DE69124235T3

DE69124235T3 - Reinigung und verwendung von pertactin, eines bordetella pertussis aussenmembranproteins

Info

Publication number: DE69124235T3
Application number: DE69124235T
Authority: DE
Inventors: Gail Richmond Hill JACKSON; Raafat Mississauga FAHIM; Larry Mississauga TAN; Pele Thornhill CHONG; John Aurora VOSE; Michel Willowdale KLEIN
Original assignee: Connaught Laboratories Ltd; Connaught Laboratories Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 1990-04-04
Filing date: 1991-04-03
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2011-04-04
Also published as: WO1991015505A1; EP0527753A1; DE69124235D1; DK0527753T3; DK0527753T4; EP0761230A2; EP0761230A3; DE761230T1; ES2088374T5; JPH05506649A; GR3022769T3; ES2088374T1; GR970300034T1; ATE147754T1; EP0527753B2; ES2104535T1; US5667787A; CA2079887C; US5444159A; JP2549225B2

Description

Die Erfindung betrifft die Aufreinigung eines Außenmembranproteins von Bordetella pertussis mit einem Molekulargewicht von ungefähr 69000 Dalton, das früher als 69 kDa-Protein bezeichnet wurde und jetzt als Pertactin bezeichnet wird. Die Erfindung erstreckt sich auf aufgereinigtes Pertactin und auf Verfahren zur Aufreinigung. Das Pertactin kann aus der Fermentationsbrühe und zellulären Extrakten des Organismus gewonnen werden. Das durch das Verfahren gewonnene Protein soll in einem "Komponenten"-Impfstoffverwendet werden, um gegen die Krankheit Keuchhusten zu schützen.
Die Krankheit Keuchhusten oder Pertussis ist das Ergebnis einer Infektion durch Bordetella pertussis und ist eine ernste und schwächende menschliche Krankheit insbesondere bei jungen Kindern. In den letzten fünfzig Jahren ist die Erkrankung durch Immunisierungsprogramme in großem Maßstab kontrolliert worden. Der gegenwärtig lizenzierte Impfstoff in Nordamerika ist ein "Ganzzell"-Impfstoff, der durch Züchten des Organismus in Fermentern und darauffolgendes Behandeln der resultierenden B. pertussis-Zellen mit chemischen Mitteln, wie Formaldehyd, um die Organismen zu töten und toxische Proteine zu inaktivieren, hergestellt wird. Die Zellen werden resuspendiert und dann direkt oder in Kombination mit anderen Antigenen verwendet. Dieser Impfstoff ist, obwohl hochwirksam, mit klinischen Symptomen assoziiert gewesen, die Fieber, lokale Reaktionen, Schreien in hohen Tönen und Krämpfe umfassen. Trotz der Tatsache, daß kein bewiesener Zusammenhang zwischen diesen Symptomen und dem Impfstoff besteht, bestand eine verringerte öffentliche Akzeptanz dieses Impfstoffs und in einer Anzahl von Ländern, z.B. Japan, Schweden und dem Vereinigten Königreich, hat eine verringerte Immunisierung zu Ausbrüchen der Krankheit geführt. Das Erfordernis für einen definierteren Impfstoff ist erkannt und beträchtlicher Aufwand durch zahlreiche Hersteller und Forscher auf die Entwicklung eines wirksamen Pertussis-Impfstoffs gerichtet worden, der aus einer geringen Anzahl hoch aufgereinigter Proteine besteht. Dieser Impfstoff ist als Komponenten-Impfstoff bezeichnet worden.
Diese Forschung wurde durch einen Mangel an Informationen über den Mechanismus der Pathogenese von B. pertussis gehemmt. Viele mit der Virulent assozierte Faktoren, wie Pertussistoxin (PT), auch bekannt als Lymphozytose fördernder Faktor ("lymphocytosis promoting factor" (LPF)), filamentöses Hämagglutinin (FHA), Adenylatcyclase, Lipopolysaccharid, Agglutinogene und andere Außenmembranproteine sind für ein Einbringen in einen „azellulären" Impfstoff vorgeschlagen worden, der weniger definiert ist als der Komponenten-Impfstoff Ein Großteil der Arbeit an azellulären Impfstoffen hat sich auf einen Impfstoff auf PT-Basis konzentriert. Ergebnisse einer neueren klinischen Studie ließen darauf schließen, daß ein ausschließlich aus PT-Toxoid bestehender Impfstoff Kinder nur teilweise vor der Infektion schützte. Eine PT/FHA-Kombination zeigte eine geringfügig höhere Wirksamkeit, aber diese war dennoch geringer als jene, die mit dem Ganzzell-Impfstoff erhalten wurde.
Ein potentiell protektives Antigen ist ein Außenmembranprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 69000 Dalton (Pertactin), das in sämtlichen virulenten Stämmen von B. pertussis gefunden wird. Dieses Protein wird in relativ großen Mengen während der Kultur des Organismus produziert und kann entweder aus der Fermentationsbrühe oder aus Zellextrakten aufgereinigt werden. Die Erfindung umfaßt ein neues Verfahren zum Ausführen einer solchen Aufreinigung.
