DE69315993T2

DE69315993T2 - Konjugate aus hitzeshockproteinen und oligo- oder polysacchariden

Info

Publication number: DE69315993T2
Application number: DE69315993T
Authority: DE
Inventors: Paolo I-53034 Colle Val D'elsa Costantino; Francesco I-53100 Siena Norelli; Rino I-53010 Monteriggioni Rappuoli; Stefano I-53018 Sovicille Viti
Original assignee: Biocine SpA
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1992-03-06
Filing date: 1993-03-08
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2013-03-09
Also published as: US6403099B1; CA2131551C; ITFI920058A1; DE69315993D1; JP2004346083A; WO1993017712A2; JP3641483B2; JP2011052000A; EP0632727A1; JPH07504423A; CA2131551A1; WO1993017712A3; JP2005068131A; JP4840745B2; EP0632727B1; ITFI920058A0; JP2009102344A; IT1262896B; ATE161425T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugatverbindungen, die aus Hitzeschockproteinen und Polysacchariden oder Oligosacchariden, besonders von der Kapsel von pathogenen Mikroorganismen stammende Polysaccharide oder Oligosaccharide, bestehen. Diese Verbindungen können die Bildung von anti- Polysaccharid-Antikörpern induzieren und sind daher als Impfstoffe zur Verwendung in Mensch und Tier verwendbar.

Stand der Technik

Bakterien sind die ätiologischen Mittel für eine Vielzahl von Krankheitszuständen.
Beispiele für solche Krankheiten sind von Neisseria meningitidis verursachte Meningitis und andere von Haemophilus influenzae Typ b (Hib) oder Streptococcus (einschließlich Pneumococcus) verursachte Infektionen, durch eine Infektion mit Salmonella typhi verursachtes typhoides Fieber und von nicht-typhoiden Salmonella- oder Shigella-Bakterien verursachte Darmerkrahkungen.
Es ist bekannt, daß eine schützende Immunität gegen eine Kapsel aufweisende Bakterien durch Antikörper gegen die Kapselpolysaccharide vermittelt wird. Es ist ferner bekannt, daß es zum Erhalt einer ausreichenden Stimulierung des Immunsystems erforderlich ist, Kapselpolysaccharide mit Trägerproteinen zu konjugieren (Robbins et al., J. Infect. Dis. 161 (1990), 821-832).
Insbesondere wurden in der Literatur Konjugatverbindungen beschrieben, die aus Polysacchariden (beispielsweise Gruppe C-Meningococcen-Polysaccharid (MenC), Hib und Gruppe A-Meningococcen-Polysaccharid (MenA)) und Proteinen wie CRM-197 (ein von Corynebacterium diphtheriae stammendes Peptid), TD (Diphtherie-Toxoid) oder TT (Tetanus-Toxoid - vgl. Peeters et al., Inf. Immun. (Okt. 1991), 3504-3510; Claesson et al., J. Pediatrics St Leuis 112(5) (Mai 1988), 695-702) bestanden.
Einige dieser Impfstoffe werden bereits mit guten Ergebnissen in der klinischen Praxis verwendet. Es ist jedoch nötig, neue Proteinträger zu identifizieren, die den Konjugaten bessere immunogene Eigenschaften verleihen, als sie mit bisher verwendeten Trägern erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hitzeschockproteinen als Proteinträger zur Erhöhung der Immunantwort auf Oligosacchariden und Polysacchariden.
Es ist bekannt, daß Hitzeschockproteine eine signifikante Zahl von T- Epitopen enthalten und daher das zelluläre Immunsystem stimulieren.
Über eine Konjugatverbindung des Hitzeschockproteins von Mycobacterium bovis (65 kl)) als Träger für ein Malaria-Epitop wurde berichtet, daß sie eine deutliche Immunität in Tieren induzierte, die mit dem Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vorimmunisiert wurden, ohne daß Adjuvantien erforderlich waren (Lussow et al., Eur. J. Immunol. 21(1991), 2297-2302). Es muß jedoch beachtet werden, daß sich die von Lussow et al. beobachteten Wirkungen auf T-Zell-abhängige Wirkungen beziehen, die von mit Hitzeschockproteinen konjugierten Peptiden (von denen gut bekannt ist, daß sie T-Zell-abhängig sind) gezeigt werden.
Da die Hitzeschockproteine bei Bakterien von unterschiedlichen Stämmen und Typen gut konserviert sind, garantiert insbesondere eine zufällige Infektion mit Bakterien, die ein kontinuierlicher Prozeß ist, daß das Immunsystem für Hitzeschockproteine sensibilisiert bleibt, wodurch eine gute Antwort auf die erfindungsgemäßen Konjugatverbindungen entweder bei der primären Impfung oder bei der Verabreichung einer Auffrischungsimpfung sichergestellt ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Verwendung von bakteriellen Kapsel-Polysacchariden und -Oligosacchariden ohne Verwendung von Adjuvantien (obwohl Adjuvantien verwendet werden können).
Zahlreichen Kindern wird BCG-Impfstoff (der bakterielle Hitzeschockproteine einschließt) zum Schutz vor Tuberkulose verabreicht, und daher trifft ein ein Hitzeschockprotein als Träger enthaltendes erfindungsgemäßes Konjugat auf zahlreiche Individuen, die bereits mit dem Träger vorimmunisiert sind, was genau eine Folge der an sie verabreichten BCG-Impfung ist.
Da die Hitzeschockproteine stark konserviert sind, kann ferner wiederum selbst die nicht mit BCG geimpfte Bevölkerung leicht eine Immunität entwickeln (als Folge einer natürlichen Interaktion mit anderen Bakterien) und sich daher in einem Stadium befinden, in der sie nach der Impfung mit einem aus einem Hitzeschockprotein und einem T-Zell-unabhängigen Antigen (Oligosaccharid oder Polysaccharid) bestehenden Konjugat eine gute Immunantwort entwickeln kann. Daher nutzen die erfindungsgemäßen Träger die hohe Konservierung von Hitzeschockproteinen unter Bakterien und das T-Zell-Gedächtnis zur Gewährleistung einer Impfung mit hohem Titer auf einzigartige Weise aus.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung einer Konjugatverbindung, die mindestens ein Hitzeschockprotein oder einen Teil davon, enthaltend mindestens eine immunstimulierende Domäne, und mindestens ein Oligosaccharid oder Polysaccharid umfaßt.
Das Hitzeschockprotein kann jedes Hitzeschockprotein sein, das eine immunstimulierende Wirkung in Tieren, vorzugsweise in Menschen, zeigen kann.
Die Hitzeschockproteine sind in Bakterien, Parasiten und Säugern stark konserviert. Jedes Hitzeschockprotein kann in den erfindungsgemäßen Konjugaten verwendet werden, sofern es eine positive immunstimulierende Wirkung in dem zu immunisierenden Zielindividuum ohne signifikant nachteilige Wirkungen zeigt. Spezifische, nicht beschränkende Beispiele sind Hitzeschockproteine von Helicobacter pylori, P. aeruginosa, C. trachomatis und M. leprae, besonders die hsp60-Gruppe der Hitzeschockproteine.
Insbesondere werden drei Hitzeschockproteine hier besonders erläutert, nämlich das 65 kD-hsp vom BCG GroEL-Typ aus M. bovis (hspR65), rekombinantes 70 kD-hsp vom DnaK-Typ aus M. tuberculosis (hspR70) und ein neues Hitzeschockprotein von H. pylori.
Das Hitzeschockprotein (hsp) von H. pylori ist ein Protein, dessen Nucleotidund Aminosäuresequenz in Fig. 3 dargestellt ist und dessen Molekulargewicht im Bereich von 54 bis 62 kD), vorzugsweise etwa 58 bis 60 kD, liegt. Dieses hsp gehört zur Gruppe hsp60 der Hitzeschockproteine von gram-negativen Bakterien. Allgemein gehört hsp zu den am meisten konservierten Proteinen in allen lebenden prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen, Tieren und Pflanzen, und die Konservierung ist entlang der gesamten Sequenz verteilt.
Das Konjugat kann ein oder mehrere Hitzeschockproteine oder immunstimulierende Domänen davon enthalten. Die Hitzeschockproteine können gleich oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise ist jedoch ein Hitzeschockprotein oder ein eine oder mehrere immunstimulierende Domänen enthaltender Teil davon vorhanden.
Wie hier verwendet, meint der Begriff "immunstimulierende Domäne" einen Bereich einer Aminosäuresequenz eines Hitzeschockproteins, der die Immunreaktion eines Säugerindividuums gegen einen Polysaccharid- oder Oligosaccharid-Bestandteil einer die Domäne enthaltenden Konjugatverbindung fördern kann.
Die Verwendung von nur bestimmten Domänen der vollständigen Hitzeschockproteine hat den Vorteil, daß mit menschlichen Hitzeschockproteinen übereinstimmende Domänen selektiv ausgeschlossen werden können. Für das Impfen von Menschen ist dies vorteilhaft, da diese Bereiche die immunstimulierende Wirkung des Hitzeschockproteins nicht beeinflussen, da sie als "selbst" erkannt werden. Ferner kann jegliche gegen diese "selbst"-Bereiche stimulierte Immunität zu einer Autoimmunität führen.
Geeignete Domänen der hsp60-Familie der Hitzeschockproteine sind in Figur 2 durch Unterstreichen der Sequenzen mit einer reduzierten Homologie zum menschlichen Hitzeschockprotein identifiziert. Funktionelle Sub-Domänen innerhalb der in Figur 2 dargestellten Domänen sowie Kombinationen aus Domänen und Sub-Domänen können ebenfalls verwendet werden.
Der Fachmann kann für ein bestimmtes Hitzeschockprotein leicht nachweisen, welche Domänen oder Epitope für die immunstimulierende Wirkung verantwortlich sind, und ein modifiziertes nur diese Domänen oder einen Subsatz davon enthaltendes Hitzeschockprotein herstellen.
Der Oligosaccharid- oder Polysaccharid-Bestandteil der Konjugatverbindung kann das vollständige Kapsel-Polysaccharid oder -Oligosaccharid jedes pathogenen Mikroorganismus, gegen den eine Impfung indiziert ist, oder ein eine schützende Immunität erzeugender Teil davon sein. Das Oligosaccharid oder Polysaccharid kann von einem einzigen Bakterium oder von zwei oder mehreren Bakterien sein.
Bestimmte nicht-beschränkende Beispiele von Zielbakterien sind: Haemophilus influenzae Typ b (Hib), Streptococcus (einschließlich Pneumococcus), Salmonella, besonders Salmonella typhi, und Darmerkrankungen verursachende nichttyphoide Salmonella- oder Shigella-Bakterien.
In einer bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden aus Oligosacchariden der Meningococcus C (MenC)-Gruppe und hsp bestehende Konjugate hergestellt.
In einer weiteren bestimmten erfmdungsgemäßen Ausführungsform sind die dazu verwendeten hsp hspR65 und hspR70.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von erfindungsgemäßen Konjugatverbindungen, das die kovalente Bindung eines Hitzeschockproteins oder eines Teils davon, enthaltend mindestens eine immunstimulierende Domäne, an mindestens ein Oligosaccharid oder Polysaccharid umfaßt.
Das Oligosaccharid oder Polysaccharid wird vorzugsweise aus dem Zielbakterium isoliert, kann jedoch auch synthetisch hergestellt werden.
Das Hitzeschockprotein kann aus seiner natürlich vorkommenden Quelle isoliert oder synthetisch hergestellt werden. Das Hitzeschockprotein wird vorzugsweise durch DNA-Rekombinationsverfahren unter Verwendung der hier allgemein beschriebenen Verfahren produziert.
Das Oligosaccharid oder Polysaccharid wird zur Bereitstellung von Reaktionsstellen für die Konjugation vorzugsweise vor der Konjugation mit dem Hitzeschockprotein oder einem Teil davon modifiziert. Geeigneterweise schließt dies die Einführung von aktiven funktionellen Gruppen wie Aminogruppen in die Endgruppen des Oligosaccharids oder Polysaccharids ein. Das so modifizierte Oligosaccharid oder Polysaccharid kann anschließend unter Verwendung eines Linkers wie Succinimid aktiviert und an das Hitzeschockprotein oder einen Teil davon konjugiert werden.
Ein dritter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung einer Konjugatverbindung gemäß dem ersten effindungsgemäßen Gesichtspunkt zur Verwendung als Arzneimittel, vorzugsweise als Impfstoff.
Ein vierter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft die Verwendung der Konjugatverbindung gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Gesichtspunkt zur Herstellung eines Arzneimittels zur Impfung gegen eine bakterielle Infektion.
Ein fünfter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung eines Impfverfahrens, das die Verabreichung einer immunologisch wirksamen Menge einer Konjugatverbindung gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Gesichtspunkt umfaßt.
Ein sechster erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung einer Impfstoff- oder einer therapeutischen Zusammensetzung, die eine oder mehrere Konjugatverbindungen gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Gesichtspunkt und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine Impfstoffzusammensetzung und kann gegebenenfalls weitere Excipienten wie Adjuvantien einschließen (vgl. den Abschnitt mit dem Titel "Impfstoffe" in der nachstehenden Beschreibung).
Ein siebter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Impfstoffs, das das Zusammenbringen einer oder mehrerer Konjugatverbindungen des ersten erfindungsgemäßen Gesichtspunkts mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls einem Adjuvans umfaßt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Ergebnisse der Immunisierung von Mäusen mit einem hspR65/MenC-Konjugat und umfaßt die ELISA-Ergebnisse für anti-MenC im Blut. In Figur 1A wurden die Mäuse mit BCG vorimmunisiert und in Figur 1B nicht. Die Figur zeigt die Ergebnisse für das hspR65-MenC-Konjugat (o) oder das hspR70-MenC- Konjugat ( ) in PBS. Die Maus-Kontrollgruppen wurden mit dem MenC-Oligosaccharid allein (Δ) oder mit einem Impfstoff aus CRM197-MenC-Konjugat in Aluminiumhydroxid ( ) immunisiert.
Figur 2 zeigt die Aminosäuresequenz des Hitzeschockproteins von Helicobacter pylori und vergleicht sie mit verwandten Hitzeschockproteinen von P. aeruginosa, C. trachomatis, M. leprae und H. sapiens. Die Balken unter der Sequenz zeigen Domänen einer reduzierten Homologie zwischen den Sequenzen 1 bis 4 und dem menschlichen Hitzeschockprotein.
Figur 3 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des Hitzeschockproteins von Helicobacter pylori.

