KR20010042573A

KR20010042573A - 애쥬번트 조성물

Info

Publication number: KR20010042573A
Application number: KR1020007011240A
Authority: KR
Inventors: 마틴 프리이드; 필립 허맨드
Original assignee: 장 스테판느; 스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2001-05-25
Also published as: EP1069910A1; AR019026A1; HUP0101619A2; CA2325939A1; AU3419799A; PL354714A1; HUP0101619A3; IL138000A0; NZ506603A; CN1296416A; AU746163B2; BR9909915A; NO20005051L; TR200002930T2; JP2002511423A; WO1999052549A1; NO20005051D0

Abstract

본 발명은 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 조합되는 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함하는 애쥬번트 조성물, 및 이러한 애쥬번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 애쥬번트 제형 및 백신 제형의 제조에 있어서, 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도, 및 의약으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

애쥬번트 조성물 {ADJUVANT COMPOSITIONS}

점막 백신접종, 예컨대 비강내 또는 경구 백신접종은 전신 주사를 통한 전통적인 백신접종 보다 용이하고 편리한 접종 방식이라고 할 수 있다. 백신 투여량을 투여하기 위한 주사의 사용은 많은 단점, 즉 주사후 주사 부위의 통증 및 자극과 관련이 있다. 이러한 요인들은 백신접종 레짐에 대한 환자의 순응도를 약화시키는 결과를 가져오는 것으로 알려진 "주사침에 대한 공포"를 가져올 수 있다. 또한, 통상적인 전신 주사는 피부의 구멍난 부위에 감염의 원인일 수 있다.

주사에 대한 필요성을 회피하는 것은 별도로 하고, 항원의 점막 투여가 동물에서 많은 병원체의 침입 경로인 점막 표면에서 보호 반응을 일으키는데 보다 큰 효율성을 갖는 것으로 나타났기 때문에, 점막 백신접종은 흥미롭다. 또한, 비강내 백신접종과 같은 점막 백신접종은 비점막 뿐만 아니라, 생식기 점막과 같은 먼 점막 부위에서 점막 면역을 일으킬 수 있는 것으로 시사되었다[Mesteckey, 1987, Journal of Clinical Immunology, 7, 265-276; McGhee and Kiyono, Infectious Agents and Disease, 1993, 2, 55-73].

점막 백신접종이 주사를 통한 백신접종에 대한 존속가능한 대체물, 또는 대안이 되기 위해서는, 이러한 백신접종 경로가 주사에 의해 일어나는 것 이상으로 효율적으로 전신 면역 반응을 일으킬 수 있어야 할 것이다. 특정 항원이 이러한 경로를 통해 투여될 경우 전신 반응을 일으킬 수 있는 것으로 보고된 바 있으나, 비강내 투여된 대부분의 가용성 항원은 단독으로 면역 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않는다.

많은 저자들이 이러한 문제점을 해결하기 위하여 가능한 점막 애쥬번트를 연구하였으며, 상기 애쥬번트는 항원의 캡슐화(예컨대, 리포좀 및 마이크로파티클); 또는 표적 세포와의 직접 상호작용 후 표적 세포로부터 면역 자극 사이토카인의 유리를 통하여(예컨대, 콜레라 톡신 및 대장균 열불안정성 톡신); 또는 상피를 가로질러 항원의 흡수를 증가시킴에 의한 것(예컨대, 콜레라 톡신)과 같은 다양한 메카니즘을 통하여 애쥬번트 활성을 나타낸다.

본 발명은 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 조합되는 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함하는 애쥬번트 조성물, 및 이러한 애쥬번트 조성물 및 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 애쥬번트 제형 및 백신 제형의 제조에 있어서 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도, 및 의약으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

본 출원인은 본원에서 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르가 백신용 강력 애주번트로서 작용한다는 놀라운 발견을 제공한다. 본 발명의 애쥬번트는 안전하고, 용이하게 멸균가능하며, 투여하기 간편하다. 유리하게도, 이러한 조성물은 점막으로 투여될 때 백신의 통상적인 전신 주사후에 관찰되는 것 이상으로 높은 전신 면역 반응을 일으키기에 충분하다.

폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 Merck index(12^thed: entry 7717)에 기재되어 있으며, 상기 문헌에서는 치료적 용도가 국소 마취제; 항소양제; 및 경화제 활성을 포함한 것으로 기재되어 있다. 분류상으로는, 이러한 폴리옥시에틸렌 에테르, 또는 에스테르는 비이온성 계면활성제이다.

폴리옥시에틸렌 에테르 및 에스테르의 비강내 투여는 비강에서의 인슐린 흡수의 증가를 위한 것으로 기술되어 왔다[Hirai et al. 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 165-172; Hirai et al. 1981, International Journal of Pharmaceutics, 9, 173-184].

기타 비이온성 계면활성제는 백신 제제화에 사용되어 왔다. 폴리옥시에틸렌 피마자유 또는 카프릴산/카프르산 글리세라이드의 혼합물을 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에스테르, 및 항원과 함께 포함하는 백신 제제는 점막으로 국소 투여한 후에 전신 면역 반응을 일으킬 수 있는 것으로 보고되어 왔다[WO 9417827]. 이러한 특허 출원은 TWEEN20^TM(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에스테르) 및 Imwitor742^TM(카프릴산/카프르산 글리세라이드)의 조합물, 또는 TWEEN20^TM및 폴리옥시에틸렌 피마자유의 조합물이 비강내 백신접종후에 전신 면역 반응을 증가시킬 수 있음을 개시한다. 또한, 비강내 투여된 항원에 대한 면역 반응의 증가에 미치는 이 제형의 효과에 관한 상세한 사항은 문헌에 기재되어 왔다[Gizurarson et al. 1996. Vaccine Research, 5, 69-75; Aggerbeck et al. 1997. Vaccine, 15, 307-376].

노바좀[US 5,147,725]은 폴리옥시에틸렌 에테르 및 콜레스테롤을 포함하는 소수층상(pucilamenar)소포 구조물이고, 항원을 캡슐화하며, 전신 투여후에 항원에 대한 면역 반응을 보조할 수 있다.

또한, 계면활성제는 비이온성 계면활성제 소포를 형성하는 방식으로 제제화되어 왔다(네오좀으로서 일반적으로 공지됨, WO 95/09651). 이러한 소포는 콜레스테롤의 존재하에서, 내부 수상 내에 또는 이중층 그 자체 내에 항원을 포획할 수 있는 지질 이중층 소포를 형성한다.

본 발명자들은 본원에서 비교적 저농도의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르가 함께 투여된 항원에 대한 전신 면역 반응을 유의하게 증가할 수 있다는 놀라운 발견을 제공한다. 또한, 점막 백신 제형으로 사용될 때, 이들 애쥬번트의 축항원자극(boosting) 효과는 전신 면역 반응을 통상적인 항원의 전신 주사에 의해 달성되는 것과 동등하거나 우수한 수준으로 상승시킨다. 이러한 분자는 통상적인 전신 백신 목적으로, 또는 전신 예방 접종을 점막 백신접종으로 대체시키기 위하여 사람에게 투여하기에 적합한 일종의 애쥬번트를 의미한다.

많은 유용한 백신 애쥬번트가 항원 캡슐화 때문에 작용하지만, 놀랍게도 본 발명은 비소포성 용액 또는 현탁액의 형태로 강력한 백신 애쥬번트로서 작용한다. 따라서, 본 발명의 한 구현예는 비소포성 용액 또는 현탁액의 형태로 존재하는 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 애쥬번트 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 구현예는 콜레스테롤의 부재하에 제형화된 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 백신 애쥬번트의 형태를 취한다.

본 발명의 백신 및 애쥬번트 제형은 하기 화학식(Ⅰ)의 분자를 포함한다:

상기식에서,

n은 1 내지 50이고,

A는 결합선 또는 -C(O)-이며,

R은 C_1-50알킬 또는 페닐 C_1-50알킬이다.

본 발명의 한 구현예는 n은 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R 성분은 C_1-50, 바람직하게는 C_4-20알킬 및 가장 바람직하게는 C₁₂알킬이며, A는 결합선인 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르를 포함하는 백신 제형으로 구성된다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%이어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.

본 발명의 다른 구현예는 n은 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R 성분은 C_1-50, 바람직하게는 C_4-20알킬 및 가장 바람직하게는 C₁₂알킬이며, A는 -C(O)-인 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함하는 백신 조성물로 구성된다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%이어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에스테르는 하기 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에스테르.

