DE3005495C2

DE3005495C2 - Herstellung von Fragmenten von Viren mit Lipidhülle und sie enthaltende Arzneimittelzubereitungen

Info

Publication number: DE3005495C2
Application number: DE19803005495
Authority: DE
Inventors: Philipe Garches Adamowicz; Ludwig Plessis-Robinson Muller
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1980-02-14
Filing date: 1980-02-14
Publication date: 1983-03-31
Also published as: DE3005495A1

Description

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Erfindungsgegenstand Ist das im Patentanspruch 1 genannte Verfahren sowie die durch den Patentanspruch 9 definierten Arznelniittelzubereitungen. Die PatentansDrüche 2 bis 8 nennen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders zweckmäßig für die Behandlung von Viren, insbesondere Grippeviren, die die Gewinnung von Impfstoffen auf Basis von Grippevirusfragmenten ermöglichen.

Ein Grippeviruspartikel besteht aus einem Ribonucleinsäurekern, der mit einem Nucleoprotein assoziiert ist, das die Typspezifität des Virus bestimmt. Der Kern ist einerseits von einem inneren Proteinmantel und andererseits von einer äußeren Lipidhülle umgeben, die mit Glykoproteinvorsprüngen (oder Spießen) besetzt ist. Der Innenmantel wird gewöhnlich als Proteinmatrix (oder auch Protein M) bezeichnet. Die Lipidhülle wird als Mantel bezeichnet, und die Vorsprünge, die zu zwei verschiedenen Klassen von Glykoprotelnen gehören, werden als Neuraminidase (NA) bzw. Hämagglutlnin (HA) bezeichnet.

Es ist allgemein bekannt, daß die Neuraminidase und das Hfmagglutlnin Antigene des Grippevirus und notwendig sind, um gute Immunität beim Menschen gegen Krankheit auszulösen. Demzufolge muß jeder Grippeimpfstoff diese beiden Antlgentypen In genügenden Mengen enthalten.

Es Ist davon auszugehen, daß es zur Zelt drei Typen von Impfstoffen auf Basis von Inaktivierten Aniigenen gibt. Der erste Typ besteht aus Antlgenen von ganzen Viria. Dieser Impfstofftyp erzeugt bekanntlich nach der Injektion beim Menschen unerwünschte Reaktionen, die an das komplette Viruspartikel gebunden sind.

Ein zweiter Impfstofflyp besteht aus zersprengten und teilweise llpidfrelen Viria: Die Lipidhülle der vorher gereinigten VIrIa wird durch gleichzeitige Einwirkung eines Lösungsmittels der Lipide, z. B. Äther, und eines Detergens zerrissen. In der Praxis erfolgt die Extraktion der Lipide Im Zweiphasensystem aus Lösungsmittel und Probe. Sie erfordert die Verwendung von 1 bis 2 Raumteilen Äther pro Raumteil Viruspräparat, und diese Maßnahme kann zwei- bis dreimal wiederholt werden. Das In dieser Welse erhaltene Präparat enthält die Antigene HA und NA sowie alle Bestandteile Im Innern der Hülle, und es enthält außerdem das verwendete Detergens. Obwohl ein solches Präparat somit alle Bestandteile des Vlrlons mit Ausnahme eines Teils seiner Lipide enthält, gilt dieser zweite Impfstofftyp als weniger reaktogen als der erste Typ

Schließlich besteht ein dritter Impfstofftyp allein aus den Glykoproteinen HA und NA. In der Praxis werden die vorher gereinigten Viria mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt, so daß lediglich JIe Vorsprünge vom Viruskern entfernt werden, der durch die Lipidhülle, die alle Inneren Bestandteile des Vlrlons umschließt, gebildet wird, und dieses Präparat wird anschließend einer Zonenfraktlonlerung unterworfen, die durch Ultrazentrlfugierung der Probe mit Dichtegradient erfolgt, wobei die leichte Fraktion des Gradienten die Antigene HA und NA und die schwere Fraktion die Kerne enthält. Aus der Tatsache, daß die Antigene HA und NA sich In der leichten Fraktion des Gradienten wiederfinden, Ist festzustellen, daß die evtl. verunreinigenden Elerelwelße sowie das Detergens In dieser Fraktion zurückgewonnen werden. Dies stellt ein Handicap für diesen Impfstofftyp dar. Schließlich Ist sein Immunisierungsvermögen bei gleichen Dosen der Antigene HA und NA bekanntlich schwächer als das des Impfstoffs auf Basis von kompletten Viria, bedingt wahrscheinlich dadurch, daß die genannten Antigene Ihre ursprüngliche Anordnung auf der Lipidhülle des Vlrlons verloren haben.

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Die vorstehenden Ausführungen, die nur eine kurze Zusammenfassung darstellen, haben den Zweck, den Stand der Technik auf dem Gebiet der Erfindung darzulegen. Um diesen Stand der Technik zu veranschaulichen, wird außerdem eine Reihe von Literaturstellen genannt, die den Stand der Technik abgrenzen. Eine neuere Arbeit von Peter A. Gross und Francis A. Ennis in »The New England Journal of Medicine« vom 10. 3. 1977, Band 296, Nr. 10, Seite 567 bis 568, stellt einen Vergleich an zwischen Grippe-Impfstoffen, die aus dem ganzen Virus und aus zersprengten Viria hergestellt worden sind. Die in dieser Arbeit genannten Literaturstellen befassen sich ebenfalls mit der Technik der Herstellung von Grippe-Impfstoffen.