Genaue Beschreibung der Ausführungsformen

1. Allgemeines Verfahren

Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anders angegeben, übliche auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren der Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination und Immunologie verwendet. Diese Verfahren werden in der Literatur ausführlich erläutert. Vgl. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (1989); DNA Cloning, Bd. I und II (D. N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Hrsg., 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular doning (1984); die Reihe, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller und M. P. Calos, Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Bd. 154 und Bd. 155 (Wu und Grossman, bzw. Wu, Hrsg.), Mayer und Walker, Hrsg., (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Lendon), Scopes, (1987), Protein Purification: Principles And Practice, Zweite Ausgabe (Springer-Verlag, N.Y.), und Handbook Of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D. M. Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., 1986).
Standardabkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren werden in dieser Beschreibung verwendet.

2. Definitionen

Erfindungsgemäß verwendbare Hitzeschockproteine schließen die vorstehend beschriebenen Polypeptide und die Polypeptide mit geringen Variationen der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins ein; besonders konservative Aminosäureaustausche werden erwogen.
Konservative Substitutionen erfolgen innerhalb einer Familie von Aminosäuren mit verwandten Seitenketten. Genetisch codierte Aminosäuren werden üblicherweise in vier Familien eingeteilt: (1) saure Aminosäuren = Aspartat und Glutamat; (2) basische Aminosäuren = Lysin, Arginin und Histidin; (3) nicht-polare Aminosäuren = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan; und (4) nicht-geladene polare Aminosäuren = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystin, Serin, Threonin und Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden gelegentlich zusammen als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Es ist beispielsweise vernünftigerweise vorhersagbar, daß ein einzelner Austausch eines Leucins durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonins durch ein Serin oder ein ähnlicher konservativer Austausch einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflussen wird. Polypeptidmoleküle mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie das Protein, jedoch mit geringen die Funktion nicht wesentlich beeinflussenden Aminosäuresubstitutionen, sind in die Definition des Proteins eingeschlossen.
Ein signifikanter Vorteil der Produktion des Hitzeschockproteins durch DNA- Rekombinationsverfahren anstatt durch Isolierung und Reinigung eines Proteins aus natürlichen Quellen ist die Möglichkeit der Produktion von äquivalenten Mengen des Proteins unter Verwendung von weniger Ausgangsmaterial als für die Isolierung des Proteins aus einer natürlichen Quelle erforderlich wäre. Die Produktion des Proteins durch Rekombinationsverfahren erlaubt ferner die Isolierung des Proteins in Abwesenheit von einigen normalerweise in Zellen vorhandenen Molekülen. Von allen Spuren menschlicher Proteinverunreinigungen vollständig freie Proteinzusammensetzungen können also leicht produziert werden, da das einzige menschliche Protein, das durch den rekombinanten nicht-menschlichen Wirt produziert wird, das interessierende rekombinante Protein ist. Potentielle virale Stoffe von natürlichen Quellen und für Menschen pathogene virale Bestandteile werden ebenfalls vermieden.
Der Begriff "rekombinantes Polynucleotid", wie hier verwendet, meint ein Polynucleotid, das von einem Genom oder von cDNA oder durch Semisynthese oder Synthese erhalten wird und das auf Grund seines Ursprungs oder seiner Manipulation:
(1) nicht mit dem vollständigem oder einem Teil eines Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid als in der Natur verbunden ist oder (3) in der Natur nicht vorkommt.
Der Begriff "Polynucleotid", wie hier verwendet, meint eine polymere Form eines Nucleotids einer beliebigen Länge, vorzugsweise Desoxyribonucleotide, und wird hier austauschbar mit den Begriffen "Oligonucleotid" und "Oligomer" verwendet. Der Begriff bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls Daher schließt dieser Begriff doppel- und einzelsträngige DNA sowie Antisense-Polynucleotide ein. Er umfaßt ferner bekannte Modifikationsformen, beispielsweise die Gegenwart von auf dem Fachgebiet bekannten Markern, Methylierung, "Kappen"-Termini, Substitution von einem oder mehreren der naturlich vorkommenden Nucleotide durch ein Analoges, Internucleotidmodifikationen wie beispielsweise ein Austausch durch bestimmte Arten von ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate etc.) oder geladene Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate etc.), Einführung von Seitengruppen wie beispielsweise Proteine (einschließlich Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin etc.), intercalierende Stoffe (z. B. Acridin, Psoralen etc.), Chelatbildner (z. B. Metalle, radioaktive Stoffe, Bor, oxidative Einheiten etc.) und Alkylierungsmittel (z. B. α- anomere Nucleinsäuren etc.).
Mit "genomisch" ist eine Sammlung oder Bank von DNA-Molekülen gemeint, die von in Vektoren donierten Restriktionsfragmenten stammen. Diese kann das gesamte oder einen Teil des genetischen Materials eines Organismus einschließen.
Der Begriff "cDNA" meint eine komplementäre mRNA-Sequenz, die an den komplementären mRNA-Strang hybridisiert.
Wie hier verwendet, meint der Begriff "Oligomer" sowohl Primer als auch Sonden und wird hier austauschbar mit dem Begriff "Polynucleotid" verwendet. Der Begriff Oligomer bezeichnet nicht die Größe des Moleküls Oligomere sind jedoch typischerweise nicht länger als 1 000 Nucleotide, noch typischer nicht länger als 500 Nucleotide und sogar noch typischer nicht länger als 250 Nucleotide; sie können auch nicht länger als 100, 75 oder 50 Nucleotide sein.
Der Begriff "Primer", wie hier verwendet, meint ein Oligomer, das bei Verwendung unter geeigneten Bedingungen als Initiationspunkt der Synthese eines Polynucleotidstrangs wirken kann. Der Primer ist zu einem Bereich des zu kopierenden Polynucleotidstrangs vollständig oder im wesentlichen komplementär. Unter die Hybridisierung fördernden Bedingungen aneliert der Primer daher an den komplementären Bereich des Analytstrangs. Nach der Zugabe von geeigneten Reaktanten (z. B. eine Polymerase, Nucleotidtriphosphate etc.) wird der Primer durch das Polymerisationsmittel verlängert, wobei eine Kopie des Analytstrangs gebildet wird. Der Primer kann einzelsträngig oder alternativ partiell oder vollständig doppelsträngig sein.
Die Begriffe "Analytpolynucleotid" und "Analytstrang" meinen ein einzeloder doppelsträngiges Nucleinsäuremolekül, von dem angenommen wird, daß es eine Zielsequenz enthält, und das in einer biologischen Probe vorhanden sein kann.
Wie hier verwendet, meint der Begriff "Sonde" eine Struktur, die aus einem Polynucleotid besteht, das eine Hybridstruktur mit einer Zielsequenz aufgrund der Komplementarität von mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz im Zielbereich bildet. Die Polynucleotidbereiche der Sonden können aus DNA und/oder RNA und/oder synthetischen Nucleotidanalogen bestehen. Zu den Sonden gehören auch "Abfangsonden" und "Markersonden".
Wie hier verwendet, meint der Begriff "Zielbereich" einen Bereich der Nucleinsäure, der amplifiziert und/oder nachgewiesen werden soll. Der Begriff "Zielsequenz" meint eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer ein stabiles Hybrid unter den gewunschten Bedingungen bildet.
Der Begriff "Abfangsonde", wie hier verwendet, meint eine Polynucleotidsonde, die aus einem an einen Bindungspartner gekoppelten einzelsträngigen Polynucleotid besteht. Das einzelsträngige Polynucleotid besteht aus einer Ziel-bindenden Polynucleotidsequenz, die zu einer Zielsequenz in einem im Analytpolynucleotid nachzuweisenden Zielbereich komplementär ist. Dieser komplementäre Bereich ist im Bezug auf die Zielsequenz ausreichend lang und komplementär zur Bildung eines stabilen Duplexmoleküls, das das Analytpolynucleotid (über die Bindungspartner) an einer festen Oberfläche immobilisieren kann. Der Bindungspartner ist für einen zweiten Bindungspartner spezifisch; der zweite Bindungspartner kann an die Oberfläche eines festen Trägers gebunden werden oder indirekt über weitere Strukturen oder Bindungspartner an einen festen Träger gebunden werden.
Der Begriff "Zielbindende Polynucleotidsequenz", wie hier verwendet, meint eine Polynucleotidsequenz, die aus zu einer Zielnucleotidsequenz komplementären Nucleotiden besteht; die Sequenz ist von ausreichender Länge und Komplementarität zur Zielsequenz zur Bildung eines Duplexmoleküls, das für den beabsichtigten Zweck eine ausreichende Stabilität aufweist.
Der Begriff "Bindungspartner", wie hier verwendet, meint ein Molekül, das ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität wie beispielsweise ein Antigen oder einen spezifischen Antikörper dagegen binden kann. Allgemein müssen die spezifischen Bindungspartner mit ausreichender Affinität binden, um die Analytkopie/komplementärer Strang-Duplexmoleküle (bei Abfangsonden) unter Isolierungsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen beispielsweise Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, zahlreiche bekannte Rezeptor-Liganden-Paare und komplementäre Polynucleotidstränge ein. Bei komplementären Polynucleotid-Bindungspartnern sind die Partner üblicherweise mindestens etwa 15 Basen lang und können mindestens 40 Basen lang sein; ferner haben sie einen Gehalt an G und C von mindestens etwa 40% und in etwa 60%. Die Polynucleotide können aus DNA, RNA oder synthetischen Nucleotidanalogen bestehen.
Der Begriff "gekoppelt", wie hier verwendet, meint eine Bindung durch kovalente Bindungen oder durch starke nicht-kovalente Wechselwirkungen (z. B. hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbindungen etc.). Kovalente Bindungen können beispielsweise Ester, Ether, Phosphoester, Amide, Peptide, Imide, Kohlenstoff- Schwefel-Bindungen, Kohlenstoff-Phosphor-Bindungen etc. sein.
Der Begriff "Träger" meint jegliche feste oder halbfeste Oberfläche, an der ein gewünschter Bindungspartner verankert werden kann. Geeignete Träger sind beispielsweise Glas, Plastik, Metall, Polymergele etc. und können die Form von Kügelchen, Vertiefungen, Meßstäbchen, Membranen etc. annehmen.
Der Begriff "Marker", wie hier verwendet, meint jegliche Atome oder Einheiten, die zur Bereitstellung eines nachweisbaren (vorzugsweise quantifizierbaren) Signals verwendet und an ein Polynucleotid oder Polypeptid gebunden werden können.
Der Begriff "Markersonde", wie hier verwendet, meint eine Polynucleotidsonde, die eine Ziel-bindende Polynucleotidsequenz umfaßt, die zu einer im Analytpolynucleotid nachzuweisenden Zielsequenz komplementär ist. Der komplementäre Bereich ist von ausreichender Länge und Komplementarität zur Zielsequenz, um ein Duplexinolekül zu liefern, das die "Markersonde" und die durch den Marker nachzuweisende "Zielsequenz" umfaßt. Die Markersonde ist an den Marker entweder direkt oder indirekt über einen Satz von Ligandmolekulen mit hoher Spezifität für einander, einschließlich Multimere, gekoppelt.