또한, n은 1 내지 50이나, 바람직하게는 4 내지 24, 및 가장 바람직하게는 9이고; R 성분은 C_1-50, 바람직하게는 C_4-20알킬 및 가장 바람직하게는 C₁₂알킬이며, A는 결합선인 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 페닐 에테르를 포함하는 백신 조성물은 본 발명의 한 구현예를 이룬다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 및 가장 바람직하게는 0.25 내지 1%이어야 한다.

본 발명의 백신 제제는 백신을 경구/협측/장관/질/직장 또는 비강 경로와 같은 점막 투여 경로에 의해 투여함으로써, 질병에 걸리기 쉽거나, 질병을 앓는 포유동물을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 투여는 비말, 분무, 또는 건조 분말 형태일 수 있다. 분무형 또는 에어로솔형 백신 제형도 본 발명의 일부를 형성한다. 경구 투여용 위 저항성 캡슐 및 과립, 직장 또는 질 투여용 좌제와 같은 장성 제제도 본 발명의 일부를 형성한다. 본 발명은 피부에 적용되는(경피 투여) 항원의 면역원성을 증가시키는데 사용될 수도 있다. 또한, 본 발명의 애쥬번트는 애쥬번트가 소포의 형태로 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 비경구적 투여, 예컨대 근육내, 또는 피하로 투여될 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 구현예는 점막 백신 제제에 사용되는 애쥬번트를 제공한다. 이러한 애쥬번트는 사람에서 내성이 우수하고, 전신 면역 반응의 유도에 효능이 있다. 본 발명의 애쥬번트는 용액, 또는 비소포성 용액 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있고, 그 자체로서 제조, 안정성, 균일성, 및 미립자성 애쥬번트 시스템의 품질 관리와 관련된 문제점이 없다. 이러한 제제는 강력 애쥬번트이고 또한 낮은 반응원성을 나타내며 환자에 의한 내성이 우수하다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리옥시에틸렌 에테르는 용혈 활성을 갖는다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 용혈 활성은 시험관내에서 하기 검정으로 측정될 수 있고, 적혈구 세포의 용해(lysis)를 일으키지 못하는 세정제의 최고 농도로서 표시된다:

1. 기냐 피그의 신선한 혈액을 소형 원심분리기에서 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3회 세척한다. 최초 부피로 재현탁한 후, 혈액을 PBS로 추가로 10배 희석시킨다.

2. 이 혈액 현탁액 50㎕를 세정제 2배 희석액을 함유한 PBS 800㎕에 첨가한다.

3. 8시간 후에, 육안으로 또는 상등액의 광학 밀도를 측정함으로써 평가한다. 570nm에서 빛을 흡수하는 적색 상등액의 존재는 용혈의 존재를 지시한다.

4. 결과를 용혈이 더 이상 일어나지 않는 최초 세정제 희석액의 농도로 표시한다.

이러한 생물학적 검정에 내재하는 실험적 변이성 내에서, 본 발명의 폴리옥시에틸렌 에테르, 또는 화학식(Ⅰ)의 계면활성제는 바람직하게는 약 0.5 내지 0.0001%, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.0001%, 더욱 바람직하게는 0.005 내지 0.0001%, 및 가장 바람직하게는 0.003 내지 0.0004%의 용혈 활성을 가진다. 이론상, 상기 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르는 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르 또는 폴리옥시에틸렌-8 스테오릴 에테르와 유사한(즉, 10배 차이 내) 용혈 활성을 가져야 한다.

계면활성제에서 폴리옥시에틸렌 부분의 길이 대 알킬 사슬의 길이의 비(즉, n:알킬 사슬 길이의 비)는 수성 매질에서 이러한 종류의 세정제의 용해도에 영향을 미친다. 따라서, 본 발명의 애쥬번트는 용액 상태일 수 있거나 미셀과 같은 미립자성 구조를 형성할 수 있다. 본 발명의 애쥬번트는 그 비소포형 성질 때문에 투명하며, 탁하거나 불투명하지 않고, 안정하며 220nm 막을 통한 여과에 의해 용이하게 멸균가능하며, 용이하고 조절된 방식으로 제조된다.