Als weitere spezialisierte Arbeiten sind insbesondere die folgenden zu nennen:

R. G. Webster und W. G. Laver »The Journal of Immunology« 96, Nr. 4 Π966) 596 ff.; »InP.uenza virus subunit vaccines; imniunogenicity and lack of toxicity or rabbits of ether- and detergent disrupted virus«.

Diese Arbeit befaßt sich mit der Untersuchung von Impfstoffen, die Untereinheiten des Virus enthalten, die durch Zerreissen mit Äther und oberflächenaktiven Mitteln erhalten wurden. Es wird festgestellt, daß die Behandlung von Mlxoviren mit Äther die Beseitigung ihrer pyrogenen Aktivität ermöglicht, obwohl das erhaltene Produkt sein Immunisierungsvermögen bei Tier und Mensch bewahrt. Es wird festgestellt, daß die Detergentien außerdem die Virionen zerteilen und die hämagglutlnierenden Untereinheiten freisetzen. Der Umgang mit den Detergentien gilt als weniger gefährlich als die Handhabung des Äthers bei der Herstellung der Impfstoffe. Die Verfasser haben insbesondere Arbeiten mit dem Ziel durchgeführt, zu ermitteln, ob die durch Detergentien zerrissenen oder zerteilten Grippeviren bei Kaninchen toxisch sind, und sie verglichen quantitativ das Immunisierungsvermögen der Vlrus-Unterelnheiten mit ganzen intakten Viren und den mit Äther behandelten Viren. Als Detergentien wurden Natrlumdodocylsulfat und Natriumdesoxycholat verwendet.

In der Arbelt von B. A. Rubin, W. A. Plerzchala und A. R. Neurath »Ellcltation of antibody response against influenza viruses by different viral subunit preparations« In »Archiv für Virusforschung«, Band 20H2, Seite 268 ff., untersuchen die Verfasser Viruspräparate, die durch Behandlung des Virus mit Kombinationen des oberflächenaktiven Mittels »Tween« und Äther sowie Natrlumdesoxycholat und anschließende Reinigung der HA-Antigene durch Adsorption-Desorption an roten Blutkörperchen erhalten worden waren. Die Verfasser stellen fest, daß die durch Behandlung mit Natriumdesoxycholat erhaltenen Präparate von HA-Antigenen ein geringeres Immunisierungsvermögen haben als die durch Behandlung mit Tween-Äther erhaltenen Präparate.

Die Arbelt von A. R. Neurath et al in »Microbios« (1970) 7-8, 209-224, Band 2, mit dem Titel »The effect of non aqueous solvents on the quaternary structure of viruses: properties of haemagglutinins obtained by disruption of influenza viruses with trl(n-butyl)-phosphate« bo beschreibt das Zerteilen von Grippeviren mit Tri(nbutyD-phosphat (TNBP) in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels »Tween 80«. Die Verfasser untersuchen die Eigenschaften der nach dem Zerteilen erhaltenen Hämagglutinine und stellen fest, daß diese HA-Hämag- b5 glutinine den durch Behandlung mit Diätliyläther erhaltenen Hämagglutlninen ähneln. Indessen lsi TNBP beim Virustyp B/Mass. viel weniger schädlich für die Neuraminidase als Äther.

Der Artikel von Frederik L. Ruben und George Gee Jackson in »The Journal of Infectious diseases« Band 125, Nr. 6, Juni 1972, Seite 556 bis 664, mit dem Titel »A new subunit influenza vaccine: Acceptability compared with standard vaccines and effect of dose on antigenicity« befaßt sich mit Arbeiten über das mit Tri(n-butyl)phosphat zerteilte Grippevirus. Die Verfasser stellen die gute Impfwirkung der erhaltenen Präparate und die Verminderung der pyrogenen Reaktionen bei der Verabreichung fest.

Die Arbeit von H. Fukumi in dem Bericht über das »International Symposium on Influenza Vaccines for Men and Horses«, London 1972; Symp. Series Immunoblol. Standard Band 20, Seite 99 bis 105 (Karger, Basel/München/Paris/London/New York/Sydney 1973), mit dem Titel »Production and Potency standardization of hemagglutinin sub-unit influenza vaccine« untersucht die durch Behandlung des ganzen Grippevirus mit Äther erhaltenen Untereinheiten.

Der Artikel von W. G. Laver und R. G. Webster in »Virology« 69 (1976) 511 bis 522 mit dem Titel »Preparation and Immunogenicity of an influenza virus hemagglutinin and neuraminidase subunit vaccine« befaßt sich mit der Herstellung des Grippevirus-Präparats durch Behandlung mit Ammoniumdesoxycholat. Andere Tenside, z. B. Natriumdodecylsulfat und das Produkt der Handelsbezeichnung »Triton X-100« werden ebenfalls genannt. Die Verfasser stellen fest, daß das Ammoniumdesoxycholat zu einem Impfstoff aus zerteilten Virla führt, in dem das Hämagglutinin und die Neuraminidase ebenso wirksam sind wie im Impfstoff auf Basis des inaktivierten ganzen Virions.

