DE69331733T2

DE69331733T2 - Rekombinantes vielwertiges m-protein-vakzin

Info

Publication number: DE69331733T2
Application number: DE69331733T
Authority: DE
Inventors: B. Dale; W. Lederer
Original assignee: University of Tennessee Research Foundation
Current assignee: University of Tennessee Research Foundation
Priority date: 1992-09-16
Filing date: 1993-09-15
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2013-09-16
Also published as: ATE214601T1; US6063386A; EP0625043A4; IL107025A0; DE69331733D1; ES2170075T3; WO1994006421A1; DK0625043T3; AU5128493A; EP0625043B1; CA2123579C; EP0625043A1; CA2123579A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft rekombinante, multivalente M-Protein-Vakzine, die nützlich sind, um Gruppe A-Streptokokken-Infektionen verschiedener Serotypen, die zu rheumatischen Fieber, rheumatischer Herzerkrankung führen können, zu beherrschen, und andere Ausführungsformen, die hier näher beschrieben werden.

Hinterrund der Erfindung

Akutes rheumatisches Fieber (ARF) ist die Hauptursache einer Herzerkrankung bei Kindern auf der ganzen Welt. Diese Erkrankung grassiert in Entwicklungsländern, wo der Grad der Verbreitung der rheumatischen Herzerkrankung mindestens 35-40 pro 1.000 Individuen betragen kann. Einer Schätzung zufolge betrifft sie nahezu 6 Millionen Kinder im Schulalter in Indien. Obwohl die Häufigkeit von ARF in den Vereinigten Staaten und anderen westlichen Ländern während der zweiten Hälfte des 20. Jahrhunderts deutlich abnahm, hat es kürzlich ein bemerkenswertes Wiederaufleben dieser Erkrankung in den Vereinigten Staaten gegeben. Der Bedarf an einem sicheren und wirksamen Vakzin ist deshalb dringend und ernst.
Streptokokken sind eine Gruppe von Bakterien mit der Fähigkeit, in Ketten zu wachsen. Viele Unterarten sind Teil der normalen Bakterienflora im Menschen und sind nicht besonders schädlich. Eine bestimmte Untergruppe von Streptokokken-Bakterien allerdings, genannt Gruppe A und vertreten durch Streptococcus pyogenes, ist ein Humanpathogen. Zwischen 20 und 30 Millionen Fällen von GruppeA-Streptokokken-Infektionen treten jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten auf. Diese Fälle schließen Infektionen der Haut und des Rachens, Formen von Pneumonie und eine in jüngerer Zeit identifizierte Erkrankung, die dem toxischen Schock ähnelt, ein. Die geläufigste Injektion ist die akute Streptokokken-Pharyngitis oder Halsentzündung, die vor allem bei Kindern im Schulalter auftritt. Die Halsentzündung eignet sich als ein weltweit größtes Gesundheitsproblem, wenn nur die Ausfallzeit in der Schule und bei der Arbeit und die Menge an entsprechenden Arzthonoraren, die bezahlt werden, beurteilt werden.
Der Tribut der Halsentzündung ist allerdings sehr viel größer. In 4% der Fälle von Pharyngitis, die nicht oder ineffektiv behandelt werden, führt die Halsentzündung zu ARF. Gegenwärtige Bestrebungen, ARF zu verhüten, vertrauen auf eine Behandlung der Pharyngitis mit Antibiotika. Während eines jüngsten Ausbruchs von ARF in Utah nahmen nur ein Viertel der Patienten vor Beginn der Symptome ärztliche Hilfe in Anspruch, und nur ein Drittel berief sich auf kürzliche Halsschmerzen. Die Feststellung, daß ARF einer subklinischen Infektion in einer derart hohen Prozentzahl von Individuen folgen kann und die Tatsache, daß ein Zugang zu ärztlicher Hilfe in Entwicklungsländern nicht weitgehend verfügbar ist, dient dazu, den Bedarf an einem sicheren und wirksamen Vakzin gegen Gruppe A-Streptokokken zu unterstreichen.
Die kausale Beziehung zwischen einer Streptokokken-Pharyngitis und ARF wurde vor über 50 Jahren begründet, dennoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese dieser Erkrankung unklar. Es wird allgemein daran festgehalten, daß ARF eine Autoimmunerkrankung ist, und daß in einem empfindlichen Wirt die Infektion eine Immunantwort verstärkt, die zu entzündlichen und manchmal destruktiven Änderungen in Zielgeweben führt. Es wurde gezeigt, daß Streptokokken Antigene enthalten, die immunologisch mit Wirtsgeweben kreuzreaktiv sind, und es ist gezeigt worden, daß Herz-kreuzreaktive Antikörper von Patienten mir rheumatischem Fieber mit Streptokokken reagieren. Allerdings wurde auch gezeigt, daß Seren von Patienten mit unkomplizierter Pharyngitis ebenfalls Herz-kreuzreaktive Antikörper enthalten können, dennoch entwickeln diese Patienten kein klinisches Anzeichen einer Karditis. Bis die Bedeutung von Gewebe-kreuzreaktiven Antikörpern in der Pathogenese von ARF besser verstanden wird, bleibt ein Notwendigkeit, potentiell schädliche Epitope aus Vakzin- Präparationen auszuschließen.
Das Oberflächen-M-Protein von Gruppe A-Streptokokken ist der hauptsächliche Virulenzfaktor und das protektive Antigen dieser Organismen. Gruppe A-Streptokokken haben ein System entwickelt, um einige der antimikrobiellen Abwehrmechanismen eines menschlichen Wirts zu vermeiden. Stämme von Streptokokken, die reich an M-Protein sind, umgehen eine Phagozytose durch PMNs und vermehren sich in nicht-immunem Blut. Dennoch ist eine Resistenz gegen eine Infektion durch diese Bakterien möglich, wenn der Körper des Wirts opsonisierende Antikörper, die gegen das M-Protein gerichtet sind, produzieren kann. Derartige Antikörper werden die protektive Fähigkeit des M-Proteins neutralisieren und ermöglichen, den Streptokokkus durch Phagozyten zu verschlingen und zu zerstören. Die Entwicklung sekretorischer oder mukosaler Antikörper, im Gegensatz zu opsonsisierenden Serumantikörpern, steht jetzt im Verdacht, eine wichtige Rolle beim Verhüten von Streptokokken- Infektionen zu spielen.
Ein hauptsächliches Hindernis für eine effektive Vakzinentwicklung ist die sehr große Anzahl von M-Protein-Serotypen gewesen. Siehe Stollerman, "Rheumatic Fever and Streptococcal Infection", Grune & Stratton (1975). Von diesen wird berichtet, daß sie bis heute ungefähr 82 zählen und es kann erwartet werden, daß mehr identifiziert werden.
Es ist gezeigt worden, daß Antikörper gegen einen Serotyp nicht notwendigerweise einen Schutz gegenüber anderen bieten, obwohl einige durchaus mit anderen kreuzreagieren. Immunität scheint folglich Typ- oder Serotyp-spezifisch zu sein, und optimale Vakzine würden erfordern, daß die meisten der Serotypen vertreten werden. Das Konzept der "rheumatogenen" und "nicht-rheumatogenen" Organismen wird durch vielfache Kontrollstudien über mehrere Jahre und in unterschiedlichen Gegenden der Welt unterstützt. Demzufolge sind wahrscheinlich ungefähr 12-15 Serotypen für die meisten Fälle von ARF verantwortlich. Einige von diesen sind die Typen 1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24, 27 und 29.
Um zu einem besseren Verständnis der Erfindung zu verhelfen, ist eine Beschreibung der M- Protein-Struktur nützlich. Siehe Scientific American, June 1991, Streptococcal M Protein by Vincent A. Fischetti. Betrachtet man eine typische M-Protein-Struktur, wie etwa die von Typ M6, sind ungefähr 80% des M6-Moleküls aus vier distinkten Regionen aufgebaut, von denen jede aus wiederholten Sequenzen von Aminosäuren besteht. Diese Regionen werden willkürlich durch die Buchstaben A bis D bezeichnet. Nahe dem N-terminalen oder Aminoende, dem Teil des Moleküls, das am weitesten von der Bakterienzelle entfernt liegt, liegt Region A. Diese Region hat fünf Tandem-repetitive Sequenzen oder Blöcke von jeweils 14 Aminosäuren. Die drei zentralen repetitiven Sequenzen sind identisch, während die repetitiven Sequenzen an jeden Ende der Region geringfügig von der allgemeinen Aminosäuresequenz abweichen. Als nächstes auf dem Molekül ist Region B gelegen, die eine ähnliche 5-fach repetitive Struktur aufweist, außer daß die wiederholten Blöcke 25 Aminosäuren enthalten. Region C besteht aus zweieinhalb Tandem-repetitiven Sequenzen von jeweils 42 Aminosäuren; die Identität dieser Blöcke ist nicht so groß wie bei den A- und B-repetitiven Sequenzen. Region D ist aus 4 partiellen repetitiven Sequenzen aufgebaut, die 7 Aminosäuren enthalten. Der Abschnitt, der in die Zelle eingebettet ist, erstreckt sich von ungefähr der letzten repetitiven Sequenz der C-Regioin bis zu dem C-Terminus.
Angrenzend an die D-repetitiven Blöcke liegt eine Region nicht-repetitiver Sequenzen, die ein Übermaß an Prolin- und Glycin-Aminosäuren enthält, die nach einem nahezu regulären Muster verteilt sind. Jenseits dieser Region liegt das C-terminale oder Carboxyende des Moleküls, welches der Teil innerhalb der Zelle ist. Nahe dem C-terminalen Ende gibt es 20 hydrophobe Aminosäuren und am Terminus selbst 6 geladene Aminosäuren.
Ähnliche Anordnungen von repetitierenden Blöcken treten in den M-Proteinen von Typ 5-, 12-, 24- und anderen Streptokokken auf. EinVergleich der Aminosäuresequenzen dieser verschiedenen M-Proteine zeigt, daß ihre C-terminalen Enden zu mehr als 98% identisch sind. Näher zum N-Terminus nehmen Sequenzunterschiede zwischen M-Proteinen allerdings zu. Folglich sind die A-repetitiven Blöcke und eine kurze Aminosäureregion von ungefähr 10 bis ungefähr 20 Aminosäuren an dem N-Terminus bei jedem M-Molekül einzigartig. Diese Einzigartigkeit ist die Hauptdeterminante der Serotyp-Spezifität der immunologischen Antwort.
In der Aminosäuresequenz von M6 und später in anderem M-Protein entdeckt, offenbarte sich ein weiteres, verblüffendes strukturelles Detail selbst. Durchgängig durch alle die repetitiven Regionen gibt es ein ungewöhnliches 7-Aminosäuren-Muster: die Aminosäuren in der ersten und vierten Position sind hydrophob; die dazwischen liegenden Aminosäuren erlauben dem Protein, sich selbst in eine spirale Form zu verdrehen, die als eine alpha-Helix bezeichnet wird.
Das Muster aus 7er-Einheiten in der Anordnung der Aminosäuren in M6 zeigt, daß die repetitiven Regionen des Proteinmoleküls einen langen helikalen Stab aufbauen. Das Muster in M6 ist weder perfekt, noch wird das Muster in vielen anderen Coiled-Coil-Strukturen gefunden. Solche Unregelmäßigkeiten sind wahrscheinlich für die Flexibilität der M-Moleküle, die in Elektronen-Mikrophotographien beobachtet wird, verantwortlich. Wichtiger ist, daß sich die Charakteristika dieser Unregelmäßigkeiten in den A-, B- und C-repetitiven Regionen unterscheiden. Diese Beobachtung legt nahe, daß sich jede repetitive Region unabhängig entwickelt hat und eine eigene Funktion haben könnte. Für eine Darstellung der Proteinsequenz von M6, bestimmt durch Klonierung ihres Gens, und für verschiedene Formen verwandter M- Proteine, wenn Streptokokken-Mutanten Kopien der repetitiven Aminosäuresequenzen, die in dem parentalen Molekül, insbesondere im N-Terminus, gefunden werden, deletieren, siehe Scientific American, wie oben zitiert. Untersuchungen haben gezeigt, daß jede M-Protein- Faser an einer Streptokokken-Zellwand ungefähr 50 bis 60 Billionstel Meter lang ist und aus einem einzelnen Coiled Coil-Dimer (zwei M-Proteine, die umeinander gewunden sind) besteht.
Es ist wahrscheinlich, daß M-Proteine aller Serotypen nach einem grundsätzlichen Motiv aufgebaut sind; sie haben eine übermäßig lange Coiled Coil-Stab-Region in ihren Zentren, die von einem biegsamen Abschnitt an dem N-terminalen Ende flankiert ist, und eine verankernde Region an dem C-terminalen Ende. Da die alpha-helikale Coiled Coil-Struktur eine große Anzahl verschiedener Aminosäuresequenzen beherbergen kann, können viele verschiedene M-Proteine mit der gleichen allgemeinen Konformation konstruiert werden, wie nachfolgend gezeigt wird.
Damit ein M-Protein einen Streptokokkus schützt, muß es in der Lage sein, sich an den Organismus anzuheften. Der Mechanismus, der Oberflächenproteine auf Gram-positiven Bakterien festhält, wird noch immer wenig verstanden, aber verschiedene Untersuchungen des M- Proteins sind in dieser Hinsicht aufschlußreich gewesen.
Es wird angenommen, daß die 20 hydrophoben Aminosäuren nahe dem C-terminalen Ende in die ähnlich hydrophobe Membran selbst verankert sind, während die geladenen Aminosäuren an dem äußersten Terminus in das wässrige Zytoplasma hinausragen. Da die geladenen Aminosäuren widerstehen würden, sich in eine hydrophobe Umgebung zu bewegen, würden sie sich wie ein Knoten am Ende einer Schnur verhalten, wodurch das M-Molekül davor geschützt wird, durch die Membran gezogen zu werden. Dieser Mechanismus kann für einige Proteine, die an Membranen angeheftet sind, wertvoll sein. Jüngere Hinweise allerdings zeigen, daß der Anhefiungsmechanismus bei M-Proteinen und anderen bakteriellen Oberflächenproteinen eigentlich komplizierter sein kann. Untersuchungen haben gezeigt, daß alle Oberflächenproteine von Gram-positiven Bakterien eine ähnliche Anordnung von hydrophoben und geladenen Aminosäuren an ihrem C-terminalen Ende aufweisen. Siehe beispielsweise Fischetti et al., Surface Proteins form Gram-Positive Cocci Share Unique Structural Features, New Perspectives on Streptococci and Streptococcal Infections, (G. Orefici, Editor), Gustav and Jena (Publishers) 1992.
Wichtiger ist allerdings, daß eine kurze 6er-Aminosäuresequenz, die der hydrophoben Region benachbart ist, in allen bekannten Oberflächenproteinen von Gram-positiven Bakterien hochkonserviert ist. Die Sequenz besteht aus einem Leucin, einem Prolin, einem Serin, einem Threonin, einem Glycin und einer Glutaminsäure. Ihre Bezeichnung wird gewöhnlich mit LPSTGE abgekürzt.
Die Bedeutung der LPSTGE-Sequenz für die Anheftung des M-Proteins (und wahrscheinlich bei allen anderen Proteinen mit diesem Sequenzmotiv) wurde durch genetische Experimente gezeigt, von denen berichtet wurde. Es wurde gefunden, daß wenn nur die LPSTGE-Sequenz aus dem M-Protein-Gen entfernt wird, das M-Molekül, das hergestellt wurde, nicht an die bakterielle Membran anheften würde. Dieses Ergebnis legte nah, daß die hydrophobe Domäne und die geladenen Aminosäuren an dem C-Terminus für eine Membrananheftung nicht ausreichen, und daß das LPSTGE-Motiv ein wichtiges Signal zum Initiieren dieses Prozesses sein könnte.
Bei nahezu allen Oberflächenproteinen, die in Gram-positiven Bakterien gefunden wurden, gibt es eine weitere unverwechselbare Region, die sich über ungefähr S0 bis 75 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite der hydrophoben Region erstreckt. Dieser Teil ist wahrscheinlich innerhalb des Peptidoglycans lokalisiert. Prolin, Glycin, Threonin und Serin machen einen hohen Prozentsatz dieser Aminosäuren aus. Der Grund für ihre Häufigkeit ist nicht vollständig erforscht worden, aber es wird angenommen, daß Proline und Glycine Drehungen und Biegungen in Proteinen schaffen können. Eine Hypothese behauptet, daß Quervernetzungen in dem Peptidoglycan sich durch die Prolin- und Glycin-induzierten Biegungen ziehen können, wodurch die Position des M-Proteins in der Zellwand stabilisiert wird.