본 발명의 백신은 PBS 또는 물과 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제중에 비소포형 용액 또는 현탁액의 형태의 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르, 및 항원 또는 항원성 제제를 취할 수 있다. 그 후, 이러한 백신 제형은 초회항원자극 또는 추가항원자극 백신접종법에서 포유동물의 점막 표면에 적용될 수 있거나; 대안적으로 전신 투여, 예컨대 경피 또는 근육내 경로에 의해 투여될 수 있다.

점막 및 전신 면역 반응 모두를 증가시키는 것으로 공지된 기타 애쥬번트는 비브리오 콜레라 및 대장균(즉, 각각 콜레라 톡신(CT), 및 열불안정성 엔테로톡신 (LT))으로부터 유도된 세균성 엔테로톡신을 포함한다. CT 및 LT는 독성 A 아단위를 크래들링하는 β-아단위의 오량체 환으로 구성된 이종이량체이다. 이들의 구조 및 생물학적 활성은 Clements and Finklestein, 1979, Infection and Immunity, 24:760-769; Clements et al., 1980, Infection Infection and Immunity, 24:91-97에 개시되어 있다. 최근, 일단 세포로부터 유리되면, LT의 비독성 형태를 독성 형태로 "스위치 온" 시킬 수 있도록 하는데 필요한 단백분해성 부위가 결핍된 LT의 비독성 유도체가 개발되었다. 이러한 형태의 LT(mLT(R192G)로 명명)는 192 위치에서 아미노산 아르기닌을 글리신으로 치환함으로써 단백분해성 절단을 받기 어렵게 되어, 독성은 크게 감소되는 반면, 강력한 애쥬번트 활성은 유지된다. mLT(R192G)의 제조 방법은 특허 출원 WO 96/06627에 개시되어 있다. LT의 다른 돌연변이 형태는 LTA 서열의 69 위치에서 알라닌 대신 글리신의 치환을 함유한 mLT(R192G)와 같은 활성 부위 돌연변이를 포함한다. 점막 백신으로서 mLT(R192G)의 사용은 특허 출원 WO 96/06627에 기재되어 있다. 이러한 애쥬번트는 본 발명의 비이온성 계면활성제와 유리하게 조합될 수 있다.

따라서, 본 발명의 대안적인 구현예에서 폴리옥시에틸렌 에테르, 또는 에스테르는 콜레라 톡신 및 그의 B 아단위, 모노포스포릴 리피드 A 및 그의 비독성 유도체인 3-데-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A(영국 특허 제 GB 2,220,211호에 기재), 퀼 A(남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 목피로부터 유도)와 같은 사포닌, 및 QS21 및 QS17[US 5,057,540; Kensil, C. R. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55; EP 0 362 279 B1; Kensil et al.(1991. J. Immunology vol 146, 431-437; WO 99/10008)]을 포함한 그의 분획물 및 비메틸 CpG 디누클레오티드를 함유한 올리고누클레오티드 애쥬번트 시스템을 포함하는 기타 애쥬번트 또는 면역자극제와 추가로 조합될 수 있다. POE와 함께 사용되는 특히 바람직한 면역자극제는 CpG 면역자극성 올리고누클레오티드이며, 이 제제는 보다 큰 동물에서 연역 반응의 유도 및 추가자극하는데 효능이 있다. 바람직한 올리고누클리오티드는 하기 서열을 가진다: 서열은 바람직하게는 모든 포스포로티오에이트 변형된 누클레오티드간 연결을 함유한다.

올리고 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

올리고 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT

올리고 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

본 발명에서 사용된 CpG 올리고누클레오티드는 당해 분야에서 공지된 방법(예컨대, EP 468520)에 의해 합성될 수 있다. 편의상, 이러한 올리고누클레오티드는 자동화된 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.

대안적으로, 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르는 카이토산 또는 다른 다가양이온성 중합체폴리락티드 및 폴리락티드-코글리콜라이드 입자, 폴리사카라이드 또는 화학적으로 수식된 폴리사카라이드로 구성된 입자, 콜레스테롤 무함유 리포좀 및 지질 기제의 입자, 수중유형 유제(WO 95/17210), 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자 등으로 구성된 백신 비히클과 조합될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르는 건조 분말로서 투여될 수 있는 항원 함유 락토오스와 같은 분말 부형제와 혼합될 수도 있다.