Die mögliche Bedeutung dieses Außenmembranproteins für ein Einbringen in einen humanen Impfstoff gegen Keuchhusten wurde anhand von Versuchen, einen Impfstoff zum Schutz von Schweinen gegen eine B. bronchiseptica-Infektion herzustellen, vermutet. Zelloberflächenextrakte von B. bronchiseptica wurden verwendet, um Säue zu immunisieren. Konzentrationen von Antikörper gegen ein Zelloberflächenantigen mit einem Molekulargewicht von 68000 Dalton korrelierten mit einem Schutz neugeborener Ferkel gegen eine Infektion. Ähnliche Antigene mit ähnlichen Molekulargewichten wurden in B. pertussis (ungefähr 69000 Dalton) und in B. parapertussis (ungefähr 70000 Dalton) nachgewiesen. Eine Immunisierung mit dem aus B. pertussis gewonnenen Protein schützte Mäuse gegen intrazerebrale Expositionen gegen lebende Organismen und Antikörper gegen das Protein verliehen Mäusen einen passiven Schutz in diesem Test. Sowohl aktiver als auch passiver Schutz von Mäusen in einem Aerosol-Expositions-Modell sind gleichfalls beschrieben worden.
Die veröffentlichten Verfahren zur Aufreinigung von Pertactin erlauben keine Produktion eines hoch aufgereinigten, nicht pyrogenen und stabilen Antigens in großem Maßstab. Ein berichtetes Verfahren (Kanadisches Patent Nr. 1,253,073) umfaßt eine Säure-Glycin-Extraktion der Zellen, Anionenaustauschchromatographie und präparative isoelektrische Fokussierung. Jedoch ist berichtet worden, daß das erhaltene Pertactin zu kleineren Fragmenten abgebaut wird, gegen niedrigen pH empfindlich ist und eine Adenylatcyclaseaktivität aufweist. Aus diesen Gründen wird dieses Extraktionsverfahren für eine Produktion in großem Maßstab als nicht wünschenswert angesehen. Zusätzlich ist eine isoelektrische Fokussierung für eine Produktion in großem Maßstab nicht zugänglich. Ein zweites Verfahren umfaßte die Extraktion des Außenmembranproteins aus den Zellen eines von Fimbrien befreiten Stamms von B. pertussis. Das Protein wurde durch eine Kombination von DEAE-Sepharose- und Affigel-blue-Chromatographien aufgereinigt. Die Möglichkeit eines Auswaschens des blauen Farbstoffs in
das Produkt wäre ein mögliches Sicherheitsproblem. Keines der beiden Verfahren betrifft die Aufreinigung von Pertactin direkt aus Fermentationsbrühen.
Die Erfindung stellt unter einem ersten Gesichtspunkt ein Verfahren zur Herstellung von Pertactin bereit, das gekennzeichnet ist durch:
Vorsehen einer unreinen wäßrigen Lösung von Pertactin, die von Pertussistoxin (PT) und filamentösem Hämagglutinin (FHA) im wesentlichen frei ist,
Aufreinigen von Pertactin in der wäßrigen Lösung durch Fließenlassen der unreinen wäßrigen Lösung nacheinander in Kontakt mit Hydroxylapatit und einer Matrix, die aus einem Ionenaustauschmedium, wie Q-Sepharose, gebildet ist, und
Gewinnen einer aufgereinigten Lösung von Pertactin.
Vorzugsweise wird die unreine wäßrige Lösung von Pertactin gebildet durch:
Vorsehen eines Mediums aus der Züchtung von Bordetella pertussis, das das Pertactin, PT und FHA enthält, und selektives Entfernen des PT und FHA aus dem Medium,
darauffolgendes Präzipitieren von Pertactin aus dem Medium und
Bilden der wäßrigen Lösung von Pertactin durch Lösen des präzipitierten Pertactin.
Das Pertactin kann durch Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem Medium präzipitiert werden.
Die unreine wäßrige Lösung von Pertactin kann gebildet werden durch:
Präzipitieren von Pertactin, PT und FHA aus einem Züchtungsmedium, in dem der Bordetella pertussis-Organismus gezüchtet worden ist, nach einer Abtrennung des Züchtungsmediums von den gezüchteten Zellen,
Bilden einer wäßrigen Lösung des Präzipitats und
selektives Entfernen des PT und FHA aus der resultierenden Lösung, wobei das Pertactin, PT und FHA aus dem Züchtungsmedium durch Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem Medium präzipitiert werden können.
Die unreine wäßrige Lösung von Pertactin kann gebildet werden durch:
Züchten von Zellen von Bordetella nertussis in einem Züchtungsmedium,
Extrahieren von Pertactin aus gezüchteten Zellen von Bordetella pertussis unter Erzeugung eines Extrakts,
Unterwerfen des Extrakts einer Ultrazentrifugation, um Proteine mit hohem Molekulargewicht daraus unter Bildung eines ultrafiltrierten Filtrats zu entfernen,
Unterwerfen des Extrakts einer weiteren Ultrazentrifugation, um Proteine mit niedrigem Molekulargewicht daraus unter Bildung eines ultrafiltrierten Retentats zu entfernen,
Präzipitieren von Pertactin aus dem ultrafiltrierten Retentat und
Bilden der unreinen wäßrigen Lösung von Pertactin durch Lösen des präzipitierten Pertactin.
Die Ultrafiltration des Filtrats kann unter Verwendung einer 100 bis 1000 kDa-Nominal Molecular Weight Limit (Nominale Molekulargewichtsgrenze (NMWL)-Membran bewirkt ' werden. Das ultrafiltrierte Retentat kann unter Verwendung einer 30 kDa oder weniger NMWL-Membran vor der Präzipitation diafiltriert werden und das Pertactin kann durch Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem ultrafiltrierten Extrakt präzipitiert werden.
