DE68915045T2

DE68915045T2 - Reinigung von Pertussis-Toxinen und Herstellung von Vakzine.

Info

Publication number: DE68915045T2
Application number: DE68915045T
Authority: DE
Inventors: Dirk Alkema; Rafaat Emil Fahmy Fahim; Gail Jackson; Larry U L Tan; Po S Wah
Original assignee: Connaught Laboratories Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1989-04-05
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2009-04-06
Also published as: EP0336736A1; ES2052909T3; ATE105188T1; JPH0789949B2; DE68915045D1; CA1331134C; EP0336736B1; US4997915A; JPH0231689A; GB8807860D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung und Reinigung spezifischer Proteine aus dem Fermentationsmedium des Organismus Bordatella pertussis, die Entfernung von pyrogenen Faktoren aus diesen Proteinen, die Entgiftung der Proteine und die Herstellung eines Impfstoffes aus diesen Proteinen, der praktisch nicht toxisch ist, geringe oder keine Nebenwirkungen aufweist und Schutz gegen die Krankheit Pertussis verleiht.
Für Kinder unter einem Alter von 24 Monaten kann die von Bordatella pertussis verursachte Krankheit, Pertussis oder Keuchhusten genannt, sehr ernst sein und weist eine Mortalitätsrate von etwa 1 % auf. Während der letzten fünfzig Jahre waren drei Impfstofftypen zur Immunisierung gegen die Krankheit erhältlich. Der am meisten verwendete Impfstoff, der zum Schutz von Kindern gegen die Pertussisinfektion in Kombination mit Tetanus- und Diphtherieimpfstoffen erhältlich war, ist der sogenannte "Ganzzell"-Impfstoff, der in allen hochentwickelten Ländern und vielen Ländern der dritten Welt erhältlich ist.
Dieser Ganzzellpertussisimpfstoff wird durch Kultivieren bekannter Stämme des B. pertussis Organismus in einem definierten Medium für einige Stunden in einem Fermenter hergestellt, bis das Gemisch bestimmte definierte Parameter erreicht. Das Gemisch wird dann mit einem chemischen Mittel, wie Formaldehyd, behandelt, das den Organismus abtötet und die im Überstand vorhandenen Proteine und den Organismus selbst entgiftet. Nachdem das Gemisch für eine bestimmte Zeit stehengelassen wurde, um sicherzustellen, daß dieses Entgiftungsverfahren vollständig ist, werden die Zellen durch Hindurchschleusen des Gemisches durch eine kontinuierliche Zentrifuge vom Überstand getrennt, um eine kompakte Zellmasse und den Überstand zu erhalten, der verworfen wird. Die Zellen werden dann in einer Natriumchloridlösung resuspendiert, um eine Lösung zu erhalten, die bei Verdünnung auf eine bekannte Stärke, die gewöhnlich durch die Trübung der Suspension bestimmt wird, und subkutaner Injektion Antikörper hervorruft, die gegen die Krankheit schützen. Von diesem Ganzzellimpfstoff ist bekannt, daß er geringe lokale Reaktionen an der Injektionsstelle hervorruft, die manchmal mit ernsteren Gesamtreaktionen verbunden sind, wie erhöhte Temperatur und allgemeines Unwohlsein. Es gab eine Spekulation, daß der Impfstoff für einige neurologische Reaktionen bei Kindern verantwortlich ist.
Bei einem zweiten Impfstofftyp wurde B. pertussis wie vorher kultiviert und mit Formaldehyd entgiftet, und dann wurden die isolierten Zellen mit einer konzentrierten Harnstofflösung extrahiert. Nach Filtration und Dialyse zur Entfernung des Harnstoffs wird ein Gemisch löslicher Zellwandbestandteile erhalten, das nach Verdünnung auf eine bekannte Stärke von 1969 bis 1974 als Impfstoff in Gebrauch war, aber jetzt wegen geringer Wirksamkeit zurückgezogen wurde. Seit kurzem wird ein dritter Impfstofftyp durch Isolierung und Reinigung der Bestandteile des Kulturüberstands von B. pertussis nach Entgiftung hergestellt, der allgemein als nicht-zellulärer Impfstoff bezeichnet wird, in Japan in Gebrauch und in einigen anderen hochentwickelten Ländern in klinischen Tests ist. Insbesondere wurden die als Lymphocytose-fördernder Faktor (LPF), auch bekannt als Pertussistoxin (PT), als filamentöses Hämagglutinin (FHA) und als Agglutinogene bezeichneten Bestandteile isoliert und identifiziert. Jedoch kann die Zusammensetzung des isolierten Proteingemisches durch die Variationen im Wachstum des Organismus und im Isolierungsverfahren, das nicht spezifisch ist, variieren. Zur Zeit gibt es keinen allgemein verwendeten und zugelassenen Impfstoff, der absolut untoxisch ist und dennoch guten Schutz bietet.
Mit dem Anwachsen des Wissens in der Wissenschaft der Immunologie über die Jahre stellte sich heraus, daß schützende Antikörper gegen eine bestimmte Krankheit durch die Verabreichung von bestimmten zellulären Komponenten des Organismus, die die Krankheit verursachen, eher hervorgerufen werden können, als durch den ganzen Organismus, der inaktiviert oder attenuiert wurde, um einen nicht-pathogenen Stamm zu ergeben. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung von entgifteten oder attenuierten Organismen als Impfstoff Komponenten mit sich bringt, die den Empfänger schädigen können. Unter Berücksichtigung dieses Umstands wurden einige Versuche unternommen, Komponenten des Pertussisorganismus zu isolieren, die entweder aus der Zelle stammen oder in das Medium exkretiert wurden, und antigene Eigenschaften haben könnten, vollkommen untoxisch sind und daher als Impfstoffe wirken könnten.