Die Kenntnis, daß alle bekannten Oberflächenproteine auf Gram-positiven Bakterien sich durch einen ähnlichen Mechanismus selbst anheften, könnte neue Wege eröffnen, wie etwa ein Beherrschen von Infektionen, die durch diese Organismen verursacht werden. Oberflächenproteine helfen pathogenen Organismen, Infektionen auszulösen. Es ist vorgeschlagen worden, daß indem die Proteine vom Verankern in der bakteriellen Zelle abgehalten werden, man eventuell in der Lage sein sollte, Infektionen zu verhindern und einige der Probleme, die mit einer Resistenz gegenüber Antibiotika-Therapien verbunden sind, zu umgehen.
Ebenso wie die Strukturen am C-terminalen Ende des Moleküls Information dazu bereitstellen, wie das M-Protein an die Bakterienzelle anheftet, bieten Strukturen an dem N-terminalen Ende Hinweise darauf, wie das Molekül dazu beiträgt, Phagozyten abzuwehren. Das Nterminale Ende aller M-Moleküle hat ein Überschuß an negativ geladenen Aminosäuren, der zu einer negativen Nettoladung für den Bereich führt. Säugetierzellen zeigen ebenfalls eine negative Ladung auf ihrer Oberfläche. Es ist vorgeschlagen worden, daß die Ladung auf M- Proteinen sich deshalb entwickelt hat, um einen Kontakt zwischen Streptokokken und phagozytischen Zellen durch elektrostatische Abstoßung zu behindern. Es ist vorgeschlagen worden, daß eine Funktion des zentralen Stabs in dem M-Protein darin besteht, als ein Speer zu wirken, der das negativ geladene N-terminale Ende - und Phagozyten - von der bakteriellen Oberfläche weghält.
An dem N-terminalen Ende des Coiled Coil-Stabs gibt es ebenfalls eine hypervariable Region. Dieser Teil des Moleküls weist in jedem M-Serotyp eine unverwechselbare Sequenz auf. Die hypervariable Region besteht aus der kurzen, 10-30 Aminosäuren großen, nicht-helikalen Sequenz und, falls vorhanden, der benachbarten A-repetitiven Region. Die hypervariable Region spielt eine wichtige Rolle bei der biologischen Aktivität des Moleküls; Antikörper gegen diesen Bereich sind zum Vorantreiben von Phagozytose und Abtöten der Streptokokken optimal. Diese Beobachtung erklärt wieder, weshalb nur Serotyp-spezifische Antikörper gegen Streptokokken-Infektionen schützen.
Ein Kennzeichen von rheumatischem Fieber ist das Vorhandensein von Antikörpern im Serum eines Patienten, die mit Muskelgewebe, insbesondere Herzgewebe, reagieren. Siehe "Rheumatic Fever" von Earl H. Freimer und Maclyn McCarty; Scientific American, Dezember 1965. Normalerweise werden gegen eigene Gewebe keine Antikörper hergestellt. Forscher haben j edoch entdeckt, daß sogenannte kreuzreaktive Antikörper manchmal durch ein Molekül in einem infektiösen Organismus, das einem in dem Säugetierwirt ähnelt, induziert werden. Bei dem Prozeß einer Produktion von Antikörpern gegen die mikrobiellen Moleküle, mit dem Zweck, eine Infektion zu beseitigen, wird der Körper getäuscht, so daß Antikörper gegen seine eigenen Gewebe (serologische Kreuzreaktivität) erzeugt werden, eine potentiell gefährliche Entwicklung.
Aus dieser Beschreibung heraus ist es einleuchtend, daß es einen wichtigen und dringenden Bedarf an einem Vakzin gibt, das gegen die verschiedenen Serotypen von Gruppe A- Streptokokken wirksam ist. Das Vakzin sollte in der Lage sein, Serotyp-spezifische Antikörper zu erzeugen, vornehmlich jene, die in der Lage sind, akutes rheumatisches Fieber auszulösen, ohne eine Kreuzreaktion mit menschlichem Gewebe hervorzurufen. Ebenfalls gibt es einen bedeutenden Bedarf an einem Vakzin, das nicht nur diese Eigenschaften aufweist, sondern auch in der Lage ist, protektive Antikörper gegen Infektionen, Halsentzündung, Hautinfektionen, verborgene Gewebeinfektionen und dergleichen, worauf nicht notwendigerweise, häufig jedoch rheumatisches Fieber folgt, hervorzurufen. Die Erfindung trägt zum Lösen dieser wichtigen Bedürfnisse der menschlichen Gesundheit bei.
Folglich gibt es einen wichtigen Bedarf an einem Vakzin, das gegen Streptokokken- Infektionen wirksam ist, welches humorale Immunantworten gegen die verschiedenen Serotypen von Gruppe A-Streptokokken und, falls erwünscht, auch zelluläre Immunantworten verfügbar macht. Das Vakzin sollte keine Antikörper hervorrufen, die mit menschlichem Herzgewebe reagieren.
In Verbindung mit Untersuchungen des M-Proteins verschiedener Serotypen ist festgestellt worden, daß in den meisten Fällen die protektiven Epitope des M-Proteins von den potentiell schädlichen Autoimmun-Epitopen des Moleküls getrermt werden können (siehe Referenzen 5-7). Für die NH&sub2;-terminalen Segmente von M-Proteinen ist gefunden worden, daß sie Antikörper mit der größten bakteriziden Aktivität hervorrufen.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß synthetische Peptide, die begrenzte Regionen von M-Proteinen der Typen 5, 6 und 24 kopieren, Typ-spezifische, opsonisierende Antikörper hervorrufen, die mit Herzgewebe nicht kreuzreaktiv sind. Aufgrund ihres Fehlens von Immunogenität allerdings war es notwendig, die synthetischen Peptide chemisch mit Trägerproteinen kovalent zu verknüpfen (siehe Referenzen 5-7). Derartige Fragmente von M-Proteinen, die mit Hilfe chemischer Reagenzien mit Trägerproteinen verknüpft sind, führen nicht zu Hybrid-Proteinen mit definierten Strukturen. Folglich ist es nicht möglich gewesen, Antigene zu erhalten, die spezifische, gewünschte Antikörper hervorbringen, ohne eine Zunahme des Risikos unerwünschter Nebenreaktionen zu verursachen. Weiterhin ist die Bildung von Hapten- Träger-Komplexen unter Verwendung chemischer, quervernetzender Reagenzien zeitaufwendig und kostspielig und führt zu undefinierten, heterogenen Gemischen von Vakzin- Bestandteilen. Diese Erfindung macht multivalente Vakzine, die Typ-spezifisch sind und nicht die Nachteile des Stands der Technik haben, verfügbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Patentanmeldung ist mit der Patentanmeldung Nr. EP-A-0618813 mit dem Titel "ANTIGEN OF HYBRID M PROTEIN AND CARRIER FOR GROUP A STREPTOCOCCAL VAKZINE", in der James D. Dale als Erfinder genannt wird, verwandt und gemeinsam mit dieser am selben Tag eingereicht worden.
Die Erfindung betrifft ein rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein-Vakzin gegen eine Vielzahl von Serotypen von Gruppe A-Streptokokken, wobei mindestens einer der genannten Serotypen M1 ist. Das Vakzin umfaßt ein Proteinmolekül, das Epitope (antigene Determinanten) enthält, das opsonisierende Antikörper gegen eine Vielzahl von Serotypen von Gruppe A-Streptokokken hervorruft. Das Molekül enthält ein Aminosäurefragment, das mindestens ein Epitop enthält, das humorale, opsonisierende Antikörper vom Serotyp M1 hervorruft. Die entsprechenden Fragmente sind wahlweise als Tandem durch Linker verknüpft, die Aminosäuren beinhalten. Das M-Protein ist frei von Epitopen, die Antikörper erzeugen, die mit dem menschlichen Herzgewebe kreuzreagieren. Das Hybrid-M-Protein wird durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt.
Das multivalente Hybrid-M-Protein enthält Aminosäurefragmente, die aminoterminale Fragmente des M-Proteins sind und deshalb in der Lage sind, die gewünschten opsonisierenden Antikörper gegen die Vielzahl von Serotypen von Gruppe A-Streptokokken hervorzurufen. Die Erfindung betrifft auch multivalente Hybrid-M-Proteine, die zusätzlich zu Aminosäurefragmenten, die opsonisierende Antikörper gegen spezifische Serotypen von Gruppe A- Streptokokken hervorrufen, auch Aminosäurefragmente mit Epitopen, die auch protektive, zelluläre Immunität oder mukosale Antikörper hervorrufen, tragen.
Bei dem Hybrid-M-Protein der Erfindung müssen die Aminosäurefragmente nicht alle als solches immunogen sein, werden sie jedoch mit anderen Aminosäurefragmenten coexprimiert, ist das Hybridmolekül gegen mindestens mehr als einen Serotyp von Gruppe A- Streptokokken, einschließlich Serotyp M1, immunogen.
Von besonderem Interesse sind rekombinante, multivalente, immunogene Hybrid-M-Proteine, welche aminoterminale Fragmente des M-Proteins umfassen, welche Epitope enthalten, die Antikörper hervorrufen, die für rheumatisches Fieber ursächlich sind, wie etwa die Serotypen 1, 3, 5, 6, 14, 18, 19, 24, 27 und 29 oder andere. Idealerweise ist das Hybrid-M-Protein aus einer Vielzahl von Aminosäurefragmenten aufgebaut, die vorselektiert sind, um Antikörper gegen die speziellen Ziel-Serotypen von Gruppe A-Streptokokken hervorzurufen.
Die Erfindung betrifft auch ein Vakzin von M-Protein-Typ, das multivalent oder allgemein, wie etwa tetra-, penta- oder hexavalent, gegen die entsprechende Anzahl von Serotypen von Gruppe A-Streptokokken ist, wobei mindestens ein Serotyp M1 ist. Folglich betrifft die Erfindung Hybridproteine, die verschiedene Aminosäurefragmente der C-repetitiven Sequenzen eines M-Proteins verschiedener Serotypen umfaßt, welche zelluläre Immunantworten verursachen, insbesondere solche, die nicht gewebe-kreuzreaktiv sind. Derartige Hybrid-Proteine können auch Fragmente vom Aminoterminus der verschiedenen Serotypen beinhalten, um eine Hybrid-Zusammensetzung zu ergeben, die eine humorale Immunantwort und eine oder mehrere zelluläre Immunantworten hervorruft. Die multivalenten Vakzine können von jedem speziellen aminoterminalen Fragment unterschiedlichen Serotyps eines oder mehr als eines, d. h. Repititionen, enthalten.
Weiterhin müssen die Fragmente nicht, können jedoch dieselbe Aminosäurelänge aufweisen. Weiterhin zieht die Erfindung eine Mischung oder einen "Cocktail" aus Hybrid-M-Protein, welches geeignete Epitope trägt, um die gewünschten opsonisierenden Antikörper gegen die Ziel-Serotypen hervorzubringen, in Erwägung. Die Mischung aus diesen Hybriden wird gegen eine große Zahl, wenn nicht alle, der Ziel-Streptokokken-Typen wirksam sein, insbesondere jene, welche die Ursache von rheumatischem Fieber sind.
Die Erfindung betrifft auch Mischungen von individuellen Hybrid-M-Protein-Molekülen, die in der Lage sind, nicht nur opsonisierende Antikörper gegen eine Vielzahl von Serotypen von Gruppe A-Streptokokken, einschließlich Serotyp M1, hervorzubringen, sondern auch mukosale Antikörper hervorzubringen. Auf diese Weise macht die Erfindung, wie gewünscht, ein vollständiges Vakzin nicht nur gegen jene Serotypen, die wahrscheinlicher rheumatisches Fieber auslösen oder verursachen, sondern auch jene, welche die oben beschriebenen Infektionen verursachen, welche häufig zu rheumatischem Fieber führen können, verfügbar.
In Übereinstimmung mit der Erfindung können die Aminosäurefragmente, welche die gewünschten protektiven Epitope (opsonisierend oder mukosal) tragen, miteinander als Tandem durch Linker, die Aminosäuren umfassen, fusioniert sein (müssen aber nicht). Eine große Vielzahl derartiger Aminosäure-Linker kann in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden. Es ist wünschenswert, daß die Aminosäuren zu der Orientierung, Konformation und eigentlich zu der immunologischen Zugänglichkeit der Epitope der Fragmente beitragen, um eine optimale Immunantwort zu erzeugen. Es ist nicht ausgeschlossen, daß diese Aminosäure-Linker ein oder mehrerer Moleküle, die keine Aminosäuren sind, enthalten.
In Übereinstimmung mit der Erfindung kann die Reihenfolge, d. h. die Sequenz von Aminosäurefragmenten, welche die Hybrid-M-Proteine, welche die protektiven Epitope tragen, aufbaut, wie gewünscht geändert werden, um die immunogene Wirkung des Moleküls zu maximieren.
Wie oben angeführt, betrifft die Erfindung Hybrid-M-Proteine, die Aminosäuren der Aminotermini der M-Proteine, d. h. M24, M5, M6 und M19, und Aminosäuren des Carboxyterminus von Typ 5-M-Protein einschließen. Dieses Vakzin erzeugt Typ-spezifische, opsonisierende Antikörper gegen alle die verwandten M-Fraktionen, einschließlich Serotyp M1, kreuzprotektive mukosale Immunantworten gegen zwei oder mehrere von diesen und zelluläre Immunität.
Ebenfalls offenbart wird ein spezielles PCR-Verfahren, das erlaubt, die kodierenden Nukleotidsequenzen zu organisieren, um die gewünschten Aminosäurefragmente (oder Sequenzen) in der gewünschten Reihenfolge zu exprimieren.
Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren zur Immunisierung mit den therapeutischen, rekombinanten, multivalenten Hybrid-M-Proteinen der Erfindung oder mit einer Zusammensetzung, welche das rekombinante, multivalente Hybrid-M-Protein, und einen geeigneten biochemisch oder pharmazeutisch akzeptierbaren Trägerstoff umfaßt. Die immunogenen Hybrid-M- Proteine der Erfindung können mit dem biochemisch oder pharmazeutisch akzeptierbaren Trägerstoff formuliert werden, um ein Vakzin herzustellen, das eine wirksame Menge des gewünschten Antikörpers in dem Versuchssäugetier, einschließlich dem Menschen, hervorruft, um die gewünschte Immunität, d. h. humoral oder humoral und zellulär, verfügbar zu machen.
Weiterhin werden avirulente Mikroorganismen, die mit rekombinanten, multivalenten Hybrid-M-Protein-Genen der Erfindung (oder Teilen davon) transformiert (oder transfiziert) sind, offenbart. Der Mikroorganismus kann als solches avirulent sein oder kann durch im Stand der Technik bekannte Verfahren nicht-virulent gemacht worden sein. Das avirulente Wirtsbakterium ist unfähig, in dem zu immunisierenden Individuum Kolonien zu bilden, im allgemeinen mittels einer Nährstoffdefizienz; trotzdem wird sich das Bakterium gerade bis zu einem begrenzten Ausmaß multiplizieren, um das M-Protein-Antigen freizusetzen und die entsprechenden Antikörper hervorzurufen. Derartige Zusammensetzungen sind sehr gut zur oralen Verabreichung geeignet.
Die Erfindung betrifft auch die Hybrid-Gene, welche für die gewünschten Hybrid-M-Proteine kodieren und diese in einem geeigneten selbstreplizierenden Vehikel exprimieren.
Die Erfindung macht weiterhin eine Modifikation der Aminosäuresequenzen, welche das antigene Hybrid-Molekül aufbauen, verfügbar, wobei durch ein chemisches Verfahren, falls gewünscht, an irgendeiner der Aminosäuren ein anderes Molekül angehängt und/oder durch ein solches ersetzt und/oder die Immunogenität des Hybridmoleküls modifiziert wird.
Diese Zusammenfassung der Erfindung beabsichtigt nicht, alle Ausführungsformen (oder Aspekte) der Erfindung zusammenzufassen.

