DE3786806T2

DE3786806T2 - Reinigung von Keuchhustenantigenen.

Info

Publication number: DE3786806T2
Application number: DE87300387T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Ian Irons; Andrew Robinson
Original assignee: Health Protection Agency
Current assignee: Public Health England
Priority date: 1986-01-20
Filing date: 1987-01-16
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2007-01-17
Also published as: KR950010323B1; CN87100399A; DE3786806D1; DK27287D0; AU6766487A; JP2538224B2; US4784589A; ATE92335T1; DK27287A; CN1028206C; CA1280693C; DK172936B1; EP0231083A2; GB8601279D0; KR870006902A; EP0231083A3; EP0231083B1; AU592727B2; JPS62234031A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von antigenen Substanzen zur Verwendung bei der Formulierung von Vakzinen gegen Infektionen durch Bordetella pertussis.
In der Vergangenheit hat man zur Abwehr von Keuchhusten weitgehend Vakzine aus abgetöteten ganzen Zellen von Bordetella pertussis verwendet. Negative Reaktionen auf Vakzine aus ganzen Zellen und die sich daraus ergebende verringerte Akzeptanz dieser Impfstoffe in der Öffentlichkeit haben dazu geführt, daß umfangreiche Forschung betrieben wurde mit dem Ziel, ein sichereres azelluläres Vakzin herzustellen, das isolierte Keuchhustenantigene enthält.
Drei spezielle Antigenfraktionen gelten als nützliche Komponenten azellulärer Vakzine, nämlich (1) der die Lymphozytose steigernde Faktor (LPF), filamentöses Hämagglutinin (FHA) und (3) fimbriale Agglutinogene (Fimbrien).
Zu den durch die Fraktion (3), d. h. die fimbrialen Agglutinogene, vertretene Klasse von Antigenen gehören die als "Agglutinogene 2 und 3" bezeichneten Agglutinogene. (Die Agglutinogene 2 und 3 können auch als "Ag&sub2;&sbplus;&sub3;" bezeichnet werden). Man könnte sagen, die Agglutinogene 2 und 3 bestehen aus Fimbrien, die aus Organismen isoliert wurden, welche mindestens Agglutinogen 2 und 3-Antigene tragen. (Agglutinogen 3 wird von manchen Forschern als "Agglutinogen 6" bezeichnet; möglicherweise sind die Agglutinogene 3 und 6 identisch.)
Obwohl Verfahren zur Isolierung dieser Fraktionen in kleinen Ausbeuten bekannt sind, standen bisher keine Verfahren zur Verfügung, alle drei Fraktionen getrennt und wirtschaftlich aus Bordetella pertussis-Kulturen herzustellen. So beschreibt EP-A-0 003 916 zum Beispiel ein Verfahren zur Gewinnung des die Lymphocytose steigernden Faktors (LPF), indem man eine aus Bordetella pertussis-Zellen erhaltene flüssige Zubereitung einer Affinitätschromatographie unterwirft, bei der ein Sialoprotein als stationäre Phase verwendet wird. Die dazu verwendete flüssige Zubereitung wurde allerdings aus einer homogenisierten Zellpaste erhalten, und obwohl die beschriebenen Verfahren wirksam bei der Herstellung von LPF sind, geht es bei dem Patent nicht um die getrennte Isolierung von filamentösem Hämagglutinen (FHA) und der Agglutinogene 2 und 2 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;).
Es sind sind auch Verfahren zur Herstellung von die Lymphozytose steigerndem Faktor (LPF) und von filamentösem Hämagglutinin (FHA) aus Kulturüberständen von Bordetella pertussis vorgeschlagen worden; z. B. beschreiben Sato et al. (Infection and Immunity, Juli 1983, Band 41, S. 313-320) die Reinigung von LPF und FHA aus Kulturüberständen durch Differentialadsorption auf einer Hydroxylapatitsäule.
Diese früheren Patentschriften befassen sich jedoch nicht mit der Co-Produktion aller drei, also des die Lymphozytose steigernden Faktors (LPF), filamentösen Hämagglutinins (FHA) und fimbrialer Agglutinogene.