Bis jetzt gibt es keinen überzeugenden Beweis, daß irgendeine bestimmte Zellkomponente selbst als schützendes Antigen wirken kann. In einer Reihe an Veröffentlichungen und Patentanmeldungen (siehe beispielsweise EP-A-0 231 083 und EP-A-0 175 841) wurde jedoch vorgeschlagen, daß eine Mischung der gereinigten und entgifteten Proteine, der Lymphocytose-fördernde Faktor (LPF) und das filamentöse Hämagglutinin (FHA), als kombiniertes Antigen wirken können, und wenn sie einem Säuger verabreicht werden, Antikörper erzeugen, die Schutz gegen die Krankheit verleihen. In den vorher genannten Veröffentlichungen wurden verschiedene Methoden zur Gewinnung dieser Proteine in einer gereinigten Form, und einmal gereinigt, die Verwendung derer in verschiedenen Anteilen als Impfstoff beschrieben.
Die EP-A-0 175 841 beschreibt die getrennte Reinigung von LPF und FHA aus einem B. pertussis Fermentationsmedium durch Zusammenbringen einer LPF- oder FHA-enthaltenden Lösung mit einem Cellulosesulfatgel, einem Polysaccharidgel, an das chemisch Dextransulfat gebunden ist oder einem quervernetzten Polysaccharidsulfatgel und die Elution des adsorbierten FHA oder LPF aus dem Gel. Die Lösungen sind gewöhnlich auf eine Leitfähigkeit von 0,5 bis 5,0 mS/cm (LPF) oder 5,0 bis 25,0 mS/cm (FHA) eingestellt und das Elutionsmittel ist gewöhnlich ein Puffer mit der Leitfähigkeit 5 bis 100 mS/cm (LPF) oder 25 bis 130 mS/cm (FHA).
Die Abtrennung und Reinigung von LPF und FHA aus Kulturüberständen von B. pertussis mittels Hydroxylapatit, Haptglobin-Sepharose - und Sepharose CL-6B Filtrationschromatographie wurde von Y. Sato et al (Infect. Immun. 41 (1983) 313-320) beschrieben.
Die EP-A-0 121 249 beschreibt die Entgiftung einer LPF- und FHA- enthaltenden Fraktion durch die Behandlung mit Formaldehyd in Gegenwart einer Aminosäure. Die Gegenwart der Aminosäure soll die Zeit der Entgiftungsbehandlung wesentlich reduzieren und eine Ausfällung durch Aggregation vermeiden.
Obwohl die derzeitige Technologie hochgereinigtes LPF und FHA produziert, weisen die Verfahren Nachteile auf. Die verwendeten Methoden der Affinitätschromatographie sind effektiv, aber die Bedingungen der Adsorption und Elution verwenden oft Materialien, die toxisch sind, teuer sind und/oder die benötigten Proteine denaturieren. Zusätzlich können einige der in den Affinitätssäulen verwendeten Materialien unter den benötigten drastischen Elutionsbedingungen in das Produkt ausgewaschen werden und, da einige dieser Materialien aus Blut stammen, die Möglichkeit von durch Blut übertragenen Krankheiten oder Autoimmunisierung mit sich bringen. Die ausschließliche Verwendung von Gelfiltrationsmedien und Hydroxyapatit ist akzeptabel, aber ergibt nur geringe Reinigungsfaktoren.
Eine wesentliche Herausforderung bei den von B. pertussis gebildeten LPF und FHA ist die Entfernung der Lipopolysaccharide (LPS) als Kontamination. LPS kann sogar in Nanogrammengen Fieber erzeugen und ist eine unerwünschte Komponente jedes Impfstoffs. Die anfängliche Konzentration von LPS im Fermentationsüberstand kann bis zu einem Milligramm pro Milliliter betragen. Es wurden einige Methoden zur Entfernung von Pyrogenen aus Impfstoffen verwendet (siehe beispielsweise US-A-4 000 257 und US-A-4 380 511). Viele dieser Methoden sind zu drastisch und führen zu einer Denaturierung der benötigten Proteine. Andere Methoden sind ineffektiv, umständlich anzuwenden und teuer.
Vor der Verwendung von LPF und FHA als Impfstoff müssen diese Proteine entgiftet werden, da LPF in seinem natürlichen Zustand hoch toxisch ist und im gereinigten FHA immer noch geringe Mengen vorkommen. Dieses Verfahren wurde früher durch Behandlung der Proteine mit einem chemischen Mittel bewerkstelligt, das eine Quervernetzung bewirkt. Die traditionell verwendeten Mittel waren Formaldehyd und Glutaraldehyd. Die Verwendung von Formaldehyd und Glutaraldehyd kann zu schweren Verlusten aufgrund von Aggregation und Fällung führen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zur Isolierung und Reinigung der proteinartigen Materialien LPF und FHA aus dem Wachstumsmedium von B. pertussis durch die Adsorption und Desorption auf verschiedenen Substraten mittels einer Kombination von Lösungen mit niedriger und hoher Ionenstärke bereitgestellt. Zusätzlich wird ein verbessertes Verfahren zur Entfernung von pyrogenen Faktoren, repräsentiert durch LPS, aus LPF und FHA durch Waschen der adsorbierten Proteine mit einer Detergenzlösung bereitgestellt. Weiterhin wird ein verbessertes Verfahren zur Entgiftung von LPF und FHA unter Verwendung eines quervernetzenden Mittels in Gegenwart eines Antiaggregationsmittels bereitgestellt, um die gereinigten Materialien leicht in einem wirksamen Impfstoff zur Prävention der Pertussiskrankheit kombinieren zu können.
