Biotechnologie-Zentraleinheit des Staatlichen Zentrums für Infektionskrankheiten (National Center for Infectious Diseases Biotechnology Core Facility) interne Primer zur Analyse überlappender Sequenzen hergestellt. Beide Stränge des hpr-Gens von E. coli und der DNA-Bereich, der das stromaufwärts von diesem Gen gelegene umuD-Gen enthält, wurden unabhängig voneinander sequenziert und die Sequenzdaten wurden mit dem Software-Paket "Sequence Editor" (Applied Biosystems) verarbeitet. Sequenzanalysen und Datenbanksuchen wurden mit dem Sequenzanalyse-Paket "GCG Wisconsin" (Version 7.3, Devereux, 1984) und mit GenBank (einschließlich Ausgabe 81.0, Februar 1994) durchgeführt.
Hämolytische Aktivität. Die Stämme H37Rv (TMC #102) und H37Ra (TMC #201) von M. tuberculosis sowie M. bovis BCG wurden ursprünglich vom Trudeau Institut erhalten und bis zur Benutzung bei -70ºC gelagert. Der Stamm XL1-Blue von E. coli wurde von Stratagene Cloning Systems (La Jolla, California) und der Stamm DH5α von E. coli von Gibco BRL (Grand Island, New York) bezogen. Vor jedem Experiment wurden die Mykobakterien-Stämme in ruhenden Kulturen 4 Wochen lang in Middlebrook 7H9- Vollmedium (complete Middlebrook 7H9 broth, Difco) bei 37ºC und Stämme von E. coli in Luria-Bertani(LB)-Medium mit oder ohne geeignete(n) Antibiotika als Schüttelkultur bei 37ºC bis zur stationären Phase aufgezogen.
Die zum Screening des hämolytischen Phänotyps bei E. coli und M. smegmatis verwendeten Blutagarplatten wurden durch zweimaliges Waschen von mit Citrat versetztem Schaf-Vollblut (erhalten von der Animal Products Division, CDC) mit einer mit Phosphat gepufferten 0,01 M Kochsalzlösung (pH 7,2) präpariert. Sodann wurde das gewaschene Schafsblut in einer Konzentration von 5% mit oder ohne geeignete(n) Antibiotika auf Trypticase Soy Agar (TSA) gegeben. Transformanten von E. coli und M. smegmatis wurden in diesem Medium 24 h bzw. 4 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Der virulente Stamm H37Rv (TMC 102) und der avirulente Stamm H37Ra (TMC 201) von Mycobacterium tuberculosis wurden mit Hilfe eines modifizierten Erythrozytenlyse- Tests (20,22) nach kontaktabhängiger Lyse von Schaferythrozyten durchmustert. Die Lyse wurde über die Extinktion eines zellfreien Überstandes bei 540 nm überwacht, die ein Maß für die aus Erythrozyten freigesetzte Hämoglobinmenge ist. Die Bazillen wurden durch 10-minütige Zentrifugation (17.500 g) geerntet, gewaschen und in einer 0,1%igen Lösung von Tween 80 in einer mit Phosphat gepufferten 0,01 M Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2) bei einer Konzentration von ~10¹² Bakterien/ml resuspendiert. Schaferythrozyten wurden aus Vollblut gewonnen, das von der Abteilung Tierprodukte der Zentren zur Kontrolle und Prävention von Krankheiten (The Animal Products Division, Centers for Disease Control and Prevention) erhalten wurde und mit einer 0,1%igen Lösung von Tween 80 in 0,01 M PBS (pH 7,2) gewaschen und in einer Konzentration von ~10¹&sup0; Zellen/ml resuspendiert. Für Kosedimentationsversuche wurden gleiche Volumina der Erythrozyten und Bakteriensuspensionen gemischt, 10 min lang bei 17.500 g zentrifugiert und dann bei 37ºC inkubiert. Gemische jeweils einer Kultur gewaschener Stämme von M. tuberculosis bzw. M. bovis und Erythrozyten wurden ebenfalls ohne Sedimentierung bei 37ºC inkubiert. Nach 3 h wurden die Proben 10 min lang bei 17.500 g zentrifugiert; die Überstände wurden vorsichtig entnommen und ihre Extinktion bei 540 nm (A&sub5;&sub4;&sub0;) wurde gemessen. Der mittlere Wert der Hämoglobin-Freisetzung wurde durch Bildung der Differenz zu A&sub5;&sub4;&sub0; von Vergleichsproben berechnet, die nur Schaferythrozyten enthielten und die wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und inkubiert wurden. Wurden Suspensionen von virulenten Bazillen H37Rv und Erythrozyten durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 17500 g kosedimentiert und die Pellets 3 h lang bei 37ºC inkubiert, so betrug der mittlere Wert für die Hämoglobin-Freisetzung Apo = 0,67 ± 0,36. Die Hämoglobin-Freisetzung war deutlich niedriger (A&sub5;&sub4;&sub0; = 0,19 ± 0,04; p = 0,026), wenn virulente Bazillen H37Rv und Erythrozyten gemischt und unzentrifugiert in Suspension gelassen wurden. Im Gegensatz zu den virulenten Bazillen H37Rv ergaben die avirulenten Bazillen H37Ra nach Zentrifugation und Inkubation mit Schaferythrozyten nur eine A&sub5;&sub4;&sub0; = 0,21 ± 0,16, eine Extinktion, die sich von der des Kontrollysats (p = 0,092) nicht wesentlich unterscheidet. Der attenuierte Impfstamm M. bovis BCG ergab nach Zentrifugation und Inkubation eine A&sub5;&sub4;&sub0; = 0,06 ± 0,03. Die nachfolgenden Versuche zur Kontakt-Hämolyse unter Verwendung von E. coli und Rekombinanten von E. coli wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt, jedoch mit zwei Ausnahmen: Zum Waschen und Resuspendieren der Bakterien und Erythrozyten wurde PBS ohne Tween 80 verwendet und für jeden Test mit oder ohne Sedimentierung wurden ~10&sup9; Bakterien/ml und ~10¹&sup0; Erythrozyten/ml verwendet. Screening einer Cosmid-Bibliothek nach kontaktvermittelter hämolytischer Aktivität. Eine Cosmid-Bibliothek des Stammes H37Rv von M. tuberculosis wurde mit dem Plasmid-Paar pJC98 und pJC100 erzeugt (24). Zur Subklonierung der Isolate, die in E. coli kontaktabhängige Zytolyse vermitteln, wurden die Plasmide pUC19 und pBluescript II KS-(Stratagene) unter Anwendung bereits beschriebener Verfahren (22) eingesetzt.
Über Nacht angezogene Kulturen der einzelnen Transformanten mit DNA aus der Cosmid-Bibliothek von M. tuberculosis H37Rv in dem Stamm XL1-Blue von E. coli K-12 wurden nach kontaktabhängiger Hämolyse von Schaferythrozyten durchmustert. Aus einem Screening von 96 Transformanten wurde ein einziger Klon, bezeichnet als pHK101, isoliert, der zytolytische Aktivität zeigte. Es wurde festgestellt, daß nur stationäre Kulturen dieses rekombinanten Klons zytolytische Aktivität zeigen. Um sicherzustellen, daß die kontaktabhängige zytolytische Aktivität dieses rekombinanten Klons pHK101 auf ein Gen bzw. auf Gene im Cosmid und nicht auf eine davon unabhängige Änderung im Genom von E. coll zurückzuführen ist, wurde DNA von pHK101 gereinigt und zur Transformation von frischen kompetenten Zellen der nichthämolytischen Stämme XL1-Blue und DH5α von E. coli verwendet. Die beiden neuen Transformanten bewirkten die Lyse der Erythrozyten, während keiner der nichttransformierten Empfängerstämme eine merkliche Lyse herbeiführte. Die kontaktvermittelte zytolytische Aktivität von XK1-Blue(pHK101)-Zellen wurde mit der Aktivität der zur Herstellung der Cosmid-Bibliothek verwendeten XL1-Blue-Zellen verglichen, die das Plasmid pJC98 bzw. pJC100 enthalten. Die Sedimentation von ~10&sup9; XL1-Blue(pHK101)-Bakterien mit Erythrozyten ergab eine A&sub5;&sub4;&sub0; = 0,24 ± 0,028, während die Sedimentation von ~10&sup9; XL1-Blue(pJC98)-, XL1-Blue(pJC100)- oder XL1-Blue- Bakterien mit Schaferythrozyten eine A&sub5;&sub4;&sub0; < 0,02 ergab. Wurden XL1-Blue(pHK101)- Bakterien nicht mit Schaferythrozyten zentrifugiert, so ergaben sie eine merklich geringere Hämoglobin-Freisetzung (p = 0,019). Filtrate von XL1-Blue(pHK101)-Kulturen in der stationären Phase ergaben keine signifikante Hämoglobin-Freisetzung (p > 0,05).
Genetische Analyse. Das Cosmid pHK101 enthält etwa 32 kb DNA aus M. tuberculosis. XbaI-Fragmente des Cosmids pHK101 wurden in die Xbal-Schnittstelle von pUC19 subkloniert und die Transformanten wurden nach dem Auftreten von Hämolyse-Bereichen auf mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung gewaschenen und in Luria-Bertani-Topagar eingebetteten Schaferythrozyten durchmustert. Nur Rekombinanten, die ein 6,5 kb langes XbaI-Fragment enthielten, waren von einem Hof aus lysierten Erythrozyten umgeben. Kulturen mit 109 E. coli-Zellen in der stationären Phase, die dieses Plasmid (bezeichnet als pHK1001) enthielten, ergaben eine durchschnittliche Hämoglobin-Freisetzung von A&sub5;&sub4;&sub0; = 0 652 ± 0,012 im Vergleich zu einer A&sup5;&sup4;&sup0; von 0 241 ± 0,029 für 10&sup9; Bakterien, die das Cosmid pHK101 enthielten. Die zytolytische Aktivität des mit pHK1001 transformierten XL1-Blue-Stammes war ebenfalls auf die stationäre Wachstumsphase beschränkt und