Der Begriff "Multimer", wie hier verwendet, meint lineare oder verzweigte Polymere der gleichen sich wiederholenden einzelsträngigen Polynucleotideinheit oder von verschiedenen einzelsträngigen Polynucleotideinheiten. Mindestens eine der Einheiten hat eine Sequenz, Länge und Zusammensetzung, die es ihr ermöglicht, spezifisch mit einer interessierenden ersten einzelsträngigen Nucleotidsequenz, üblicherweise ein Analyt oder eine an einen Analyten gebundene Polynucleotidsonde (z. B. eine Markersonde), zu hybridisieren. Zur Erreichung dieser Spezifität und Stabilität weist diese Einheit üblicherweise eine Länge von mindestens etwa 15 Nucleotiden, typischerweise von nicht mehr als etwa 50 Nucleotiden und vorzugsweise von etwa 30 Nucleotiden auf; der Gehalt an G und C ist ferner üblicherweise mindestens etwa 40% und höchstens etwa 60%. Zusätzlich zu diese(r)n Einheit(en) schließt das Multimer eine Multiplizität von Einheiten ein, die spezifisch und stabil mit einem interessierenden zweiten einzeisträngigen Nucleotid, üblicherweise ein markiertes Polynucleotid oder ein anderes Multimer, hybridisieren können. Diese Einheiten haben üblicherweise etwa die gleiche Größe und Zusammensetzung wie die vorstehend beschriebenen Multimere. Wenn ein Multimer zur Hybridisierung mit einem anderen Multimer entwickelt wird, sind die ersten und zweiten Oligonucleotideinheiten heterogen (unterschiedlich) und hybridisieren unter den Bedingungen des gewählten Tests nicht miteinander. Multimere können daher Markersonden oder Liganden sein, die den Marker an die Sonde koppeln.
Ein "Replicon" ist jegliches genetische Element, z. B. ein Plasmid, Chromosom, Virus, Cosmid etc., das als eine autonome Einheit der Polynucleotidreplikation in einer Zelle wirkt; d. h. unter seiner eigenen Kontrolle replizieren kann. Dies kann selektierbare Marker einschließen.
"PCR" meint das Verfahren der Polymerasekettenreaktion, wie von Saiki et al., Nature 324 (1986), 163, Scharf et al., Science 233 (1986), 1076-1078, und in den US-Patenten mit den Nm. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben.
Wie hier verwendet, ist X im Bezug auf y "heterolog", wenn x nicht natürlicherweise in identischer Weise mit y assoziiert ist; d. h., x ist in der Natur mit y nicht assoziiert oder x ist nicht in der gleichen Weise wie in der Natur mit y assoziiert.
"Homologie" meint den Grad der Ähnlichkeit zwischen x und y. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz einer Form mit einer anderen kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren ermittelt werden. Sie kann beispielsweise durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynucleotids ermittelt werden. Alternativ kann der Grad der Homologie durch Hybridisierung der Polynucleotide unter stabile Duplexinoleküle zwischen homologen Bereichen erzeugenden Bedingungen (beispielsweise die vor der S&sub1;-Spaltung verwendeten), anschließende Spaltung mit (einer) Einzelstrang-spezifischen Nuclease(n) und anschließende Bestimmung der Größe der gespaltenen Fragmente ermittelt werden.
Ein "Vektor" ist ein Replicon, in den ein anderer Polynucleotidabschnitt eingefügt wird, um die Replikation und/oder Expression des eingefügten Abschnitts zu erreichen.
"Kontrollsequenz" meint Polynucleotidsequenzen, die für eine Expression der mit ihnen ligierten codierenden Sequenzen erforderlich sind. Die Natur dieser Kontrollsequenzen unterscheidet sich in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; in Prokaryonten schließen solche Kontrollsequenzen üblicherweise einen Promotor, eine ribosomale Bindungsstelle und eine Transkriptionsterminationssequenz ein; in Eukaryonten schließen üblicherweise solche Kontrollsequenzen Promotoren und Transkriptionsterminationssequenzen ein. Der Begriff "Kontrollsequenzen" soll minde stens alle für eine Expression erforderlichen Bestandteile einschließen und kann ferner weitere vorteilhafte Bestandteile, beispielsweise Leadersequenzen und Fusionspartnersequenzen, einschließen.
"Funktionell verbunden" meint eine Anordnung, die die so beschriebenen Bestandteile in eine Beziehung bringt, durch die sie in der beabsichtigten Weise funktionieren können. Eine mit einer codierenden Sequenz "funktionell verbundene" Kontrollsequenz wird so ligiert, daß eine Expression der codierenden Sequenz unter Kontrollsequenz-kompatiblen Bedingungen erreicht wird.
Ein "offener Leseralimen" (ORF) ist ein Bereich einer ein Polypeptid codierenden Polynucleotidsequenz; dieser Bereich kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine vollständige codierende Sequenz darstellen.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die üblicherweise über mRNA in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen steht. Die Grenzen der codierenden Sequenz sind durch ein Translationsstartcodon am 5'-Terminus und ein Translationsstopcodon am 3'- Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann, jedoch ohne Beschränkung darauf, cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen einschließen.
Wie hier verwendet, meint der Begriff "Polypeptid" ein Polymer von Aminosäuren und keine bestimmte Länge des Produkts; daher sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in die Polypeptiddefinition eingeschlossen. Dieser Begriff meint ferner keine Postexpressionsmodifikationen des Polypeptids wie Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen etc., ohne sie jedoch auszuschließen. Eingeschlossen in die Definition sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoge einer Aminosäure (beispielsweise nicht-natürliche Aminosäuren etc.) enthalten, Polypeptide mit substituierten Bindungen sowie weitere auf dem Fachgebiet bekannte sowohl natürlich als auch nicht-natürlich vorkommende Modifikationen.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, die abgeleitet ist von "einer bestimmten Nucleinsäuresequenz", meint ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mit der eines von der Sequenz codierten Polypeptids identisch ist, oder einen Teil davon, wobei der Teil aus mindestens 3 bis 5 Aminosäuren, stärker bevorzugt aus mindestens 8 bis 10 Aminosäuren und am stärksten bevorzugt aus mindestens 11 bis 15 Aminosäuren besteht oder mit einem innerhalb der Sequenz codierten Polypeptid immunologisch übereinstimmt. Diese Terminologie schließt ferner ein von einer bestimmten Nucleinsäuresequenz exprimiertes Polypeptid ein.
"Immunogen" meint die Fähigkeit eines Polypeptids zur Erzeugung einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort entweder allein oder nach einer Bindung an einen Träger in Gegenwart oder Abwesenheit eines Adjuvans. "Neutralisation" meint eine Immunantwort, die die Infektivität eines infektiösen Erregers entweder partiell oder vollständig blockiert. "Epitop" meint eine antigene Determinante eines Peptids, Polypeptids oder Proteins; ein Epitop kann 3 oder mehr Aminosäuren in einer für das Epitop einzigartigen räumlichen Konformation umfassen. Üblicherweise besteht ein Epitop aus mindestens 5 solcher Aminosäuren und häufiger aus mindestens 8 bis 10 solcher Aminosäuren. Verfahren zur Ermittlung der räumlichen Konformation von Aminosäuren sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen beispielsweise die Röntgenkristallographie und die zweidimensionale kernmagnetische Resonanz ein. Antikörper, die das gleiche Epitop erkennen, können in einem einfachen Immuntest, der die Fähigkeit eines Antikörpers zur Blockierung der Bindung eines anderen Antikörpers an ein Zielantigen zeigt, identifiziert werden.
"Behandlung", wie hier verwendet, meint eine Prophylaxe und/oder Therapie (d. h. die Modulation von Krankheitssymptomen). Ein "Individuum" bezeichnet ein Tier, das für eine Infektion durch ein Bakterium, das eine antigene Kapselpolysaccharidoder -Oligosaccharidstruktur aufweist, empfindlich ist, und schließt, jedoch ohne Beschrähkung darauf, Primaten einschließlich des Menschen ein. Ein "Impfstoff" ist eine zur Behandlung eines Individuums verwendbare immunogene oder auf andere Weise einen entweder partiellen oder vollständigen Schutz gegen ein solches Bakterium erzeugende Zusammensetzung.
Die erfindungsgemäßen Konjugatverbindungen können zur Produktion von entweder monodonalen oder polydonalen Antikörpern, die für die Proteine spezifisch sind, verwendet werden. Die Verfahren zur Produktion dieser Antiktrper sind auf dem Fachgebiet bekannt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellkulturen" und andere Begriffe dieser Art meinen beispielsweise Mikroorganismen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger für einen rekombinanten Vektor oder eine andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und schließen die Nachkommen der transformierten ursprünglichen Zelle ein. Es ist selbstverständlich, daß die Nachkommen einer einzigen Elternzelle in bezug auf Morphologie oder das Genom- oder Gesamt-DNA-Komplement aufgrund einer natürlichen, zufälligen oder absichtlichen Mutation nicht notwendigerweise vollständig mit der ursprünglichen Elternzelle identisch sein müssen. Beispiele für Säugerwirtszellen sind Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und Affennieren (COS)-Zellen.
Wie hier verwendet, meint "Zellinie" spezifisch eine Zellpopulation, die in vitro kontinuierlich oder länger wachsen und sich teilen kann. Zellimen sind häufig donale Populationen, die von einer einzigen Vorläuferzelle abstamen. Es ist auf dem Fachgebiet ferner bekannt, daß spontane oder induzierte Änderungen im Karyotyp während der Aufbewahrung oder dem Transfer dieser donalen Populationen auftreten können. Daher müssen von der bestimmten Zellinie stannnende Zellen nicht genau identisch mit den Vorläuferzellen oder -Kulturen sein und die bestimmte Zellinie schließt diese Varianten ein. Der Begriff "Zellinien" schließt ferner immortalisierte Zellen ein. Die Zellinien schließen vorzugsweise Nicht-Hybrid-Zellinien oder Hybridome aus nur zwei Zelltypen ein.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff "Mikroorganismus" prokaryontische und eukaryontische mikrobielle Arten wie Bakterien und Pilze ein, wobei die letzteren Hefe und filamentöse Pilze einschließen.
"Transformation", wie hier verwendet, meint die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des Insertionsverfahrens wie direkte Aufnahme, Transduktion, f-Paarung oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als ein nicht-integrierter Vektor, beispielsweise als Plasmid, aufrechterhalten oder alternativ in das Wirtsgenom integriert sein.
"Gereinigt" und "isoliert" meint in bezug auf eine Polypeptid- oder Nucleotidsequenz, daß das angegebene Molekül in der fast vollständigen Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen des gleichen Typs vorhanden ist. Der Begriff "gereinigt", wie hier verwendet, meint vorzugsweise, daß mindestens 75 % (Gew./Gew.), stärker bevorzugt mindestens 85 % (Gew./Gew.), noch stärker bevorzugt mindestens 95 % (Gew. /Gew.) und am meisten bevorzugt mindestens 98% (Gew./Gew.) an biologischen Makromolekülen der gleichen Art vorhanden sind (Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, besonders Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1 000, können vorhanden sein).