Der Artikel von H. Bachmayer et al in »Postgraduate Medical Journal« (Band 52, Juni 1976, Seite 360 bis 367) mit dem Titel »Preparation and properties of a novel influenza subunit vaccine« beschreibt die selektive Lösllchmachung von Hämagglutinin und Neuraminidase aus ganzen Grippeviren durch Einwirkung eines kationaktiven Tensids, nämlich CTAB (Ammoniumcetyltrimethylbromid). Die Verfasser stellen fest, daß die Technik der Lösllchmachung die immunisierenden Eigenschaften der beiden Antigene HA und NA nicht ungünstig beeinflußt. Diese Arbeiten werden bestätigt und ergänzt von M. Just et al in »Medical Microbiology und Immunology« 164 (1978) 277 bis 284 mit dem Titel »A New Jersey/76 Influenza Vaccine Trial in Seronegative School children: Comparison of a subunit vaccine with a whole-virus Vaccine«. Dieser Artikel vergleicht die Eigenschaften der Vaccine aus dem ganzen Virus und der Vaccine aus Untereinheiten, die nach dem Verfahren von H. Bachmayer et al erhalten worden sind.

Der Artikel von M. Leigh Hammond et al in Med. J. Aust. 1 (1978) 301 bis 303 »Effective protection against influenza after vaccination with subunit vaccine« berichtet über eine klinische Untersuchung der Ergebnisse von Impfungen gegen Grippe.

In den vorstehend genannten Veröffentlichungen sind ferner zahlreiche Literaturstellen genannt, auf die der Fachmann nach Bedarf zurückgreifen kann. Diese Einzelheiten des Standes der Technik lassen eine praktisch universelle Übereinstimmung hinsichtlich des Nutzens und der Vorteile von Impfstoffen auf Basis von zerteilten Viria oder HA- und NA-Untereinheiten erkennen. Alle Forscher bemühen sich jedoch, die in allgemeiner Weise bekannte Technik der Zerteilung der Viria zu verbessern und insbesondere Zerleilungsreagenlien zu finden, die einfacher und bequemer zu handhaben sind und Weiter-

Verarbeitungsbedingungen ermöglichen, die zu einer wirksameren Entfernung der Nebenprodukte führen, die häufig für unerwünschte Nebenreaktionen bei der Verabreichung des Impfstoffs verantwortlich sind.

Die Erfindung ist im Prinzip auf ein Verfahren zur _s gelenkten Zerteilung von Viria gerichtet, das zur Freisetzung der schweren Fragmente ^er die HA- und NA-Glykoproteinvorsprünge tragende Virushülle führt, mit anschließender Anreicherung dieser Glykoproteine nach üblichen Fraktioniermethoden, die an die Verbindungen ,„ mit sehr hohem Molekulargewicht angepaßt sind. Es ist zu bemerken, daß im Rahmen der Erfindung die Gewinnung der Antigene in schweren Fragmenten ihre Abtrennung von den leichten Bestandteilen, insbesondere vom verwendeten Detergens und vom verwendeten Lösungs- ,_; mittel und von den Eiereiweißen, falls diese in der in dieser Weise behandelten ursprünglichen Probe vorhanden sind, und von einem Teil der das Virion bildenden, nicht-immunogenen Bestandteile ermöglicht. Ferner können diese Fragmente auf Grund ihrer im Vergleich zum ganzen Virion geringeren Teilchengröße und ihrer geringeren Starrheit mit Hilfe sterilisierender Membranen, beispielsweise Membranen mit Poren von 0,22 μίτι, filtriert werden, wodurch es möglich ist, praktisch absolute Sterilität der nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Antigenpräparate zu gewährleisten.

Die Erfindung schließt alle Formen von unbedenklichen Arzneimittelzubereitungen, insbesondere wäßrige und gefriergetrocknete Zubereitungen, und Injektionslösungen ein, welche die erfindungsgemäß erhaltenen jo schweren Fragmente enthalten.

Zur exakten Definition der Erfindung wire auf die Patentansprüche 1 und 9 verwiesen.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung erfolgt die Zerteilung der Viria in einem einphasigen Reaktionssystem bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich durch Verwendung eines nichtionogenen Tensids und von Chloroform, das in einer Konzentration, die bei oder in der Nähe seiner Lösllchkeltsgrenze in Wasser liegt, verwendet wird.

Von der Anmeldern wurde gefunden, daß durch die gleichzeitige Einwirkung eines nichtionogenen Tensids, beispielsweise Polyoxyäthylen (20)-sorbitanmonooleat und Chloroform, letzteres in einer Konzentration, die seiner Löslichkeitsgrenze in Wasser entspricht oder dicht bei dieser Grenze liegt, genügt, um die Lipidhülle zu spalten und zu zerteilen und einen geringen Teil dieser Hülle löslich zu machen, damit praktisch die Gesamtmenge der HA- und NA-Antigene durch die schweren Fragmente der Lipidhülle aufgenommen wird und hierdurch ihre quantitative Abtrennung durch eine entsprechende Fraktionierstufe ermöglicht wird. Es ist zu bemerken, daß das angewandte System ein Einphasensystem ist, das nicht die Trennung von zwei nicht mischbaren Phasen aus Lösungsmittel und Wasser erfordert. Das zerteilte Antlgenpräparat ist in dieser Welse für die anschließende Fraktionierstufe direkt verwendbar.

Das Verfahren gernüß der Erfindung wird bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich, beispielsweise bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,5 und 8,7, bo durchgeführt. Im allgemeinen wird der pH-Wert des Reaktionsmediums nach der Auflösung des Chloroforms eingestellt. Es ist jedoch auch möglich, zuerst den pH-Wert der Ausgangssuspension des Virus einzustellen. Diese pH-Einstellung erfolgt nach beliebigen geeigneten hs bekannten Methoden.