Kultur-Filtrate von Kulturen in der stationären Phase induzierten keine Schaferythrozytenlyse. Die zytolytische Aktivität wurde ferner auf einem 3,2 kb langen NotI-Fragment aus dem Plasmid pHK1001 dadurch lokalisiert, daß man dieses Fragment in pBluescript II KS&supmin;klonierte. Dieses Plasmid wurde als pTBLA3 bezeichnet. Dieses Fragment hybridisierte mit NotI- Fragmenten identischer Größe aus genomischen DNAs aus M. tuberculosis H37Rv, M. tuberculosis H37Ra und M. bovis BCG. Diese Bereiche könnten Homologa des regulatorischen Gens in diesen Organismen darstellen. Genetische Analyse der Hämolysin-Induktion durch hpr in E. coli und M. smegmatis. Eine erste Analyse des Gens, das in E. coli für diesen hämolytischen Phänotyp verantwortlich ist, wurde durch Subklonierung des 1.978 bp langen NotI/SalI- Fragments aus dem Plasmid pTBLA3/S2 (King et al., 1994) und Screening der Subklonen nach Hämolyse in Blutagarplatten durchgeführt. Das Plasmid pTBLA3JS2 wurde gleichzeitig mit NotI und SalI verdaut und das 1.978 bp lange Fragment wurde mit Hilfe von Geneclean II (Bio 101, LaJolla, Kalifomien) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus einem 1,0%igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA (TBE) gereinigt. Nach Sequenzanalyse des DNA-Fragments wurde es mit Hilfe einer Bgl II-Verdauung in zwei Fragmente aufgespalten. Daraus ergaben sich ein 852 bp langes Fragment mit Bgl II/NotI-Schnittstellen und ein 1.126 bp langes Fragment, das Bgl II-Schnittstellen enthielt. Diese zwei Fragmente wurden aus einem 1%igen Agarosegel in TBE wie vorstehend beschrieben gereinigt, in die BamHI- oder BamHI/NotI-Schnittstelle(n) von pBluescript IIks- durch Ligation einzeln eingebaut und durch Transformation in den Stamm XL1-Blue von E. coll eingeführt. Alle Transformanten wurden nach Hämolyse- Höfen auf Blutagarplatten mit 50 ug/ml Ampicillin, die 24 h lang bei 37ºC inkubiert wurden, durchmustert.
Zur Untersuchung der Bedeutung des umuD-Gens bei der Hämolysin-Induktion in E. coli und M. smegmatis wurde eine partielle Deletion des in dem 1.978 bp langen Fragment enthaltenen umuD-Gens durchgeführt. Ein 404 bp langes Fragment mit einer 151 bp langen Deletion im umuD-Gen wurde durch Verdauung mit dem Hinc II-Enzym aus dem Plasmid pTBLA3/S2 heraus kloniert und die Reinigung der verbleibenden Gensequenz und die Wiederverknüpfung durch Ligation mit dem gereinigten Stammvektor wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Das 404 bp lange Fragment, welches das umuD-Gen mit einer partiellen Deletion von 151 bp enthält, wurde ebenfalls gereinigt und mit dem Stammplasmid durch Ligation wieder verknüpft. Beide Subklone wurden wie oben beschrieben nach Hämolyse-Höfen in Blutagarplatten durchmustert. Sodann wurde die Fähigkeit der beschriebenen umuD-Gensequenz, diesen Phänotyp in E. coli zu komplementieren, durch Klonierung des das umu-Operon enthaltenden Plasmids pSE117 (Walker, 1984) in den Stamm XL1-Blue von E. coli getestet. Transformanten, die dieses Plasmid enthielten, wurden dann wie oben beschrieben mit dem Kontakt- Hämolysin-Test und auf Hämolyse in Blutagarplatten getestet.
Das 1.978 bp lange Fragment aus dem Plasmid pTBLA3/S2 wurde auf die Anwesenheit eines unabhängigen Promotors für die Transkription von hpr in E. coli hin untersucht. Zu diesem Zweck wurde das 1.978 bp lange EcoR Sal -Fragment aus dem Plasmid pTBLA3/S2 in die EcoRI/SalI-Schnittstellen der Plasmide pUC18 und pUC19 subkloniert. Sodann wurden diese Klone auf 50 ugg/ml Ampicillin enthaltenden Blutagarplatten nach dem hämolytischen Phänotyp durchmustert und die Orientierung des Inserts wurde durch Ermittlung der Größe der durch Verdauung der Plasmide mit den Enzymen NdeI/ClaI erhaltenen DNA-Fragmente auf einem 0,7%igen Agarosegel in TBE bestätigt. Das Enzym Nde I spaltet die Plasmide pUC19 und pUC18 einmal und das Enzym Cla I spaltet nur einmal innerhalb des 1.978 bp langen Inserts.