Demnach wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von proteinartigen Materialien, die Lymphocytose-fördernder Faktor (LPF) und filamentöses Hämagglutinin (FHA) genannt werden, aus einem Wachstumsmedium bereitgestellt, in dem der Organismus Bordatella pertussis kultiviert wurde. Das Verfahren umfaßt das Zusammenbringen des Wachstumsmediums bei niedriger Ionenstärke mit einem underivatisierten, festen, partikulären Adsorbtionsmedium, um LPF und FHA selektiv aus dem Wachstumsmedium zu adsorbieren, und die Desorption der proteinartigen Materialien durch Zusammenbringen des Adsorptionsmediums mit einem wässrigen Medium hoher Ionenstärke.
Das isolierte LPF und FHA kann nach weiterer Reinigung und Entgiftung zu einem nicht-toxischen Impfstoff zum Schutz gegen Pertussis formuliert werden.
Die Erfinder haben festgestellt, daß LPF und FHA bei niedriger Ionenstärke bevorzugt aus dem filtrierten Wachstumsmedium von B. pertussis an eine Vielzahl an festen, partikulären Adsorbtionsmaterialien adsorbiert werden können. Nachdem LPF und FHA aus dem Überstand des Wachstumsmediums bei niedriger Ionenstärke an die Substrate adsorbiert haben, werden sie mittels einer wässrigen Lösung mit hoher Ionenstärke vom Adsorbtionsmaterial desorbiert.
Das Desorptionsmaterial mit hoher Ionenstärke ist eine wässrige Lösung eines Salzes und/oder Puffers. Der hierin verwendete Ausdruck "Salzlösung" bezieht sich auf alle Metall- oder Ammoniumsalze, wie Kaliumnitrat, Natriumchlorid und Ammoniumsulfat, die, wenn sie in Wasser gelöst werden, in ihre Ionenbestandteile dissoziieren und hierbei die Ionenstärke der Lösung erhöhen, ohne den pH der Lösung wesentlich zu verändern. Der hierin verwendete Ausdruck "Puffer" bezieht sich auf eine chemische Verbindung, die, wenn sie in Wasser gelöst wird, in ihre Ionenbestandteile dissoziiert und hierbei die Ionenstärke der Lösung erhöht und Pufferkapazität aufweist.
Der Ausdruck "niedrige Ionenstärke", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein wässriges Medium, das eine Leitfähigkeit von 11 mS/cm oder weniger, vorzugsweise etwa 4 mS/cm, aufweist. Die Einheit mS/cm der Maßzahl ist Millisiemens pro Zentimeter. Ein Siemens (S) ist eine Einheit der Leitfähigkeit und ist das Äquivalent des inversen Widerstands (Ohm) und wird manchmal als mho bezeichnet. Der Ausdruck "hohe Ionenstärke", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein wässriges Medium, das eine Leitfähigkeit von mehr als 11 mS/cm und vorzugsweise mindestens 50 mS/cm aufweist.
Feste, partikuläre Adsorptionsmaterialien, die in der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, beinhalten Filterhilfen, wie Perlit (aus Vulkanasche stammend) und Celite (eine Diatomeenerde, die eine feste Lösung aus Dicalciumsilicat in Dicalciumaluminat sein dürfte), kieselartige Materialien, wie Sand, Cellulosen, Agarosen und Gelfiltrationsmedien, wie die Sepharosen , die Sephadexe , Ultragel und ihre Derivate.
Die Vielzahl an Matrixmaterialien, die sich in der vorliegenden Erfindung als brauchbares Adsorptionmedium herausgestellt haben, legen nahe, daß die Eigenschaften des Matrixmaterials nicht entscheidend sind, aber es eine Eigenschaft von LPF und FHA ist, daß sie unter Bedingungen mit niedriger Ionenstärke an eine große Vielzahl von Materialien binden.
Obwohl man nicht wünscht, sich bei der Erklärung des erfindungsgemäßen Verfahrens durch irgendeine bestimmte Theorie festzulegen, glaubt man, daß unter den anfänglich verwendeten Bedingungen mit niedriger Ionenstärke LPF und FHA fast schon aus der Lösung ausfallen. Wenn die Lösung mit den unlöslichen, partikulären Materialien in Kontakt kommt, wirken die Partikel des Materials als Kerne, auf denen LPF und FHA präzipitieren können. Die Resolubilisierung zur Desorption erfordert dann eine Lösung mit höherer Ionenstärke.
Nach der Desorption vom Adsorptionsmedium durch die Lösung mit der hohen Ionenstärke erhält man eine Mischung der zwei Proteine, die weiter auf anderen Materialien getrennt werden können, wie Hydroxyapatit oder anderen Ionenaustauscherharzen, um die zwei Proteine mit hohen Ausbeuten und hoher Reinheit zu erhalten. Alternativ dazu fanden wir, daß die Trennung von FHA und LPF nach der Adsorption an das Adsorptionsmedium durch die Desorption vom Adsorptionsmedium bei verschiedenen Ionenstärken erreicht werden kann. Um die bevorzugte Elution von LPF vom Adsorptionsmedium zu bewirken, wird eine Ionenstärke der Lösung von 11 mS/cm bis 20 mS/cm verwendet. Wenn LPF eluiert ist, kann FHA mit einer Ionenstärke der Lösung von mindestens 20 mS/cm, vorzugsweise mindestens 50 mS/cm eluiert werden.