Kurze Beschreibun dg er Figuren

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA der rekombinanten und trivalenten Aminosäuresequenzen von M24-M5-M6.
Fig. 2 zeigt die Immunoblot-Analyse von gereinigtem M24-M5-M6-Hybrid-Vakzin.
Fig. 3 zeigt ELISA-Inhibitionstests.
Fig. 4 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des tetravalenten M24-M5-M6-M19-Hybridmoleküls.
Fig. 5 zeigt die Immunoblot-Analyse des M24-M5-M6-M19-Hybridvakzins.
Fig. 6 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des tetravalenten Hybrids M24-M5-M6-M19 mit verschiedenen Linkem.
Fig. 7 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des tetravalenten Hybrids M24-M5-M6-M19, aufgebaut aus Repititionen kleinerer Fragmente von jedem der verschiedenen Serotypen, wobei diese Fragmente direkt durch ihre entsprechenden Amino- und Carboxyenden mit dem benachbarten Fragment an den angelebenen Restriktionsstellen verknüpft sind.
Fig. 8 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA des tetravalenten, hybriden M24- M5-M6-M19-C-Terminus aus 915 Nukleotiden, welche das 305 Aminosäuren lange Hybrid kodieren, wobei die COOH-terminale Hälfte von M5 an die Restriktionsstelle PstI geknüpft ist.
Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des tetravalenten Hybrids M19-M6-M5-M24, wobei die Untereinheiten umgekehrt wie in dem in Fig. 4 gezeigten Konstrukt angeordnet sind. Keine Linker verbinden die Fragmente des Nukleotids und die der Aminosäuren.
Fig. 10 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA eines divalenten M24-M5- Hybrids.
Fig. 11 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA des tetravalenten M19-M6-M5- M24 von 1029 Nukleotiden Länge, die an C-repetitive Sequenzen des Carboxyterminus geknüpft sind.
Fig. 12 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA des tetravalenten, hybriden M24-M5-M6-M19, abgeleitet von 15 Aminosäureeinheiten, die direkt miteinander verbunden sind.
Fig. 13 zeigt die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA des oktavalenten Hybridproteins M24-M5-M6-M19-M4-M1-M18-M12, das einen nicht-rheumatogenen Serotyp von Streptokokken (M12) enthält.
Geeignete Vektoren zum Klonieren der ausgewählten DNA-Fragmente des M-Proteins sind kommerziell erhältlich. Siehe das Literaturverzeichnis, das hiermit zur Verfügung gestellt wird. Die Expression des Hybrid-Proteins wird durch geeignete Prokaryoten wie E. coli oder, falls gewünscht, Eukaryonten wie Hefe, durchgeführt.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführun sformen

Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Die Konstruktion eines trivalenten und eines tetravalenten Hybrid-Antigens wird ausführlicher beschrieben, es ist allerdings selbstverständlich, daß ähnliche Protokolle anwendbar sind, um die anderen, hier beschriebenen Hybrid-Antigene zu konstruieren.
Das Verfahren zum Konstruieren der multivalenten Hybrid-Konstrukte beteiligt die rekombinante-DNA-in vitro-Technologie. Das Verfahren kann auf allgemeine Weise wie folgt beschrieben werden. Ein polyvalentes Hybrid-Gen wird konstruiert, indem ein ausgewähltes natives Fragment der gewünschten Länge verwendet wird und aus einem gewünschten M- Gen, wie M24, 1, 5, etc. (genannt emm24, emml bzw. emm5) erzeugt wird. Das Fragment ist frei von Nukleotiden, die eine Aminosäuresequenz kodieren, die Gewebe-Kreuzreaktivität verursachen kann. Die DNA-Sequenzen, die Aminosäurefragmente kodieren, die frei sind von Epitopen, welche Autoimmunantworten verursachen, werden wie in der Literatur gezeigt identifiziert, siehe z. B. Referenzen 5, 6, 7 im angefügten Literaturverzeichnis. Das Fragment wird durch die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) amplifiziert, gereinigt und in ein selbst-replizierendes Vehikel, z. B. ein Plasmid wie pBR322, ligiert. Oligonuleotid-Paare werden verwendet, um die gewünschten Codons der anderen strukturellen Gene, welche die multivalenten Hybrid-Gene aufbauen, zu kopieren, und werden jeweils synthetisiert, damit geeignete Restriktionsstellen enthalten sind, um eine Ligation an das erste ausgewählte Gen, z. B. emm24, zu erleichtern. Das vollständige polyvalente Konstrukt wird aus dem Vehikel (z. B. pBR322) ausgeschnitten und ligiert, um eine hochgradige Expression des rekombinanten Hybrid-Proteins in einem geeigneten Plasmid, z. B. pKK233-3, zu ermöglichen.
Das ausgewählte Gen (z. B. emm24) wird durch PCR amplifiziert, indem synthetische Oligonukleotid-Primer, die spezifisch dasjenige Gen amplifizieren, das die gewünschte Region des aminoterminalen Bereichs, z. B. die Hälfte des Moleküls, z. B. die pep M24-Region, kodiert, verwendet werden, wobei die in Beachey et al., 1978, mit dem Titel "Repeating Covalent Structure of Streptococcal M Protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3163-3167 und Mouw et al., 1988, mit dem Titel "Molecular Evolution of Streptococcal M Protein, J. Bacteriol. 170, 676, offenbarten Verfahren und Materialien verwendet werden. Im Hinblick auf das strukturelle Gen von Typ 24M schließt die vollständige Nukleotidsequenz ein offenes Leseraster aus 1617 Basenpaaren ein, welche ein M24-Präprotein aus 539 Aminosäuren mit einem vorhergesagten M.W. von 58.738 kodieren. Das strukturelle Gen enthält zwei distinkte, sich tandemartig wiederholende Elemente. Das erste wiederholte Element besteht aus 5,3 Einheiten und das zweite enthält 2,7 Einheiten. Jedes Element zeigt geringe Variation in der grundlegenden 35-Aminosäuren-Einheit.
Die (Top- und Bottom-) PCR-Primer werden von einem automatisierten DNA-Synthesizer (ABI, Modell 381A) synthetisiert. Falls nötig, d. h. wenn die zu amplifizierende Region keine geeignete Signalsequenz und kein natives Startcodon enthält, wird der Top-Strand Primer am 5'-Ende durch ein geeignetes Startcodon, wie ATG, erweitert.
Dies ist im Fall von emm24 verwirklicht. Geeignete Restriktionsstellen (z. B. EcoRI) werden ebenfalls angefügt und ein GGG-Schwanz aufgenommen, um sicherzustellen, daß das Enzym die Schnittstelle in dem gereinigten, doppelstrangigen DNA-Produkt erkennen würde. Der Bottom-Strand Primer wird an dem 5'-Ende durch eine geeignete Restriktionsstelle (z. B. BamHI) und einen CTC-Schwanz erweitert.
Die PCR-Amplifikation wird unter Verwendung chromosomale DNA, die aus dem ausgewählten Streptokokken-Typ (z. B. Typ 24) extrahiert wurde, welche dann als Matrize verwendet wird, durchgeführt. Siehe Dale et al., Type-Specific Immunogenicity of a Chemically Synthesized Peptide Fragment of Type 5 Streptococcal M Protein, J. Exp. Med. 158, 1727 (1983). Die Reaktionsmischungen umfassen Matrizen-DNA, Primer-Paare, dNTPs und Tag- DNA-Polymerase in PCR-Puffer. Die Amplifikation wird in einem geeigneten, automatischen Thermocycler mit Denaturierung, Primer-Reassoziation und Primer-Extension gemäß Standardverfahren durchgeführt. Mit dem PCR-Produkt wird eine Elektrophorese nach bekannter Methodik durchgeführt und das gereinigte Produkt wird, falls notwendig, mittels Klenow- Fragment aus gefüllt und nacheinander mit den geeigneten Restriktionsenzymen, in diesem Fall EcoRI und BamHI, in geeigneten Puffern geschnitten.
Das gereinigte PCR-Produkt (z. B. emm24) wird in ein geeignetes, selbst-replizierendes Vehikel, wie etwa pBR322, das mit Restriktionsenzymen wie EcoRI und BamHI geschnitten wurde, ligiert. Das Plasmid wird verwendet, um den E. coli-Stamm MC 1061 durch Standardverfahren zu transformieren. Transformanten werden durch Agarose-Gelelektrophorese auf das Vorhandensein von Plasmiden, welche Inserts der passenden Größe enthalten, durchgemustert, und ein Plasmid wurde für die Reinigung und anschließende Ligation der anderen, zuvor synthetisierten, synthetischen Oligonukleotid-Paare ausgewählt.
Die ausgewählten Oligonukleotide (emm5) werden in äquimolaren Verhältnissen gemischt und reassozüeren gelassen. Das ausgewählte Oligonukleotid-Paar (z. B. emm5) wird dann in das gereinigte, geschnittene Plasmid, das verwendet wird, um einen geeigneten Stamm von E. coli, wie etwa MC1061, zu transformieren, ligiert. Plasmide, die Inserts der passenden Größe enthalten, werden identifiziert und eines wird für die Ligation der zusätzlichen Oligonukleotid-Paare (z. B. emm6) ausgewählt, was auf eine ähnliche Weise erreicht wird. Das resultierende, polyvalente Plasmid, z. B. pCDM24 M5-M6, wird dann gereinigt und mit Restriktionsenzymen geschnitten. Das ausgeschnittene polyvalente Hybrid-Gen (z. B. emm24-5-6) wird dann in einen High-level-Expressionsvektor (z. B. pKK233-3), der einen Promotor und eine Ribosomen-Bindungsstelle neben der Klonierungsstelle, z. B. EcoRI, enthält, ligiert.
Auf eine ähnliche Weise werden andere multivalente Hybrid-Genkonstrukte synthetisiert. Beispielsweise wird das tetravalente Hybridprotein M24-M5-M6-M19 konstruiert, indem Fragmente aus der 5'-Region der emm-Gene, die durch PCR amplifiziert, gereinigt, als Tandem ligiert und in pKK223-3 exprimiert wurden, verwendet werden.
Die Sequenzanalyse der polyvalenten emm-Hybrid-Gene wird durch Sequenzieren entsprechender Inserts in einem geeigneten Vehikel, wie etwa pKK223-3, durch die Didesoxy- Nukleotid-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al., DNA Sequencing with Chain- Terminating Inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977), bestätigt.
Die Methode schließt die Reinigung von rekombinanten Hybrid-M-Proteinen ein. Diese werden aus Extrakten eines E. coli gereinigt, die Zellen werden pelletiert und durch Standardreinigungsverfahren behandelt und schließlich lyophilisiert.
Die Offenbarung schließt auch ein Verfahren zum Synthetisieren einer rekombinanten DNA- Sequenz durch PCR ein, das auf der Grundlage des gewünschten Nukleotids in der bestimmten Reihenfolge (Sequenz) und der bestimmten Größe und gewünschten Orientierung etabliert wird. Berücksichtigt man, daß das Ziel ist, eine DNA-Sequenz, bestehend aus den Sequenzen A-B-C-D, zu synthetisieren, wird das folgende Verfahren verfolgt. Nachdem das durch PCR hergestellte Fragment A und B mit dem gewünschten Restriktionsenzym an den Unique Sites, kodiert durch das 5'-Ende der PCR-Primer geschnitten wurde, werden A und B miteinander ligiert. Das A-B-Fragment wird amplifiziert, wobei als Primer das A-Top-Strand- Oligonukleotid und das B-Bottom-Strand Oligonukleotid verwendet werden, wodurch nur das A-B-Ligationsprodukt amplifiziert wird. Dieses Produkt wird mit Fragment C ligiert. Das A- B-C-Fragment wird wiederum durch PCR amplifiziert, wobei das Top-Strand Oligonukleotid von A als Primer und das C-Bottom-Oligonukleotid als Primer verwendet werden, wodurch nur der A-B-C-Strang amplifiziert wird.
Das Produkt wird mit Fragment D ligiert. Das Fragment A-B-C-D wird wiederum amplifiziert, indem das Top-Strand-Oligonukleotid von A als Primer und der Bottom-Strand von D als Primer verwendet werden, wodurch nur der gewünschte A-B-C-D-Strang amplifiziert wird.
In einer Abwandlung von dem Verfahren kann das A-B-Fragment amplifiziert und C-D synthetisiert werden, wie für A-B beschrieben. Dann werden A-B und C-D ligiert und durch PCR amplifiziert, wobei das Top-Strand-Oligonukleotid von A als Primer und das D-Bottom- Strand Oligonukleotid verwendet werden, wodurch die gewünschte Sequenz A-B-C-D amplifiziert wird.
Wenn gewünscht ist, zusätzliche Sequenzen, die beispielsweise Aminosäuren als Linker (wie hier beschrieben) zwischen den Aminosäuresegmenten enthalten, einzubauen, können diese Moleküle (z. B. Aminosäuren) durch Nukleotide kodiert werden, die in den Primern, die verwendet werden, um das (die) gewünschte(n) Fragment(e) zu amplifizieren, enthalten sind.
Auf diese Weise werden die durch PCR hergestellten Fragmente in der gewünschten Reihenfolge ligiert und Abschnitte werden unter Verwendung der oberen und unteren Stränge durch PCR wie dargestellt amplifiziert. Das Verfahren vermeidet Anordnungen von Nukleotidsegmenten in einer unerwünschten Sequenz oder Orientierung. Dieselbe Methodik wird bei längeren Fragmenten verfolgt und Abwandlungen können leicht verfügbar gemacht werden.
Die polyvalenten Hybrid-M-Proteine der Erfindung werden durch Immunisierung von Kaninchen, einem klassischen Versuchstier, getestet. Der Test auf M-Protein-Antikörper wird gemäß bekannten Verfahren, wie sie in dem angehängten Literaturverzeichnis beschrieben werden, durchgeführt. Dazu gehören Tests auf Herz-kreuzreaktive Antikörper, die in Beachey und Dale (1982) beschrieben werden.
Ebenfalls offenbart wird die Konstruktion von Hybrid-Konstrukten, die sich wiederholende aminoterminale M-Protein-Untereinheiten enthalten, unter Verwendung von PCR. Eine nichteinschränkende Veranschaulichung wird hier nachfolgend beschrieben. Das Verfahren wird leicht auf jede Anzahl von Aminosäuren jedes bestimmten, ausgewählten Serotyps angewendet, um ein Hybridgen zu liefern, das sein ausgewähltes, wiederholtes Aminosäurefragment enthält.
Ein typisches trivalentes Gen, M24-M5-M6, wurde in einer allgemeinen Weise wie folgt konstruiert.
Das M24-M5-M6-Hybrid-Gen wurde unter Verwendung eines nativen Fragments des emm24-Gens konstruiert, das durch die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) amplifiziert, gereinigt und in pBR322 ligiert wurde. Oligonukleotid-Paare, welche die ersten 11 und 12 Codons der strukturellen emm5- bzw. emm6-Gene kopieren, wurden synthetisiert, damit sie geeignete Restriktionsstellen enthalten, um eine Ligation mit dem emm24-Gen zu erleichtern. Das vollständige trivalente Konstrukt wurde aus pBR322 ausgeschnitten und in pKK223-3 ligiert, um eine hochgradige Expression des rekombinanten Hybrid-Proteins zu ermöglichen.
Das emm24 Gen wurde durch PCR amplifiziert, indem synthetische Oligonukleotid Primer, welche die Amplifikation desjenigen Abschnitts des Gens, das die pep M24-Region des Proteins, welche ungefähr der aminoterminalen Hälfte des Moleküls entspricht, vorschreiben, verwendet wurden. Die Primer wurden durch einen automatisierten DNA-Synthesizer (ABI, Modell 381A) synthetisiert und wiesen die folgenden Strukturen auf:
Der Top-Strand-Primer wurde an dem 5'-Ende durch ein ATG verlängert, da die zu amplifizierende Region von emm24 die Signalsequenz und das native Startcodon ausschloß. Eine EcoRI -Restriktionsenzym-Schnittstelle wurde ebenfalls angefügt, und ein GGG-Schwanz wurde eingebaut, um sicherzustellen, daß das Enzym die Spaltungssstelle in dem gereinigten, doppelstrangigen DNA-Produkt erkennen würde. Der Bottom-Strand-Primer wurde an dem 5'-Ende durch eine BamHI-Restriktionsstelle und einen CTC-Schwanz verlängert.
Die PCR-Amplifikation wurde, unter Verwendung chromosomaler DNA, extrahiert aus Typ 24-Streptokokken, die als die Matrize verwendet wurde, durchgeführt. Die Reaktionsmischungen bestanden aus Matrizen-DNA, Primer-Paaren, dNTPs und Tag-DNA-Polymerase in PCR-Puffer. Die Amplifikation wurde in einem automatischen Thermocycler von Perkin- Elmer Cetus mit Denaturierung bei 95ºC für eine Minute, Primer-Reassozüerung bei 55ºC für 1 Minute und Primer-Extension bei 72ºC für 3 Minuten über insgesamt 39 Zyklen durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese in einem 1%-igen Agarose (niedriger Schmelzpunkt)-Gel unterzogen, die Bande mit der vorhergesagten Größe wurde ausgeschnitten und durch Adsorption an und Elution von "Glasmilch" (Geneclean, Bio 101) gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde an den Enden unter Anwendung des Klenow-Fragments aufgefüllt und nacheinander mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI in den entsprechenden Puffern geschnitten.
Das gereinigte emm24-PCR-Produkt wurde in pBR322, der mit EcoRI und BamHI geschnitten worden ist, ligiert. Das Plasmid wurde verwendet, um E. coli Stamm MC 1061 durch Standardverfahren zu transformieren. Die Transformanten wurden auf das Vorhandensein von Plasmiden, die Inserts der passenden Größe enthielten, auf Agarose-Gelen durchgemustert. Ein solches Plasmid (pCDM24) wurde dann für die Reinigung und Ligation mit synthetischen. emm5- und emm6-Oligonukleotid-Paaren, die wie oben beschrieben gemäß den folgenden Sequenzen synthetisiert wurden, ausgesucht: synthetische emm5-Oligonukleotid-Paare synthetische emm6-Oligonukleotid-Paare,
Die emm5-Oligonukleotide wurden in äquimolaren Verhältnissen gemischt, bei 65ºC 2 Minuten erhitzt und bei Umgebungstemperatur reassoziieren gelassen. pCCDM24 wurde mit BamHI und SalI geschnitten und wie oben beschrieben auf einem Agarose-Gel gereinigt. Das emm5-Oligonukleotid-Paar wurde dann in das gereinigte, geschnittene Plasmid ligiert und verwendet, um E. coli Stamm MC1061 zu transformieren. Plasmide, die Inserts der entsprechenden Größe enthielten, wurden auf Agarose-Gelen identifiziert und eines (pCDM24.M5) wurde für die Ligation des emm6-Oligonukleotid-Paars ausgewählt, was auf eine ähnliche Weise erreicht wurde. Das resultierende pCDM24.M5-Nl6 wurde dann gereinigt und mit EcoRI und PstI, die Schnittstelle, deretwegen das emm6-Oligonukleotid-Paar synthetisiert wurde, geschnitten. Das ausgeschnittene emm24-5-6-Hybrid-Gen wurde dann in pKK223-3, einem High-Level-Expressionsvektor, der den tac-Promotor und eine Ribosomen- Bindungsstelle neben der EcoRI-Klonierungsstelle enthält, ligiert.
Die Konstruktion, Klonierung und Expression des tetravalenten Hybrid-M-Proteins M24-M5- M6-M 19 wurde wie folgt ausgeführt.
Das tetravalente M Protein M24-M5-M6-M19 wurde unter Verwendung von Fragmenten der 5'-egionen von emm-Genen, die durch PCR amplifiziert, gereinigt, als Tandem ligiert und in pKK223-3 exprimiert wurden, konstruiert. Das gesamte Ziel war, die Regionen der entsprechenden emm-Gene, die protektive und nicht-Gewebe-kreuzreaktive Epitope kodieren, zu amplifizieren und sie in ein Proteinmolekül einzubinden. Das rekombinante Hybrid-Protein enthielt 113 aminoterminale Aminosäuren von M24, 58 Aminosäuren von M5, 35 von M6 und 35 von M19. Jedes Segment war durch 2 Aminosäuren, bestimmt durch die entsprechenden Restriktionsenzym-Schnittstellen, die in die verwendeten Oligonukleotid-Primer synthetisiert wurden, um die PCR-Produkte zu bestimmen, verbunden.
Die Primer für jedes emm-Gen wurden wie oben beschrieben gemäß den folgenden Sequenzen synthetisiert:
Die M24-, NI5- und M6-Oligonukleotid-Sequenzen beruhten auf früher publizierten Daten. Siehe Literaturverzeichnis, das hiermit bereitgestellt und durch Zitat hier aufgenommen wird. Die M19-Sequenz wurde auf eine ähnliche Weise aus einem Plasmid, welches das gesamte emml9-Strukturgen enthielt, erhalten.
Die oben beschriebenen Oligonukleotid-Primerpaare wurden verwendet, um die Regionen jedes emm-Gens zu amplifizieren, wobei chromosomale DNA des entsprechenden Serotyps von Gruppe A Streptokokken als Matrize bei der PCR-Reaktion, wie oben beschrieben, verwendet wurde. Die PCR-Produkte wurden durch Ausschneiden aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Da einige der Bottom-Strand-PCR-Primer mit Regionen der sich wiederholenden emm-Gene reassoziierten, waren die PCR-Produkte von unterschiedlichen Größen. Es wurde jeweils die kleinste Hauptbande ausgeschnitten und für die Ligation gereinigt.
Die Ligation der gereinigten PCR-Produkte wurde erreicht, indem zunächst die M24- und M5-Fragmente mit BamHI geschnitten und die zwei geschnittenen Fragmente dann ligiert wurden. Die Ligationsmischung wurde dann der Amplifikation durch PCR unterzogen, wobei als Primer die M24-Top-Strand-Oligonukleotide und die M5-Bottom-Strand-Oligonukleotide verwendet wurden, um nur das M24-M5-Ligationsprodukt zu amplifizieren. Dieses hybride PCR-Produkt wurde dann gereinigt, mit SalI geschnitten und mit dem M6-Fragment, das ebenfalls mit SalI verdaut wurde, ligiert. Das M24-NI5-NI6-Hybrid wurde noch einmal der PCR-Amplifikation unterzogen, wobei der M24-Top-Strand-Primer und in diesem Fall der M6-Bottom-Strand-Primer verwendet wurde. Die gleiche Abfolge von Schritten wurde dann verfolgt, um die M19-Komponente zu ligieren, um das fertige, tetravalente Gen herzustellen. Die gereinigten Produkte wurden mit EcoRI und PstI geschnitten und in die entsprechenden Schnittstellen von pKK223-3 ligiert, was verwendet wurde, um E. coli Stamm JM105 zu transformieren. Das Rekombinant, welches das Hybrid-M-Protein exprimiert, wurde zunachst durch Durchmustern von Kolonieabdrücken auf Nitrozellulose mit Kaninchen-Antiserum gegen pep M24 identifiziert.
Das Konstruieren von sich wiederholenden aminoterminalen M-Protein-Untereinheiten unter Verwendung von PCR wurde wie folgt durchgeführt.
Multimere aminoterminale Fragmente von emm-Genen wurden mittels PCR-Amplifikation konstruiert. Beispielsweise wurden die ersten 12 Aminosäuren von M19 als drei repetitive Sequenzen durch die folgende Methode exprimiert:
PCR-Primer:
Der M19-5'-Repeater kodiert die ersten 12 Aminosäuren des NW-Terminus mit den Codons für die ersten 6 Aminosäuren, die an das J'-Ende des Primers als eine repetitierende Untereinheit angehängt sind. M19-3'-BS kopiert den komplementären Strang von Codons 7-12 mit einer NcoI-Enzym-Schnittstelle und einer poly-G-Klammer. Das M19-5'-Monomer kodiert die ersten 6 Aminosäuren des NH&sub2;-Terminus mit einer EcoRI-Enzym-Schnittstelle und einer poly-G-Klammer an dem 5'-Ende.
Matrizen-DNA aus Typ 19-Streptokokken wurde zunächst mit dem M19-5'-Repeater und M19-3'-BS amplifiziert, was zu einer Leiter von PCR-Produkten im Größenbereich von 2-6 Untereinheiten führte. Ein Produkt der entsprechenden Größe (um 3 Untereinheiten zu kodieren) wurde aus Agarose-Gelen gereinigt und dann einer PCR-Amplifikation unter Verwendung des M19-5'-Monomers und der M19-3'-BS-Primer unterzogen. Das einzelne Produkt wurde dann in die entsprechenden Restriktionsstellen ligiert.
Die Sequenzanalyse der trivalenten und tetravalenten Hybrid-emm-Gene wurde wie folgt durchgeführt.
Die Strukturen der oben beschriebenen hybriden emm-Gene wurden durch Sequenzieren der Inserts in pKK223-3 durch die Didesoxy-Nukleotid-Kettenabbruchmethode von Sanger et al., bestätigt.
Die Reinigung von rekombinanten Hybrid-M-Proteinen wurde wie folgt durchgeführt. Die trivalenten und tetravalenten Hybrid-M-Proteine wurden aus Extrakten von E. coli JM 1 O5, die über Nacht in 11l Nährlösung, supplementiert mit 75 ug/ml Ampicillin, 25 ug/ml Streptomycin und IPTG (1 mMol), gewachsen waren, gereinigt. Die Zellen wurden bei 7000 · g pelletiert und in 50 ml Carbonat-Puffer, pH 11,0, der 100 ug/ml Lysozym, 1 mMol EDTA und 100 ug/ml PMSF enthielt, resuspendiert und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden bei 7000 · g zentrifugiert und der Überstand wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Reinigung wurde durchgeführt, indem 50 ml Extrakt, der das trivalente Hybrid-M-Protein enthielt, auf eine präparative PAGE-Einheit (PrepCell, Modell 491, Bio Rad, Inc.) geladen wurde, wobei eine 37 mm-Säule und 9 cm 11% Polyacrylamid- Gel verwendet wurde. Fraktionen von sechs ml wurden gesammelt und auf das Vorhandensein von rekombinanten Proteinen durch Western Blot-Analyse unter Verwendung von pep M24-Antiseren getestet. Proben, die Spitzenaktivität enthielten, wurden gepoolt und lyophilisiert.