Für die Herstellung von Vakzin-Zusammensetzungen, die alle diese Antigenfraktionen umfassen, wäre es wünschenswert, die drei notwendigen Fraktionen in vergleichbaren Mengen zu erhalten, da es von Vorteil sein kann, wenn die Fraktionen im schließlich erhaltenen Vakzin in ungefähr gleichen Teilen vorliegen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von die Lymphozytose steigerndem Faktor (LPF), filamentösem Hämagglutinin (FHA) und mindestens einem fimbrialen Agglutinogen aus einer flüssigen Bordetella pertussis- Kultur zur Verfügung gestellt, bei dem man:
a) die Kultur in zelluläre und Überstandsfraktionen trennt;
b) die Überstandsfraktion konzentriert,
c) die konzentrierte Überstandsfraktion zur Isolierung der LPF- und FHA-haltigen Fraktionen auftrennt und
d) mindestend ein fimbriales Agglutinogen aus der zellulären Fraktion isoliert.
In Schritt d) werden vorzugsweise fimbriale Agglutinogene, die mindestens die Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) umfassen, aus der zellulären Fraktion isoliert. Wahlweise enthalten die isolierten Agglutinogene zusätzlich eines oder mehrere der Agglutinogene 4, 5 und 6.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzin-Zusammensetzung zur Verfügung, die den die Lymphozytose steigernden Faktor (LPF), filamentöses Hämagglutinin (FHA) und mindestens ein fimbriales Agglutinogen enthält, umfassend die Mischung von (i) LPF, (ii) FHA und (iii) mindestens einem fimbrialen Agglutinogen, wobei LPF, FHA und mindestens ein fimbriales Agglutinogen durch die vorstehend beschriebenen Schritte a) bis d) hergestellt und vor oder nach dem Mischen entgiftet werden. Vorzugsweise schließen die fimbrialen Agglutinogene mindestens die Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) ein. Die fimbrialen Agglutinogene können auch mindestens eines der Agglutinogene 4, 5 und 6 enthalten.
Die erfindungsgemäße Isolierung von LPF, FHA und mindestens eines fimbrialen Agglutinogens ermöglicht die Gewinnung dieser Komponenten aus einer einzigen flüssigen Kultur, und zwar in Ausbeuten, die die Rekombination in therapeutisch wirksamen Mengen in Vakzin-Zusammensetzungen gestatten.
Wie angegeben, wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Überstandsfraktion vor dem Auftrennungsschritt c) konzentriert, und man hat überraschend festgestellt, daß durch diese Schrittfolge, d. h. Ausführung des Konzentrationsschritts b) nach der Trennung der Überstandsfraktion von der zellulären Fraktion, unannehmbare Verluste an FHA vermieden werden können.
Die Trennung der Kultur in zelluläre und Überstandsfraktionen wird vorzugsweise durch Zentrifugieren ausgeführt, wenn der pH der Kultur über 7,0 liegt, und noch bevorzugter bei einem pH von über oder gleich 8,0. Am meisten bevorzugt liegt der pH der Kultur im Bereich von 7,5 bis 9,0.
Nach dem Zentrifugieren wird die Überstandsfraktion vorzugsweise konzentriert, damit sich ihr Volumen auf weniger als 50% und, noch bevorzugter, auf 25% des Originalvolumens verringert. Praktischerweise kann die Konzentration durch jedes herkömmliche Entwässerungsmittel erfolgen, zum Beispiel durch Pellicon-Konzentration. Nach dem Konzentrationsschritt und vor der Auftrennung des Überstands in LPF- und FHA-haltige Fraktionen wird der Überstand zur Entfernung irgendwelcher Restorganismen vorzugsweise einer Membranfiltration unterzogen. Anschließend kann der Auftrennungsschritt c) bequem ausgeführt werden, indem der Überstand mit Hydroxylapatit, beispielsweise in einer Säule, in Kontakt gebracht wird; dabei bleibt eine FHA-haltige Fraktion zurück, und man erhält ein eine LPF-haltige Fraktion umfassendes Eluat.
