DE69027013T2

DE69027013T2 - Verfahren zur Reinigung eines 69000 Dalton antigenischen Proteins aus Bordetella pertussis

Info

Publication number: DE69027013T2
Application number: DE69027013T
Authority: DE
Inventors: John William Gotto
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-10-29
Publication date: 1996-12-19
Anticipated expiration: 2010-10-30
Also published as: US5276142A; SG54177A1; AU641711B2; JPH03191789A; ES2087109T3; KR910012234A; DK0437687T3; FI906071A0; FI101380B; AU6793390A; EP0437687B1; NO905324L; ATE137976T1; NO905324D0; JP2950970B2; KR0180527B1; CA2031763A1; DE69027013D1; FI101380B1; EP0437687A2

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen eines Proteins mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 69.000 Dalton aus der ällßeren Membran des Bakteriums Bordetella pertussis. Das so extrahierte und gereinigte Protein kann als eine Komponente eines nicht zellularen Keuchhusten-Impfstoffes eingesetzt werden.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Das Bakterium Bordetella pertussis ist die Ursache der als Keuchhusten bekannten, ernsten Infektionskrankheit. Zum Immunisieren von Kindern benutzte Impfstoffe sind aus ganzen Zellen von B. pertussis zusammengesetzt, die mit chemischen Mitteln oder Wärme inaktiviert wurden. Während Impfstoffe aus ganzen Zellen die zum Anregen der schützenden Immunität erforderlichen, antigenen Komponenten enthalten, können sie auch Substanzen enthalten, die irrelevant für den Schutz sind und möglicherweise mit unerwünschten Nebenwirkungen der Immunisierung in Beziehung stehen.
Um irgendwelche, unerwünschten Nebenwirkungen der Immunisierung mit Impfstoffen aus ganzen Zellen zu minimieren, wurden die pathogenen Mechanismen von B. pertussis untersucht, um festzustellen, welche antigenen Komponenten zur schützenden Immunitat beitragen. Die so identifizierten, spezifischen Antigene könnten in einen zell freien Impfstoff eingebracht werden, der Immunitat gegenüber der Krankheit verleiht, ohne irrelevante und möglicherweise unerwünschte Substanzen in die Immunisierung einzuführen. Es wurde eine Anzahl von Antigenen als Komponenten zellfreier Impfstoffe vorgeschlagen, z.B.: der Lymphozytose fördernde Faktor (LPF; auch als Histamin sensibilisierender Faktor, inselaktivierendes Protein und Keuchhustentoxin bekannt), fadenföriges Hämagglutinin (FHA) und fransenartige Agglutinogene (A.A. Weiss und E.L. Hewlett, 1986, Ann. Rev. Microbiol, 40:661-686.).
Ein mit der äußeren Membran von B. pertussis verbundenes, anderes Antigen, das ein augenscheinliches Molekulargewicht von etwa 69.000 Dalton aufweist, wird als das B. pertussis 69K Protein oder P.69 bezeichnet. Das B. pertussis 69K Protein ist immunologisch mit ähnlichen Proteinen verwandt, die geringe Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit aufweisen und durch das menschliche Pathogen B. parapertussis und das tierische Pathogen B. bronchiseptica produziert werden. Es wurde vorgeschlagen, daß das 69K Protein ein schützendes Antigen wäre, das als eine Impfstoffkomponente brauchbar ist. Die Beziehung zwischen dem Schutz gegen die Erkrankung und die Anwesenheit spezifischer Antikörper wurde zuerst für das B. bronchiseptica 68K Protein festgestellt, und die Untersuchung wurde später von Novotny et al. auf das 69K Protein von B. pertussis ausgedehnt (P. Novotny, A.P. Chubb, K. Cownley, J.A. Montaraz und J.E. Beesley, 1985, Dev. Biol. Stand. 61: 27-41; P. Novotny, M. Korisch, K. Cownley, A.P. Chubb und J.A. Montaraz, 1985, Infect. Immun. 50: 190-198; J.A. Montaraz, P. Novotny und J. Ivanyi, 1985, Infect. Immun. 47: 744-751 und P. Novotny, A.P. Chubb, K. Cownley und J.A. Montaraz, 1985, Infect. Immun. 50: 199-206). Andere haben gezeigt, daß 69K in gewissen Tiermodellen des Keuchhustens entweder durch aktive oder passive Immunität schützt. Weiter sind Antikörper gegen 69K in menschlichen Seren vorhanden, die von Keuchhusten genesen sind. Das 69K Protein hat die Eigenschaften eines B. pertussis Agglutinogens und kann als ein Adhäsin wirken, das ein Anhaften an Säugetierzellen verursacht. Das 69K Protein wird koordinativ mit LPF, FHA und anderen spezifischen Faktoren unter der Kontrolle eines genetischen Ortes exprimiert, der in Beziehung steht zur Virulenz von B. pertussis,und es wird nur in virulenten Stammen exprimiert. Schließlich wurde berichtet, daß das 69K Protein eine Komponente eines zellfreien Pertussis-Impfstoffes ist, der erfolgreich in Japan eingesetzt wurde (J. Aoyama, Y. Murase, M. Kato, H. Iwai und J. Iwata, 1989, Am. J. Dis. Child. 143: 655-659; R.D. Shahin, M.J. Brennan, Z.M. Li, B.D. Meade und C.R. Manclark, 1989, J. Exp. Med. (im Druck); M.J. Brennan, Z.M. li, J.L. Lowell, M.E. Bisher, A.C. Steven, P, Novotny und C.R. Manclark, 1988, Infect. Immun. 56: 3189-3195; I.G. Charles, G. Dougan, D. Pickard, S. Chatfield, M. Smith, P. Novotny, P. Morrissey und N.F. Fairweather, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3554-3558; E. Leininger-Zapata, M.J. Brennan, J.G. Kenimer, I.G. Charles, N. Fairweather und P. Novotny, 1989,Abstr. Amer. Microbiol. Seite 51, abstr. B-123; und R. Shahin, M.J. Brennan und B.D. Meade, 1989, Abstr. Amer. Soc. Microbiol., Seite 51, abstr. 13-125).
Um das 69K Protein als eine Komponente eines zellfreien Pertussis-Impfstoffes einzusetzen, ist ein Verfahren zur wirksamen Reinigung des Proteins erforderiich, das in einer kommerziellen Herstellung anwendbar ist. Früher beschriebene Verfahren haben jedoch verschiedene Nachteile zur Anpassung an eine Großproduktion.
Novotny et al. (Infection and Immunity, 50: 199-206, 1985, EP 0 162 639) beschreiben ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von 69K Protein aus ganzen Zeilen von B. pertussis. Das von Novotny et al. beschriebene Verfahren schließt das Suspendieren der ganzen Zellen von B. pertussis in Wasser, das Einstellen auf pH 3 mit einem Puffer, das Inkubieren bei 37ºC für etwa 18 Stunden zur Freisetzung von Proteinen einschließlich des 69K Proteins aus den ganzen Zellen, das Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren unter Zurücklassung eines Proteinextraktes, das Ausfällen des Proteinextraktes mit Aceton bei -20ºC und das Zentrifugieren der Ausfällung zur Trennung der ausgefällten Proteine von nicht proteinartigem Material, das in Lösung bleibt, ein. Der resultierende Proteinextrakt wurde auf einer DEAE-Trisacyl-Ionenaustauschsäule und Eluieren mit einem Salzgradienten chromatographiert. Nicht von der Ionenaustauschsäule zurückgehaltenes Material wurde einem isoelektrischen Fokussieren mit einem präparativen, isolektrischen Fokussierungsgel oder einem Chromato-Fokussieren unterworfen. Proteinhaltige Fraktionen, wie sie durch einen monoklonalen Anti-69K Protein-Antikörper erkannt wurden, wurden dann auf eine Säule mit monoklonalem Antikörper aufgebracht und dann mit 6M Harnstoff eluiert, um das 69K Protein herzustellen.
Dieses Verfahren ist für eine kommerzielle Herstellung des 69K Proteins nicht brauchbar, weil es 18 Stunden für die Extraktion des Proteins aus den Zellen benötigt, Aceton, ein gefährliches Lösungsmittel, bei der Ausfällungsstufe benutzt, einen 20 Stunden dauernden Lauf mit einer Ionenaustausch-Chromatographiesäule erfordert und ein mühsames, präparatives, isoelektrisches Fokussierungsverfahren benutzt, das 16 Stunden dauert. Weiter ist die resultierende Proteinzubereitung vor einer zusätzlichen Stufe nicht vollständig gereinigt, bei der es durch eine Infinitätssäule geschickt wird, die monoklonale Anti-69K-Antikörper benutzt, die an einen polymeren Träger gebunden sind, und unter Einsatz eines harschen 6M Harnstoffes eluiert ist. Schießlich ist das Protein während des Reinigungsverfahrens instabil, was zu einem gewissen Abbau des Proteins während der Reinigung führt.