Man kann eine Ergänzungsmenge des Chloroforms nach dem Zusatz des richilonogenen Tensids zugeben, wenn der pH-Wert des Reaktionsmediums im basischen Bereich liegt.

Es ist zu bemerken, daß die Reihenfolge der Stufen des Verfahrens gemäß der Erfindung entscheidend wichtig ist, um ein einphasiges Reaktionssystem auszubilden, und daß es unerläßlich ist, das Chloroform in der Virussuspension löslich zu machen, bevor das nichtionogene Tensid zugesetzt wird. Es wurde gefunden, daß durch Zusatz von Chloroform zu einer Lösung Polyoxyäthylen(20)sorbitanmonooleat das Tensid ausgefällt wird, so daß kein einphasiges Reaktionssystem ausgebildet werden kann.

Wie bereits erwähnt, kann das Chloroform im Überschuß zugesetzt werden, jedoch kann dieser ergänzende Zusatz nur vorgenommen werden, wenn der pH-Wert im basischen Bereich liegt. Wenn unter diesen Bedingungen gearbeitet wird, bleibt das Reaktionssystem einphasig, so daß keine Ausfällung des Tensids stattfindet. Die Sättigung mit Chloroform kann somit sichergestellt werden, ohne die Konzentration des Detergens zu verändern.

Wie bereits erwähnt, eignet sich das Verfahren gemäß der Erfindung zur Behandlung von Viren mit Lipidhülle, insbesondere zur Behandlung des Grippevirus. Von den Viren, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung behandelt werden können, sind insbesondere die Viren zu nennen, die Impfstoffe auf Basis von Fragmenten zu bilden vermögen und Oberflächenantlgene enthalten, die von Fragmenten der Lipidhülle getragen werden, beispielsweise die folgenden Viren: Togavirus, Rhabdovirus, Leukovirus, Coronavirus, Adenovlrus, Herpes-Virus, Vacciniavirus und Hepatitis-Virus des Typs B (DANE-Partikel). Alle diese Viren sind dem Fachmann zugänglich.

Das beim Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzte Ausgangsmaterial besteht aus einer Suspension eines der vorstehend genannten Viren, die nach klassischen Methoden erhalten worden Ist unter der einzigen Voraussetzung, daß die Verunreinigung mit Lipiden, die keine Bestandteile des Virions sind, so weit herabgesetzt wird, daß das Chloroform nicht übermäßig stark durch diese Lipide verbraucht wird. Geeignet ist beispielsweise eine Suspension des Grippevirus, das nach klassischen Methoden auf Bruteiern vermehrt, konzentriert und/oder gereinigt worden ist.

Für die Zwecke der Erfindung können beliebige nichtionogene Tenside verwendet werden. Als geeignete nichtionogene Tenside werden vorzugsweise oberflächenaktive Mittel auf Basis von Polyoxyäthylenderivaten von Teilestern von Fettsäuren und von Sorbit abgeleiteten Hexitanhydriden, insbesondere das Monooleat von PoIyoxyäthylen(20)-sorbltan.

Als Beispiele anderer nlchtionogener Tenside, die für die Zwecke der Erfindung besonders geeignet sind, seien genannt:

1) Kondensate von Alkylphenolen und Äthylenoxid.

2) Additionsprodukte von aliphatischen Äthern und Äthylenoxid.

3) Additionsprodukte von Estern und Äthylenoxid.

4) Additionsprodukte von Aminen und Äthylenoxid.

5) Additionsprodukte von Alkanolamiden und Äthylenoxid. In dieser Hinsicht wird auf die FR-PS 74 35 179 verwiesen, in der Beispiele solcher geeigneter nlchtionogener Mittel genannt sind.

Wie bereits erwähnt, wird das nichtionogene Tensid In der kleinsten wirksamen Konzentration verwendet, um die Zerteilung der Vlrla zu schweren Fragmenten zu erreichen. Der Fachmann kann durch Routineversuche

die einzusetzende Konzentration für ein gegebenes nichtlonogenes Tensld leicht ermitteln. Wenn als nlchtionogenes Tensld das Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat verwendet wird, liegt seine kleinste wirksame Konzentration zwischen 0,02 und 0,2%.

Die Kontaktzeit der mit Chloroform versetzten Virussuspension mit dem nichtionogenen Tensid muß genügen, um die Zerteilung der Viria zu ermöglichen. Im allgemeinen Hegt diese Kontaktzelt zwischen 1 und 20 Stunden. Die Temperatur des Reaktionsmllleus ist nicht entscheidend wichtig, jedoch darf sie nicht zu einer Denaturierung des zu behandelnden Virions führen. Im allgemeinen wird aus Zweckmäßlgketlsgründen bei +4° C gearbeitet.

Wie bereits erwähnt, wird das Chloroform In einer Konzentration verwende!, die seiner maximalen Löslichkeit im wäßrigen Medium entspricht oder dicht bei dieser Konzentration liegt. Zweckmäßig beträgt diese Konzentration etwa 0,4 bis 0,7 Vol.-H,.

