CH650682A5 - Verfahren zur herstellung von reinem hepatitis b antigen aus menschlichem plasma. - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von reinem Hepatitis B Antigen (HBsAg) aus menschlichem Plasma. Das HBsAg ist ein Virusprotein, das im Blut von Menschen vorkommt, die an infektiöser Hepatitis B leiden oder immer im Blut von Trägern des Hepatitis B Virus vorhanden ist. Nach der Reinigung von restlichem Plasma-Protein stellt HBsAg einen Impfstoff für infektiöse Hepatitis B dar, welcher nach der Verabreichung an Menschen oder Tiere die Produktion von HBs-Antikörpern im Organismus des Patienten verursacht. Diese Antikörper schützen den Organismus vor einer vollständigen Infektion, nämlich einer Infektion, die durch infektiöse aktive Teilchen des Hepatitis B Virus verursacht wird.
Es gibt ein bekanntes Verfahren zur Herstellung von reinem HBsAg durch mehrfaches Zentrifugieren von geeignet vorbereitetem Plama in Dichte-Gradienten, erhalten aus Saccharose odér Caesiumchlorid. Bei dieser Trennmethode mit Dichte-Gradienten durch Ultra-Zentrifugieren, nämlich durch Zentrifugieren bei hohen Geschwindigkeiten, kann man HBsAg-Präparate erhalten, die von restlichem Plasma befreit sind. Diese Ultra-Zentrifugiermethode ist sehr zeitraubend, sie verlangt die Anwendung zahlreicher teurer Apparate und kann daher nur zur Herstellung geringer Mengen des Antigens, das nur für wissenschaftliche Zwecke bestimmt ist, verwendet werden. Aus diesen Gründen eignet sich diese Methode nur für das Laboratorium, nicht aber für eine industrielle Anwendung. Nach dieser Methode besteht keine Möglichkeit, grössere Mengen des Materials, das für eine Immunisierung durch Impfen, sogar für eine verhältnismässig nicht grosse Gruppe von Menschen, notwendig ist, zur Verfügung zu stellen.
Es sind noch weitere Methoden zur Herstellung von HBsAg bekannt, die auf der Filtration an mit Gel gepackten Kolonnen, auf der Affinitätschromatographie sowie auf der Elektrophorese beruhen. Es ist nicht möglich, nach all diesen beschriebenen Methoden Antigen-Präparate zu erhalten, die vollständig gereinigt sind. Die beschriebenen Methoden eignen sich für das Laboratorium und sie arbeiten nur mit einer sehr geringen Ausbeute.
Das erfmdungsgemässe Verfahren zur Herstellung von reinem Hepatitis B Antigen beruht darauf, dass man menschliches Plasma, das von Lipiden und teilweise von Proteinen befreit war, mit Pepsin in einer Menge von
0,01-0,5 mg/mg Protein digeriert, vorzugsweise mit 0,05 mg Pepsin/mg Protein, in einem Phosphat-gepufferten Medium, das einen pH-Wert von 7,1-7,3 aufweist, an Molekularfiltern, die Teilchen bis zu 1,6603 • 10~19 g durchlassen, filtriert und die Infektiosität mit Formaldehyd inaktiviert, vorzugsweise mit einem Volumverhältnis von 1: 2000 während 96 Stunden.
Im Vergleich mit bekannten Verfahren liefert das erfmdungsgemässe Verfahren ein HBsAg, das vollständig von Plasma-Proteinen befreit wurde. Wenn man das erfindungs-gemäss erhaltene Antigen als Impfstoff gegen infektiöse Hepatitis B verwendet, so treten bei den geimpften Patienten keine unerwünschten Nebenerscheinungen auf. Ausserdem kann man das erfmdungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer grösseren Menge Impfstoff aus Plasma, welches Hepatitis B Virus-Protein enthält, verwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfmdungsge-mässen Verfahrens wird das gereinigte Hepatitis B Antigen folgendermassen hergestellt:
In der ersten Phase werden die Lipide aus dem menschlichen Plasma entfernt. Für diesen Zweck gibt man zu 1000 ml Plasma, das von einem Hepatitis B Antigen-Träger erhalten wurde und einen Titer von mindestens 1:16 aufwies, bestimmt nach der immunoelektroosmotischen Ausfällungsmethode (IEOP) 1000 ml 0,1 molares Manganchlorid (MnCl2 • 4H20). Nach dieser Zugabe von Manganchlorid wurde das Plasma in einem elektromagnetisch angetriebenen Mischgefäss bei der Temperatur eines Eisbades eine Stunde lang gerührt. Anschliessend wird das Material 30 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 6 U/Min. zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der Niederschlag, welcher kein HBsAg enthält, verworfen.