Das präzipitierte Pertactin kann in einer Pufferlösung mit geringer Ionenstärke bei einem pH von 6,0 bis 8,5, vorzugsweise mit einer Ionenstärke von weniger als 4 mS/cm gelöst werden.
Die aufgereinigte Lösung kann ferner einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran von 100 bis 300 kDa-NMWL unterworfen werden, um eine ultrafiltrierte aufgereinigte Lösung zu erhalten, die gegebenenfalls weiter unter Verwendung einer Membran von 30 kDa oder weniger NMWL aufkonzentriert wird.
Die ultrafiltrierte Pertactinlösung kann in Kontakt mit einer Ionenaustauschmatrix gebracht werden, um Pertactin daran zu binden, und aufgereinigtes Pertactin kann dann selektiv von dem Ionenaustauschmedium eluiert werden.
Die Passage der unreinen wäßrigen Lösung von Pertactin in Kontakt mit dem Hydroxylapatit und der aus einem Ionenaustauschmedium zusammengesetzten Matrix kann nicht gebundenes Pertactin in dem Durchfluß und an das Medium gebundene Verunreinigungen liefern und der Durchfluß aus jedem Kontakt kann gesammelt werden, um eine aufgereinigte Lösung von Pertactin zu erhalten.
Alternativ kann unter unterschiedlichen Bedingungen die Passage der unreinen wäßrigen Lösung von Pertactin in Kontakt mit dem Hydroxylapatit und der aus einem Ionenaustauschmedium zusammengesetzten Matrix bei einer Leitfähigkeit für ein Binden des Pertactins an das Hydroxylapatit und/oder die Matrix durchgeführt werden und danach kann das gebundene Pertactin selektiv von dem Hydroxylapatit und/oder der Matrix eluiert werden, um eine aufgereinigte Lösung von Pertactin bereitzustellen.
Unter einem zweiten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein biologisch reines und stabiles Pertactin mit keiner nachweisbaren Adenylatcyclaseaktivität bereit, das vorzugsweise auch frei von jeder aus der Chromatographie stammenden Farbstoffkontamination ist.
Unter einem dritten Gesichtspunkt stellt die Erfindung einen Impfstoff gegen eine Infektion durch Bordetella pertussis bereit, der durch ein immunprotektives, biologisch reines und stabiles Pertactin, das keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist, als aktive
Komponente davon und einen physiologisch annehmbaren Träger dafür, vorzugsweise mit mindestens einem anderen immunprotektiven Pertussis-Antigen in dem Impfstoff, z.B. PT, FHA und/oder Agglutinogenen, gekennzeichnet ist.
In einem solchen Komponenten-Impfstoff können das Pertactin und das mindestens eine aufgereinigte andere immunprotektive Antigen aus einer einzigen Fermentation von Bordetella nertussis aufgereinigt worden sein.
Die Erfindung umfaßt ferner biologisch reines und stabiles Pertactin, das keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist, für eine Verwendung in einem Impfverfahren gegen Bordetella pertussis und auch eine Verwendung von biologisch reinem und stabilem Pertactin, das keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist, zur Herstellung eines Komponenten-Impfstoffs gegen Bordetella pertussis.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend beschrieben, in denen Pertactin in großen Mengen aus einer Fermenterbrühe erhalten wird, die die bevorzugte Quelle ist, und in einer aufgereinigten Form. Das Protein kann in ein Produkt eingebracht werden, das für die weitverbreitete Impfung von Kindern gegen Keuchhusten verwendet werden soll.
Nach Züchten des Organismus in einem Fermenter werden die Zellen durch Zentrifugation und Filtration entfernt und der Überstand an Volumen verringert und sterilisiert. Die Brühe wird auf eine geringe Ionenstärke verdünnt und nach einer Entfernung anderer Antigene wird das Pertactin durch Chromatographie an verschiedenen Substraten isoliert und durch Ultrafiltration weiter aufgereinigt.
Das resultierende Produkt ist sehr stabil, wenn es durch dieses Verfahren aufgereinigt worden ist, und weist keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität auf.
Das Verfahren ermöglicht die Aufreinigung mehrerer Proteinantigene für ein mögliches Einbringen in einen Pertussis-Komponenten-Impfstoff aus einer einzigen Fermentation von B. ertussis.
B. pertussis wird in einem Fermenter unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet. Kohlenstoffquellen und Wachstumsfaktoren werden entweder kontinuierlich oder chargenweise zu verschiedenen Zeitpunkten während der Fermentation zugegeben, bis die Pertussis-Proteine (PT, FHA und Pertactin) in den gewünschten Mengen vorliegen, die durch einen spezifischen Enzymimmuntest (ELISA) für jedes Antigen bestimmt werden. Die Fermenterbrühe wird geerntet, die Hauptmenge der Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Brühe durch Mikrofiltration, vorzugsweise unter Verwendung bekannter Membranfilter von ungefähr 0,2 um Porengröße, sterilisiert. Die Brühe wird z.B. 10-fach durch Membran-Ultrafiltration
aufkonzentriert und für die Aufreinigung von Pertussistoxin und FHA verwendet (siehe veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 0,336,736; U.S.-Patent Nr. 4,997,915, deren Offenbarung in diese Beschreibung unter Bezugnahme aufgenommen wird). Die Zellen sind die Materialquelle für die Aufreinigung der Agglutinogene. Pertactin kann sowohl aus der Brühe als auch den Zellen aufgereinigt werden. Die erstgenannte ist bevorzugt, da die Hauptmenge des Proteins in der Brühe gefunden wird.