Zweckmäßig kann das Chloroform der Virussuspension durch Ausschließungschromatographle in 0,5%lgem Chloroformpuffer zugesetzt werden. Die Ausschließungschromatographie kann beispielsweise nach der in der FR-PS 77 12 518 beschriebenen Methode durchgeführt werden. In dieser Weise wird gleichzeitig mit dem Zusatz des Chloroforms zum Ausgangsmaterial eine sehr weitgehende Vorreinigung des Ausgangsmaterials erreicht.

Wie bereits erwähnt, eignet sich das Verfahren gemäß der Erfindung besonders gut für die Behandlung des Grippevirus mit dem Ziel, Virusfragmente für die Her- Jo stellung von Grippe-Impfstoffen zu gewinnen. Als Detergens wird in diesem Fall das Polyoxyäthylc ■ (20)-sorbltanmonooleat bevorzugt.

Gemäß einer bevorzugten Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung wird dem Reaktionsmedium zu Ji einem beliebigen Zeitpunkt des Verfahrens ein Inaktlvlerungsmittel, z. B. Formaldehyd oder /5-Propiolacton, zugesetzt, wobei jedoch darauf geachtet wird, daß das Reaktionsmedium bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich gehalten wird. Zweckmäßig wird das *n Inaktivierungsmittel nach dem nichtionogenen Tensid zugesetzt. Im Falle der Verwendung von /3-Proplolacion als Inaktivierungsmittel wird der pH-Wert des Reaktionsmediums durch Zusatz einer Base nach beliebigen geeigneten Methoden reguliert, um einen Abfall des pH- ->'> Werts durch Autohydrolyse des Inaktivierungsmittels zu verhindern. Das Inaktivierungsmittel, z. B. Formaldehyd oder /J-Propiolacton, wird in üblichen Konzentrationen verwendet, um den Inaktlvierungseffekt zu erzielen. Im allgemeinen wird das /J-Propiolacton oder der Formal- > <> dehyd in einer Konzentration von etwa 0.02% verwendet. Das nach der Stufe (b) des Verfahrens der Erfindung erhaltene Reaktionsmedium wird anschließend einer Fraktionierstufe unterworfen, um die schweren Fragwerden in den dichten Fraktionen des Gradienten wiedergefunden, während in den leichten Schichten sowie im Ablauf das Chloroform und das »Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat« sowie die nlcht-antigenen Bestandteile, die aus der Zerteilung der Vlria und der gegebenenfalls in der behandeilen Probe vorhandenen Eierelweiße stammen, wiedergefunden werden.

Die die Antigene enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, und das Gemisch wird in physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Durch sterilisierende Filtration durch eine Membran mit Poren von 0,22 μηι wird das Antigenpräparat erhalten. 2) Die zweite Trennmethode beruht auf dem Prinzip, das der Reinigung des Grippevirus zu Grunde liegt, und !n der FR-PS 77 !2 518 und dem Zusatzpaten! FR 78 10 769 zu diesem Patent beschrieben wird. Das Prinzip dieser Trennmethode ist eine Ausschließungschromatographie in der Flüssigphase an porösen Siliciumdioxidkugeln, die zweckmäßig einen mittleren Porendurchmesser von 60 nm und eine Größe von 100 bis 200 μπι haben. Die Adsorptionsstellen des Siliciumdioxids werden vorher blockiert, indem eine wäßrige Lösung eines polyäthoxylierten Mittels, z. B. Polyäthylenglykol-20 000, durchgeleitet wird. Es ist zu bemerken, daß diese Passivierung des Siliciumdioxids durch wiederholtes Durchleiten der zu fraktionierenden Probe nicht verändert wird. Die Probe führt vielmehr bei jeder Einspritzung eine ergänzende Charge des polyäthoxylierten Mittels zu, das durch das darin enthaltene Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleat dargestellt wird, wodurch die ursprüngliche Passivierung nur verstärkt werden kann. Als Puffer für die Chromatographie dient eine zweckmäßig bei pH 8,0 bis 8,2 gepufferte Salzlösung, die 0,5% Chloroform enthält und hier als aseptisches Mittel verwendet wird, das absolute Sterilität im Verlauf der Operationen gewährleistet. Die Chromatographie-Apparatur ist mit automatischen Vorrichtungen versehen, die kontinuierliches Arbeiten ermöglichen. Das zu fraktionierende Antigenpräparat wird in regelmäßigen Zeitabständen eingesprilzl, und die ausgeschlossenen bzw. am Kolonnenaustritt verzögerten Phasen werden durch Elektroventile, die durch eine Programmlervorrichtung gesteuert werden, auf verschiedene Gefäße verteilt.

Die ausgeschlossene Phase enthält die Antigene mit hämagglutlnierender Aktivität und Neuraminidase-Aktivität in Chloroformpuffer, während die verzögerte Phase das Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleat sowie die n!cht-antigenen Bestandteile enthält, die aus der Zerteiiung der Viria und der gegebenenfalls in der behandelten Probe vorhandenen Eierelweiße stammen. Das in dieser Weise gereinigte Antigenpräparat wird

mente des Mediums abzutrennen. Diese Stufe ist eine an 55 durch Eindampfen unter Teilvakuum vom Chloroform

die Reinigung der hochmolekularen Verbindungen angepaßte Fraktionierstufe. Gemäß der Erfindung können zwei für die Großherstellung geeignete Reinigungsmethoden angewandt werden:

1) Die erste Methode besteht aus einer Trennung durch Zonen-Ultrazentrifugieren unter Ausbildung des Dichtegradienten. Zweckmäßig wird ein Saccharose-Gradient gewählt, der dynamisch von selbst in einem Reorientierungsrotor des Typs K2 (ElectronuclSonlcs), dem die Probe kontinuierlich In gleichbleibender Menge zugeführt wird, ausgebildet wird. Die hämagglutmierende Aktivität und Neuraminidase-Aktivität befreit, anschließend durch Diafiltration mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert und schließlich durch Sterüisationsmembranen mit Poren von 0,22 μηι Durchmesser filtriert.