Die Fähigkeit, eine Adsorption bei niedriger Ionenstärke und die anschließende Elution von LPF und FHA bei hoher Ionenstärke an herkömmlichen Gelfiltrationsmedien und anderen underivatisierten Adsorptionsmedien zu bewirken, die hierin verwendet wurden, ist vollkommen unerwartet und weicht vom derzeitigen Stand der Technik ab, bei dem Proteine nicht an Gelfiltrationsmedien adsorbiert werden und das Protein kontinuierlich unter isokratischen Bedingungen, das heißt mit einem einzelnen Puffer, eluiert wird. Die Gelmedien wurden in früheren Arbeiten wegen ihrer sehr geringen unspezifischen Proteinadsorption ausgewählt, und jetzt adsorbieren sie LPF und FHA unter den erfindungsgemäßen Bedingungen sehr gut. Es wurde durch die Erfinder gezeigt, daß FHA und LPF in einem höheren Maß an Agarose gereinigt werden können, als an derivatisierter Agarose.
Das Verfahren kann entweder als Batchprozess oder als Trennverfahren an einer Chromatographiesäule des Adsorbens mit zellfreiem Medium durchgeführt werden, das man nach dem Wachstum des Organismus erhalten hat. Wegen ihrer leichten Filtrierbarkeit, ihrer niedrigen Kosten und der akzeptierten Verwendung von Filterhilfen bei der Herstellung von pharmazeutischen Produkten, ist die Verwendung von Filterhilfen gegenüber der Verwendung von anderen Materialien, wie Gelfiltrationsmedien bevorzugt.
Die Erfinder haben weiterhin festgestellt, daß falls die an die Materialien adsorbierten Proteine vor der Elution mit einer wässrigen nicht-ionischen Detergenzlösung gewaschen werden, das LPS im Endprodukt um den Faktor 10 000 bis 100 000 auf eine Konzentration von 1 bis 10 ng/ml reduziert werden kann. Beispiele für geeignete nicht-ionische Detergenzlösungen sind Triton-X-100 in einer Konzentration von 0,005 bis 5 % (V/V), vorzugsweise 0,1 bis 1 % (V/V), und Nonidet p40 in einer Konzentration von 0,0005 bis 0,1 % (V/V), vorzugsweise 0,001 bis 0,01 % (V/V). Triton-X-100 dürfte ein Alkylphenolalkoxylat sein und Nonidet p40 dürfte ein Alkylenoxidkondensat sein.
Es wurde ebenfalls durch die Erfinder gefunden, daß gereinigtes LPF und FHA durch den Kontakt mit einem quervernetzenden Mittel, wie Glutaraldehyd und/oder Formaldehyd in Gegenwart eines Antiaggregationsmittels, wie Glycerin oder Saccharose, entgiftet werden kann, um die Ausbeute an Endprodukt zu verbessern. Das Antiaggregationsmittel ist in einem wesentlichen Anteil während des Entgiftungsverfahrens anwesend und verhindert die Aggregation und Fällung, die in Abwesenheit eines solchen Materials auftritt. Für die Entgiftung von LPF in Gegenwart von Glycerin ist Glycerin in einer Menge von 30 bis 80 % (V/V) vorhanden, vorzugsweise etwa 50 %, während für die Entgiftung von FHA Glycerin in einer Menge von 10 bis 80 % (V/V), vorzugsweise etwa 25 %, vorhanden ist. Wenn Saccharose als Antiaggregationsmittel verwendet wird, ist die Saccharose in einer Menge von 30 bis 60 % (G/V), vorzugsweise etwa 40 %, vorhanden.
In der vorliegenden Erfindung wird B. pertussis in einem Fermenter unter kontrollierten Bedingungen kultiviert. Die Kohlenstoffquellen und Wachstumsfaktoren werden kontinuierlich oder in Schüben in verschiedenen Intervallen während der Fermentation zudosiert, bis die zwei Proteine , LPF und FHA, die gewünschte Menge erreicht haben, was durch enzymgekoppelten Immunoassay (ELISA) bestimmt werden kann. Bei der Erfindung wird das Zellgemisch und das Medium aus dem Fermenter nicht sofort nachdem die Fermentation beendet ist durch chemische Mittel inaktiviert, sondern später im Reinigungsverfahren. Die Verwendung einer chemischen Entgiftung bei dieser Verfahrensstufe kann zur Aggregation der Proteine und schlechter Trennung in den Folgeschritten führen.
Der Fermenter wird dann geerntet und der Hauptteil der Zellen durch kontinuierliche Zentrifugation abgetrennt. Die verbleibenden Zellen werden dann durch Filtration mittels bekannter Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 um aus dem Überstand entfernt, was die Lösung auch sterilisiert. In der vorliegenden Erfindung ist es der Überstand, der zurückbehalten und zur Isolierung und Reinigung von LPF und FHA verarbeitet wird. Nach der Zentrifugation und Filtration wird der Überstand mittels Membranfiltration konzentriert, etwa 10-fach, auf Protein getestet und dann verdünnt, bis die Ionenstärke im erforderlichen Bereich liegt. Diese Lösung, die die LPF und FHA Proteine enthält, wird dann mit dem Adsorptionsmedium entweder im Batchverfahren oder im Chromatographieverfahren behandelt. LPF und FHA werden nach der Adsorption am Adsorptionsmedium zuerst mit einigen Volumen Puffer gewaschen, um Kontaminationen zu entfernen, und dann mit einer Lösung eines Detergenz, das den Hauptteil der Lipopolysaccharide (LPS) entfernt. Weiteres Waschen entfernt jegliche Spuren des Detergenz.
