JP2538224B2 - 百日咳抗原の精製 - Google Patents
百日咳抗原の精製Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はボルデテラ百日咳（百日咳菌）による感染に
対するワクチンの生成に使われる抗原物質の製造方法に
関する。
対するワクチンの生成に使われる抗原物質の製造方法に
関する。
従来百日咳防疫に殺した全細胞ボルデテラ百日咳ワク
チンが広く使われている。全細胞ワクチンに対する逆反
応およびそれによるこのワクチンの公式利用の減少によ
り分離された百日咳抗原を含むより安全な非細胞ワクチ
ン生成のための多くの試験研究が行なわれている。
チンが広く使われている。全細胞ワクチンに対する逆反
応およびそれによるこのワクチンの公式利用の減少によ
り分離された百日咳抗原を含むより安全な非細胞ワクチ
ン生成のための多くの試験研究が行なわれている。
非細胞ワクチンの有用成分として３つの抗原成分、即
ち（１） リンパ球増加症促進因子（LPF）、（２）
フイラメント状ヘマグルチニン（Haemagglutinin）（FH
A）および（３） フィムブリエ性凝集原があげられ
る。
ち（１） リンパ球増加症促進因子（LPF）、（２）
フイラメント状ヘマグルチニン（Haemagglutinin）（FH
A）および（３） フィムブリエ性凝集原があげられ
る。
第３部分、即ちフィルブリエ性凝集原によつてあらわ
される種類の抗原には“凝集原２と3"といわれる凝集原
がある。（凝集原２と３は“Ag2+3"ともいわれる。凝集
原２と３は少なくとも凝集原２と３抗原をもつている有
機体から分離されるフィムブリエより成ると思われる。
（凝集原３はある著者によつて“凝集原6"ともいわれ凝
集原３と６は同じかもしれない。） これらの各部分を小規模分離する方法は知られている
が３部分全部をボルデテラ百日咳培養液から個別に能率
よく生成する方法はこれまで使われていない。故に例え
ばEP−Ａ−0003916号はボルデテラ百日咳の細胞からえ
た液体資料を固定相として用いて親和力クロマトグラフ
法にかけることによりリンパ球増加症促進因子（LPF）
をえる方法を記載している。しかし使用した液体試料は
均質化した細胞ペーストからえたもので、記載の方法は
LPF生成に有効であるが、特許はフイラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）と凝集原２と３（Ag2+3）の個別分離に
向けられていない。
される種類の抗原には“凝集原２と3"といわれる凝集原
がある。（凝集原２と３は“Ag2+3"ともいわれる。凝集
原２と３は少なくとも凝集原２と３抗原をもつている有
機体から分離されるフィムブリエより成ると思われる。
（凝集原３はある著者によつて“凝集原6"ともいわれ凝
集原３と６は同じかもしれない。） これらの各部分を小規模分離する方法は知られている
が３部分全部をボルデテラ百日咳培養液から個別に能率
よく生成する方法はこれまで使われていない。故に例え
ばEP−Ａ−0003916号はボルデテラ百日咳の細胞からえ
た液体資料を固定相として用いて親和力クロマトグラフ
法にかけることによりリンパ球増加症促進因子（LPF）
をえる方法を記載している。しかし使用した液体試料は
均質化した細胞ペーストからえたもので、記載の方法は
LPF生成に有効であるが、特許はフイラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）と凝集原２と３（Ag2+3）の個別分離に
向けられていない。
ボルデテラ百日咳の培養上澄液からリンパ球増加症促
進因子（LPF）とフイラメント状ヘマグルチニン（FHA）
をえる方法も提案されている。例えばサトーら（Infect
ion and Immunity.41巻,313−320,1983年７月）は培養
上澄液からヒドロキシルアパタイト管上の分別吸着によ
るLPFとFHAの精製を述べている。
進因子（LPF）とフイラメント状ヘマグルチニン（FHA）
をえる方法も提案されている。例えばサトーら（Infect
ion and Immunity.41巻,313−320,1983年７月）は培養