Brennan et al. (Infection and Immunity, 56: 3189-3195 (1988)] beschreiben auch ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen des B. pertussis 69K Proteins aus ganzen B. pertussis- Zellen. Das von Brennan et al. beschriebene Verfahren schließt das Suspendieren lebender Zellen von B. pertussis in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung, das Inkubieren bei 60ºC für 1 Stunde zum Freisetzen der Proteine aus den Zellen, das Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren unter Zurücklassung eines Proteinextraktes und das Dialysieren des so erhaltenen Proteinextraktes in einer Tris-gepufferten Salzlösung ein, die die Protease-Inhibitoren Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Phenylmethylsulfonylfiuorid (PMSF) sowie Brij 35, ein Reinigungsmittel, enthält. Der Extrakt wird dann auf eine Fetuin-Sepharose-Säule aufgebracht, um Pertussistoxin zu entfernen, gefolgt von einer Mfinitätssäule mit monoklonalem Antikörper, die mit 6M Harnstoff eluiert wird, um das 69K Protein herzustellen. Wie bei dem durch Novotny et al. offenbarten Verfahren, unterliegt dieses Verfahren einigen Einschränkungn, die es relativ schwer machen, es wirksam in einem kommerziellen Rahmen auszuführen. Vergleicht man, z.B., die mehrfachen Inkubations-Extraktionsstufen der vorliegenden Erfindung mit der einzelnen Stufe von Brennan et al., dann zeigt dies, daß die einzelne Inkubations-Extraktionsstufe zu einer sehr unvollständigen Extraktion des 69K Proteins aus den Zellen führt. Darüber hinaus würde das durch Brennan et al. offenbarte Verfahren einen Einsatz toxischer und teuerer Chemikalien in großem Umfang erfordern, wenn es in einem kommerziellen Maßstab ausgeführt werden würde. Schließlich erfordern sowohl das Verfahren von Novotny et al. als auch das von Brennan et al. den Einsatz einer Infinitätssäule mit monoklonalem Antikörper.
Allgemein sind Verfahren, die Affinitätssäulen mit monoklonalem Antikörper benutzen, für die kommerzielle Produktion nicht geeignet, da die Antikörper nicht kommerziell erhältlich sind, und sie in einem länglichen Immunisierungsverfahren, gefolgt von einer Herstellung von Hybridomen und deren Screening, erzeugt werden müssen. Die Antikörper müssen dann gereinigt und an den Affinitätsträger gebunden werden, was sowohl arbeits- als auch zeitaufwendig ist. Weiter schießt die Elution aus den Affinitätssäulen hohe Konzentrationen von Harnstoff ein, was nachteilig ist, weil Harnstoff ein bekanntes Denaturierungsmittel ist und die strukturellen Charakteristika von Protein verändern kann.
Ein drittes Verfahren zum Extrahieren und Reinigen des 69K Proteins aus ganzen Zellen von B. pertussis ist von Burns et al. in der US-Patentanmeldung Seial Nr.7/308,864, eingereicht am 10. Februar 1989 und in "Abstracts of American Society of Microbiology", Seite 51, Abstract B-126 (1889) beschrieben. Dieses Verfahren schließt das Suspendieren lebender Zellen von Dertussis in einer Tris-gepufferten Salzlösung, die PMSF und Natriumazid enthält, das Inkubieren bei 60ºC für 1 Stunde zum Freisetzen von Proteinen aus den Zellen, das Entfernen der Zellen durch Zentrifugieren unter Zurücklassung eines Proteinextraktes und das Dialysieren des so erhaltenen Proteinextraktes in einer Tris-gepufferten Salzlösung ein, die den Protease-Inhibitor PMSF in einer beträchtlichen Konzentration (1mM) enthält. Der Extrakt wird dann auf Ionenaustauschsäule mit DEAE-Sepharose aufgebracht, die mit einem Salzgradienten eluiert wird. Das Eluat wird dialysiert und dann durch eine Farbstoffliganden-Chromatographiesäule [Affi- Gel Blue (Bio-Rad)] geschickt und mit einer hohen Konzentration von Harnstoff in Gegenwart eines Reinigungsmittels eluiert, um das 69K Protein herzustellen. Wie bei den Verfahren von Novotny et al. und Brennan et al. ist auch dieses Verfahren für die kommerzielle Produktion des 69K Proteins nicht geeignet, weil es die Anwesenheit von Protease-Inhibitoren in beträchtlicher Konzentration (z.B. 1mM PMSF) während des Verfahrens erfordert, um das 69K Protein vor proteolytischem Abbau zu schützen. Zur Anpassung an einen großen Maßstab ist der Einsatz großer Volumina von Puffern, die solche toxischen und teuren Substanzen enthalten, ein Nachteil, und es muß die vollständige Entfernung dieser Substanzen aus dem Endprodukt sichergestellt werden. Zusätzlich können die zum Eluieren des Proteins aus der Farbstoffliganden-Säule benutzten Harnstoff- und Reinigungs-Materialien die Proteinstruktur durch Denaturierung beeinträchtigen.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Extraktion und Reinigung von 69K Protein aus ganzen Zellen von B. pertussis zu schaffen, das zu einer kommerziellen Produktion des Proteins in der Lage ist. Es ist eine andere Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, mit dem die Ausbeute an Protein erhöht wird. Es ist eine andere Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, bei dem die Stabilität des 69K Proteins erhöht ist. Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, bei dem toxische Protease-Inhibitoren oder harsche, denaturierende Mittel, wie eine hohe Konzentration von Harnstoff, nicht benutzt werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen eines Außenmembran-Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 69.000 Dalton aus Zellen von B. pertussis, wie es in Anspruch 1 definiert ist. Das Verfahren ist zur Produktion in kommerziellem Maßstab gut geeignet, und es stellt eine beträchtliche Verbesserung gegenüber früheren Verfahren dar, insbesondere hinsichtlich einer verbesserten Ausbeute und Stabilität des Proteins. Im besonderen ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Ausbeute und Stabilität des 69K Proteins durch Inaktivieren der Zellen von B. pertussis durch Inberührungbringen mit einem bakteriostatischen Quecksilbermittel vor der Extraktion des Proteins aus den Zellen. Die Inaktivierung auf diese Weise stabilisiert das 69K Protein gegen Abbau und beseitigt die Notwendigkeit des Einsatzes von Protease-Inhibitoren, Überraschenderweise führt die Inaktivierung in dieser Weise auch zu einer erhöhten Ausbeute an 69K Protein.
Zusätzlich ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Ausbeute an Protein durch wiederholte Extraktion des Proteins aus Zellen von B. Dertussis. Die wiederholte Extraktion ergibt erhöhte Ausbeuten, wenn sie entweder mit lebenden oder inaktivierten Zellen ausgefuhrt wird, es wurde jedoch festgestellt, daß die besten Ausbeuten erhalten werden, wenn inaktivierte Zellen benutzt werden. Die wiederholte Extraktion schließt eine Vielzahl von Extraktionsstufen ein, wobei jede Extraktionsstufe das Suspendieren der Zellen in einem wässerigen Medium, das vorzugsweise einen Puffer einschließt, das Inkubieren der Zellen bei einer Temperatur von etwa 45ºC bis etwa 65ºC für etwa 30 Minuten bis etwa 1,5 Stunden umfaßt, um die Proteine aus den Zellen freizusetzen, gefolgt von der Abtrennung der aus den Zellen freigesetzten Proteine, um einen Proteinextrakt zu erhalten. Die zurückbleibenden Zellen werden in einem frischen, wässerigen Medium nochmals suspendiert und die Inkubations- und Trenn- Stufen werden so oft wie nötig wiederholt, um den größeren Teil des 69K Proteins aus den Zellen zu erhalten.