3. Expressionssysteme

Nach ihrer Isolierung kann die ein geeignetes Hitzeschockprotein codierende Sequenz in einer Reihe von unterschiedlichen Expressionssystemen exprimiert werden; beispielsweise den bei Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefe verwendeten.

3.1. Säugersysteme

Säugerexpressionssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein Säugerpromotor ist jegliche DNA-Sequenz, die die Säuger-RNA-Polymerase binden und die (3'-seitig) stromabwärts erfolgende Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. ein Strukturgen) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor weist einen Transkriptionsinitiationsbereich auf, der üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt, und eine TATA-Box, die üblicherweise 25 bis 30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle liegt. Es wird angenommen, daß die TATA-Box die RNA-Polymerase II steuert, die RNA-Synthese an der richtigen Stelle zu beginnen. Ein Säugerpromotor enthält ferner ein stromaufwärts liegendes Promotorelement, das üblicherweise 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box liegt. Ein stromaufwärts liegendes Promotorelement bestimmt die Geschwindigkeit, mit der die Transkription initiiert wird und kann in jeder Orientierung wirken (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg. (1989)).
Säugervirus-Gene werden häufig stark exprimiert und haben ein breites Wirtsspektrum; daher liefern Säugervirus-Gene codierende Sequenzen besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele sind der frühe SV40-Promotor, Maus- Brusttumorvirus-LTR-Promotor, späte Hauptpromotor von Adenovirus (Ad MLP) und Herpes simplex-Viruspromotor. Ferner liefern auch Sequenzen, die von nicht-viralen Genen stammen, wie das murine Metallothioneingen, nützliche Promotorsequenzen. Die Expression kann je nach Promotor entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein und mit Glucocorticoiden in auf Hormone antwortenden Zellen induziert werden.
Die Gegenwart eines Enhancer-Elements (Enhancer) in Kombination mit den vorstehend beschriebenen Promotorelementen erhöht üblicherweise die Expressionsraten. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription bei einer Verknüpfung mit homologen oder heterologen Promotoren bis zum 1 000fachen stimulieren kann, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhaneer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstelle entweder in einer normalen oder verkehrten Orientierung oder in einem Abstand von mehr als 1 000 Nucleotiden vom Promotor liegen (Maniatis et al., Science 236 (1989), 1237; und Alberts et al., Molecular Biology of the Cell 2. Ausg. (1989)). Von Viren stammende Enhancer-Elemente können besonders nützlich sein, da sie üblicherweise ein breiteres Wirtsspektrum haben. Beispiele sind der Enhancer der frühen Gene von SV40 (Dijkema et al., EMBO J. 4 (1985), 761) und die Enhancer/Promotoren, die von der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarkoma-Virus (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 6777) und vom menschlichen Cytomegalovirus (Boshart et al., Cell 41 (1985), 5221) stammen. Ferner sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in Gegenwart eines Inducers wie eines Hormons oder Metallions aktiv (Sassone-Corsi et al., Trends Genet. 2 (1986), 215, und Maniatis et al., Science 236 (1987), 1237).
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Säugerzellen exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann mit dem DNA-Molekül direkt verbunden werden, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein vom ATG- Startcodon codiertes Methionin ist. Falls gewunscht, kann der N-Terminus vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle in das Nährmedium sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das ein eine Sekretion von Fremdprotein aus Säugerzellen bewirkendes Leadersequenzfragment enthält. Die entweder in vivo oder in vitro spaltbaren Prozessierungsstellen werden vorzugsweise zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen codiert. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Die Tripartit-Leadersequenz des Adenovirus ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die die Sekretion eines Fremdproteins aus Säugerzellen bewirkt.
Üblicherweise sind von Säugerzellen erkannte Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen regulatorische Bereiche, die 3'-seitig zum Translationsstopcodon liegen und daher zusammen mit den Promotorelementen die codierende Sequenz flankieren. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch eine stellenspezifische posttranskriptionelle Spaltung und Polyadenylierung gebildet (Birnstiel et al., Cell 41(1985), 349); Proudfoot und Whitelaw (1988), "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", in Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover); Proudfoot Trends Biochem. Sci. 14 (1989), 105). Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in ein von der DNA codiertes Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele für Transkriptionsterminator/Polyadenylierungssignale sind die von SV40 stammenden (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual).
Einige Gene können effizienter expruniert werden, wenn Introns (auch als intervenierende Sequenzen bezeichnet) vorhanden sind. Mehrere cDNAs wurden jedoch effizient von Vektoren exprimiert, denen Spleiß-Signale (auch als Spleiß-Donor- und - Akzeptorstellen bezeichnet) fehlen, vgl. z. B. Gething und Sambrook, Nature 293 (1981), 620. Introns sind intervenierende nicht-codierende Sequenzen in einer codierenden Sequenz, die Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Stellen enthalten. Sie werden durch ein als "Spleißen" bezeichnetes Verfahren entfernt, mit einer anschließenden Polyadenylierung des primären Transkripts (Nevins, Annu. Rev. Biochem. 52 (1983), 441, Green, Annu. Rev. Genet. 20 (1986), 671, Padgett et al., Annu. Rev. Biochem. 55 (1986), 1119, und Krainer und Maniatis, "RNA splicing", in Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames und D. M. Glover) (1988).
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Enhancer, Introns mit funktionellen Spleiß-Donor- und -Akzeptorstellen und Leadersequenzen können, falls gewunscht, auch in ein Expressionskonstrukt eingeschlossen werden. Expressionskonstrukte werden häufig in Replicons wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide) aufrechterhalten, die in einem Wirt, beispielsweise Säugerzellen oder Bakterien, stabil aufrechterhalten werden. Säugerreplikationssysteme schließen die von Tierviren stammenden Systeme ein, die zur Replikation transagierende Faktoren benötigen. Plasmide, die die Replikationssysteme von Papovaviren wie SV40 (Gluzman, Cell 23 (1981), 175) oder Polyomavirus enthalten, replizieren in Gegenwart des geeigneten viralen T-Antigens zu einer extrem hohen Kopienzahl. Weitere Beispiele für Säuger-Replicons sind die vom Rinder-Papillomavirus und Epstein-Barr-Virus stammenden. Ferner kann das Replicon zwei Replikationssysteme haben, so daß es beispielsweise in Säugerzellen zur Expression und in einem prokaryontischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann. Beispiele für solche Säuger-Bakterien-Shuttle-Vektoren sind pMT2 (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989), 946) und pHEBO (Shimizu et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 1074).
Das verwendete Transformationsverfahren hängt vom zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zur Einführung von heterologen Polynucleotiden in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen eine Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatpräzipitation, Polybrene-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einschluß des Polynucleotids (der Polynucleotide) in Liposomen und direkte Mikroinjektion der DNA in Kerne ein.
Säugerzellinien, die als Wirte zur Expression verfügbar sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen viele immortalisierte Zellinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten werden können und, jedoch ohne Beschränkung darauf, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nieren (BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), menschliche hepatozelluläre Carcinomzellen (z. B. Hep G2) und eine Reihe von anderen Zellinien einschließen.

ii. Baculovirussysteme

Das das Protein codierende Polynucleotid kann ferner in einen geeigneten Insekten-Expressionsvektor insertiert werden und wird in diesem Vektor mit den Kontrollelementen funktionell verbunden. Zur Vektorkonstruktion werden auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet.
Die Bestandteile des Expressionssystems schließen normalerweise einen Transfervektor ein, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirusgenoms als auch eine geeignete Restriktionsstelle zur Insertion des/der zu exprimierenden heterologen Gens/Gene enthält; ein Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz, die zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment im Transfervektor homolog ist (dies ermöglicht die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus- Genom); und geeignete Insekten-Wirtszellen und Nährmedien.
Nach der Insertion der das Protein codierenden DNA-Sequenz in den Transfervektor werden der Vektor und das Wildtyp-Virusgenom in eine Insektenwirtszelle transfiziert, wo der Vektor und das virale Genom rekombinieren können. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert, und rekombinante Plaques werden identifiziert und gereinigt. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind in Form eines Kits im Handel unter anderem von Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"-Kit) erhältlich. Diese Verfahren sind dem Fachmann allgemein bekannt und werden von Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (hier nachstehend als "Summers und Smith" bezeichnet), ausführlich beschrieben.
Vor der Insertion der das Protein codierenden DNA-Sequenz in das Baculovirusgenom werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Leadersequenz (falls gewunscht), eine interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, üblicherweise in ein intermediäres Transplacement-Konstrukt (Transfervektor) eingebaut. Dieses Konstrukt kann ein einzelnes Gen und funktionell verbundene regulatorische Elemente, multiple Gene, von denen jedes einen eigenen Satz von funktionell verbundenen regulatorischen Elementen aufweist, oder multiple Gene, die durch den gleichen Satz von regulatonschen Elementen reguliert werden, enthalten. Intermediäre Transplacement-Konstrukte werden häufig in einem Replicon aufrechterhalten, beispielsweise einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das in einem Wirt, beispielsweise einem Bakterium, stabil bleibt. Das Replicon hat ein Replikationssystem, so daß es in einem geeigneten Wirt zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann.
Gegenwärtig ist pAc373 der am häufigsten verwendete Transfervektor zur Einführung von Fremdgenen in AcNPV. Viele andere dem Fachmann bekannte Vektoren wurden ebenfalls entwickelt. Diese schließen beispielsweise pVL985 ein (wodurch sich das Polyhedrin-Startcodon von ATG in ATT umwandelt und eine BamHI-Clonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts von ATT eingeführt wird (vgl. Luckow und Summers, Virology 17 (1989), 31).
Das Plasmid enthält üblicherweise auch das Polyhedronpolyadenylierungssignal (Miller et al., Arm. Rev. Microbiol. 42 (1988), 177), ein prokaryontisches Ampicillin-Resistenz (amp)-Gen und einen Replikationsursprung zur Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculoviruspromotor. Ein Baculoviruspromotor ist jegliche DNA-Sequenz, die eine Baculovirus- RNA-Polymerase binden und die stromabwärts erfolgende (5' nach 3') Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. Strukturgen) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor hat einen Transkriptionsinitiationsbereich, der üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch eine zweite Domäne aufweisen, die als Enhancer bezeichnet wird, der, falls vorhanden, üblicherweise distal zu dem Strukturgen liegt. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturgene, die in einer späten Phase des viralen Infektionszyklus abundant transkribiert werden, liefern besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele sind Sequenzen, die von dem das virale Polyhedrinprotein codierenden Gen (Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" in The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler) (1986) und EPO-Veröffentl. Nrn. 127 839 und 155 476) und dem das p10-Protein codierenden Gen stammen (Vlak et al., J. Gen. Virol. 69 (1988), 765).
Geeignete Signalsequenzen codierende DNA kann von Genen für sezernierte Insekten- oder Baculovirusproteine wie das Baculovirus-Polyhedringen abgeleitet werden (Carbonell et al., Gene 73 (1988), 409). Da die Signale für posttranslationale Modifikationen in Säugerzellen (wie eine Signalpeptidspaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) von Insektenzellen anscheinend erkannt werden und die zur Sekretion und Anreicherung im Zellkern erforderlichen Signale anscheinend ebenfalls zwischen Invertebratenzellen und Vertebratenzellen konserviert sind, können alternativ die nicht von Insekten stammenden Leadersequenzen, beispielsweise von Genen, die menschliches α-Interferon (Maeda et al., Nature 315 (1985), 592), menschliches Gastrin-freisetzendes Peptid (Lebacq-Verheyden et al., Molec. Cell. Biol. 8 (1988), 3129), menschliches IL-2 (Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8404), Maus-IL-3 (Miyajima et al., Gene 58 (1987), 273) und menschliche Glucocerebrosidase (Martin et al., DNA 7 (1988), 99) codieren, auch verwendet werden, um eine Sekretion in Insekten zu bewirken.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert werden oder bei einer Expression mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen sezerniert werden. Eine gute intrazelluläre Expression von nicht-fusionierten Fremdproteinen erfordert üblicherweise heterologe Gene, die idealerweise eine kurze geeignete Translationsinitiationssignale vor einem ATG-Startsignal enthaltende Leadersequenz aufweisen. Falls gewünscht, kann Methionin am N-Terminus vom reifen Protein durch In vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Alternativ können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die natürlich nicht sezerniert werden, aus der Insektenzelle sezerniert werden, indem chimäre DNA- Molekule, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem die Sekretion des Fremdproteins in Insekten bewirkenden Leadersequenzfragment besteht, erzeugt werden. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Verlagerung des Proteins in das endoplasmatische Retikulum regulieren.
Nach der Insertion der DNA-Sequenz und/oder des Gens, wobei die DNA- Sequenz und/oder das Gen den Expressionsproduktvorläufer des Proteins codieren, wird ein Insektenzellwirt mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus -- üblicherweise durch Cotransfektion -- transfiziert. Der Promotor und die Transkriptionsterminationssequenz des Konstrukts umfassen üblicherweise einen 2 bis 5 kb-Abschnitt des Baculovirusgenoms. Verfahren zur Einführung von heterologer DNA in die gewünschte Stelle im Baculovirus sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. Summers und Smith, Ju et al. (1987), Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 2156, und Luckow und Summers (1989)). Die Insertion kann beispielsweise in ein Gen wie dem Polyhedringen durch homologe doppelte Crossover- Rekombination erfolgen; die Insertion kann ferner in eine Restriktionsenzymstelle erfolgen, die in ein gewünschtes Baculovirusgen eingebaut ist (Miller et al., Bioessays 4 (1989), 91).
Die DNA-Sequenz wird bei einer Clonierung in das Polyhedringen im Expressionsvektor sowohl 5'-seitig als auch 3'-seitig von Polyhedrin-spezifischen Sequenzen flankiert und stromabwärts des Polyhedrinpromotors positioniert.
Der neu gebildete Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in ein infektiöses rekombinantes Baculovirus verpackt. Die homologe Rekombination erfolgt mit geringer Häufigkeit (zwischen etwa 1 % und etwa 5%); der größte Teil des nach der Cotransfektion produzierten Virus ist noch ein Wildtyp-Virus. Daher ist ein Verfahren zur Identifizierung von rekombinanten Viren erforderlich. Ein Vorteil des Expressionssystems ist eine visuelle Durehmusterung, die eine Unterscheidung von rekombinanten Viren errnöglicht. Das vom nativen Virus produzierte Polyhedrinprotein wird in sehr großen Mengen in den Kernen der infizierten Zellen in einer späten Phase der Virusinfektion produziert. Das akkumulierte Polyhedrinprotein bildet Einschlußkörperchen, die auch eingebettete Partikel enthalten. Diese Einschlußkörperchen bis zu 15 µm an Größe sind stark refraktil, was ihnen ein helles glänzendes Aussehen verleiht, das unter dem Lichtmikroskop leicht sichtbar gemacht werden kann. Den Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, fehlen Einschlußkörperchen. Zur Unterscheidung des rekombinanten Virus vom Wildtyp-Virus wird der Transfektionsüberstand zur Plaquebildung auf einer einzelligen Schicht von Insektenzellen durch dem Fachmann bekannte Verfahren verteilt. Das heißt, die Plaques werden unter dem Lichtmikroskop darauf durchmustert, ob Einschlußkörperchen vorhanden (zeigt das Wildtyp-Virus an) oder abwesend (zeigt das rekombinante Virus an) sind ("Current Protocols in Microbiology" Bd. 2 (Ausubel et al., Hrsg.) bei 16.8 (Supp. 10, 1990), Summers und Smith, Miller et al. (1989)).
Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden zur Infektion von mehreren Insektenzellen entwickelt. Beispielsweise wurden rekombinante Baculoviren unter anderem entwickelt für: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mon, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT- Veröffentlichungsnr. WO 89/046699; Carbonell et al., J. Virol. 56 (1985), 153, Wright, Nature 321(1986), 718, Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 2156, und vgl. allgemein Fraser et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25 (1989), 225).
Die Zellen und Zellkulturmedien sind sowohl zur direkten als auch zur Fusionsexpression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus/Expressionssystem im Handel erhältlich; das Zellkülturverfahren ist dem Fachmann allgemein bekannt (vgl. z. B. Summers und Smith).
Die modifizierten Insektenzellen können anschließend in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, in dem das (die) im modifizierten Insektenwirt vorhandene(n) Plasmid(e) stabil aufrechterhalten werden kann (können). Wenn das Expressionsproduktgen unter induzierbarer Kontrolle ist, kann der Wirt bis zu einer hohen Dichte gezüchtet und die Expression induziert werden. Wenn die Expression konstitutiv ist, wird das Produkt alternativ kontinuierlich in das Medium exprimiert, und das Nährmedium muß kontinuierlich zirkuliert werden, während das interessierende Produkt entfernt und fehlende Nährstoffe ergänzt werden. Das Produkt kann durch solche Verfahren wie Chromatographie, z. B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie etc.; Elektrophorese; Dichtegradientenzentrifugation; Lösungsmittelextraktion etc. gereinigt werden. Das Produkt kann, falls erforderlich, weiter gereinigt werden, um im wesentlichen jegliche ebenfalls in das Medium sezernierten oder aus der Lyse der Insektenzellen resultierenden Insektenproteine zu entfernen, um ein Produkt bereitzustellen, das wenigstens im wesentlichen frei von Wirtstrümmern, z. B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden, ist.
Für die Proteinexpression werden von den Transformanten stammende rekombinante Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression der das rekombinante Protein codierenden Sequenz ermöglichen, inkubiert. Diese Bedingungen variieren je nach der gewählten Wirtszelle. Die Bedingungen sind für den Fachmann aufgrund seines Fachwissens jedoch leicht ermittelbar.