ω In allen Fällen führt das Verfahren gemäß der Erfindung zur Gewinnung von Lipoglykopeptidstrukturen von hohem Molekulargewicht, deren Zusammensetzung und Struktur denen der Hülle des Virons sehr analog sind. Das Immunisierungsvermögen ist somit demjenigen des kompletten Virions ähnlich oder gleich.

Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht nach der Reinigung des Präparats der zerteilten Viria die Gewinnung eines Präparats mit einer Proteinkonzentra-

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tion, das bis zu zweimal weniger Proteine und Lipide als das ursprüngliche Präparat bei gleicher Größe der Antigenaktivitüt enthalten kann.

Die Erfindung hat zahlreiche Vorteile für die Herstellung von als Impfstoffe geeigneten gereinigten Antigenen, insbesondere in Ihrer Anwendung auf Grippe-lmpfsloff. Hinsichtlich der Bedingungen der Zerteilungsreaktion wird beim Verfahren gemäß der Erfindung vor allem ein einphasiges Reaktionssystem verwendet, weil das Chloroform In einer Menge verwendet wird, die in der Nähe seiner maximalen Löslichkeitskonzentration in Wasser liegt.

Be' den klassischen Systemen des Standes der Technik, beispielsweise bei den Tween-Äther-Systemen, ist das Reaktionsgemisch zweiphasig, und die freigesetzten Fragmente sind nicht sämtlich hochmolekular, so daß eine quantitative Abtrennung der Antigene in einer einzigen Fraktionierstufe nicht möglich ist.

Im Gegensatz hierzu ist es gemäß der Erfindung möglich, die Virussuspension anschließend auf Grund der verhältnismäßig großen Teilchengröße des erhaltenen Antigens einfach zu reinigen. In dieser Weise können Verunreinigungen, nämlich »Tween«, Chloroform, verunreinigende Proteine des Systems, Lipide sowie ein Teil der Zerteilungsprodukte des Virus entfernt werden. Bei den Verfahren des Standes der Technik bleiben das verwendete Tensid sowie die Zerteilungsprodukte des Virus im Viruspräparat. Beim Verfahren gemäß der Erfindung gelingt eine viel stärkere Entfernung der Proteine, während es beim bekannten Verfahren nicht möglich war, jo die zerteilten Antigene mit befriedigender Ausbeute zu reinigen.

Ferner kann die Sterilität des zerteilten Antigens durch Filtration mit Sterilisationsmembran erreicht werden. Es findet somit eine Entfernung von evtl. abgetöteten Bak- J5 terien statt, die in ein Kulturmedium des Grippevirus gelangt sein können. Hierdurch ist es möglich, die Gefahr von unerwünschten Nebenreaktionen beispielsweise bei der Verabreichung des Impfstoffs auszuschließen. Bei Impfstoffen mit kompletten Viren wird die Virussuspension in den meisten Fällen durch Einwirkung von UV-Strahlung sterilisiert. Die Bakterien, die gegebenenfalls in den in dieser Weise sterilisierten Suspensionen vorhanden sind, können bei der Impfung unerwünschte Reaktionen auslösen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Das Verfahren ist insbesondere auf das Grippevirus anwendbar, das nach bekannten Methoden auf Bruteiern vermehrt, konzentriert und/oder gereinigt worden Ist. Die Methoden der Titration der Antigene In vitro sind die Hämagglutination oder auch die radiale Immonodiffusion in Agar, das ein reines Antihämagglutininserum enthält (Schild et al.. Journal of General Virology 16 [1972] 231 bis 236), für den Nachweis des Hämaggsutlnins und die Methode nach Warren (J. Biol. Chcm. 234 [1959] 1971) für den Nachweis der Neuramtnidase.

Beispiel 1

Influenzavirus wurde auf bebrüteten Hühnereiern ω durch Bebrütung bei 34,5° C für 2 bis 3 Tage vermehrt. Die Eier wurden während einer Nacht auf +4° C gekühlt. Die infizierten Flüssigkeiten der Allantoishöhle wurden vereinigt und durch Zentrifugation geklärt. Die Viria der Flüssigkeit der Allantoishöhle wurden anschließend nach bekannten Verfahren an roten Blutkörperchen von Hühnern absorbiert und dann desorbiert, und die hierbei erhaltene virulente Flüssigkeit wurde abschließend durch Ultrafiltration konzentriert. Diesem virulenten Konzentrat wurden 0,5% Chloroform zugesetzt, und nach Auflösung des Lösungsmittels wurde der pH-Wert auf 8,2 eingestellt. Anschließend wurde 0,1% Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Nacht bei + 4° C gerührt, dann durch Zentrifugation geklärt und anschließend in einer Menge von 12 1/Std. in einen K2-Rolor ( Electronucleonics) eingespritzt, der mit 35 000 U/Minute drehte und einen Saccharose-Gradienten enthielt (2 bis 55%). Nach Durchgang der gesamten Probe wurde der Rotor unter den bekannten Bedingungen, die eine angemessene Reorientierung des Gradienten ermöglichen, verlangsamt. Nach dem Stillstand des Rotors wurde sein Inhalt von unten abgehebert, wobei Fraktionen von je 100 ml entnommen wurden. Die Fraktionen des Gradienten, im allgemeinen mit 20 bis 45% Saccharose, die die HA- und NA-Antigene enthielten, wurden vereinigt. Das Gemisch wurde durch Diafiltration mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert, und abschließend wurde die Suspension der Antigene durch sterilisierende Membranen mit Poren von 0,22 μηι filtriert.