Expression in Mycobacterium smegmatis. Zur Auswertung der Induktion eines hämolytischen Phänotyps in M. smegmatis wurden die DNA-Fragmente, die diesen Phänotyp in E. coli induzieren, in den elektroporierbaren Stamm LR222 von M, smegmatis kloniert. Das 3,2 kbp lange, hpr enthaltende BamHI-Fragment aus dem Plasmid pTBLA3 (King et al., 1993) wurde unter Benutzung der BamHI-Schnittstellen des Schaukelvektors pMV261 für E. coli und Mykobakterien (Stover et al., 1991) in den Stamm XL1-Blue von E. coli kloniert und dieses Plasmid wurde als pMV261/S3 bezeichnet. Als Kontrollplasmid wurde das Plasmid pMV261 ohne Insert ebenfalls in den Stamm XL1-Blue von E. coli kloniert. Die aus E. coli gereinigten Plasmide wurden in den Stamm LR222 von M. smegmatis durch Transformation eingeführt, die Transformanten wurden auf 50 ug/ml Kanamycin enthaltenden Blutagarplatten ausplattiert, die vier Tage lang bei 37ºC inkubiert wurden, und die Hämolyse-Bereiche wurden gezählt. Die Plasmide pMV261/S3 und pMV261 wurden aus hämolytischen bzw. nichthämolytischen Klonen von M. smegmatis gereinigt. Zur Bestätigung des DNA- Inserts im Plasmid pMV261/S3 wurde das Plasmid wieder in den Stamm XL1-Blue von E. coli kloniert und von hämolytischen Transformanten von E. coli gereinigt, und die Größe des Inserts wurde nach Verdauung mit dem Enzym BamHI in einem 1,0%igen Agarosegel in TBE ermittelt. Hämolytische und nichthämolytische Klone von M. smegmatis und E. coli auf Blutagarplatten wurden ebenfalls mit dem Test auf kontaktabhängige Hämolyse getestet.
Sodann wurde ermittelt, ob der vermutliche Promotor für hpr bei der Induktion des hämolytischen Phänotyps in M. smegmatis eine Funktion hat; dafür wurde das 1.978 bp lange, hpr enthaltende Fragment in M. smegmatis kloniert, und zwar in beiden Orientierungen in Bezug auf den Mykobakterien-Promotor im Plasmid pMV261. Das 1.978 bp lange Fragment mit SalI-Enden wurde mit dem Enzym SalI aus dem Plasmid pTBLA3 isoliert und in die SalI-Schnittstelle des Vektors pMV261 in den Stamm XL1- Blue von E. coli kloniert. Zum Screening der Plasmide verschiedener hämolytischer Transformanten von E. coli nach den zwei verschiedenen SalI-Orientierungen im Vektor pMV261 wurden die Plasmide mit dem Enzym Cla I verdaut und die Größe der Fragmente wurde in einem 1,0%igen Agarosegel in TBE wie vorstehend beschrieben ermittelt. Es wurde erwartet, daß beide Orientierungen das Hämolysin in E. coli induzieren, und zwar durch eine stromaufwärts vom hpr-Gen gelegene, unabhängig funktionierende Promotor-Region in diesem Fragment. Die Plasmide pMV261 mit den beiden Orientierungen des SalI-Fragments (als pMV261/S2 und pMV261/S2º bezeichnet) wurden gereinigt und in den Stamm LR222 von M. smegmatis durch Elektroporation eingeführt. Die Transformanten von M. smegmatis wurden in Kanamycin enthaltenden Blutagarplatten nach Hämolyse durchmustert, und die Plasmide wurden wie vorstehend beschrieben durch Reinigung und erneute Klonierung in E. coli bestätigt. Minizell-Analyse. Die Plasmide pMV261, pMV261/S3 und pMV261/S2 wurden einzeln in den Minizell-Stamm 678-54 von E. coli (Alder et al. 1967) hineinkloniert und die hämolytischen und nichthämolytischen Klone wurden unter Verwendung von Blutagarplatten und des Tests für kontaktabhängige Hämolyse bestätigt. Nach Kultivierung dieser Klone von E. coli in 50 ug/ml Kanamycin enthaltendem LB-Medium bis zur frühen stationären Phase wurden aus den Klonen Minizellen wie bereits beschrieben (Quinn und Tompkins, 1989) isoliert. Mit [³&sup5;S]-Methionin markierte Proteine wurden neben Protein-Standards in einem 10%igen SDS-PAGE analysiert. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, mit En³hance-Lösung gemäß den Angaben des Herstellers (Dupont, Boston, Massachusetts) fixiert und auf Filterpapier gelegt getrocknet. Ein Kodak AR-Röntgenfilm wurde 24 Stunden lang bei -70ºC mit den Gelen belichtet.