iii. Bakterielle Systeme

Bakterielle Expressionsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein bakterieller Promotor ist jegliche DNA-Sequenz, die eine bakterielle RNA-Polymerase binden und die stromabwärts (3'-seitig) erfolgende Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. ein Strukturgen) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor hat einen Transkriptionsinitiationsbereich, der üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein bakterieller Promotor kann ferner eine zweite als Operator bezeichnete Domäne aufweisen, die mit einer benachbarten RNA-Polymerase-Bindungsstelle, an der die PNA-Synthese beginnt, überlappt. Der Operator erlaubt eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da ein Genrepressorprotein den Operator binden und so die Transkription eines spezifischen Gens inhibieren kann. Die konstitutive Expression kann in Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen wie dem Operator erfolgen. Ferner kann die positive Regulation durch eine Genaktivatorprotein-Bindungssequenz erreicht werden, die, falls vorhanden, üblicherweise proximal (5'-seitig) zu der RNA- Polymerase-Bindungssequenz liegt. Ein Beispiel eines Genaktivatorproteins ist das Catabolit-Aktivator-Protein (CAP), das die Initiation der Transkription des lac-Operons in E. coli unterstützt (Raibaud et al., Annu. Rev. Genet. 18 (1984), 173). Die Regulation der Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder erhöht oder reduziert wird.
Die Sequenzen, die Stoffwechselenzyme des metabolischen Wegs codieren, liefern besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele dafür sind von Zucker-metabolisierenden Enzymen stammende Promotorsequenzen wie Galactose, Lactose (lac) (Chang et al., Nature 198 (1977), 1056) und Maltose. Weitere Beispiele sind von biosynthetischen Enzymen wie Tryptophan (trp) stammende Promotorsequenzen (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8 (1980), 4057, Yelverton et al., Nucl. Acids Res. 9 (1981), 731, US-Patent Nr. 4,738,921 und EPO-Veröffentlichungsnrn. 036 776 und 121 775). Das β-Lactamase (bla)-Promotorsystem (Weissmann, "The doning of interferon and other mistakes", in Interferon 3 (Hrsg. 1. Gresser) (1981)), das Bakteriophage-lambda PL-Promotorsystem (Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128) und das T5 (US-Patent Nr. 4,689,406)-Promotorsystem liefern ebenfalls nützliche Promotorsequenzen.
Ferner wirken in der Natur nicht vorkommende synthetische Promotoren ebenfalls als bakterielle Promotoren. Beispielsweise können transkriptionsaktivierende Sequenzen eines Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotors mit den Operonsequenzen eines anderen Bakterien- oder Bakteriophagenpromotors verknüpft werden, wobei ein synthetischer Hybridpromotor erzeugt wird (US-Patent Nr. 4,551,433). Beispielsweise ist der tac-Promotor ein durch den lac-Repressor regulierter Hybrid-trp-lac-Promotor, der sowohl trp-Promotor- als auch lac-Operonsequenzen umfaßt (Amann et al., Gene 25 (1983), 167, und de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21). Ferner kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren von nicht-bakteriellem Ursprung einschließen, die die Fähigkeit zur Bindung von bakterieller RNA- Polymerase und zur Initiation der Transkription haben. Ein natürlich vorkommender Promotor von nicht-bakteriellem Ursprung kann ferner auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsraten von einigen Genen in Prokaryonten zu erzeugen. Das Bakteriophage T7-RNA-Polymerase/Promotorsystem ist ein Beispiel eines gekoppelten Promotorsystems (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), 113, und Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985), 1074). Ein Hybridpromotor kann ferner auch aus einem Bakteriophagen-Promotor und einem E. coli-Operatorbereich bestehen (EPO-Veröffentl.-Nr. 267 851).
Zusätzlich zu einer funktionierenden Promotorsequenz ist eine effiziente Ribosomenbindungsstelle zur Expression von Fremdgenen in Prokaryonten ebenfalls nützlich. In E. coli wird die Ribosomenbindungsstelle als Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bezeichnet und schließt ein Initiationscodon (ATG) und eine 3 bis 9 Nucleotide lange Sequenz ein, die 3 bis 11 Nucleotide stromaufwärts des Initiationseodons liegt (Shine et al., Nature 254 (1975), 34). Es wird angenommen, daß die SD-Sequenz die Bindung der mRNA an das Ribosom durch die Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der E. coli 165-RRNA fördert (Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequenees in messenger RNA", in Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger (1979)). Zur Expression von eukaryontischen und prokaryontischen Genen mit einer schwachen Ribosomenbindungsstelle vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989).
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verknüpft werden, wobei die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein vom ATG-Startcodon codiertes Methionin ist. Falls gewünscht, kann Methionin am N-Terminus vom Protein durch In vitro-Ihkubation mit Bromcyan oder entweder durch In vivo- oder In vitro-Ihkubation mit einer baktenellen Peptidase für N-terminales Methionin abgespalten werden (EPO-Veröffentl.-Nr. 219 237).
Fusionsproteine sind eine Alternative zur direkten Expression. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen bakteriellen Proteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Nach der Expression liefert dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. Das Bakteriophagen lambda-Zellgen kann beispielsweise an den 5'-Terminus eines Fremdgens gebunden und in Bakterien exprimiert werden. Das erhaltene Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagenprotein vom Fremdgen abzuspalten (Nagai et al., Nature 309 (1984), 810). Fusionsproteine können ferner mit Sequenzen des lacz-Gens (Jia et al., Gene 60 (1987), 197) und des trpe-Gens (Allen et al., J. Biotechnol. 5 (1987), 93, Makoffet al., J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 11, und EPO-Veröffentl. -Nr. 324 647) hergestellt werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann, kann aber auch nicht, eine Spaltungsstelle codieren. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit dem Ubiquitin-Bereich, der zur Abspaltung des Ubiquitins vom Fremdprotein vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym (z. B. Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease) behält, hergestellt. Durch dieses Verfahren kann das native Fremdprotein isoliert werden (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989), 698).
Alternativ können Fremdproteine auch aus der Zelle durch Erzeugung von chimären DNA-Molekülen, die ein Fusionsprotein codieren, das ein die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien bewirkendes Signalpeptidsequenzfragment enthält (US- Patent Nr. 4,336,336), sezerniert werden. Das Signalsequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuert. Das Protein wird entweder in das Nährmedium (gram-positive Bakterien) oder in den zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle liegenden periplasmatischen Raum (gram-negative Bakterien) sezerniert. Es gibt vorzugsweise Prozessierungsstellen, die zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen codiert werden und die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können.
Geeignete Signalsequenzen codierende DNA kann von Genen für sezernierte bakterielle Proteine wie dem Gen für das äußere Membranprotein von E. coli (ompA) (Masui et al., in Experimental Manipulation of Gene Expression (1983), Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984), 2437) und von der alkalische Phosphatase-Signalsequenz von E. coli (phoa) (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7212) abgeleitet werden. Ferner kann beispielsweise die Signalsequenz des alpha-Amylasegens von verschiedenen Bacillusstämmen zur Sekretion von heterologen Proteinen von B. subtilis verwendet werden (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5582 und EPO- Veröffentl.-Nr. 244 042).
Üblicherweise sind Transkriptionsterminationssequenzen, die von Bakterien erkannt werden, regulatorische Bereiche, die 3'-seitig zum Translationsstopcodon liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA codierte Polypeptid translatiert wird. Die Transkriptionsterminationssequenzen schließen häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden ein, die die Termination der Transkription unterstützenden Stamm-Schlaufen-Strukturen bilden körnen. Beispiele dafür sind Transkriptionsterminationssequenzen, die von Genen mit starken Promotoren wie dem trp-Gen in E. coli sowie anderen biosynthetischen Genen stammen.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Signalsequenz (falls gewünscht), eine interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Die Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replicon wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das in einem Wirt, beispielsweise Bakterien, stabil aufrechterhalten wird, aufrechterhalten. Das Replicon hat ein Replikationssystem, so daß es in einem prokaryontischen Wirt entweder zur Expression oder zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann. Ein Replicon kann ferner ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl hat allgemein eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von 10 bis etwa 150. Ein Wirt mit einem Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält vorzugsweise mindestens etwa 10 und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Es kann ein Vektor entweder mit einer hohen oder niedrigen Kopienzahl, je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt, gewählt werden.
Alternativ können die Expressionskonstrukte in das bakterielle Genom mit einem integrierenden Vektor integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine Sequenz, die zum bakteriellen Chromosom homolog ist und die Integration des Vektors ermöglicht. Integrationen erfolgen anscheinend durch Rekombinationen zwischen der homologen DNA im Vektor und dem bakteriellen Chromosom. Integrierende Vektoren, die aus DNA von verschiedenen Bacillusstämmen konstruiert werden, integrieren beispielsweise in das Bacilluschromosom (EPO- Veröffentl.-Nr. 127 328). Integrierende Vektoren können ferner aus Bakteriophagen- oder Transposonsequenzen bestehen.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker zur Selektion von transformierten Bakterienstämmen enthalten. Selektierbare Marker können im bakteriellen Wirt exprimiert werden und Gene einschließen, die den Bakterien eine Resistenz gegen Wirkstoffe wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin verleihen (Davies et al., Annu. Rev. Microbiol. 32 (1978), 469). Selektierbare Marker können ferner biosynthetische Gene wie die zur Biosynthese von Histidin, Tryptophan und Leucin einschließen.
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengesetzt werden. Die Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten wird oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation in viele Bakterien entwickelt. Beispielsweise wurden Expressionsvektoren unter anderem für die folgenden Bakterien entwickelt: Bacillus subtilis (Palv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5582, EPO-Veröffentl.-Nrn. 036 259 und 063 953 und PCT-Veröffentl.-Nr. WO 84/04541), E. coli (Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128, Amann et al., Gene 40 (1985), 183, Studier et al., 3. Mol. Biol. 189 (1986), 113, und EPO-Veröffentl.- Nrn. 036 776, 136 829 und 136 907), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655), Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655) und Streptomyces lividans (US-Patent Nr. 4,745,056).
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in bakterielle Wirte sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen üblicherweise die Transformation von mit CaCl&sub2; oder anderen Stoffen wie divalente Kationen und DMSO behandelten Bakterien ein. DNA kann auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingeführt werden. Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit den zu transformierenden Bakterienarten (vgl. z. B. Masson et al., FEMS Microbiol. Lett. 60 (1989), 273, Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5582, EPO-Veröffentl.-Nrn. 036 259 und 063 953, PCT-Veröffentl.-Nr. WO 84/04541 für Bacillus, Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 856, Wang et al., 3. Bacteriol. 172 (1990), 949, für Camphylobacter, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1973), 2110, Dower et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 6127, Kushner, "An improved method for transformation of E. coli with Colel-derived plasmids", in Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer und S. Nicosia) (1978), Mandel et al., 3. Mol. Biol. 53 (1970), 159, Taketo, Biochim. Biophys. Acta 949 (1988), 318, für Escherichia, Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett. 44 (1987), 173, für Lactobacillus, Fiedler et al., Anal. Biochem. 170 (1988), 38, für Pseudomonas, Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett. 66 (1990), 203, für Staphylococcus, Barany et al., 3. Bacteriol. 144 (1980), 698, Harlander, "Transformation of Streptococcus lactis by eleetroporation", in Streptococcal Genetics (Hrsg. 3. Ferretti und R. Curtiss III) (1987), Perry et al., Infec. Immun. 32 (1981), 1295, Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655, und Somkuti et al., Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1(1987), 412, für Streptococcus.