Beispiel 2

Der Versuch wurde unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch nach der Zugabe des Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleats ß-Propiolacton In einer Konzentration von 0,02% zugesetzt und der pH-Wert durch Zusatz einer Base bei 8,2 gehalten wurde.

Beispiel 3

Der Versuch wurde unter den In Beispiel ! beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch der pH-Wert des Chloroform enthaltenden virulenten Konzentrats auf 8,7 eingestellt und das /J-Propiolacton nach Zugabe des Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleats in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt wurde. Im Verlauf der Autohydrolyse des /3-Propiolactons sank der pH-Wert allmählich auf 7,6 bis 7,7. Vor der Reinigungsstufe wurde er durch Zusatz einer Base wieder auf 8,2 eingestellt.

Beispiel 4

Der Versuch wurde unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch der Formaldehyd nach der Zugabe des Polyoxyäthylen(20)-sorbitanmonooleats in einer Konzentration von 0,02% zugesetzt wurde.

Beispiel 5

Dem auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise erhaltenen virulenten Konzentrat wurden 0,5% Chloroform zugesetzt. Nach der Auflösung des Chloroforms wurde der pH-Wert auf 8.2 eingestellt und dann Polyoxyäthylen(20)-sorbltanmonooleat In einer Konzentration von 0,196 zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Nacht mit einem Magnetrührer gerührt und dann nacheinander durch Zentrifugation und durch Filtration durch Membranen mit Poren von 0,45 μπι Durchmesser geklärt. Das in dieser Weise erhaltene Antigenpräparat wurde einer Fraktionierung durch Ausschließungschromatographie an porösen Siliciumdioxidkugeln in 0,5%lgem Chloroformpuffer von pH 8,2 unterworfen. Die ausgeschlossene Fraktion, die die HA- und NA-Antigene enthielt, wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck vom Chloroform befreit, durch Diafiltration mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung dialysiert und schließlich

durch sterilisierende Membranen mit Poren von 0,22 μηι Durchmesser filtriert.

Beispiel 6

Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch /J-Propiolacton in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise zugesetzt wurde.

Beispiel 7

Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch /J-Propiolacton auf die in Beispiel 3 beschriebene Welse zugesetzt wurde.

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Beispiel 8

Der in Beispiel 5 beschriebene Versuch wurde wiederholt, wobei jedoch der Formaldehyd auf die in Beispiel 4 angegebene Weise zugesetzt wurde.

Beispiel 9

Ein Impfstoff wurde durch Mischen der in der beschriebenen Weise hergestellten Antigenpräparate jedes von der O.M.S. empfohlenen Virusstamms, der der derzeitigen epidemischen Situation entsprach, und Einstellen ihrer Konzentration entweder in internationalen Hämagglutinineinheiten oder In μg Hämagglutinin in einem Volumen von 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung, die bei pH 7,3 gepuffert wurde und Natriumäthylquecksilberthiosalicylat in einer Konzentration von 1/10 000 oder weniger enthielt, hergestellt. Die Wirksamkeit dieses Impfstofftyps wurde an Menschen nachgewiesen.

Beispielsweise wurde in dieser Weise ein dreiwertiger Impfstoff aus erfindungsgemäß zerteilten und gereinigten einwertigen Antigenen durch Mischen und Verdünnen mit dem Verdünnungspuffer des Impfstoffs in einer solchen Weise hergestellt, daß in 0,5 ml Endgemisch

300 I.E. des Typs A/URSS/Η,Ν,, 500 I.E. des Typs A/TEXAS/Η,Ν, und 400 I.E. des Typs B/HK

erhalten wurden.

56 Erwachsene, die zu einer Gruppe der tätigen Bevölkerungen gehörten, erhielten diesen Impfstoff subkutan In einer Dosis von 0,5 ml. Eine serologische Kontrolle wurde durch Blutentnahmen am Tage der Impfung und 30 Tage später durchgeführt. Eine Titration der das Hämagglutinin hemmenden Antikörper wurde gegenüber den drei Antigenen nach der vom O.M.S. empfohlenen Methode vorgenommen. Die Höhe der serologischen Umwandlung sowie das geometrische Mittel der Titer an Antikörpern vor urd nach der Impfung wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle genannt. Sie lassen eine gute Immunisierungswirkung dieses Impfstofftyps erkennen.

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A/URSS/ H₁N,

A/TEXAS H₃N₂

B/HK

Höhe der 92,8% 91,0% 89,3%

serologischen Umwandlung

Geometri- 4,4 3,9 6,0 vor der

sches Mittel Impfung

des Titers

Λ/URSS/ HiN₁

A/TEXAS

H₃N;

H/Ilk

an Antikörpern

183

109 nach der Impfung

.

Aus dieser Untersuchung ist auf die gute Veiiräglldikeit dieses Impfstoffs zu schließen, der lediglich einige seltene und bösartige postvakzinale Reaktionen auslöste.

