DE69626022T3

DE69626022T3 - Verfahren zur industriellen herstellung eines japanischen enkephalitis impfstoffes, und so erhaltener impfstoff

Info

Publication number: DE69626022T3
Application number: DE1996626022
Authority: DE
Inventors: Bernard Fanget; Alain Francon; Pierre Heimendinger
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-29
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2016-07-30
Also published as: US6149917A; CA2228128C; DE69626022D1; ATE231729T1; KR19990036028A; CA2228128A1; EP0841942A1; EP0841942B2; CN1194584A; AU6704196A; DE69626022T2; NZ315357A; AU709584B2; WO1997004803A1; EP0841942B1; JPH11510151A; CN1122531C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine zur Vorbeugung der Japanischen Encephalitis auf der Basis des Japanischen Encephalitis-Virus (JEV) und insbesondere einer Vakzine, die am Menschen anwendbar ist. Die Erfindung betrifft auch die Behandlung mit der nach diesem Verfahren erhaltenen Vakzine.
Das Virus der Japanischen Encephalitis, dessen Übertragungsvektor eine Stechmücke ist, ist der Grund für schwere Infektionen, die Japanische Encephalitis genannt werden, in zahlreichen Ländern des Fernen Ostens, sowie in anderen Gebieten der Welt.
Es sind Vakzinen gegen die Japanische Encephalitis bekannt, die nach Verfahren erhalten werden, die darin bestehen, das JEV-Virus auf intrakranialem Wege an die Jungmaus zu verabreichen und die infizierten Gewebe zu gewinnen. Die Gewebeemulsion, die man erhält, wird anschließend gereinigt, im allgemeinen durch Ausfällungsmethoden, insbesondere mit Protamin. Es wurden auch andere Techniken zur Reinigung derartiger Gewebepräparate in der Literatur vorgeschlagen, wie die Techniken der Ultrafiltration, der Filtration und des Zentrifugierens, oder der Ausfällung mit Polyethylenglykol, wobei diese Techniken miteinander oder mit Techniken der Gelfiltration, der Chromatographie an Cellulosesulfat oder an vernetztem Polysaccharidsulfat kombiniert werden können ( JP-B-65 000 611 , JP-A-53 133 627 , JP-A-50 048 118 , JP-A-2 223 531 , US-A-4 725 546 , JP-A-49 020 322 und B-81 005 204 , JP-B-67 025 408 ).
Im Stand der Technik werden die viralen Präparate inaktiviert, wie die Weltgesundheitsorganisation empfiehlt, mit chemischen Mitteln, wie Formalin, nach standardisierten Verfahren, nämlich eine langandauernde Inaktivierung während 50 bis 60 Tagen bei +4°C bei einer Formalinkonzentration von 1/2000 aufgrund der Instabilität der Viren bei höheren Temperaturen in dieser Umgebung.
Die so erhaltenen im Handel befindlichen Vakzinen sind wirksam, sie sind jedoch schwierig und kostspielig herzustellen, zu reinigen und zu inaktivieren. Sie können darüber hinaus zu Nebenreaktionen führen, aufgrund von Verunreinigungen, die von den Jungmausgeweben stammen, wodurch manchmal die Anwendung begrenzt wird.
Es besteht daher ein Bedürfnis zur Herstellung einer Vakzine nach anderen Techniken industriellerer Natur und insbesondere unter Anwendung einer Multiplikation und Propagation des Virus auf einer Zelllinie. Dennoch ist die Herstellung einer Vakzine in großen Mengen nach sehr industrialisierten Methoden wesentlich schwieriger als im Falle der Multiplikation auf intrakranialem Wege und dies nicht nur aufgrund der wesentlichen Mengen, die behandelt werden müssen, sondern auch wegen Schwierigkeiten, hohe Ausbeuten zu erzielen und zu steuern, sowie aufgrund von Reinigungsproblemen, die sich durch Verunreinigungen ergeben, die von Zellen oder dem viralen Multiplikationsmilieu stammen, die bereits genannt wurden.
Im Stand der Technik ist es bekannt, dass das Virus der Japanischen Encephalitis sich auf verschiedenen Zellkulturen verbreiten kann, einschließlich von Kulturen von Zelllinien, insbesondere von VERO-Zellen. Jedoch ermöglichen es die bekannten Kulturmethoden nicht, ausreichende Ausbeuten unter den Bedingungen einer industriellen Kultur im großen Maßstab zu erzielen, die allein eine Produktion unter vernünftigen Kosten ermöglicht. Darüber hinaus wurde im Stand der Technik keine Methode zur Reinigung in hohem Ausmaß für die viralen Präparate beschrieben, die von der Propagation und Multiplikation auf Zelllinien stammen.
Ziel der Erfindung ist es, diese Nachteile auszuräumen und ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine gegen Japanische Encephalitis bereitzustellen, das in großem Maßstab unter sicheren Bedingungen rasch und wirtschaftlich durchgeführt werden kann und das die Erzielung einer wirksamen Vakzine von sehr hoher Reinheit bei einer sehr guten industriellen Ausbeute ermöglicht.
Um diese Ziele zu erreichen, ist der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur industriellen Herstellung einer Vakzine gegen Japanische Encephalitis, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es folgende Stufen umfasst:

a) Kultur von Zellen, die von einer Zelllinie stammen,
b) Inokulieren der so erhaltenen Zellkultur mit dem Virus der Japanischen Encephalitis in Anwesenheit eines Virus-Multiplikations-Mediums,
c) Propagation und Multiplikation des Virus auf den Zellen,
d) Ernte des Virus-Multiplikations-Mediums, das eine Suspension der erhaltenen durch die Zellen erzeugten Viren darstellt,
e) Reinigung der Virussuspension in mindestens einer Ionenaustauscherchromatographie-Stufe, einer Stufe der Adsorptionschromatographie und einer Stufe der Gelpermeation,
f) Formulieren und pharmazeutische Bereitung der Virussuspension, um eine Konservierung bis zur Verwendung sicherzustellen.

Gemäß einem speziellen Merkmal der Erfindung entspricht die Menge des inokulierten Virus einem Vielfachen der Infektion unter 0,1. Somit erhält man eine gute Ausbeute für die Propagation und virale Multiplikation.
Gemäß einem speziellen Charakteristikum der Erfindung umfasst das Verfahren darüber hinaus eine Inaktivierungsstufe für die virale Suspension vor oder nach der Reinigungsstufe e). Es ist so möglich, eine inaktivierte Vakzine herzustellen, unter Ausnutzung der Propagation und viralen Multiplikation eines virulenten Stammes.
Gemäß einem Charakteristikum des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Inaktivierung mit einem chemischen Mittel bei Raumtemperatur durchgeführt. So erfolgt die Inaktivierung rasch.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform besteht das Verfahren darin, eine Zelllinie VERO zu verwenden, um die virale Multiplikation sicherzustellen. Es ist so möglich, gute Ausbeuten zu erzielen, da diese Zellen sehr tolerant gegenüber dem Virus der Japanischen Encephalitis sind.
Gemäß einem weiteren Charakteristikum zur Ausführung der Erfindung besteht das Verfahren darin, die virale Suspension zu reinigen, wobei man folgende Stufen durchführt:

• Ionenaustauscherchromatographie,
• Adsorptionschromatographie,
• Gelpermeation.