본 발명의 애쥬번트는 계면활성제를 포함한다: 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르가 소포의 형태로 존재하지 않는 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르. 따라서, 본 발명은 화학식(Ⅰ)의 계면활성제가 소포 형태로 존재하지 않는 애쥬번트 조성물 및 백신의 제조에 있어서 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르 및 에스테르의 용도를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 백신 제형은 인간 병원체에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 함유하며, 상기 항원 또는 항원성 조성물은 HIV-1(예컨대, tat, nef, gp120 또는 gp160과 같은), gD 또는 그의 유도체와 같은 인간 헤르페스 바이러스 또는 HSV1 또는 HSV2 유래의 ICP27과 같은 즉시 조기(Immediate Early) 단백질, 거대세포바이러스(cytomegalovirus)((특히, 인간)(예컨대, gB 또는 그의 유도체), 로타바이러스(Rotavirus)(약독화된 생 바이러스를 포함), 엡스타인 바아 바이러스(Epstein Barr virus)(예컨대, gp350 또는 그의 유도체), 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster virus)(예컨대, gPⅠ,Ⅱ 및 IE63), 또는 B형 간염 바이러스(예컨대, B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스와 같은 간염 바이러스, 또는 파리믹소바이러스(paramyxovirus)와 같은 기타 바이러스성 병원체: 호흡기 합포 바이러스(Respiratory Syncytial virus) (예컨대, F 및 G 단백질 또는 그의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스(papilloma virus)(예컨대, HPV6, 11, 16, 18…), 플라비바이러스(flavivirus)(예컨대, 황열 바이러스, 뎅구 바이러스, 틱-본(Tick-borne) 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스(완전 생 바이러스 또는 약독화 바이러스, 난 또는 MDCK 세포, 베로(Vero) 세포에서 성숙한 스플릿 인플루엔자 바이러스 또는 완전 인플루엔자 비로좀(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920에 의해 기술) 또는 HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 이들의 조합과 같은 이들의 정제된 또는 재조합 단백질), 또는 임질균 및 수막염균과 같은 나이세리아 종(Neisseria spp)(예컨대, 캡슐형 폴리사카라이드 및 그의 콘쥬게이트, 트랜스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 아드헤진); S. 파이오제네스(S. pyogenes)(예컨대, M 단백질 또는 그의 단편, C5A 프로테아제, 리포테이콘산), S. 아갈락시아(S. agalactiae), S. 뮤턴스(S. mutans); H. 듀크레이(H. ducreyi); 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella cataralis)로도 알려진 M 카타랄리스를 포함한 모락셀라 종(Moraxella spp), B. 퍼투시스(B. pertussis)(예컨대, 페르탁틴, 백일해 톡신 또는 이들의 유도체, 필라멘트형 헤마글루티닌, 아데닐산 사이클라제, 핌브리아), B. 파라퍼투시스(B. parapertussis) 및 B. 브론키셉티카(B. bronchiseptica)를 포함한 보르데텔라 종(Bordetella spp); M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)(예컨대, ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), M. 보비스(M. bovis), M. 레프라(M. leprae), M. 아비움(M. avium), M. 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis), M. 스메그마티스(M. smegmatis)를 포함한 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp); L. 뉴모필라(L. pneumophila)를 포함한 레지오넬라 종(Legionella spp); 장관독성 대장균(예컨대, 전이증식 인자, 열불안정성 톡신 또는 이들의 유도체, 열안정성 톡신 또는 그의 유도체), 장출혈성 대장균, 장병원성 대장균(예컨대, 시가 톡신 유사 톡신 또는 이들의 유도체)를 포함하는 에스케리챠 종(Escherichia spp); V. 콜레라(V. cholera)(예컨대, 콜레라 톡신 또는 그의 유도체)를 포함하는 비브리오 종(Vibrio spp); S. 손네이(S. sonnei), S. 디센테리아(S. dysenteriae), S. 플렉스네리(S. Flexnerii)를 포함하는 시겔라 종(Shigella spp); Y. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)(예컨대, 욥(Yop) 단백질), Y. 페스티스(Y. pestis), Y. 슈도투베르쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)를 포함하는 예르시니아 종(Yersinia spp); C. 제쥬니(C. jejuni)(예컨대, 톡신, 아드헤진 및 인바진) 및 C. 콜라이(C. coli)를 포함하는 캄필로박터 종(Campylobacter spp); S. 타이피(S. typhi), S. 파라타이피(S. paratyphi), S. 콜레라에수이스(S. choleraesuis), S. 엔테리티디스(S. enteritidis)를 포함하는 살모넬라 종(Salmonella spp); L. 모노사이토제네스(L. monocytogenesis)를 포함하는 리스테리아 종(Listeria spp); H. 필로리(H. pylori)(예컨대, 우레아제, 카탈라아제, 공포성 톡신)를 포함하는 헬리코박터 종(Helicobacter spp); P. 에루지노사(P. aeruginosa)를 포함하는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp); S. 오레우스(S. aureus), S. 에피더미스(S. epidermis)를 포함하는 스타필로콕커스 종(Staphylococcus spp); E. 페칼리스(S. faecalis), E. 페시움(E. faecium)을 포함하는 엔테로콕커스 종(Enterococcus spp); C. 테타니(C. tetani)(예컨대, 파상풍 톡신 및 그의 유도체), C. 보툴리눔(C. botulinum)(예컨대, 보툴리눔 톡신 및 그의 유도체), C. 디이피셀(C. difficile)(예컨대, 클로스트리듐 톡신 A 또는 B 및 그의 유도체)를 포함하는 클로스트리듐 종(Clostridium spp); B. 안트라시스(B. anthracis)(예컨대, 보툴리눔 톡신 및 그의 유도체)를 포함하는 바실루스 종(Bacillus spp); C. 디프테리아(C. diphtheriae)(디프테리아 톡신 및 그의 유도체)를 포함하는 코르네박테리움 종(Cornebacterium spp); B. 부르그도르페리(B. burgdorferi)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 가리니(B. garinii)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 아프젤리(B. afzelii)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 안데르소니(B. andersonii)(예컨대, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 험시(B. hermsii)를 포함하는 보렐리아 종(Borrelia spp); E. 에퀴(E. equi) 및 인간 과립세포 에를리히오시스의 약제를 포함하는 에를리히아 종(Ehrlichia app); R. 리켓치(R. rickettsii)를 포함하는 리켓치아 종(Rickettsia spp); C. 트라코마티스(C. trachomatis)(예컨대, MOMP, 헤파린 결합 단백질), C. 뉴모니아(C. pneumoniae)(예컨대, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 앵무병 클라미디아(C. psittaci)를 포함하는 클라미디아 종(Chlamydia spp); L. 인테로간스(L. interrogans)를 포함하는 렙토스피라 종(Leptosira spp); T. 팔리둠(T. pallidum)(예컨대, 희박 외부 막 단백질), T. 덴티콜라(T. denticola), T. 히오디센테리아(T. hyodysenteriae)를 포함하는 트레포네마 종(Traponema spp)과 같은 세균성 병원체로부터 유래되거나; 또는 P. 팔시파룸(P. falciparum)을 포함한 플라스모디움 종(Plasmodium spp); T. 곤디(T. gondi)(예컨대, SAG2, SAG3, Tg34)를 포함하는 톡소플라스마 종(Toxoplasma spp); E. 히스톨리티카(E. histolytica)를 포함하는 엔타메바 종(Entamoeba spp); B. 미크로티(B. microti)를 포함하는 바베시아 종(Babesia spp); T. 크루지(T. cruzi)를 포함하는 트리파노조마 종(Trypanosoma spp); G. 램블리아(G. lamblia)를 포함하는 지아르디아 종(Giardia spp); L. 마조르(L. major)를 포함하는 레슈마니아 종(Leshmania spp); P. 카리니(P. carinii)를 포함하는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp); T. 바지날리스(T. vaginalis)를 포함하는 트리코모나스 종(Trichomonas spp); S. 만소니(S. mansoni)를 포함하는 시소스토마 종(Schisostoma spp)과 같은 기생충으로부터 유래되거나; 또는 C. 알비칸스(C. albicans)를 포함하는 칸디다 종(Candida spp); C. 네오포르만스(C. neoformans)를 포함하는 크립토콕커스 종(Cryptococcus spp)과 같은 효모로부터 유래된다.