Die LPF-haltige Fraktion kann durch herkömmliche Techniken zur Proteinauftrennung gereinigt werden, z. B. durch Ausfällung des proteinhaltigen Materials durch Erhöhung der Salzkonzentration unter Verwendung von beispielsweise Ammoniumsulfat gefolgt von der Extraktion des Niederschlags mittels eines geeigneten Puffers. Der Extrakt kann anschließend dialysiert werden, und die so gewonnene dialysierte LPF-haltige Lösung kann weiter gereinigt werden, um andere Proteine oder Lipopolysaccharide zu entfernen, beispielsweise durch die in EP-A- 0 003 916 beschriebene Technik.
So kann die dialysierte LPF-haltige Lösung beispielsweise auf eine Fetuinsepharosesäule aufgetragen werden und das zurückgehaltene LPF mittels eines Magnesiumchloridpuffers eluiert werden.
Dann kann die gereinigte LPF-haltige Fraktion erneut dialysiert, filtriert und einem Entgiftungsschritt unterworfen werden.
Die Reinigung der FHA-haltigen Fraktion kann erfolgen, indem man die Fraktion unter Verwendung von Puffern mit zunehmender Ionenstärke aus dem Hydroxylapatitadsorbens eluiert, gefolgt von herkömmlichen Proteinreinigungsschritten einschließlich beispielsweise Ausfällung bei hohen Salzkonzentrationen und Chromatographie. Zum Schluß können die gereinigten FHA-haltigen Fraktionen einer Membranfiltration und dann einem Entgiftungsschritt unterworfen werden.
Um fimbriale Agglutinogene, z. B. die Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) aus der zellulären Fraktion zu isolieren, werden die Zellen vorzugsweise gewaschen und anschließend in einem geeigneten Puffer homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren kann der Überstand dann herkömmlichen Proteinreinigungstechniken unterworfen werden, um eine Fraktion zu isolieren, die fimbriale Agglutinogene enthält. So kann beispielsweise eine Fraktion, die fimbriales Agglutinogen enthält, durch Erhöhung der Ionenstärke der Lösung ausgefällt werden, gefolgt von einer oder mehreren Extraktionen mit Puffern, erneuten Ausfällungen und Dialyse. Schließlich kann die gereinigte, fimbriales Agglutinogen enthaltende Fraktion einer von einem Entgiftungsschritt gefolgten Membranfiltration unterworfen werden.
Wenn gewünscht, kann der Lipopolysaccharidgehalt der fimbrialen Agglutinogen-Fraktion durch Affinitätschromatographie verringert werden, z. B. auf einer Polymyxinsepharose-4B-Säule.
Die Entgiftungsschritte werden vorzugsweise ausgeführt, indem man die LPF, FHA und fimbriales Agglutinogen enthaltenden Fraktionen einzeln oder kombiniert mit einem herkömmlichen Toxoid-Mittel wie z. B. Formaldehyd behandelt.
Um Vakzin-Zusammensetzungen aus den LPF-, FHA- und fimbrialen Agglutinogen-Fraktionen herzustellen, werden diese Fraktionen in therapeutisch wirksamen Dosen kombiniert und in Dosiseinheiten formuliert, die beispielsweise mindestens 1-5 und bevorzugt mindestens 2 ug von jeder Komponente pro Dosiseinheit enthält.
Man kann herkömmliche Wachstumsmedien verwenden, um flüssige Bordetella pertussis-Kulturen als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren herzustellen. Um wirtschaftlich verwertbare FHA-Ausbeuten herzustellen, hat es sich jedoch als sinnvoll erwiesen, das Medium von Stainer und Scholte zu verwenden, das 2,6-O-dimethylbeta-cyclodextrin (MeCD) enthält, besonders in Schüttelkulturen oder gerührten Fermentern. Das Wachstum der Hauptkultur kann praktischerweise in 1-Liter Thompson- Flaschen mit 300 ml Medium oder in 10-Liter Fermentern durchgeführt werden. Ein geeigneter Bordetella pertussis-Stamm ist der Stamm Wellcome 28 vom 1,2,3-Serotyp. Auch andere Stämme vom 1,2,3-Serotyp, die ausreichende Antigenausbeuten ergeben, können verwendet werden.
Nachstehend wird die erfindungsgemäße Herstellung von die Lymphozytose steigerndem Faktor (LPF), filamentösem Hämagglutinin (FHA) und der Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) anhand eines Beispiels erläutert.