Schließlich schafft das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Reinigungsanordnung, bei dem 69K Protein aus einem Proteinextrakt durch Farbstoffliganden-Chromatographie, gefolgt vom Chromato-Fokussieren, gereinigt und gewonnen wird. Im besonderen wird der Proteinextrakt zuerst teilweise unter Anwendung der Farbstoffliganden-Chromatographie gereinigt, die selektiv das 69K und eine begrenzte Anzahl anderer Proteine bindet, aber die Abtrennung der großen Mehrheit verunreinigender Proteine und anderer Verunreinigungen durch Hindurchlassen durch die Säule gestattet. Das 69K Protein wird dann vollständig von der begrenzten Anzahl anderer Proteine, die von der Farbstoffliganden-Chromatographiesäule eluiert wurden, durch eine chromato-fokussierende Operation, die Proteine durch differentielles Binden und Elution auf der Grundlage von Unterschieden in den isoelektrischen Punkten abtrennt, abgetrennt. Unerwarteterweise gestattet die spezielle Reihenfolge der Farbstoffliganden-Chromatographie, gefolgt vom Chromato-Fokussieren, die Maximierung der Säulenkapazitat, was diese Anordnung besonders geeignet für einen kommerziellen Maßstab macht.
Das beschriebene Verfahren repräsentiert somit eine einfache, zuverlässige Prozedur, bei der die Ausbeute an Protein sowohl durch die Stabilität während der Reinigung als auch die Wirksamkeit der Extraktion erhöht wird. Zusätzlich wird die zur Gewinnung des 69K Proteins erforderliche Zeit als ein Ergebnis der minimalen Anwendung von Dialysestufen minimiert. Die in einer speziellen Reihenfolge angewendeten, chromatographischen Prozeduren führen zu einer unerwarteten Maximierung der Säulenkapazität und zu einem schnelleren Beladen und Eluieren. Das Verfahren dieser Erfindung schafft somit eine Methode, die weniger Zeit benötigt und billiger ist als derzeit bekannte Verfahren, und die in idealer Weise für die kommerzielle Produktion geeignet ist.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Es wird davon ausgegangen, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Extrahleren und Reinigen von 69K Protein aus allen 69K produzierenden Stämmen von Bordetella pertussis geeignet ist. Das 69K Protein kann aus irgendeinem virulenten Stamm von Bordetella pertussis gereinigt werden, der unter Bedingungen gezüchtet wird, bei denen Virulenz-Faktoren exprimiert werden. Geeignete Stämme sind, z.B., Phasen 1-Külturen von B. pertussis Tohama I, 165, 18323 oder andere, einschließlich klinischer Isolate und Stämme, die für die Herstellung von Pertussis-Impfstoff aus ganzen Zellen benutzt werden. Es wird davon ausgegangen, daß Proteine, die antigenisch mit dem 69K Protein in Beziehung stehen, einschließlich, z.B., dem 68K Protein von B. bronchiseptica, und dem 70K Protein von B. parapertussis, auch aus diesen Bordetella-Arten durch die hier beschriebenen Verfahren extrahiert und gereinigt werden können. Weiter wird davon ausgegangen, daß rekombinante Versionen des 69K Proteins nach Extraktion aus genetisch geschaffenen Zellen, die zum Exprimieren des Proteins benutzt wurden, z.B. Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces, Hefe, Säugetier-Zellkulturen und anderen, ebenfalls unter Anwendung der beschriebenen Verfahren gereinigt werden können.
Das Züchten von virulentem B. pertussis in Kulturmedien ist bekannt, und vorbeschriebene Kulturbedingungen sind allgemein geeignet. Das Züchten kann in irgendeinem Medium ausgeführt werden, das für Phasen I-Stämme, z.B. Cohen-Wheeler, Stainer-Scholte, Verwey und anderen, geeignet ist. Die Kulturen können unter statischen Bedingungen, in geschüttelten Kulturen oder in Gefäßen, die für die Eintauchfermentation benutzt werden, bei einer Temperatur gezüchtet werden, die mit der Expression von Virulenz-Faktoren kompatibel ist, z.B. 30ºC bis 37ºC, insbesondere 37ºC. Die Kulturen sollten für eine Zeitdauer gezüchtet werden, die das Wachstum mindestens bis zur Mitte der logarithmischen Phase gestattet, aber nicht länger als bis zur Mitte der stationären Phase, z.B. 24 Stunden in Fermenter-Kulturen.
Eine wachsende Kultur von Bordetella Dertussis oder äquivalenten Zellen wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch Zugabe eines bakteriostatischen Mittels, vorzugsweise von der Art, die die hemmenden Eigenschaften von Schwermetallverbindungen zeigt, inaktiviert. Besonders bevorzugt ist die Klasse der Bakteriostatischen Mittel, die als "Quecksilber-Materialien" bekannt ist, einschließlich Thimerosal, Quecksilber(II)chlorid und verschiedene organische oder anorganische, quecksilberhaltige Verbindungen. Thimerosal kann zum Inaktivieren einer wachsenden Kultur benutzt werden, indem man es zu der Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,005 bis 0,2% (Gewicht/Volumen der Kultur), vorzugsweise 0,02%, hinzugibt. Das Aussetzen gegenüber Thimerosal kann bei irgendwelchen geeigneten Bedingungen erfolgen, doch ist ein Aussetzen für 12 bis 18 Stunden bei Temperaturen von 37ºC bis 10ºC bevorzugt. Die inaktivierten Zellen werden dann vom Wachstumsmedium durch irgendein physikalisches Verfahren, vorzugsweise durch Zentrifugieren und Gewinnen der sedimentierten Zellen, getrennt.
Es ist besonders bevorzugt, Zellen mit 0,02% Thimerosal (USP, XX, Seite 791, 1980) vor dem Extrahieren von 69K Protein zu inaktivieren. Zellen, die zuvor mit 0,02% Thimerosal inaktiviert worden sind, sind kommerziell erhältlich und können auch benutzt werden. Es wurden keine besonderen Probleme mit dem proteolytischen Abbau des Proteins während der Reinigung beobachtet, wenn inaktivierte Zellen eingesetzt wurden. Während nicht gewünscht wird, durch irgendeine Theorie festgelegt zu werden, scheint es, daß die anfängliche Inaktivierung der Zellen mit Thimerosal einigen Nutzen bei der Stabilisierung des 69K Prote ins oder der 11cmmung proteolytischer Enzyme während der übrigen Extraktions- und Reinigungs-Stufen hat. Die Ausbeuten sind daher erhöht, weil proteolytische Enzyme das Protein nicht zerstören. Die erhöhte Stabilitat des 69K Proteins vermeidet die Notwendigkeit, teuere und toxische Protease- Inhibitoren einzusetzen, wie das bei anderen bekannten Verfahren erforderlich ist.
Der unerwartete Vorteil, der aus der Inaktivierung der Zellen vor dem Extrahieren und Reinigen des 69K Proteins gewonnen wird, wird durch die Beispiele 1 und 2 demonstriert, deren Ergebnisse in Tabelle 1 aufgeführt sind. Beispiel 2 repräsentiert einen Versuch, 69K aus lebenden Zellen bei Abwesenheit von Protease-Inhibitoren zu reinigen. Bei diesem Beispiel wurden schließlich 0,8 µg des Proteinslg Naßgewicht der Zellen gewonnen. Beispiel 1 benutzte mit Thimerosal inaktivierte Zellen. Bei diesem Beispiel wurden 196 µg von 6gK/g Naßgewicht der Zellen gewonnen. Ein Teil des Unterschiedes kann dem wirksameren, wiederholten Extraktionsverfahren zugeschrieben werden, das für die inaktivierten Zellen in Beispiel 1 benutzt wurde, nicht aber für die lebenden Zellen in Beispiel 2. Es kann jedoch abgeschätzt werden, daß die wiederholte Extraktion die Abgabe von 69K aus den Zellen um das mindestens 2,7-fache gegenüber einer einzelnen Extraktion erhöht, wie in fabelle 2, Beispiele 1 und 7 gezeigt. Wenn daher eine einzelne Extraktion benutzt worden wäre, dann würde man als Ausbeute aus inaktivierten Zellen in Beispiel 1 etwa 73 µg/g Naßgewicht der Zellen anstelle der tatsächlich 196 µg erwarten. Dieses Ergebnis repräsentiert noch immer eine unerwartete, 90-fache Verbesserung der Endausbeute unter Einsatz inaktivierter Zellen anstelle von lebenden Zellen. Die nützliche Wirkung des Inaktivierens von Zellen mit Thimerosal vor der Reinigung von 69K Protein auf die Ausbeute war vollkommen unerwartet. Die Wirksamkeit von Thimerosal als ein bakteriostatisches Mittel beruht auf seinem Gehalt an einer quecksilberhaltigen Verbindung. Quecksilber und andere Schwermetalle sind bekannte Inhibitoren vieler Arten von enzymatischen Reaktionen. Es wird angenommen, daß der scheinbare Schutz von 69K vor Abbau nach der Thimerosal-Inaktivierung von Zellen das Ergebnis einer Quecksilber-Hemmung von proteolytischen Enzymen im Zellextrakt sein könnte. In dieser Hinsicht ist Thimerosal repräsentativ für die allgemeine Klasse bakteristatischer Mittel, die als "Quecksilber-Materialien" bekannt ist, und auch für andere Mittel, die auf anderen Schwermetallverbindungen beruhen, von denen angenommen wird, daß sie ebenfalls nützlich sind. Während Zellen durch Wärme oder Behandlung mit anderen Arten chemischer Mittel, wie Azid oder anderen Atmungsgiften, inaktiviert werden könnten, würden diese Behandlungen den Nutzen der Verhinderung des proteolytischen Abbaus wahrscheinlich nicht haben.