Die erste Stufe der Aufreinigung des Pertactins erfordert eine Verdünnung der Brühe auf eine geringe Ionenstärke und eine Chromatographie an Perlit oder an einem anderen geeigneten, festen, partikulären Adsorptionsmaterial, um die PT- und FHA-Antigene zu entfernen, wie ausführlicher in der vorstehend angesprochenen veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 0,336,736 und dem vorstehend angesprochenen U.S.-Patent Nr. 4,997,915 beschrieben ist. Die PT- und FHA-Antigene können von dem Adsorptionsmaterial durch Behandlung mit einem wäßrigen Medium hoher Ionenstärke für eine Verwendung in einem Pertussis-Komponenten-Impfstoff entfernt werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „geringe Ionenstärke" auf ein wäßriges Medium, das eine Leitfähigkeit von ungefähr 11 mS/cm oder weniger, vorzugsweise ungefähr 4 mS/cm oder weniger aufweist. Die Maßeinheit mS/cm bedeutet Millisiemens pro Zentimeter. Ein Siemens (S) ist eine Einheit der Leitfähigkeit und ist dem Kehrwert des Widerstands (Ohm) äquivalent und wird machmal als mho bezeichnet. Die Bezeichnung „hohe Ionenstärke", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf ein wäßriges Medium, das eine Leitfähigkeit von mehr als ungefähr 11 mS/cm und vorzugsweise mindestens ungefähr 50 mS/cm aufweist.
Die verbleibende Mischung wird dann durch Membranfiltration aufkonzentriert, einer Ammoniumsulfatpräzipitation unterworfen und das resultierende Pellet in einem Puffer mit geringer Ionenstärke, wie Tris·HCl, bei einem pH von 6,0 bis 8,5 gelöst, wodurch eine Lösung mit einer endgültigen Leitfähigkeit von im allgemeinen weniger als ungefähr 4 mS/cm, typischerweise ungefähr 3,4 mS/cm erhalten wird. Die Lösung wird nacheinander an Hydroxylapatit und einem Ionenaustauschmedium, wie Q-Sepharose , chromatographiert. Pertactin eluiert in der nicht gebundenen Fraktion beider Säulen bei der angegebenen Leitfähigkeit des Puffers. Jedoch bindet Pertactin, wenn die Leitfähigkeit geringer als 1,5 mS/cm bei Hydroxylapatit oder 2,8 mS/cm bei Q-Sepharose^® ist, an beide Säulen und kann mit einem Puffer mit Leitfähigkeiten von 1,5 mS/cm oder höher bei Hydroxylapatit und 2,8 mS/cm oder höher bei Q-Sepharose^® eluiert werden.
Das Pertactin wird weiter durch Ultrafiltration durch ungefähr 100 bis 300 kDa-Nominal Molecular Weight Limit (NMWL)-Membranen aufgereinigt, wo es in dem Filtrat ge sammelt wird, unter Verwendung von Membranen mit einem von ungefähr 30 kDa oder weniger aufkonzentriert und für eine Verwendung in Kombination mit anderen Pertussis-Antigenen in einem Impfstoff sterilfiltriert.
In einem alternativen Verfahren wird Pertactin gemeinsam mit FHA und PT aus der Fermenterbrühe durch Zugabe von Ammoniumsulfat präzipitiert. Das Präzipitat wird aus der restlichen Brühe entfernt und erneut gelöst, um eine wäßrige Lösung bereitzustellen, die für eine Verarbeitung geeignet ist, wie vorstehend beschrieben, um zunächst PT und FHA zu entfernen und dann das Pertactin aufzureinigen.
Pertactin kann auch aus B. pertussis-Zellen aufgereinigt werden. Die Zellen werden in einer Lösung, die eine hohe Konzentration (beispielsweise 4 M) Harnstoff enthält, beispielsweise 1,5 h bei Raumtemperatur extrahiert. Zellrückstände werden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das Protein enthält, einer Ultrafiltration unter Verwendung von 100 bis 1000 kDa=NMWL-Membranen unterworfen. Proteine mit hohem Molekulargewicht, wie die Agglutinogene, werden zurückgehalten, während die Hauptmenge an Pertactin hindurchfiltriert wird. Das Filtrat wird aufkonzentriert, unter Verwendung einer 30 kDa oder weniger NMWL-Membran diafiltriert und dann durch Ammoniumsulfat präzipitiert und zentrifugiert, um ein Pellet für eine Verarbeitung, wie vorstehend beschrieben, zu ergeben.
Pertactin ist sehr stabil, wenn es durch das Verfahren der Erfindung aufgereinigt wird, obwohl berichtet worden war, daß es anfällig für eine proteolytische Spaltung ist. SDS-PAGE-Analyse läßt darauf schließen, daß das aufgereinigte Pertactin homogen und im wesentlichen intakt mit Spuren von Abbauprodukten mit Molekulargewichten zwischen 30 und 40 kDa ist. Keine Anzeichen für einen weiteren Abbau oder eine Veränderung der Immunogenität wurden nach mehreren Monaten Lagerung bei 2 bis 8°C oder bei höheren Temperaturen (24°C, 37°C) gefunden. Im Gegensatz zu einer früheren Veröffentlichung (Kanadisches Patent Nr. 1,253,073) macht die Entdeckung, daß das durch dieses Verfahren hergestellte Pertactin keinerlei nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität zeigt und eine erhöhte Stabilität aufweist, es zu einem idealen Kandidaten für ein Einbringen in einen Komponenten-Impfstoff für einen Schutz gegen B. pertussis.