上澄液からヒドロキシルアパタイト管上の分別吸着によ
るLPFとFHAの精製を述べている。
しかしこれらの従来法はリンパ球増加症促進因子（LP
F）、フイラメント状ヘマグルチニン（FHA）およびフィ
ムブリエ性凝集原全３種の同時生成法と関係ない。
F）、フイラメント状ヘマグルチニン（FHA）およびフィ
ムブリエ性凝集原全３種の同時生成法と関係ない。
これらの抗原部分すべて含むワクチン組成物製造法に
おいて各部分が最終ワクチンにおいてほぼ同一割合であ
ると便利なので望む３部分を匹敵する収率でえることが
望ましい。
おいて各部分が最終ワクチンにおいてほぼ同一割合であ
ると便利なので望む３部分を匹敵する収率でえることが
望ましい。
本発明によって （ａ）百日咳菌の培養液を細胞部分と上澄液部分とに分
離し、 （ｂ）工程（ａ）の後に、上澄液部分をその最初の量の
50％よりも少なくなるまで、濃縮して、水の含有量が減
少した濃縮水性上澄液部分を生成し、 （ｃ）工程（ｂ）の後に、該濃縮上澄液部分をリンパ球
増加促進因子（LPF）含有部分とフィラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）含有部分とに分別し、そして、 （ｄ）細胞部分から少なくとも１つのフィムブリエ性凝
集原を単離する 工程よりなる百日咳菌の培養液からリンパ球増加促進因
子（LPF）、フィラメント状ヘマグルチニン（FHA）及び
少なくとも１つのフィムブリエ性凝集原の同時製造法が
提供される。
離し、 （ｂ）工程（ａ）の後に、上澄液部分をその最初の量の
50％よりも少なくなるまで、濃縮して、水の含有量が減
少した濃縮水性上澄液部分を生成し、 （ｃ）工程（ｂ）の後に、該濃縮上澄液部分をリンパ球
増加促進因子（LPF）含有部分とフィラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）含有部分とに分別し、そして、 （ｄ）細胞部分から少なくとも１つのフィムブリエ性凝
集原を単離する 工程よりなる百日咳菌の培養液からリンパ球増加促進因
子（LPF）、フィラメント状ヘマグルチニン（FHA）及び
少なくとも１つのフィムブリエ性凝集原の同時製造法が
提供される。
工程（ｄ）において少なくとも凝集原２と３（A
g2+3）よりなるフィムブリエ性凝集原は細胞部分から分
離される。分離された凝集原はなお任意に凝集原４、５
および６の１又は２以上を含む。
g2+3）よりなるフィムブリエ性凝集原は細胞部分から分
離される。分離された凝集原はなお任意に凝集原４、５
および６の１又は２以上を含む。
本発明は（１） （ａ）百日咳菌の培養液を細胞部分と上澄液部分とに分
離し、 （ｂ）工程（ａ）の後に、上澄液部分をその最初の量の
50％よりも少なくなるまで、濃縮して、水の含有量が減
少した濃縮水性上澄液部分を生成し、 （ｃ）工程（ｂ）の後に、該濃縮上澄液部分をリンパ球
増加促進因子（LPF）含有部分とフィラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）含有部分とに分別し、そして、 （ｄ）細胞部分から少なくとも１つのフィムブリエ性凝
集原を単離することにより（ｉ）百日咳菌の培養液から
リンパ球増加促進因子（LPF）、（ii）フィラメント状
ヘグマルチニン（FHA）及び（iii）少なくとも１つのフ
ィムブリエ性凝集原を製造し、次いで、（２）製造した
生成物（ｉ）、（ii）及び（iii）を混合してワクチン
組成物を生成し、且つこの生成に際して、LPF、FHA及び
少なくとも１つのフィムブリエ性凝集原を混合前または
嵌合後に解毒する工程よりなるワクチン組成物の製造方
法も提供する。フィムブリエ性凝集原は少なくとも凝集
原２と３（Ag2+3）を含むとよい。フィムブリエ性凝集
原はまた凝集原４、５および６の少なくとも１を含んで
もよい。
離し、 （ｂ）工程（ａ）の後に、上澄液部分をその最初の量の
50％よりも少なくなるまで、濃縮して、水の含有量が減
少した濃縮水性上澄液部分を生成し、 （ｃ）工程（ｂ）の後に、該濃縮上澄液部分をリンパ球
