CN102481349B - 抗革兰氏阳性细菌疫苗中的Cna_B结构域 - Google Patents

Abstract

本发明提供可用于疫苗组合物中以诱导抵御革兰氏阳性细菌，特别是无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌和马链球菌的保护作用的保护性抗原。

Description

抗革兰氏阳性细菌疫苗中的Cna_B结构域

本申请要求2009年1月12日提交的US 61/143,859的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

发明领域

本发明涉及免疫学和疫苗学领域。具体地说，本发明涉及衍生自革兰氏阳性细菌的抗原及其在免疫中的应用。

发明背景

革兰氏阳性细菌包括最具毒力的人和动物病原体中的一些，它们导致许多严重的疾病和随之的后遗症。暴露于不断需要有效的疫苗来抵御革兰氏阳性细菌感染。

附图简述

图1A.与侧接结构域(″Fb信号″)克隆在一起的酿脓链球菌(S.pyogenes)蛋白Cpa_M18(Spy_M18_0126)的Cna_B结构域(″Cna_B-Fb″)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。图1B.所克隆结构域的图示。参见实施例1。

图2.含有纯化的重组His-标记的Cna_B-Fb结构域的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。参见实施例1。

图3A-D.证明酿脓链球菌Cpa_M18(Spy_M18_0126)Cna_B-Fb结构域是免疫原性的和Cna_B-Fb结构域抗血清识别酿脓链球菌各种M菌株的Cpa和F2(MGAS2O96_Spy0119)蛋白质(图3A-C)以及无乳链球菌(S.agalactiae)(图3C-D)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)(图3D)的菌毛组分的蛋白质印迹。参见实施例1。

图4A-B.比较Cna_B-Fb抗血清(图4A)与Cpa_M18抗血清(图4B)的反应性的蛋白质印迹。参见实施例1。

图5.图示了利用重组Cna_B-Fb产生的抗血清(参见实施例1)和分化HL-60细胞进行无乳链球菌菌株515和JM的调理吞噬试验结果。参见实施例2。

图6.图示了无乳链球菌突变型菌株R13(缺乏菌毛岛2)及其含有酿脓链球菌菌毛M1或酿脓链球菌菌毛M6的互补菌株的调理吞噬试验结果。参见实施例2。

图7.各种酿脓链球菌菌株的Cpa蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Cna_B_Cpa_M5_Manfredo(Spy_M5_0104；SEQ ID NO：18)，SEQ IDNO：2；Cna_B_Cpa_M28(M28_Spy0107，SEQ ID NO：19)，SEQ ID NO：3；Cna_B_Cpa_M12(MGAS2096_Spy0113，SEQ ID NO：20)，SEQ ID NO：4；Cna_B_Cpa_M1(M5005_Spy_0107，SEQ ID NO：21)，SEQ ID NO：5；Cna_B_Cpa_M3(SpyM3_0098，SEQ ID NO：22)，SEQ ID NO：6；Cna_B_Cpa_M18(spyM18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQ ID NO：7；Cna_B_Cpa_M6(M6_SpyO159，SEQ ID NO：24)，SEQ ID NO：8；Cna_B_Cpa_M4_C(MGAS10750_Spy0115，SEQ ID NO：25)，SEQ ID NO：9；Cna_B_Cpa_M2(MGAS 10270_Spy0113，SEQ ID NO：26)，SEQ ID NO：10。

图8.各种无乳链球菌的菌毛蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Cna_B_GBS_52(SAG 0646，SEQ ID NO：45)，SEQ ID NO：27；Cna_B_GBS_150(SAL 1482，SEQ ID NO：26)，SEQ ID NO：28；Cna_B_GBS_104_1(SAG 0649，SEQ ID NO：47)，SEQ ID NO：29；Cna_B_GBS_67(SAL 1487，SEQ ID NO：48)，SEQ ID NO：30；Cna_B_GBS_1523(SAN 1518，SEQ ID NO：49)，SEQ ID NO：31；Cna_B_GBS_1524(SAN 1519，SEQ ID NO：50)，SEQ ID NO：32；Cna_B_GBS_80(SAG 0645，SEQ ID NO：51)，SEQ ID NO：33；Cna_B_GBS_104_2(SAG 0649，SEQ ID NO：47)，SEQ ID NO：34；和Cna_B_GBS_1521(SAN 1516，SEQ ID NO：52)，SEQ ID NO：35。

图9.GBS岛1菌毛组分与菌株M18的酿脓链球菌Cpa蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Cna_B_GBS_80(SAG 0645，SEQ ID NO：51)，SEQ IDNO：33；Cna_B_GBS_52(SAG 0646，SEQ ID NO：45)，SEQ ID NO：27；Cna_B_GBS_104_2(SAG 0649，SEQ ID NO：47)，SEQ ID NO：34；Cna_B_GBS_104_1(SAG 0649，SEQ ID NO：47)，SEQ ID NO：29；和Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQ ID NO：7。

图10.GBS岛2菌毛组分与菌株M18的酿脓链球菌Cpa蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQ ID NO：7；Cna_B_GBS_150(SAL 1482，SEQ ID NO：46)，SEQ ID NO：28；Cna_B_GBS_67(SAL 1487，SEQ ID NO：48)，SEQ ID NO：30；和Cna_B_GBS_59(SAL 1486，SEQ ID NO：102)，SEQ ID NO：103。

图11.GBS岛3菌毛组分与菌株M18的酿脓链球菌Cpa蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQ ID NO：7；Cna_B_GBS_1524(SAN 1519，SEQ ID NO：50)，SEQ IDNO：32；和Cna_B_GBS_1523(SAN 1518，SEQ ID NO：49)，SEQ ID NO：31。

图12.肺炎链球菌菌毛TIGR4组分与菌株M18的酿脓链球菌Cpa蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ IDNO：23)，SEQ ID NO：7；RrgB(SP 0463，SEQ ID NO：63)，SEQ ID NO：53；RrgA1(SP 0462，SEQ ID NO：64)，SEQ ID NO：54；RrgC2(SP 0464，SEQ IDNO：65)，SEQ ID NO：56；RrgA2(SP 0462，SEQ ID NO：64)，SEQ ID NO：57；和RrgC1(SP 0464，SEQ ID NO：65)，SEQ ID NO：58。

图13.包含Cna_B结构域的金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白与菌株M18的酿脓链球菌Cpa蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列比对。Ser-Asp rich(富含)2(SdrD MW0517，SEQ ID NO：72)，SEQ ID NO：66；Ser-Asp rich3(SdrDMW0517，SEQ ID NO：72)，SEQ ID NO：67；CBP(MW2612，SEQ ID NO：73)，SEQ ID NO：68；和Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQID NO：7。

图14.证明Cna_B抗血清识别猪链球菌(S.suis)重组蛋白的蛋白质印迹。Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQ ID NO：14；Cna_B_Bkb3(DUF 11)89/1591(SEQ ID NO：83)，SEQ ID NO：75：Cna_BBbk1 SSU05_0474 05AYH33(SEQ ID NO：82)，SEQ ID NO：76。

图15.证明Cna_B抗血清识别马链球菌(S.suis)重组蛋白的蛋白质印迹。Cna_B_CPA_M18(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)，SEQ ID NO：14；BKBSEQ0936(SEQ ID NO：88)，SEQ ID NO：77；辅助蛋白SEQ 0935(SEQ IDNO：87)，SEQ ID NO：78。

图16.酿脓链球菌Cpa蛋白(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)的Cna_B结构域(SEQ ID NO：7)与两种猪链球菌蛋白的Cna_B结构域的比对。Cna_B自转运蛋白(Cna_B_AUTOTRANSPORTER)(SEQ ID NO：82)，SEQ IDNO：80；Cna_B_(SEQ ID NO：83)，SEQ ID NO：81。

图17.酿脓链球菌Cpa蛋白(Spy_M18_0126，SEQ ID NO：23)的Cna_B结构域(SEQ ID NO：7)与两种马链球菌蛋白的Cna_B结构域的比对。Cna_Bbkb(SEQ ID NO：88)，SEQ ID NO：86；Cna_B ap1(SEQ ID NO：87)，SEQ IDNO：84；Cna_B_ap2(SEQ ID NO：87)，SEQ ID NO：85。

图18.GAS Cna_B血清与所选GBS菌株的FACS分析。

图19.图示了实施例4所述的ELISA试验的结果。

图20.蛋白质印迹证明抗Cna_B结构域抗原的抗血清识别GBS蛋白质提取中的GBS菌毛。″α-GAS_Cna_B_M18″是用Cna_B-Fb-M18免疫的小鼠的抗血清，如实施例1所述。

图21.该图证明在GAS皮下感染模型中，用Cna_B结构域抗原免疫的小鼠显示皮肤病损面积减小。参见实施例6。

图22.该图证明用金黄色葡萄球菌攻击时，Cna_B结构域抗原免疫的小鼠显示鼻咽定殖率(colonization rate)降低。参见实施例7。

图23.该图证明用金黄色葡萄球菌攻击时，Cna_B结构域抗原免疫的小鼠显示鼻咽定殖率降低。参见实施例9。

图24.该图证明用嵌合型Cna_B结构域抗原免疫时，用嵌合型Cna_B结构域抗原免疫的母鼠产下的小鼠的存活率高于对照。参见实施例1。

图25.该图证明在GAS皮下感染模型中，用嵌合型Cna_B结构域抗原免疫的小鼠显示皮肤病损面积减小。参见实施例6。

图26A-B.金黄色葡萄球菌金黄色亚种NCTC8325的SdrD蛋白的图示和氨基酸序列(SEQ ID NO：132)(图26A)；同一Cna_B结构域抗原的图示及其氨基酸序列(SEQ ID NO：132)，标出了Cna_B结构域(图26B)。

图27A-C.Cna_B结构域的克隆、表达和纯化。图27A，SdrD的克隆Cna_B结构域(SEQ ID NOS：134-138)的图示。图27B，克隆的结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：133)。图27C，含有纯化的Cna_B结构域的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。

图28.图示了小鼠模型中，Cna_B_SdrD赋予抵御金黄色葡萄球菌菌株USA300感染的保护作用。

发明详述

“Cna_B结构域”首先在金黄色葡萄球菌胶原-结合表面蛋白中描述为不介导胶原结合的区域。重复B-区域的结构构成β夹心结构。据认为，该区域形成将配体结合域呈递远离细菌细胞表面的金黄色葡萄球菌胶原结合蛋白中的茎。含有Cna_B结构域的蛋白存在于各种革兰氏阳性病原性细菌中，包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌(GBS)、酿脓链球菌(GAS)、马链球菌、猪链球菌、产气荚膜梭菌(C.perifringens)、单核细胞增多性李司特菌(L.monocytogenes)、苏芸金芽胞杆菌(B.thuringiensis)、没食子酸居泥杆菌(P.acidigallici)、屎肠球菌(E.faceium)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、粪肠球菌(E.faecalis)、艰难梭菌(C.difficile)、白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)、格氏链球菌(S.gordonii)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、和破伤风梭菌(C.tetani)。

如以下具体实例所述，酿脓链球菌Cpa蛋白(Spy_M18_0126，SEQ IDNO：23)的Cna_B结构域(SEQ ID NO：7)是免疫原性的。用其产生的特异性抗体识别酿脓链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、猪链球菌和马链球菌的重组蛋白。GAS_Cpa_M18蛋白血清中所含约一半的抗体是Cna_B结构域特异性的，用菌株M18的酿脓链球菌Cpa蛋白的Cna_B结构域产生的抗血清(“抗-Cna_B结构域”)在蛋白质印迹中检测到用完整蛋白(″GAS_M18_cpa″)产生的抗血清检测不到并介导无乳链球菌的吞噬细胞杀伤作用的蛋白质。Spy_M18_0126的Cna_B结构域还在GBS-攻击小鼠中介导主动保护作用。因此，优选用链球菌Cna_B结构域或其它革兰氏阳性细菌蛋白(例如，金黄色葡萄球菌)的Cna_B结构域产生抗体。

本发明提供可用于疫苗组合物中以诱导抵御革兰氏阳性细菌，特别是金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌(GBS)、酿脓链球菌(GAS)、马链球菌和猪链球菌中一种或多种的保护作用的Cna_B结构域抗原。本发明还提供利用Cna_B结构域抗原诱导抗体和治疗或保护免遭革兰氏阳性细菌感染的方法，包括各种链球菌和/或葡萄球菌种类之间的交叉保护作用。