BEISPIELE
Verwendete Verfahren der Proteinbiochemie und Immunchemie, die jedoch nicht explizit in dieser Offenbarung und in diesen Beispielen beschrieben werden, sind in der wissenschaftlichen Literatur ausführlich berichtet worden und liegen unzweifelhaft innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute auf jenem Gebiet.
Beispiel 1
Dieses Beispiel verdeutlicht die Züchtung von B. pertussis in Fermentern.
Ein Fermenter, der 250 l Brühe (modifiziertes Stainer-Scholte-Medium) enthielt, wurde mit B. pertussis angeimpft. Während der Fermentationsdauer wurden Mononatriumglutamat und die Wachstumsfaktoren Glutathion, Eisen(II)-sulfat, Calciumchlorid, Ascorbinsäure, Niacin und Cystein während des Fermentationsverfahrens zugegeben, um die Antigenausbeuten zu erhöhen. Am Ende einer 48-stündigen Fermentationsdauer wurde die Brühe zentrifugiert, um die Hauptmenge der Zellen zu entfernen, und der Überstand, der PT, FHA und die Hauptmenge des Pertactin enthält, weiter durch Ultrafiltration durch Celluloseacetatmembranen (0,22 um Porengröße) geklärt. Das sterilisierte Filtrat wurde ungefähr 10-fach unter Verwendung einer 20 kDa-NMWL-Membran aufkonzentriert und hinsichtlich Proteingehalt und hinsichtlich Antigen durch antigenspezifische ELISAs untersucht.
Beispiel 2
Dieses Beispiel verdeutlicht die Entfernung von PT und FHA in großem Maßstab unter Verwendung einer Perlit-Chromatographiesäule.
Das Brühenkonzentrat, hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde mit Wasser bis auf eine Leitfähigkeit von s 4 mS/cm verdünnt und einer Chromatographie an einer Perlit-Säule (12 cm [Höhe] × 37 cm [Durchmesser]), die vorab mit Wasser äquilibriert worden war, bei einem Protein-zu-Perlit-Verhältnis von ungefähr 3 mg pro ml und einer linearen Flußrate von ungefähr 100 cm/h unterworfen. An das Perlit gebundene Proteine waren fast ausschließlich PT und FHA, während Pertactin im Durchfluß gefunden wurde.
Beispiel 3
Dieses Beispiel verdeutlicht die Präzipitation von Pertactin unter Vornahme einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung.
Die Durchflußfraktion aus Beispiel 2 wurde auf ein Volumen von ungefähr 101 durch Ultrafiltration unter Verwendung von 10 kDa-NMWL-Membranen aufkonzentriert. Die resultierende Lösung hatte üblicherweise eine Proteinkonzentration von 1 bis 2 mg/ml. Während eines Rührens bei Raumtemperatur wurde Ammoniumsulfat (3,5 kg/10 l Konzentrat oder 35% Gew./Vol.) langsam zugegeben und man ließ die Mischung sich lösen, bevor sie in einen Kühl-schrank bei 2 bis 8°C überführt und zusätzliche zwei Stunden, vorzugsweise über Nacht, gerührt wurde. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 21 10 mM Tris·HCl, pH 6,0 bis 8,5, gelöst. Eine zweite Ammoniumsulfat-Fraktionierung (25% Gew./Vol.) wurde durch langsames Zugeben von Ammoniumsulfat (500 g) zu den 21 Lösung und Rühren für mindestens 2 h, üblicherweise über Nacht, nachdem die Lösung auf 2 bis 8°C abgekühlt worden war, vorgenommen. Zuletzt wurde das Präzipitat durch Zentrifugation gesammelt, in 21 Tris·HCl, pH 7,5, gelöst und die Leitfähigkeit auf ungefähr 3,4 mS/cm durch Zugeben von entweder Ammoniumsulfat (wenn unter 3,4 mS/cm) oder 10 mM Tris·HCl, pH 7,5 (wenn höher als 3,4 mS/cm) eingestellt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel verdeutlicht die Präzipitation von Pertactin aus Pertussis-Fermentationsbrühenkonzentraten.
Ammoniumsulfat (250 g/l Brühe) wurde zu Fermenterbrühenkonzentraten gegeben und die Mischung mehr als 2 h, nachdem die Mischung 2 bis 8°C erreicht hatte, gerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 10 mM Tris·HCl, pH 7,5, gelöst und der gleiche Puffer zugegeben, bis die Leitfähigkeit ≤ 4,0 mS/cm betrug. Diese Lösung enthielt sämtliches PT, FHA und Pertactin. Die Lösung wurde einer Perlit-Chromatographie (wie in Beispiel 2 beschrieben) unterworfen, um PT und FHA zu entfernen, und der Perlit-Durchfluß wurde einer Hydroxylapatit- und Q-Sepharose^®-Chromatographie unterworfen (siehe Beispiel 5).
Beispiel 5
Dieses Beispiel verdeutlicht die Chromatographie von Pertactin an Hydroxylapatit und Q-Sepharose^®.
