DE69015314T2

DE69015314T2 - Verwendung von adenylzyclase als vakzin gegen bordetella.

Info

Publication number: DE69015314T2
Application number: DE69015314T
Authority: DE
Inventors: Nicole F-75013 Paris Guiso-Maclouf
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1989-05-12
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2010-05-12
Also published as: FR2646776B1; EP0424518A1; US20020172691A1; FR2646776A1; JP3399525B2; CA2033085C; JPH03506044A; US20030224003A1; EP0424518B1; ES2066206T3; PT94030A; CA2033085A1; DE69015314D1; ATE115861T1; PT94030B; WO1990013312A1; US6214356B1; US7211263B2

Description

Die Erfindung betrifft Impfstoffe, die Mensch oder Tier gegen die tödlichen Infektionen, die von den Bakterien der Gattung Bordetella hervorgerufen werden, schützen können. Sie betrifft besonders die Verwendung von Impfzubereitungen, die ausgehend von Bordetella oder insbesondere von von diesen Bakterien produzierter Adenylcyclase hergestellt werden, als Schutzantigene gegen die toxischen Wirkungen der durch Bakterien der Gattung Bordetella bedingten Infektionen.
Bekanntermaßen sind die Bakterien der Gattung Bordetella insbesondere Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica für Atemwegserkrankungen bei Vertebraten verantwortlich.
Zum Beispiel ist B. pertussis beim Menschen für Keuchhusten, eine Kinderkrankheit, die in der ganzen Welt stark verbreitet ist, verantwortlich.
Die Impfung gegen Keuchhusten wird heutzutage meistens allgemein mittels ganzer inaktivierter Bakterien durchgeführt.
Dennoch sind diese Impfstoffe nicht immer frei von Toxizität, da die Virulenzfaktoren von den von den Bakterien sezernierten Proteinen gebildet werden und nicht von den Bakterien selbst. Die Proteine können folglich selbst nach dem Tod der Bakterien schwere pathologische Wirkungen ausüben.
Unter den Virulenzdeterminanten von B. pertussis können die Adhäsine, wie die Agglutinogene (AGG), filamentöses Haemagglutinin (FHA) und das Pertussistoxin (PTx), ein Cytotrachealtoxin (TCT), ein dermonekrotisches Toxin (DNT) und ein Adenylcyclase-Hämolysin (AC) aufgeführt werden. Dieses letztere wird in Form eines großen Vorläufers von 1706 Resten synthetisiert. Der aminoterminale Abschnitt des Moleküls trägt die Adenylcyclaseaktivität und der carboxyterminale Abschnitt weist eine hohe Homologie zu dem Produkt des Hly-Gens von E. coli (Hämolysin) auf. Diese Adenylcyclase hat die Eigenschaft, durch Calmodulin aktiviert zu werden.
Die Forschung nach besser angepaßten Schutzmethoden hat die Erfinder dazu veranlaßt, die Rolle von jeder dieser Virulenzdeterminanten zu untersuchen und ein experimentelles Infektionsmodell zu entwickeln, das den Verlauf der natürlichen Erkrankung nachahmt.
Diese Arbeiten haben es ermöglicht, die Rolle der Adenylcyclase als Cytotoxin und als Schutzantigen und zum Entwickeln einer neuen Verwendung der Impfzubereitungen auf Basis von Adenylcyclase oder bakteriellen Zubereitungen, die die Adenylcyclase produzieren, festzustellen.
EP-A-0 272 174 beschreibt ein Reinigungsverfahren für Adenylcyclase aus Bordetella. Diese Patentanmeldung beschreibt gleichfalls die Verwendung von Bakteriensuspensionen verschiedener Arten von Bordetella. um einen Schutz gegen B. pertussis zu erhalten. Die Verwendung von gereinigter Adenylcyclase aus B. bronchiseptica ist nicht beschrieben.
EP-A-0 338 169 beschreibt einen Kreuzschutz zwischen B. pertussis und B. parapertussis, der durch die Verabreichung von Adenylcyclase erhalten wird.
Novotny et al. (Develop. Biol. Stand. 61, 27-41, 1984) beschreibt die Verwendung eines von Bordetella stammenden Proteins, um einen Schutz gegen die Infektion durch B. pertussis zu erhalten. Das Protein (P69) wurde als "Adenylcyclase" bezeichnet. Demgegenüber haben spätere Arbeiten gezeigt, daß das Protein keine Adenylcyclase, sondern ein Agglutinogen ist.