Cna_B结构域

任何革兰氏阳性细菌蛋白的Cna_B结构域可用于本发明的组合物和方法。各种金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、猪链球菌和马链球菌蛋白的Cna_B结构域的氨基酸序列示于图7-13、16和17，并在序列表中显示为SEQ ID NO：2-10、27-35、53-57、66、67、75、76、80、81、84-86、110-117、122-126和134-138。含有Cna_B结构域的其它蛋白质的例子示于SEQ ID NO：89-102和132。Cna_B结构域通常含有图7-16所示一条或多条序列作为“G盒”。图7-13所示G盒的共有序列氨基酸序列示于SEQ ID NO：74。

变体

在一些实施方式中，本发明Cna_B结构域的变体具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2-10、27-35、53-57、66、67、75、76、80、81、84-86、110-117、122-126和134-138中任一条有至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、或至少99％相同。Cna_B结构域的氨基酸序列与Cna_B结构域变体的氨基酸序列之间的任何差异通常是一个或多个保守性氨基酸取代所致(通常是1、2、3、4、5、6、7或8个取代)。然而，氨基酸缺失或插入也可能。

在一些实施方式中，保守性氨基酸取代基于化学性质，包括用一个带正电荷的氨基酸取代另一个带正电荷的氨基酸(例如，H、K、R)、用一个带负电荷的氨基酸取代另一个带负电荷的氨基酸(例如，D、E)、用一个疏水性很高的氨基酸取代另一个疏水性很高的氨基酸(例如，C、F、I、L、M、V、W)、用一个疏水性较低的氨基酸取代另一个疏水性较低的氨基酸(例如，A、G、H、P、S、T、Y)、用一个部分疏水性的氨基酸取代另一个部分疏水性的氨基酸(例如，K、R)、用一个脂族氨基酸取代另一个脂族氨基酸(例如，A、I、L、M、P、V)、用一个极性氨基酸取代另一个极性氨基酸(例如，A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、Y)、用一个芳族氨基酸取代另一个芳族氨基酸(例如，F、H、W、Y)以及用一个小氨基酸取代另一个小氨基酸(例如，D、N、T)。

在一些实施方式中，采用BLOSUM62表确定保守性氨基酸取代。所述BLOSUM62表是从蛋白质序列区段的约2000个局部多次比对得到的氨基酸取代矩阵，显示超过500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1992)。BLOSUM62取代频率可用于确定可引入Cna_B结构域的氨基酸序列的保守性氨基酸取代。在这些实施方式中，保守性取代优选指由大于-1的BLOSUM62值代表的取代。例如，如果氨基酸取代的特征为BLOSUM62值为0、1、2或3，则所述氨基酸取代是保守的。根据该系统，优选的保守性氨基酸取代的特征为BLOSUM62值至少为1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征为BLOSUM62值至少为2(例如，2或3)。

可通过比对图7-13中所示Cna_B结构域来鉴定具体氨基酸取代或改变。包括此类选择的任何组合在内的Cna_B结构域抗原(下述的)属于本发明的范围。

Cna_B结构域抗原

“Cna_B结构域抗原”包含一个或多个上述Cna_B结构域，还可在N末端、C末端或两端包含或不包含额外的氨基酸。在一些实施方式中，Cna_B结构域抗原由SEQ ID NO：1、10、27、-35、53、-57、66、-68、75、76、80、81、84、-86、110、-117、122、-126、133和-138中任一条构成。在其它实施方式中，Cna_B结构域抗原包含Cna_B结构域以及天然细菌(例如，链球菌或葡萄球菌)蛋白中不与Cna_B结构域直接毗邻的其它氨基酸序列。即，在此类抗原中，Cna_B结构域的N末端氨基酸的氨基不经肽键与天然细菌(例如，链球菌或葡萄球菌)蛋白中其所连的氨基酸的羧基相连和/或Cna_B结构域的C末端氨基酸的羧基不经肽键与天然革兰氏阳性细菌蛋白，例如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌(GBS)、酿脓链球菌(GAS)、马链球菌或猪链球菌的蛋白中其所连的氨基酸的氨基相连。“天然”革兰氏阳性细菌蛋白是在革兰氏阳性细菌中发现它们天然存在的蛋白；“天然”链球菌或葡萄球菌蛋白是在链球菌或葡萄球菌中分别发现它们天然存在的蛋白。

在还有其它实施方式中，Cna_B结构域抗原由Cna_B结构域以及该结构域的N和/或C末端的额外氨基酸构成，只要Cna_B结构域抗原不由全长细菌(例如，链球菌或葡萄球菌)蛋白构成(参见表1-32)。

在其它实施方式中，Cna_B结构域抗原由下式所示多肽构成：

A(LB)_n

式中A是第一Cna_B结构域；B是第二Cna_B结构域；n是整数(通常是1-10；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；L独立为不存在或是氨基酸接头。此类抗原中的Cna_B结构域可以相同、不同或一些相同而一些不同的Cna_B结构域的混合物(即，所有的Cna_B结构域可以不同或者两种或更多种Cna_B结构域可以相同)。例如，Cna_B结构域可以是两种或更多种不同革兰氏阳性蛋白，特别是革兰氏阳性球菌蛋白，例如链球菌蛋白、葡萄球菌蛋白或两种或更多种类或菌株(例如，无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌和/或马链球菌)的蛋白的结构域。

如果任何Cna_B结构域之间存在氨基酸接头，其通常含有6-12个氨基酸(例如，6、7、8、9、10、11或12个)。GSGGGG(SEQ ID NO：79)是有用接头的例子。Cna_B结构域抗原中的接头可以相同或不同。

式A(LB)_n所示Cna_B结构域抗原的例子包括含有SEQ ID NO：108或由其构成的蛋白质。从N到C末端，SEQ ID NO：108包含SAG 0645的Cna_B结构域(SEQ ID NO：112)、氨基酸序列VDS、第一氨基酸接头(SEQ ID NO：79)、SAN 1518的Cna_B结构域(SEQ ID NO：113)、第二氨基酸接头(SEQID NO：79)、SAL 1487的第一Cna_B结构域(SEQ ID NO：110)、氨基酸序列NSG、SAL 1487的第二Cna_B结构域(SEQ ID NO：111)和氨基酸KQI。

式A(LB)_n所示Cna_B结构域抗原的其它例子包括含有SEQ ID NO：109或由其构成的蛋白质。从N到C末端，SEQ ID NO：109包含SAG 0645的Cna_B结构域(SEQ ID NO：112)、氨基酸序列VDS、第一氨基酸接头(SEQID NO：79)、SAN 1518的Cna_B结构域(SEQ ID NO：113)、第二氨基酸接头(SEQ ID NO：79)、SAL 1486的第一Cna_B结构域(SEQ ID NO：114)、氨基酸序列LPL、SAL 1486的第二Cna_B结构域(SEQ ID NO：115)和氨基酸DIE。

式A(LB)_n所示Cna_B结构域抗原的其它例子包括含有以下序列或由其构成的蛋白质：SEQ ID NO：127、128、129、130、131、133、134、135、136、137或138；参见实施例8和10。

在上述Cna_B结构域抗原中，包含氨基酸序列VDS、NSG、KQI、LPL和DIE，从而不截短β折叠片。本领域普通技术人员熟知本发明Cna_B结构域抗原中可包含其它此类氨基酸序列以帮助保留Cna_B结构域的三级结构。

式A(LB)_n所示Cna_B结构域抗原的其它例子包含：

a.酿脓链球菌Spy_M18_0126(例如，SEQ ID NO：7)和M6_Spy0159)(例如，SEQ ID NO：8)及MGAS2O96_Spy0119(例如，SEQ ID NO：121)的Cna_B结构域；这些包括含有SEQ ID NO：121的5个Cna_B结构域(SEQID NO：122-126)的融合体的Cna_B结构域抗原。Spy0159的Cna_B结构域的编码序列示于SEQ ID NO：120。Spy0119的编码序列示于SEQ ID NO：119。SEQ ID NO：121的核苷酸181-390、1576-1797、1915-2127、2281-2496和2716-2916分别编码SEQ ID NO：122-126所示的Cna_B结构域。

b.金黄色葡萄球菌SdrD(例如，SEQ ID NO：134-138；SEQ ID NO：66和/或67；SEQ ID NO：139)和Cna_B_cap(例如，SEQ ID NO：68)的Cna_B结构域。

c.肺炎链球菌SP 0463)(例如，SEQ ID NO：53)、Cna_B_RrgA(SP 0462)(例如，SEQ ID NO：54和/或56)和Cna_B_RrgC(SP 0464)(例如，SEQ IDNO：55和/或57)的Cna_B结构域。

d.Spy_M18_0126(例如，SEQ ID NO：7)、SAG 0645(SEQ ID NO：33)、RrgB(SP 0463)(例如，SEQ ID NO：53)和SdrD(例如，SEQ ID NO：134-138；SEQ ID NO：66和/或67；SEQ ID NO：139)的Cna_B结构域。

本发明的Cna_B结构域抗原还可包含上述任何Cna_B结构域抗原。在这些实施方式的一些中，Cna_B结构域的N末端氨基酸的氨基不经肽键与天然细菌(例如，链球菌或葡萄球菌)蛋白中其所连的氨基酸的羧基相连和/或Cna_B结构域的C末端氨基酸的羧基不经肽键与天然细菌(例如，链球菌或葡萄球菌)蛋白中其所连的氨基酸的氨基相连。

在一些实施方式中，一个或多个本发明的Cna_B结构域抗原是包含另一细菌抗原，优选另一细菌(例如，链球菌或葡萄球菌)抗原的融合多肽的一部分。例如，WO 99/05447、WO 02/034771、WO 04/018646、WO 05/028618、WO 05/032482、WO 06/042027和WO 06/078318中公开了合适的抗原。

包含一个或多个Cna_B结构域和其它结构域，例如von Willenbrand因子A(vWFA)结构域(例如，SEQ ID NO：105、106、107)的融合多肽也属于本发明的范围，例如：

a.Spy_M18_0126)的Cna_B结构域(例如，SEQ ID NO：7)和vWFA_cpa_M6(M6_Spy0159)(例如，SEQ ID NO：105)；和

b.SAG 0645的Cna_B结构域(例如，SEQ ID NO：33)和vWFA_SAL_1487(例如，SEQ ID NO：106)。

此类融合多肽可在各种融合伴侣和/或各融合伴侣的侧接序列之间包含接头序列，可从下表1-37和43-48公开的那些中选择。

核酸分子

本发明包括编码本发明Cna_B结构域抗原的核酸分子。本发明还包括含有与此类分子有至少95％序列相同性的核苷酸序列的核酸分子。根据特定的序列，序列相同性程度优选至少95％、96％、97％、98％或99％。优选通过MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性检索算法，利用仿射空位检索测定核苷酸序列之间的相同性，其中参数为空位开放罚分＝12、空位延伸罚分＝1。

本发明还提供可与这些分子杂交的核酸分子。可以在不同严谨性条件下进行杂交反应。本领域知晓并公开了增加杂交反应严谨性的条件。参见，例如Sambrook等.，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，1989的第7.52页。相关条件的例子包括(严谨性增加的顺序)：温育温度25℃、37℃、50℃、55℃和68℃；缓冲液浓度10x SSC、6x SSC、1x SSC、0.1x SSC(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其它缓冲液体系的等同条件；甲酰胺浓度0％、25％、50％和75％；温育时间5分钟-24小时；1个、2个或多个洗涤步骤；洗涤温育时间1、2或15分钟；洗涤溶液6x SSC、1x SSC、0.1x SSC或去离子水。杂交技术及其优化是本领域熟知的。参见，例如Sambrook，1989；Ausubel等编.，《分子生物学简便方法》(Short Protocols in Molecular Biology).第4版.，1999；美国专利5,707,829；Ausubel等编.，《最新分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology).增补30，1987。

在一些实施方式中，本发明核酸分子在低严谨性条件下与靶标杂交；在其它实施方式中，本发明核酸分子在中等严谨性条件下杂交；在优选的实施方式中，本发明核酸分子在高严谨性条件下杂交。低严谨性杂交条件的例子是50℃和10X SSC。中等严谨性杂交条件的例子是55℃和1X SSC。高严谨性杂交条件的例子是68℃和0.1X SSC。