増加促進因子（LPF）含有部分とフィラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）含有部分とに分別し、そして、 （ｄ）細胞部分から少なくとも１つのフィムブリエ性凝
集原を単離することにより（ｉ）百日咳菌の培養液から
リンパ球増加促進因子（LPF）、（ii）フィラメント状
ヘグマルチニン（FHA）及び（iii）少なくとも１つのフ
ィムブリエ性凝集原を製造し、次いで、（２）製造した
生成物（ｉ）、（ii）及び（iii）を混合してワクチン
組成物を生成し、且つこの生成に際して、LPF、FHA及び
少なくとも１つのフィムブリエ性凝集原を混合前または
嵌合後に解毒する工程よりなるワクチン組成物の製造方
法も提供する。フィムブリエ性凝集原は少なくとも凝集
原２と３（Ag2+3）を含むとよい。フィムブリエ性凝集
原はまた凝集原４、５および６の少なくとも１を含んで
もよい。
本発明によつてLPF、FHAおよび少なくとも１のフィム
ブリエ性凝集原を分離することにより単一培養液からこ
れら成分をワクチン組成物に治療有効量で再混合できる
収量でえることができる。
ブリエ性凝集原を分離することにより単一培養液からこ
れら成分をワクチン組成物に治療有効量で再混合できる
収量でえることができる。
上記のとおり本発明の方法を行なうに分別工程（ｃ）
の前に上澄液を濃縮する、そして驚いたことに細胞部分
から上澄液を分離後行なつた濃縮工程（ｂ）とこの工程
を連続行なうことによつてFHAの甚しい損失を避けうる
ことがわかつたのである。
の前に上澄液を濃縮する、そして驚いたことに細胞部分
から上澄液を分離後行なつた濃縮工程（ｂ）とこの工程
を連続行なうことによつてFHAの甚しい損失を避けうる
ことがわかつたのである。
培養物の細胞部分と上澄液への分離は培養物pHが7.0
以上、好ましくは8.0又はそれ以上である場合遠心分離
法によつて行なわれる。培養物pHは7.5乃至9.0の範囲が
最もよい。
以上、好ましくは8.0又はそれ以上である場合遠心分離
法によつて行なわれる。培養物pHは7.5乃至9.0の範囲が
最もよい。
遠心分離後上澄液は元の容量の50％以下、好ましくは
25％以下の濃縮減量するとよい。普通の脱水法、例えば
ペリコン濃縮法によつて便利に濃縮できる。濃縮工程後
でLPFとFHA含有部分に上澄液を分ける前残留有機体除去
のため過するとよい。次いで分別工程（ｃ）は上澄液
を例えば管中のヒドロキシアパタイトと接触させて便利
にできる。ここでFHA含有部分は保留されLPF含有部分を
含む溶離液は回収できる。
25％以下の濃縮減量するとよい。普通の脱水法、例えば
ペリコン濃縮法によつて便利に濃縮できる。濃縮工程後
でLPFとFHA含有部分に上澄液を分ける前残留有機体除去
のため過するとよい。次いで分別工程（ｃ）は上澄液
を例えば管中のヒドロキシアパタイトと接触させて便利
にできる。ここでFHA含有部分は保留されLPF含有部分を
含む溶離液は回収できる。
LPF含有部分は普通の蛋白質分別方式、例えば硫酸ア
ンモニウムを用いて塩濃度増加により蛋白質物質を沈澱
させた後適当な緩衝液を用いて沈澱を抽出する方法によ
つて精製できる。抽出液は透析できかくてえたLPF含有
液は例えばEP−Ａ−0003916号に記載の方法により他の
蛋白質と脂肪多糖類を除去して精製できる。
ンモニウムを用いて塩濃度増加により蛋白質物質を沈澱
させた後適当な緩衝液を用いて沈澱を抽出する方法によ
つて精製できる。抽出液は透析できかくてえたLPF含有
液は例えばEP−Ａ−0003916号に記載の方法により他の
蛋白質と脂肪多糖類を除去して精製できる。
故に例えば透析したLPF含有液はフエトウインセフア
ローズ管に応用し保持されたLPFを塩化マグネシウム緩
衝液で溶離できる。
ローズ管に応用し保持されたLPFを塩化マグネシウム緩
衝液で溶離できる。
こうして精製したLPS含有部分は次に再び透析し過
した後解毒することができる。
した後解毒することができる。
FHA含有部分の精製は増加するイオン強度をもつ緩衝
液を用いて部分をヒドロキシルアパタイト吸着剤から溶
離した後例えば塩高濃度における沈澱生成とクロマトグ
ラフ法を含む普通の蛋白質精製法によつて行なうことが