iv. Hefeexpression

Hefeexpressionssysteme sind dem Facbmann ebenfalls bekannt. Ein Hefepromotor ist jegliche DNA-Sequenz, die die Hefe-RNA-Polymerase binden und die stromabwärts (3'-seitig) erfolgende Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor hat einen Transkriptionsinitiationsbereich, der üblicherweise proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Dieser Transkriptionsinitiationsbereich schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (die "TATA Box") und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Hefepromotor kann auch eine zweite Domäne, die als stromaufwärts liegende Aktivatorsequenz (UAS) bezeichnet wird, aufweisen, die, falls vorhanden, üblicherweise distal zu dem Strukturgen liegt. Die UAS erlaubt eine regulierte (induzierbare) Expression. Eine konstitutive Expression erfolgt in Abwesenheit einer UAS. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder erhöht oder reduziert wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechsel, daher liefern Enzyme des metabolischen Weges codierende Sequenzen besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele sind die Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO-Veröffentl- Nr. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, Glycerinaldehyd-3- Phosphatdehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3- Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (PyK) (EPO-Veröffentl.-Nr. 329 203). Das die saure Phosphatase codierende Hefe-PHO5-Gen liefert ebenfalls nützliche Promotorsequenzen (Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 1).
Ferner wirken in der Natur nicht vorkommende synthetische Promotoren ebenfalls als Hefepromotoren. Beispielsweise können UAS-Sequenzen eines Hefepromotors mit dem Transkriptionsaktivierungsbereich eines anderen Hefepromotors verknüpft werden, wobei ein synthetischer Hybridpromotor erzeugt wird. Ein Beispiel für einen Hybridpromotor ist die ADH-regulierende Sequenz, die mit dem GAP- Transkriptionsaktivierungsbereich verknüpft ist (US-Patente mit den Nrn. 4,876,197 und 4,880,734). Weitere Beispiele für Hybridpromotoren sind Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen der ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PHO5-Gene bestehen, die mit dem Transkriptionsaktivierungsbereich eines Gens für glycolytische Enzymgene wie GAP oder PyK (EPO-Veröffentl.-Nr. 164 556) kombiniert sind. Ferner kann ein Hefepromotor natürlich vorkommende nicht von Hefe stammende Promotoren einschließen, die die Hefe-RNA-Polymerase binden und die Transkription initiieren können. Beispiele für solche Promotoren werden unter anderem beschrieben von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1078, Henikoff et al, Nature 283 (1981), 835, Hollenberg et al., Curr. Topics Mierobiol. Immunol. 96 (1981), 119, Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timmis und A. Puhler) (1979), Mercerau-Puigalon et al., Gene 11 (1980), 163, und Panthier et al., Curr. Genet. 2 (1980), 109.
Ein DNA-Molekül kann in Hefe intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden werden, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein vom ATG- Startcodon codiertes Methionin ist. Falls gewünscht, kann das Methionin am N- Terminus vom Protein durch In vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Fusionsproteine liefern eine Alternative für Hefeexpressionssysteme sowie Säuger-, Baculovirus- und bakterielle Expressionssysteme. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Nach der Expression liefert dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen. Das Hefe- oder menschliche Superoxiddismutase (SOD)-Gen kann beispielsweise mit dem 5'-Terminus eines Fremdgens verknüpft und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz kann, kann aber auch nicht, an der Verbindung der beiden Aminosäuresequenzen eine Spaltungsstelle codieren (vgl. z. B. EPO- Veröffentl.-Nr. 196 056). Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird aus dem Ubiquitinbereich hergestellt, der vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym (z. B. Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease) zur Abspaltung des Ubiquitins vom Fremdprotein enthält. Durch dieses Verfahren kann daher ein natives Fremdprotein isoliert werden (vgl. z. B. PCT-Veröffentl.-Nr. WO 88/024066).
Alternativ können Fremdproteine aus der Zelle in das Nährmedium sezerniert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem bei Hefe die Sekretion des Fremdproteins bewirkenden Leadersequenzfragment besteht. Die Prozessierungsstellen werden vorzugsweise zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen codiert und können entweder in vivo oder in vitro gespalten werden. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuernden hydrophoben Aminosäuren besteht.
Geeignete Signalsequenzen codierende DNA kann von Genen für sezernierte Hefeproteine wie dem Hefe-Invertasegen (EPO-Veröffentl.-Nr. 012 873, und JPO- Veröffentl.-Nr. 62,096,086) und dem A-Faktor-Gen (US-Patent Nr. 4,588,684) abstammen. Alternativ existieren Leadersequenzen, die nicht aus der Hefe stammen, wie eine Interferonleadersequenz, die ebenfalls eine Sekretion in Hefe bewirken (EPO- Veröffentl.-Nr. 060 057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadersequenzen verwendet ein Fragment des Hefe-alpha-Fäktor-Gens, das sowohl eine "Prä"-Signalsequenz als auch einen "Pro"-Bereich enthält. Die verwendbaren Arten von alpha-Faktor-Fragmenten schließen Präpro-alpha-Faktor-Leadersequenzen (etwa 83 Aminosäurereste) von vollständiger Länge sowie verkürzte alpha-Faktor-Leadersequenzen (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) ein (US-Patente mit den Nrn. 4,546,083 und 4,870,008, und EPO-Veröffentl.-Nr. 324 274). Weitere Leadersequenzen, die ein die Sekretion bewirkendes alpha-Faktor-Leaderfragment enthalten, schließen Hybrid-alpha-Faktor- Leadersequenzen ein, die aus der Präsequenz einer ersten Hefe und einem Probereich von einem zweiten Hefe-alpha-Faktor hergestellt werden (vgl. z. B. PCT-Veröffentl. Nr. WO 89/02463).
Üblicherweise sind von Hefe erkannte Transkriptionsterminationssequenzen regulatorische Bereiche, die 3'-seitig zum Translationsstopcodon liegen und daher zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das von der DNA codierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele für Transkriptionsterminatorsequenzen und weitere von der Hefe erkannte Terminationssequenzen sind solche, die glycolytische Enzyme codieren.
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Leadersequenz (falls gewünscht), eine interessierende codierende Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, zusammen in Expressionskonstrukte eingebaut. Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replicon wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das in einem Wirt, beispielsweise Hefe oder Bakterien, aufrechterhalten wird, aufrechterhalten. Das Replicon kann zwei Replikationssysteme haben, so daß es beispielsweise in Hefe zur Expression oder in einem prokaryontischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden kann. Beispiele für solche Hefe-Bakterien-Shuttle-Vektoren sind YEp24 (Botstein et al., Gene 8 (1979), 17-24), pCl/1 (Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984), 4642-4646) und YRp17 (Stinchcomb et al., J. Mol. Biol. 158 (1982), 157). Ein Replicon kann ferner ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl hat allgemein eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt mit einem Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält vorzugsweise mindestens etwa 10 und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Es kann ein Vektor entweder mit einer hohen oder niedrigen Kopienzahl, je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt, gewählt werden.
Alternativ können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Hefegenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zum Hefechromosom homologe Sequenz, die die Integration des Vektors ermöglicht, und enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen erfolgen anscheinend durch Rekombinationen zwischen der homologen DNA im Vektor und dem Hefechromosom (Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol. 101(1983), 228-245). Ein integrierender Vektor kann gegen eine spezifische Stelle in der Hefe gerichtet sein, indem die geeignete homologe Sequenz für einen Einschluß in den Vektor gewählt wird. Es können ein oder mehrere Expressionskonstrukte integrieren, was möglicherweise die Mengen von produziertem rekombinantem Protein beeinflußt (Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 6750). Die in dem Vektor eingeschlossenen chromosomalen Sequenzen können entweder als einzelner Abschnitt im Vektor vorkommen, was zur Integration des vollständigen Vektors führt, oder in zwei Abschnitten, die zu benachbarten Abschnitten im Chromosom homolog sind und das Expressionskonstrukt im Vektor flankieren, was zur stabilen Integration von nur dem Expressionskonstrukt führen kann.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker zur Selektion von transformierten Hefestämmen enthalten. Selektierbare Marker können im Hefewirt exprimierbare biosynthetische Gene wie ADE2, HIS4, Leu2, TRP1 und ALG7 und das den Hefezellen eine Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 verleihende G418-Resistenzgen einschließen. Ferner verleiht ein geeigneter selektierbarer Marker der Hefe auch die Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von toxischen Verbindungen wie einem Metall. CUP1 erlaubt beispielsweise der Hefe das Wachstum in Gegenwart von Kupferionen (Butt et al., Microbiol. Rev. 51 (1987), 351).
Alternativ können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile in Transformationsvektoren zusammengebaut werden. Die Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replicon aufrechterhalten wird oder zu einem integrierenden Vektor entwickelt wird.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder extrachromosomale Replicons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation in viele Hefen entwickelt. Beispielsweise wurden Expressionsvektoren unter anderem für die folgenden Hefen entwickelt: Candida albicans (Kurtt: et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 142), Candida maltosa (Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 3459, und Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 302), Kluyveromyces fragilis (Das et al., J. Bacteriol. 158 (1984), 1165), Kluyveromyces lactis (De Leuvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 737, und Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990), 135), Pichia quillenmondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141), Pichia pastoris (Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3376, und die US-Patente mit den Nrn. 4,837,148 und 4,929,555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929, und Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163), Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., Nature 300 (1981), 706) und Yarrowia lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet. 10 (1985), 380471, und Gaillardin et al., Curr. Genet. 10 (1985), 49).
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Hefewirte sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und schließen üblicherweise entweder die Transformation von Spheroplasten oder von intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt wurden, ein. Transformationsverfahren variieren üblicherweise mit den zu transformierenden Hefearten. Vgl. z. B. Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 142, und Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141, für Candida, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 3459, und Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 302, für Hansenula, Das et al., J. Bacteriol. 158 (1984), 1165, De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 1165, und Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990), 135, für Kluyveromyces, Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3376, Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141, und die US-Patente mit den Nrn. 4,837,148 und 4,929,555 für Pichia, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929, und Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163, für Saccharomyces, Beach et al., Nature 300 (1981), 706, für Schizosaccharomyces und Davidow et al., Curr. Genet. 10 (1985), 39, und Gaillardin et al., Curr. Genet. 10 (1985), 49, für Yarrowia.

4. Impfstoffe

Alle hier beschriebenen Konjugatverbindungen können als Einzelimpfstoffe oder in Kombination mit einem oder mehreren Antigenen von anderen pathogenen Quellen verwendet werden. Diese Impfstoffe können entweder prophylaktisch (zur Verhinderung einer Infektion) oder therapeutisch (zur Behandlung einer Erkrahkung nach der Infektion) sein.
Diese Impfstoffe umfassen die Konjugatverbindung üblicherweise in Kombination mit "pharmazeutisch verträglichen Trägern", die jeglichen Träger einschließen, der nicht selber die Produktion von Antikörpern induziert, die für das Individuum, das die Zusammensetzung erhält, schädlich sind. Geeignete Träger sind üblicherweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Diese Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Diese Träger können ferner als immunstimulierende Mittel ("Adjuvanzien") wirken. Das Antigen kann ferner mit einem bakteriellen Toxoid konjugiert werden, wie einem Toxoid von Diphtheria, Tetanus etc.
Bevorzugte Adjuvanzien zur Erhöhung der Effizienz der Zusammensetzung enthalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: (1) Aluminiumsalze (Alaun) wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat etc., (2) Öl-in-Wasser- Emulsionsformulierungen (mit oder ohne andere spezifische Immunstimulanzien wie Muramylpeptide (siehe nachstehend) oder bakterielle Zellwandbestandteile) wie beispielsweise (a) MF59 (PCT-Veröffentl.-Nr. WO 90/14837), das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5 % Span 85 enthält (das gegebenenfalls verschiedene Mengen MTP-PE enthält (nachstehend beschrieben), obwohl dies nicht erforderlich ist) und als Submikron-Partikel unter Verwendung eines Mikrofluidizierers wie dem Modell 1 10Y- Mikrofluidizer (Microfluidics, Newton, MA) formuliert ist, (b) SAF, das 10% Squalan, 0,4% Tween 80, 5% Pluronic-blockiertes Polymer L121 und thr-MDP (siehe nachstehend) entweder in einer Submikron-Emulsion mikrofluidiziert oder zur Erzeugung einer Emulsion mit einer größeren Partikelgröße mit dem Vortexgerät behandelt enthält, und (c) Ribi -Adjuvanssystem (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2% Squalen, 0,2% Tween 80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwandkomponenten von der Gruppe, die aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM), und dem Zellwandskelett (CWS), vorzugsweise MPL + CWS (DETOX ), besteht, enthält, (3) Saponin-Adjuvanzien wie Stimuion (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) oder daraus hergestellte Partikel wie ISCOM (immunostimulierende Komplexe) können verwendet werden, (4) komplettes Freundsches-Adjuvans (CFA) und inkomplettes Freundsches-Adjuvans (IFA), (5) Cytokine wie Interleukine (IL- 1, IL-2 etc.), den Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) etc. und (6) andere Substanzen, die als Immunstimulanzien zur Erhöhung der Wirksamkeit der Zusammensetzung wirken. Alaun und MF59 werden bevorzugt.
Wie vorstehend beschrieben, enthalten Muramylpeptide, jedoch ohne Beschrähkung darauf, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N- Acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE) etc.
Die immunogenen Zusammensetzungen (z. B. das Antigen, pharmazeutisch verträgliche Träger und Adjuvans) enthalten üblicherweise Verdünnungsmittel wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol etc. Weitere Hilfssubstanzen wie Netzmittel oder Emulgatoren, pH-puffernde Substanzen und ähnliche können in diesen Vehikeln vorhanden sein.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden typischerweise als Injektionen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; feste Formen, die für eine Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann ferner, wie vorstehend unter pharmazeutisch verträglichen Trägern beschrieben, emulgiert oder für eine erhöhte Wirkung des Adjuvans in Liposomen eingeschlossen werden.
Als Impfstoffe verwendete immunogene Zusammensetzungen umfassen eine immunologisch wirksame Menge der antigenen Polypeptide sowie alle anderen vorstehend beschriebenen Bestandteile, falls erforderlich. Der Begriff "immunologisch wirksame Menge" meint, daß die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum entweder in einer einzelnen Dosis oder als Teil einer Serie in der Behandlung oder Prävention wirksam ist. Diese Menge variiert je nach der Gesundheit und dem physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht-menschlicher Primat, Primat etc.), der Kapazität des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern, dem gewünschten Grad des Schutzes, der Impfstofformulierung, der Beurteilung des medizinischen Zustands durch den behandelnden Arzt und anderen relevanten Faktoren. Es wird erwartet, daß die Menge in einem relativ breiten Bereich liegt, der durch Standardversuche ermittelt werden kann.
Die immunogenen Zusammensetzungen werden üblicherweise parenteral verabreicht, z. B. durch subcutane oder intramuskuläre Injektion. Beispiele für weitere Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, sind orale und pulmonale Formulierungen, Zäpfchen und transdermale Anwendungen. Die Dosierungsbehandlung kann ein Behandlungsplan mit einer oder mehreren Dosen sein. Der Impfstoff kann zusammen mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.