产生Cna_B结构域抗原

重组生产

遗传密码的冗余性众所周知。因此，编码本发明Cna_B结构域抗原的任何核酸分子(多核苷酸)均可用来重组产生该蛋白质。编码含Cna_B结构域的蛋白的核酸分子可采用标准核酸纯化技术从合适的细菌(例如，链球菌或葡萄球菌细菌)分离，或可采用扩增技术，如聚合酶链反应(PCR)或利用自动合成仪合成。参见，Caruthers等.，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215 223，1980；Horn等.Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225 232，1980；Hunkapiller等.，Nature 310，105-11，1984；Grantham等.，Nucleic Acids Res.9，r43-r74，1981。

可采用标准分子生物学技术，以mRNA为模板制备cDNA分子。之后可采用本领域熟知的分子生物学技术复制cDNA分子。可利用基因组DNA或cDNA为模板，采用扩增技术，如PCR来获得额外拷贝的本发明多核苷酸。

如果需要，可采用本领域通常所知方法工程改造多核苷酸，从而为各种原因改变编码序列，包括但不限于：改进克隆、加工和/或多肽或mRNA产物表达的改变。可通过随机断裂和基因片段的PCR重装配及合成寡核苷酸，采用DNA改组来工程改造核苷酸序列。例如，可采用定点诱变插入新的限制性位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好、产生剪接变体、引入突变等。

核酸分子可包含N-末端前导序列(包含Cna_B的天然蛋白质的N-末端前导序列或所选的另一N-末端前导序列)的编码序列。在一些实施方式中，可采用序列修饰，如加入纯化标记序列或密码子优化来促进表达。例如，所表达的蛋白可包含标签，例如聚组氨酸(HIS)或谷胱甘肽S-转移酶(GST)。可利用此类标记促进表达蛋白的纯化、检测和稳定性。可选择特定原核或真核宿主偏好的密码子以提高蛋白质表达率或产生具有所需特性的RNA转录物，例如半衰期长于天然序列产生的转录物的半衰期。这些方法是本领域熟知的，WO05/032582中有描述。

表达载体

可将编码Cna_B结构域抗原的核酸分子插入含有所插入编码序列转录和翻译必需元件的表达载体。可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有编码序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。

宿主细胞

产生Cna_B结构域抗原的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。大肠杆菌是优选的宿主细胞，但其它合适的宿主包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、枯草芽胞杆菌、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseriacinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞等。

可选择宿主细胞株调节所插入序列表达或以所需方式加工表达多肽的能力。多肽的此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。也可采用切割多肽的“前体”形式的翻译后加工以促进正确的插入、折叠和/或功能。可从美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC；弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号，20110-2209)获取具有特定细胞机器或翻译后活性的特征性机制的不同宿主细胞，可对其进行选择以确保外源蛋白质的正确修饰和加工。参见WO01/98340。

可采用公知技术将表达构建物引入宿主细胞，所述技术包括但不限于：运铁蛋白-聚阳离子介导的DNA转移、用裸露或包封核酸转染、脂质体介导的细胞融合、DNA包被胶乳珠的胞内转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、“基因枪”法和DEAE或磷酸钙介导的转染。

可在适合表达和从细胞培养物回收蛋白的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞。根据所用的核苷酸序列和/或表达载体，转化细胞产生的蛋白可分泌出或包含于胞内。本领域技术人员应理解，可将表达载体设计为包含指导可溶性多肽通过原核或真核细胞膜分泌的信号序列。

纯化

信号输出序列可包含于重组产生的Cna_B结构域抗原中，从而可采用已知方法从细胞培养基中纯化所述抗原。或者，可采用本领域熟知的方法从工程改造的宿主细胞分离重组产生的本发明Cna_B结构域抗原，并将其与细胞中的其它组分如蛋白质、碳水化合物或脂质分离。此类方法包括但不限于：尺寸排阻色谱、硫酸铵分级、离子交换色谱、亲和色谱和制备型凝胶电泳。纯化Cna_B结构域抗原的制品的纯度为至少80％，优选所述制品的纯度为90％、95％或99％。可通过本领域已知的任何手段如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来评估所述制品的纯度。如果合适，可用例如脲增溶Cna_B结构域抗原。

化学合成

可采用，例如固相技术合成Cna_B结构域抗原。参见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149 54，1963；Roberge等，Science 269，202 04，1995。可采用人工技术或自动化方法进行蛋白质合成。可采用例如应用生物系统431A肽合成仪(帕金埃尔默公司(Perkin Elmer))来实现自动化合成。任选可分别合成Cna_B结构域抗原的诸部分，并采用化学方法组合以产生完整的分子。

药物组合物

本发明提供用作药物的组合物。本发明药物组合物可用于产生针对革兰氏阳性细菌，特别是链球菌或葡萄球菌细菌(例如，无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌和/或金黄色葡萄球菌)的免疫应答。在一些实施方式中，所述组合物可用于治疗链球菌和/或葡萄球菌感染以及降低此类感染的风险。

本发明药物组合物包含至少一种活性剂，其可以是本文公开的Cna_B结构域抗原或编码该Cna_B结构域抗原的核酸分子。疾病可以是，例如菌血症、脑膜炎、产褥热、猩红热、丹毒、咽炎、脓疱病、坏死性筋膜炎、肌炎或中毒性休克综合征。

含有Cna_B结构域抗原或编码Cna_B结构域抗原的核酸分子的组合物优选免疫原性组合物，更优选疫苗组合物。本发明的药物组合物可以是预防性或治疗性的，单通常是预防性的。如果药物组合物降低革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染的风险或减轻革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染的严重程度或革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染的症状，其是预防性的。因此，本发明包括治疗性或预防性治疗革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染的方法。可治疗动物，优选哺乳动物，最优选人。所述方法包括给予所述动物治疗或预防用量的本发明免疫原性组合物。

此类组合物的pH通常为6-8，优选约7。可用缓冲液来维持pH。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。所述组合物与人组织(例如，血液)等渗。

一些本发明组合物包含本文所述的一种或多种Cna_B结构域抗原。其它本发明组合物包含编码抗原的一种或多种核酸分子和可包含在该组合物中的其它任选抗原(参见下文)。参见，例如Robinson和Torres(1997)Seminarsin Immunology 9：271-283；Donnelly等，(1997)Ann.Rev Immunol15：617-648；Scott-Taylor和Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs9：471-480；Apostolopoulos和Plebanski(2000)Curr Opin MoI Ther 2：441-447；Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1：116-120；Dubensky等.(2000)Mol Med6：723-732；Robinson和Pertmer(2000)Adv Virus Res 55：1-74；Donnelly等.(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2)：S190-193；Davis(1999)Mt.Sinai J.Med.66：84-90。所述核酸分子通常为DNA分子，例如质粒形式。在一些实施方式中，本发明组合物可包含一种或多种Cna_B结构域抗原和一种或多种核酸分子。

其它活性剂

在一些实施方式中，本发明组合物可包含一种或多种其它活性试剂。此类试剂包括但不限于：(a)本发明的Cna_B结构域抗原，(b)可用于儿科疫苗的多肽抗原，(c)可用于老年人或免疫受损个体的疫苗的多肽抗原，(d)编码(a)-(c)的核酸分子和以下定义的GBS多糖抗原。

抗体

可利用革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)蛋白的Cna_B结构域产生抗体，优选保护性抗体。本文所用的“抗体”包括但不限于：完整的免疫球蛋白分子及其能结合Cna_B结构域的片段。因此，“抗体”可包括单克隆抗体、杂合(嵌合)抗体分子(例如，Winter等，Nature 349，293-99，1991；美国专利4,816,567)；F(ab′)2和F(ab)片段以及Fv分子；非共价异源二聚体(例如，Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，2659-62，1972；Ehrlich等，Biochem 19，4091-96，1980)；单链Fv分子(sFv)(例如，Huston等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，5897-83，1988)；二聚和三聚抗体片段构建物；小体(minibody)(例如，Pack等，Biochem 31，1579-84，1992；Cumber等，J.Immunology 149B，120-26，1992)；人源化抗体分子(例如，Riechmann等，Nature 332，323-27，1988；Verhoeyan等，Science 239，1534-36，1988；和于1994年9月21日公开的英国专利申请公开第GB 2,276,169号)；和从这些分子获得的任何功能片段，以及通过非常规方法如噬菌体展示获得的抗体。

如果用于免疫化学试验时抗体提供的检测信号比其它蛋白质提供的检测信号高至少5、10或20倍，则所述抗体与本发明Cna_B结构域“特异性结合”。特异性结合Cna_B结构域的抗体优选能从溶液中免疫沉淀Cna_B结构域抗原。在一些实施方式中，特异性结合Cna_B结构域的抗体诱导至少30％(例如，30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)的GBS菌株515的调理吞噬作用。

其它抗原

本发明组合物可与一种或多种其它抗原联合给药以便用于本发明的治疗或预防方法。合适的抗原包括以下列出的那些。此外，本发明的组合物可用来治疗或预防任何下列病原体引起的感染。除与下述抗原联用外，本发明组合物还可与本文所述的佐剂组合。

GBS多糖抗原

在一些实施方式中，本发明组合物包含GBS多糖抗原。无乳链球菌GBS碳水化合物通常的特征是含L-吡喃型鼠李糖(Rhap)主链的分支结构，其由交替的α-(1→2)和α-(1→3)键和与交替的鼠李糖环作β-(1→3)-连接的D-N-乙酰葡糖胺(GlcpNAc)残基构成(Kreis等，Int.J.Biol.Macromol.17，117-30，1995)。可用于本发明组合物的GBS多糖抗原具有下式：

式中R是末端还原L-鼠李糖或D-GlcpNAc，n是约3到约30的数字。

本发明所用的GBS多糖抗原可以是天然发现的基本全长的GBS碳水化合物，或其可短于天然长度。可解聚全长多糖以得到本发明所用的较短片段，例如，在温和酸中水解、作加热、尺寸层析等。然而，优选采用基本全长的糖。具体而言，优选采用分子量为约10kDa的糖。可通过凝胶过滤测定相对于葡聚糖标准品的分子量。

可相对于天然发现的GBS碳水化合物所述糖进行化学修饰。例如，可对所述糖进行去-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等。可通过常规试验评价去乙酰化等，例如对免疫原性的影响。

在一些实施方式中，所述GBS多糖抗原与载体，如突变的白喉毒素CRM197和下述其它载体偶联。

用于本发明的抗原包括但不限于：一种或多种以下列出的抗原，或衍生自一种或多种以下列出的病原体的抗原：

A.细菌抗原

适用于本发明的细菌抗原包括可从细菌分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多糖和外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。细菌抗原可通过重组表达产生。细菌抗原优选包括在细菌生命周期的至少一个阶段中暴露于细菌表面的表位。细菌抗原优选在多种血清型之间具有保守性。细菌抗原包括衍生自一种或多种下述细菌的抗原以及以下鉴定的特定抗原例子。

奈瑟脑膜炎球菌(Neisseria meningitides)：脑膜炎抗原可包括纯化的或衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清型，如A、C、W135、Y和/或B的蛋白质(如参考文献1-7所鉴定的那些)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(参考文献8、9、10、11)。可从粘附蛋白、自转运蛋白(autotransporter)、毒素、Fe获取蛋白和膜缔合蛋白(优选外膜整合蛋白)中选择脑膜炎蛋白抗原。

肺炎链球菌：肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。可选用血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的糖抗原。可选用WO 98/18931、WO 98/18930、美国专利号6,699,703、美国专利号6,800,744、WO 97/43303和WO 97/37026所鉴定蛋白质的蛋白抗原。肺炎链球菌蛋白可选自聚组氨酸三聚体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133。

酿脓链球菌(A群链球菌)：A群链球菌抗原可包括WO 02/34771或WO 2005/032582鉴定的蛋白质(包括GAS40)、融合的GAS M蛋白片段(包括WO 02/094851和Dale，Vaccine(1999)17；193-2000及Dale Vaccine14(10)：944-948中描述的那些)、纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)、链球菌亚铁血红素缔合蛋白(Shp)和链球菌溶血素S(SagA)。

粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：粘膜炎莫拉菌抗原包括WO02/18595和WO 99/58562鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。

百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：百日咳抗原包括百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日咳杆菌粘附素和/或凝集原2和3联用。