Die Extraktion von 69K Protein aus der Zelloberfläche von B. pertussis-Zellen wird, wie durch Brennan et al. berichtet, durch Suspendieren nassen Zellmaterials, das anfänglich aus einer Kultur von Zellen in einem Puffer abgetrennt wurde, Inkubieren der Zellsuspension zur Freisetzung von Protein und Abtrennen der so freigesetzten Proteine durch Zentrifugieren bewerkstelligt, um einen Proteinextrakt zu erhalten. Brennan et al. offenbaren eine Extraktionsstufe dieser Art. Diese einzelne Extraktionsstufe hat sich jedoch als relativ unwirksam erwiesen, da ein beträchtlicher Teil der Gesamtmenge des 69K Proteins nicht freigesetzt wird. Unerwarteterweise hat die wiederholte Extraktion mit einer Vielzahl von Extraktionsstufen zur Freisetzung signifikanter, zusätzlicher Mengen von 69K Protein geführt. Wie Tabelle 2 zeigt, resultieren drei Wiederholungen der Extraktionsstufe, jede bestehend aus 90 Minuten bei 60ºC, in der Freisetzung von 570 µg von 69K Protein pro Gramm nassen Zellgewichtes (Beispiel 1), verglichen mit der Freisetzung von nur 212 µg pro Gramm nasses Zellgewicht für eine einzelne Extraktion von 4,5 Stunden (Beispiel 7). Die freigesetzte Meuge ist daher für die Wiederholung unerwartet höher als für die verlängerte Extraktionszeit. Aufgrund von Immunoassay und SDS- PAGE wird angenommen, daß weniger als 1% des Gesamtproteins der Zellen von B. pertussis 69K Protein ist. Die anfängliche Extraktion von 570 µg/g Naßgewicht (äquivalent 0,46% des gesamten Zellproteins) zeigt daher ein außerordentlich wirksames Verfahren zur Freisetzung von 69K Protein aus Zellen an. Während nicht gewünscht wird, an irgendeine Theorie gebunden zu werden, wird angenommen, daß die Ausbeute von 69K Protein im Extrakt durch das wiederholte Extraktionsverfahren stark vergrößert wird, weil das Ergänzen des Extraktes mit frischem,. wässerigem Medium und vorzugsweise frischem Puffer einen Satz von Bedingungen überwinden kann, die die Freisetzung von 69K Protein bei der anfänglichen Inkubation begrenzt haben mag.
Die wiederholte Extraktion gemäß der vorliegenden Erfindung schließt eine Vielzahl von in Reihe ausgeführten Extraktionsstufen ein. Jede Stufe ist ähnlich der einzelnen Extraktion, die durch Brennan et al. offenbart ist, und umfaßt das Suspendieren von Zellen in einem wässerigen Medium, das Inkubieren der Zellsuspension zur Freisetzung von Proteinen in Lösung in dem wässerigen Medium und Abtrennen des so freigesetzten Proteins, um einen Zellextrakt zu erhälten. Die Proteine werden durch irgendein physikalisches Mittel, vorzugsweise Zentrifugieren, von den Zellen abgetrennt. Das proteinhaltige Überstehende wird gewonnen und die nach der Abtrennung des Zellextraktes verbliebenen Zellen werden in einem frischen, wässerigen Medium erneut suspendiert und die Inkubations- und Trennteile wiederholt, um zusätzlichen Proteinextrakt freizusetzen und zu gewinnen. Drei Wiederholungen sind bevorzugt, obwohl davon ausgegangen wird, daß etwas zusätzliches Protein durch weitere Wiederholungen gewonnen werden kann.
Die wiederholte Extraktion des Proteins kann bei erhöhter Temperatur über einen ziemlich breiten Temperatur- und Zeitbereich ausgeführt werden. Ein wirksamer, brauchbarer Temperaturbereich von 37ºC bis 70ºC, vorzugsweise 60ºC, wird vorgesehen. Die Länge jeder Inkubation kann auf irgendeine wirksame Zeit von 30 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 90 Minuten, eingestellt werden. Es wird davon ausgegangen, daß jede Extraktionsstufe wirksame Zeit- und Temperatur-Bedingungen benutzt, die von Stufe zu Stufe gleich oder verschieden sein können.
Die wiederholte Extraktion kann erfolgen durch Suspendieren des Zell materials von B. pertussis in irgendeinem wässerigen Medium vor der Inkubation. Ein bevorzugtes, wässeriges Medium ist eine Pufferlösung, die auf einen pH von 7 bis 8 eingstellt ist. Ein besonders bevorzugtes, wässeriges Medium ist eine mit 0,01M Phosphat gepufferte Salzlösung, die in einer Konzentration von etwa 5 Volumina wässeriges Medium pro Volumen des nassen Zellmaterials eingesetzt wird.
Das Proteinextrakt-Material wird dann mit Polyethylenglykol ausgefällt. Polyethylenglykol wird in einer Konzentration von 30% (Gewicht/Volumen) zu dem Proteinextrakt hinzugegeben, um eine Ausfällungsfraktion zu ergeben, die reich an 60K Protein ist. Andere Reagenzien, die üblicherweise zum Ausfähen von Proteinen benutzt werden, würden auch geeignet sein, z.B. Ammoniumsulfat oder organische Lösungsmittel, wie Ethanol oder Aceton. Die unmittelbare Ausfällung der Proteine aus dem Proteinextrakt kann für die Abtrennung des 69K Proteins von anderen Substanzen im Extrakt, die seine Stabilität beeinträchtigen könnten, nützlich sein. Zusätzlich gestattet die unmittelbare Ausfällung die schnelle Fortsetzung des Verfahrens bis zu den Chromatographie-Stufen, durch Wiederauflösen des Proteinextraktes im erwünschten Puffer in einer konzentrierten Form ohne die länglichen Dialyse-Verfahren, die ansonsten erforderlich wären.
Das 69K Protein wird aus dem ausgefällten Proteinextrakt durch Farbstoffliganden- Chromatographie, gefolgt vom Chromato-Fokussieren, gewonnen. Unerwarteterweise wurde festgestellt, daß der Einsatz einer Farbstoffliganden-Chromatographiesäule, als erste Reinigungsstufe, Nutzen zieht aus dem selektiven Binden nur einiger Proteine, die 69K einschließen, an dieses Material. Der größte Teil der verunreinigenden Proteine und anderer Verunreinigungen wird daher vom Proteinextrakt entfernt, da der größte Teil davon sich nicht bindet und einfach durchläuft. Einige der Verunreinigungen, die sich binden, können durch differentielles Eluieren mit einem Gradienten der Elutionsmittel-Konzentration aus der Farbstoffliganden- Säule vom 69K Protein abgetrennt werden. Ein anderer Vorteil der Farbstoffliganden-Chromatographie in diesem Stadium des Verfahrens ist seine Kapazität; da sich die meisten Proteine nicht binden, kann eine relativ kleine Säule für die Chromatographie des Extraktes benutzt werden, der aus einer großen Zellmenge stammt. So sind, z.B., 30 ml Gel genügend für den Extrakt von mindestens 120 g Naßgewicht von Zellen. Die Selektivität und hohe Kapazität gestatten den Einsatz relativ kleiner Farbstoffliganden-Chromatographiesäulen mit sich ergebendem, schnellem Beladen und Eluieren.
Geeignete Farbstoffiiganden-Chromatographiematrices schließen solche Affinitäts- Matrices ein, die ein spezifisches Protein-Bindemedium enthalten, wie einen Farbstoff, der sich mit dem 69K Protein von B. pertussis verbindet. Besonders brauchbar sind solche Farbstoffliganden, die organische Moleküle mit einer nucleotid-ähnlichen Stuktur sind. Beispielhaft für solche Matrices sind Mfi-Gel Blue (Bio-Rad), Blue Sepharose CL-6B, Red Sepharose CL-6B (Pharmacia).
