FR2507478A1 - Procede pour preparer l'antigene de surface de l'hepatite b pur a partir du plasma humain - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE POUR PREPARER L'ANTIGENE DE SURFACE DE L'HEPATITE B A PARTIR DU PLASMA HUMAIN. CE PROCEDE CONSISTE A ELIMINER LES LIPIDES ET UNE PARTIE DES PROTEINES PLASMATIQUES, A EFFECTUER UNE DIGESTION PAR LA PEPSINE, ET A FILTRER AVEC DES FILTRES MOLECULAIRES LAISSANT PASSER LES MOLECULES DONT LA TAILLE NE DEPASSE PAS 100000DALTONS DANS UN MILIEU TAMPONNE AU PHOSPHATE AYANT UN PH DE 7, 1-7, 3 ET A DESACTIVER L'INFECTIVITE AVEC DU FORMALDEHYDE.

Description

250747 3

Procédé pour préparer l'antigène de surface de l'hépatite B pur à

partir du plasma humain.

La présente invention concerne un procédé pour préparer l'antigène de surface de l'hépatite B (H Bs Ag) pur à

partir du plasma humain L'H Bs Ag est une protéine virale pré-

sente dans le sang des personnes atteintes d'hépatite infec-

tieuse de type B ou présente constamment dans le sang des porteurs de virus de l'hépatite B L'H Bs Ag après purification

par élimination des protéines plasmatiques résiduelles cons-

titue un vaccin contre l'hépatite infectieuse B qui lorsqu'on l'administre à l'homme ou à l'animal provoque la production

d'anticorps anti-H Bs dans l'organisme du patient Ces anti-

corps protègent l'organisme contre l'infection complète pro-

voquée par les particules infectantes du virus de l'hématite B. On connaît un procédé pour préparer l'H Bs Ag pur par centrifugations multiples de plasma convenablement préparé dans des gradients de densité obtenus avec du saccharose ou du chlorure de césium Dans le procédé de séparation dans un gradient de densité par ultracentrifugation, c'est-à- dire par

centrifugation à grande vitesse, on peut obtenir des prépara-

tions d'H Bs Ag débarrassées des protéines plasmatiques restan-

tes Le procédé d'ultracentrifugation est très long et néces-

site l'emploi de nombreux appareils coûteux et on ne l'uti-

lise-que pour obtenir de petites quantités d'antigène desti-

nées à la recherche Il s'agit donc d'un procédé de labora-

toire et non d'un procédé de production Dans ce procédé, il

n'est pas possible d'obtenir une quantité de matière suffi-

sante pour immuniser par vaccination même un groupe relative-

ment restreint de personnes.

On connaît d'autres procédés pour préparer l'H Bs Ag, qui utilisent la filtration sur des colonnes garnies

de gel, la chromatographie d'affinité ou l'électrophorèse.

Tous ces procédés ne permettent pas d'obtenir des prépara-

tions d'antigène totalement purifiées, sont des procédés de

laboratoire et ont une faible production.

Le procédé de préparation d'H Bs Ag pur selon l'in-

vention consiste à débarrasser la matière initiale des lipides

et partiellement des protéines plasmatiques humaines, à effec-

tuer une digestion avec de la pepsine à raison de 0,01-0,5 mg/mg de protéines, de préférence de 0,05 mg/mg de protéines,

filtrer sur des filtres moléculaires laissant passer les mo-

lécules dont la masse moléculaire ne dépasse pas 100 000 dal-

tons dans un milieu tamponné au phosphate à un p H ne dépassant pas 7,1-7, 3, l'infectiosité étant ensuite désactivée par du formaldéhyde, de préférence à raison de 1/2 000 en volumes

pendant 96 heures.

Le procédé selon l'invention, contrairement aux procédés connus, produit un H Bs Ag totalement débarrassé des protéines plasmatiques Cet antigène, lorsqu'on l'utilise

comme vaccin contre l'hépatite infectieuse de type B, ne pro-

voque aucun effet secondaire au patient vacciné De plus, le

procédé selon l'invention peut être utilisé pour la produc-

tion en grande quantité de vaccins à partir de plasma conte-

nant la protéine virale de l'hépatite B.