できる。最後に精製されたFHA含有部分は膜過と解毒
工程をうける。
液を用いて部分をヒドロキシルアパタイト吸着剤から溶
離した後例えば塩高濃度における沈澱生成とクロマトグ
ラフ法を含む普通の蛋白質精製法によつて行なうことが
できる。最後に精製されたFHA含有部分は膜過と解毒
工程をうける。
細胞部分からフィムブリエ性凝集原、例えば凝集原２
と３（Ag2+3）を分離するには細胞を洗い適当な緩衝剤
中に均質化するとよい。遠心分離後フィムブリエ性凝集
原含有部分を分離するため上澄液は普通の蛋白質精製法
をうける。したがって例えばフィムブリエ性凝集原含有
部分は液のイオン強度を増して沈澱させた後緩衝液で１
又は２回以上押出し再沈澱し透析できる。結局精製フィ
ムブリエ性凝集原含有部分は膜濾過され解毒される。
と３（Ag2+3）を分離するには細胞を洗い適当な緩衝剤
中に均質化するとよい。遠心分離後フィムブリエ性凝集
原含有部分を分離するため上澄液は普通の蛋白質精製法
をうける。したがって例えばフィムブリエ性凝集原含有
部分は液のイオン強度を増して沈澱させた後緩衝液で１
又は２回以上押出し再沈澱し透析できる。結局精製フィ
ムブリエ性凝集原含有部分は膜濾過され解毒される。
必要ならばフィムブリエ性凝集原部分の脂肪多糖類含
量は例えばポリミキシン−セフアローズ4B管上親和力ク
ロマトグラフ法によつて減少できる。
量は例えばポリミキシン−セフアローズ4B管上親和力ク
ロマトグラフ法によつて減少できる。
解毒工程はLPF、FHAおよびフィムブリエ性凝集原含有
部分を個々に又は例えばアルムアルデヒドの様な普通の
解毒剤と混合して処理して行なわれる。
部分を個々に又は例えばアルムアルデヒドの様な普通の
解毒剤と混合して処理して行なわれる。
LPF、FHAおよびフィムブリエ性凝集原部分からワクチ
ン組成物を生成するためにこれらの部分は治療的有効割
合に混合し単位服用量当り各成分少なくとも１乃至５μ
ｇ、好ましくは少なくとも２μｇを含む服用単位に調合
される。
ン組成物を生成するためにこれらの部分は治療的有効割
合に混合し単位服用量当り各成分少なくとも１乃至５μ
ｇ、好ましくは少なくとも２μｇを含む服用単位に調合
される。
本発明に出発物質として使われるボルデテラ百日咳培
養液生成には普通の成長媒質が使用できる。しかしFHA
を商業的に価値ある収率で製造するためには特に振とう
培養又は撹拌発酵器中のジメチル−β−シクロデキスト
リン（MeCD）２−6mg/mlを含むステイナーとシヨルテの
媒質を用いるとよいことがわかつている。多量の培養物
成長は媒質300ml入り１トンプソンびん中又は10発
酵器中で便利に行なうことができる。ボルデテラ百日咳
の適当株は１、２、３セロタイプ（serotype）のウエル
カム28株である。抗原の適当収率を生成する１、２、３
セロタイプの他の株も使用できる。
養液生成には普通の成長媒質が使用できる。しかしFHA
を商業的に価値ある収率で製造するためには特に振とう
培養又は撹拌発酵器中のジメチル−β−シクロデキスト
リン（MeCD）２−6mg/mlを含むステイナーとシヨルテの
媒質を用いるとよいことがわかつている。多量の培養物
成長は媒質300ml入り１トンプソンびん中又は10発
酵器中で便利に行なうことができる。ボルデテラ百日咳
の適当株は１、２、３セロタイプ（serotype）のウエル
カム28株である。抗原の適当収率を生成する１、２、３
セロタイプの他の株も使用できる。
本発明によるリンパ球増加症促進因子（LPF）、フイ
ラメント状ヘマグルチニン（FHA）および凝集原２と３
（Ag2+3）の製造法は次の実施例に記載する。
ラメント状ヘマグルチニン（FHA）および凝集原２と３
（Ag2+3）の製造法は次の実施例に記載する。
実 施 例 ボルデテラ百日咳培養液を次のとおりつくつた： B.ペルタシス株ウエルカム28の冷凍乾燥アンプルを開け
内容物を殺菌水に分散させ繊維素除去した馬の血液10％
を含む木炭寒天板上にピペツトでとつた。35℃48時間培
養後有機体を多数の木炭寒天板上に２次培養して35℃に
48時間保つた。
内容物を殺菌水に分散させ繊維素除去した馬の血液10％