LPF und FHA können durch Elution vom Adsorptionsmittel mit Lösungen mit schrittweise steigender Ionenstärke getrennt voneinander erhalten werden, oder die zwei Proteine können zusammen mittels einer Salzlösung mit hoher Ionenstärke eluiert werden. Die Proteine können auf einer Chromatographiesäule eines Materials, wie Hydroxyapatit, weiter gereinigt werden. Die Proteine werden von einer solchen Säule durch Lösungen mit verschiedener Ionenstärke nach vorherigem Waschen eluiert. Die getrennten Proteine werden dann in Gegenwart eines Antiaggregationsmittels entgiftet, um hohe Ausbeuten von entgiftetem Protein zu erzielen. Nach der Entfernung der Zusätze werden die entgifteten Proteine durch Filtration sterilisiert und können nach einem Test in den erforderlichen Anteilen gemischt werden, um eine Lösung zu erhalten, die als Impfstoff gegen Pertussis verwendet werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um im großen Maßstab eine Trennung von LPF und FHA mittels einer Chromatographiesäule aus Perlit zu bewirken, was derzeit die beste den Anwendern bekannte Weise für die Bewirkung der Trennung und die Gewinnung von gereinigtem LPF und FHA ist.
Konzentriertes B. pertussis Fermentationsmedium wird entsprechend einer Leitfähigkeit von 4 mS oder weniger auf eine niedrige Ionenstärke verdünnt und auf eine Säule mit gepacktem Perlit aufgetragen, um eine Proteinbeladung von 1 bis 5 mg, vorzugsweise 2 bis 3 mg pro Milliliter gepacktem Perlit bereitzustellen. Die gepackte Perlitsäule ist gewöhnlich 15 bis 18 cm hoch und weist einen Durchmesser von 10 bis 45 cm auf.
Das verdünnte Fermentationsmedium wird mit der Perlitsäule bei einer linearen Flußrate von 50 bis 200 cm/h, vorzugsweise etwa 100 cm/h in Kontakt gebracht. Die an den Perlit adsorbierten Proteine sind fast ausschließlich LPF und FHA, wobei die meisten kontaminierenden Proteine und das LPS durch die Säule laufen.
Die Säule wird dann mit 2 bis 10 Säulenvolumen eines Puffers gewaschen, der 10 bis 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0 enthält. Ein anschließender Waschschritt mit einem wässrigen, nicht-ionischen Detergenz, typischerweise etwa 5 Säulenvolumen einer 0,5 %igen (V/V) Triton X-100 Lösung in 50 mM Tris HCl Puffer bei pH 8,0, reduziert den LPS Gehalt der Proteine um einen Faktor von etwa 100 auf eine Gesamtreduktion des LPS/LPF Verhältnisses zwischen 10 000 und 100 000. Anschließendes Waschen der Säule mit weiteren Volumen, vorzugsweise etwa 5 Volumen Puffer mit 50 mM Tris HCl bei pH 8,0, entfernt das nicht-ionische Detergenz.
LPF wird durch Zusammenbringen der Säule mit einer Pufferlösung, beispielsweise 5 Volumen 50 mM Tris HCl bei pH 8,0, die 0,1 bis 0,2 M Natriumchlorid, vorzugsweise etwa 0,12 M, enthält von der Säule eluiert. FHA wird als nächstes durch Zusammenbringen der Säule mit einer Pufferlösung, beispielsweise 5 Volumen 50 mM Tris HCl bei pH 8,0, die mindestens 0,2 M Natriumchlorid, vorzugsweise etwa 0,6 M, enthält von der Säule eluiert.
Die eluierten Lösungen werden auf den Proteingehalt getestet. Durch dieses Verfahren wurden LPF und FHA mit Wiederfindungsraten von etwa 60 bis 65 % beziehungsweise 65 bis 70 % der anfänglichen Mengen dieser Proteine im Medium erhalten.
Weitere Reinigung von LPF und FHA kann durch Verwendung einer Säule aus gepackten Hydroxyapatit erreicht werden, die 5 bis 8 cm hoch ist und einen Durchmesser von 5 bis 30 cm aufweist. Die Säule wird vor dem Gebrauch gewaschen und äquilibriert. Das LPF enthaltende Eluat wird auf die Säule bei einer Beladung von 0,5 bis 1 mg/ml gepacktem Gel bei einer linearen Flußrate von 15 bis 25 cm/h aufgetragen, um LPF daraus zu adsorbieren.
Die Säule wird mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise 5 Säulenvolumen 30 mM Kaliumphosphatpuffer bei pH 8,0 gewaschen, worauf LPF mit 5 bis 10 Säulenvolumen eines Elutionsmediums eluiert wird, beispielsweise mit 0,1 bis 0,3 M Natriumchlorid, vorzugsweise 0,225 M enthaltendem 75 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0.
Das Verfahren kann für den FHA-enthaltenden Eluenten wiederholt werden, wobei die Elution mit einem wässrigen Elutionsmedium, beispielsweise 200 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 bewirkt wird, das mindestens 0,2 M, vorzugsweise etwa 0,6 M Natriumchlorid enthält.
Bei diesen Hydroxyapatitreinigungsverfahren liegen die typischen Ausbeuten des reinen Proteins zwischen 80 und 100 %, wobei die jeweiligen Proteine eine Reinheit von mindestens 90 % aufweisen.
Die Entgiftung des weiter gereinigten LPF und FHA sollte durchgeführt werden, um diese Materialien in einer Form bereitzustellen, die für die Formulierung als nicht-toxischer Impfstoff geeignet ist. Es ist bevorzugt, die Entgiftung des LPF Proteins mittels Glutaraldehyd in Gegenwart von Glycerin durchzuführen, während es zur Durchführung der Entgiftung des FHA Proteins bevorzugt ist, Formaldehyd in Gegenwart von Glycerin zu verwenden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiele

Die Methoden der Proteinbiochemie, der Fermentation und der Tests, die verwendet werden, aber in dieser Beschreibung und den Beispielen nicht ausdrücklich beschrieben sind, werden häufig in der wissenschaftlichen Literatur zitiert und sind Fachleuten gut bekannt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert das Wachstum von B. pertussis in Fermentern.
Bordatella pertussis wurde in einem 250 l Medium (modifiziertes Stainer-Scholte Medium) enthaltenden Fermenter geimpft. Während der Fermentationsperiode wurden Mononatriumglutamat (2,18 kg) und die Wachstumsfaktoren Glutathion (41 g), Eisensulfat (2,7 g), Calciumchlorid (5,5 g), Ascorbinsäure (109 g), Niacin (1,1 g) und Cystein (10,9 g) in Intervallen zugegeben, um die Ausbeuten an LPF zu erhöhen. Am Ende der 48 Stunden dauernden Fermentationsperiode ließ man das Medium durch eine kontinuierliche Zentrifuge laufen, um den Hauptteil der Zellen zu entfernen. Diese Suspension, die sowohl LPF als auch FHA in Lösung enthält, wurde weiter durch Mikrofiltration mittels Celluloseacetatmembranen (0,22 um Porengröße) geklärt. Das sterilisierte Filtrat wurde mittels einer 20 000 NML Membran etwa 10fach konzentriert und dann durch die Farbstoffbindungsmethode auf Protein getestet.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Isolierung von LPF und FHA mittels mehrerer unterschiedlicher Materialien.
Es wurden mehrere 1 Milliliter Säulen mit verschiedenen Materialien gepackt und mit 50 mM Tris HCl bei pH 8,0, 10 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 oder Wasser äquilibriert. Die Materialien beinhalteten Orange A-, Blue A-, Green A- Red A-Agarosen*, Blue Sepharose *, Blue B-, Reactive Blue 4-, Cibacron Blue 3GA-, Reactive Brown 10-, Reactive Green 19-, Reactive Yellow 86-Sepharose *, underivatisierte Agarose, Ultragel ACA44 , Sephadex G50 , Sepharose 6B , Sepharose CL4B , S-Sepharose *, Q-Sepharose *, Cellulosesulfat*, QAE-Cellulose*, CM-Cellulose, Perlit und Celite (* derivatisiertes Material).
Das B. pertussis Kulturmedium wurde zentrifugiert, durch eine 0,2 um Membran sterilfiltriert und etwa 10fach durch Ultrafiltration mittels 20 kD NML Membranen konzentriert. Die Mediumkonzentrate wurden so verdünnt, daß die Ionenstärke weniger oder gleich 4 mS/cm betrug. Proben zwischen 2 und 10 ml wurden auf die Säulen mittels Beladung durch Schwerkraft aufgetragen und dann ausgiebig mit 10 mM Kaliumphosphat, gefolgt von 50 mM Tris HCl Puffer bei pH 8,0 gewaschen. Jede Säule wurde mit 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 eluiert, das entweder 0,6 M oder 1,0 M Natriumchlorid enthielt. Die Fraktionen wurden durch Absorbtion bei 280 nm und auf SDS-PAGE analysiert. Alle Materialien adsorbierten LPF und FHA. Das eluierte LPF und FHA war hoch gereinigt.
In einem ähnlichen Experiment mittels weitem Quartzsand wurde eine Säule mit 1,5 cm Durchmesser und einer Höhe von 18 cm gewaschen und mit demselben verdünnten Mediumkonzentrat beladen, um LPF und FHA daraus zu adsorbieren, und erneut gewaschen. Die Säule wurde dann zuerst mit 0,1 M Natriumchlorid enthaltendem 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 eluiert, gefolgt von einem 1,0 M Natriumchlorid enthaltendem Tris Puffer, um zuerst LPF und dann FHA zu eluieren. Das getrennt eluierte LPF und FHA war jeweils hoch gereinigt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert die Trennung von LPF und FHA im großen Maßstab mittels einer Chromatographiesäule aus Perlit.
Das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Mediumkonzentrat wird mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von etwa 4 mS/cm so verdünnt, daß die Beladung am Ende etwa 3 mg Rohprotein pro Milliliter gepacktem Perlit betrug. Die gepackte Perlitsäule mit einer Höhe von 18 cm und einem Durchmesser von 10 cm wurde mit 1,4 l zur Injektion geeignetem Wasser (WFI) vorgewaschen. Das verdünnte Konzentrat wurde bei einer linearen Flußrate von 100 cm/h auf die Säule aufgetragen. Die an das Perlit gebundenen Proteine waren fast ausschließlich LPP und FHA, wobei das meiste kontaminierende Protein und das Lipopolysaccharid (LPS) durch die Säule ging. Die Säule wurde mit 1,4 l eines 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 enthaltenden Puffers gewaschen. Ein anschließender Waschschritt mit Detergenz, bestehend aus 1,4 l einer 0,5 % (V/V) Triton X-100 Lösung in 50 mM Tris HCl Puffer bei pH 8,0, reduzierte den LPS Gehalt um einen weiteren Faktor von 100 auf eine Gesamtreduktion des LPS/LPF Verhältnisses zwischen 10 000 bis 100 000. Die Säule wurde dann mit weiteren 1,4 l 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 gewaschen, um das Triton X-100 zu entfernen. LPF wurde dann mit 0,12 M Natriumchlorid enthaltendem 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 von der Säule eluiert. FHA wurde mittels 0,6 M Natriumchlorid enthaltendem 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 von der Säule eluiert. Etwa 1,4 l jedes Elutionspuffers wurden verwendet. Die Lösungen wurden dann durch den Farbstoffbindungstest auf Protein getestet. Die Ausbeuten an LPF und FHA betrugen, basierend auf ELISA Werten, 60 % beziehungsweise 65 %.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert die Adsorption von LPF und FHA an Perlit im Batch.
B. pertussis Mediumkonzentrate (60 ml) wurden 4fach mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von etwa 4 mS/cm verdünnt und Perlit (2g) wurde zugegeben. Das Gemisch ließ man langsam bei 4ºC für 3 Stunden rotieren. Das Gemisch wurde auf einem gesinterten Glasfilter vakuumfiltriert und der restliche Perlit wurde mit 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 (20 ml) in den Filter gewaschen. Der Perlit wurde mit 4 x 50 ml des Tris Puffers gewaschen und dann mit 3 x 20 ml 1,0 M Natriumchlorid enthaltendem 50 mM Tris HCl bei pH 8,0 eluiert. Die Eluate wurden vereinigt und mittels ELISA Test getestet. Die Ausbeuten an LPF lagen bei mindestens 65 %.