金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌抗原包括5和8型金黄色葡萄球菌包膜多糖，任选偶联于无毒的重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A，如Staph VAX^TM，或表面蛋白衍生的抗原、侵袭素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)、能抑制吞噬细胞吞噬的表面因子(荚膜、A蛋白)、类胡萝卜素、过氧化氢酶产物、A蛋白、凝固酶、凝固因子和/或能溶解真核细胞膜的膜损伤毒素(任选脱毒的)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)。

表皮葡萄球菌：表皮葡萄球菌抗原包括粘质结合抗原(SAA)。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作载体蛋白与本发明组合物结合/偶联。

白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素，优选脱毒的，如CRM197。此外考虑将能调节、抑制ADP核糖基化或与之结合的抗原与本发明组合物联用/共同给药/偶联，所述白喉类毒素可用作运载体蛋白。

流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenzae B)(Hib)：Hib抗原包括Hib糖抗原。

铜绿假单胞菌：铜绿假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz蛋白、铜绿假单胞菌LPS，更具体说是分离自PAO1(O5血清型)的LPS和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)(Infect Immun.2001，May；69(5)：3510-3515)。

嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)：细菌抗原可衍生自嗜肺军团菌。

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)：B群链球菌抗原包括WO 02/34771、WO 03/093306、WO 04/041157或WO 2005/002619鉴定的蛋白或糖抗原(包括蛋白GBS80、GBS104、GBS276和GBS322以及包括血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII和VIII产生的糖抗原)。

淋病奈瑟菌(Neiserria gonorrhoeae)：淋病抗原包括Por(或膜通道蛋白)蛋白，如PorB(参见Zhu等.，Vaccine(2004)22：660-669)、转移结合蛋白如TbpA和TbpB(参见Price等.，Infection and immunity(2004)71(1)：277-283)、混浊蛋白(如Opa)、还原可修饰蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(参见Plante等.，JInfectious Disease(2000)182：848-855)，也参见例如WO 99/24578、WO99/36544、WO 99/57280、WO 02/0792430。

砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：砂眼衣原体抗原包括血清型A、B、Ba和C产生的抗原(砂眼致病因子，导致失明)、血清型L1、L2和L3产生的抗原(与性病性淋巴肉芽肿(Lymphogranuloma venereum)有关)和血清型D-K产生的抗原。砂眼衣原体抗原还可包括WO 00/37494、WO 03/049762、WO 03/068811或WO 05/002619鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-样(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosA(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。

苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)：梅毒抗原包括TmpA抗原。

杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(导致软性下疳)：杜克雷嗜血杆菌抗原包括外膜蛋白(DsrA)。

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)：抗原包括三糖重复序列或美国专利号6,756,361提供的其它肠球菌衍生抗原。

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。

腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)：抗原包括腐生葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)：抗原包括LPS(InfectImmun.2002，八月；70(8)：4414)。

大肠杆菌(E.coli)：大肠杆菌抗原可以是肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散性附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠溶血性大肠杆菌(EHEC)产生的抗原。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)：炭疽杆菌抗原任选是脱毒的，可选自A-组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者具有称为保护性抗原(PA)的共同B-组分。

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原(Infect Immun.，2003年1月；71(1)：374-383)，LPS(Infect Immun.1999年10月；67(10)：5395)，鼠疫耶尔森菌V抗原(Infect Immun.1997年11月；65(11)：4476-4482)。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)：结核抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任选配制在阳离子脂质载体中(Infect Immun.2004年10月；72(10)：6148)，结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(Proc Natl Acad Sci USA.2004年8月24日；101(34)：12652)，和/或MPT51抗原(Infect Immun.2004年7月；72(7)：3829)。

立克次体(Rickettsia)：抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(Biochim Biophys Acta.2004年11月1日；1702(2)：145)，LPS和表面蛋白抗原(SPA)(J Autoimmun.1989年6月；2增刊：81)。

单核细胞增多症李斯特菌(Listeria monocytogenes)：细菌抗原可衍生自单核细胞增多性李斯特菌。

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：抗原包括WO 02/02606鉴定的那些。

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)：抗原包括蛋白酶抗原、LPS、特别是霍乱弧菌II的脂多糖、O1 Inaba O-特异性多糖、霍乱弧菌O139、IEM108疫苗的抗原(Infect Immun.2003年10月；71(10)：5498-504)和/或紧密连接毒素(Zot)。

伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒热)：抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，即，vax-TyVi)。

博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相关蛋白(Erps)、核心蛋白多糖结合蛋白(如DbpA)和抗原性可变的VI蛋白，如与P39和P13结合的蛋白(一种膜内在蛋白，Infect Immun.2001年5月；69(5)：3323-3334)、VLsE抗原可变异蛋白(J Clin Microbiol.1999年12月；37(12)：3997)。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)：抗原包括牙龈卟啉单孢菌外膜蛋白(OMP)。

克雷伯菌(Klebsiella)：抗原包括OMP，包括OMP A，或任选与破伤风类毒素偶联的多糖。

本发明组合物中可用的其它细菌抗原可以是任何上述的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白抗原。其它细菌抗原还可包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括活的、减毒的和/或纯化的任何上述细菌。本发明的抗原可以衍生自革兰氏-阴性或革兰氏-阳性细菌。抗原可以衍生自需氧或厌氧细菌。

此外，任何上述细菌来源的糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)可与另一种试剂或抗原，如载体蛋白(如CRM197)偶联。此类偶联可以是通过还原胺化糖上的羰基部分而实现与蛋白质上的氨基直接偶联，参见美国专利号5,360,897和Can.，J Biochem Cell Biol.1984 May；62(5)：270-5。或者，糖可以通过接头，如采用《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，1996和CRC，《蛋白质偶联与交联化学》(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)，1993中提供的琥珀酰胺或其它键偶联。

B.病毒抗原

适用于本发明的病毒抗原包括灭活(或杀伤的)病毒，减毒病毒，分离的病毒制剂、纯化的亚基制剂，可分离、纯化或衍生自病毒的病毒蛋白，以及病毒样颗粒(VLP)。病毒抗原可衍生自在细胞培养物或其它基质上增殖的病毒。或者，可重组表达病毒抗原。病毒抗原优选包含在病毒生命周期的至少一个阶段中暴露于病毒表面上的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物之间具有保守性。病毒抗原包括衍生自一种或多种下述病毒的抗原以及下面鉴定的特定抗原例子。

正粘病毒：病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙型流感(病毒)。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白质，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。优选的抗原包括HA和NA。

流感病毒抗原可以可衍生自流行病爆发间的(年度)流感毒株。或者，流感病毒抗原可以衍生自可能导致流行病爆发的毒株(即，与目前的流行毒株相比，具有新血凝素的流感毒株，或者在禽类对象中致病并可能平行传播至人群的流感毒株，或对人致病的流感毒株)。

副粘病毒科病毒：病毒抗原可以衍生自副粘病毒科病毒，如肺病毒属(RSV)、副粘病毒属(PIV)和麻疹病毒属(麻疹)。

肺病毒属：病毒抗原可以衍生自肺病毒属，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。优选的肺病毒是RSV。肺病毒抗原可选自以下一种或多种蛋白，包括表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)、基质蛋白M1和M2、核衣壳蛋白N、P和L及非结构蛋白NS1和NS2。优选的肺病毒抗原包括F、G和M。参见J Gen Virol.2004年11月；85(部分11)：3229。肺病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。

副粘病毒属：病毒抗原可衍生自副粘病毒属，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎病毒、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可以选自以下一种或多种蛋白：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。优选的副粘病毒属蛋白包括HN、F1和F2。副粘病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。可商品化购得的腮腺炎疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗联用(MMR)的减毒活腮腺炎病毒。

麻疹病毒属：病毒抗原可以衍生自麻疹病毒属如麻疹病毒。麻疹病毒属抗原可选自以下一种或多种蛋白：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。可商品化购得的麻疹病毒疫苗包括通常与腮腺炎和风疹病毒组成联合减毒活疫苗(MMR)。

微小RNA病毒：病毒抗原可衍生自微小RNA病毒，如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心病毒和口蹄疫病毒。优选衍生自肠病毒，如脊髓灰质炎病毒的抗原。

肠病毒：病毒抗原衍生自肠病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22型和24型柯萨奇A病毒、B1-6型柯萨奇病毒、1-9型、11-27型和29-34型艾柯病毒(ECHO)，及68-71型肠病毒。优选的肠病毒是脊髓灰质炎病毒。肠病毒抗原宜选自以下VP1、VP2、VP3和VP4衣壳蛋白的一种或多种。可商品化购得的脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。

嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自可以是嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。可商品化购得的HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。

披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选衍生自风疹病毒属，如风疹病毒的抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NAPO-2、NSP-3或NSP-4。优选的披膜病毒抗原是E1、E2或E3。可商品化购得的风疹病毒疫苗包括通常与腮腺炎和麻疹疫苗联用的冷适应的活病毒(MMR)。

黄病毒属：病毒抗原可衍生自黄病毒属，如蜱传脑炎(病毒)(TBE)、登革热(病毒)(1、2、3或4型)、黄热病(病毒)、日本脑炎(病毒)、西尼洛河脑炎(病毒)、圣露易斯脑炎(病毒)、俄罗斯春夏型脑炎(病毒)、波瓦桑脑炎病毒。黄病毒属抗原可选自：PrM、M、C、E、NS-1、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。优选的黄病毒属抗原是PrM、M和E。可商品化购得的TBE疫苗包括病毒灭活疫苗。

鼠疫病毒：病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、经典猪瘟病毒(CSFV)或边界病病毒(BDV)。

嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原选自：表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。可商品化购得的HBV疫苗包括含表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。

丙型肝炎病毒：病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自E1、E2、E1/E2、NS345糖蛋白、NS345-核心多蛋白和/或非结构区肽中的一种或多种(Houghton等.，Hepatology(1991)14：381)。

杆状病毒：病毒抗原可衍生自杆状病毒，如莱萨病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒抗原可选自：糖蛋白(G)、核蛋白(NP)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。可商品化购得的狂犬病毒疫苗包含在人二倍体细胞或恒河猴胎肺细胞上培养的杀伤病毒。

杯状病毒科：病毒抗原可衍生自杯状病毒科，如诺瓦克病毒，和诺瓦克样病毒如夏威夷病毒和雪山病毒。

冠状病毒：病毒抗原可衍生自冠状病毒，SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自：突刺(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和血凝素-脂酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原参见WO 04/92360中的描述。

逆转录病毒：病毒抗原可衍生自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可衍生自HTLV-1、HTLV-2和HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原选自：gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原可选自：gag(p24gag和p55gag)、env(gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微小蛋白(优选p55gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自以下病毒株：HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN、HIV-1CM235、HIV-1U54。

呼肠孤病毒：病毒抗原可衍生自呼肠孤病毒，如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自：结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3或非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。优选的呼肠孤病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒抗原可选自：VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)及VP7。

细小病毒：病毒抗原可衍生自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原可选自：VP-1、VP-2、NS-1和NS-2。优选的细小病毒抗原是衣壳蛋白VP-2。

δ-肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可以是衍生的HDV，特别是HDV的δ-抗原(参见例如美国专利号5,378,814)。

戊肝病毒(HEV)：病毒抗原可衍生自HEV。

庚肝病毒(HGV)：病毒抗原可衍生自HGV。

人疱疹病毒：病毒抗原可衍生自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自：立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原选自：糖蛋白gb、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、外被膜或包膜蛋白。可商品化购得VZV减毒活疫苗。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)和膜抗原(MA)的糖蛋白。CMA抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)和外被膜蛋白。

乳多空病毒：抗原可衍生自乳多空病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可选自：衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7或其融合蛋白。优选将HPV抗原配制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原选自VP1、VP2或VP3。

《疫苗》(Vaccines)，第四版，(Plotkin和Orenstein编，2004)；《医学微生物》(Medical Microbiology)，第四版，(Murray等编，2002)；《病毒学》(Virology)，第三版，(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学》(FundamentalVirology)，第二版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)也提供了其它抗原、组合物、方法和微生物，本发明的组合物包括这些抗原。