Die Erfindung betrifft spezieller die Verwendung einer von Bordetella pertussis oder Bordetella bronchiseptica stammenden Adenylcyclase oder eines aktiven Fragments dieser Adenylcyclase, um ein Arzneimittel zu erhalten, das dazu bestimmt ist, Mensch oder Tier einen Kreuzschutz gegen die Infektionen und die toxischen Wirkungen, die von B. bronchiseptica bzw. B. pertussis hervorgerufen werden, zu verleihen.
Nach einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung den B. bronchiseptica-Stamm 9.73S, der bei der CNCM unter der Nr. I-858 hinterlegt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Impfzubereitung ausgehend von Adenylcyclase von B. bronchiseptica hergestellt und wird eingesetzt, um gegen die Infektionen und die toxischen Wirkungen, die von B. pertussis hervorgerufen werden, zu schützen.
Es ist festzuhalten, daß dieser Kreuzschutz, der ausgehend von Stämmen von B. bronchiseptica erhalten wird, den Vorteil aufweist, daß Stämme mit schnellerem Wachstum als B. pertussis verwendet werden, um Impfstoffe gegen die von B. pertussis hervorgerufenen Infektionen herzustellen.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Impfzubereitung ausgehend von Adenylcyclase von B. pertussis hergestellt und wird eingesetzt, um gegen die Infektionen und die toxischen Wirkungen, die von B. bronchiseptica hervorgerufen werden, zu schützen.
Die Adenylcyclase der Bordetella auf die vorstehend Bezug genommen worden ist, ist eine Adenylcyclase, wie sie durch Inkontaktbringen eines Überstands einer Bakterienkultur von Bordetella mit einem Gel Affigel-Calmoduline(R) erhalten wird.
Es handelt sich spezieller um eine Präparation von Adenylcyclase, wie sie in der Anmeldung FR 2606789, hinterlegt am 17.11.1986, beschrieben werden.
Es wird daran erinnert, daß diese Präparationen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine erhöhte Reinheit aufweisen und praktisch vollständig ohne verunreinigende bakterielle Produkte, insbesondere Pertussistoxine, Lipopolysaccharide (oder LPS) und filamentöses Haemagglutinin (oder FHA), sind.
Die Adenylcyclase dieser Präparationen liegt in homogener Form vor, die in einem Saccharose-Dichtegradienten mit einem S-Koeffizienten gleich 3,6 sedimentiert. Sie existiert in zwei molekularen Formen von 45 bzw. 43 kDa, die strukturell verwandt sind.
Solche Präparationen von Adenylcyclase besitzen eine Aktivität, die 1600 µmol cAMP min&supmin;¹ mg&supmin;¹ erreichen und selbst diese übersteigen kann.
Diese Präparationen können aus Kulturen von Bakterien, die AC (Adenylcyclase) exprimieren, spezieller von pathogenen Bakterien, deren AC in der Lage ist, mit der AC von Eukaryotenzellen zu interferieren, durch Inkontaktbringen eines vorab aufkonzentrierten Überstandes von Bakterienkulturen, die die Adenylatcyclase exprimieren, oder eines Extrakts dieser Bakterien mit Calmodulin hergestellt werden.
Um das Enzym in freier Form zu erhalten, verwendet man Calmodulin, das an einen Träger angeheftet ist, gewinnt dann das adsorbierte Enzym mittels eines Denaturierungsmittels, das nachfolgend entfernt wird, zurück und erhält die Präparation mit dem freien Enzym.
Der Träger wird insbesondere durch ein gegenüber der das Enzym enthaltenden Präparation inertes Material gebildet, das in der Lage ist, die Moleküle von hohem Molekulargewicht zurückzuhalten, wie ein Gel oder ein Filtrationsmaterial.
Das Filtrationsmaterial besteht vorteilhafterweise aus Nitrocellulose oder aus einem Kunststoff und weist eine Porosität von 0,45 - 0,22 µm auf.
Das Denaturierungsmittel ist vorzugsweise Harnstoff, vorzugsweise 4 bis 8,8 M.
Der aufkonzentrierte Überstand der Bakterienkultur wird erhalten, indem ein Überstand von Bakterienkulturen, die AC exprimieren, einem oder mehreren Filtrationsschritten mittels Nitrocellulose- oder Kunststoffiltern einer Porosität von vorteilhaft 0,45 bis 0,22 µm unterworfen wird, dann die Filter mit einem Detergens inkubiert werden, um die AC freizusetzen, und aus der AC-Präparation die darin vorliegenden unlöslichen Stoffe entfernt werden.