Es ist so möglich, eine Vakzine mit sehr hohem Reinheitsgrad zu erhalten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besteht das Verfahren unter anderem darin, nach der Erntestufe d) erneut in ein neues virales Multiplikationsmedium einzuführen, eine ausreichende Zeit abzuwarten, um erneut die Multiplikation des Virus zu ermöglichen und eine neue Ernte des viralen Multiplikationsmediums durchzuführen.
Man kann so eine wesentliche Anzahl an Ernten, ausgehend von der gleichen Zellkultur, erzielen.
Es wurde ebenfalls eine Vakzine beschrieben, die erhalten wurde durch Kultur auf Zellen, die von einer Zelllinie stammen, die dadurch charakterisiert ist, dass sie das Virus der Japanischen Encephalitis umfasst und dadurch, dass der Gehalt an zellulärer DNA unter 100 pg/Dosis liegt.
Eine derartige Vakzine zeigt gleichzeitig die Wirksamkeit und die notwendige Sicherheit, was die viralen Verunreinigungen, wie Proteine, betrifft, um in systematischer Weise jeglicher Person verabreicht werden zu können, die in Kontakt mit dem Virus kommen kann.
Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Erfindungsgemäß kann man die Zellkultur entweder in einem Fermentor oder in üblicher Weise in Flaschen (Boîtes de Roux, rollende Flaschen, Multiray^TM, Cell-Cube^TM...) durchführen.
Vorzugsweise jedoch bedient man sich eines Fermentors mit großem Volumen (500 bis 2000 l), der Mikroträger enthält, wie ein Zell-Kulturmedium, in den man ein Zellinokulum einer Zelllinie einführt, die tolerant für das Virus der Japanischen Encephalitis ist; es kann sich um BHK 21-Zellen (Babyhamster-Niere) oder auch um VERO-Zellen handeln.
Die Mikroträger, die die Kultur in Suspension in einem Fermentor ermöglichen, können unterschiedliche Mikroträger sein, die bereits für einen derartigen Einsatz bekannt sind; man kann insbesondere Teilchen von Cytodex 1^TM mit einer Konzentration von 1 bis 3 g/l des Kulturmediums nennen, wie es speziell für die Kultur von VERO-Zellen zweckmäßig ist. Die Dauer, Temperatur und anderen Kulturbedingungen und insbesondere die Zusammensetzung des Kulturmediums sind der Funktion und der Natur der VERO-Zellen auf Mikroträgern von Cytodex 1^TM angepasst, wobei eine Dauer von vier Tagen geeignet war, um ein gutes Zellwachstum zu erzielen und so das Inokulieren des Virus vor der stationären Phase der Kultur zu ermöglichen. Man ersetzt daraufhin das Kulturmedium durch ein virales Multiplikationsmedium und man führt in den Fermentor ein Virus inoculum der Japanischen Encephalitis mit einer berechneten Menge, um einen geringen Wert für die Multiplizität der Infektion (oder MOI für die Multiplizität der Infektion) zu erzielen, bei der es sich um das Verhältnis der Menge der eingebrachten viralen Teilchen zur Anzahl der vorhandenen Zellen handelt.
Die Multiplizität liegt vorzugsweise unter etwa 0,1 und noch bevorzugter unter 0,01.
Der verwendete virale Stamm kann ein abgeschwächter Stamm sein, wie der Stamm SA 14-14-2 oder jeder bekannte virulente immunogene Stamm, wie der Stamm Nakayama oder Beijing. Der Stamm P₃ aus dem 88. Durchlauf, geliefert von der NVSI (National Vaccine and Serum Institute, Beijing) ist für die Zwecke der Erfindung besonders geeignet.
Das zur Virus-Multiplikation verwendete Milieu ist ein übliches Medium, wie MEM, wobei es wichtig ist, dass die Menge der Proteine so stark wie möglich verringert ist. Man verwendet vorzugsweise ein Medium, dessen Konzentration an Proteinen, bei denen es sich gewöhnlich um Humanalbumin handelt, unter 5 g/l, liegt. Vorzugsweise verwendet man sogar ein Kulturmedium, das völlig frei von Proteinen ist.
Die zur Propagation und viralen Multiplikation benötigte Zeit kann durch Überwachen des Infektionstiters bestimmt werden. Man geht davon aus, dass eine Virusernte wirksam erzielt werden kann, wenn der Titer LD 50/ml in der Größenordnung von 10⁷ oder 10⁸ liegt. Die Ernte wird durch einfache Entnahme des viralen Multplikationsmediums, welches die durch die Zellen erzeugten Viren enthält, durchgeführt. Vorteilhafterweise führt man nach der Entnahme des viralen Multiplikationsmediums erneut in den Fermentor mit neuem Medium ein, um eine neue Multiplikation des Virus zu ermöglichen, was zu einer erneuten Ernte führt. Man kann so leicht bis zu acht aufeinander folgende Ernten in dem gleichen Fermentor, ausgehend von der gleichen Zellkultur, erzielen. Die notwendige Zeit für die Propagation und Multiplikation des Virus zur Erzielung einer Dosis LD 50/ml von 10⁷ oder 10⁸ beträgt im allgemeinen zwei bis drei Tage; man führt vorzugsweise eine erste Ernte drei Tage nach der Virus-Inokulation durch und anschließend aufeinander folgende Ernten, alle zwei bis drei Tage.
So kann ein vollständiger Zyklus in einem Fermentor, aufgeteilt auf 23 Tage, in folgender Weise andauern:

• T0: Beginn der Zellkultur auf den Mikroträgern in dem Fermentor,
• T4: Ersatz des Zellkulturmediums durch virales Multiplikationsmedium und Inokulieren des Virus,
• T7: erste Ernte,
• T9: zweite Ernte,
• T11: dritte Ernte,
• T14: vierte Ernte,
• T16: fünfte Ernte,
• T18: sechste Ernte,
• T21: siebte Ernte,
• T23: achte Ernte.