C.真菌抗原

用于本发明的真菌抗原可衍生自一种或多种下述真菌。

真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括：絮状表皮癣菌(Epidermophytonfloccusum)、头癣小孢子菌(Microsporum audouini)、犬小孢子菌(Microsporumdistortum)、扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)、马小孢子菌(Microsporumequinum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypsum)、矮小孢子菌(Microsporumnanum)、同心发癣菌(Trichophyton concentricum)、马发癣菌(Trichophytonequinum)、鸡发癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏样发癣菌(Trichophytongypseum)、麦格发癣菌(Trichophyton megnini)、须发癣菌(Trichophytonmentagrophytes)、昆克努发癣菌(Trichophyton quinckeanum)、红色发癣菌(Trichophyton rubrum)、舍恩莱发癣菌(Trichophyton schoenleini)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、疣状发癣菌album变种(var.album)、discoides变种(var.discoides)、ochraceum变种(var.ochraceum)、堇色发癣菌(Trichophyton violaceum)和/或蜜块状发癣菌(Trichophyton faviforme)。

真菌病原体可衍生自：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄麴菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽生裂殖酵母(Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、类星形念珠菌(Candida stellatoidea)、克鲁斯念珠菌、(Candidaparakwsei)、葡萄牙念珠菌(Candida lusitaniae)、假热带念珠(Candidapseudotropicalis)、吉利蒙德念珠菌(Candida guilliermondi)、卡里翁分支孢子菌(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、腐霉菌(Pythiumninsidiosum)、瓶形酵母(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉第酵母菌(Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克(氏)孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、马尼弗(氏)青霉菌(Penicillium marneffei)、鳞斑霉属(Malassezia spp.)、产色芽生菌属(Fonsecaea spp.)、万吉拉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、担子菌团属(Basidiobolusspp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉菌属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucorspp)、犁头霉属(Absidia spp)、被孢霉属(Mortierella spp)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp)、瓶霉属(Saksenaea spp)、链格孢属(Alternaria spp)、弯孢霉属(Curvularia spp)、长蠕孢属(Helminthosporium spp)、镰孢菌属(Fusarium spp)、曲霉菌属(Aspergillus spp)、青霉菌属(Penicillium spp)、褐腐病菌属(Monolinia spp)、丝核菌属(Rhizoctonia spp)、拟青霉属(Paecilomyces spp)、皮司霉属(Pithomyces spp)和分支孢子菌属(Cladosporium spp)。

本领域熟知产生真菌抗原的方法(参见美国专利第6,333,164号)。在优选的方法中，提取溶解组分，将其与真菌细胞的不可溶组分分开，其中基本上除去或至少部分除去了细胞壁，该方法的特征在于包括以下步骤：获得活的真菌细胞；获得基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；使基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞破裂；获得不可溶组分；和提取溶解的组分并将其与不可溶组分分开。

D.STD抗原

本发明组合物可包含衍生自性传播疾病(STD)的一种或多种抗原。此类抗原可供预防或治疗STD，例如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(特别是HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软下疳(参见WO00/15255)。抗原可衍生自一种或多种病毒或细菌性STD。用于本发明的病毒STD抗原可衍生自，例如HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)。用于本发明的细菌STD抗原可衍生自例如淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜克雷嗜血杆菌、大肠杆菌和无乳链球菌。以上描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

E.呼吸道抗原

本发明组合物可包含衍生自引起呼吸道疾病的病原体的一种或多种抗原。例如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒，如正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起呼吸道疾病的细菌，如肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、百日咳博德特菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。以上描述了衍生自这些病原体的特定抗原的例子。

F.儿科疫苗抗原

本发明组合物可包含适用于儿童对象的一种或多种抗原。儿童对象通常年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿童用抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中多次给药。儿童用抗原可衍生自可靶向儿童群体的病毒和/或儿童群体易受感染的病毒。儿童用病毒抗原包括衍生自正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和流行性腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠道病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)的一种或多种抗原。儿童用细菌抗原包括衍生自肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、铜绿假单胞菌、无乳链球菌(B群链球菌)和大肠杆菌的一种或多种抗原。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。

G.适用于老年人或免疫力低下个体的抗原

本发明的组合物可包含适合用于老年人和免疫力低下个体的一种或多种抗原。此类个体可能需要更经常接种疫苗，用较高剂量或含佐剂的制剂以增强对靶抗原的免疫反应。用于老年人和免疫力低下个体的抗原包括衍生自以下一种或多种病原体的抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团病杆菌、无乳链球菌(B群链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。

H.适用于青少年疫苗的抗原

本发明组合物可包含适用于青少年对象的一种或多种抗原。青少年可能需要用先前已给予的儿童用抗原作加强接种。以上描述了可能适用于青少年的儿童用抗原。此外，青少年是接受衍生自STD病原体抗原的目标人群，以保证在性行为开始之前产生保护性或治疗性免疫力。以上描述了可能适用于青少年的STD抗原。

I.抗原制剂

在本发明的其它方面，提供了产生已吸附抗原的微粒的方法。该方法包括：(a)分散含以下成分的混合物来提供乳液：(i)水，(ii)洗涤剂，(iii)有机溶剂和(iv)生物可降解的聚合物，所述聚合物选自：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。与有机溶剂相比，混合物中存在的所述聚合物浓度通常约1％-约30％，而根据洗涤剂-聚合物的重量比，混合物中存在的洗涤剂通常约为0.00001∶1-约0.1∶1(更常见是约0.0001∶1-约0.1∶1，约0.001∶1-约0.1∶1，或约0.005∶1-约0.1∶1)；(b)除去乳液中的有机溶剂；和(c)将抗原吸附到微粒表面。在某些实施方式中，与有机溶剂相比，所述生物可降解聚合物的存在浓度是约3％-约10％。

可以用可灭菌、无毒和生物可降解的材料制备本文所用的微粒。此类材料包括但不限于：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。本发明所用的微粒优选源自聚(α-羟酸)，特别是聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。微粒可源自分子量不同的任何聚合起始材料，以共聚物，例如PLG为例，各种丙交酯∶乙交酯的比例(其选择在很大程度上是个选择问题)部分取决于共同给予的大分子。下文将更详细地讨论这些参数。

其它抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制品。

美国专利6,884,435中提供了其它配制方法和抗原(尤其是肿瘤抗原)。

J.抗原参考文献

以下参考文献包括可与本发明组合物联用的抗原：

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以上所有引用的专利、专利申请和期刊论文的内容均如完全列于本文那样的通过引用纳入。

载体蛋白

当采用糖或碳水化合物抗原时，优选将其与载体蛋白偶联以增强免疫原性。参见Ramsay等(2001)Lancet 357(9251)：195-196；Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36；Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond34：163-168；Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am13：113-133，vii；Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567；欧洲专利0477 508；美国专利5,306,492；WO98/42721；Conjugate Vaccines(偶联物疫苗)(Cruse等编)ISBN 3805549326，特别是10：48-114；Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)ISBN：0123423368或012342335X。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。特别优选CRM197白喉类毒素。

其它载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽(EP-A-0378881和EP-A 0427347)、热休克蛋白(WO 93/17712和WO94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668和EP A 0471177)、流感嗜血杆菌的蛋白D(WO 00/56360)、细胞因子(WO 91/01146)、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO 00/61761)、摄铁蛋白(WO01/72337)等。在混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，可优选MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。不同的糖可与相同或不同类型的载体蛋白偶联。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。

如需要可脱毒有毒性的蛋白抗原，如用化学和/或遗传方法脱毒百日咳毒素。

药学上可接受的载体

除上述组分以外，本发明的组合物通常包含一种或多种“药学上可接受的载体”。这些包括本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生的任何载体。合适的载体通常是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这样的载体为本领域普通技术人员熟知。组合物还可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。可从Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice ofPharmacy(雷明顿：药物科学与实践)”第20版ISBN：0683306472一书中获得关于药学上可接受组分的全面论述。

免疫调节剂

佐剂

本发明的疫苗可与其它免疫调节剂联合给药。具体而言，组合物通常含有佐剂。用于本发明的佐剂包括但不限于一种或多种以下试剂：

A.含有矿物质的组合物

本发明中适合用作佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等(例如参见Powell和Newman主编的“疫苗设计(Vaccine Design...)”，第8和9章，ISBN：030644867X普莱纳姆出版社(Plenum.))或不同矿物质化合物的混合物(如磷酸盐与氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，这些盐优选(具有)吸附性。也可将含矿物质的组合物配制成金属盐颗粒(WO 00/23105)。

本发明的疫苗中可包含铝盐，使Al³⁺剂量为每剂0.2-1.0mg。

在一个实施方式中，用于本发明的基于铝的佐剂是明矾(硫酸钾铝(AlK(SO₄)₂))或明矾衍生物，通过在磷酸盐缓冲液中混合抗原与明矾原位形成，之后用碱，如氢氧化铵或氢氧化钠滴定和沉淀。

用于本发明疫苗制剂的另一种基于铝的佐剂是氢氧化铝佐剂(Al(OH)₃)，或结晶碱式氢氧化铝(AlOOH)，其为极佳的吸附剂，表面积约为500m²/g。或者提供磷酸铝佐剂(AlPO₄)或羟基磷酸铝，其包含磷酸根基团代替氢氧化铝佐剂的一些或所有羟基基团。本文提供的优选磷酸铝佐剂为无定形形式，并可溶于酸性、碱性和中性介质。

在另一实施方式中，本发明的佐剂同时包含磷酸铝和氢氧化铝。在一更具体的实施方式中，此佐剂的磷酸铝含量高于氢氧化铝，例如以重量计，磷酸铝与氢氧化铝之比为2∶1、3；1、4∶1、5；1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或高于9∶1。更具体说，该疫苗所含的铝盐为：每疫苗剂量0.4-1.0mg、或每疫苗剂量0.4-0.8mg、或每疫苗剂量0.5-0.7mg或每疫苗剂量约0.6mg。

通常，优选的基于铝的佐剂或多种基于铝的佐剂如磷酸铝和氢氧化铝的比例通过优化分子之间的静电吸引力进行选择，从而抗原在所需pH下携带与佐剂相反的电荷。例如，磷酸铝佐剂(等电点＝4)在pH 7.4时吸附溶菌酶，但不吸附清蛋白。如果清蛋白是吸附靶，则选择氢氧化铝佐剂(等电点为11.4)。或者用磷酸盐预处理氢氧化铝降低其等电点，使其成为碱性更大抗原的优选佐剂。

B.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油-乳剂包括角鲨烯-水乳剂，例如5％角鲨烯、0.5％聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯(聚山梨醇酯80，例如TWEEN80)，和0.5％失水山梨糖醇三油酸酯(例如，SPAN85)，例如MF59，用微流化器制成亚微米颗粒。参见WO90/14837。也参见Podda，Vaccine(2001)19：2673-2680；Frey等，Vaccine(2003)21：4234-4237。MF59用作FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗中的佐剂。

用于组合物的特别优选的佐剂是亚微米水包油乳液。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80^TM(聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)和/或0.25-1.0％司盘85^TM(失水山梨醇三油酸酯)和任选的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(国际公布号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325；和Ott等，“MF59-人用疫苗的一种安全而强效佐剂的设计与评估”(MF59--Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant forHuman Vaccines)()，刊于《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)，普莱纳姆出版社(Plenum Press)，纽约，1995，第277-296页)。MF59含有4-5％w/v角鲨烯(如4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温80^TM和0.5％司盘85^TM，并任选含有各种含量的MTP-PE，用微流化仪，例如110Y型微流化仪(微射流公司(Microfluidics)，牛顿市，马萨诸塞州)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量可以是约0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。本文所用的术语“MF59-0”指不含MTP-PE的以上亚微米水包油乳剂，而术语“MF59-MTP”表示含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”含有100μg MTP-PE/剂，等等。MF69是本文所用的另一种亚微米水包油乳剂，其含有4.3％w/v角鲨烯、0.25％w/v吐温80^TM和0.75％w/v司盘85^TM和任选的MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制剂，例如100-400μg MTP-PE/剂。

WO90/14837和美国专利6,299,884和6,451,325详细描述了用于所述组合物的亚微米水包油乳液、其制备方法和免疫刺激剂，如胞壁酰肽。

也可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用作本发明的佐剂。

C.皂苷制剂

皂苷制剂也适用作本发明佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologousgroup)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可商品化购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。

已利用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术专门纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540公开了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。

可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM一般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。EP0109942、WO96/11711和WO96/33739进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂。参见WO00/07621。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见Barr等，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：247-271。另参见sjolander等，Advanced Drug DeliveryReviews(1998)32：321-338。