を含む木炭寒天板上にピペツトでとつた。35℃48時間培
養後有機体を多数の木炭寒天板上に２次培養して35℃に
48時間保つた。
次いで有機体をけずりとつてカサミノ酸１％とMeCD1m
g/mlを含むストレイナーとシヨルターの媒質100mlの入
つている250mlコニカルフラスコ多数に入れた。フラス
コを35℃で毎分180回24時間振とうし、液の５−10mlの
媒質300mlを入れた60トムプソンびんの各々に移した。
びんを振とう機上で35℃でしづかに48時間振とうした後
びん内容物を併せた。
g/mlを含むストレイナーとシヨルターの媒質100mlの入
つている250mlコニカルフラスコ多数に入れた。フラス
コを35℃で毎分180回24時間振とうし、液の５−10mlの
媒質300mlを入れた60トムプソンびんの各々に移した。
びんを振とう機上で35℃でしづかに48時間振とうした後
びん内容物を併せた。
えたボルデテラ百日咳培養液をソルヴアルRC3B遠心分
離機中で5000rpmで１時間分離した。上澄液を傾瀉し細
胞を凝集原２と３（Ag2+3）調合用に４℃で貯えた。
離機中で5000rpmで１時間分離した。上澄液を傾瀉し細
胞を凝集原２と３（Ag2+3）調合用に４℃で貯えた。
10,000分子量カツトオフフイルター付きミリポアペリ
コン装置を用いて上澄液を濃縮した。18の上澄液を約
４の容量に濃縮した。濃厚液を次にゲルマン0.2μ
ｍ、ポリスルホンミニカプセルフイルターをとおして無
菌過をした。
コン装置を用いて上澄液を濃縮した。18の上澄液を約
４の容量に濃縮した。濃厚液を次にゲルマン0.2μ
ｍ、ポリスルホンミニカプセルフイルターをとおして無
菌過をした。
1.フイラメント状ヘマグルチニン（FHA）の精製 ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフ法、硫酸アン
モニウム沈澱法およびセフアローズCL−6Bクロマトグラ
フ法の連続工程によつて培養上澄液からのフイラメント
状ヘマグルチニン（FHA）の精製を行なつた。
モニウム沈澱法およびセフアローズCL−6Bクロマトグラ
フ法の連続工程によつて培養上澄液からのフイラメント
状ヘマグルチニン（FHA）の精製を行なつた。
A.ヒドロキシアパタイトクロマトグラフ法 回転長円体ヒドロキシルアパタイト（BDHケミカルズ
社）400gを0.1M NaOH液500ml中に懸濁させた。粉末を室
温で20分間沈降させ過剰液を傾瀉した。沈澱をNaOH液で
２回洗つた後溶離液のpHが約8.0となるまで蒸留水を洗
つた。
社）400gを0.1M NaOH液500ml中に懸濁させた。粉末を室
温で20分間沈降させ過剰液を傾瀉した。沈澱をNaOH液で
２回洗つた後溶離液のpHが約8.0となるまで蒸留水を洗
つた。
洗つた粉末を0.01Mりん酸塩緩衝液500ml中に懸濁させ
20分後緩衝液を傾瀉した。更に３回りん酸塩緩衝液で洗
つた。
20分後緩衝液を傾瀉した。更に３回りん酸塩緩衝液で洗
つた。
洗つたヒドロキシルアパタイトを0.01Mりん酸塩緩衝
液でpH8.0に平衡させたクロマトグラフ管中につめた。
次いで管を濃縮上澄液容器に接続して蠕動ポンプを用い
て液を約500ml/時の流速で管をとおして送つた。溶離液
はLPF単離用にとりおいた（下記参照）。
液でpH8.0に平衡させたクロマトグラフ管中につめた。
次いで管を濃縮上澄液容器に接続して蠕動ポンプを用い
て液を約500ml/時の流速で管をとおして送つた。溶離液
はLPF単離用にとりおいた（下記参照）。
管を（ｉ） 0.01Mりん酸塩pH8緩衝液、（ii） 0.1M
りん酸塩pH8.0緩衝液および（iii） 0.1Mりん酸塩−0.
5M塩化ナトリウムpH6.5緩衝液で順次洗うことによつて
とりおいたFHA部分から管から溶離した。最終洗浄にお
いて78ml部分を捕集し各部分の280nmにおける光学密度
を記録した。また別の部分のヘマグルチネーチング活性
を新しく洗つたがちようの赤血球を用いて試験した。ヘ
マグルチネーチング滴定値（Log2）７又は７以上をかつ
部分を併せた。溶離記録は図１に示している。
りん酸塩pH8.0緩衝液および（iii） 0.1Mりん酸塩−0.