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die weitere Reinigung von LPF auf Hydroxyapatit.
Hydroxyapatit wurde in eine Säule gepackt, die einen Durchmesser von 5 bis 30 cm und eine Höhe von 6 cm hatte. Die Säule wurde mit 200 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0, 1 M Kaliumchlorid, 0, 5 % Triton X-100 gewaschen und mit 10 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 vor dem Gebrauch äquilibriert. Die, wie in Beispiel 3 beschrieben, gewonnene LPF Lösung wurde mit einer Beladung von etwa 0,5 mg Protein/ml gepacktem Gel bei einer linearen Flußrate von etwa 20 cm/h auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 500 ml 30 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 gewaschen. LPF wurde mit 1 l 0,225 M Natriumchlorid enthaltendem 75 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 eluiert. Der erhaltene LPF war mindestens zu 90 % rein. Der LPF wurde durch den Farbstoffbindungstest auf Protein getestet. Die Ausbeute an LPF betrug etwa 90 % für diesen Schritt.

Beispiel 6

Dieses Beispiel erläutert die weitere Reinigung von FHA auf Hydroxyapatit.
Das Hydroxyapatit wurde in eine Säule derselben Größe gepackt und gewaschen, wie sie in Beispiel 5 beschrieben wurde. Die FHA Fraktion der in Beispiel 3 beschriebenen Perlittrennung wurde bei einer linearen Flußrate von 20 cm/h und einer Beladung von 0,5 mg Protein/ml gepacktem Gel auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit jeweils 500 ml 30 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0, 0,5 % (V/V) Triton X-100 enthaltendem 30 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 und 30 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 gewaschen. Jeglicher in der Fraktion verbliebener LPF wurde zuerst mit 500 ml 85 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 eluiert, und das FHA wurde dann mit 0,6 M Kaliumchlorid enthaltendem 200 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 eluiert. Das erhaltene FHA war mindestens zu 90 % rein. Das FHA wurde durch die Lowry-Methode auf Protein getestet. Die Ausbeute an FHA betrug für diese Säule etwa 90 %.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Entgiftung von LPF mit Glutaraldehyd.
Der gereinigte LPF, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, in 0,22 M Natriumchlorid enthaltendem 75 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 wurde mit einem gleichen Volumen Glycerin auf eine Proteinkonzentration von etwa 200 ug/ml verdünnt. Die Lösung wurde auf 37ºC aufgeheizt und durch die Zugabe von Glutaraldehyd in einer Endkonzentration von 0,5 % (G/V) entgiftet. Das Gemisch wurde für 4 h auf 37ºC gehalten und anschließend wurde Asparaginsäure (1,5 M) bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugegeben. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert und dann mit 10 Volumen 0, 15 M Natriumchlorid enthaltendem 10 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 diafiltriert, um sowohl das Glycerin, als auch das Glutaraldehyd zu entfernen. Das LPF Toxoid wurde durch eine 0,2 um Membran sterilfiltriert.

Beispiel 8

Dieses Beispiel erläutert die Entgiftung von FHA mit Formaldehyd.
Das gereinigte FHA, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, in 0,6 M Natriumchlorid enthaltendem 200 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 wurde mit Glycerin bis auf eine Endkonzentration von 25 % V/V verdünnt. Die Proteinkonzentrationen betrugen auf den Lowry-Test basierend etwa 500 ug/ml. Die FHA Lösung wurde auf 37ºC aufgeheizt und es wurde eine 1,5 M Lösung L-Lysin HCl bei pH 8,0 bis zu einer Endkonzentration von 50 mM zugegeben. Es wurde Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,25 % V/V zugegeben. Die Entgiftung wurde bei 37ºC für eine Zeitspanne von 6 Wochen durchgeführt. Das erhaltene Toxoid wurde dann gegen 10 Volumen 0, 5 M Natriumchlorid enthaltendes 10 mM Kaliumphosphat bei pH 8,0 diafiltriert, um sowohl das Glycerin, wie auch das Formaldehyd zu entfernen. Die Toxoidlösung wurde durch eine 0,2 um Membran sterilfiltriert.

Beistiel 9

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von entgifteten LPF und FHA zur Herstellung schützender Antikörper.
Meerschweinchen (SPF) wurden auf Pertussisantikörpertiter voruntersucht, und nur die Tiere, die niedrige Hintergrundtiter aufwiesen, wurden im Experiment verwendet.
Den Tieren wurden 0,5 ml Testmaterial am Tag null injiziert. Die in den Tests verwendeten Testmaterialien waren adsorbierte und nicht-adsorbierte, gereinigte und entgiftete LPF und FHA Produkte, die jeweils in den Verfahren der Beispiele 7 und 8 hergestellt wurden, und der herkömmliche Ganzzellimpfstoff.
Vier Wochen nach der Injektion ließ man die Tiere bluten und die Seren wurden mittels ELISA auf PT und FHA Antikörper getestet. Die Seren wurden auch auf CHO Antitoxinaktivität getestet. Am Tag 35 wurden die Tiere mit derselben Antigendosis geboostert und schließlich ließ man die Tiere am Tag 49 bluten und testete die Antiseren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I gezeigt: Tabelle 1 Immunogenität von Pertussistoxoid in Meerschweinchen bei einer Dosis von 25 ug ELISA x 10&supmin;³ Protein ug CHO Einheiten (nicht-adsorbiert) (adsorbiert) Ganze Zelle humane Dosis Blutung
Alle Ergebnisse sind reziproke reaktive Titer.
Die in der Tabelle dargestellten Ergebnisse zeigen, daß beim Vergleich mit dem herkömmlichen Ganzzellimpfstoff sowohl die durch die erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellten adsorbierten als auch die nicht-adsorbierten gereinigten und entgifteten LPF und FHA Proteine beachtenswert höhere Antikörpertiter ergeben.