Um die Farbstoffliganden-Chromatographie auszuführen, wird der ausgefällte Proteinextrakt in einer Pufferlösung geringer lonenstärke in einem pH-Bereich von etwa 6 bis 8,5, vorzugsweise einer Tris-hydroxymethylaminomethan(tris)-Lösung von 0,05M beim pH 7,4, aufgelöst. Die wieder aufgelöste Proteinextrakt-Ausfällung wird dann auf eine Chromatographiesäule aufgebracht, die mit einer Matrix gepackt ist, wie Affi-Gel Blue (Bio-Rad), Blue Sepharose CL-6B, Red Spepharose CL-6B (Pharmacia) oder anderem Farbstoffligandengel, vorzugsweise Affi-Gel Blue, das mit dem obigen Puffer äquilibriert worden ist. Nachdem der Niederschlag des Proteinextraktes auf die Säule gegeben wurde, wird diese mit dem Äquilibrierungs-Puffer gewaschen. Das 69K Protein, das sich an die Säule gebunden hat, wird dann mit einer Lösung eines Salzes oder einer anderen Substanz eluiert, die die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand unterbricht. Das Elutiorismittel kann ein Salz sein, wie MgCl&sub2;, NaCl, KCl oder ein anderes. Andere Elutionsmittel, wie KSCN oder Harnstoff, die als chaotrope Mittel wirken, könnten auch eingesetzt werden. Alternativ könnte eine biospezifische Verbindung, wie NAD+, ATP oder ein anderes Nucleotid, als ein Elutionsmittel benutzt werden. Vorzugsweise wird MgCl&sub2; eingesetzt, da es billig ist und in geringer Konzentration die Struktur des Proteins wahrscheinlich nicht beeinträchtigt. Weiter wird das MgCl&sub2;-Elutionsmittel vorzugsweise in einem linearen Konzentrations-Gradienten von 0 bis 0,5M eingesetzt, der weiter das 69K von Verunreinigungen durch differentielle Elution bei zunehmender Mg&spplus;&spplus;-Konzentration trennt. Die Anwesenheit von 69K Protein in den eluierten Fraktionen kann durch elektrophoretische Analyse von Proben oder durch spezifische Assays auf 69K Protein, wie ELISA oder DOT-BLOT-Immunoassays, mit Anti-69K-Antikörpern überwacht werden.
Das 69K Protein enthaltende Eluat von der Stufe der Farbstoffliganden-Chromatographie wird dialysiert, um das MgCl&sub2; zu entfernen und das Eluat in dem geeigneten Puffer für die folgende Chromato-Fokussierungsstufe zuzubereiten. Es könnten auch andere Verfahren benutzt werden, z.B. Diafiltration auf einer entsalzenden Gelsäule Die 69K Protein enthaltenden Fraktionen, die aus der Mfi-Gel Blue-Säule eluiert sind, wie durch Elektrophorese, spezifische Immunoassays oder andere geeignete Mittel bestimmt, werden zusammengefügt und dann gegen einen Puffer geringer lonenstärke und hohen pH-Wertes, vorzugsweise 0,025M Ethanolamin/Acetat pH 9,4, dialysiert.
Die Endreinigung benutzt eine Chromato-Fokussierungs-Matrix der Art, die Proteine bei hohem pH bindet und mit einem Gradienten abnehmenden pH-Wertes eluiert. Das Chromato- Fokussieren ist besonders wirksam als die Endreinigungsstufe für die Gewinnung von 69K Protein. Eine ziemlich kleine Säule hat genügend Kapazität für das teilweise gereinigte Material, das aus einer großen Menge von Zellen stammt. Eine Chromatographie-Säule wird mit einem Chromato-Fokussierungsgel, wie Polypuffer Exchanger Gel PBE 94 (Pharmacia) gepackt, in einem Puffer geringer lonenstärke/hohen pH-Wertes, vorzugsweise 0,025M Ethanolamin/Acetat pH 9,4, äquilibriert. Das dialysierte Eluat aus der Stufe der Farbstoffliganden-Chromatographie wird auf die Säule gegeben und diese dann mit einem Bettvolumen des Äquilibrierungspuffers gewaschen. Das gebundene Protein wird mit einem Gradienten abnehmenden pH-Wertes (von 9,4 bis 6,0) eluiert, der erhalten wird, indem man durch die Säule etwa 12 Bettvolumina einer 1/10-Verdünnung des Polypuffers 96 (Pharmacia) schickt, die mit Essigsäure auf einen pH von 6 eingestellt ist. Die Analyse der aus der Säule eluierten Fraktionen mittels SDS-PAGE und Färben mit Coomassie Blue zeigt, daß das 69K durch die Chromato-Fokussierungssäule wirksam von den übrigen Verunreinigungen abgetrennt ist, und das Protein wird reproduzierbar als 2 Peaks bei pH 7,2 und 6,5, entsprechend isolelektrischen Varianten des gleichen Proteins, eluiert. Das Verfahren führt zu einer gereinigten 69K Zubereitung hoher Reinheit, die im wesentlichen frei ist von Verunreinigung mit bakteriellem Endotoxin.
Während das PBE-Gel von Pharmacia mit dem Polypuffer-Elutionsmittelsystem ein geeignetes, kommerziell erhältliches Material ist, wird davon ausgegangen, daß die Endreinigung des 69K Proteins auch durch irgendein Ionenaustausch-Gelsystem erzielt werden kann, das Proteine bei hohem pH bindet und ihre Elution in einem abgehenden pH-Gradienten gestattet.
Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte, reine 69K Material kann zur Herstellung einer zellfreien Impfstoff-Formulierung von B. pertussis zum Induzieren von Immunität gegenüber Keuchhusten in Säugetieren eingesetzt werden. Das 69K Protein kann mit einem pharmazeutisch akzeptablem Träger, wie irgendeinem geeigneten, flüssigen Medium, verarbeitet werden. Ein Beispiel eines solchen Trägers ist eine Salzlösung. Das antigene Protein kann in dem Träger in Lösung vorhanden oder als ein Feststoff suspendiert sein. Die Impfstoff-Formulierung kann auch einen Zusatz zum Stimulieren der Immunantwort umfassen und dadurch die Wirkung des Impfstoffes verstärken. Geeignete Zusätze zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung schließen, z.B., Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat ein. Geeigneterweise werden die Impfstoff-Formulierungen so hergestellt, daß sie eine Endkonzentration des antigenen Proteins im Bereich von 0,01 bis 5 mg/ml, vorzugsweise 0,03 bis 2 mg/ml, am bevorzugtesten 0,3 mg/ml, enthalten. Nach dem Formulieren kann der Impfstoff in einen sterilen Behälter gefüllt werden, der dann abgedichtet und bei einer geringen Temperatur, z.B. 4ºC, gelagert oder gefriergetrocknet werden kann. Um im Menschen lmmunität gegen Keuchhusten zu induzieren, können ein oder mehrere Dosen des geeignet formulierten Impfstoffes verabreicht werden. Es wird empfohlen, daß jede Dosis 0,1 bis 2 me, vorzugsweise 0,2 bis 1 ml, am bevorzugtesten 0,5 ml, des Impfstoffes beträgt. Die vorliegende Erfindung schafft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Induzieren von Immunität gegen Keuchhusten in Säugetieren, einschließlich des Menschen, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Impfstoff-Formulierung, wie sie oben definiert ist, an den Wirt. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können mittels irgendeines konventionellen Verfahrens für die Veabreichung von Impfstoffen verabreicht werden, einschließlich oraler und parenteraler (z.B. subcutaner oder intramuskulärer) Injektion. Die Behandlung kann aus einer Einzeldosis des Impfstoffes oder mehreren Dosen über eine Zeitdauer bestehen. Impfstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung können auch ein oder mehrere andere antigene Komponenten umfassen, wie, z.B., in geeigneter Weise toxisch gemachtes LPF, um die Wahrscheinlichkeit von mutanten Stämmen von B. pertussis zu verringern, die das Eintreten der Immunität verhindern.
Das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte, reine 69K Material kann auch für analytische oder diagnostische Zwecke bei der Bewertung von Immunantworten auf Krankheit oder Impfstoffverabreichung eingesetzt werden. So erfordert, z.B., die ELISA- Technik (Enzym-verbundener Immunsorptionsmittel-Assay) für den Nachweis spezifischer Antikörper eine Quelle des relevanten Antigens. Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigte 69K Protein ist frei von Verunreinigungen und wäre somit eine erwünschte Protein-Zubereitung zum Einsatz bei ELISA zum eindeutigen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern, die gegen 69K Protein gerichtet sind. Es könnte auch in irgendeinem anderen immunologischen Verfahren eingesetzt werden, das ein gereinigtes Antigen zur Messung von Immunantworten erfordert. Gleicherweise könnte gereinigtes 69K als ein Immunogen für die Entwicklung spezifischer Antikörper eingesetzt werden, die dann in anderen immunologischen Anwendungen diagnostischer Verfähren benutzt werden könnten, die die spezifische Erkennung von 69K Protein einschließen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Verfahren der vorliegenden Erfindung, ohne dasselbe einzuschränken.