5. Beispiel 1

Die Konjugatverbindungen, die Polysaccharide der Meningococcus C-Gruppe und die Hitzeschockproteine hspR70 und hspR65 umfassen, wurden konstruiert und auf ihre Wirksamkeit als Impfstoff getestet.

5.1. Reinigung von Polysacchariden der Meningococcus C (MenC)-Gruppe und Herstellung von MenC-Oligosacchariden

Das Meningococcen-Polysaccharid der Gruppe C wurde, wie in Frasc, C. E., "Advances in Biotechnological Processes: Bacterial vaccines" (A. Mizrahi, Hrsg.) Bd. 13 (1990), 123-145, Wiley-Liss Inc., New York, beschrieben, gereinigt. Das gereinigte Polysaccharid (10 mg/ml) wurde durch Hydrolyse in 0,01 M Acetatpuffer von pH 5 8 Stunden bei 100ºC depolymerisiert. Das erhaltene Produkt wurde durch analytische Chromatographie (auf Sephadex 6-50) analysiert und zeigte einen Kd (Verteilungskoeffizienten) von 0,27.

5.2. Einführung einer primären Aminogruppe in die terminalen Gruppen des Oligosaccharids

0,5 M Ammoniumchlorid und 0,15 M Natriumcyanoborhydrid wurde der aus der Hydrolyse erhaltenen Lösung zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 7 erhöht und die erhaltene Lösung eine Woche bei 35ºC gehalten. Das Oligosaccharid wurde anschließend durch Chromatographie (auf Sephadex 6-15) gereinigt und die Ausschlußvolumenfraktionen, die eine chemische Aktivität in bezug auf die Aminogruppen und Kohlehydratreste aufwiesen, wurden gesammelt, während die monomere Zucker und einen Überschuß von Reagenzien enthaltenden Fraktionen verworfen wurden. Das erhaltene MenC-Oligosaccharid wurde durch Ermittlung der Aminogruppen, Sialinsäuregruppen und der O-Acetylgruppe ermittelt. Die folgenden molaren Verhältnisse wurden erhalten: Sialinsäure/Aminogruppen = 20 und O- Acetylgruppe/Sialinsäure = 0,84.

5.3. Herstellung von Hitzeschockproteinen

Ein 65 kD-hsp (hspR65) BCG vom GroEL-Typ aus M. bovis wurde aus einem rekombinanten E. coli K12-Stamm, der das Plasmid pRIB1300 (Thole et al., Infect. Immun. 50 (1985), 800, und Van Eden et al., Nature 331(1988), 171) enthielt, exprimiert und, wie von Thole et al., Infect. Immun. 55 (1987), 1466, beschrieben, gereinigt.
Das rekombinante 70 kD-hsp (hspR70) vom Dnak-Typ aus M. tuberculosis wurde erhalten und durch ATP-Agarose-Chromatographie gereinigt (Mehlert et al., Mol. Microbiol. 3 (1989), 125).

5.4. Herstellung der Glycokoniugate des MenC-Polysaccharids und von hspR65 und hspR70

Das MenC-Amino-Oligosaccharid wurde in Dimethylsulfoxid mit 10% H&sub2;O gelöst und anschließend mit einem 12fachen Überschuß (relativ zu den Aminogruppen) von N-Hydroxysuccinimidester der Adipinsäure umgesetzt [gemäß Hill et al., "FEBS LETT." 102 (1979), 282, hergestellt]. Nach der Reinigung durch Präzipitation mit Dioxan (1 bis 4fache Menge) wurde das aktivierte Oligosaccharid im Vakuum getrocknet und auf seinen Gehalt an N-Hydroxysucciniminoester analysiert. HspR65 und hspR70 in einer Menge von 5 mg/ml 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7 wurden anschließend mit einem 300fachen molaren Überschuß von aktiviertem Oligosaccharid umgesetzt. Die jeweils erhaltenen Glycokonjugate wurden von den nichtumgesetzten Oligosacchariden durch Chromatographie abgetrennt, filtriert und bei 4ºC aufbewahrt. Das Verhältnis ihres Gehalts an Sialinsäure zum prozentualen Gehalt von Sialinsäure im MenC-Polysaccharid-Ausgangsmaterial gibt die Menge des Kupplungs- Oligosaccharids wieder. Der Proteingehalt der Präparation wurde durch das Verfahren von Lowry "J. Biol. Chem."193 (1951), 265, bestätigt. Insbesondere hat das Konjugat mit hspR70 einen Proteingehalt von 310 µg/ml und einen Saccharidgehalt von 76 µg/ml, während das Konjugat mit hspR65 einen Proteingehalt von 180 µg/ml und einen Saccharidgehalt von 97 µg/ml aufwies.

5.5. Mäuse und Immunisierung

Weibliche BALB/c (H-2d)-, C567BL/6 (H-2b)- und CBA/J (H-2k)-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden in Zuchteinrichtungen der Erfinder gezüchtet.
Die Ausgangspaare wurden von Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME., und die thymuslosen BALB/c-nu/nu-Mäuse von Iffa Credo, L'Arbresle, Frankreich, erhalten.
Am Tag 0 erhielt jede Maus intraperitoneal 10&sup6; CFU BCG (oder PBS bei der Kontrollgruppe), worauf 2 Dosen Konjugat an den Tagen 14 und 35 (in PBS) folgten.
Die Kontrollgruppen erhielten das MenC-Oligosaccharid allein oder den an Aluminiumhydroxid (1 mg/Dosis, in 0,5 ml) adsorbierten MenC-Oligosaccharid - CRM197-Konjugat-Impfstoff. Bei jeder Immunisierung erhielten die Mäuse 2 µg MenC- Oligosaccharid, das 8,7 µg MenC-Oligosaccharid - CRM197-Konjugatimpfstoff, 8,4 µg MenC-Oligosaccharid - hspR70-Konjugat oder 3,7 µg MenC-Oligosaccharid - hspR65- Konjugat entsprach.

5.6. Bestimmung der Antikörper durch das ELISA-Verfahren

Jede Woche wurde Blut aus dem retro-orbitalen Plexus der Maus entnommen, und die Antikörper wurden durch einen ELISA titriert.
Zur Bestimmung der anti-MenC-IgG-Antikörper wurden die flachbödigen Platten mit 96 Vertiefungen mit dem MenC-Polysaccharid (5 µg/ml) (Nunc Immunoplate 1, Nunc, Roskilde, Dänemark) in PBS bei einem pH-Wert von 7,4 durch Inkubation über Nacht bei 37ºC beschichtet. Nach wiederholtem Waschen mit 0,05% Tween-20 (PBS-T) enthaltendem PBS und einer einstündigen Inkubation bei 37ºC mit 200 µl 5 % FCS enthaltendem PBS-T wurden die Vertiefungen über Nacht bei 4ºC mit 100 µl Mausserum, das in 5 % FCS enthaltendem PBS-T verdünnt war, ihkubiert. Nach wiederholtem Waschen wurden die Platten erneut 3 Stunden bei 37ºC mit 100 µl einer geeigneten Verdünnung eines mit Peroxidase konjugiertem anti-Maus IgG-anti-Serum ihkubiert.
Die Gegenwart von spezifischen Antikörpern wurde durch Zugabe von 2,2'- Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolinsulfonsäure) (ABTS; Kirkegaard and Pery Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) als Substrat gezeigt. Die Ergebnisse wurden als Absorption bei 414 nm gemessen. Serumproben mit einer Absorption von weniger als 0,2 bei der ersten getesteten Verdünnung (1:50) wurden als negativ angesehen.

5.7. Wirkung der Träger hspR65 und hspR70. die mit Oligosaccharid koniugiert sind

Die hspR65- und hspR70-MenC-Oligosaccharidkonjugate wurden zur Immunisierung von BALB/C- und C57BL/6-Mäusen, die zuvor mit BCG sensibilisiert oder nicht sensibilisiert wurden, verwendet.
Als Kontrolle erhielten Gruppen von Mäusen nur Menc oder den CRM 197- MenC-Konjugatimpfstoff in Aluminiumhydroxid.
Figur 1 zeigt, daß die anti-MenC-Polysaccharid-IgG-Antikörper nach der Immunisierung mit hsp-MenC-Konjugaten in Mengen produziert wurden, die mit den bei Verwendung von CRM 197-MenC-Konjugatimpfstoff in Aluminiumhydroxid gemessenen Mengen vergleichbar oder größer waren (C57BL/6 in Figur 1A). Diese Wirküng wurde nicht nur in Abwesenheit eines Adjuvans, sondern auch beim hspR70- MenC-Konjugat in Abwesenheit einer Sensibilisierung mit BCG (Figur 1B) beobachtet. Diese Ergebnisse ermöglichen die Feststellung, daß die Immunisierung auch mit Oligosaccharidantigenen unter Verwendung von mycobakteriellem hsp in Abwesenheit von Adjuvantien und ohne eine Sensibilisierung mit BCG erreicht werden kann. Es bestätigte sich daher, daß die hsp-Moleküle, besonders hspR70, als Träger auch in nicht mit BCG sensibilisierten Mäusen eine starke Wirkung haben und daß hsp als ein potenter Träger von Molekülen, die gegen das transportierte Polysaccharid spezifische IgG- Antikörper induzieren können, selbst in Abwesenheit der Adjuvantien wirkt.
Diese potente Trägerwirkung des mycobakteriellen hsp, die in Abwesenheit von Adjuvanzien und ohne Präsensibilisierung vorhanden ist, macht die beschriebenen Konjugate für die Entwicklung von neuen Impfstoffen gegen bakterielle Infektionen besonders nützlich.

6. Beispiel 2

Ein neues H. pylori-Hitzeschockprotein wurde identifiziert und unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren produziert.

6.1. Materialien und Verfahren

6.1.1. H. pylori-Stämme und Wachstumsbedingungen

Die folgenden H. pylori-Stämme wurden verwendet: CCUG 17874, G39 und G33 bei Biopsien (aus dem Magen im Krankenhaus von Grosseto, Italien, isoliert), Pylo 2U+ und Pyb 2U- (von F. Megraud, Krankenhaus Pellegzin, Bordeaux, Frankreich, bereitgestellt) und BA96 (an der Universität von Siena, Italien, bei Biopsien aus dem Magen isoliert). Der Stamm Pyb 2U+ ist nicht-cytotoxisch; der Stamm Pyb 2U- ist nicht-cytotoxisch und Urease-negativ. Alle Stämme wurden routinemäßig auf Columbia- Agar, der 0,2% Cyclodextrin, 5 µg/ml Cefsulodin und 5 µg/ml Amphotericin B enthielt, unter mikroaerophilen Bedingungen 5 bis 6 Tage bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und mit PBS gewaschen. Die Pellets wurden in Laemmli- Probenpuffer resuspendiert und durch Kochen lysiert.
Seren von an Gastritis und Geschwüren leidenden Patienten (von A. Ponzetto, Krankenhaus "Le Molinette", Torino, Italien, bereitgestellt) und Seren von Patienten mit Magenkarzinomen (von F. Roviello, Universität von Siena, Italien, bereitgestellt) wurden verwendet.