Immunisierung von Kaninchen

Kaninchen wurden mit 300 ug der ausgewählten polyvalenten (z. B. der trivalenten oder tetravalenten) Hybrid-M-Proteine, emulgiert in komplettem Freund'schem Adjuvans, immunisiert. Wiederholungsinjektionen derselben Dosis in PBS wurden nach 4, 8 und 12 Wochen verabreicht. Blut wurde vor der Immunisierung und danach in 2-wöchigen Intervallen gewonnen. Die anderen polyvalenten Hybrid-M-Proteine werden auf dieselbe Weise verwendet. Ebenso wurde eine Mischung (oder ein "Cocktail") solcher Hybride auf die gleiche Weise verwendet.

Tests auf M-Protein-Antikörper

Die Antikörper-Gesamtaktivität gegen M-Protein wurde durch ELISA bestimmt, indem native pep M-Proteine, rekombinante M-Proteine, synthetische Peptide oder gereinigte polyvalente (z. B. trivalente oder tetravalente) Hybrid-M-Proteine als Festphase-Antigene durch früher beschriebene Methoden verwendet wurden. Opsonisierende Antikörper wurden durch Opsonophagozytose-Tests, wie beschrieben, in vitro getestet. ELISA-Inhibitionstests und Opsonisieiungs-Hemmexperimente wurden unter Verwendung gereinigter M-Proteine oder synthetischer Peptide als lösliche Inhibitoren von M-Protein-Antikörpern im ELISA oder in Opsonisierungstests verwendet. Western Blots rekombinanter Proteine wurden unter Verwendung von Antiseren, die in Kaninchen gegen synthetische Peptide oder native M-Proteine erzeugt wurden, durchgeführt. Die anderen polyvalenten Hybride wurden getestet, indem das gleiche Protokoll verfolgt wurde.

Tests auf Herz-kreuzreaktive Antikörper

Antiseren gegen rekombinante, multivalente M-Proteine wurden auf das Vorhandensein von Herz-kreuzreaktiven Antikörpern durch indirekte Immunfluoreszenz-Tests durchgemustert, wobei Gefrierschnitte von menschlichem Myokard, wie früher in der Literatur beschrieben, verwendet wurden.

Tests auf M-Protein-Epitope, die mukosale Antikörper hervorrufen, die weitgehenden Schutz vor Infektionen verleihen