Beispiel 1

Inaktivierte Zellen

Zelloberflächenextrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in einem flüssigen Steiner-Scholte-Medium (D.W. Steiner und M.J. Scholte 1971, J. Gen. Microbiol. 63: 211-220) gezüchtet und mit 0,02% Thimerosal inaktiviert. Das Thimerosal wurde zu der Kultur bei einer Temperatur von 37ºC hinzugegeben, und die Inaktivierung trat über Nacht ein, während die Temperatur auf 10- 15ºC verringert wurde. Die inaktivierten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die feuchte Zellpaste (112 g) wurde in mit 0,01M Phosphat gepufferter Salzlösung vom pH 7,2 (PBS) bis zu einem Endvolumen von 640 ml suspendiert. Die Suspension wurde 90 Minuten bei 60ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugieren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Zellen wurden wieder in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 640 ml suspendiert, 90 Minuten bei 60ºC inkubiert und die Zellen durch Zentrifugieren entfernt. Das Überstehende dieser zweiten Inkubation wurde mit dem ersten Überstehenden vereinigt und bei 4ºC gelagert. Die Zellen wurden dann, wie oben beschrieben, ein drittes Mal in mit Phosphat gepufferter Salzlösung suspendiert, inkubiert und die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Das dritte Überstehende wurde mit den ersten beiden bei 4ºC vereinigt. Die Proteine in dem kombinierten Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen (10.000 U/min, 20 Minuten) und das Überstehende verworfen. Das Pellet wurde wieder in 830 me Puffer aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Diese Protein-Lösung repräsentiert den Zelloberfiächenextrakt (CSE).
Die Konzentration des 69K Proteins in dem CSE wurde durch einen Dot-Blot-Immunoassay gemessen, bei dem reihenmäßig verdünnte Proben und reiner 69K Standard fleckförmig auf eine Nitrocellulose-Membran aufgebracht und zuerst mit spezifischem Anti-69K-Antikörper und dann mit einem zweiten peroxidase-konjugierten Antikörper und schließlich mit einem Reagenz (4-Chlor-1-naphthol) umgesetzt werden, das eine Farbe in Gegenwart von Peroxid und Peroxidase entwickelte. Die Ergebnisse des Immunoassay stimmten mit Messungen überein, die auf dem relativen Anteil einer 69K Bande in Proben bei der SDS-PAGE beruhen. Wie nach dem Dot-Blot-Immunoassay gemessen, betrug der 69K Gehalt des CSE 570 µg 6gK/g Naßgewicht der zum Herstellen des CSE eingesetzten Zellen.