La préparation de l'antigène de surface de l'hé-

patite B purifié selon le procédé de l'invention s'effectue

comme suit.

Dans la première phase, on délipide le plasma humain Pour cela, à 1 000 ml de plasma provenant de donneurs

d'H Bs Ag ayant un titre déterminé-par immuno-électro-osmopré-

cipitation d'au moins 1/10, on ajoute 1 000 ml de Mn C 12,

4 H 20 0,1 M.

Après l'addition du chlorure de manganèse, on

agite le plasma dans un agitateur électromagnétique à la tem-

pérature d'un bain glacé pendant 1 heure On centrifuge en-

suite la matière pendant 30 minutes à la vitesse de 6 000 tr/min Après centrifugation, on rejette le précipité qui ne

contient pas d'H Bs Ag.

On porte le p H du liquide surnageant obtenu après centrifugation à 5,6 avec l'acide chlorhydrique 0,1 N et on ajoute du polyéthylèneglycol 6 000 (PEG 6 000) à raison de 75 g pour 1 000 ml de matière On soumet ensuite la matière à une agitation pendant environ 12 heures à la température de 4 C dans un agitateur électromagnétique On retire ensuite la matière de l'agitateur et on la centrifuge pendant 30 minutes

à la vitesse de 6 000 tr/min Le liquide surnageant ne conte-

nant pas d'antigène est rejeté et on recueille le sédiment de

centrifugation pour le soumettre à un traitement ultérieur.

On dissout ce sédiment dans 200 ml de chlorure

de sodium 0,9 N et avec de l'eau désionisée on ramène le vo-

lume à celui précédant la centrifugation Après addition de chlorure de sodium, il se forme un nouveau sédiment dans la solution On effectue une nouvelle centrifugation pendant 30 minutes à la vitesse de 6 000 tr/min Après centrifugation, on recueille le liquide surnageant qui contient l'antigène H Bs et on rejette le sédiment qui ne le contient pas On ajoute de l'eau désionisée pour porter le volume du liquide surnageant à 10 000 ml On élimine une petite quantité de sédiment demeurant après la dilution, par centrifugation pendant 30 minutes à la vitesse de 6 000 tr/min On utilise le liquide surnageant de cette centrifugation dans le stade

suivant du procédé de préparation d'antigène -

On soumet la matière préparée dans l'opération

d'élimination des lipides à une digestion avec une enzyme.

On chauffe 10 000 ml de la matière à environ 370 C en ajus-

tant le p H à 2,5 par addition d'acide chlorhydrique 1 N.

On ajoute à la matière ainsi préparée de la pepsine commer-

cialisée sous le nom Sigma cristallisée plusieurs fois, à

raison d'environ 0,05 mg par mg des protéines de la solution.

On détermine la teneur en protéines de la solution selon une méthode spectrophotométrique Après environ 1 heure, on arrête la digestion par la pepsine en portant le p H de la solution à 4,6 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N Après achèvement de la digestion, on centrifuge la solutionpendant 30 minutes à la vitesse de 6 000 tr/min On ne détecte pas d'H Bs Ag dans le sédiment demeurant après la centrifugation, la totalit de

l'H Bs Ag étant transférée dans le liquide surnageant.

La digestion par la pepsine provoque une dégra-

dation des protéines plasmatiques humaines en motifs poly-

peptidiques dont la taille ne dépasse pas 30 000 daltons.

Cependant, la protéine H Bs Ag ne subit pas de digestion. On effectue ensuite une phase de purification de la matière pour la débarrasser des protéines plasmatiques digérées par la pepsine, par filtration moléculaire sur des

filtres laissant passer les particules dont la taille ne dé-

passe pas 100 000 daltons Èn peut donc utiliser un système de filtration à circuit fermé fabriqué par AMICON Company U.S A dans lequel la matière à filtrer est filtrée plusieurs

fois à travers la zone filtrante o les particules sont éli-

minées d-e la solution par des filtres moléculaires dont la

taille des pores est inférieure à-la limite de filtration.