D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也适用作本发明的佐剂。这些结构通常含有任选与磷脂混合或用磷脂配制的一种或多种病毒蛋白。它们通常无致病性、不能复制，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括源自以下的蛋白：流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。WO03/024480、WO03/024481；Niikura等，(2002)，Virology 293：273-280；Lenz等，(2001)，J.Immunol 166(9)：5246-5355；Pinto等，(2003)，J.Infect.Dis.188：327-338；和Gerber等，(2001)，J.Virol.75(10)：4752-4760进一步讨论了VLP。例如，Gluck等，(2002)，Vaccine 20：B10-B16进一步讨论了病毒体。鼻内三价INFLEXAL^TM产品(Mischler和Metcalfe，(2002)Vaccine20，增刊5：B17-23)和INFLUVAC PLUS^TM产品中使用免疫增强型重建流感病毒体(IRIV)作为亚单位抗原递送系统。

E.细菌和微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如：

(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物

这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP 0 689 454公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜无菌过滤(参见EP 0 689454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2273-2278。

(2)脂质A衍生物

脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于，例如Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491；和Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842。

(3)免疫刺激性寡核苷酸

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与随后的鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示出免疫刺激性。

CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链。可任选用类似物，例如2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。可能的类似物取代可参见Kandimalla等，(2003)，Nucleic Acids Research.31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923。Krieg，(2003)，Nat.Med.9(7)：831-835；McCluskie等，(2002)，FEMS Immunology and Medical Microbiology.32：179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。

CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions.31(部分3)：654-658。CpG序列，例如CpG-A ODN可特异性诱导Th1免疫应答，或者，例如CpG-BODN可更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等(2003)J.Immunol.170(8)：4061-4068；Krieg(2002)TRENDS in Immunol.23(2)：64-65；和WO 01/95935讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。

优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如Kandimalla等(2003)BBRC 306：948-953；Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions.31(部分3)：664-658；Bhagat等(2003)BBRC 300：853-861；和WO03/035836。

(4)ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物

细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(弧菌)(“CT”)或百日咳(杆菌)(“PT”)。WO95/17211描述了脱毒ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，WO98/42375描述了其作为胃肠外佐剂的应用。佐剂优选脱毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见以下参考文献：Beignon等，Infection and Immunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza等，Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，Infection andImmunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan等，Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos等，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni等，Vaccines(2003)2(2)：285-293和Pine等，(2002)J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸取代的数字基准优选以Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础。

F.生物粘附剂和粘膜粘附剂

生物粘附剂(bioadhesive)和粘膜粘附剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)J.Cont.Release.70：267-276)，或者粘膜粘附剂，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。参见WO99/27960。

G.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选用丙交酯-乙交酯共聚物形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。

H.脂质体

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于美国专利6,090,406；美国专利5,916,588和EP 0 626 169。

I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。此类制剂还包含联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。

优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。

J.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂描述于，例如Andrianov等，“Preparation of hydrogelmicrospheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions(通过凝聚聚磷腈水溶液制备水凝胶微球)”，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne等，“Protein Release from Polyphosphazene Matrices(聚磷腈基质的蛋白质释放)”，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196。

K.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。

L.咪唑并喹啉化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特(Imiquimod)及其类似物，其描述参见Stanley，Clin Exp Dermatol(2002)27(7)：571-577；Jones，Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2)：214-218和美国专利4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612。

M.缩氨基硫脲化合物

所有适合用作本发明佐剂的缩氨基硫脲化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合物的方法包括WO 04/60308所述的。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有效。

N.色胺酮化合物

所有适合用作本发明佐剂的色胺酮化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合物的方法包括WO 04/64759所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有效。

本发明还包括以上鉴定的一种或多种佐剂的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：

(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；

(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；

(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；

(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO98/57659)；

(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂混合物(参见欧洲专利申请0 835 318；0 735 898和0 761 231)；

(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化成亚微米乳剂或旋振(vortex)产生粒度较大的乳剂；

(7)RIBI^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi免疫化学公司(Ribi Immunochem))，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)组成的细菌细胞壁组分；和

(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)；

(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸序列)。

O.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

可注射的流感疫苗采用的优选佐剂是铝盐和MF59。粘膜递送疫苗，如鼻腔疫苗采用的优选佐剂是细菌毒素和生物粘附剂。

以上所有引用的专利、专利申请和期刊论文的内容均通过如完全列出的引用纳入本文。

治疗方法

本发明提供利用上述组合物诱导或增强对一种或多种革兰氏阳性(例如，链球菌和/或葡萄球菌)细菌(例如，无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌和/或金黄色葡萄球菌)的免疫反应的方法。本发明还提供上述组合物在诱导或增强对一种或多种革兰氏阳性(例如，链球菌和/或葡萄球菌)细菌(例如，无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌和/或金黄色葡萄球菌)的免疫反应中的应用。免疫反应优选为保护性，包括抗体和/或细胞介导免疫力(包括全身和粘膜免疫力)。免疫反应包括加强反应。

青少年和儿童，包括学步儿童和婴儿可接受预防用疫苗，而治疗疫苗通常给予青少年和成人。儿童疫苗也可给予成人，例如评估其安全性、剂量、免疫原性等。

本发明可预防或治疗的无乳链球菌所致疾病包括但不限于：新生儿脓毒症、脑膜炎和肺炎及妊娠妇女感染，例如剖腹产手术后在子宫、羊水中，在尿路中。

本发明可预防或治疗的肺炎链球菌所致疾病包括但不限于；肺炎、菌血症、中耳炎、脑膜炎、鼻窦炎、腹膜炎和关节炎。

本发明可预防或治疗的酿脓链球菌所致疾病包括但不限于：丹毒咽炎(例如，链球菌性扁桃体炎)、猩红热、脓疱病、蜂窝组织炎、败血症、坏死性筋膜炎、肌炎、中毒性休克综合征和后遗症，例如风湿热和急性肾小球肾炎。

本发明可预防或治疗的金黄色葡萄球菌所致疾病包括但不限于：较小的皮肤感染、脓疱病、疖、蜂窝组织炎、毛囊炎、疗疮、痈、皮肤烫伤综合征、脓肿、肺炎、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征和败血症。

本发明可预防或治疗的猪链球菌所致疾病包括但不限于：猪中的链球菌感染和接触猪或猪产品的人的脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎、关节炎和败血症性休克。

本发明可预防或治疗的马链球菌所致疾病包括但不限于：马、犬和驼患者(例如，马、驴、骡子、狗、骆驼和单峰骆驼)中的“腺疫”和转移性腺疫。

本发明可预防或治疗的乳房链球菌(S.uberis)所致疾病包括但不限于：牛的乳腺炎。

本发明可预防或治疗的停乳链球菌(S.dysgalactiae)所致疾病包括但不限于：例如马、牛和猪的乳腺炎。

本发明可预防或治疗的海豚链球菌(S.iniae)所致疾病包括但不限于：鱼的海豚链球菌感染和处理受感染的鱼期间皮肤损伤后的人侵入性感染。

检测免疫反应效果的试验

评价治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物之后监测细菌感染。评价预防性治疗的功效的一种方式包括在给予所述组合物之后监测针对本发明组合物中Cna_B结构域的免疫应答。

评价本发明免疫原性组合物中组分蛋白的免疫原性的另一种方式是重组产生Cna_B结构域并通过免疫印迹方法筛选患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者血清之间的阳性反应表明该患者已对所研究的蛋白质产生免疫应答，即所述蛋白质是免疫原。也可采用该方法鉴定优势免疫蛋白质和/或表位。

检测治疗性治疗的功效的另一种方式包括在给予本发明组合物之后监测感染。检测预防性治疗的功效的一种方式包括在给予所述组合物之后同时监测针对Cna_B结构域的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a产生水平)和粘膜免疫应答(如监测IgA产生水平)。通常在免疫后但攻击前测定血清特异性抗体应答，而在免疫后和攻击后测定粘膜特异性抗体应答。

本发明的疫苗组合物可在给予宿主例如人之前在体外和体内动物模型中进行评价。特别有用的小鼠模型包括腹膜内免疫之后进行腹膜内攻击或鼻内攻击的那些模型。

本发明免疫原性组合物的效力也可用革兰氏阳性(例如，葡萄球菌或链球菌)细菌体内攻击经该免疫原性组合物免疫的模型动物，如豚鼠或小鼠来测定。免疫原性组合物可源自或不源自与攻击血清型相同的血清型。

体内效力模型包括但不限于：(i)使用人革兰氏阳性(例如，链球菌和/或葡萄球菌)细菌血清型的鼠感染模型；(ii)鼠疾病模型，这是一种采用鼠适应性链球菌菌株，例如在小鼠中特别有毒力的酿脓链球菌的M23菌株的鼠模型；和(iii)利用人链球菌分离物的灵长类模型。以下实施例公开了其它体内模型。

所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答之一或两者兼有。免疫应答可以是改善的、或增强的、或改变的免疫应答。所述免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答之一或两者兼有。优选所述免疫应答为增强的全身和/或粘膜应答。

增强的全身和/或粘膜免疫力表现为增强的TH1和/或TH2免疫应答。增强的免疫应答优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA的产量升高。

粘膜免疫应答优选TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA产量增加。

活化的TH2细胞提高抗体产量，因此在应对胞外感染方面具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可导致产生IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞，用于将来的保护作用。

TH2免疫应答可包括与TH2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产量增加中的一种或多种现象。增强的TH2免疫应答优选包括IgG1产量增加。

TH1免疫应答可包括CTL中的一种或多种增加，与TH1免疫应答相关的一种或多种细胞因子(例如IL-2、IFNγ和TNFβ)的增加，活化的巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a产生增加。增强的TH1免疫应答优选包括IgG2a产量增加。

本发明的免疫原性组合物，具体说，含一种或多种本发明Cna_B结构域的免疫原性组合物可单用或与其它革兰氏阳性细菌抗原(例如，链球菌和/或葡萄球菌抗原)联用，任选与能引发Th1和/或Th2反应的免疫调节剂联用。

本发明还包括包含一种或多种免疫调节剂，例如矿物盐如铝盐，和含CpG基序的寡核苷酸的免疫原性组合物。更优选所述免疫原性组合物同时包含铝盐和含CpG基序的寡核苷酸。或者所述免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素，如去毒的ADP核糖基化毒素和含CpG基序的寡核苷酸。一种或多种免疫调节剂优选包括佐剂。所述佐剂可选自TH1佐剂和TH2佐剂中的一种或多种。

本发明的组合物优选同时引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答，以有效抵御革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染。该免疫应答优选诱导持久(如中和性)抗体和细胞介导的免疫力，可在接触一种或多种革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)抗原时迅速作出反应。

在一特别优选的实施方式中，该免疫原性组合物包含能引发中和抗体反应的一种或多种Cna_B结构域抗原，和能引发细胞介导免疫反应的一种或多种Cna_B结构域抗原。以此方法，中和抗体应答能防止或抑制最初的革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染，而细胞介导免疫反应能引发增强的Th1细胞反应以防止革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染进一步扩散。

本发明的组合物通常直接给予患者。本发明的组合物可经各种不同途径单独或作为组合物的一部分给药。对某些组合物可能宜采用某些途径，导致产生更有效的免疫应答，优选CMI应答，或引起副作用的可能性较低，或者更易于给药。

递送方法包括胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)和直肠、口服(例如，片剂或喷雾剂)、阴道、局部、透皮(例如参见WO 99/27961)、经皮(例如参见WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(例如参见WO03/028760)、眼部、耳部和肺部或其它粘膜给药。

例如，本发明的组合物可经全身途径或粘膜途径或透皮途径给药，或其可将其直接给予特定组织。本文所用的术语“全身给药”包括但不限于任何胃肠外给药途径。具体而言，胃肠外给药包括但不限于：皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌内或胸骨内注射，静脉内、动脉内或肾脏透析输注技术。所述全身性胃肠外给药优选为肌内注射。本文所用的术语“粘膜给药”包括但不限于口服、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠道和眼部给药。

剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径，如胃肠外初免和粘膜加强、粘膜初免和胃肠外加强等给予各剂量。