Kaninchen-Antiseren wurden auf das Vorhandensein weitgehend protektiver Antikörper unter Verwendung von passiven Protektionstests an der Maus (siehe Bronze, M.S., et al., Protective and Heat-Crossreactive Epitopes Located within the N-Terminus of Type 19 Streptococcal M Protein, J. Exp. Med. 167, 1849-1859 (1988)) durchgemustert. Antiseren wurden zunächst auf die Fähigkeit, mit dem Oberflächen-M-Protein einer Vielzahl von heterologen Serotypen von Gruppe-A Streptokokken durch ELISA getestet. Solche, die M-Protein-Epitope in deren nativen Konformationen erkannten, wurden verwendet, um Mäuse gegen intranasal ausgelöste Infektionen passiv zu schützen. Die Antikörper wurden an virulente Streptokokken absorbiert und die Mäuse wurden intranasal mit 10&sup7; CFU behandelt. Rachenkulturen wurden an abwechselnden Tagen angelegt und Tote wurden über die nachfolgenden 14 Tage gezählt. Vakzin- Konstrukte, die protektive Antikörper in Kaninchen auslösen, werden verwendet werden, um Mäuse intranasal zu immunisieren, um direkt deren protektive Immunogenität zu testen. Aktiv immunisierte Mäuse werden mit virulenten Streptokokken ähnlich behandelt.
Eine Darstellung eines tetravalenten Hybrid-Gens M24-M5-M6-M19 mit anderen Linkem als den in Fig. 4 dargestellten, wird in Fig. 6 gezeigt. Die Sequenz des Hybrid-Gens zeigt die Struktur von emm24, emm5, emm6 und emm19. Das tetravalente emm-Gen exprimiert ein Protein mit einem berechneten M.W. von 30,7 kDa, das 113 aminoterminale Aminosäuren vom Typ 24-M-Protein, 58 Aminosäuren vom Typ M5-Protein, 35 Aminosäuren vom Typ 6M-Protein und 35 Aminosäuren vom Typ 19M-Protein enthält. Der Linker ist ein Prolinreicher Linker Pro-Gly-Asn-Pro-Ala-Val-Pro, die Codons für diesen sind in die BamHI-, SalI bzw. NcoI-Restriktionsenzym-Stellen insertiert, welche in die ursprünglichen PRC- Primer synthetisiert wurden. Dieser Linker beinhaltet teilweise die Aminosäuren des Codons der Restriktionsstelle in der gewünschten Position.
Andere Linker können verwendet werden, wie etwa eine Sequenz, welche Aminosäuren wie Ile-Pro-Gly oder Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Ser-Ser einschließt.
Die Sequenz der Aminosäure in jedem bestimmten Linker, der verwendet Wird, scheint zu dieser Zeit nicht kritisch zu sein. Theoretisch könnte ein Linker aus einer Aminosäure aufgebaut sein; falls der gewünschte Effekt, eine funktionell wirksame Konformation des kodierten Proteins zu fördern, gewünscht ist, können längere Linker ausgewählt werden, wie etwa solche mit 14 oder mehr (z. B. 20) Aminosäuren.
Wie hier beschrieben, sind Linker für die Struktur nicht unverzichtbar, so daß es nicht notwendig ist, daß irgendeine Aminosäureuntereinheit oder sogar alle Aminosäuren durch einen Aminosäure-Linker miteinander fusioniert sind. Zur Erläuterung, M24 und M5 können direkt miteinander fusioniert sein. Weiterhin, während sich die Beschreibung hier auf Linker, aufgebaut aus Aminosäuren, die durch Hybrid-Gene kodiert werden, bezieht, können einige Hybrid-Konstrukte gereinigte, rekombinante M-Proteine enthalten, die ein oder mehrere Moleküle, die keine Aminosäure sind, wie etwa Succinimidyl-4-(N-maleimidmethyl)cyclohexan-1- carboxylat (SMCC), einschließen, enthalten. Die Linker können dieselbe oder verschiedene Längen zwischen jedem Aminosäuresegment haben. Diese Moleküle können durch chemische Mittel eingeführt werden, im Gegensatz zum Exprimiertwerden mit dem Hybrid-Protein.
Das in Fig. 6 dargestellte, tetravalente Hybrid-Gen wird, wenn es durch Reaktion mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen jede einzelne Komponente des Hybrid-Proteins erzeugt wurde, auf eine antigene Wirkung getestet wird, anzeigen, daß die Epitope in einer Konformation vorhanden sind, die der des nativen Proteins ähnelt.
Die Immunogenität des tetravalenten Proteins und die Antikörper-Konzentration wird bestimmt werden, die Immunseren werden ebenfalls opsonisierende Antikörper gegen alle vier Serotypen von Gruppe A-Streptokokken enthalten.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird in Erwägung gezogen, daß das aminoterminale Aminosäurefragment gebildet werden kann, um eine oder mehrere aminoterminale Bereiche anderer, potentiell rheumatogener Streptokokken-Typen, z. B. Typ 1, 3, 18, 27 und/oder 29 oder jedes anderen zur Zeit bekannten oder jedes, von dem entdeckt werden sollte, daß er eine derartige, potentiell rheumatogene Wirkung hat, zu enthalten. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, daß die Konstrukte dieser Erfindung konstruiert werden, um ein oder mehrere Fragmente der aminoterminalen Region von Serotypen, von denen nicht bekannt ist, einen derartigen rheumatogenen Effekt aufzuweisen, wie solche, die oben und in der Literatur beschrieben sind, zu enthalten. In jenen Fällen, in denen eine derartige Struktur noch nicht sequenziert worden ist oder wenn solch eine Sequenz noch nicht publiziert worden ist, kann jemand, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, durch Methoden, die leicht zugänglich sind, solche Strukturen sequenzieren und dann das Hybrid der Erfindung mit den gewünschten Fraktionen konstruieren. Folglich zieht die Erfindung in Erwägung, ein solches, multivalentes Protein, das durch ein entsprechendes Hybrid-Gen oder entsprechende -Gene kodiert wird, in einem geeigneten Organismus ein Protein zu exprimieren, das die gewünschten Antikörper hervorrufen wird.
Die Wirkung der verschiedenen Linker auf die immunogene Wirkung des Hybrid-Moleküls könnte weitere Untersuchungen rechtfertigen. Es ist nicht ausgeschlossen, daß, abhängig von der Natur des Linkers und des Typs und der Größe der Aminosäurefraktionen, ein Hybrid- Protein von ideal oder nahezu ideal hoher immunogener Wirkung identifiziert werden kann. Ein solches Hybrid wird vom Umfang der Erfindung umfaßt.
Was hier oben beschrieben worden ist, trifft auch im Hinblick auf die carboxyterminale Fraktion oder die C-repetitiven Sequenzen davon zu, wenn (eine) derartige Fraktion(en) oder repetitive Sequenzen verwendet werden, wie hier beschrieben.
Es sollte in Erinnerung behalten werden, daß nicht alle - anstelle von keinem - der Fragmente, die das Hybrid aufbauen, immunogen sein müssen, wenn sie einzeln (und ohne einen Trägerstoff) betrachtet werden, vorausgesetzt daß, wenn Teile des endgültigen Hybrids, zu dem sie beitragen, die gewünschte immunogene Wirkung mindestens nicht beeinträchtigen.
Die Sequenz von amplifizierten (M-ähnlichen) 2, 3, 18 und 19M-Genen wird in Podbielski et al., Application of the Polymerase Chain Reaction to Study the M Protein(-like) Gene Family in Beta Hemolytic Streptococci, Med. Microbiol. Immunol. 180, 213 (1991), diskutiert. Gene vom M12-Typ (emm12) einer Nukleotidsequenz von 1693 Basenpaaren wird in Robbins et al., Streptococcus Pyogenes Type 12 Protein Gene Regulation by Upstream Sequences, Journal of Bacteriology, 5633-5640 (Dec. 1987), beschrieben. Die NH&sub2;-terminale Sequenz des M- Proteins von Typ 1-Streptokokken in Kraus et al., Sequence and Typ-Specific Immunogenicity of the Amino-Terminal Region of Type 1 Streptococcal M Protein, The Journal of Immunology 139, 3084-3090 (Nov. 1987) diskutiert, was durch Zitat aufgenommen ist. Das NH&sub2;- terminale Fragment wird aus Fragmenten von 28 kDa, 25 und 23,5 kDa aufgebaut. Der Artikel diskutiert Ähnlichkeiten mit und Unterschiede zu anderen NH&sub2;-terminalen M-Protein- Sequenzen. Opsonisierende Antikörper werden gegen Typ 1-Streptokokken entwickelt. Es ist bemerkenswert, daß die NHZ-terminale Region von Typ 1-M-Protein ebenfalls Epitope enthält, die protektive Immunantworten auslösen.
Vom Umfang der Erfindung ist deshalb umfaßt, daß das Hybrid-Konstrukt NH&sub2;-terminale Regionen enthält, die ebenfalls protektive mukosale Antworten (nicht nur opsonisierende Antworten) in jenen Fällen, in denen die NH&sub2;-terminale Region beide Typen hervorruft, hervorrufen. Folglich ist das carboxyterminale Fragment nicht immer notwendig, damit ein Hybrid mukosale oder zelluläre Antworten auslöst.
Im allgemeinen umfassen die NH&sub2;-terminalen Reste der verschiedenen M-Proteine, welche eine weniger geordnete Struktur zeigen und von einem Typ zum anderen stärker variabel sind, ungefähr 10 bis 20 Reste.
Eine andere Ausführungsform wird in Fig. 7 dargestellt, die ein multivalentes M24-M24- M24-M5-M5-M5-M6-M6-M6-M19-M19-M19-Hybrid aus 561 Nukleotiden und mit einem berechneten M.W. von 21,6 kDa, aufgebaut aus 187 Aminosäuren mit Restriktionsstellen zwischen den verschiedenen Fragmenten, wie gezeigt BamHI, SalI bzw. NcoI, zeigt. Es wird zu beobachten sein, daß die wiederholten Aminosäurefraktionen der entsprechenden Typen M24, M5, M6 und M19 (unterstrichen) von gleicher Länge sind. Das müssen sie nicht sein. Die kleinere Größe der Repeat-Fragmente des Konstrukts hat den Zweck, die immunogene Wirkung des Gesamtmoleküls zu verstärken, im Gegensatz zu längeren Fragmente, wie hier an anderer Stelle beschrieben, und Antikörper gegen die distalen (und am stärksten protektiven und am wenigsten Gewebe-kreuzreaktiven) Epitopen auszulösen. Jede 15-Aminosäuren- Uritereinheit wird dreimal wiederholt. Weiterhin können derartige kleinere Aminosäurefragmente leichter durch einen Aminosäure-Synthesizer oder durch eine neue Modifikation der hier beschriebenen klassischen PCR-Methode synthetisiert werden. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird zu beobachten sein, daß keine Linker vorhanden sind.
Im Rahmen der Erfindung werden ähnliche Hybrid-Strukturen, in welchen die einzelnen, sich wiederholenden Segmente länger oder kürzer als die gezeigten 15 Aminosäuren sind, in Erwägung gezogen. Da die einzelnen M-Fragmente, die das Hybrid aufbauen, werden sie alleine berücksichtigt, von unterschiedlicher immunogener Wirkung sind, scheint es lohnenswert, ein Verlängern oder Verkürzen der Länge von einem oder mehreren solcher Fragmente zu berücksichtigen, um die immunogene Gesamtwirkung des Moleküls weiter zu steigern. Linker können ebenfalls eingeschlossen werden.
Weiterhin kann jedes der in Fig. 1 oben dargestellten Fragmente durch einen anderen Serotyp, wie etwa Serotyp 1, 3 oder 18, ersetzt werden. Auf diese Weise können tetravalente Hybrid-Gene konstruiert und das korrespondierende Hybrid-Protein exprimiert werden. Gleichermaßen können längere, wie etwa penta-, hexa-, octa-, nona- oder decavalente Hybrid- Gene und die korrespondierenden, exprimierten Proteine erhalten werden.
In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, daß, im Gegensatz zum Erhöhen der Anzahl an Aminosäurefragmenten, die ein bestimmtes multivalentes Vakzin aufbauen, wie etwa zu einem octa-, nona- oder decamultivalenten Vakzin, es vorteilhafter wäre, eine Mischung aus kleineren Konstrukten zur Verfügung zu stellen, wobei die Mischung aus mindestens zwei solcher Konstrukte besteht. Auf diese Weise kann eine Mischung oder ein "Cocktail" multivalenter Vakzine, welche eine optimale Maximallänge (oder Größe), wie etwa tetra- oder pentavalente Struktur, aufweisen würde, und eine andere mit ungefähr ähnlicher Länge und aus anderen Serotypen bestehend, verfügbar gemacht werden. Ein multivalentes Hybrid- Vakzin, aufgebaut aus M24-M5-M6-M19, kann beispielsweise zusammengemischt mit einem, das M1-M3-M18 enthaltenden Hybrid-Vakzin, und einer weiteren Zusammenmischung mit einem multivalenten Hybrid-Vakzin, aufgebaut aus M1-M24-M5, und noch einem vierten, das jedes der oben genannten, einschließlich M18, enthält, verfügbar gemacht werden. Es ist zu beobachten, daß die Reihenfolge (Sequenz), in der diese M-Protein-Fragmente hier beschrieben worden sind, nicht notwendigerweise der Reihenfolge entsprechen, auf die die Erfindung beschränkt ist, wie hier wiederholt beschrieben worden ist.
Eine andere interessante Darstellung eines tetravalenten Hybrid-Gens ist in Fig. 8 dargestellt, welche die Sequenz von tetravalentem M24-M5-M6-M19 zeigt, wobei die carboxyterminale Hälfte von M5 an die Restriktionsstelle PstI gebunden ist. Das Hybrid-Konstrukt weist 305 Aminosäuren auf, exprimiert durch die 915 Nukleotide. Die Restriktionsstellen werden gezeigt.
Es wird zu beobachten sein, daß die tetravalenten Aminosäurefragmente jeweils 15 Aminosäuren lang und direkt ohne die Vermittlung von Aminosäure-Linkem miteinander verbunden sind. Dies ist eine Darstellung der Idee eines Kombinierens des multivalenten Vakzins mit dem eines Carboxyterminus in einem der M-Protein-Serotypen.
Anstatt den Carboxyterminus von M5 zu verwenden, kann jeder andere M-COOH, wie etwa der von M24, M19 und M6, verwendet werden. Aufgepaßt wird natürlich werden, daß der Carboxyterminus nicht einer ist, der unerwünschte Antikörper, wie etwa Gewebekreuzreaktive Antikörper, erzeugen würde. In dem dargestellten Konstrukt sind dort nicht nur opsonisierende Antikörper gegen die vier M-Protein-Fraktionen dargestellt, sondern auch protektive mukosale Antikörper gegen den carboxyterminalen Bereich des Moleküls. Wie hier erklärt wird, hat eine solche Struktur deutliche Vorteile darin, daß sie als ein Vakzin zum Beherrschen nasaler oder anderer Infektionen, die rheumatischem Fieber häufig vorausgehen, dienen kann.
Ein Vakzin, das aus dem hier dargestellten Konstrukt aufgebaut ist, oder ein ähnliches ist deshalb ein wirksames, therapeutisch prophylaktisches Agens, welches, interessant genug, nasal oder durch ein Spray verabreicht werden kann.
Anstatt den gesamten Carboxyterminus von jedem der M-Serotypen zu verwenden, kann es vorteilhaft sein, nur eine oder mehrere Aminosäuren der C-repetitiven Sequenzen des Carboxyterminus eines bestimmten Serotyps zu verweden. Es ist bemerkenswert, daß der Carboxyterminus oder die Aminosäuren, die ein oder mehrere der in dem Konstrukt verwedeten C-repetitiven Sequenzen aufbauen, nicht von dem(den)selben Serotyp(en) sein müssen wie das, welches den aminoterminalen Bereich des Konstrukts aufbaut. Folglich wird ein solches Vakzin zelluläre Immunantworten (welche normalerweise weniger Typ-spezifisch oder stärker kreuzreaktiv als die opsonierende Antwort sind) verfügbar machen und gleichzeitig Typspezifische Immunität zur Verfügung stellen.
In Verbindung mit der Erfindung wie sie hier beschrieben worden ist, sollte beachtet werden, daß nicht alle M-Protein-Epitope hinsichtlich ihres aminoterminalen Bereichs des Moleküls Serotyp-spezifisch sind. Einige Epitope von bestimmten Serotypen, wie etwa M5, kreuzreagieren zu einem bestimmten Ausmaß mit Streptokokken eines anderen Typs als M5, wie etwa M6 oder M19. Und bis zu einem gewissen Ausmaß tritt dies auch mit anderen M-Serotypen auf.
Dementsprechend wird vom Umfang dieser Erfindung umfaßt, daß, wenn auf Serotyp- Spezifität verwiesen wird, dies eine gewisse Kreuzreaktivität zwischen bestimmten gemeinsamen Strukturen nicht ausschließt.
Allerdings ist bei solchen gemeinsam benutzten Epitopen häufig höchstwahrscheinlich, daß sie mit Herzgewebe kreuzreagieren und deshalb potentiell erhebliche Risiken darstellen und nicht opsonisierend wirken oder keine Antikörper mit einem hohen Maß an wünschenswerter opsonisierender Aktivität hervorbringen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung, kann die Sequenz der aminoterminalen Aminosäuren der verschiedenen Fragmente in einer anderen Reihenfolge coexprimiert sein. Ein Vergleich der Strukturen in Fig. 5 und 6 auf der einen Seite und Fig. 9 auf der anderen Seite wird zeigen, daß die Nukleotidsequenz der rekombinanten DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des tetravalenten Hybrids M19-M6-M5-M24 im Vergleich zu den anderen oben genannten Konstrukten die umgekehrte Reihenfolge aufweist. Das Konstrukt von Fig. 9 stellt ein multivalentes Vakzin mit 247 Aminosäuren dar, die von einer Nukleotidsequenz von 741 DNA-Nukleotiden exprimiert wurde. Die entsprechenden M 19-, M6-, M5- und M24-Fragmente weisen die folgende entsprechende Aminosäurenlänge auf: 35, 35, 58 und 113.
Bei mit dieser Erfindung verbundenen Untersuchungen ist festgestellt worden, daß die immunogene Wirkung bestimmter Untereinheiten oder Fragmente größer ist als die anderer. Beispielsweise ist M24 größer als M5, welches wiederum größer ist als M6 und welches wiederum größer ist als M19. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß die immunogene Wirkung gegen die aminoterminalen M24- und M5-Untereinheiten in einem Konstrukt, das M24-M5-M6- M19 enthält, größer war als gegen die M6- und M19-Komponenten. Allerdings war es im Zusammenhang mit dieser Erfindung von Interesse, festzustellen, ob solche Postulate sich in den Konstrukten der Erfindung bewahrheiten, insbesondere bei einer totalen Umkehrung der Reihenfolge der Aminosäureuntereinheiten, wie in Fig. 9 gezeigt, oder sogar bei der Neuanordnung einiger dieser Untereinheiten in jeder gewünschten Ordnung, wie etwa M19 gefolgt durch M6 und dann gefolgt durch M24 und dann durch M5.
Dieselben Anmerkungen treffen auf die anderen M-Protein-Serotypen, wie etwa 3, 12 und 18 zu. In der Tat ist zu dieser Zeit nicht zu sehen, warum ein Organisieren der Sequenz von Aminosäuren durch zunehmende (oder abnehmende) immunogene Wirkung auf die Konstrukte der Erfindung zutreffen sollte. In diesem Sinne können die Vakzine dieser Erfindung andere interessante Abwege vom Üblichen darstellen.
Das tetravalente Protein reagierte mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen jede Komponente des hier beschriebenen Hybrid-Proteins erzeugt wurde, was anzeigt, daß die Epitope in einer Konformation vorhanden waren, welche das native Protein nachahmte. Von Kaninchen, die mit einem gereinigten, tetravalenten M-Protein immunisiert werden, wird angenommen, daß sie signifikante Antikörper-Konzentrationen gegen das tetravalente Vakzin aus allen vier Serotypen der gereinigten, nativen M-Proteine entwickeln. Durch Ändern der Reihenfolge der Aminosäurefragmente in dem tetravalenten Hybrid können unterschiedliche Grade der Opsonisierung beobachtet werden.
Wenn wie hier beschrieben Linker verwendet werden, sind Linker, die von besonderem Interesse sind, derart aufgebaut, daß sie überall hydrophob sind, d. h. sie sind aus einer Vielzahl von Aminosäuren mit unpolaren Gruppen aufgebaut. Umfaßt von derartigen Aminosäuren sind solche mit aliphatischen Gruppen, wie etwa Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin und Prolin; und mit aromatischen Ringen wie Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Es stimmt mit der Erfindung überein, daß andere der 22 Aminosäuren bei den hydrophoben Säuren berücksichtigt werden können oder nicht, um die entsprechenden Bindungen in jenem Hybrid- Konstrukt, wo Verbindungen erwünscht sind, zu bilden.
Eine Darstellung eines divalenten Hybrid-Gens emm24 und emm5 und die Aminosäuresequenz wird in Fig. 10 gezeigt, wobei 522 Nukleotide als das Hybrid-Protein von 174 Aminosäuren exprimiert sind. Die Restriktionsstelle BamHI wird gezeigt.
Opsonisierende Antikörper werden gegen die entsprechenden nativen M-Proteine hervorgerufen. Die immunogene Wirkung wird in Kaninchen getestet.
Eine Darstellung eines tetravalenten Gens in Fig. 11 zeigt die Sequenz von M19-M6-M5- M24 in der umgekehrten Reihenfolge wie in Fig. 8 gezeigt mit zweieinhalb C-repetitiven Sequenzen des M5-Carboxyterminus. Die 1029 Nukleotide große Sequenz zeigt die Restriktionsstellen zwischen den entsprechenden Fragmenten und die fusionierten C-repetitiven Sequenzen auf einer Gesamtlänge von 280 Nukleotiden der carboxyterminalen Aminosäureregion von M5.
Dieses Konstrukt ist insofern bemerkenswert, als es nicht nur Antikörper gegen M6-M19- M24-M5 hervorrufen wird, sondern auch gegen die C-repetitiven Sequenzen. Jede vollständige C-repetitive Sequenz ist 35 Aminosäuren lang, wobei die letzte ungefähr 1/2 davon ausmacht. Die C-repetitiven Sequenzen werden mukosale, protektive Antikörper erzeugen. Folglich ist dieses wieder ein interessantes Vakzin für vielfache Zwecke.