Es wurde festgestellt, daß der Subklon von E. coli, der ein 3,2 kbp langes NotI- Fragment aus dem Cosmid pHK101 enthält, klare Hämolyse-Höfe auf Blutagarplatten mit gewaschenen Schaferythrozyten ergibt, während dieser Klon auf mit Vollblut angesetzten Blutagarplatten keine Hämolyse-Höfe ergibt. Dieser Subklon ergab ebenfalls eine kontaktabhängige Hämolyse von Schaferythrozyten, die der Hämolyse des pHK101 enthaltenden Klons von E. coli ähnlich ist. Wurde dieses 3,2 kbp lange Fragment unter Verwendung des Vektors pMV261 (das Plasmid wurde als pMV261/S3 bezeichnet) in E. coli kloniert und dann aus einem hämolytischen Transformanten von E. coli gereinigt und in den Stamm LR222 von M. smegmatis hineinkloniert, so stellte man fest, daß auch dieses DNA-Fragment in Mykobakterien-Transformanten nach Wachstum auf 4 Tage lang inkubierten Blutagarplatten Hämolyse-Höfe induziert. Transformanten von E. coli und M. smegmatis, die den Vektor pMV261 enthielten, waren nach 4-tätiger Kultivierung auf Blutagarplatten nichthämolytisch, und Transformanten von M. smegmatis blieben nach 14-tätiger Inkubation negativ. Obwohl Transformanten von E. coli und M. smegmatis, die den Vektor pMV261/S3 enthalten, auf Blutagarplatten hämolytisch waren, ergaben nur die Transformanten von E. coli eine kontaktabhängige Hämolyse der gewaschenen Schaferythrozyten. Eine Analyse der Größe des DNA-Inserts im Plasmid pMV261/S3 wurde nach Replikation des Plasmids in E. coli bzw. M. smegmatis durchgeführt. Diese Studien zeigten, daß bei der Klonierung des Plasmids in M. smegmatis eine Deletion in dem 3,2 kbp langen BamH I-Fragment auftrat. Das aus M. smegmatis direkt isolierte supergeknäulte (supercoiled) Plasmid war etwa 6,0 kbp lang und das aus diesem Plasmid nach Transformation und Replikation in E. coli isolierte BamH I-Fragment war 1,5 kbp lang.
Eine partielle Sequenzanalyse und eine Datenbankrecherche des 3,2 kbp langen Fragments im Plasmid pTBLA3 zeigten, daß dieses Fragment Bereiche enthielt, die zu den umuD- und umuc-Genen homolog sind und mit der von Kitagawa et al., 1985 und Perry et al., 1985 beschriebenen DNA-Sequenz des das umu-Operon enthaltenden chromosomalen Bereichs von E. coli zu 100% übereinstimmt. Um herauszufinden, welches der in diesem Insert vorhandenen Gene den hämolytischen Phänotyp in E. coli und M. smegmatis kodiert, wurde dieses DNA-Insert subkloniert. Es wurde festgestellt, daß ein 1.978 bp langes SalI/NotI-Fragment, das aus dem Plasmid pTBLA3 in den Vektor pMV261 subkloniert wurde, bei E, coli- und M. smegmatis-Transformanten Hämolyse induziert. Eine partielle Sequenzanalyse dieses 1.978 bp langen Inserts in dem Plasmid pTBLA3/S2 zeigte, daß dieses Fragment zusätzlich zu der Teilsequenz des umu-Operons eine bisher nicht beschriebene 852 bp lange DNA-Sequenz enthielt, die sich stromaufwärts von der homologen Bgl II-Schnittstelle der beschriebenen DNA- Sequenz für den umuD enthaltenden chromosomalen Bereich befindet. Die Analyse dieses 1.978 bp langen Inserts durch Subklonierung deutete daraufhin, daß das umuD-Gen für die Induktion des hämolytischen Phänotyps in E. coli oder M. smegmatis nicht verantwortlich ist. Ein aus dem 1.978 bp langen Fragment subkloniertes Bgl II-Fragment, das das intakte umuD-Gen und seinen Promotor in dem Vektor pBluescript IIks- kloniert enthielt, war nicht in der Lage, Transformanten von E. coli einen hämolytischen Phänotyp zu verleihen. Transformanten von E. coli, die das Bgl II/NotI-Fragment aus diesem Insert enthielten, waren ebenfalls nichthämolytisch. Eine Teildeletion des umuD-Gens aus dem Plasmid pTBLA3/S2 hatte keine Wirkung auf den hämolytischen Phänotyp von dieses Plasmid enthaltenden E. coli-Transformanten. Klone von E. coli, die den aus umuD entfernten Bereich und die Teilsequenz von umuC enthielten, waren nicht hämolytisch. Darüber hinaus waren dieselben Stämme von E. coli, wenn sie mit dem Plasmid pSE117, das die klonierten chromosomalen Bereiche des umu-Operons von E. coli enthält, transformiert waren, auf Blutagarplatten oder beim Test auf kontaktabhängiges Hämolysin nichthämolytisch. Die Amplifizierung der chromosomafen DNA des Stammes XL1-Blue von E. coli unter Verwendung von Primern für den flankierenden Bereich des umuD-Gens und für die bisher nicht beschriebene DNA-Sequenz, die sich auf dem 1.978 bp langen Fragment stromaufwärts von umuD befindet, führte bei der genomischen DNA aus E. coli und bei dem Plasmid pTBLA3 zur Amplifizierung der Größe nach identischer Fragmente von 1,6 kbp, wenn die Größe in einem 0,7%igen Agarosegel in TBE ermittelt wurde. Entgegengesetzte Orientierungen des 