Farbliganden-Chromatographie des Zelloberflächenextraktes

Ein Affi-Gel Blue Chromatographieträger (Bio-Rad) wurde gewaschen, in Puffer A äquilibriert und in eine Säule von 2,5 x 9 cm (etwa 30 ml Bettvolumen) gepackt. Die 830 ml Zelloberflächenextrakt wurden auf die Säule aufgebracht, gefolgt von einem Waschen mit einem Bettvolumen von Puffer A. Die Säule wurde erst mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5M Magnesiumchlorid in Puffer A (jeweils 50 ml) eluiert, gefolgt von einem Waschen mit 30 ml 0,5M Magnesiumchlorid. Schließlich wurden 50 ml von 2M Magnesiumchlorid durch die Säule geschickt. Das Protein im Eluat wurde überwacht durch die Extinktion bei 280 nm. Ein prominenter Peak beim Eluieren mit dem Magnesiumchlorid-Gradienten wurde beobachtet. Die Analyse der Fraktionen durch SDS-PAGE zeigte, daß das 69K Protein stark in den Fraktionen angereichert war, die den Eluat-Peak repräsentieren. Diese werden kombiniert und gegen 0,025M Ethanolaminlacetat, pH 9,4 (Puffer B), dialysiert.

Chromato-Fokussieren

Der Chromato-Fokussierungsträger war Polypuffer -Austauscher PBE 94 (Pharmacia), der in Puffer B äquilibriert und in eine Säule von 1,7 x 15 cm (etwa 35 mC Gel) gepackt wurde. Das dialysierte Eluat von der Affi-Gel Blue-Säule (etwa 135 ml) wurde auf die PBE-Säule gegeben, gefolgt vom Waschen mit einem Bettvolumen von Puffer B. Die Säule wurde mit einem selbstbildenden Gradienten (pH 9,4-6,0) eluiert, indem man 400 mC einer 1/10 Verdünnung von Polypuffer 96 (Pharmacia), die mit Essigsäure auf einen pH von 6 eingestellt war, hindurchschickte. Etwas Protein (überwacht durch A280) wurde nicht durch die Säule festgehalten. Der pH-Gradient führte zum Eluieren mehrerer Peaks, am prominentesten bei pH 7,2 und 6,5. SDS- PAGE und Westernblot mit Anti-69K-Antikörper zeigten, daß das Protein in diesen beiden Eluatpeaks 69K Protein hoher Reinheit war. Um die Polypuffer-Salze zu entfernen, wurde das Protein in den zusammengefügten Fraktionen durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat, 0,7 g/ml Eluat, ausgefällt, und die Ausfällung durch Zentrifugieren bei 10.000 U/min für 20 Minuten gewonnen. Das Pellet wurde in einem Minimalvolumen von mit Phosphat gepufferter Salzlösung wieder aufgelöst. Die Ausbeute an reinem 69K Protein aus diesem Verfahren betrug 22 mg oder etwa 196 µg/g Naßgewicht des Ausgangszellmaterials. Die Wirksamkeit der Gewinnung aus dem anfänglichen CSE-Extrakt betrug etwa 35% (196 µg gegenüber 570 µg). Das bakterielle Endotoxin im gereinigten Protein, gemessen durch den Limulus-Amoebozytenlysat (LAL) Assay betrug 0,06 EU/µg Protein.

Beispiel 2

Lebende Zellen

Zelloberflächen-Extrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in flüssigen Steiner-Scholte-Medium gezüchtet und nicht inaktiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die nasse Zellpaste (26 g) wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 62 ml suspendiert. Die Suspension wurde 90 Minuten bei 60ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugieren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Proteine im Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren (10.000 U/min, 20 Minuten) gewonnen und das Überstehende verworfen. Das Pellet wurde in 22 ml eines Puffers aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Diese Protein-Lösung repräsentiert den Zelloberflächenextrakt (CSE).

Farbliganden-Chromatographie des Zelloberflächenextraktes

Ein Affi-Gel Blue Chromatographieträger (Bio-Rad) wurde gewaschen, in Puffer A äquilibriert und in eine Säule von 1,7 x 9 cm (etwa 20 ml Bettvolumen) gepackt. Die 22 ml Zelloberflächenextrakt wurden auf die Säule aufgebracht, gefolgt von einem Waschen mit einem Bettvolumen von Puffer A. Die Säule wurde erst mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5M Magnesiumchlorid in Puffer A (jeweils 50 ml) eluiert, gefolgt von einem Waschen mit 30 ml 0,5M Magnesiumchlorid. Schließlich wurden 50 ml von 2M Magnesiumchlorid durch die Säule geschickt. Das Protein im Eluat wurde überwacht durch die Extinktion bei 280 nm. Ein kleiner Peak beim Eluieren mit dem Magnesiumchlorid-Gradienten wurde beobachtet. Die Analyse der Fraktionen durch SDS-PAGE zeigte, daß das 69K Protein in den Fraktionen war, die den Eluat-Peak repräsentierten. Diese wurden kombiniert und gegen 0,025M Ethanolamin/Acetat, pH 9,4 (Puffer B) dialysiert.

Chromato-Fokussieren

Der Chromato-Fokussierungsträger war Polypuffer-Austauscher PBE 94 (Pharmacia), der in Puffer B äquilibriert und in eine Säule von 0,9 x 5 cm (etwa 5 me Gel) gepackt war. Das dialysierte Eluat von der Affi-Gel Blue-Säule (etwa 24 ml) wurde auf die PBE-Säule gegeben, gefolgt vom Waschen mit einem Bettvolumen von Puffer B. Die Säule wurde mit einem selbstbildenden Gradienten (pH 9,4-6,0) eluiert, indem man 60 ml einer 1/10 Verdünnung von Polypuffer 96 (Pharmacia), die mit Essigsäure auf einen pH von 6 eingestellt war, hindurchschickte. Etwas Protein (überwacht durch A280) wurde nicht durch die Säule festgehalten. Der pH-Gradient führte zum Eluieren von Peaks bei pH 7,2 und 6,5. SDS-PAGE und Westernblot mit Anti-69K- Antikörper zeigten, daß das Protein in diesen beiden Eluatpeaks 69K Protein hoher Reinheit war, doch war die Konzentration so gering, daß es erst nachgewiesen wurde, nachdem die Probe durch Lyophilisieren um etwa das 30-fache konzentriert worden war. Die Ausbeute an reinem 69K Protein aus diesem Verfahren betrug 0,02 mg oder etwa 0,8 µg/g Naßgewicht des Ausgangszeilmaterials. TABELLE 1 Wirkung der Inaktivierung auf die Gewinnung von 69K Protein Beispiel Gewinnung µg/g Naßgewicht der Zellen

Beispiel 3

Zelloberflächenextrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in einem Hüssigen Steiner-Scholte- Medium gezüchtet und mit 0,02% Thimerosal inaktiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die feuchte Zeilpaste (37 g) wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 213 ml suspendiert. Die Suspension wurde 16 Stunden bei 25ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugieren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Proteine in dem Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht- Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen (10.000 U/min, 20 Minuten) und das Überstehende verworfen. Das Pellet wurde wieder in 32 ml Puffer aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Diese Protein-Lösung repräsentiert den Zelloberflächenextrakt (CSE). Die Konzentration des 69K Proteins im CSE wurde wie in Beispiel 1 durch Dot-Blot-Immunoassay und durch SDS-PAGE-Analyse gemessen und ergab sich zu 7,5 µg/g Naßgewicht des Zell-Ausgangsmaterials.