Bei noch einer weiteren, offenbarten Ausführungsform ist ein multivalentes Hybrid-M- Protein mit kurzen Untereinheiten in Fig. 12 dargestellt. Fig. 12 zeigt die Nukleotidsequenzen rekombinanten DNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des tetravalenten Hybrids M24-M5-M6-M19, das 201 Nukleotide umfaßt, die 65 Aminosäuren kodieren. In Verbindung mit dieser Ausführungsform ist die Verkürzung jeder Untereinheit und der Linker, die zwei Aminosäuren umfassen, kodiert durch die gezeigten Restriktionsstellen BamHI, SalI und NcoI, von Interesse. Durch Verkürzen jeder Untereinheit kann die immunogene Wirkung von jeder bestimmt werden. Die Gesamtgröße des Moleküls kann minimiert werden. Dies ermöglicht die Konstruktion multivalenter Konstrukte, an die andere Untereinheiten aus heterologen Serotypen von M-Proteinen co-fusioniert sind. Demnach kann leicht erkannt werden, daß andere rheumatogene aminoterminale Fragmente, wie etwa Serotyp M1-M3-M18, diesem Konstrukt angefügt werden können, um dafür zu sorgen, daß das multivalente Hybrid- M-Protein von zunehmender Multivalenz ist. Oder es kann, wie oben beschrieben, eine Mischung aus derartigen kleineren Strukturen als ein Vakzin an den Patienten verabreicht werden.
Wenn Kaninchen mit dem gereinigten, tetravalenten M-Protein immunisiert werden, sind signifikante Antikörper-Konzentrationen aller vier Serotypen des gereinigten, nativen M- Proteins zu beobachten. Das gleiche Konstrukt kann hergestellt werden, indem die kurzen Linker weggelassen werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 13 ein oktavalentes Hybrid- Protein M24-M5-M6-M19-M3-M1-M18-M12 dargestellt. Dieses oktavalente Hybrid-Protein- Vakzin ist aus einer Fraktion von M24 mit einer Länge von 15 Aminosäuren, einer Fraktion von M5 mit einer Länge von 15 Aminosäuren, aus einer Fraktion von M6 mit einer Länge von 15 Aminosäuren, einer von M19 mit einer Länge von 15 Aminosäuren, einer Faktion von M3 mit einer Länge von 15 Aminosäuren, einer Fraktion von M1 mit einer Länge von 15 Aminosäuren, einer Fraktion von M18 mit einer Länge von 15 Aminosäuren und einer Fraktion von M12 mit einer Länge von 15 Aminosäuren aufgebaut.
Jede Aminosäure wird durch einen, 2 Aminosäuren langen Linker mit der folgenden Aminosäure verknüpft, wobei die Nukleotidsequenz 405 lang ist und das Hybrid-Proteinmolekül mit einer Länge von 135 Aminosäuren kodiert.
Was bei dieser Idee der Erfindung von besonderem Interesse ist, ist, daß zusätzlich zu den Untereinheiten von rheumatogenen endterminalen Fraktionen, ein nicht-rheumatogener Serotyp von Streptokokken kodiert und exprimiert wurde, nämlich der von M12.
Dies ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, die nicht auf einen bestimmten nichtrheumatogenen M12-Serotyp von Streptokokken, wie dargestellt, beschränkt ist. Allerdings kann anstelle einer Fraktion von M12 eine geeignete Fraktion, wie etwa aus 10, 12 oder mehr Aminosäuren von jedem der nicht-rheumatogenen Serotypen, verwendet werden, wie etwa die folgenden: 2, 10, 8, 9, 11, 22, 33 und andere.
Während eine bestimmte Anzahl von rheumatogenen Typ M-Proteinen noch nicht sequenziert oder ihre Sequenz noch nicht offenbart worden ist, ist eine solche Sequenzierung leicht durch im Stand der Technik bekannten Verfahren durchzuführen und folglich können geeignete Fraktionen, die frei sind von Epitopen, die mit menschlichem Gewebe kreuzreagieren, hergestellt werden, um das multivalente Hybrid der Erfindung zu bilden. Es wird auch in Erwägung gezogen, daß mehr als eine Fraktion des rheumatogenen Serotyps von Streptokokken in dem multivalenten Vakzin enthalten ist. Wenn die antigene Wirkung dieses oktavalenten Hybrid- Pröteins getestet wird, reagiert es mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum, das gegen jede Komponente des Hybrid-Proteins erzeugt wurde. Seine immunogene Wirkung und das Fehlen einer Kreuzreaktivität mit menschlichem Gewebe, insbesondere Myokard, kann in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Tests getestet werden. Folglich werden die Immunseren opsonisierende Antikörper gegen alle sieben Typen von Serotypen von Gruppe A- Streptokokken enthalten. Die immunogene Wirkung des tetravalenten Proteins und die Antikörper-Konzentration wird bestimmt werden. Die Immunseren werden auch opsonisierende Antikörper gegen alle vier Serotypen von Gruppe A-Streptokokken enthalten, werden auf bakterielle Aktivität in vitro in einem passiven Protektionstest an der Maus wie beschrieben in vivo getestet werden. Das multivalente Protein wird gemäß dem hier beschriebenen Test auf das Vorhandensein von weitgehend protektiven Antikörpern unter Verwendung der passiven Protektionstests an der Maus, getestet. In diesem Fall werden aktiv immunisierten Mäusen die virulenten Streptokokken auf ähnliche Weise verabreicht.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird folglich ein multivalentes Hybrid-M-Protein verfügbar gemacht, welches eine breite Immunität gegen verschiedene Serotypen, von denen einer Serotyp M1 ist, verfügbar macht und auch protektive mukosale Immunität hervorruft.
Es ist ebenfalls die Absicht der Erfindung, ein multivalentes Vakzin zu haben, das aus zwei verschiedenen Serotypen aufgebaut ist, gefolgt von einer nicht-rheumatogenen Fraktion wie hier oben dargestellt, z. B. im Zusammenhang mit Fig. 13. Ebenfalls sollte beachtet werden, daß es vorstellbar ist, daß das Hybrid-Gen und folglich das exprimierte Hybrid-Protein den nicht-rheumatogenen Serotyp des Streptokokkus als die erste Fraktion stromaufwärts von den rheumatogenen Aminosäurefraktionen der aminoterminalen Bereiche der entsprechenden Serotypen von Streptokokken aufweist. Weiterhin ist es im Rahmen der Erwägung der Erfindung, Hybrid-Gene und die exprimierten Hybrid-Gene zu konstruieren, die aus einem rheumatogenen Serotyp, wie etwa M24-M5-M6-M19-M1-M3-M18 oder anderen aufgebaut sind, wobei eine nicht-rheumatogene Fraktion eines Serotyps von Streptokokken, wie etwa M12 oder andere, folgt oder vorausgeht, zu konstruieren.
Von besonderem Interesse in Verbindung mit der Erfindung sind Vakzine, die Aminosäureuntereinheiten von jedem oder allen der 1-80 verschiedenen bekannten oder zu entdeckenden Serotypen beinhalten, wovon von ungefähr 15 bekannt ist, daß sie bei der Entwicklung von akutem rheumatischem Fieber nach einer Halsentzündung ursächlich sind oder zumindest dazu beitragen.
Es ist wichtig anzumerken, daß die Erfindung nicht auf eine bestimmte Aminosäuresequenz beschränkt ist, wo auch immer Aminosäuresequenzen hier genannt oder beschrieben werden. Bei jeder bestimmten Aminosäuresequenz oder jedem Fragment, die hier genannt werden, können eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, substituiert, d. h. durch (eine) andere Aminosäure ersetzt, sein, solange die gewünschten Epitope durch derartige Änderungen in der Struktur der Aminosäuren nicht nachteilig beeinflußt werden. Allerdings wird dies ganz häufig insofern gefunden, als die Aminosäuresequenzen bestimmter Typen von M-Proteinen, wie etwa Typ M5, der von verschiedenen Stämmen von M5 stammt (und ebenfalls von verschiedenen Ursprüngen und/oder zu verschiedenen Zeiten stammen), verschiedene Aminosäuresubstitutionen, d. h. Konstitution, haben können. Dies ist für mehrere solcher M-Proteine gezeigt worden. Hinsichtlich dieser Wirkung sollte auf Miller et al., J. Biol. Chem. 263: 5668 (1988) "Antigenic Variation Among Group A Streptococcal M Proteins: Nucleotide Sequence of the Serotype SM Protein Gene and its Relationship with Genes Encoding Types 1, 6 and 24 Proteins", verwiesen werden und siehe auch Dale et al., J. Exp. Med. 163: 1191-1202 (1986), "Localization of Protective Epitopes of the Amino Terminus of Type 5 Streptococcal M Protein."
Wie beschrieben worden ist, kann das N-terminale Segment, das frei von Gewebekreuzreaktiven Epitopen ist, von 10 bis 115 Aminosäuren reichen und als ein Mittelwert ungefähr 35 Aminosäuren aufweisen, abhängig von dem speziellen M-Protein-Typ.
Dementsprechend kann jedes einzelne Fragment einer Untereinheit, die das Hybrid-Gen und folglich das exprimierte Hybrid-Protein aufbaut, entsprechend konstruiert sein, so daß es mehrere Aminosäuresubstitutionen aufweist, um solche Amiosäuresubstitutionen von einem Stamm und z. B. zwei oder mehrere Substitutionen eines anderen Stamms desselben Serotyps zu enthalten. Folglich würden die hergestellten Antikörper funktionell optimal von und mit allen Stämmen des bestimmten Typ 5M-Proteins reagieren.
Es ist deshalb eine wichtige Idee bei dieser Erfindung, daß, wenn auf einen speziellen Serotyp (d. h. auf jeden der bekannten oder zu entdeckenden Serotypen, z. B. 1-82) Bezug genommen wird, die Bezugnahme nicht einen einzelnen Typ oder Stamm, wie etwa der von M5-M6- M19-M24 beabsichtigt, sondern die verschiedenen Stämme solcher Serotypen, die, wie beschrieben, Aminosäurevarianten aufweisen können. Folglich ist das fundamentale Konzept dieser Erfindung nicht nur, ein multivalentes Vakzin gegen verschiedene Serotypen zur Verfügung zu stellen, sondern auch verschiedene Stämme innerhalb des bestimmten Serotyps.
Gleichfalls kann die Nukleotidsequenz so modifiziert sein, daß sie für die gewünschten, immunbiologisch funktionell äquivalenten Aminosäuresequenzen kodiert. Ähnlich ist vom Umfang der Erfindung umfaßt, daß aufgrund der Degeneration des genetischen Codes DNA- Sequenzen konstruiert oder verwendet werden, welche die gewünschten Aminosäurefragmente kodieren und in einem ausgewählten Organismus, transformiert (oder transfiziert) mit dem ausgewählten selbstreplizierenden Vehikel, exprimiert werden.
Wie hier beschrieben worden ist, ist die Erfindung nicht auf ein bestimmtes Maximum von multivalenten Hybrid-Genen oder exprimiertem multivalentem Vakzin durch irgendeine bestimmte Anzahl von Serotypen beschränkt. Da es allerdings praktische Grenzen zu geben scheint, ist vorgeschlagen worden, daß ein Cocktail oder eine Mischung von multivalenten Hybriden mit geeigneter Größe konstruiert wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Hybrid- oder Fusions-Gene, die konstruiert worden sind, welche die Antigene der vorliegenden Erfindung kodieren. Die Fusionsgene kodieren für die Antigene der Erfindung, aufgebaut wie oben beschrieben aus Aminosäurefragmenten, die an den ausgewählten Trägerstoff gebunden sind. Die Gene werden in geeignete selbst-replizierende Vehikel, wie Plasmide, insertiert. Die Plasmide, welche die Gene enthalten, werden dann verwendet, um nicht-virulente Mikroorganismen zu transformieren. Die transformierten Mikroorganismen exprimieren die Hybrid- oder Fusionsprotein- Antigene, die in der Lage sind, opsonisierende und/oder protektive Antikörper gegen Serotypen von Gruppe A-Streptokokken in immunisierten Säugetieren hervorzurufen, ohne im Säugetier kreuzreaktive Antikörper gegen Herzgewebe-Antigene hervorzurufen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auf jedem geeignetem Weg, einschließlich oral und nasal, verabreicht werden. Sie können zur nasalen Verabreichung in einem geeigneten Treibgas dispergiert sein.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch parenteral verabreicht werden. Säugetiere, insbesondere Menschen, die mit einer ausreichenden Menge an der therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung parenteral immunisiert wurden, entwickeln opsonisierende und/oder protektive Antikörper, die gegen die Epitope des Hybrid-M-Protein-Antigens von Streptokokken gerichtet sind. Nicht-einschränkende Beispiele solcher parenteralen Wege einer Verabreichung sind intrakutan und intramuskulär.
Für eine intrakutane Injektion wurden einem Säugetier 100-300 ug Hybrid-Antigen, emulgiert in komplettem oder inkomplettem Freund'schem Adjuvans, verabreicht. Eine Wiederholungsinjektion von ungefähr derselben Dosis in Kochsalzlösung wurde ungefähr einen Monat später verabreicht. Vor der ersten Injektion und danach über 8 Wochen wurde in zweiwöchigen Intervallen Blut abgenommen.
Eine topische Methode der Verabreichung wird ebenfalls verfügbar gemacht, nämlich intranasal. Zur intranasalen Verabreichung erhält ein Säugetier ungefähr 50 ug bis ungefähr 10 mg von gereinigtem Antigen in einem zur Verabreichung geeigneten Lösungsmittel. Eine derartige Methode kann besonders gut geeignet sein, wenn das Vakzin konstruiert worden ist, um sekretorische oder mukosale Immunität hervorzurufen, da eine Infektion des Nasopharynx eine häufige Infektion beim Menschen ist.
In Übereinstimmung mit der Erfindung kann die therapeutische Zusammensetzung einzeln in Serien oder vorteilhafterweise in einer Mischung oder einem Cocktail mit einer Vielzahl von Zusammensetzungen verabreicht werden, um ein breites Immunitätsspektrum gegen Gruppe A-Streptokokken hervorzurufen.
Die Vakzin-Zusammensetzungen der Erfindung, welche die Antigene der Erfindung einschließen, können wie im US-Patent Nr. 5,124,153 von Bleachey et al., das hiermit durch Zitat aufgenommen ist, offenbart, und wahlweise in biologisch akzeptierbaren Verdünnungsmitteln oder Adjuvanzien verabreicht werden. Die Zusammensetzungen sind für das Hervorrufen opsonisierender und/oder protektiver Antikörper gegen Serotypen des M-Proteins von Gruppe A-Streptokokken geeignet. Die verabreichten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung rufen derartige Antikörper hervor, ohne kreuzreaktive Antikörper gegen Herzgewebe-Antigene eines Säugetiers hervorzubringen.
Die Plasmide, welche die Hybrid-M-Protein-Gene der vorliegenden Erfindung kodieren, können zunächst kloniert und in Escherichia coli exprimiert werden. Jede anderen Darmbazillen der coliformen Gruppe, wie etwa Klebstella oder Enterobacter, können verwendet werden, normalerweise wird jedoch E. coli bevorzugt. Das Plasmid, welches das Hybrid-M-Gen trägt, wird isoliert und gereinigt, und dann wird ein Konstrukt geschaffen, um die gewünschten avirulenten Bakterien, wie etwa araA-S. typhimurium (5L3261), zu transformieren. Dieser Mutanten-Stamm zeigt einen Nährstoff-Marker sowohl für PABA als auch 2,3-DHB. Siehe Brown et al. (im Patent von Beachey). Eine andere gewünschte Spezies von S. typhimurium ist recA-S. typhimurium, insbesondere Stamm Ty2la. Siehe Clements, et al., "Construction of a Potential Live Aro Vaccine for typhoid type fever and cholorea-E. coli-related diarrheas", Infect. Immun. 46 : 564-9 (1984). Siehe auch die anderen Referenzen, die in dem oben zitierten Artikel von Brown, et al. zitiert werden, welche durch Zitat ebenfalls hier aufgenommen worden sind. Vektoren, die auf Wirtszellen anderer Gram-negativer Bakterien, wie etwa der Enterobacteriaceae-Gattung (wie etwa Shigella; Klebstella wie Klebstella pneumonia; und Enterobacter wie Enterobacter aerogenes. Salmonellae, wie etwa Salmonella arizona; und Citrobacter) übertragen werden können, können verwendet werden, wenn sie auf geeignete Weise nicht-virulent gemacht oder abgeschwächt wurden. Übliche Salmonella-Spezies, die verwendet werden können, wenn sie abgeschwächt und nicht-virulent gemacht wurden, schließen die folgenden ein: S. paratyphi A, S. schottmulleri, S. typhimurium, S. paratyphi C, S. choleraesuis, S. montevideo, S newport, S typhi, S enteritidis, S. gallinarium und S. anatum.
Ebenfalls als Wirtsbakterien der Streptokokkus-Gattung, die nicht-virulent sind oder die nicht-virulent gemacht oder abgeschwächt worden sind, einschließlich Streptokokken der immunologischen Gruppen A-O, können verwendet werden, normalerweise andere als A. Geeignete Streptokokken, welche als bakterieller Wirt verwendet werden können, schließen S. cremoris, S. faecalis, S salivarius, S. mitior, S. mitis, S mutans und S. sanguis ein. Besonders bevorzugt sind S. sanguis, S. mutans, welche nicht-cariogen sind.
Weitere geeignete Mikroorganismen, welche abgeschwächt und in Übereinstimmung mit der Erfindung transformiert sein können, sind bekannt. Als Referenz könnte Davis et al., Microbiology, (Harper & Row, Second edition, 1973) angeführt werden.
Allgemein kann jedes Darmbakterium als das Wirtsbakterium dienen. Es ist bevorzugt, daß das Wirtsbakterium in dem Individuum nur lange genug überlebt, um die Opsonisierungsantwort auszulösen, aber allgemein kann jeder Bakterienstamm, der abgeschwächt worden ist, um keine Kolonien zu bilden, sich jedoch bis zu einem begrenzten Grad multipliziert, um Antikörper gegen das Protein-Antigen der vorliegenden Erfindung hervorzurufen, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der arcf-Stamm von S. typhimurium verwendet, der zwei Metaboliten benötigt, die in Säugetiergeweben nicht vorhanden sind, nämlich PABA und 2,3-DHB. Als ein Ergebnis sterben die inokulierten Bakterien nach mehreren Generationen an einem Mangel an diesen Metaboliten ab. Siehe Hoiseth and Stocker (in dem Patent von Beachey). Allerdings kann jedes mutierte mikrobiologische Agens mit einer metabolischen Defizienz für Nährstoff-Verbindungen, die nicht in den Geweben des zu immunisierenden Individuums gefunden werden oder eines, das durch genetische Manipulationen dahingehend verändert wurde, eingesetzt werden. Die Expression des Hybrid-Gens ist nahezu ausschließlich auf das zytoplasmatische Kompartiment beschränkt.
In Llbereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden allgemeine molekularbiologische Verfahren angewendet. Jedes geeignete Plasmid oder jeder geeignete Bacteriophagen- Klonierungsvektor kann ausgewählt werden. Der Vektor sollte einen Replikationsstart haben, der in den vorgesehenen mikrobiologischen Wirtszellen funktionell ist, und einen selektionsfähigen Marker (wie etwa ein Antibiotika-Resistenzgen), um bei der Identifikation von Wirtszellen, die mit dem Vektor transformiert worden sind, zu helfen. Er sollte in der Lage sein, insertierte DNA-Fragmente zu akzeptieren und sich noch normal zu replizieren. Bevorzugterweise umfaßt der Vektor eine oder mehrere einzigartige Restriktionsendonuklease- Erkennungsstellen, an denen Hybrid-DNA-Fragmente insertiert werden können, ohne die Fähigkeit des Vektors, sich zu replizieren, zu zerstören.
Geeignete Klonierungsvektoren schließen Phagen-Derivate, wie etwa lambda gtll (Young and Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198 (1983)), die verschiedenen vom Phagen M13 abgeleiteten Vektoren, wie etwa M13mp9 (kommerziell erhältlich von Bethesda Research Labs), Plasmide, wie etwa pBR322, und viele andere ein (Old and Primose, Principles of Gene Manipulation, 2nd Ed., University of California, Press, 32-35 und 46-47 (1981). Die Streptokokken-DNA wird in den Klonierungsvektor durch solche Standardverfahren wie homopolymeres Tailing oder unter Verwendung von Linker-Molekülen insertiert.
In Verbindung mit der Offenbarung werden die PCR-Methode und andere molekularbiologische und immunologische Verfahren und Materialien verwendet. Für die Methode zum Synthetisieren bestimmter Fragmente in der vorselektierten Sequenz und Orientierung allerdings, wird die PCR-Methode und andere Materialien, die hier verwendet wurden, in mehreren allgemeinen Standardtexten und Laborhandbüchern beschrieben, z. B. Sambrook, Sektion 14, in vitro Amplifleation of DNA by PCR; Ausubel Protocols Molecular Biology, Sektion 15; für die Proteinexpression siehe ibid, Sektion 16; für prokaryotische und eukaryotische Expressionsvektoren siehe Sambrook, Sektion 17; Protocols Molecular, Sektion 1, z. B. E. coli- Plasmide, worin zahlreiche verfügbare Plasmide aufgeführt sind. Für andere geeignete Vektoren zum molekularen Klonieren siehe Perbal (2nd Ed.), Sektion 6, worin beispielsweise Klonierungvektoren, die von pBR322 (hier verwendet) abgeleitet sind, aufgeführt werden. Für Materialien, Protokolle etc. in der Immunologie siehe allgemein Current Protocols, Immunology; siehe auch Sektion 7 für immunologische Untersuchungen am Menschen und Sektion 8 für die Isolierung und Analyse von Proteinen. Der ATTC-Katalog zu Bakterien und Phagen führt geeignete Mikroorganismen auf. Als einen Katalog über Hefen siehe ATCC-Katalog zu Hefe (1990) 1 Sth Ed. Für geeignete, rekombinante DNA-Materialien (Wirte, Bibliotheken, Vektoren, Klone, etc.), siehe ATCC-Katalog über rekombinante DNA-Materialien, 2nd Ed. (1991).
Eine andere lohnende Publikation ist Immunology of Proteins, Atassi (Vol. 3), Plenium Press (1979).
Diese Erfindung liefert einen bedeutenden Beitrag zum medizinischen Stand der Technik. Als vom Umfang der Erfindung umfaßt, wird in Erwägung gezogen, daß im wesentlichen dieselben Ergebnisse durch im wesentlichen dieselben Mittel, die im wesentlichen in der gleichen Weise wie hier beschrieben funktionieren oder verwendet werden, erhalten werden. Jemand, der auf dem Gebiet sachkundig ist, kann das unten aufgeführte Literaturverzeichnis hinzuziehen, was durch Zitat hier aufgenommen wurde.