Das Detergens ist beispielsweise Triton(R) oder NP40(R).
Der Bakterienextrakt wird erhalten durch Behandlung der Bakterienzellen, die Adenylatcyclase exprimieren, mit Harnstoff und Gewinnung des Überstands.
In einer Variante verwendet man eine Adenylcyclase, wie sie durch die Nukleotidsequenz, die in der einzigen Figur mit der entsprechenden Aminosäuresequenz angegeben ist, exprimiert wird.
Es versteht sich von selbst, daß die Basen der in Betracht gezogenen Nukleotidsequenz in einer unterschiedlichen Reihenfolge gegenüber der, die in den Genen gefunden wird, sein können und/oder daß diese Basen gegebenenfalls demnach substituiert sein können, daß eine Sonde, die aus einer solchen Sequenz hergestellt wird, eine charakteristische Antwort liefert und nicht zweideutige Aussagen liefert, was die Fähigkeit angeht, die Anwesenheit eines Gens, das für ein Protein mit Adenylatcyclaseaktivität kodiert, zu erkennen.
Jede Nukleotidsequenz, die mit der der Sequenzabfolge, wie sie durch enzymatische inverse Transkription der entsprechenden RNA oder ferner durch chemische Synthese erhalten wird, hybridisiert werden kann, liegt gleichfalls im Rahmen der Erfindung.
Die vorstehend verwendeten Impfzubereitungen oder -präparationen können mit FHA und/oder PTx in demselben Inokulum oder nicht kombiniert werden.
Im letzteren Falle wird FHA zur gleichen Zeit wie die Impfzubereitung oder zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt verabreicht. Die FHA-Präparationen werden vorteilhafterweise nach beispielsweise dem Verfahren von SATO et al. in Infect. Immun., 1983, 41, 310-320 oder jenem von IMAIZUMI et al. in Journal of Microbiol. Methods, 2,334-347 (1984) erhalten.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt zieht die Erfindung als Impfstoffe, die in der Lage sind, einen Schutz gegen die toxischen Wirkungen und die Infektionen, die von den Bakterien der Gattung Bordetella hervorgerufen werden, zu induzieren, molekulare Impfstoffe in Betracht, die mindestens den aktiven Abschnitt der Aminosäuresequenz, die in der einzigen Figur wiedergegeben wird, enthalten, gegebenenfalls kombiniert, in demselben Inokulum oder nicht, mit FHA und/oder PTx.
Diese Impfstoffe werden gemäß der Erfindung verwendet, um Kreuzschutz zu bewirken.
Beim Ausführen der Erfindung werden die Impfzubereitungen auf Basis von durch diese Bakterien hergestellter Adenylcyclase, vorzugsweise gereinigt, wie auch die Impfstoffe, die ausgehend von rekombinanter Adenylcyclase hergestellt wurden, in Dosen und in üblichen Verabreichungsformen, insbesondere in klassischen, auf intranasalem, oralem oder parenteralem Wege verabreichbaren Formen, verwendet.
Andere charakteristische Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden in der Beschreibung der nachfolgenden Beispiele, die sich auf die einzige Figur beziehen, die die Nukleotidsequenz des aktiven Abschnitts des Gens von B. pertussis das für die Adenylcyclase kodiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz wiedergibt, verdeutlicht.
Das in den in den Beispielen beschriebenen Versuchen verwendete Atemwegsinfektionsmodell ist ein Modell einer Infektion auf intranasalem Wege. Die in vivo-Selektion eines hyperpathogenen Abkömmlings des virulenten B. pertussis-Stamms 18323S (internationaler Referenzstamm für die Untersuchungen zur Bewertung von Impfstoffen) aus einer Lunge einer durch B. pertussis infizierten Maus hat es erlaubt, bei erwachsenen Mäusen eine akute ödematöse hämorrhagische Alveolitis (AOHA), die nach 48-72 h letal verläuft, nach einer Injektion der Bakterien auf intranasalem Wege zu beobachten.
Die Analysen der Produkte der Beispiele werden, wie folgt, ausgeführt.
Die AC-Aktivität wird gemäß dem Verfahren von Wilite A.A. in Methods Enzymol. 38C 41-46, 1974, wie von Hanoune et al. (J. Biol. Chem 252 2039-2046, 1977) modifiziert, gemessen.
Die PTx- und FHA-Aktivitäten werden gemäß dem Verfahren von TUOMANON S. und WEISS A. in J. Inf. Dis., 152, 118-125, 1985, gemessen.