Beispiel

Eine Bordetella pertussis-Kultur wurde wie folgt hergestellt:
Man öffnete eine gefriergetrocknete Ampulle B. pertussis, Stamm Wellcome 28, dispergierte den Inhalt in sterilem Wasser und pipettierte ihn dann auf eine Agarplatte aus Holzkohle, die 10% defibriniertes Pferdeblut enthielt. Nach 48-stündiger Bebrütung bei 35ºC wurden die Organismen in Subkulturen auf verschiedene Agarplatten aus Holzkohle übertragen, die ebenfalls 48 Stunden lang bei 35ºC bebrütet wurden.
Anschließend wurden die Organismen in verschiedene konische 250 ml-Kolben geschabt, die 100 ml mit 1% Casaminosäuren und 1 mg MeDC/ml ergänztes Stainer und Scholte-Medium enthielten. Die Kolben wurden 24 Stunden bei 35ºC orbital geschüttelt (180 U/min.); anschließend wurden 5-10 ml in jede der 60 Thompson Flaschen mit je 300 ml Medium umgefüllt. Nach 48-stündige Schütteln der Flaschen bei 35ºC auf einer sich sanft hin und her bewegenden Schüttelvorrichtung wurde der Inhalt der Flaschen zusammengeschüttet und geerntet.
Die sich dabei ergebende flüssige Bordetella pertussis- Kultur wurde in einer Sorvall RC3B-Zentrifuge eine Stunde lang bei 5000 upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und die Zellen bei 4ºC für die Zubereitung der Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) gelagert.
Der Überstand wurde unter Einsatz einer mit einem "cutoff"-Filter mit einem Molekulargewicht von 10.000 ausgerüsteten Millipore Pellicon-Vorrichtung konzentriert. 18 Liter Überstand wurden auf ein Volumen von ca. 4 Litern konzentriert. Anschließend wurde das Konzentrat einer sterilen Filtration durch einen Gelman 0,2 um Polysulfon-Minikapselfilter unterzogen.

1. Herstellung von filamentösem Hämagglutinin (FHA)

Die Reinigung des filamentösen Hämagglutinins (FHA) aus dem Kulturüberstand erfolgte durch die aufeinanderfolgenden Schritte der Hydroxyapatit-Chromatographie, Ammoniumsulfatausfällung und Sepharose CL-6B-Chromatographie.