Selon l'invention, on effectue une filtration avec un filtre de type H 1 x 100 laissant passer les particules dont la taille ne dépasse pas 100 000 daltons Le cycle de filtration complet comporte un pompage répété neuf fois de la matière sous un volume de 80 litres à la pression de 6,3 bars Avant d'introduire la matière dans le système de filtration, on la dilue au volume précédemment indiqué avec de l'eau désionisée

apyrogène tamponnée au phosphate Cette eau peut être produi-

te dans un appareil fabriqué par ELGA Company Grande-Breta-

gne.

La filtration provoque l'élimination complète

des protéines plasmatiques précédemment digérées par la pep-

sine La matière fournie par le système de filtration conte-

nant l'H Bs Ag purifié est placée par portions de 10 000 mi chacune dans un réfrigérateur pendant une durée de 96 heures, avec addition de la quantité de formaldéhyde nécessaire pour obtenir une concentration dans la solution d'environ 1/2 000

en volumes Après sortie du réfrigérateur, on élimine le for-

maldéhyde de la matière par dialyse On effectue ensuite l'ad-

sorption de l'H Bs Ag sur de l'hydroxyde d'aluminium que l'on

ajoute à raison de 1 mg par millilitre de solution On con-

ditionne en ampoules le vaccin final ainsi obtenu.

Le vaccin obtenu comme décrit ci-dessus, lors-

qu'on y recherche la présence de protéines plasmatiques hu-

maines selon la méthode de double diffusion en gélose, ne présente pas de ligne de précipitation à la concentration

de 30 fois avec un plasma -contenant des anti-protéines hu-

maines Cç vaccin ne contient pas non plus de particules in-

fectieuses de virus de l'hépatite B. L'invention est illustrée par l'exemple non

limitatif suivant.

On recueille du plasma contenant de l'H Bs Ag d'un donneur par plasmaphorèse L'activité de i'H Bs Ag déterminée par immuno-électroosmophorèse indique un titre au moins égal

à 1/16 On soumet le plasma humain à une élimination des li-

pides par addition à un litre de plasma de un litre de Mn C 12, 4 H 20 0, 1 M et 150 000 unités internationales d'héparine dans un volume de 30 ml On incube la matière à la température de

la pièce sur un agitateur électromagnétique pendant 0,5 heure.

Ensuite, on centrifuge la totalité de la matière avec un centrifugeur de type Beckman J-6, muni du rotor JA-10 à la vitesse de 6 000 tr/min pendant 30 minutes On rejette le

sédiment obtenu qui est H Bs Ag-négatif et on recueille le sur-

nageant dans un flacon de 2 litres.

On ajoute à la matière une certaine quantité de

solution à 7,5 % de polyéthylèneglycol ayant une masse molé-

culaire de 6 000 On porte le p H à 5,5 avec de l'acide chlor-

hydrique 1 N On place ensuite la matière au réfrigérateur

et on l'incube pendant une nuit sous agitation continue.

Le lendemain, on centrifuge la matière avec le

centrifugeur Beckman J-6 muni du rotor JA-10 à 6 000 tr/min.

On rejette le surnageant qui est H Bs Ag-négatif et on dissout le sédiment dans du chlorure de sodium à 10,9 % et on porte le volume à 2 litres avec de l'eau désionisée Après 20 à 30 minutes, il se forme un sédiment abondant qu'on élimine par centrifugation avec un centrifugeur Beckman J-6 équipé dus rotor JA-10 à 6 000 tr/min en 30 minutes Le filtrat clarifié

obtenu présente une activité de H Bs Ag, déterminée par immuno-

électrophorèse correspondant à un titre de 1/8 On porte ensuite le volume de la matière à 10 litres avec de l'eau désionisée ( 2 litres + 8 litres d'eau désionisée) Après 30 minutes, on observe le dép 6 t d'une petite quantité de sédi- ment que l'on sépare par centrifugation avec un centrifugeur Beckman J-6 équipé du rotor JA-10 o à 6 000 tr/min pendant 30 minutes On obtient un surnageant clarifié dont le titre

déterminé par immuno-électro-osmoprécipitation est de 1/2.