바람직한 세균성 백신은 S. 뉴모니아(예컨대, 캡슐형 폴리사카라이드 및 그의 콘쥬게이트, PsaA, PspA, 스트렙토라이신, 콜린 결합 단백질)를 포함하는 스트렙토콕쿠스 종 유래의 항원 및 단백질 항원 뉴모라이신[Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342], 및 그의 돌연변이성 탈독성화된 유도체[WO90/06951;WO99/03884]를 포함한다. 다른 바람직한 세균성 백신은 H. 인플루엔자 타입 B(예컨대, PRP 및 그의 콘쥬게이트), 비타입형 H. 인플루엔자를 포함하는 헤모필루스 종 유래의 항원, 예컨대 OMP26, 고분자량 아드헤진, P5, P6, 단백질 D 및 리포단백질 D, 및 핌브린 및 핌프린 유래의 펩티드[US5,843,464] 또는 다중 복제 변이물 또는 그의 융합 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 세균성 백신은 모락셀라 카타랄리스(그의 외막 소포, 및 OMP106[WO97/41731]를 포함) 및 수막염균 B(그의 외막 소포, 및 NspA[WO96/29412]를 포함)로부터 유래된 항원을 포함한다.

B형 간염 표면 항원의 유도체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 특히 유럽 특허 출원 EP-A-414 374; EP-A-0304 578, 및 EP 198-474에 기재된 PreS1, PreS2 항원을 포함한다. 한 바람직한 측면에서, 본 발명의 백신 제형은 특히 CHO 세포에서 발현된 경우 HIV-1 항원인 gp120를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 백신 제형은 상기 정의한 바와 같은 gD2를 포함한다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 청구된 애쥬번트를 함유하는 백신은 생식기 사마귀를 일으키는 것으로 간주되는 인간 유두종 바이러스(HPV) (HPV6 또는 HPV11 및 기타), 및 자궁경부암을 일으키는 HPV 바이러스 유래의 항원을 포함한다.

생식기 사마귀 예방, 또는 치료 백신의 특히 바람직한 형태는 L1 입자 또는 캡소머, 및 HPV6 및 HPV11 단백질 E6, E7, L1, 및 L2로부터 선택된 하나 이상의 항원을 포함한 융합 단백질을 포함한다.

융합 단백질의 가장 바람직한 형태는 WO96/26277에 개시된 바와 같은 L2E7, 및 GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)에 개시된 바와 같은 단백질 D(1/3)-E7이다.

바람직한 HPV 자궁경부 감염 또는 암 예방 또는 치료 백신 조성물은 HPV16 또는 18 항원을 포함할 수 있다. 예컨대, L1 또는 L2 항원 단량체, 또는 L1 또는 L2 항원은 바이러스 유사 입자(VLP)로서 함께 제공되거나 L1 단독 단백질은 VLP 또는 캡소머 구조로 단독으로 제공된다. 이러한 항원, 바이러스 유사 입자 및 캡소머는 그 자체로 공지되어 있다[참조: 예컨대 WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792, 및 WO93/02184].

추가적인 초기 단백질은 단독 또는 바람직하게는 E7, E2 또는 E5와 같은 융합 단백질로서 포함될 수 있다; 이의 특히 바람직한 구현예는 L1E7 융합 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다(WO96/11272).

특히 바람직한 HPV16 항원은 단백질 D - HPV 유래의 E6 또는 E7 융합을 형성하도록 단백질 D 담체와 융합된 초기 단백질 E6 또는 E7, 또는 이들의 조합물; 또는 E6 또는 E7과 L2와의 조합물을 포함한다(WO96/26277).

대안적으로, HPV16 또는 18 초기 단백질 E6 및 E7은 단일 분자, 바람직하게는 단백질 D-E6/E7 융합으로서 제공될 수 있다. 이러한 백신은 임의적으로 HPV18유래의 E6 및 E7 단백질중 하나 또는 양자 모두를, 바람직하게는 단백질 D-E6 또는 단백질 D-E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로 함유할 수 있다.