A. Hydroxylapatit-Chromatographie

400 g kugelförmiges Hydroxylapatit (BHD Chemicals Ltd.) wurden in 500 ml 0,1 MNaOH suspendiert. Man wartete etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich das Pulver gesetzt hatte; dann wurde die überschüssige Flüssigkeit abdekantiert. Der Waschvorgang mit Natriumhydroxid wurde zweimal wiederholt, gefolgt von mehrfachem Waschen mit destilliertem Wasser, bis der pH des Eluats etwa 8,0 betrug.
Das gewaschene Pulver wurde in 500 ml 0,01 M Phosphatpuffer suspendiert; nach 20 Minuten wurde der Puffer abdekantiert. Der Waschvorgang mit dem Phosphatpuffer wurde dreimal wiederholt.
Das gewaschene Hydroxylapatit wurde in eine Chromatographiesäule gepackt und mit 0,01 M Phosphatpuffer bei pH 8,0 äquilibriert.
Anschließend wurde die Säule an einen Tank mit dem konzentrierten Überstand angeschlossen; dieser Überstand wurde mit einer peristaltischen Pumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von ca. 500 ml/h durch die Säule gepumpt. Das Eluat wurde zur Isolierung des LPF (siehe unten) zurückbehalten.
Die zurückbehaltene FHA-Fraktion wurde aus der Säule eluiert, indem sie nacheinander mit (i) 0,01 M Phosphatpuffer bei pH 8, (ii) 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 und (iii) 0,1 M Phosphat-0,5-Natriumchloridpuffer bei pH 6,5 gewaschen wurde. Während des letzten Waschvorgangs wurden siebzig 8 ml-Fraktionen gesammelt und die optische Dichte jeder Fraktion bei 280 nm aufgezeichnet. Auch die hämagglutinierende Aktivität alternierender Fraktionen wurde mittels frisch gewaschener Gänse-Erythrozyten untersucht. Fraktionen mit einem hämagglutinierenden Titer (Log 2) von über oder gleich 7 wurden zusammengeschüttet. Fig. 1 zeigt eine Aufzeichnung der Elution.

B. Ammoniumsulfat-Ausfällung

Aus den zusammengeschütteten Fraktionen wurde FHA ausgefällt, indem man Ammoniumsulfat zusetzte, bis sich eine 30% gesättigte Lösung ergab, und diese Lösung dann zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und weggeschüttet; der Niederschlag wurde in einem 0,05 M Phosphat-0,5 M Natriumchlorid-Puffer bei 7,2 pH auf gelöst und gegen dem gleichen Puffer dialysiert. Die dialysierte Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand zur anschließenden Reinigung zurückbehalten.

C. Sepharose-CL-6B-Chromatographie

Anschließend wurde der Überstand auf Sepharose-CL-6B-Gel chromatographiert, das vorher bei 7,2 pH mit einem 0,05 M Phosphat-0,5 M Natriumchlorid-Puffer äquilibriert worden war.
Anschließend wurde das FHA unter Einsatz eines 0,05 M Phosphat-0,5 M-Natriumchlorid-Puffers bei einem pH von 7,2 aus der Säule eluiert und achtzig 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Eluatfraktionen wurden auf die vorstehend beschriebene Weise auf Protein und hämagglutinierende Aktivität untersucht, und Fraktionen mit einem Hämagglutinin-Titer über oder gleich 7 wurden zusammengeschüttet. Fig. 2 zeigt eine Aufzeichnung der Elution.

2. Reinigung von LPF

Das Eluat aus der Hydroxyapatit-Chromatographie wurde dann zur Gewinnung von LPF behandelt.

A. Ammoniumsulfat-Ausfällung

In einem ersten Schritt wurde ungereinigtes LPF ausgefällt, indem man Ammoniumsulfat zusetzte, bis sich eine 74% gesättigte Lösung ergab. Die sich dabei ergebende Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand weggeschüttet. Der Niederschlag wurde in 0,05 M Phosphat- 0,05 M Natriumchlorid-Puffer bei einem pH von 7,2 erneut suspendiert. Anschließend wurde die Suspension bei 15.000 upm zentrifugiert und der Überstand zurückbehalten. Das Produkt wurde weitere viermal unter Verwendung des gleichen Puffers extrahiert; die sich dabei ergebenden Überstände wurden zusammengeschüttet.