5M塩化ナトリウムpH6.5緩衝液で順次洗うことによつて
とりおいたFHA部分から管から溶離した。最終洗浄にお
いて78ml部分を捕集し各部分の280nmにおける光学密度
を記録した。また別の部分のヘマグルチネーチング活性
を新しく洗つたがちようの赤血球を用いて試験した。ヘ
マグルチネーチング滴定値（Log2）７又は７以上をかつ
部分を併せた。溶離記録は図１に示している。
B.硫酸アンモニウム沈澱法 上記の併せた部分に硫酸アンモニウムを加えて30％飽
和溶液とした後遠心分離してFHAを沈澱させた。上澄液
を傾瀉しすてて沈澱をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩化
ナトリウム緩衝液にとかし同一緩衝液に対して透析し
た。透析懸濁液を遠心分離し上澄液は次の精製のためと
りおいた。
和溶液とした後遠心分離してFHAを沈澱させた。上澄液
を傾瀉しすてて沈澱をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩化
ナトリウム緩衝液にとかし同一緩衝液に対して透析し
た。透析懸濁液を遠心分離し上澄液は次の精製のためと
りおいた。
C.セフアローズCL−6Bクロマトグラフ法 上記のとおりpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩化ナトリ
ウム緩衝液と平衡させておいた上澄液をセフアローズCL
−6Bゲル上でクロマトグラフ法を行つた。
ウム緩衝液と平衡させておいた上澄液をセフアローズCL
−6Bゲル上でクロマトグラフ法を行つた。
次いで0.05Mりん酸塩−0.5M塩化ナトリウムのpH7.2緩
衝液を用いてFHAを管から溶離し85ml部分を捕集した。
溶離部分を上記の方法で蛋白質とヘマグルチネーチング
活性について検べてヘマグルチネーチング滴定値７又は
７以上をもつ部分を併せた。溶離液の記録は図２に示し
ている。
衝液を用いてFHAを管から溶離し85ml部分を捕集した。
溶離部分を上記の方法で蛋白質とヘマグルチネーチング
活性について検べてヘマグルチネーチング滴定値７又は
７以上をもつ部分を併せた。溶離液の記録は図２に示し
ている。
2.LPFの精製 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフ法工程からの溶
離液をLPF回収のため処理した。
離液をLPF回収のため処理した。
A.硫酸アンモニウム沈澱法 初工程において硫酸アンモニウムを加えて74％飽和溶
液として粗LPFを沈澱させた。えた懸濁液を遠心分離し
て液はすてた。沈澱をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.05M塩
化ナトリウム緩衝液に再懸濁させた。次いで懸濁液を1
5,000rpmで遠心分離して上澄液をとりおいた。生成物を
更に同じ緩衝液で４回抽出しえた上澄液を併せた。
液として粗LPFを沈澱させた。えた懸濁液を遠心分離し
て液はすてた。沈澱をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.05M塩
化ナトリウム緩衝液に再懸濁させた。次いで懸濁液を1
5,000rpmで遠心分離して上澄液をとりおいた。生成物を
更に同じ緩衝液で４回抽出しえた上澄液を併せた。
B.フェトウイン（Fetuin）セフアローズクロマトグラフ
法 併せた上澄液をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.05M塩化ナ
トリウム緩衝液に対して透析した後予めpH7.2の0.05Mり
ん酸塩−0.05M塩化ナトリウム緩衝液と平衡させておい
たフエトウインセフアローズゲル上でクロマトグラフ法
を行つた。管を同じ緩衝液で洗い溶離液はすてた。
法 併せた上澄液をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.05M塩化ナ
トリウム緩衝液に対して透析した後予めpH7.2の0.05Mり
ん酸塩−0.05M塩化ナトリウム緩衝液と平衡させておい
たフエトウインセフアローズゲル上でクロマトグラフ法
を行つた。管を同じ緩衝液で洗い溶離液はすてた。
管からpH6.4の6.7mMトリス−0.013M塩化ナトリウム/3
M塩化マグネシウム緩衝液を用いて精製LPF含有部分を溶
離して50滴部分30個を捕集した。ヘマグルチネーチング
滴定値７又は７以上をもつ部分を集め0.05トリスHCl、1
M NaCl pH8.0の緩衝液２に対し透析した。LPF含有部
分をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩化ナトリウム緩衝液
を用いて再び透析してえた精製LPF含有部分をとりおい
た。