6.1.2. Durchmusterung der Bank durch immunologischen Verfahren

500 000 Plaques einer λgt11-H. pylori-DNA-Expressionsbank wurden mit 5 ml einer Suspension des E. coli-Stamms Y1090 vermischt, der über Nacht in LB mit 0,2% Maltose und 10 mM MgSO&sub4; gezüchtet und in 10 mM MgSO&sub4; mit einer OD von 0,5 resuspendiert wurde. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37ºC wurden 75 ml geschmolzene Topagarose in das Bakterien/Phagen-Gemisch gegossen und das Ganze auf BBL-Platten plattiert (50 000 Plaques/Platte). Nach einer 3,5-stündigen Inkubation der plattierten Bank bei 42ºC wurden zuvor mit 10 mM IPTG angefeuchtete Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) auf die Platten aufgebracht und die Inkubation 3,5 Std. bei 37ºC und anschließend über Nacht bei 4ºC fortgesetzt. Abgezogene Filter mit Lambda-Proteinen wurden in PBS gespült und 20' (Minuten) mit 5% fettfreier getrockneter Milch, die in TBST (10 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl und 5 M MgCl&sub2;) gelöst war, gesättigt. Der erste Hybridisierungsschritt wurde mit den Seren der Patienten durchgeführt; zur Entwicklung und Sichtbarmachung von positiven Plaques wurde ein anti-Mensch-Ig-Antikörper-alkalische Phosphatase- Konjugat (Cappel, West Chester, PA) und der NBT/BCIP-Kit (Promega, Madison, WI) in AP-Puffer (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl und 5 mM MgCl&sub2;) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet.

6.1.3. DNA-Rekombinationsverfahren

Die verwendeten Reagenzien und Restriktionsenzyme waren von Sigma (St. Leuis, MO) und Boehringer (Mannheim, Deutschland). Standardverfahren wurden zur molekularen Clonierung, Reinigung von einzelsträngiger DNA, Transformation in E. coli, radioaktiven Markierung der Sonden, Durchmusterung der Kolonien der DNA- Genombank von H. pylori, Southern-Blot-Analyse, PAGE und Western-Blot-Analyse verwendet.

6.1.4. DNA-Sequenzanalyse

Die DNA-Fragmente wurden in Bluescript SK+ (Stratagene, San Diego, CA) subcloniert. Die Sequenzierung der einzelsträngigen DNA wurde unter Verwendung von [³³P]αdATP (NEW England Nuclear, Boston, MA) und des Sequenase-Kits (U. S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Sequenz wurde in beiden Strängen bestimmt und jeder Strang im Durchschnitt zweimal sequenziert. Die Computer-Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des GCG-Packets durchgeführt.

6.1.5. Rekombinante Proteine

MS2-Polymerase-Fusionsproteine wurden unter Verwendung des Vektors pEX34A, einem Derivat von pEX3 1, produziert. Die Insertion Hp67 (von Nucleotid 445 bis Nucleotid 1402 in Fig. 3) und die EcoRI-Linker wurden im Leserahmen in die EcoRI-Stelle des Vektors doniert. Zur Bestätigung der Lage des Stopcodons wurde das HpG3'-HindIII-Fragment im Leserahmen in die HindIII-Stelle von pEX34A doniert. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli K12 H1 Δtrp transformiert. In beiden Fällen wurde nach der Induktion ein Fusionsprotein vom erwarteten Molekulargewicht produziert. Im Fall des EcoRI/EcoRI-Fragments wurde das nach der Induktion erhaltene Fusionsprotein elektroeluiert, um Kaninchen unter Verwendung von Standardprotokollen zu immunisieren.

6.2. Ergebnisse

6.2.1. Durehmusterung einer Expressionsbank und Clonierung von H. pylori- hsp

Zum Auffmden eines Serums, das zur Durchmusterung einer H. pylori-DNA- Expressionsbank geeignet ist, wurden Ultraschall-behandelte Extrakte des H. pylori- Stamms CCUG 17874 in einer Western-Blot-Analyse gegen Seren von an verschiedenen Formen von Gastritis leidenden Patienten getestet. Das Muster der Antigenerkennung durch unterschiedliche Seren war variabel, wahrscheinlich aufgrund von Unterschieden in der individuellen Immunantwort sowie der Unterschiede in den Antigenen, die durch die an der Infektion beteiligten Stämme exprimiert werden.
Serum Nr. 19 wurde zur Durchmusterung einer λgt11-H. pylori-DNA- Expressionsbank zur Identifizierung von H. pylori-spezifischen Antigenen, die in vivo während des Bakterienwachstums exprimiert wurden, selektiert. Nach der Durchmusterung der Bank mit diesem Serum wurden viele positive Clone isoliert und charakterisiert. Die Nucleotidsequenz eines dieser Clone mit der Bezeichnung Hp67 zeigte einen offenen Leserahmen von 958 Basenpaaren, der ein Protein mit hoher Homologie für die hsp60-Familie von Hitzeschockproteinen codiert (Ellis, Nature 358 (1992), 191-92). Zum Erhalt des vollständigen codierenden Bereichs wurde das Fragment Hp67 als Sonde bei einer Southern-Blot-Analyse von mit verschiedenen Rcstriktionsenzymen gespaltener H. pylori-DNA verwendet. Die Sonde Hp67 erkannte zwei HindII-Banden von etwa 800 bzw. 1 000 Basenpaaren. Eine genomische H. py- Iori-Bank von HindIII-gespaltener DNA wurde mit der Sonde Hp67 durchmustert, und zwei positive Clone (HpG5' und HpG3') vom erwarteten Molekulargewicht wurden erhalten. E. coli mit den Plasmiden pHp60G2 (etwa die Nucleotide 1 bis 829) und pHp60G5 (etwa die Nucleotide 824 bis 1838) wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt.

6.3. Sequenzanalyse

Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte einen offenen Leserahmen von 1638 Baenpaaren mit einer angenommenen Ribosomenbindungsstelle 6 Basenpaare stromaufwärts des Starteodons. Fig. 3 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des H. pylori-hsp. Die angenommene Ribosomenbindungsstelle und die interne HindIII-Stelle siiid unterstrichen. Cytosin in Position 445 und Guanin in Position 1402 sind das erste bzw. das letzte Nucleotid des Fragments Hp67. Thymin 1772 wurde als das letzte angenommene Nucleotid, das transkribiert wird, identifiziert, wobei ein Algorithmus zur Lokalisierung von Faktor-unabhängigen Terminatorbereichen verwendet wurde. Der offene Leserahmen codierte ein Protein von 546 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 58,3 kD und einem vorhergesagten pI von 5,37. Die Codon- Präferenz dieses Gens stimmt mit der H. pylori-Codon-Verwendung überein.
Die Analyse der Hydrophilitätsprofile zeigte ein stark hydrophiles Protein ohne ein vorhergesagtes Leaderpeptid oder andere Transmembrandomänen. Die aminoterminale Sequenz zeigte eine 100% Homologie zu der Sequenz von 30 Aminosäuren, die von Dunn et al., Infect. Immun. 60 (1992), 1946-51, im gereinigten Protein ermittelt wurde, und unterschied sich nur durch eine Stelle (Ser42 anstelle von Lys) von der Sequenz von 44 Aminosäuren, die von Evans et al., Infect. Immun. 60 (1992), 2125- 27, beschrieben wurde (Evans et al., (1992)). Die N-terminale Sequenz des reifen hsp- Proteins enthielt kein Startmethionin, was anzeigt, daß dieses nach der Translation entfernt wurde.

6.4. Homologie mit der hsp60-Familie

Die Aminosäuresequenzanalyse zeigte eine sehr starke Homologie zur Familie der hsp60-Hitzeschockproteine, deren Mitglieder in jedem lebenden Organismus vorhanden sind. Auf der Basis des Grads an Homologie zwischen hsp60-Proteinen von unterschiedlichen Arten gehört H. pylori-hsp zur Untergruppe von hsp60-Proteinen von gram-negativen Bakterien; der Grad der Homologie zu anderen Proteinen der hsp60- Familie ist jedoch sehr hoch (mindestens 54% Identität).
Die Homologie des H. pylori-hsp zu anderen Hitzeschockproteinen ist in Figur 2 vollständig exemplarisch dargestellt. Das II. pylori-hsp oder eine oder mehrere funktionelle immunstimulierende Domänen davon können mit einem Oligosaccharid oder Polysaccharid unter Verwendung der Verfahren des vorstehenden Beispiels 1 zur Produktion der erfindungsgemäßen Konjugatverbindungen konjugiert werden.

6.5. Expression von rekombinanten Proteinen und Produktion eines polydonalen Antiserums

Die Insertionen von Clon Hp67 und Clon HpG3' wurden in den Expressionsvektor pEX34A subcloniert, um diese an den Aminoterminus der MS2- Polymerase fusionierte offene Leserahmen zu exprimieren. Die Clone produzierten rekombinante Proteine der erwarteten Größe und wurden durch für die anfängliche Durchmusterung verwendetes menschliches Serum erkannt. Das von Clon Hp67 stammende fusionierte Protein wurde elektroeluiert und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet, um anti-hsp-spezifische polydonale Antiseren zu erhalten. Das erhaltene Antiserum erkannte beide Fusionsproteine und ein Protein von 58 kD in Gesamtzellextrakten von mehreren getesteten Stämmen von H. pylori, die einen Ureasenegativen Stamm und nicht-cytotoxische Stämme einschlossen.
Es wurde gezeigt, daß hsp von allen getesteten H. pylori-Stämmen exprimiert wurde und seine Expression nicht mit der Gegenwart der Urease oder mit der Cytotoxizität zusammenhängt. Das vom anti-hsp-Antiserum erkannte Protein wurde in wasserlöslichen Extrakten von H. pylori gefunden und zusammen mit den Urease Untereinheiten gereinigt. Dies legt den Schluß nahe, daß dieses Protein mit der äußeren bakteriellen Membran schwach assoziiert ist. hsp kann daher als Urease-assozuert und oberflächenexponiert beschrieben werden. Die Lage auf der Zelloberfläche ist überraschend, da die meisten hsp-homologen Proteine im Cytoplasma oder in den Mitochondrien und Plastiden liegen. Die Abwesenheit eines Leaderpeptids in hsp legt den Schluß nahe, daß es entweder durch ein bestimmtes Exportsystem zur Membran exportiert wird oder daß das Protein aus dem Cytoplasma freigesetzt und nach dem Tod des Bakteriums durch die bakterielle Membran passiv adsorbiert wird.

7. Hinterlegung von biologischen Materialien

Die nachstehend beschriebenen Materialien wurden am 15. Dezember 1992 und 22. Januar 1993 durch Biocine Sclavo, S.p.A., dem Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung, bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Tel. (301) 231-5519, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck des Patentverfahrens hinterlegt.
ATCC-Nr. 69155 E. coli TG1 enthaltend das Plasmid pHp60G2
ATCC-Nr. 69156 E. coli TG1 enthaltend das Plasmid pHp605
Diese Hinterlegungen werden zur Erleichterung der Arbeit des Fachmanns bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, daß eine Hinterlegung unter 35 U.S.C. §112 oder irgendeiner gleichlautenden Bestimmung in einem der hier genannten Staaten erforderlich ist. Die Nucleinsäuresequenzen dieser Hinterlegungen sowie die Aminosäuresequenzen der von ihnen codierten Polypeptide sind hier unter Bezugnahme eingeschlossen, und es muß sich bei Auftreten eines Fehlers in den hier beschriebenen Sequenzen im Vergleich mit den Sequenzen der Hinterlegungen darauf bezogen werden. Eine Lizenz kann erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, und eine solche Lizenz wird hier nicht gewährt.

Claims

1. Konjugatverbindung, die mindestens ein Hitzeschockprotein oder einen Teil davon umfaßt, enthaltend mindestens eine immunstimulierende Domäne und mindestens ein Oligosaachand oder Polysaccharid.

2. Konjugatverbindung nach Anspruch 1, umfassend Oligosaacharide der Meningococcus C (Men C)-Gruppe und ein Hitzeschockprotein.

3. Konjugatverbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Hitzeschockprotein das 65kDa hsp vom BCG GroEL-Typ aus M. bovis (hspR65), das rekombinante 70kDA hsp vom Dnak- Typ aus M. tuberculosis (hspR70) oder ein Hitzeschockprotein aus H. pylori ist.

4. Verfahren zur Herstellurig von Konjugatverbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das die kovalente Bindung eines Hitzeschockproteins oder eines Teils davon, enthaltend mindestens eine immunstimulierende Domäne, an mindestens ein Oligosaccharid oder Polysaccharid umfaßt.

5. Konjugatverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als pharmazeutisch wirksame Verbindung.

6. Verwendung einer Konjugatverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Impfung gegen eine bakterielle Infektion.

7. Impfstoff oder Arzneimittel, enthaltend eine oder meh-

rere Konjugatverbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

8. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes, wobei man eine oder mehrere Konjugatverbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger formuliert.