BEISPIEL 1: KULTUR VON B. BRONCHISEPTICA UND GEWINNUNG EINES ÜBERSTANDS MIT ERHÖHTER KONZENTRATION AN ADENYLATCYCLASE

Es wird eine Vorkultur von B. bronchiseptica 9.73, Phase I, und einer von selbst stabilen, avirulenten Variante, Phase IV, dieses Stamms über 48 h bei 36ºC in einem modifizierten Stainer-Scholte-Agarmedium, supplementiert mit Cyclodextrin (gemäß IMAIZUIMI et al., in J. Chim. Microbiol., 17, 781-786, 1983), vorgenommen. Man transferiert dann die Vorkultur in ein modifiziertes Stainer-Scholte-Flüssigmedium ohne Cyclodextrin. Der Stamm von B. bronchiseptica 9.73 wurde aus Nüstern eines Hasen gewonnen.
Die Flüssigkulturen wurden 15 h einer Bewegung von 150 t/min bei 36ºC in einem 1 l-Erlenmeyer, der 250 ml Medium enthielt, unterworfen. Man betreibt die Kultur, bis eine optische Dichte DO&sub6;&sub5;&sub0; = 1,2 ± 0,2 erhalten wird. Die Bakterien werden dann durch Zentrifugation bei 5000 g während 25 min entfernt.
Die Kulturüberstände werden bei -30ºC bis zur Verwendung aufbewahrt oder direkt aufkonzentriert.
Zum Zwecke einer Aufkonzentrierung filtriert man 3 l Kulturüberstand, der ungefähr 10 µg Proteine und 0,1 Einheiten Enzym pro ml enthält, durch Filter vom Typ Millipore(R) HAWP von 0,45 µm. Man hält auf diese Weise mehr als 90% der enzymatischen Aktivität auf den Filtern zurück. Ungefähr 80% dieser Aktivität können durch Inkubation der Filter in 40 ml Puffer A, gebildet aus 50 mM Tris.HCl, pH 8 mit 6 mM MgCl&sub2; und 0,1% Triton-X- 100(R), wiedergewonnen werden. Das unlösliche Material wird durch 30 minütige Zentrifugation bei 15000 g und 4ºC entfernt. Die spezifische Aktivität des aufkonzentrierten Kulturüberstands beträgt 115 Einheiten pro mg Protein.
Eine Bakteriensuspension des Stamms 9.73 wurde auf intranasalem Wege einer Maus injiziert: 48 h danach wurden die Lungen entnommen und aufgebrochen und ein hämolytischer Klon isoliert, nämlich der Klon 9.73S. Dieser Klon wurde am 12. Mai 1989 bei der CNCM unter der Nr. I-858 hinterlegt. Dieser Klon ist hämolytisch und synthetisiert große Mengen Adenylcyclase. Eine Bakteriensuspension dieses Klons ruft ein hämorrhagisches Ödem im Bereich der Lungen bei Mäusen hervor.