B. Fetuinsepharose-Chromatographie

Die zusammengeschütteten Überstände wurden gegen 0,05 M Phosphat-0,05 Natriumchloridpuffer bei 7,2 pH dialysiert und dann auf einem Fetuinsepharose-Gel chromatographiert, welches vorher in 0,05 M Phosphat-0,05 M Natriumchlorid-Puffer äquilibriert worden war. Anschließend wurde die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Eluat weggeschüttet.
Dann wurde eine gereinigte LPF-haltige Fraktion mittels 6,7 mM Tris-0,013 M Natriumchlorid/3 M Magnesiumchlorid- Puffer bei einem pH von 6,4 aus der Säule eluiert und dreißig Fraktionen à 50 Tropfen gesammelt. Fraktionen mit einem hämagglutinierenden Titer von über oder gleich 7 wurden zusammengeschüttet und gegen 2 l 0,05 M Tris HCl, 1 M NaCl-Puffer bei einem pH von 8,0 dialysiert. Anschließend wurde die LPF-haltige Fraktion unter Verwendung eines 0,05 M Phosphat-0,5 M Natriumchlorid- Puffers von pH 7,2 erneut dialysiert und die dabei entstehende gereinigte LPF-haltige Fraktion zurückbehalten.

3. Herstellung der Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;)

Die zentrifugierte zelluläre Fraktion wurde mit sterilem, pyrogenfreiem destilliertem Wasser gewaschen, zentrifugiert und dann unter Verwendung von 0,014 M Phosphat-0,14 M Natriumchlorid-Puffer bei 7,2 pH homogenisiert. Die homogenisierte bakterielle Suspension wurde dann bei 9000 upm zur Entfernung der Bakterienzellen zentrifugiert und der Überstand, der Bordetella pertussis-Fimbrien enthielt, zurückbehalten. Dem Überstand wurde Ammoniumsulfat zugesetzt, bis sich eine Endkonzentration von 30% Sättigung ergab, und die Suspension über Nacht bei 4ºC gelagert, um die fimbrialen Proteine auszufällen. Nach Zentrifugieren bei 9000 upm wurde der Überstand weggeschüttet und der Niederschlag mittels eines vorgekühlten Phosphatpuffers extrahiert. Die Suspension wurde bei 15000 upm zentrifugiert und der Überstand zurückbehalten. Die Extraktion wurde viermal wiederholt und die sich dabei ergebenden Überstände zusammengeschüttet.
Den zusammengeschütteten Überständen wurde Ammoniumsulfat zugesetzt, bis sich eine Endkonzentration von 15% Sättigung ergab, und die Suspension wurde über Nacht bei 4ºC gelagert, um fimbriale Proteine auszufällen.
Die Suspension wurde bei 15.000 upm zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Das Pellet wurde mit Phosphatpuffer extrahiert und bei 15.000 upm zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die Extraktion viermal wiederholt; die sich dabei ergebenden Überstände wurden zusammengeschüttet.
Den zusammengeschütteten Überständen wurde Ammoniumsulfat zugesetzt, bis sich eine Endkonzentration von 15% Sättigung ergab, und die dabei entstandene Suspension wurde über Nacht bei 4ºC gelagert, um fimbriale Proteine auszufällen. Die Suspension wurde bei 15.000 upm zentrifugiert und der Überstand verworfen. (Wenn notwendig, können weitere Ammoniumsulfatausfällungen eingesetzt werden.)
Das Pellet wurde mit Phosphatpuffer extrahiert und bei 15.000 upm zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die Extraktion viermal wiederholt; die sich dabei ergebenden Überstände wurden zusammengeschüttet.
Anschließend wurde der zusammengeschüttete Überstand gegen 0,05 M Phosphat-0,5 M Natriumchlorid-Puffer bei pH 7,2 dialysiert.