Hydroxylapatit wurde in eine Säule geeigneter Größe, vorzugsweise von 5 cm [Durchmesser] × 10 cm [Höhe] gepackt und mit 10 mM Tris·HCl-Puffer, pH 7,5, der 15 mM Ammoniumsulfat enthielt, (Leitfähigkeit ungefähr 3,4 mS/cm) äquilibriert. Q-Sepharose^® wurde in eine ähnliche Säule gepackt und mit dem gleichen Puffer äquilibriert. Die zwei Säulen wurden hintereinander geschaltet, wobei sich die Hydroxylapatitsäule stromaufwärts von der Q-Sepharose^®-Säule befand. Das resolubilisierte Pertactin (aus Beispiel 3), band, wenn es einer Chromatographie an den zwei hintereinander angeordneten Säulen unterworfen wurde, nicht an die Matrices und die Durchflußfraktion wurde gesammelt. Nach einer Filtration durch eine 300 kDa-NMWL-Membran wurde das das Pertactin enthaltende Filtrat aufkonzentriert und unter Verwendung von ≤ 30 kDa NMWL-Membranen diafiltriert und zuletzt unter Verwendung einer 0,22 μm-Membran sterilfiltriert.
Beispiel 6
Dieses Beispiel verdeutlicht die Aufreinigung von Pertactin durch Binden an Q-Sepharose^®.
Die Perlit-Durchflußfraktion aus Beispiel 2 wurde auf ungefähr 71 mit einer Proteinkonzentration von üblicherweise 1,5 bis 3,0 mg/ml aufkonzentriert. Festes Ammoniumsulfat wurde dem Konzentrat in einem Verhältnis von ungefähr 35 % (Gew.Nol.) zugegeben. Die Mischung wurde 2 oder mehr Stunden bei 2 bis 8°C gerührt. Das gesammelte Präzipitat wurde in ungefähr 500 ml 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, gelöst und dann mit Ammoniumsulfat (100 g/l) präzipitiert. Nach mindestens 2 h Rühren bei 2 bis 8°C wurde der Überstand durch Zentrifugation isoliert. Ein zusätzliches Aliquot von Ammoniumsulfat (100 g/1) wurde dem Überstand zugesetzt, um das Pertactin zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde gelöst und mit 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, auf eine Leitfähigkeit von ungefähr 3,4 mS/cm eingestellt. Das Pertactin wird entsprechend Beispiel s durch Hindurchleiten durch hintereinander angeordnete Hydroxylapatit/Q-Sepharose^®-Säulen (jeweils 11 cm [Durchmesser] × 8 cm [Höhe]), gereinigt, durch eine 300 kDa-Membran ultrafiltriert und mit einer 10 bis 30 kDa-Membran aufkonzentriert. Das Lösemittel des Pertactin wurde dann entweder durch Dialyse, Diafiltration oder unter Verwendung einer Lösemittelaustauschsäule gegen eine Lösung in 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, (Leitfähigkeit ungefähr 0,6 mS/cm) ausgetauscht, dann an eine in 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, äquilibrierte Q-Sepharose^®-Säule (11 cm [Durchmesser] × 8 cm [Höhe]) gebunden. Die Säule wurde mit 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, das 5 mM Ammoniumsulfat enthielt, (Leitfähigkeit ungefähr 1,7 mS/cm) gewaschen und das Pertactin mit 10 bis 100 nM (vorzugsweise 50 mM) Phosphatpuffer bei pH 8,0 eluiert. Das Lösemittel des aufgereinigten Pertactins wird gegen PBS ausgetauscht und die Lösung sterilfiltriert.
Alternativ wird die auf eine Ionenstärke von ungefähr 3,4 mS/cm eingestellte Pertactinlösung nach den Ammoniumsulfatpräzipitationsschritten durch die Hydroxylapatitsäule allein hindurchgeleitet. Die Durchflußfraktion wird aufkonzentriert und das Lösemittel gegen 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, ausgetauscht und die Lösung direkt an die Q-Sepharose -Säule gebunden. Nach Waschen mit 10 mM Tris·HCl, pH 8,0, das 5 mM Ammoniumsulfat enthält, wird das Pertactin von der Q-Sepharose^®-Säule mit 10-100 mM (vorzugsweise 50 mM) Phosphatpuffer bei pH 8,0 eluiert. Das aufgereinigte Pertactin wird durch eine 300 kDa-Membran ultrafiltriert, aufkonzentriert und mit einer 10 bis 30 kDa-Membran diafiltriert und sterilfiltriert.
Beispiel 7
Dieses Beispiel verdeutlicht die Extraktion von Pertactin aus B. pertussis-Zellen.
B. pertussis-Zellen (5% Gew.Nol.) wurden in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 0,15 M Natriumchlorid {PBS}), die 4 M Harnstoff enthielt, suspendiert und die Suspension 15 s bis 60 min dispergiert und 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Zellrückstände wurden durch Zentrifugation bei 5 bis 6000 × g entfernt. Der Zellextrakt wurde durch 100 kDa- oder 300 kDa-Membranen filtriert und das Retentat mit 2 bis 3 Volumina PBS diafiltriert. Das Filtrat aus den Membranen und das Diafiltrat wurden vereinigt und auf 1/5 des ursprünglichen Volumens unter Verwendung von s 30 kDa-NMWL-Membranen aufkonzentriert und weiter mit 5 Volumina PBS diafiltriert.
Beispiel 8
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Pertactin aus Extrakten von B. pertussis-Zellen.