Die erhaltenen verschiedenen Ernten können anschließend getrennt oder gemischt behandelt werden.
Die Behandlung besteht in einer Reinigung und einer Inaktivierung, wobei die Inaktivierung vor oder nach der Reinigungsstufe durchgeführt werden kann.
Bei der Inaktivierung handelt es sich um eine unumgängliche Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn der zu Beginn verwendete Virusstamm ein virulenter Stamm ist; wenn dagegen der verwendete Stamm für die virale Multiplikation ein abgeschwächter Stamm ist, wie der Stamm SA 14-14-2, kann diese Inaktivierungsstufe entweder ausgelassen werden oder durchgeführt werden, um die besten Sicherheitsvorkehrungen zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß bewirkt man eine Inaktivierung mit chemischen Mitteln bei Raumtemperatur. Unter Raumtemperatur gemäß der Erfindung versteht man eine Temperatur, die weit über +4°C liegt, bei der es sich um die Temperatur handelt, die üblicherweise zur Inaktivierung des JEV-Virus verwendet wird. Diese Temperatur kann vorteilhaft zwischen 20 und 37°C liegen und man bevorzugt eine Temperatur in der Größenordnung von 25°C. Es wurde tatsächlich festgestellt, dass das Virus bei dieser Temperatur rasch inaktiviert wird und man konnte unter anderem feststellen, dass überraschenderweise das in dem viralen Multiplikationsmedium enthaltene Virus trotz der erhöhten Temperatur stabil ist; diese sehr kurze Inaktivierungszeit ist ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens vom industriellen Standpunkt her gesehen.
Die chemischen Mittel, die zur Inaktivierung verwendet werden, können insbesondere Formalin oder β-Propiolacton sein; Formalin ist bevorzugt. Man kann die Inaktivierung beispielsweise mit Formalin bei 25 oder bei 37°C während 14 Tagen oder weniger durchführen; vorzugsweise liegt die Dauer bei mindestens 7 Tagen. Vorteilhaft kann beim erfindungsgemäßen Verfahren die verwendete Formalinkonzentration unter der zur Inaktivierung des JEV-Virus üblicherweise verwendeten liegen; sie kann beispielsweise in der Größenordnung von 1/2000 bis 1/8000, insbesondere von 1/4000, liegen.
Es ist auch möglich, nacheinander in zwei unterschiedlichen Inaktivierungsstufen vorzugehen, wobei beispielsweise zwei unterschiedliche chemische Mittel eingesetzt werden können.
Es ist auch möglich, vor dieser Inaktivierungsstufe eine Filtration jeder Ernte vorzunehmen, um Zellbruchstücke (Proteine, Nukleinsäuren ...) zu eliminieren, sowie eine Konzentration so vorzunehmen, um den Gehalt an Virus und den Gehalt an Proteinen des flüssigen Mediums zu erhöhen. Der Konzentrationsfaktor ist vorzugsweise zumindest gleich 10, beispielsweise in der Größenordnung von 1000. Das Konzentrieren kann in üblicher Weise und insbesondere durch Ultrafiltration durchgeführt werden.
Die inaktivierte oder nicht-inaktivierte virale Suspension des verwendeten Verfahrens muss gereinigt werden. Gemäß einem wichtigen Charakteristikum der Erfindung umfasst die Reinigungsstufe mindestens eine Chromatographie. In vorteilhafter Weise führt man nacheinander die drei folgenden Stufen durch:

• Ionenaustauscherchromatographie,
• Adsorptionschromatographie durch Chelierung,
• Gelpermeation.

Die Ionenaustauscherchromatographie ist vorzugsweise eine Austauscherchromatographie von Anionen, die schwach oder stark sein können. Der verwendete Träger ist beispielsweise DEAE-Spherodex^TM (Handelsprodukt der Biosepra, USA), welches selektiv die viralen Teilchen zurückhält und den wesentlichen Anteil der verunreinigenden Proteine durchlaufen lässt.
Das das Virus enthaltende Eluat kann anschließend auf Träger aufgebracht werden, wie Hydroxyapatit oder chelierende Gele (Kalzium ...). In diesem Falle fixiert sich das Virus nicht auf dem Träger, der speziell die Nukleinsäuren zurückhält.
Im Anschluß an diese Stufe führt man eine Filtration an Gel oder Molekularsieben (ebenfalls als Gelpermeation bezeichnet) an jeglichem geeigneten Träger durch, wie Sepharose 6FF^TM (Pharmacia) oder Fractogel^TM (E. Merck). Während dieses Vorgangs ermöglicht das Eluieren die Gewinnung der viralen Teilchen in einer ersten Fraktion; die folgenden Elutions-Peaks entsprechen den viralen Proteinen oder Rückständen von Verunreinigungen. Für die Herstellung einer Vakzine fängt man jedoch nur die erste Fraktion des Eluats auf.
Vorteilhafterweise ist es möglich, zwischen der Adsorptionschromatographie und der Gelfiltration eine Konzentrationsstufe durchzuführen, vorzugsweise durch Ultrafiltration mit einer Membrane, deren Ausschlussgrenze 10000 Daltons beträgt.
Die gereinigte virale Suspension wird gegebenenfalls inaktiviert und anschließend formuliert unter Erzielung des gewünschten Antigengehalts; man kann ihr auch ein Stabilisierungsmittel oder ein Adjuvans zusetzen; sie wird schließlich in eine pharmazeutische Form gebracht, um unter guten Bedingungen bis zur Verwendung konserviert werden zu können.
Beispiel
1. Materialien