Beispiel 4

Zelloberflächenextrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in einem flüssigen Steiner-Scholte-Medium gezüchtet und mit 0,02% Thimerosal inaktiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die feuchte Zellpaste (37 g) wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 213 ml suspendiert. Die Suspension wurde 16 Stunden bei 37ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugieren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Proteine in dem Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen (10.000 U/min, 20 Minuten) und das Überstehende verworfen. Das Peuet wurde wieder in 69 ml Puffer aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Diese Protein-Lösung repräsentiert den Zelloberflächenextrakt (CSE). Die Konzentration des 69K Proteins im CSE wurde wie in Beispiel 1 durch Dot-Blot-Immunoassay und durch SDS-PAGE-Analyse gemessen und ergab sich zu 53,4 µg/g Naßgewicht des Zell-Ausgangsmaterials.

Beispiel 5

Zelloberflächenextrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in einem flüssigen Steiner-Scholte-Medium gezüchtet und mit 0,02% Thimerosal inaktiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die feuchte Zellpaste (11,3 g) wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 65 mC suspendiert. Die Suspension wurde 60 Minuten bei 50ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugieren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Proteine in dem Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen (10.000 U/min, 20 Minuten) und das Überstehende verworfen. Das Pellet wurde wieder in 8 ml Puffer aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Diese Protein-Lösung repräsentiert den Zelloberflächenextrakt (CSE). Die Konzentration des 69K Proteins im CSE wurde bestimmt durch Messen des Gesamtproteingehaltes durch ein kommerzielles Proteinassay-Kit (Bio-Rad) dann unter Anwendung von SDS-PAGE-Analyse zur Messung des Prozentsatzes des Gesamten, der als 69K Band in den gefärbten Gelen erscheint. Die Konzentration wurde zu 161 µg/g Naßgewicht der Ausgangszellen bestimmt.

Beispiel 6

Zelloberflächenextrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in einem flüssigen Steiner-Scholte-Medium gezüchtet und mit 0,02% Thimerosal inaktiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die feuchte Zellpaste (11,3 g) wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 65 me suspendiert. Die Suspension wurde 60 Minuten bei 50ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugieren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Zellen wurden wieder in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 65 ml suspendiert, 60 Minuten bei 50ºC inkubiert und die Zellen durch Zentrifugieren entfernt. Das Überstehende dieser zweiten Inkubation wurde von dem ersten Überstehenden separat gehalten und bei 4ºC gelagert. Die Zellen wurden dann, wie oben beschrieben, ein drittes Mal in Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert, inkubiert und die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Das dritte Überstehende wurde von den ersten beiden separat bei 4ºC gehalten. Die Proteine in jedem Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierenden Ausfällungen wurden durch Zentrifugieren gewonnen (10.000 U/min, 20 Minuten) und die Überstehenden verworfen. Die Pellets wurden jedes in 8 me Puffer aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Jede aufgelöste Ausfällung wurde auf Proteingehalt und 69K Gehalt, wie in Beispiel 5, untersucht. Die drei Lösungen wurden dann zusammengeschüttet und diese gemeinsame Lösung repräsentierte den vollstandigen Zelloberflächenextrakt (CSE). Die Gesamtgewinnung an 69K Protein wurde gemessen und ergab 271 µg/g Naßgewicht des Ausgangs-Zellmaterials.

Beispiel 7

Zelloberflächenextrakt

Bordetella pertussis, Lederlestamm 130, wurde in einem flüssigen Steiner-Scholte-Medium gezüchtet und mit 0,02% Thimerosal inaktiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, und die feuchte Zellpaste (37 g) wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bis zu einem Endvolumen von 213 me suspendiert. Die Suspension wurde 4,5 Stunden bei 60ºC inkubiert, dann entfernte man die Zellen durch Zentrifugiliren und bewahrte das Überstehende bei 4ºC auf. Die Proteine in dem Überstehenden wurden durch graduelle Zugabe von festem Polyethylenglykol (PEG, MW 8000) bis zu einer Endkonzentration von 30% (Gewicht/Volumen) unter Rühren ausgefällt. Die resultierende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren gewonnen (10.000 U/min, 20 Minuten) und das Überstehende verworfen. Das Pellet wurde wieder in 103 m l Puffer aufgelöst, bestehend aus 0,05M Tris, pH 7,4 (Puffer A). Diese Protein-Lösung repräsentiert den Zelloberflächenextrakt (CSE). Die Konzentration des 69K Proteins im CSE wurde wie in Beispiel 1 durch Dot-Blot-Immunoassay und durch SDS-PAGE-Analyse gemessen und ergab sich zu 212 µg/g Naßgewicht des Zell-Ausgangsmaterials. TABELLE 2 Wirkung der wiederholten Extraktion auf die Ausbeuten an 69K Protein Beispiel Temperatur Zeit (h) Im CSE vorhandene Ausbeute an 69K µg/g Naßzellengewicht
* 3 wiederholte Extraktionen

Claims

1. Verfaliren zum Extrahieren und Reinigen eines Außenmembran-Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 69.000 Dalton aus Zellen von Bordetella pertussis, umfassend: Inaktivieren der Zellen von Bordetella pertussis durch Inberührungbringen der Zellen mit einem quecksilberhaltigen, bakteriostatischen Mittel;

Herstellen eines Proteinextraktes aus den inaktivierten Zellen durch Suspendieren der Zellen in einem wasserigen Medium;

Inkubieren der Zellsuspension zur Freisetzung von Proteinen aus den Zellen und Abtrennen der freigesetzten Proteine von den Zellen nach der Inkubation;

Abtrennen des Außenmembran-Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 69.000 Dalton aus dem Proteinextrakt durch Aufbringen des Proteinextraktes auf einen chromatographischen Farbstoff-Liganden-Träger;

Eluieren von an den Farbstoff-Liganden-Träger gebundenen Proteinen;

Aufbringen des Eluates von dem Farbstoff-Liganden-Träger auf einen chromatofokussierenden Träger und Gewinnen des Außenmembran-Proteins davon.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das quecksilberhaltige, bakteriostatische Mittel Thiomersal oder Quecksilber(II)chlorid umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das quecksilberhaltige, bakteriostatische Mittel Thiomersal umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin Bordetella pertussis durch Inberührungbringen mit Thiomersal in einer Konzentration von 0,01 bis 0,05% (Gewicht/Volumen der Kultur) inaktiviert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Thiomersal in einer Konzentration von 0,02% (Gewicht/Volumen der Kultur) eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das wässerige Medium eine auf einen pH von 7 bis 8 eingestellte Pufferlösung ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Puffer 0,01 M Phosphat-gepufferte Salzlauge umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der chromatographische Farbstoff-Liganden-Träger mit einem linearen Gradienten eluiert wird, der bis zu etwa 0,5 M Magnesiumchlorid in einem Puffer umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Eluat vom chromatographischen Farbstoff- Liganden-Träger mit einem Ethanolaminlacetat-Puffer mit einem pH von 9,4 dialysiert wird, bevor es auf den chromatofokussierenden Träger aufgebracht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Inkubation bei einer Temperatur von 45ºC bis 65ºC für eine Zeit von 30 bis 90 Minuten ausgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Proteinextrakt mittels Zentrifuge getrennt wird, wobei man das Überstehende zurückbehält.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Überstehende mit Ammoniumsulfat, Ethanol oder Aceton gefällt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Überstehende mit Polyethylenglykol gefällt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Polyethylen in einer Konzentration von etwa 30% Gewicht/Volumen eingesetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 1, worin der chromatographische Farbstoff-Liganden-Träger eine Affinitätsmatrix umfaßt, die ein spezifisch Protein bindendes Medium enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Außenmembran-Protein durch Eluieren mit einem selbstgebildeten pH-Gradienten aus dem chromatofokussierenden Träger gewonnen wird.