Das Retentat aus Beispiel 7 wurde durch die langsame Zugabe von Ammoniumsulfat (25% Gew./Vol.) bei Raumtemperatur präzipitiert und die Mischung bei 2 bis 8°C zusätzliche 2 h, vorzugsweise über Nacht, weitergerührt. Das Präzipitat wurde in 10 mM Tris·HCl-Puffer, pH 7,5, gelöst und gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugegeben, um eine Leitfähigkeit entsprechend jener von 10 mM Tris·HCl, pH 7,5, das 15 mM Ammoniumsulfat enthält, (3,5 mS/cm), zu erzielen. Das Pertactin lag dann in einer Form für eine Aufreinigung durch Hydroxylapatit/Q-Sepharose^®-Chromatographie, wie in Beispiel 5 beschrieben, vor.
Beispiel 9
Dieses Beispiel verdeutlicht die Immunogenität von Pertactin in Kombination mit anderen Antigenen.
Eine Lösung von aufgereinigtem Pertactin wurde mit Aluminiumphosphat (3 mg/ml) gemischt und variierende Mengen von Pertactin (1 bis 20 μg) wurden mit konstanten Mengen von PT-Toxoid, FHA-Toxoid und Agglutinogenen kombiniert. Meerschweinchen (10 pro Gruppe und mit einem Gewicht im Bereich von 400 bis 450 g) erhielten an den Tagen 0 und 21 eine Injektion und ihnen wurde an Tag 28 Blut abgenommen. Eine gute Antikörperantwort auf Pertactin wurde bei so geringen Dosen wie 1 μg beobachtet. Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Antikörperantworten zwischen Dosen von 1 bis 10 μg beobachtet und es wurde zwischen verschiedenen Chargen von Pertactin Konsistenz erhalten (siehe Tabelle I unten).
Beispiel 10
Dieses Beispiel verdeutlicht die Stabilität von aufgereinigtem Pertactin.
Die Stabilität des Pertactin-Antigens wurde mit und ohne Kombination mit Aluminiumphosphat und nach einer Kombination mit anderen Pertussis-Antigenen in einer in Frage kommenden Impfstofformulierung überwacht. Proben von Pertactin (ohne Aluminiumphosphat) wurden für verschiedene Zeitdauern bei -20°C, 2 bis 8°C, 24°C und 37°C gelagert. Zwei Chargen wurden mit verschiedenen Konservierungsmitteln (Thimerosal und Phenoxyethanol) untersucht. Es war bemerkenswert, daß unabhängig davon, welches Konservierungsmittel verwendet wurde, keine Verringerung des Pertactin-spezifischen ELISA-Werts bis zu 3 Monaten auftrat. Eine Verringerung wurde mit Phenoxyethanol als Konservierungsmittel bei den 6 und 12 Monatswerten beobachtet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 unten wiedergegeben.
Mögliche Impfstoffkombinationen in Aluminiumphosphat wurden bei 2 bis 8°C, 24°C und 37°C gelagert. Die Stabilität des Antigens wurde durch allgemeines Erscheinungsbild, Pertactin-spezifischen ELISA, Proteingehalt, SDS-PAGE, Western-Blot-Analyse mit monospezifischen anti-Pertactin-Antiseren und Immunogenitätsuntersuchungen in Meerschweinchen untersucht. Das Pertactin zeigte keine Veränderungen der Stabilität bei jeder Lagerungsdauer, ob allein oder in Kombination mit entweder Adjuvans oder anderen Antigenen, wie in Tabelle III unten gezeigt. Die für das Experiment verwendeten Materialien waren Pertactin lein mit Aluminiumphosphat-Adjuvans und Impfstoffkombinationen mit Aluminiumphosphat.
In Zusammenfassung dieser Offenbarung stellt die Erfindung, wie vorstehend ausgeführt, neue Verfahren zur Gewinnung von Pertactin in stabiler Form, das für ein Einbringen als Komponente in einen Komponenten-Impfstoff geeignet ist, aus Fermentationsprodukten von Bordetella-Arten unter Verwendung von Säulenchromatographie und Ultrafiltration bereit. Modifizierungen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung möglich.
TABELLE I DOSIS-WIRKUNG UND KONSISTENZ EINER PRODUKTION VON PERTACTIN
TABELLE II STABILITÄT VON NICHT ADSORBIERTEM PERTACTIN
TABELLE III STABILITÄT VON PERTACTIN IN IMPFSTOFFKOMBINATIONEN

Claims

Verfahren zur Herstellung von Pertactin, gekennzeichnet durch: Bereitstellen einer unreinen wässrigen Lösung von Pertactin, die im wesentlichen frei von Pertussistoxin (PT) und filamentösem Hämagglutinin (FHA) ist, Reinigen von Pertactin in der wässrigen Lösung durch Fließenlassen der unreinen wässrigen Lösung nacheinander in Kontakt mit Hydroxylapatit und einer ein Ionenaustauschermedium umfassenden Matrix, um ungebundenes Pertactin im Durchfluss und an das Medium gebundene Verunreinigungen zu liefern, wobei der Durchfluss von jedem Kontakt gesammelt wird, um eine gereinigte Lösung von Pertactin bereitzustellen, und die resultierende gereinigte Lösung einer Ultrafiltration unterzogen wird.
Das Verfahren, das in Anspruch 1 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die unreine wässrige Lösung von Pertactin gebildet wird durch: Bereitstellen eines Mediums aus der Züchtung von Bordetella pertussis, das das Pertactin, PT und FHA enthält, und selektives Entfernen des PT und FHA aus dem Medium, darauf folgendes Präzipitieren von Pertactin aus dem Medium und Bilden der wässrigen Lösung von Pertactin durch Lösen des präzipitierten Pertactins.