BEISPIEL 2: VERFAHREN ZUR GEWINNUNG GEREINIGTER EXTRACYTOPLASMATISCHER ADENYLCYCLASE IN FREIER FORM

Man fügt 40 ml aufkonzentrierten Kulturüberstand 0,8 bis 1 ml Affigel-Calmoduline(R) zu und bewegt die Mischung langsam 18 h bei 4ºC. Mehr als 2/3 der enzymatischen Aktivität werden auf dem Gel zurückgehalten.
Man läßt das Affigel-Calmoduline durch einminütige Zentrifugation bei 300 g sedimentieren, wäscht mehrfach wiederholt mit 0,5 M NaCl in Puffer A. Man gewinnt die Adenylcyclase von dem Gel mittels 2,5 ml 8,8 M Harnstoff in Puffer A. Man entfernt den Harnstoff durch Filtration durch eine Sephadex G-25(R)-Säule, die mit Puffer A äquilibriert wurde.
Diese Enzympräparation besitzt eine spezifische Aktivität von 1100 Einheiten/mg Protein.
Man kann sie bei -80ºC ohne Verlust an Aktivität über mehrere Wochen aufbewahren.

BEISPIEL 3: VERFAHREN ZUR GEWINNUNG GEREINIGTER ADENYLCYCLASE AUS BAKTERIELLEN EXTRAKTEN

Man unterwirft eine Kultur von durch Calmodulin aktivierbare AC exprimierenden Bakterien einer Behandlung mit 8 M Harnstoff während 2 h bei Raumtemperatur. Man gewinnt den Überstand, der einen bakteriellen Extrakt darstellt, und man bringt ihn mit dem Gel Affigel- Calmoduline unter den vorstehend angegebenen Bedingungen in Kontakt.
Man erhält eine Enzympräparation von erhöhter Reinheit, die wahrnehmbar die gleiche spezifische Aktivität aufweist.

BEISPIEL 4: UNTERSUCHUNG DER SEKRETION VON AC, VON PTx UND VON FHA UND DER LD 50 VON STÄMMEN VON BORDETELLA

In der nachstehenden Tabelle 1 werden die Ergebnisse, die bei der quantitativen Bestimmung der Virulenzfaktoren AC, PTx und FHA und der Messung der LD50 (die Dosis, die 50% der Mäuse einer Gruppe tötete) von unterschiedlichen Stämmen von Bordetella erhalten wurden, aufgeführt.
Es handelt sich um Stämme von B. pertussis (BP), B. parapertussis (BPP) und B. bronchiseptica (BB) entsprechend entweder hyperpathogenen Stämmen, die große Mengen an Adenylcyclase sezernieren (diese Stämme tragen das Bezugszeichen S in der Tabelle) oder Elternstämmen der hyperpathogenen Stämme. TABELLE 1
Diese Ergebnisse weisen die erhöhte Produktion von Adenylcyclase durch hyperpathogene Stamme, insbesondere durch B. bronchiseptica 973S und B. pertussis 18323S, nach.
Die Sekretion von PTx ist bei den hyperpathogenen Abkömmlingen gleichfalls erhöht, wie das die sich auf B. pertussis beziehenden Ergebnisse zeigen, wohingegen die Sekretion von FHA bei den beiden Stämmen dieselbe bleibt.
B. bronchiseptica und B. parapertussis die dieselben Faktoren wie B. pertussis mit Ausnahme von PTx synthetisieren, induzieren bei Mäusen eine ödematöse hämorrhagische Alveolitis, die jener von B. pertussis induzierten ähnlich ist. Im Gegenzug ist ein von dem virulenten Stamm B. pertussis 8132 abgeleiteter Stamm, der Stamm B.P.348, der ein Tn5- Transposon in dem Strukturgen der AC beherbergt, das dieses inaktiviert, nicht in der Lage, eine AOHA bei Mäusen zu induzieren. Diese Mutante sezerniert indessen sämtliche anderen Virulenzfaktoren, insbesondere PTx.
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse bezeichnet die AC als Faktor, der für die ödematöse hämorrhagische Alveolitis bei Mäusen verantwortlich ist.