– VERO-Zellen: Die zur Inokulation des Fermentors verwendeten VERO-Zellen stammen von einer VERO-Zellbank im 137. Durchlauf, einer Bank, die allen nötigen Kontrollen für ihre Charakterisierung und Qualifikation unterzogen wurde.
– Das JEV-Virus: Der verwendete virale Stamm ist der Stamm P₃ im 88. Durchlauf, geliefert von der NVSI.

Eine Ampulle des erhaltenen Virus wird in 100 ml Medium suspendiert und mittels eines Filters von 0,1 μm filtriert. Die Lösung wird zur Infektion von zwei Fläschchen von 75 cm² verwendet. Fünf Tage später wird die gewonnene überstehende Flüssigkeit filtriert (Filter von 0,2 μm). Einige Ernten werden durchgeführt und das das Lot der ersten Animpfung bildende Gemisch weist einen Titer LD 50/ml = 10^8,16 auf. Man stellt ein Animpflot für die Bearbeitung aus 10 ml des primären Animpflots her, um 12 Rollflaschen von 850 cm² zu infizieren. Es können mehrere Ernten durchgeführt werden und das Gemisch von 30,2 Liter weist einen Titer LD 50/ml = 10^8,31 auf.
Die Ausbeuten an primärer Animpfung und zur Bearbeitung werden anschließend kontrolliert, um ihre Charakterisierung und Qualität zu kontrollieren.
2. Kulturverfahren
Man füllt den Behälter eines Fermentors von 500 l mit einem üblichen Kulturmedium für VERO-Zellen, das Cytodex 1^TM Mikroträger enthält in einer Konzentration von 3 g/l. Man impft das Medium mit einem Inokulum von VERO-Zellen (200000 Zellen/ml) an.
Man lässt die Zellen sich fixieren und vier Tage lang wachsen. Am Ende von vier Tagen wird das Kulturmedium durch ein virales Multiplikationsmedium ersetzt.
Ein Inokulum des Virus wird in den Behälter in einer Menge des Virus eingefüllt, die so berechnet wird, dass eine Infektionsmultiplizität MOI von 1/500 erzielt wird. Die verschiedenen Kulturen werden bei 37°C durchgeführt. Drei Tage nach der Virus-Inokulation erntet man das virale Multiplikationsmedium, das die erste Ernte liefert. Das virale Multiplikationsmedium wird durch ein neues Medium ersetzt und eine neue Ernte wird alle drei Tage durchgeführt, wobei die Gesamtanzahl der Ernten sechs beträgt.
Die Tabelle I zeigt die erhaltenen Titer jeder Ernte.