Die überstehende Flüssigkeit, die man nach dem Zentrifugieren erhält, wird unter Verwendung von 0,1 HCl ayf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt. Anschliessend gibt mân Po-lyethylenglycol 6000 (PEG 6000) in einer Menge von 7:5 g pro 1000 ml des Materials hinzu. Dann wird das Material etwa 12 Stunden lang bei einer Temperatur von 0 °C in einem Gefäss, das elektromagnetisch betrieben wird, gerührt. Nach der Entfernung aus dem Mischgefäss wird das erhaltene Material 30 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 6000 U/Min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, welche kein Antigen enthält, wird verworfen und man sammelt den erhaltenen Niederschlag, der nach dem Zentrifugieren erhalten wird, für eine weitere Verarbeitung.
Man löst diesen Niederschlag in 200 ml einer 0,9%igen Natriumchloridlösung auf und ergänzt diese Lösung mit entionisiertem Wasser auf dasjenige Volumen, welches sie vor dem Zentrifugieren aufwies. Nach der Zugabe von Natriumchlorid trat in der Lösung wieder ein Niederschlag auf. Diese Lösung wurde abermals 30 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 6000 U/Min. zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit, welche das Hepatitis B Antigen enthielt, gesammelt, der Niederschlag, der das gewünschte Antigen jedoch nicht enthielt, wurde verworfen. Durch die Zugabe von entionisiertem Wasser nimmt das Volumen der überstehenden Flüssigkeit bis zu 10 000 ml zu. Eine geringe Menge eines Niederschlages, der nach der Verdünnung zurückbleibt, wird durch Zentrifugieren innerhalb von 30 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 6000 U/Min. entfernt. Für den weiteren Schritt der Antigenherstellung verwendet man die überstehende Flüssigkeit, welche bei dem beschriebenen Zentrifugieren erhalten wird.
Das im Laufe der Lipid-Entfernung erhaltene Material wird nun mit einem Enzym digeriert. Für diesen Zweck erhitzt man 10 000 ml des Materials auf eine Temperatur von etwa 37 °C und stellt den pH-Wert durch Zugabe von 1 nor-
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maier Chlorwasserstoffsäure auf 2,5 ein. Zu dem Material, das auf diese Weise hergestellt war, gab man Pepsin «Sigma», welches zweimal in einer Menge von K 0,05 mg pro 1 mg Protein, das sich in der Lösung befand, umkristallisiert war. Der Gehalt an Proteinen, welche sich in der Lösung befanden, wurde nach einer spektrophotometrischen Methode bestimmt. Nach etwa einer Stunde wird das Digerieren mit Pepsin unterbrochen, indem man zu der Lösung 1 normales Natriumhydroxid hinzufügte und den pH-Wert der Lösung auf 4,6 einstellte. Nach Beendigung des Digerierens wird die Lösung 30 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 6000 U/Min. zentrifugiert. In dem Niederschlag, welcher nach dem Zentrifugieren zurückbleibt, konnte man ein HBsAg, welches in seiner Gesamtheit in die Überstehende Flüssigkeit überging, feststellen.
Das Digerieren mit Pepsin verursachte einen Abbau der im menschlichen Plasma enthaltenen Proteine in Polypeptid-einheiten, welche eine Grösse haben, die 4,9809 • IO 20 g nicht überschreitet. Das HBsAg-Protein unterliegt jedoch einer Digerierung.
Anschliessend erfolgt die Reinigung des Materials von den Plasma-Proteinen, welche mit Pepsin digeriert wurden, durch Molekularfiltration auf Filtern, welche Teilchen bis zu einer Grösse von 1,6603 • 10~19 g passieren lassen, wobei die Filtration in einem Phosphat-gepufferten Medium bei einem pH von 7,1-7,3 durchgeführt wird. Für diesen Zweck kann man ein geschlossenes Filtersystem der Firma AMICON Company, USA verwenden, worin das zu filtrierende Material viele Male durch die Filtrierzone gepumpt wird, in welcher Teilchen aus der Lösung durch Molekülfilter, die kleiner sind als die Grenzen der Filteröffnungen, zurückgehalten werden. Erfindungsgemäss setzt man vorzugsweise Filter des Typs H 1 x 100 ein, durch welche Teilchen bis zu 1,6603 • 10~19 g hindurchgehen können. Ein vollständiger Filtrationszyklus umfasst eine neunmalige Durchpumpung des Materials mit einem Volumen von 80 Liter unter einem Druck von 61 782 Pa. Bevor man das Material in das Filtersystem einführt, wird sein Volumen, wie weiter oben beschrieben, mit Phosphat-gepuffertem, entionisiertem, apyro-genem Wasser verdünnt und der pH-Wert liegt bei 7,1-7,3. Ein derartiges Wasser kann in einem Apparate, welcher von ELGA Company, Grossbritannien produziert wird, erhalten werden.