LITERATURVERZEICHNIS

1. ATCC Catalogue of Bacterial & Bacteriophages, Editors, Gherna et al., 17th Ed. (1989).
2. ATCC Catalogue of Yeasts, Editors, Jong et al., 18th Ed. (1990).
3. ATCC Catalogue of Recombinant DNA Materials, Edited Maglott et al., 2nd Ed. (1991).
4. Baird, R.W. et al., Epitopes of Group A Sireptococcal M Protein Shared with Antigens o Articular Cartilage and Synovium, J. Immunol., 146, 1191-1202 (1991).
5. Beachey, E.H. et al., Peptic Digestion of Streptococcal M Protein. II, Extraciion of M Antigen from Group A Streptococci With Pepsin, Infec. Immun., 9, 891-896 (1974).
6. Beachey, E.H., et al., Purification and Properties of M Protein Extracted from Group A Streptococci with Pepsin: Covalent Structure of the Amino Terminal Region of the Type 24 M Antigen, J. EXD. Med., 145, 1469 (1977).
7. Beachey, E.H., etal., Repeating Covalent Structure of Streptococcal M Protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3163-3167 (1978).
8. Beachey, E.H., et al., Type-Specific Protective Immuaity Evokcd by Synthetic Peptide of Streytococcus DYO2CDCS M Protein, Nature (London), 292, 457-459 (1981).
9. Beachey, E.H, and Seyer, J.M., Protective and Non-protective Epitopes of Chemically Synthesized Peptides of the NH&sub2;-Terminal Region of Type 6 Streptococcal M Protein, J. Immunol., 136, 2287-2292 (1986).
10. Beachey et al., Protective Immunogenicity and T Lymphocyte Specificity of a Trivalent Hybrid Peptide containing NH&sub2;-terminal Sequences of Types 5,6 and 24 M Proteins Synthesized in Tandem, J. Exu. Med., 166, 647 (1987)
11. Bisno, A.L., The Concept of Rheumatogenic and Non-Rheumatogenic Group A Streptococci. In Reed, S.E. and J.B. Zabrisikie (eds.) Streptococcal Diseases and the Immune Response, New York, Academic Press, 789-803.
12. Bronze, M.S., et aL, Protective and Heat-Crossreactive Epitopes Located within the N- Terminus of Type 19 Streptococcal M Protein, 1. Exv. Med., 167, 1849-1859 (1988).
13. Cunningham, M.W et al Human and Murine Antibodies Cross- Reactive with Streptococcal M Protein and Myosin Recognize the Sequence GLN-LYS-SER-LYS-GLN in M Protein, J Immunol., 143, 2677 (1989).
14. Current Protocols in Molecular Biolo, Ediced by Ausubel, et al., Greene Associates and Wiley-Intersciene (Publishers) (1987-88), Vols. 1 and 2.
15. Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan et al., Greene Associates and Wileytntersciene (Publishers) (1991), Vol. 1.
16. Dale, J.B., et al., Heterogeneity of Type-Specific and Cross-Reactive Antigenic Determinants within a Single M Protein of Group A Streptococci, J. EXp. Med., 151, 1026 (1980).
17. Dale et al., Type-Specific Immunogenicity of a Chemically Synthesized Peptide fragment of Type 5 Streptococcal M Protein, J. EXD. Med., 158, 1727 (1983).
18. Date, J.B. and Beachey, E.H., Multiple Heart-Cross-Reactive Epitopes of Streptococcal M Proteins, J. Exp.. Med., 161, 113-122 (1985).
19. Dale, J.B. aad Beachey, E.H., Epitopes of Streptococcal M Proteins Shared with Cardiac Myosin, J. Exp. Med., 162, 583-591 (1985).
20. Dale, J.B. and Beachey, E.H., Sequence of Myosin-Cross-Reactive Epitopes of Streptococcal M Protein, J. EXp. Med., 164, 1785-1790 (1986).
21. Dale, J.B. and Beachey, E.H., Localization of Protective Epitopes of the Amino Terminus of Type 5 Streptococca1 M Protein, J. Exn. Med., 163, 1191-1202 (1986).
22. Fischetti, V.A., Streptococcal M Protein, Scientific American (1991).
23. Fischetti, et al., Surface Proteins from Gram-Positive Cocci Share Unique Structural Features, Persyective an Streptococci and Streotococcal Infections (G. Orefici, Editor), Gustave and Jena (Publishers) 1992.
24. Freimer and McCarty, Rheumatic Fever, Scientific American (December 165).
25. Guthrie & Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzvmology, Academic Press (991).
26. Hollingshead, S.K. et al., Complete Nucleotide Sequence of Type 6M Proteia of the Group A Streptococcus. Repetitive Structure and Membrane Anchor, J. Biol. Chem., 261, 1677 (1986).
27. IBI Catalog, Kodak, 1990.
28. Innis, M.A., et al., PCR Protocols (eds.), San Diego CA., Academic Press (1990).
29. Inouye, M., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, 100-104 (1983k
30. Jones, K.F. and Fischetti, V.A., The importance of the Location of Antibody Binding an the M6 Protein for Opsonization and Phagocytosis of Group A M6 Streptococci, J. Exp. Med., 167, 1114 (1988).
31. Kraus et al., Sequence and Type-Specific Immunogenicity of the Amino-Terminal Region of Type 1 Streptococcal M Protein, The Journal of Immunology, 139, 3084-3090 (Nov. 1987)
32. Lancefield, R.C., Current Knowledge of the Type-Specific M Antigens of Group A Streptococci, J. Immunol., 89, 307 (1962).
33. Lancefield, R.C., Persistence of Type-Specific Antibodies in Man Following Infection with Group A Strcptococci, J. EXp. Med., 110, 271 (1959).
34. Miller, L., et al., Antigenic Variation Among Group A Streptococcal M Proteins: Nucleotide Sequence of the Serotype SM Protein Gene and its relationship with Genes Encoding Types 1,6 and 24 M Proteins, J. Biol. Chem., 263, 5668 (1988).
35. Mouw, A.R., et al., Molecular Evolution of Streptococcal M Protein: Cloning and Nucleotide Sequence of the type 24 M Protein Gene and Relation to Other Genes of Streotococcus pyoQenes, J. Bacteriol., 170, 676 (1988).
36. Podbielski et al., Application of the Polymerase Chain Reaction to Study the M Protein(-like Gene Family in Beta-Hemolytic Streptococci, Med. Microbiol. Immunol., 180, 213 (1991)
37. Robbins et al Streptococcus Pyogenes Type 12 Protein Gene Regulation by Upstream Sequences, Journal of Bacterioloav, 5633-5640 (Dec. 1987)
38. Sambrook, 1., et al., Molecular Cloning: A Laboracory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold S rin Harbor, New York, (eds.) 1989.
39. Sanger et. al., DNA Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 74, 5463 (1977).
40. Sargent, S.J., et al, Sequence of Protective Epitopes of Streptococcal M Proteins Shared witb Cardiac Sarcolemmal Membranes, J. Immunol., 139, 1285-1290 (1987).
41. Stollerman, Rhenmatic Fever and Stregtococcal Infection, Grune & Stratton (1975).
42. Watson, Molecular Biolo of the Gene, 3rd Ed., W.A. Benjamin, Inc.
43. U.S. Patent No. 4,284,537 Beachey, (August 18, 1991).
44. U.S. Patent No. 4,454,121 Beachey, (June 12, 1984).
45. U.S. Patent No. 4,521,334 Beachey, (June 4, 1985).
46. U.S. Patent No. 4,597,967 Beachey, (July 1, 1986).
47. U.S. Patent No. 4,919,930 Beachey et al., (April 24, 1990).
48. U.S. Patent No. 4,705,684 Beachey, (November 10, 1987).
49. U.S. Patent No. 5,124,153 to Beachey et al. (1992)

Claims

1. Aufgereinigtes immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein, das aminoterminale Peptidfragmente von Streptokokken-M-Protein umfaßt, die Opsonin-Antikörper gegen multiple Serotypen von Gruppe-A-Streptokokken auslösen, wobei besagtes Protein nicht Gewebe-kreuzreaktive Antikörper auslöst, wobei wenigstens einer der besagten Serotypen M1 ist.

2. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M3 umfaßt.

3. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M5 umfaßt.

4. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M6 umfaßt.

5. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M12 umfaßt.

6. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M14 umfaßt.

7. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M18 umfaßt.

8. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M19 umfaßt.

9. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M24 umfaßt.

10. Immunogenes, rekomobinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M27 umfaßt.

11. Immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, das weiterhin ein Peptidfragment vom Serotyp M29 umfaßt.

12. Immunogenes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 1, wobei das Hybrid-M- Protein auch mukosale Antikörper auslöst.

13. Immunogenes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das trivalent ist.

14. Immunogenes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das tetravalent ist.

15. Immunogenes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das octavalent ist.

16. Immunogenes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei Peptidfragmente miteinander verbunden sind über einen Linker, der Aminosäuren umfaßt.

17. Immunogenes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach Anspruch 16, wobei die Linker der Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Ser, Val, Asp, Pro und Trp.

18. Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 17.

19. Aufgereinigtes, immunogenes, rekombinantes, multivalentes Hybrid-M-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Verwendung beim Immunisieren eines Säugetiers gegen Streptokokken-Infektion.

20. Verwendung eines aufgereinigten immunogenen, rekombinanten, multivalenten Hybrid- M-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Herstellung eines Medikaments zum Immunisieren eines Säugetiers gegen Streptokokken-Infektionen.

21. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein multivalentes Hybrid-M-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 17 kodiert.