Ernte Nr. R1 R2 R3 R4 R5 R6

Tage nach der Infektion 3 5 7 10 12 14

Titer LD 50/ml 10^8,4 10^8,4 10^8,5 10^8,1 10^8,2 10^7,3
Die Ernten werden an einem Membranfilter (Porendurchmesser: 0,2 μm) filtriert. Die gesamten Ernten werden vermischt.
Das Gemisch der Ernten wird auf einen Faktor von 100 durch Ultrafiltrieren an einer Membrane von 10000 Dalton konzentriert.
Man fügt zu dem konzentrierten Erntegemisch eine Formalinlösung mit einer Endkonzentration von 1/4000 und hält bei Raumtemperatur (von 20 bis 25°C) unter kontinuierlichem Rühren während 14 Tagen.
Man führt anschließend eine neue Filtration durch und führt die Inaktivierung gemäß einer zweistufigen Kontrolle nach dem OMS-Protokoll (Rapport technique 771 von 1988) durch.
Alle durch Formalin inaktivierten Präparate erweisen sich als brauchbar.
Die inaktivierte Lösung wird durch eine Ionenaustauschersäule der Gruppe DEAE, equilibriert auf den pH 8 geleitet (Harz-DEAE-Spherodex^TM). Das Virus wird auf der Säule zurückgehalten. Nach dem Waschen mit einem Phosphatpuffer wird das Virus mit einem Phosphatpuffer, NaCl 0,2M, eluiert. Der Hauptanteil der Protein-Verunreinigungen wird so eliminiert.
Das Eluat wird durch Chelierungs-Affinität gereinigt unter Kalziumeinwirkung, durch Injektion des Eluats über eine Säule von Chelating Sepharose^TM (Pharmacia). Das Virus wird nicht fixiert und durchläuft die Säule direkt. Man konzentriert anschließend durch Ultrafiltration an Membranen mit einer Durchlässigkeitsschwelle von 10000 Da, um das Volumen der Virus-Suspension auf einen Faktor von etwa 20 zu verringern.
Die konzentrierte Lösung des vorgereinigten Virus wird in eine Säule von Sepharose6 FF^TM eingeführt. Man eluiert mit einem Phosphatpuffer NaCl 0,2M. Die viralen Teilchen befinden sich eluiert in der ausgeschlossenen Fraktion.
Die Charakteristika des Reinigungsverfahrens sind in der Tabelle II aufgeführt.

Stufe DEAE Chelbildung Gelfiltration

Restliche Proteine (*) 50 % 100 % 0,4 %

Gehalt an DNA (pg/ml) < 7000 < 30 < 30

Gewonnenes Virus (*) (ELISA-Protein E) 90 % 76 % 20 %

(*) Ausbeuten Stufe für Stufe

Die gereinigte inaktivierte Virus-Lösung wurde verwendet, um Mäuse durch Injektion am Tage 0 und anschließend am Tage 7 zu immunisieren. Der Nachweis des virulenten Virus erfolgt mit Hilfe einer Lösung von 10⁵ LD 50/ml am Tag 30. Alle mit dem gereinigten nicht-verdünnten Präparat und mit dem auf 1/32 verdünnten gereinigten Präparat geimpften Mäuse waren geschützt. Im gleichen Test wurden Mäuse, geimpft mit Biken Vakzine (Verdünnung 1/32), untersucht und lediglich 2/5 waren geschützt.

Claims

Verfahren zur industriellen Herstellung einer Vakzine gegen Japanische Encephalitis, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Stufen umfasst: a) Kultur von Zellen, die von einer Zelllinie stammen, b) Inokulieren der erhaltenen Zellkultur mit dem Virus der Japanischen Encephalitis in Anwesenheit eines viralen Multiplikationsmediums, c) Propagation und Multiplikation des Virus an den Zellen, d) Ernte des viralen Multiplikationsmediums, das eine Suspension des Virus, erzeugt durch die Zellen, bildet, e) Reinigung der viralen Suspension mit mindestens einer Ionenaustauscherstufe, einer Adsorptionschromatographie-Stufe und einer Gelpermeations-Stufe, f) Formulierung und Bringen der viralen Suspension in eine pharmazeutische Form, um eine Konservierung bis zur Verwendung sicherzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des inokulierten Virus einem Vielfachen der Infektion (MOI) unter 0,1 entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es darüber hinaus eine Inaktivierungsstufe der viralen Suspension vor oder nach der Reinigungsstufe e) umfasst.
Verfahren gemäß dem vorhergegangenen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Inaktivierung mit einem chemischen Mittel bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zur viralen Multiplikation verwendeten Zellen VERO-Zellen sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung durch folgende Arbeitsgänge erzielt wird: • Ionenaustauscherchromatographie, • Adsorptionschromatographie durch Chelieren, • Gelpermeation.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man außerdem nach der Erntestufe d) erneut in ein neues virales Multiplikationsmedium einführt, eine ausreichende Zeit verstreichen lässt, um die Multiplikation des Virus erneut zu ermöglichen und eine neue Ernte des viralen Multiplikationsmediums durchführt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, das virale Multiplikationsmedium zu ernten und zwischen ein- und siebenmal durch ein neues Medium zu ersetzen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem darin besteht, nach der Stufe d) die geerntete virale Suspension zu filtrieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das virale Multiplikationsmedium eine Proteinkonzentration unter 5 g/l aufweist.