BEISPIEL 5:

1. VERSUCHE ZUM AKTIVEN SCHUTZ AUFGRUND VON BAKTERIENIMPFSTOFFEN

Versuche zum Schutz (gegen B. pertussis) wurden mittels unterschiedlicher Bakterienimpfstoffe (im allgemeinen 3 subkutane Injektionen von 250 µl Bakteriensuspension, die 10&sup9; Bakterien/ml, die auf 56ºC erhitzt wurden, enthält, in einwöchigem Abstand) vorgenommen.
Es werden in der nachstehenden Tabelle 2 die Ergebnisse aufgeführt, die unter Verwendung von Stämmen von B. bronchiseptica 9.73S sowie von Stämmen von B. pertussis 18323S, B. parapertussis 63.25 und B. avium (Blike Hewouet) für die Herstellung der Bakterienimpfstoffe erhalten wurden.
Der B. pertussis-Stamm wird zwei Wochen nach der letzten Immunisierung verabreicht: man injiziert intranasal 50 µl 10&sup8; lebende Bakterien des Stamms B. pertussis 18323S. INJIZIERTER STAMM LERALITÄTSPRÜFUNG (B. pertussis) B. bronchiseptica B. pertussis B.parapertussis B. avium
Man stellt fest, daß die mittels Präparationen von B. bronchiseptica geimpften Mäuse vollständig gegen eine Letalitätsprüfung mit B. pertussis geschützt sind (Kreuzschutz) wie die mit B. pertussis geimpften.
Im Gegenzug sind die mit Präprationen von B. avium geimpften Mäuse nicht geschützt, was zugunsten der Rolle der AC bei der Induktion der ödematösen hämorrhagischen Alveolitis spricht.