4. Entgiftung

Alle Antigene wurden durch eine Millex GV 0,22 um- Filtereinheit filtriert. Die LPF-Zubereitung wurde mit einem 0,05 M Phosphat-0,5 M Natriumchloridpuffer bei pH 7,2 auf eine endgültige Proteinkonzentration von 200 ug/ml verdünnt. Eine 40%-ige Formaldehydlösung wurde zugesetzt, was eine Endformaldehydkonzentration von 0,5% ergab. Die LPF-haltige Fraktion wurde dann 14 Tage bei 37ºC bebrütet, wobei der Inhalt mindestens einmal alle 2 Tage umgedreht wurde, um irgendwelche Ausfällungen aufzulösen.
Die dabei entstehende entgiftete LPF-Fraktion wurde dann gegen einen PBS-Puffer mit 0,01% Formaldehyd und 0,01% Thiomersal dialysiert und zur Lagerung in einen Behälter abdekantiert, wobei sicherzustellen war, daß das ganze ausgefällte Material umgefüllt wurde.
Eine ähnliche Entgiftungstechnik wurde bei der FHA- Fraktion und der Agglutinogen 2 und 3-Fraktion (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) angewendet, nur daß hier die Inkubationszeit bei 37ºC 7 Tage betrug.
Die entgifteten Antigene in PBS mit 0,01% Formaldehyd und 0,01% Thiomersal wurden in gleichen Proportionen gemischt und mit sterilem Wasser, 4-fach konzentriertem PBS mit 0,04% Formaldehyd und 0,04% Thiomersal und Alhydrogel verdünnt. Der dabei entstehende Impfstoff in isotonischem PBS enthält 120 ug Protein/ml, 25% Alhydrogel, 0,01% Formaldehyd und 0,01% Thiomersal. Als alternativer Hilfsstoff zu Alhydrogel, kann auch Aluminiumphosphat (zugesetzt als Aluminiumchlorid) verwendet werden. Der Impfstoff kann mit PBS, Diphterie- und Tetanustoxoiden und Alhydrogel weiter verdünnt werden, so daß sich eine Konzentration von Keuchhustenantigenen auf 60 ug/ml ergibt.
Die folgenden Ausbeuten an FHA, LPF und Agglutinogenen 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) wurden aus 18 Litern Kultur gewonnen:
FHA - 190 mg LPF - 50 mg Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) - 50 mg.

Claims

1. Verfahren zur Co-Produktion von die Lymphozytose steigernden Faktor (LPF), filamentösem Hämagglutinin (FHA) und mindestens einem fimbrialem Agglutinogen aus einer Flüssigkultur von Bordetella pertussis, bei dem man:

(a) die Kultur in zelluläre und Überstandsfraktionen trennt,

(b) anschließend an Schritt (a) die Überstandsfraktion auf weniger als 50% des ursprünglichen Volumens zur Bildung einer konzentrierten wäßrigen Überstandsfraktion mit verminderten Wassergehalt konzentriert,

(c) anschließend an Schritt (b) die konzentrierte Überstandsfraktion zur Isolierung von LPF- und FHA-haltigen Fraktionen auftrennt und

(d) mindestens ein fimbriales Agglutinogen aus der zellulären Fraktion isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die in Schritt (d) isolierten fimbrialen Agglutinogene mindestens eines der Agglutinogene 2, 3, 4, 5 und 6 enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die in Schritt (d) isolierten fimbrialen Agglutinogene mindestens Agglutinogene 2 und 3 (Ag&sub2;&sbplus;&sub3;) enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die isolierten Agglutinogene zusätzlich eines oder mehrere der Agglutinogene 4, 5 und 6 enthalten.

5. Verfahren nach einem dem vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Trennungsschritt (a) bei einem pH-Wert > 7 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Trennungsschritt (a) bei einem pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 9 durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in Schritt (b) der überstand auf weniger als 50% und vorzugsweise auf weniger als 25% des ursprünglichen Volumens konzentriert wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem in Schritt (c) die LPF-haltige Fraktion durch Adsorbtion an Fetuinsepharose gefolgt von einer Elution unter Verwendung eines Magnesiumchloridpuffers gereinigt wird.

9. Verfahren zur Produktion einer Vakzine-Zusammensetzung, gekennzeichnet durch die Schritte

(i) Herstellung (i) von Lymphozytose steigernden Faktor (LPF), (ii) filamentösem Hämagglutinin (FHA) und (iii) mindestens einem fimbrialen Agglutinogen durch ein Verfahren wie in einem der Ansprüche i bis 8 definiert und

(2) Mischen der Produkte (i), (ii) und (iii) zur Bildung einer Vakzine-Zusammensetzung und worin das LPF, FHA und das mindestens eine fimbriale Agglutinin vor oder nach dem Mischen entgiftet werden.