Das Verfahren, das in Anspruch 2 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Pertactin durch Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem Medium präzipitiert wird.
Das Verfahren, das in Anspruch 1 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die unreine wässrige Lösung von Pertactin gebildet wird durch: Präzipitieren von Pertactin, PT und FHA aus einem Züchtungsmedium, in dem die Bordetella pertussis-Organismen gezüchtet wurden, nach Abtrennung des Züchtungsmediums von gezüchteten Zellen, Bilden einer wässrigen Lösung des Präzipitats und selektives Entfernen des PT und FHA aus der resultierenden Lösung.
Das Verfahren, das in Anspruch 4 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Pertactin, PT und FHA aus dem Züchtungsmedium durch Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem Medium präzipitiert werden.
Das Verfahren, das in Anspruch 1 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die unreine wässrige Lösung von Pertactin gebildet wird durch: Züchten von Zellen von Bordetella pertussis in einem Züchtungsmedium, Extrahieren von Pertactin aus gezüchteten Zellen von Bordetella pertussis, um einen Extrakt bereitzustellen, Unterwerfen des Extrakts einer Ultrazentrifugation, um Proteine mit hohem Molekulargewicht daraus zu entfernen und ein ultrafiltriertes Filtrat bereitzustellen, Unterwerfen des ultrafiltrierten Filtrats einer weiteren Ultrafiltration, um Proteine mit niedrigem Molekulargewicht daraus zu entfernen und ein ultrafiltriertes Retentat bereitzustellen, Präzipitieren von Pertactin aus dem ultrafiltrierten Retentat und Bilden der unreinen wässrigen Lösung von Pertactin durch Lösen des präzipitierten Pertactins.
Das Verfahren, das in Anspruch 6 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Ultrafiltration des Filtrats unter Verwendung einer Nominal Molecular Weight Limit (NMWL)-Membran mit 100 bis 1000 kDa bewirkt wird.
Das Verfahren, das in Anspruch 6 oder Anspruch 7 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das ultrafiltrierte Retentat unter Verwendung einer NMWL-Membran mit 30 kDa oder weniger vor der Präzipitation diafiltriert wird.
Das Verfahren, das in den Ansprüchen 6, 7 oder 8 beansprucht wird; dadurch gekennzeichnet, dass das Pertactin durch Zugeben von Ammoniumsulfat zu dem ultrafiltrierten Extrakt präzipitiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das präzipitierte Pertactin in einer Pufferlösung mit geringer Ionenstärke bei einem pH von 6,0 bis 8,5 gelöst wird.
Das Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferlösung eine Innenstärke von weniger als 4 mS/cm aufweist.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die ein Ionenaustauschermedium umfassende Matrix Q-Sepharose ist.
Das Verfahren, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die gereinigte Lösung ferner einer Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit 100 bis 300 kDa NMWL unterzogen wird, um eine ultrafiltrierte gereinigte Lösung herzustellen.
Das Verfahren, das in Anspruch 13 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die ultrafiltrierte gereinigte Lösung ferner unter Verwendung einer Membran mit 30 kDa oder weniger NMWL konzentriert wird.
Biologisch reines und stabiles Pertactin, das keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist.
Biologisch reines und stabiles Pertactin, wie es in Anspruch 15 beansprucht wird, das keine Kontamination durch aus der Chromatographie stammende Farbstoffmaterialien aufweist.
Biologisch reines und stabiles Pertactin, das durch ein Verfahren, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 beansprucht wird, erhalten wird.
Komponenten-Impfstoff gegen eine Infektion durch Bordetella pertussis, gekennzeichnet durch immunprotektives, biologisch reines und stabiles Pertactin, das keine nach weisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist, als einer aktiven Komponente davon, und einen physiologisch verträglichen Träger dafür.
Ein Komponenten-Impfstoff, wie er in Anspruch 18 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein gereinigtes anderes immunprotektives Pertussis-Antigen in dem Impfstoff vorliegt.
Ein Komponenten-Impfstoff, wie er in Anspruch 19 beansprucht wird, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine gereinigte andere immunprotektive Pertussis-Antigen PT, FHA und/oder ein Agglutinogen ist.
Ein Komponenten-Impfstoff, wie er in Anspruch 19 oder Anspruch 20 beansprucht wird, in dem das Pertactin und das mindestens eine gereinigte andere immunprotektive Pertussis-Antigen aus einer einzigen Fermentation von Bordetella pertussis gereinigt wurden.
Biologisch reines und stabiles Pertactin, das keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist, für eine Verwendung in einem Verfahren zur Impfung gegen Bordetella pertussis.
Verwendung von biologisch reinem und stabilem Pertactin, das keine nachweisbare Adenylatcyclaseaktivität aufweist, bei der Herstellung eines Komponenten-Impfstoffs gegen Bordetella pertussis.
Die Verwendung, wie sie in Anspruch 23 beansprucht wird, wobei mindestens ein gereinigtes anderes immunprotektives Pertussis-Antigen als eine Komponente des Impfstoffs eingesetzt wird.
Eine Verwendung, wie sie in Anspruch 24 beansprucht wird, wobei das Pertactin und das mindestens eine gereinigte andere immunprotektive Pertussis-Antigen aus einer einzigen Fermentation von Bordetella pertussis gereinigt wurden.