A 10 litres de surnageant, on ajoute 90 g de chlorure de sodium pour obtenir une solution à 0,9 % de

chlorure de sodium.

On incube la matière ainsi préparée à la tempé-

rature de 37 C pendant 12 heures Ensuite, on ajoute au li-

quide ayant une température de 37 C et un p H de 2,5, de la

pepsine à raison de 0,05 ml/ml, c'est-à-dire 0,5 g de pepsi-

ne pour 10 litres de matières On effectue la digestion de

la solution par la pepsine pendant une heure à la tempéra-

ture de 37 C Après une heure, on arrête la digestion en élevant le p H à 3,5 avec de l'hydroxyde de sodium 0,1 N.

On centrifuge le sédiment restant avec un cen-

trifugeur Beckman J-6 équipé du rotor JA-10 à 6 000 tr/min

pendant 20 minutes, puis on le rejette.

On soumet le surnageant à une filtration molé-

culaire dans l'appareil DC 30 d'AMICON Company en utilisant

des filtres à fibres creuses H 10 x 100.

Le produit de la filtration moléculaire dont

le volume est de 10 litres a un titre déterminé par immuno-

électro-osmoprécipitation de l'H Bs Ag de 1/2.

Cette matière concentrée 100 fois ne forme pas

de ligne de précipitation selon la technique d'immuno-diffu-

sion sur gélose avec du plasma d'animal anti-Ig G, anti-Ig M, anti-Ig A, anti-protéine humaine et anti-protéine plasmatique humaine. La vaccination des animaux de laboratoire tels que le cobaye ou le lapin avec la matière concentrée 100 fois ne provoque pas de réponse immunologique contre des

protéines dérivant du plasma humain contaminant la prépara-

tion On obtient une seule ligne de précipitation avec la

matière contenant l'H Bs Ag.

La matière obtenue selon le procédé décrit est fortement immunogène comme l'ont montré la vaccination de

chimpanzé, et une douzaine environ de volontaires humains.

Caractéristiques chimiques du vaccin contre l'hépatite vi-

rale B. H Bs Ag 0,5 lg/cm 3 Protéines totales 0,5 plg/cm 3 Polypeptides poids moléculaire 30 000 0,02 lig/cm 3 Na Cl 0,85 % Hydroxyde d'aluminium 1 mg/cm 3 Merthiolate 100 p g/cm Les tests de la troisième génération n'ont pas montré la présence dans la matière d'H Bc Ag, d'H Be Ag, ni d'ADN-polymérase.

Claims (3)

REVENDICATIONS

1 Procédé pour préparer l'antigène de surface de l'hépatite B pur à partir de plasma humain consistant en une élimination des lipides et d'une partie des protéines plasmatiques, une dégradation enzymatique des protéines de

lest restantes et un isolement final des particules antigé-

niques à activité immunologique, caractérisé en ce que la matière initiale délipidée est partiellement débarrassée des protéines plasmatiques et soumise à une digestion avec de la pepsine à raison de 0, 01 à 0,50 mg/mg et de préférence de 0,05 mg/mg, puis est filtrée sur des filtres moléculaires laissant passer les particules dont la taille ne dépasse pas 000 daltons dans un milieu tamponné au phosphate ayant un p H de 7,1 à 7,3 et l'infectivité est inactivée avec du

formaldéhyde.

2 Procédé selon la revendication 1, caractéri-

sé en ce que la matière initiale est soumise à une digestion

avec la pepsine à raison de 0,05 mg/mg de protéines.

3 Procédé selon la revendi-ation 1, caractéri-

sé en ce que l'infectivité de l'antigène purifié par élimina-

tion des protéines plasmatiques est inactivée avec du formal-

déhyde à raison-de 1/2 000 vol/vol pendant une durée de 96 heures.