本发明组合物可以各种形式制备。例如，组合物可制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式(例如冻干组合物)。组合物可制备成口服给药制剂，如片剂或胶囊、喷雾剂或糖浆(任选调味)。组合物可制备成采用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓。可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如滴剂。组合物可采用试剂盒形式，设计成在给予患者之前即刻重建的组合物。此类试剂盒可包含一种或多种Cna_B结构域抗原或液体形式的其它抗原以及一种或多种冻干抗原。

用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的一种或多种Cna_B结构域抗原(或编码该抗原的核酸分子)以及需要的任何其它组分，如抗生素。“免疫有效量”指在以单剂量或一系列剂量中的一部分给予个体时可增强可测定免疫应答，或预防或减少临床症状的用量。

本发明的免疫原性组合物可与抗生素治疗方案联合给予。在一个实施方式中，给予抗生素然后给予本发明的一种或多种Cna_B结构域抗原(或编码该抗原的核酸分子)。

在另一实施方式中，在给予本发明Cna_B结构域抗原之后给予抗生素。适用于治疗链球菌感染的抗生素的例子包括但不限于：青霉素或其衍生物或氯林肯霉素、头孢菌素、糖肽(例如万古霉素)和环丝氨酸。

组合物中活性剂的量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类学组别(例如，非人灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。所述量会落入可通过常规试验确定的较宽范围。

试剂盒

本发明还提供装有一个或多个本发明组合物的容器的试剂盒。组合物可为液体形式或可为冻干形式，各抗原也可如此。组合物的合适容器包括例如，瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由各种材料，包括玻璃或塑料制成。容器可具有无菌存取口(例如，所述容器可以是具有用皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液包或小瓶)。

所述试剂盒还可装有包含药学上可接受的缓冲剂，例如磷酸缓冲盐水、林格溶液或右旋糖溶液的第二容器。其还可装有最终使用者可用的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、填充剂、针头和注射器。所述试剂盒还可装有包含另一活性剂，例如抗生素的第二或第三容器。

该试剂盒也可装有书面的包装插页，说明诱导抗链球菌细菌的免疫力或治疗革兰氏阳性细菌(例如，链球菌和/或葡萄球菌)感染的方法。该包装插页可以是未经批准的草稿插页或可以是经食品药物管理局(FDA)或其它管理当局批准的包装插页。

本文引用的所有专利、专利申请和参考文献专门通过引用纳入本文。以上公开内容已总体上描述了本发明。参考以下具体实施例可获得更全面的理解，提供实施例的目的只是说明而非限制本发明的范围。

实施例1

Cna_B结构域的免疫原性

将GAS蛋白Cpa_M18的Cna_B结构域与侧接结构域(Fb信号)一起克隆入PET21b载体。参见，图1A-B。利用活化的螯合琼脂糖速流柱纯化His-标记的重组蛋白。参见图2。

用重组Cna_B-Fb蛋白免疫10只CD1雌性小鼠三次，每次20μg，获得抗克隆的Cna_B-Fb结构域的抗血清。然后利用含Cna_B结构域的不同人病原体的各种纯化His-标记重组蛋白，通过蛋白质印迹实验探查Cna_B-Fb血清。图3A-D分别显示了测试结果。这些实验证明Cna_B结构域是免疫原性的，用其产生的抗血清识别无乳链球菌和肺炎链球菌的GAS_Cpa和F2蛋白以及菌毛部分，这些蛋白已报道为保护性抗原(Maione等.，2005 Science 309，148-150；Rosini等，2006 Mol.Micro.61，126-141和Gianfaldoni等.，2007，Infect.Immun.75，1059-1062)。实施例5报道了为解决血清中抗体可能与His标签反应而设计的实验；还参见图20。

采用蛋白质印迹比较Cna_B抗血清的反应性与cpa_M18蛋白质的特异性抗血清的反应性。结果示于图4A-B。观察到Cna_B抗血清对测试的所有蛋白质的反应性较高。具体地说，利用抗-Cna_B-Fb血清检测所测试GBS_59(SAL 1486)的所有变体，但仅利用抗-Cpa_M18血清检测了一种变体。

实施例2

调理吞噬作用试验

体外研究利用特异性血清和分化的HL-60细胞的无乳链球菌(GBS)的调理吞噬杀伤作用来检验重组Cna_B-Fb结构域是否引发保护性抗体。在5ml托-休肉汤(Todd Hewitt Broth)(THB)中将GBS培养至中指数期，然后在4℃以3000x g离心10分钟，用PBS 1x洗涤，悬浮并用OP缓冲液(HBSS，0.1％明胶，10％胎牛血清)稀释至约2x10⁷CFU/ml的终浓度。将GBS细胞(约2x10⁵CFU)在冷却96-孔微量滴定板的孔上与热灭活小鼠血清(反应中的终浓度1∶10)混合，然后在冰上加入分化的HL60(1-2x10⁶个细胞)和幼家兔补体与GBS细胞(终反应体积125μl)。37℃下温育混合物60分钟，以400-500xg混合。温育期结束时，将样品回放于冰上来终结吞噬作用。恰在1小时温育之前(0时)和之后(1小时)，用无菌蒸馏水稀释25μl试样(25μl样品+225μl水，然后1∶10和1∶100)，接种于含5％绵羊血液的胰蛋白酶大豆琼脂平板。将平板在37℃下温育过夜。

结果示于图5。GAS_M18_Cna_B_Fb血清介导GBS菌株515(其表达菌毛蛋白SAL 1482、SAL 1486和SAL 1487中的Cna_B结构域)和菌株JM10098(其表达保护性菌毛SAN 1518和SAN 1519)的杀伤作用。

进一步的调理吞噬实验指出GAS_M18_cpa(含有Cna_B-Fb结构域的完整蛋白质)也同样能杀伤细菌，提示用Cna_B-Fb结构域产生的抗体实际上负责细菌杀伤。

没有酿脓链球菌(GAS)的合适调理吞噬系统存在下，在调理吞噬实验中检验R13(一种缺乏菌毛的GBS突变型菌株)和补充有GAS菌毛M1和GSA菌毛M6的相同GBS R13菌株。结果示于图6。这些实验证明GAS_M18_Cna_B_Fb抗血清介导对表达GAS菌毛M1的GBS R13菌株的杀伤作用，并介导对表达菌毛M6的GBS R13菌株的杀伤作用，只是程度略低。

由于Fb-信号结构域仅存在于GAS Cpa蛋白质中，而非证明抗体介导杀伤作用的GBS菌毛中，我们将注意力集中于实施例1中测试的所有蛋白质中存在的Cna_B结构域。比对这些蛋白质的氨基酸序列以比较它们的Cna_B结构域的氨基酸序列(图7-13)。这些比对鉴定到本文称为“G盒”的保守区域，其具有共有序列GXYXLXEXXXXXGY(SEQ ID NO：74)。

实施例3

GBS攻击后Cna_B-Fb免疫小鼠的存活

在第1、20和34天用如实施例1所述制备的酿脓链球菌Spy_M18_0126蛋白的重组Cna_B-Fb结构域免疫30只CD1雌性小鼠。给10只小鼠腹膜内注射100μl PBS+100μl弗氏不完全佐剂配制的20μg重组蛋白。作为阳性对照，给5只小鼠注射100μl PBS+100μl弗氏不完全佐剂配制的20μg无乳链球菌GBS59(SAL_1486蛋白)，给5只小鼠注射100μl PBS+100μl弗氏不完全佐剂配制的20μg无乳链球菌GBS1523(SAN 1518)蛋白。作为阴性对照，给10只小鼠注射PBS与弗氏不完全佐剂。

第三次注射后使小鼠交配，用致死剂量的GBS菌株A909或GBS菌株515攻击新生小鼠。攻击来自Cna_B-Fb免疫母鼠的80只新生小鼠和注射PBS母鼠的80只新生小鼠以及各自来自无乳链球菌GBS59(SAL_1486)或无乳链球菌GBS 1523(SAN 1518)免疫母鼠的40只新生小鼠。监测新生小鼠存活情况4天。用菌株A909和515攻击后，Cna_B-Fb结构域免疫的新生小鼠的存活率分别是42％和44％。结果示于下表38。

表38

类似实验的结果示于图24。

实施例4

ELISA试验

在ELISA实验中，通过包被GAS_Cpa_M18蛋白和Cna_B结构域，用GAS_Cpa_M18血清的连续稀释液连续攻击来评估GAS_Cpa_M18血清中的特异性抗-Cna_B结构域抗体(表39和40)。对应于OD₅₄₀＝1的稀释度表明各蛋白的ELISA滴度(表40)。图19显示对于GAS_Cpa_M18，Y＝1(OD₅₄₀)时，ELISA滴度是627.814。类似地，对于GAS_Cpa_M18，攻击包被的Cna_B结构域时，Y＝1(OD₅₄₀)的ELISA滴度为318.061。该实验显示GAS_Cpa_M18蛋白血清中所含约一半抗体是Cna_B结构域特异性的。

表39.

表40.

血清稀释度	OD540nm抗_cpa_M18_std	OD540nm抗_cna_B
			10000	3.407	3.136
20000	3.408	3.082
			40000	3.282	2.553
80000	3.011	1.83

160000	2.576	1.305
			320000	1.425	0.769
640000	0.815	0.508
			1280000	0.505	0.295

实施例5

GAS Cna_B_Fb结构域血清与GAS和GBS菌株的交叉反应性的FACS分析

本实施例证明GAS Cna_B_Fb结构域抗血清与GAS和GBS的菌株交叉反应。

各用20μg重组Cna_B-Fb蛋白或20μg重组M6_Cna_B结构域免疫10只CD1雌性小鼠三次，获得仅抗克隆的Cna_B-Fb结构域和抗Cna_B结构域(″Cna_B_M6″；SEQ ID NO：145)的抗血清。

采用荧光活化细胞分选(FACS)证实抗GAS和GBS的各种菌株的交叉杂交特异性。指定80个通道的阈值作为正漂移(positive shift)；指定150个通道作为极正漂移(very positive shift)。

结果示于表41。还参见图18。

实施例6

腹膜内免疫后皮下注射的体内保护作用

本实施例证明在GAS皮下注射模型中，用各种Cna_B结构域抗原腹膜内免疫的小鼠显示皮肤病损面积降低。

在第1、21和35天用20μg Cna_B-Fb_M18结构域腹膜内免疫小鼠三次，第三次免疫两周后通过皮下注射10⁹cfu的酿脓链球菌菌株SF370-M1作攻击。采用伯乐公司(Bio-Rad)的QUANTITY ONE方法，通过评估病损图片中的像素数来检测病损面积。磷酸缓冲盐水(PBS)用作阴性对照，M1蛋白(“emm-1”)用作阳性对照。用GAS Cna_B结构域抗原″Cna_B-Fb_M18″作免疫的结果示于图21和25。用GBS嵌合Cna_B结构域抗原作免疫的结果示于图25。所述嵌合Cna_B结构域抗原是实施例8中描述的″GBS_59(515)-接头-GBS_67″(SEQ ID NO：129)。

实施例7

腹膜内免疫后对金黄色葡萄球菌攻击的体内保护作用

本实施例证明在小鼠肾脓肿模型中，用Cna_B结构域抗原作腹膜内免疫对金黄色葡萄球菌定殖有保护作用。

用Cna_B结构域抗原(Cna_B-Fb_M18；20微克/小鼠)或各种金黄色葡萄球菌抗原免疫小鼠(各实验10只小鼠)，采用以下方案：在第0天作第一次免疫，在第14天作第二次免疫。在第24天进行攻击。通过腹膜内进行免疫。在第24天通过静脉内注射金黄色葡萄球菌Newman菌株的细菌悬液来攻击免疫的小鼠。离心Newman菌株的培养液，洗涤两次，先用PBS稀释再作攻击。在第28天，对小鼠施以安乐死。取出肾脏，在1％TRITONX-100中匀浆，稀释试样并涂布在琼脂培养基上以便一式三份测定CFU。PBS用作阴性对照。结果示于图22(″Cna_B″是Cna_B-Fb_M18)。

实施例8

嵌合Cna_B结构域抗原的克隆和表达

在pET15表达载体中克隆和表达以下嵌合Cna_B结构域抗原，GBS59-Cna_B因其高度可溶性而用作第一结构域。

以下所示SEQ ID NO：127是His标记的Cna_B结构域抗原(″GBS_59(515)-接头-GBS_80″；SEQ ID NO：140)的氨基酸序列，该抗原含有GBS菌株515的SAL 1486的Cna_B结构域(″GBS59″)、接头序列和GBS菌株2603V/R的SAG 0645的Cna_B结构域(″GBS80″)。嵌合序列上游的六组氨酸残基以黑体字表示。氨基酸接头序列以黑体字表示。加入下划线所示氨基酸以促进蛋白质折叠。