Im Verlaufe des Filtrierens wird das im Plasma enthaltene Protein, das vorher mit Pepsin digeriert wurde, vollständig ausgewaschen. Das aus dem Filtersystem erhaltene Material, welches gereinigtes HBsAg enthält, wird in Portionen von je 10 000 ml 96 Stunden lang in einen Kühlschrank gegeben, nachdem man Formaldehyd hinzugegeben hatte, und zwar in einer Menge die nötig ist, damit eine Konzentration in der Lösung von etwa 1 :2000, bezogen auf das Volumen, entsteht. Man nimmt das Produkt aus dem Kühlschrank heraus und entfernt den Formaldehyd durch De-Dialyse. Anschliessend wird HBsAg an Aluminiumhydroxid adsorbiert, das man in einer Menge von 1 mg pro 1 ml der Lösung hinzugab. Der auf diese Weise erhaltene Impfstoff wurde in Ampullen eingefüllt.
Der auf diese Weise erhaltene Impfstoff wurde auf die Anwesenheit von Proteinen aus menschlichem Plasma nach der Methode der Doppel-Diffusion in Agar analysiert und man stellte fest, dass bei einer 30-fachen Konzentration mit Plasma von nicht-menschlichen Proteinen keine Ausfällungslinien auftraten. Daraus geht hervor, dass der Impfstoff keine infektiösen Teilchen des Hepatitis B Virus enthält.
Beispiel
Einem Spender entnahm man HBsAg-Plasma durch Plasmaphorese und sammelte dieses Plasma. Die Aktivität von HBsAg wurde durch immunoelektroosmophorese bestimmt, wobei der Titer nicht weniger als 1 : 16 betrug. Das menschliche Plasma wurde anschliessend der Entfernung der Lipide unterworfen, indem man zu 1 Liter Plasma 1 Liter 0,1 M MnCl2 • 4 H20 und 150 000 Int. Einheiten Heparin in einem Volumen von 30 ml gab. Dieses Material wurde bei Zimmertemperatur in einem elektromagnetischen Rührge-fäss 0,5 Stunden lang bebrütet. Anschliessend wurde das gesamte Material mit einer Zentrifuge des Typs Beckman J-6, im Rotor JA-10 bei 6000 U/Min. 30 Minuten lang zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag, welcher HBsAG(-) darstellt, wird verworfen und die überstehende Flüssigkeit wird in einer Flasche, die ein Volumen von 2 Liter aufweist, gesammelt.
Zu diesem Material gab man etwa 7,5% einer PEG-Lösung, die eine molekulare Masse von 6000 besass. Durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure stellte man den pH-Wert auf 5,5 ein. Dann gab man das Material in einen Kühlschrank und bebrütete über Nacht unter Rühren.
Am nächsten Tag wurde das Material an einer Beckman J-6Zentrifuge in dem Rotor JA-10 bei 6000 U/Min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit, welche HBsAg(-) ist, wird verworfen, und den Niederschlag löst man in 200 ml 10,9%iger Natriumchloridlösung auf und füllt mit entionisiertem Wasser bis zu einem Volumen von 2 Liter auf. Nach 20-30 Minuten wird der ausgiebig entstandene Niederschlag durch Zentrifugieren mit einer Beckman J-6 Zentrifuge in dem Rotor JA-10 bei 6000 U/Min. innerhalb von 30 Minuten entfernt. Das erhaltene geklärte Filtrat zeigte eine HBsAg-Aktivität, unter Verwendung von Immunoelektroosmophorese mit einem Titer von 1: 8. Das Volumen des Materials wurde dann auf 10 Liter unter Verwendung von entionisiertem Wasser vergrössert (2 Liter + 8 Liter entionisiertes Wasser). Nach 30 Minuten konnte man feststellen, dass sich eine geringe Menge eines Niederschlages bildete, welcher durch Zentrifugieren mit einer Beckman J-6 Zentrifuge in den Rotor JA-10 bei 6000 U/Min. während 30 Minuten entfernt und dann verworfen wurde. Man erhielt eine geklärte überstehende Lösung, deren Titer etwa 1: 2 betrug, festgelegt nach dem Immunoelektroosmoimmunotest.