1.978 bp langen Fragments in Bezug auf den LacZ-Promotor in den Vektoren pUC18 und pUC19 hatten keine Wirkung auf die hämolytischen Phänotypen von diese Plasmide enthaltenden Transformanten von E. coli, was auf das Vorhandensein eines unabhängigen Promotors hindeutet, der in E. coli funktionell war. Ein Sel I-Fragment mit diesem Insert wurde in entgegengesetzten Orientierungen in Bezug auf den hsp60-Promotor in die SalI-Schnittstelle des Vektor pMV261 und diese zwei Plasmide, pMV261/S2 und pMV261S2º, wurden in den Stamm XL1-Blue von E. coli kloniert. Dadurch wurde die Transkription des Gens auf diesem DNA-Insert in entgegengesetzten Orientierungen in Bezug auf den hsp60-Promotor in pMV261, und diente der Untersuchung, ob der unabhängige Promotor in M. smegmatis funktionell ist. Transformanten von E. coli, die pMV261/S2 oder pMV261/S2º enthielten, zeigten sich auf Blutagarplatten in gleichem Maße hämolytisch. Dagegen waren nur diejenigen Transformanten von M. smegmatis hämolytisch, die das Plasmid pMV261/S2º enthielten. Diese Ergebnisse zeigen, daß der unabhängige Promotor des Gens, das Hämolysin in E. coli induzierte, in M. smegmatis nicht funktionell war. Die Orientierung dieses Gens unter der Kontrolle des hsp60-Promotors in pMV261 induzierte einen hämolytischen Phänotyp in M. smegmatis; dies zeigte, daß die Transkription des hpr- Gens auf dem 1.978 bp langen, Hämolysin-induzierenden Fragment in die entgegengesetzte Richtung der homologen, das umuD-Gen enthaltenden DNA- Sequenz stattfindet. Es wurde festgestellt, daß hämolytische Klone von M. smegmatis, die pMV261/S2º enthielten, im Vergleich zu nichthämolytischen Klonen mit pMV261 größere Zellaggregate bei der Kultivierung in 7H9- und TSA-Nährmedium bildeten. Eine vollständige Sequenzanalyse des 1.978 bp langen Fragments bestätigte die Anwesenheit eines zweiten offenen Leserasters, das vermutlich hpr kodiert, und zwar auf dem komplementären Strang und in die entgegengesetzte Richtung der homologen, umuD enthaltenden DNA-Sequenz. Diese hpr-Sequenz wird in SEQ ID NO: 2 (1021 bp) angegeben. Die Orientierung des dieses offene Leseraster enthaltenden Sinnstranges stand in Übereinstimmung mit der wie oben gezeigt in M. smegmatis unter Verwendung des Vektors pMV261 von diesem Gen induzierten Expression eines hämolytischen Phänotyps. Es wurden keine weiteren durchgehenden offenen Leseraster von mehr als 50 Aminosäuren in diesem DNA-Fragment festgestellt. Die DNA-Sequenz weist insgesamt einen G + C-Anteil von 40,8% auf, der für DNA-Sequenzen aus E. coii untypisch ist (Marmur und Doty, 1962). Eine DNA-Sequenz, die sich 17 bp stromaufwärts von dem vermutlichen Startkodon des hpr befindet, stimmt mit der -10- Konsensussequenz für Promotoren in E. coli (TATAAT) in 5 von 6 Positionen überein, und die Sequenz, die sich 46 bp stromaufwärts des Startkodons befindet, stimmt mit der -35-Konsensussequenz (TTGACA) in 4 von 6 Positionen überein. 9 bp stromaufwärts von dem vermutlichen ATG-Codon gibt es ebenfalls eine mögliche Ribosomenbindungsstelle, die mit der Konsensussequenz von E. coli (AGGAAAGG) in 4 von 8 Positionen übereinstimmt. Nimmt man an, daß das vermutliche ATG-Codon in Position 99 der DNA-Sequenz für dieses offene Leseraster das Initiatorkodon ist und befindet sich ein Stoppkodon hinter der NotI-Schnittstelle im Klonierungsvektor in einem Raster mit diesem offenen Leseraster, so kodiert dieses offene Leseraster ein Protein mit 309 Aminosäuren, das mit einem Alanin abschließt. Das auf der Grundlage der DNA-Sequenz vorhergesagte Molekulargewicht für dieses Protein beträgt etwa 34.000 Dalton. Es war ungewöhnlich, daß dieses offene Leseraster kein Stoppkodon enthielt, jedoch stimmte das vorhergesagte Molekulargewicht des von hpr unter Verwendung der Stoppkodonsequenz des Vektors kodierten Proteins mit dem Protein überein, das in Minizellen von E. coli mit diesem Gen exprimiert wird. Hämolytische Klone von E. coli- Minizellen, die pMV261/S2º enthielten, exprimierten ein Protein von etwa 34.000 Dalton; dagegen wurde dieses Protein von nichthämolytischen Minizellen von E. coli, die pMV261 enthielten, nicht produziert. Dies