LAGATFLVKKDGKYLARKSGVATDAEKAAVDSTKSALDAAVKAYNDLTKEKQEGQDGKSALATVSEKQKAYNDAFVKANYSYEWVEDKNAKNVVKLISNDKGQFEITGLTEGQYSLEETQAPTGYAKLSGDVSFNVNATSYSKGSAQDIE LGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDS

以下所示SEQ ID NO：128是His标记的Cna_B结构域抗原(″GBS_59(515)-接头-GBS_1523″；SEQ ID NO：141)的氨基酸序列，该抗原含有GBS菌株515的SAL 1486的Cna_B结构域(″GBS59″)、接头序列和GBS菌株COH1的SAN 1518的Cna_B结构域(″GBS1523″)。嵌合序列上游的六组氨酸残基以黑体字表示。氨基酸接头序列以黑体字表示。加入下划线所示氨基酸以促进蛋白质折叠。

LAGATFLVKKDGKYLARKSGVATDAEKAAVDSTKSALDAAVKAYNDLTKEKQEGQDGKSALATVSEKQKAYNDAFVKANYSYEWVEDKNAKNVVKLISNDKGQFEITGLTEGQYSLEETQAPTGYAKLSGDVSFNVNATSYSKGSAQDIE LQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSD

以下所示SEQ ID NO：129是His标记的Cna_B结构域抗原(″GBS_59(515)-接头-GBS_67″；SEQ ID NO：142)的氨基酸序列，该抗原含有GBS菌株515的SAL 1486的Cna_B结构域(″GBS59″)、接头序列和GBS菌株515的SAL 1487的两个Cna_B结构域(″GBS67″)(第二结构域以斜体字显示)。嵌合序列上游的六组氨酸残基以黑体字表示。氨基酸接头序列以黑体字表示。加入下划线所示氨基酸以促进蛋白质折叠。

LAGATFLVKKDGKYLARKSGVATDAEKAAVDSTKSALDAAVKAYNDLTKEKQEGQDGKSALATVSEKQKAYNDAFVKANYSYEWVEDKNAKNVVKLISNDKGQFEITGLTEGQYSLEETQAPTGYAKLSGDVSFNVNATSYSKGSAQDIE LSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELTGEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSG KQI

以下所示SEQ ID NO：130是His标记的Cna_B结构域抗原(″GBS_59(515)-GBS_80-接头-GBS_1523-接头″；SEQ ID NO：143)的氨基酸序列，该抗原含有GBS菌株515的SAL 1486的Cna_B结构域(″GBS59″)、GBS菌株2603V/R的SAG 0645的Cna_B结构域、接头序列、GBS菌株COH1的SAN 1518的Cna_B结构域和另一接头序列。嵌合序列上游的六组氨酸残基以黑体字表示。氨基酸接头序列以黑体字表示。加入下划线所示氨基酸以促进蛋白质折叠。

LAGATFLVKKDGKYLARKSGVATDAEKAAVDSTKSALDAAVKAYNDLTKEKQEGQDGKSALATVSEKQKAYNDAFVKANYSYEWVEDKNAKNVVKLISNDKGQFEITGLTEGQYSLEETQAPTGYAKLSGDVSFNVNATSYSKGSAQDIELGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDS LQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSD

以下所示SEQ ID NO：131是His标记的Cna_B结构域抗原(″SACna_B-SdrD″；SEQ ID NO：144)的氨基酸序列，该抗原含有金黄色葡萄球菌SdrD蛋白的Cna_B结构域，还包含SdrD蛋白质天然存在的“接头”氨基酸(黑体字)。嵌合序列上游的六组氨酸残基以黑体字表示。

VGNVTVTVFDNNTNTKVGEAVTKEDGSYLIPNLPNGDYRVEFSNLPKGYEVTPSKQGNNEELDSNGLSSVITVN ISGVTVTLKDENGNVLKTVTTDADGKYKFTDLDNGNYKVEFTTPEGYTPTTVTSGSDIEKDSNGLTTTGVIN ISGVTVTLKNENGEVLQTTKTDKDGKYQFTGLENGTYKVEFETPSGYTPTQVGSGTDEGIDSNGTSTTGVIK ISGVTVTLKDENDKVLKTVTTDENGKYQFTDLNNGTYKVEFETPSGYTPTSVTSGNDTEKDSNGLTTTGVIK IKDVKVTLLNEKGEVIGTTKTDENGKYCFDNLDSGKYKVIFEKPAGLTQTVTNTTEDDKDADGGEVDVTIT

实施例9

在小鼠肾脓肿模型中用Cna_B结构域抗原作腹膜内免疫对金黄色葡萄球菌定殖的保护作用

本实施例证明在小鼠肾脓肿模型中，用Cna_B结构域抗原作腹膜内免疫对金黄色葡萄球菌定殖有保护作用。

用Cna_B结构域抗原(Cna_B-Fb_M18；20微克/小鼠)免疫小鼠(各实验10只小鼠)，采用以下方案：在第0天作第一次免疫，在第14天作第二次免疫。在第24天进行攻击。通过腹膜内进行免疫。在第24天通过静脉内注射金黄色葡萄球菌Newman菌株的细菌悬液来攻击免疫的小鼠。离心Newman菌株的培养液，洗涤两次，先用PBS稀释再作攻击。在第28天，对小鼠施以安乐死。取出肾脏，在1％TRITONX-100中匀浆，稀释试样并涂布在琼脂培养基上以便一式三份测定CFU。葡萄球菌IsdB用作阳性对照，明矾用作阴性对照。金黄色葡萄球菌攻击后，用Cna_B结构域抗原免疫的小鼠显示肾脏定殖率降低。结果示于图23。

实施例10

Cna_B_SdrD在败血症小鼠模型中赋予抵御金黄色葡萄球菌感染的保护作用

本实施例证明在败血症小鼠模型中，用包含金黄色葡萄球菌蛋白SdrD(图26A、B)的Cna_B结构域(SEQ ID NO：134-138)的Cna_B结构域抗原(图27；SEQ ID NO：132)对金黄色葡萄球菌感染赋予保护作用。

用Cna_B SdrD抗原(20微克/小鼠，明矾配制)或不能形成孢子的金黄色葡萄球菌α-溶血素的突变形式(Hla_H35L；参见，例如Wardenburg和Schneewind，″抵御金黄色葡萄球菌肺炎的疫苗保护(Vaccineprotection against Staphlococcus aureus pneumonia)″Exp Med.2008年2月18；205(2)：287-294)(20微克/小鼠，明矾配制)免疫多组小鼠，每组14只。对照小鼠注射明矾。

采用以下方案免疫小鼠：在第0天作第一次免疫，在第14天作第二次免疫。在第24天进行攻击。通过腹膜内进行免疫。在第24天通过腹膜内注射金黄色葡萄球菌菌株USA300的细菌悬液来攻击免疫的小鼠。离心USA300菌株的培养液，洗涤两次，先用PBS稀释再作攻击。每日监测小鼠，共14天，按照诺华动物福利政策(Novartis AnimalWelfare Policies)，在出现人道终末点时对小鼠施以安乐死。用金黄色葡萄球菌菌株USA300攻击后两周的存活百分比示于图28。这些结果证明用Cna_B_SdrD免疫赋予抵御金黄色葡萄球菌攻击的高保护作用，从而提示该结构域可能是极好的候选疫苗。

表42.序列标识符

Claims (23)

1.一种能诱导或增强对一种或多种革兰氏阳性细菌的免疫反应的Cna_B结构域抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或7所示。

2.一种能诱导或增强对一种或多种革兰氏阳性细菌的免疫反应的Cna_B结构域抗原，其特征在于，所述抗原包含两条氨基酸序列，其中，一条氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或7，另一条氨基酸序列选自SEQ IDNO:1-10、27-35、53-57、66-68、75、76、80、81、84-86、110-117、122-126和134-144。

3.如权利要求2所述的Cna_B结构域抗原，其包含第一革兰氏阳性细菌蛋白的第一Cna_B结构域和第二革兰氏阳性细菌蛋白的第二Cna_B结构域，其中所述第一和第二革兰氏阳性蛋白是不同的蛋白质，其中所述第一Cna_B结构域含有SEQ ID NO：7，和所述第二Cna_B结构域含有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-10。

4.如权利要求2所述的Cna_B结构域抗原，该抗原包含两个相同的Cna_B结构域，其中所述Cna_B结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

5.一种能诱导或增强对一种或多种革兰氏阳性细菌的免疫反应的Cna_B结构域抗原，其包含：

(a)SEQ ID NO:1；和

(b)SEQ ID NO:1的N末端处的SEQ ID NO:18的0-70个额外的毗连氨基酸和/或SEQ ID NO:1的C末端处的SEQ ID NO:18的0-282个额外的毗连氨基酸。

6.一种能诱导或增强对一种或多种革兰氏阳性细菌的免疫反应的Cna_B结构域抗原，其包含下式：

A(LB)_n

式中：

A是第一Cna_B结构域，其包含SEQ ID NO:7；

B是第二Cna_B结构域，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-10、27-35、53-57、66、67、75、76、80、81、84-86、110-117、122-126和134-138；

n是1-10；和

L独立为不存在或是氨基酸接头；和

其中所述第一Cna_B结构域的N末端氨基酸的氨基不经肽键与天然革兰氏阳性细菌蛋白中其所连的氨基酸的羧基相连和/或所述第二Cna_B结构域的C末端氨基酸的羧基不经肽键与天然革兰氏阳性细菌蛋白中其所连的氨基酸的氨基相连。

7.如权利要求6所述的Cna_B结构域抗原，其中，所述B是含有选自下组的氨基酸序列的第二Cna_B结构域：SEQ ID NO:2-10。

8.如权利要求1－7中任一项所述的Cna_B结构域抗原，其中，所述抗原为分离或纯化的形式。

9.一种融合多肽，其包含：

权利要求1-8中任一项所述的Cna_B结构域抗原；和

细菌抗原。

10.权利要求1－8中任一项所述的Cna_B结构域抗原或权利要求9所述的融合多肽，其中，所述Cna_B结构域抗原或所述融合多肽偶联于载体蛋白。

11.一种核酸分子，其编码权利要求1-8中任一项所述的Cna_B结构域抗原或权利要求9所述的融合多肽。

12.如权利要求11所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是表达载体。

13.一种包含表达载体的非人宿主细胞，所述表达载体编码权利要求1-8中任一项所述的Cna_B结构域抗原或权利要求9所述的融合多肽。

14.一种产生Cna_B结构域抗原或融合多肽的方法，包括：

在表达载体表达所述Cna_B结构域抗原或融合多肽的条件下培养权利要求13所述的非人宿主细胞；和

回收所述Cna_B结构域抗原或融合多肽。

15.一种选择性结合一个或多个Cna_B结构域的分离的抗体，其中各Cna_B结构域包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1或7。

16.如权利要求15所述的分离的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。

17.如权利要求15和16中任一项所述的分离的抗体，其特征在于，所述抗体诱导至少30%的GBS菌株515的调理吞噬作用。

18.一种组合物，其包含：

选自下组的活性剂：

权利要求1-8和10中任一项所述的Cna_B结构域抗原；

权利要求9或10所述的融合多肽；

权利要求11或12所述的核酸分子；和

权利要求15-17中任一项所述的分离的抗体；以及药学上可接受的载体。

19.一种试剂盒，其装有：

(a)装有如权利要求18所述组合物的容器；和

(b)利用所述组合物产生抵御包含Cna_B结构域的革兰氏阳性细菌蛋白的免疫应答的使用说明书。

20.权利要求1-8中任一项所述的Cna_B结构域抗原或权利要求9所述的融合多肽在制备治疗革兰氏阳性细菌所致感染的药物中的用途。

21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性细菌选自下组：无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、马链球菌和猪链球菌。

22.权利要求1-8中任一项所述的Cna_B结构域抗原或权利要求9所述的融合多肽在制备减轻革兰氏阳性细菌所致感染的药物中的用途。

23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述革兰氏阳性细菌选自下组：无乳链球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、马链球菌和猪链球菌。