M塩化マグネシウム緩衝液を用いて精製LPF含有部分を溶
離して50滴部分30個を捕集した。ヘマグルチネーチング
滴定値７又は７以上をもつ部分を集め0.05トリスHCl、1
M NaCl pH8.0の緩衝液２に対し透析した。LPF含有部
分をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩化ナトリウム緩衝液
を用いて再び透析してえた精製LPF含有部分をとりおい
た。
3.凝集原２と３（Ag2+3）の製造 遠心分離した細胞部分を発熱物質のない無菌蒸留水で
洗い遠心分離した後pH7.2の0.014Mりん酸塩−0.14M塩化
ナトリウム緩衝液を用いて均質化した。均質化した細菌
懸濁液を9000rpmで遠心分離して細菌細胞を除きボルデ
テラ百日咳フイムブリエを含む上澄液をとりおいた。こ
れに硫酸アンモニウムを加えて最終濃度30％飽和液とし
４℃で懸濁液を一夜放置してフィムブリエ性蛋白質を沈
澱させた。9000rpmで遠心分離した後上澄液をすて冷り
ん酸塩緩衝液で沈澱を抽出した。懸濁液を15000rpmで遠
心分離し上澄液をとりおいた。抽出を４回反復して液を
併せた。
洗い遠心分離した後pH7.2の0.014Mりん酸塩−0.14M塩化
ナトリウム緩衝液を用いて均質化した。均質化した細菌
懸濁液を9000rpmで遠心分離して細菌細胞を除きボルデ
テラ百日咳フイムブリエを含む上澄液をとりおいた。こ
れに硫酸アンモニウムを加えて最終濃度30％飽和液とし
４℃で懸濁液を一夜放置してフィムブリエ性蛋白質を沈
澱させた。9000rpmで遠心分離した後上澄液をすて冷り
ん酸塩緩衝液で沈澱を抽出した。懸濁液を15000rpmで遠
心分離し上澄液をとりおいた。抽出を４回反復して液を
併せた。
併せた上澄液に硫酸アンモニウムを加えて最終濃度15
％飽和液としえた上澄液を４℃で一夜おいてフィムブリ
エ性蛋白質を沈澱させた。
％飽和液としえた上澄液を４℃で一夜おいてフィムブリ
エ性蛋白質を沈澱させた。
懸濁液を15000rpmで遠心分離して上澄液をすてた。
固体をリム酸塩緩衝液で抽出し15000rpmで遠心分離し
た。流出を４回反復しえた上澄液を併せた。この液に硫
酸アンモニウムを加えて最終15％飽和液としこれを４℃
で一夜おいてフィムブリエ性蛋白質を沈澱させた。懸濁
液を15000rpmで遠心分離し上澄液をすてた。（必要なら
ば更に硫酸アンモニウム沈澱法を用いてもよい。） 固体をりん酸塩緩衝液で抽出し15000rpmで遠心分離し
た。上澄液を集め、抽出を４回反復しえた抽出液を併せ
た。
た。流出を４回反復しえた上澄液を併せた。この液に硫
酸アンモニウムを加えて最終15％飽和液としこれを４℃
で一夜おいてフィムブリエ性蛋白質を沈澱させた。懸濁
液を15000rpmで遠心分離し上澄液をすてた。（必要なら
ば更に硫酸アンモニウム沈澱法を用いてもよい。） 固体をりん酸塩緩衝液で抽出し15000rpmで遠心分離し
た。上澄液を集め、抽出を４回反復しえた抽出液を併せ
た。
併せた液をりん酸塩緩衝液に対して透析し膜過し
た。
た。
4.解毒法 すべての抗原をミレツクスGV0.22μｍ過器をとおり
過した。LPF調合液をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩
化ナトリウム緩衝液を用いて最終蛋白質濃度200μg/ml
にうすめた。これにホルムアルデヒド40％溶液を加えて
最終ホルムアルデヒド濃度0.5％とした。LPF含有液を37
℃で14日培養した。この間少なくとも２日に１回内容物
をさかさにして生じた沈澱を分散させた。
過した。LPF調合液をpH7.2の0.05Mりん酸塩−0.5M塩
化ナトリウム緩衝液を用いて最終蛋白質濃度200μg/ml
にうすめた。これにホルムアルデヒド40％溶液を加えて
最終ホルムアルデヒド濃度0.5％とした。LPF含有液を37
℃で14日培養した。この間少なくとも２日に１回内容物
をさかさにして生じた沈澱を分散させた。
えた解毒LPF部分をホルムアルデヒド0.01％とチオメ
ルサル0.01％を含むPBS緩衝液に対して透析し容器に移
し沈澱物質を全部移し貯えた。
ルサル0.01％を含むPBS緩衝液に対して透析し容器に移
し沈澱物質を全部移し貯えた。
同じ解毒法をFHA部分と凝集原２と３（Ag2+3）部分に
応用した、但し培養は37℃で７日間行なつた。
応用した、但し培養は37℃で７日間行なつた。
ホルムアルデヒド0.01％とチオメルサル0.01％を含む
PBS中の解毒した抗原を同じ割合で混合し無菌水、ホル
ムアルデヒド0.04％とチオメルサル0.04％およびアルヒ
ドロゲルを含む４×濃縮PBSでうすめた。等張PBS中のえ
たワクチンは蛋白質120μg/ml、25％アルヒドロゲル、
0.01％ホルムアルデヒドおよび0.01％チオメルサルを含