Zu 10 Liter der überstehenden Flüssigkeit gibt man 90 g Natriumchlorid, welches man in Form einer 0,9%igen Lösung hinzufügte.
Das auf diese Weise hergestellte Material wurde bei einer Temperatur von 37 °C 12 Stunden lang bebrütet. Nach dieser Zeit gab man zu der Flüssigkeit, die eine Temperatur von 37 °C hatte und einen pH-Wert von 2,5 aufwies, 0,05 ml/ml Pepsin, und zwar in einer solchen Menge, dass 0,5 g Pepsin pro 10 Liter Material vorhanden waren. Die Pepsin-Digerierung dieser Lösung wurde eine Stunde lang bei der Temperatur von 37 °C durchgeführt. Nach einer Stunde wird die Digerierung unterbrochen, indem man den pH-Wert durch Zugabe von 0,1 N Natriumhydroxid auf 3,5 erhöhte.
Den entstandenen Rückstand trennte man durch Zentrifugieren an einer Beckman J-6 Zentrifuge in dem Rotor JA-10 bei 6000 U/Min. während 30 Minuten ab; dieser Rückstand wurde verworfen.
Die überstehende Flüssigkeit wurde einer Molekularfiltration in dem Apparat DC 30 der AMICON Company unterworfen, wobei man ausgehöhlte Faserfilter H 10 x 100 verwendete.
Die Filtration wird in einem Phosphat-gepufferten Medium bei pH 7,1-7,3 durchgeführt. Das nach der Molekular-filtration erhaltene Material hatte ein Volumen von 10 Liter und der Titer, in bezug auf die Menge an HBsAg, betrug 1 : 2, bestimmt durch Immunoelektroosmoausfallung.
Das genannte Material zeigte bei einer 100-fachen Konzentration keine Fällungslinien bei der Immunodiffusions-
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methode an Agar, unter Verwendung von Tierplasma: -anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, nichtmenschliches Protein sowie Plasma nicht-menschliches Protein.
Die Impfung von Laboratoriumstieren, wie z. B. Meerschweinchen oder Kaninchen, mit einem 100-fach konzentrierten Material, ergab keine immunologische Reaktion in bezug auf die Vergiftung des Präparates mit Proteinen, die aus menschlichem Plasma stammten. Man erhielt nur eine einzige Ausfallungslinie mit dem HBsAg enthaltenden Material.
Das Material, dessen Herstellung weiter oben beschrieben wurde, verhält sich äusserst immunogen, wie durch die Impfung von Schimpansen sowie auch Menschen (Freiwillige) nachgewiesen werden konnte.
Chemische Eigenschaften des Impfstoffes gegen Virushepatitis B HBsAg - 0,5 um/cm3
Gesamt-Protein - 0,5 p.m/cm3
Polypeptide
-Molekulargewicht 30 000 - 0,02 [xm/cm3 NaCl - 0,85%
Aluminiumhydroxid - 1 mg/cm3
Merthiolat - 100 um/cm3
In dem Material konnte die Anwesenheit von HBcAg, HBeAg und DNA-Polymerase nicht festgestellt werden, falls man die Tests der dritten Generation verwendete.
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Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von reinem Hepatitis B Antigen aus menschlichem Plasma, wobei man die Lipide und einen Teil des Plasma-Proteins entfernt, die restlichen Ballast-Proteine enzymatisch abbaut und schliesslich die immunologisch aktiven Antigenteilchen isoliert, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Plasma die Lipide und teilweise die Proteine entfernt und das so erhaltene Ausgangsmaterial mit 0,01-0,50 mg Pepsin/mg Protein digeriert, an einem Molekularsieb filtriert, das noch Teilchen bis zu 1,6603 • 10~19 g hindurchlässt, wobei man in einem Phosphat-gepufferten Medium bei einem pH-Wert von 7,1-7,3 arbeitet und die Infektiosität mit Formaldehyd inaktiviert'.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Ausgangsmaterial mit Pepsin in einer Menge von 0,05 mg/mg Protein digeriert.
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PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das von den Plasmaproteinen gereinigte Antigen in bezug auf seine Infektiosität mit 1: 2000 Vol./Vol. Formaldehyd während 96 Stunden inaktiviert.
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