legt nahe, daß das in der Vektorsequenz vorhandene und mit dem offenen Leseraster des hpr in einem Raster stehende Stoppkodon als Terminator des hpr-Gens fungierte, und daß dieses Gen für die Induktion des hämolytischen Phänotyps in diesem E. coli-Klon erforderlich war. Die das vermutliche offene Leseraster für hpr enthaltende DNA-Sequenz wurde auf Homologie auf der DNA- bzw. Aminosäure-Ebene untersucht. Die DNA-Sequenz zeigte eine 62,0%ige Homologie zu einem 129 bp langen Bereich des hctA-Gens von Chlamydien. Es ist beschrieben worden, daß dieses Gen ein Lysin-reiches, Histonähnliches DNA-Bindungsprotein kodiert, das an der Nukleoidkondensation beteiligt ist (Hackstadt et al., 1991). Ferner zeigt das hpr-Gen eine 55,9%ige Homologie zu einem 102 bp langen Bereich des apxl-Operons von Actinobacillus pleuropneumoniae, der das offene Leseraster des apxlA-Strukturgens für Hämolysin enthält. Darüber hinaus bestand eine 62,0%ige bzw. eine 53,3%ige Homologie zu einem 100 bp langen Bereich des LacR-Gens von Lactococcus lactis und zu einem 225 bp langen Bereich des ATP- Operons von M. gallisepticum.
Die Fähigkeit, in anderen Bakterien Membrane zu lysieren, deutet daraufhin, daß Zytolysine bei Vorgängen wie dem Befall oder dem Eindringen in eukaryotische Zellen, der intrazellulären Vermehrung, der Verbreitung von Zelle zu Zelle oder dem Austreten aus Membran-gebundenen Vakuolen oder Zellen eine Rolle spielen (Mims, C. A. et al., The Pathogenesis of Infectious Disease, Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien (1990)). Der genomische Locus für die kontaktabhängige Zytolyse in dem virulenten Stamm H37Rv von M. tuberculosis ist homolog zu genomischen Bereichen der attenuierten Stämme M. tuberculosis H37Ra und M. bovis BCG; folglich könnte die Attenuierung dieser Stämme auf die fehlende oder verminderte Expression dieser zytolytischen Aktivität zurückzuführen sein. Die Hybridisierungs- und Amplifizierungsdaten deuten ebenfalls daraufhin, daß es in M. tuberculosis ein Homolog zu dem umuCD-Operon in E. coli gibt. Eine weitere mögliche Funktion dieser zytolytischen Aktivität könnte in der Freisetzung von Mykobakterien aus schwer befrachteten Makrophagen bestehen. Eine derartige Funktion stünde mit der Beobachtung in Einklang, daß nur Rekombinanten von E. coli aus Kulturen in der stationären Phase diese zytolytische Aktivität exprimieren. Die möglichen Funktionen von Zytolysinen in der Pathogenese sind nicht lediglich auf die Lyse von Membranen beschränkt. Auch in Abwesenheit einer Lyse können bakterielle Zytolysine starke pleiotrope Wirkungen auf eukaryotische Zellen haben (als Übersicht siehe Welch, R.A. et al., Infect. Immun., 43: 156-160 (1991)). Beispielsweise kann der Energiestoffwechsel unterbrochen (Bhakdi, S. et al., J. Clin. Invest, 85: 1746-1753 (1990)) oder die Fähigkeit, auf Außensignale zu reagieren, vermindert sein (Welch, R.A. et al., The Molecular Biology of Microbial Pathogenicity, Academic Press, Inc., New York (1986)).
Daher kann das Gen für den Hämolysin-Regulator, z. B. wie in SEQ ID NO: 2 angegeben, die Grundlage für einen Impfstoff gegen Tuberkulose sein. Das Gen kann mit Hilfe herkömmlicher und im Stand der Technik bekannter Methoden in einen avirulenten Impfstamm wie M. bovis BCG eingefügt werden. Dieser modifizierte Virus kann dann nach den zur Verabreichung von M. bovis BCG als Impfung derzeit benutzten Verfahren und Dosierungen als Impfstoff verabreicht werden. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann wie die bestehenden Impfstoffe aus M. bovis BCG Makrophagen infizieren; jedoch kann der erfindungsgemäße Impfstoff mit seinem Hämolysin-Regulator-Gen die zusätzliche Fähigkeit haben, zur Antigenpräsentation und der darauf resultierenden Zellvermittelten Immunität aus den Phagosomen in das Zytoplasma zu wandern. Auch wenn die vorliegende Erfindung mit Bezug auf spezifische Details bestimmter Ausführungsformen beschrieben wurde, sollen solche Details nicht als Einschränkungen des Schutzumfangs der Erfindung angesehen werden, sofern sie und nur in dem Umfang, in dem sie in die angefügten Ansprüchen einbezogen sind.