Beispiel 10

Um die Verbesserung und die Vorteile der nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erzielten Reinigung iu veranschaulichen, wurde die erste Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung durch Emulsionschromatographie eines virulenten Konzentrats, wie es in Beispiel I defi niert ist, in 0,5%igem (Vol./Vol.) Chloroformpuffer nach dem in der FR-PS 77 12 518 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Hierbei wurde ein hochgereinigies Viruspräparat (DO) erhalten, das 0,5% Chloroform enthielt. Anschließend wurde der pH-Wert dieses Präparats auf 8,7 eingestellt, worauf 0,1% Polyoxyäthyien(20)-sorbitanmonooleat (Polysorbat 80) und abschließend 0.02'». /J-Propiolacton zugesetzt wurden.

Das erhaltene Gemisch wurde 18 Stunden gerührt und dann durch Zusatz einer geeigneten Base auf pH 8.2 eingestellt. Das hierbei erhaltene Präparat auf Basis der zerteilten Antigene wurde einer Fraktionierung durch Zonenzentrifugation mit Saccharosegradient unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen unterworfen.

Für die Gewinnung des Präparats von gereinigten zerteilten Antigenen (D) wurden die in Beispiel 1 beschriebenen aufeinanderfolgenden Maßnahmen durchgeführt. Dieser Behandlung wurden drei Grippevirusstämme unterworfen, die der epidemischen Situation in Europa während der Zelt 1978/1979 entsprachen:

Virus A/URSS/H.N,
A/TEXAS/H,Ν,
B/HK

Für jedes gereinigte Viruspräparat (D.,) einerseits und für jedes nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene Präparat auf Basis gereinigter zerteilter Antigene (O) andererseits wurden die hämagglutinierende Aktivität (ausgedrückt in internationalen Einheilen I. E.) sowie die Konzentrationen an Proteinen und Phospholipiden bestimmt. Ferner wurden die spezifischen Aktivitäten in I. E./mg Proteine (Tabelle I) und I. E./nM der Phospholipide (Tabelle II) berechnet.

Die Ergebnisse in den Tabellen I und II zeigen, daß die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Präparate auf Basis von gereinigten zerteilten Antigenen (O) eine hämagglutinierende Aktivität aufweisen, die derjenigen der Präparate auf Basis des hochgereinigten Virus (D₀) bei gleichen Protein- oder Phospholipidmengen überlegen ist.

Tabelle I

Spezifische Aktivität in I. E./mg Proteine

A/URSS/ HiN₁

A/TEXAS/ H₃N₂

B/HK

65

D₀	9.245	8.957	24.980
D	15.584	15.131	42.256
D/D_o	1,69	1,69	1,69

Tabelle II

Spezifische Aktivität in I. EVnM Phospholipide

A/URSS/ A/TEXAS/ B/HK

HiN₁ H₃N₂

D₀	61	45	nicht bestimmt
D	139	121	533
D/D_o	2,3	2,7	nicht bestimmt

D₀: Durch Ausschließungschromatographie erhaltenes Präparat des hochgereinigten Virus.

D: Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenes Präparat auf Basis gereinigter zerteilter Antigene.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von Viren mit Lipidhülle, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert im neutralen oder basischen Bereich

a) In einer wäßrigen Virussuspension Chloroform in einer bei oder in der Nähe seiner Löslichkeitsgrenze liegenden Konzentration löst,

b) das erhaltene Präparat unter Rühren mit einem nichtionogenen Tensid in der kleinsten wirksamen Konzentration, die Zerteiiung der Viria zu schweren Fragmenten bewirkt, während einer genügenden Zeit, die die Zerteilung ermöglicht, in Berührung bringt und

c) die hierbei erhaltenen schweren Fragmente vom Reaktionsmedium abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Virussuspension eine Suspension des Togavirus, Rhabdovirus, Leukovirus, Coronavirus, Adenovlrus, Herpes-Virus, Vallinlavirus oder Hepatitisvirus des Typs B verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Im Verlauf einer der Stufen (λ) bis (c) außerdem ein Inaktlvierungsmittel zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß man als Inaktlvierungsmittel Formaldehyd oder /5-Proplolacton verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der schweren Fragmente durch Fraktionierung mit Hilfe einer Zonenzentrlfugation oder durch Ausschließungschromatographie vornimmt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Inaktlvierungsmittel /f-Proplolacion verwendet und das /J-Propiolacton nach der 2'.ugabe des nichtionogenen Tenslds in einer Menge von 0,02s, zusetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als nichtlonogenes Tensid eine Verbindung aus der folgenden Gruppe verwendet:

a) Kondensate von Alkylphenole!! und Äthylenoxid,

b) Addltlonsprodukie von aliphatischen Äthern und Äthylenoxid,

c) Additionsprodukte von Estern und Äthylenoxid,

d) Additionsprodukle von Aminen und Äthylenoxid,

e) Addltionsprodukte von Alkanolamiden und Äthylenoxiden und

D oberflächenaktives MIttel auf Basis von Polyoxyäthylender'vaten von Teilestern von Fettsäuren und von Sorbit abgeleiteten Hexitanhydriden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als nichtlonogenes Tensid Polyoxyäthylen (20)-sorbitanmonooleat einsetzt.

9. Arznelmltielzubereilungen, enthaltend die gemäß Anspruch 1 bis 8 hergestellten schweren Fragmente.

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