Beispiel 10

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung der gereinigten Antigene im Mausschutztest.
Taconischen Mäusen (15 bis 17 g) wurden am Tag null 0,5 ml der Testprobe in drei Dosen intraperitoneal injiziert. Jede Dosis wurde in 16 Mäuse injiziert. Am Tag 14 wurden die Mäuse mit einer intracerebralen Injektion einer Standarddosis von B. pertussis provoziert. Zur selben Zeit wurden auch Kontrollmäuse injiziert, um die Wirksamkeit der Provokation sicherzustellen. Drei Tage nach der Provokation wurde die Anzahl der verstorbenen Tiere jeden Tag bis zu und einschließlich Tag 28 registriert. Am Tag 28 wurden auch paralysierte Mäuse und Mäuse mit cerebralem Ödem als tot registriert.
Die Ergebnisse wurden als ED&sub5;&sub0; aufgezeichnet, das der Dosis entspricht, bei der die Hälfte der Mäuse die Provokation überleben. Diese wurde durch ein Computerprogramm ermittelt, nachdem die Überlebenden geteilt durch die Gesamtzahl der Mäuse in jeder Kategorie bei jeder Dosis aufgetragen wurden.
Das Ergebnis dieses Experiments zeigte, daß die ED&sub5;&sub0; einer Mischung von LPF und FHA weniger als [1 ug LPF + 2 ug FHA] betrug und daher eine Mischung der zwei gereinigten Proteine gegen die Krankheit schützte.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung proteinartiger Materialien, die Lymphocytose-fördernder Faktor (LPF) und filamentöses Hämaglutinin (FHA) genannt werden, aus einem Wachstumsmedium, in dem der Organismus Bordatella pertussis gezogen wurde, worin (a) das Wachstumsmedium, falls nötig verdünnt, mit einer Leitfähigkeit von 11 mS/cm oder weniger mit einem underivatisierten, festen, partikulären Adsorptionsmedium zusammengebracht wird, um LPF und FHA aus dem Wachstumsmedium selektiv zu adsorbieren, und (b) die adsorbierten proteinartigen Materialien durch Zusammenbringen dieses Adsorptionsmediums mit einem wässrigen Medium, das eine Leitfähigkeit größer als 11 mS/cm aufweist und zur Bewirkung dieser Desorption ausreicht, desorbiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Adsorptionsmedium eine Filterhilfe, ein kieselartiges Material, eine Cellulose, eine Agarose oder ein Gelfiltrationsmedium ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Adsorptionsmedium ein Perlit ist, der aus vulkanischer Asche stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Adsorptionsmedium eine Diatomeenerde ist, die eine feste Lösung aus Dicalciumsilicat in Dicalciumaluminat darstellt.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das (verdünnte) Wachstumsmedium eine Leitfähigkeit von 4 mS/cm oder weniger aufweist, wenn es mit dem Adsorptionsmedium zusammengebracht wird.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin FHA und LPF in einem einzigen Desorptionsschritt vom Adsorptionsmedium desorbiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das wässrige Medium eine Leitfähigkeit von mindestens 50 mS/cm aufweist, wenn es mit dem Adsorptionsmedium zusammengebracht wird, um die Desorption zu bewirken.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Adsorptionsmedium zuerst mit einem wässrigen Medium zusammengebracht wird, das eine zur selektiven Desorption von LPF vor FHA ausreichende Leitfähigkeit aufweist und dann mit einem wässrigen Medium zusammengebracht wird, das eine zur Desorption von FHA ausreichende Leitfähigkeit aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das zuerst erwähnte wässrige Medium eine Leitfähigkeit von 11 mS/cm bis 20 mS/cm aufweist und das als zweites erwähnte wässrige Medium eine Leitfähigkeit von mindestens 20 mS/cm aufweist.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin nach dem Adsorptionsschritt und vor dem Desorptionsschritt dieses Adsorptionsmedium mit einer wässrigen nicht-ionischen Detergenzlösung zusammengebracht wird, die für die Elution von Lipopolysacchariden (LPS) vor LPF und FHA vom Adsorptionsmedium selektiv ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die nicht-ionische Detergenzlösung zur Herabsetzung der LPS Kontamination von LPF und FHA auf 1 bis 10 ng/ml wirksam ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin das nicht-ionische Detergenz ein Alkylphenolalkoxylat oder ein Alkylenoxidkondensat ist.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin anschließend an den Desorptionsschritt das desorbierte LPF und FHA einer weiteren Reinigung mittels Hydroxyapatit unterzogen werden.

14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin anschließend an den Desorptionsschritt das gereinigte proteinartige Material durch Zusammenbringen mit einem quervernetzenden Mittel in Gegenwart eines Antiaggregationsmittels entgiftet wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Antiaggregationsmittel Glycerin oder Saccharose ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das Antiaggregationsmittel Glycerin ist, das zur Entgiftung von LPF in einer Menge von 30 bis 80 % (V/V) oder zur Entgiftung von FHA in einer Menge von 10 bis 80 % (V/V) vorkommt.

17. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Pertussis, das die Herstellung eines entgifteten proteinartigen Materials mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und die Sterilisierung und Formulierung dieses entgifteten proteinartigen Materials als Impfstoff umfaßt.

18. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Pertussis, das die Herstellung eines entgifteten proteinartigen Materials mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 14 bis 16 und die Sterilisierung und Formulierung dieses entgifteten proteinartigen Materials als Impfstoff umfaßt.