LITERATURSTELLEN

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SEQUENZPROTOKOLL

(i) ALLGEMEINE ANGABEN:

(1) ANMELDER: King, C.H.
Sathish, Mundayoor
Shinnick, Thomas M.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: KONTAKTVERMITTELTER HÄMOLYSIN-REGULATOR AUS MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: Suite 1200, The Candler Building
(B) STRASSE: 127 Peachtree Street, N.E.
(C) ORT: Atlanta
(D) BUNDESLAND: Georgia
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 30303-1811
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Perryman, David G.
(B) EINTRAGUNGSNUMMER: 33.438
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 1414.611
(ix) ANGABEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (404) 688-0770
(B) TELEFAX: (404) 688-9880

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1023 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: E. coli
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) KLON: pTBLA3
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 679..682
(D) SONSTIGE ANGABEN:/Produkt = "Translations-Startkodon für kodierende Sequenzen von umuD" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1020 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: E. coli
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 99..101
(D) SONSTIGE ANGABEN:/Anmerkung = "Translations-Startkodon"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 76..81
(D) SONSTIGE ANGABEN:/Anmerkung = "5/6-Übereinstimmung mit -10-Konsensussequenz für E. coli-Promotoren (TATAAT)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 47..52
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Anmerkung = "4/5-Übereinstimmung mit -35-Konsensussequenz (TTGACA)"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(B) LAGE: 87..94
(D) SONSTIGE ANGABEN: /Anmerkung = "4/8-Übereinstimmung mit der E. coli-Konsensussequenz für Ribosomenbindungsstellen (AGGAAAGG)" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 309 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Claims

1. Isolierte, doppelsträngige Nukleinsäure, die in SEQ ID NO: 2 angegeben ist.

2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 in einem Vektor.

3. Isolierte Nukleinsäure, die die Nukleotide 99-1020 der Nukleinsäure gemäß Anspruch umfaßt.

4. Isolierte Nukleinsäure, die die Nukleotide 1-98 der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 umfaßt.

5. Nukleinsäure gemäß Anspruch 4, die operativ mit einem Reportergen verbunden ist.

6. Isolierte Nukleinsäure mit einer Länge von wenigstens 18 Nukleotiden, die selektiv mit der Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 hybridisiert.

7. Nukleinsäure gemäß Anspruch 5 in einem Vektor.

8. Vektor gemäß Anspruch 7 in einem zur Expression der Nukleinsäure geeigneten Wirt.

9. Aufgereinigtes Protein umfassend das in SEQ ID NO: 3 angegebene Polypeptid, oder ein biologisch aktiver Teil davon.

10. Isolierte Nukleinsäure, die das Protein gemäß Anspruch 9 kodiert.

11. Vektor, der die Nukleinsäure gemäß Anspruch 10 umfaßt.

12. Antikörper, der spezifisch an das Protein gemäß Anspruch 9 bindet.

13. Vektor gemäß Anspruch 11 in einem zur Expression der Nukleinsäure geeigneten wirkt.

14. Wirt gemäß Anspruch 13, worin der Wirt M. bovis BCG ist.

15. Wirt gemäß Anspruch 13, worin der Wirt Mycobacterium smegmatis ist.

16. Verwendung des Wirts gemäß Anspruch 14 zum Herstellen eines Medikaments zum Fördern einer Immunantwort in einer Person gegen Mycobacterium tuberculosis.

17. Verwendung des Wirts gemäß Anspruch 15 zum Herstellen eines Medikaments zum Fördern einer Immunantwort in einer Person gegen Mycobacterium tuberculosis.

18. Verfahren zum Erhöhen der Immunogenizität eines M. bovis BCG-Impfstoffs in einer Person umfassend das Einführen des Vektors gemäß Anspruch 11 in den M. bovis BCG-Impfstoff vor der Verabreichung des Impfstoffs an die Person.

19. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines virulenten Stamms von Mycobacterium tuberculosis in einer Probe umfassend:

a) das Identifizieren des Vorhandenseins von Mycobacterium tuberculosisspezifischer Nukleinsäuresequenz in der Probe durch Hybridisieren mit einer Probe, die eine Länge von wenigstens 18 Nukleotiden aufweist, wobei die Probe selektiv mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Nukleinsäuresequenz hybridisiert, und

b) das Nachweisen der Kontakt-vermittelten hämolytischen Aktivität in der Probe, wobei das Vorhandensein von Mycobacterium tuberculosis und der Kontaktvermittelten hämolytischen Aktivität das Vorhandensein eines virulenten Stamms von Mycobacterium tuberculosis anzeigen.