2. VERSUCHE ZUM AKTIVEN SCHUTZ AUFGRUND GEREINIGTER ANTIGENE

Man verwendet gereinigte Antigene.
Die AC-Präparationen werden gereinigt entweder ausgehend von dem Kulturüberstand (70% des Enzyms werden von dem Bakterium sezerniert) oder ausgehend von den Bakterien, indem vorteilhafterweise gemäß dem Verfahren der Patentanmeldung FR 2606789 vom 17.11.1986 vorgegangen wird.
Mäuse werden mit unterschiedlichen Dosen Antigen (3 subkutane Injektionen in einwöchigem Abstand von 250 µl Antigen in einem 10 mM Tris-Puffer, pH 7, der 1 mg/ml Am+++ enthält) immunisiert, bevor die Letalitätsprüfung mit B. pertussis vorgenommen wird.
Für die Letalitätsprüfung injiziert man auf intranasalem Wege 50 µl einer Bakteriensuspension des virulenten und hyperpathogenen Stamms 18323S zwei Wochen nach der letzten Immunisierung. Die Konzentration an Bakterien der Suspension beträgt 10&sup8; in dem Versuch a, 2 × 10&sup8; in dem Versuch b und 10&sup7; im Versuch c.
In der untenstehenden Tabelle 3 werden die Schutzergebnisse aufgeführt, die gegen einen B. pertussis-Stamm (BP 18323S) in unterschiedlichen Konzentrationen nach einer Injektion von AC, rekombinanter AC eines Impfstoffs, PTx und FHA erhalten wurden.
Die rekombinante AC ist vorteilhafterweise jene, wie sie in der Patentanmeldung FR 2621597 vom 24.07.1987 beschrieben worden ist. Es handelt sich um ein Fragment, das dem Strukturgen der AC entspricht, das in E. coli exprimiert werden konnte. Dieses Fragment, das die Adenylcyclaseaktivität und die Anheftungsstelle für Galmodulin trägt, wurde bis zur Homogenität gereinigt (siehe einzige Figur). a: Letalitätsprüfung B.P.18323S 10/LD50 b: Letalitätsprüfung B.P.18323S 20/LD50 c: Letalitätsprüfung B.P.18323S 1/LD50
Die Ergebnisse hinsichtlich der Letalität sind als Anzahl gestorbener Mäuse zur Gesamtanzahl an Mäusen ausgedrückt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß eine Synthese von antiAC-Antikörpern und ein Schutz der Mäuse nach einer Immunisierung mit AC (drei Immunisierungen von 1,5 µl AC) erhalten wird. Dieser Schutz ist gleichsam vollständig, wenn die Letalitätsprüfung mit einer Menge an Bakterien gleich der letalen Dosis 50 (10&sup7; lebende Bakterien) oder mit einer zehnfach größeren Menge als der letalen Dosis 50 (10&sup8; lebende Bakterien) ausgeführt wird; er beträgt 60%, wenn die Letalitätsprüfung mit einer Menge Bakterien gleich der zwanzigfachen letalen Dosis 50 (2 × 10&sup8; tödliche Bakterien) ausgeführt wird.
Ein vollständiger Schutz wird nach einer Immunisierung von Mäusen mit rekombinanter AC erhalten, wenn die Letalitätsprüfung mit einer Menge Bakterien gleich der letalen Dosis 50 ausgeführt wird. Die mit FHA vorgenommenen Immunisierungen haben keine Schutzwirkung dieses Toxins trotz des Vorliegens von Antikörpern in den immunisierten Mäusen gezeigt und dies selbst, wenn die Letalitätsprüfung mit einer geringen Menge Bakterien ausgeführt wird.
Die mit PTx vorgenommenen Versuche zeigen einen partiellen Schutz nach zwei Immunisierungen mit 2 µg PTx, wenn die Letalitätsprtifung mit einer zehnfach über der letalen Dosis 50 liegenden Menge vorgenommen wird; es muß aber präzisiert werden, daß in diesem Falle die Synthese von antiPTx-Antikörpern sehr gering ist. Wenn die Mäuse mit 3 × 2 µg PTx immunisiert werden, ist die Synthese von Antikörpern bedeutender und wir erhalten einen vollständigen Schutz, wenn die Letalitätsprüfung mit einer Bakterienmenge gleich der letalen Dosis 50 ausgeführt wird.
Nach der Zusammenstellung dieser Ergebnisse stellt die Adenylcyclase das Cytotoxin, das für die ödematöse hämorrhagische Alveolitis verantwortlich ist, die bei durch B. pertussis infizierten Mäusen beobachtet wird, und ein Schutzantigen gegen diese Schädigungen dar. PTx und FHA spielen keinerlei Rolle bei der Induktion dieser AOHA, könnten aber Schutzantigene gegen diese Schädigungen sein, indem sie die Anheftung der Bakterien an das Atemwegsepithel inhibieren.

Claims

1. Verwendung einer Adenylcyclase aus Bordetella pertussis oder Bordetella bronchise;,tica oder eines wirksamen Fragments dieser Adenylcyclase zur Herstellung eines Arzneimittels, welches dazu bestimmt ist, Mensch oder Tier einen Kreuzschutz zu verleihen gegen Infektionen und toxische Wirkungen, welche durch B. bronchiseptica bzw. B. pertussis verursacht werden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenylcyclase erhalten wird durch Inkontaktbringen eines Überstandes einer Bakterienkultur von B. pertussis oder B. bronchiseptica mit einem Gel Affigel Calmoduline(R).

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenylcyclase aus B. bronchiseptica stammt, wobei das Arzneimittel einen Kreuzschutz gegen Infektionen und toxische Wirkungen, welche von B. pertussis verursacht werden, verleiht.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenylcyclase aus B. bronchiseptica Stamm 9.73 (CNCM I-858) stammt.

5. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenylcyclase aus B. pertussis stammt, wobei das Arzneimittel einen Kreuzschutz gegen Infektionen und toxische Wirkungen, welche von B. bronchiseptica verursacht werden, verleiht.

6. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenylcyclase mindestens den aktiven Bereich der in der Figur dargestellten Aminosäuresequenz, insbesondere das Fragment Gly³&sup6;¹ - Ser&sup6;&sup8;&sup9;, umfaßt.

7. Verwendung nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenylcyclase in demselben Inokulum zusammen mit FHA und/oder PTX vorliegt oder nicht.

8. B. bronchiseptica Stamm 9.73 (CNCM I-858).