んでいる。アルデヒドロゲルに対する別の補薬としてり
ん酸アルミニウム（塩化アルミニウムとして加えた）を
使用できる。ワクチンは更にPBS、ジプテリア（dipther
ia）と破傷風トキソイドおよびアルヒドロゲルで稀釈し
て百日咳抗原60μg/ml濃度とすることができる。
PBS中の解毒した抗原を同じ割合で混合し無菌水、ホル
ムアルデヒド0.04％とチオメルサル0.04％およびアルヒ
ドロゲルを含む４×濃縮PBSでうすめた。等張PBS中のえ
たワクチンは蛋白質120μg/ml、25％アルヒドロゲル、
0.01％ホルムアルデヒドおよび0.01％チオメルサルを含
んでいる。アルデヒドロゲルに対する別の補薬としてり
ん酸アルミニウム（塩化アルミニウムとして加えた）を
使用できる。ワクチンは更にPBS、ジプテリア（dipther
ia）と破傷風トキソイドおよびアルヒドロゲルで稀釈し
て百日咳抗原60μg/ml濃度とすることができる。
培養液18からFHA、LPFおよび凝集原２と３（Ag2+3）
を次の収率でえた： FHA 190mg LPF 50mg 凝集原２と３（Ag2+3） 50mg
を次の収率でえた： FHA 190mg LPF 50mg 凝集原２と３（Ag2+3） 50mg
図１は本発明のpH6.5の0.1Mりん酸塩−0.5M NaCl緩衝液
によるヒドロキシルアパタイトからのFHA溶離における2
80nmにおける光学密度とヘマグルチネーチング滴定値
（Log 2）の記録を示している。 図２は本発明のセフアローズCL−6Bクロマトグラフ法に
よるFHA精製における280nmにおける光学密度とヘマグル
チネーチング滴定値（Log 2）の記録を示している。
によるヒドロキシルアパタイトからのFHA溶離における2
80nmにおける光学密度とヘマグルチネーチング滴定値
（Log 2）の記録を示している。 図２は本発明のセフアローズCL−6Bクロマトグラフ法に
よるFHA精製における280nmにおける光学密度とヘマグル
チネーチング滴定値（Log 2）の記録を示している。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ローレンス イアン アイオンズ イギリス国ウイルトシヤー サリスバリ ー ポータンド アベニユー ハウステ ーン （番地なし) (56)参考文献 Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ. １（1985），ＰＰ．11−22
Claims (8)
- 【請求項１】（ａ）百日咳菌の培養液を細胞部分と上澄
液部分とに分離し、 （ｂ）工程（ａ）の後に、上澄液部分をその最初の量の
50％よりも少なくなるまで、濃縮して、水の含有量が減
少した濃縮水性上澄液部分を生成し、 （ｃ）工程（ｂ）の後に、該濃縮上澄液部分をリンパ球
増加促進因子（LPF）含有部分とフィラメント状ヘマグ
ルチニン（FHA）含有部分とに分別し、そして、 （ｄ）細胞部分から少なくとも１つのフィムブリエ性凝
集原を単離する 工程よりなることを特徴とする百日咳菌の培養液からリ
ンパ球増加促進因子（LPF）、フィラメント状ヘマグル
チニン（FHA）及び少なくとも１つのフィムブリエ性凝
集原の同時製造法。 - 【請求項２】工程（ｄ）で単離したフィムブリエ性凝集
原が凝集原２、３、４、５及び６の少なくとも１つ含む
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】工程（ｄ）で単離したフィムブリエ性凝集
原が凝集原２と３（Ag2+3）よりなる特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項４】単離した凝集原が更に凝集原４、５及び６
の１つ又は２つ以上を含む特許請求の範囲第３項記載の
方法。 - 【請求項５】分離工程（ａ）をpH7.0より高いpHにおい
て行う特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１つの
項記載の方法。 - 【請求項６】分離工程（ａ）をpH7.5〜9.0の範囲のpHに
おいて行う特許請求の範囲第５記載の方法。 - 【請求項７】工程（ｂ）において上澄液をその最初の容
量の25％より少なくなるまで濃縮する特許請求の範囲第
１項〜第６項のいずれか１つの項記載の方法。 - 【請求項８】工程（ｃ）においてLPF含有部分をフェツ
インセファローズに吸着させた後塩化マグネシウム緩衝
液を用いて溶離して精製する特許請求の範囲第１項〜第
７項のいずれか１つの項記載の方法。
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-
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