본 발명의 백신은 기타 HPV 종, 바람직하게는 HPV 6, 11, 31, 33, 또는 45 종 유래의 항원을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 말라리아를 일으키는 기생충으로부터 유래된 항원을 추가로 포함한다. 예컨대, 플라스모디아 팔시파룸(Plasmodia falciparum)유래의 바람직한 항원은 RTS,S 및 TRAP를 포함한다. RTS는 B형 간염 바이러스 표면(S) 항원에 B형 간염 표면 항원의 preS1 부분의 4개의 아미노산을 통하여 연결된 P. 팔시파룸의 서컴스포로조이트(CS) 단백질의 실질적으로 모든 C-말단 부분을 포함하는 하이브리드 단백질이다. 그의 전구조는 영국 특허 출원 제 9124390.7호로부터 우선권을 주장하여 WO93/10152호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/EP92/02591에 개시되어 있다. 효모에서 발현되는 경우, RTS는 리포단백질 입자로서 생성되며, HBV S항원과 함께 발현되는 경우, RTS,S로 공지된 혼합 입자를 생성한다. TRAP항원은 WO90/01496호로 공개된 국제 특허 출원 PCT/GB9800895에 개시되어 있다. 본 발명의 한 바람직한 구현예는 말라리아 백신으로, 상기 항원성 제제는 RTS,S 및 TRAP 항원의 조합물을 포함한다. 다단계 말라리아 백신의 성분의 후보가 될 가능성이 있는 플라스모디아 항원은 P. 팔시파룸 MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시궤스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, Pfs27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모디움 종의 이들의 유사체이다.

제형은 항종양 항원을 함유할 수 있고 암의 면역요법 치료에 유용할 수 있다. 예컨대. 애쥬번트 제형은 전립선, 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 산장 또는 흑색종 암과 같은 종양 거부반응 항원에 있어서 유용성이 있다. 예시적인 항원은 흑색종의 치료를 위한 MAGE1 및 MAGE3 또는 다른 MAGE 항원, PRAME, BAGE 또는 GAGE를 포함한다[Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical ＆ Laboratory Research(submitted 1997); Correale et al.(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293]. 사실, 이러한 항원은 흑색종, 페암종, 육종 및 방광 암종과 같은 광범위한 종양 유형에서 발현된다. 다른 종양 특이적 항원은 본 발명의 애쥬번트와 함께 사용하는데 적합하며, 전립선 특이적 항원(PSA) 또는 Her-2/neu, KSA(GA733), MUC-1 및 암태아성 항원(CEA)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 본 발명에 따른 애쥬번트 조성물 및 종양 거부반응 항원을 포함하는 백신을 제공한다.

추가적으로, 상기 항원은 많은 암의 치료, 또는 면역거세에서 전길이 고나도트로핀 호르몬 유리 호르몬(GnRH, WO95/20600)과 같은 자기 펩티드 호르몬, 짧은 10개 아미노산 길이 펩티드일 수 있다.

본 발명의 조성물은 보렐리아 종 유래의 항원을 함유하는 백신을 제제화하기 위하여 사용될 것으로 예상된다. 예컨대, 항원은 핵산, 병원체 유도 항원 또는 항원성 제제, 재조합적으로 제조된 단백질 또는 펩티드, 및 키메라 융합 단백질을 포함할 수 있다. 특히, 항원은 OspA이다. OspA는 명명된(Lipo-OspA) 숙주 세포(대장균)의 지질화된 형태 또는 비지질화된 유도체에 의해 완전 성숙된 단백질일 수 있다. 이러한 비지질화된 유도체는 인플루엔자 바이러스의 비구조 단백질(NS1)의 처음 81개 N 말단 아미노산을 가진 비지질화된 NS1-OspA 융합 단백질, 및 완전한 OspA 단백질, 및 기타를 포함하며, MDP-OspA는 3개의 추가적인 N 말단 아미노산을 보유한 OspA의 비지질화된 형태이다.

본 발명의 백신은 앨러지의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이러한 백신은 앨러지항원 특이적 항원(예컨대, Der p1) 및 앨러지항원 비특이적 항원(예컨대, 스탠워쓰(stanworth) 데카펩티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 인간 IgE로부터 유도된 펩티드(EP 0 477 231 B1))을 포함한다.

각 백신 투여량에서 단백질의 양은 전형적인 백신에서의 현저한, 불리한 부작용 없이 면역보호 반응을 일으킬 수 있는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 어떠한 명역원이 사용되고 어떻게 제공되는가에 따라 변화할 것이다. 일반적으로, 각 투여량은 단백질 1 내지 1000㎍, 바람직하게는 1 내지 500㎍, 바람직하게는 1 내지 100㎍, 가장 바람직하게는 1 내지 50㎍으로 포함할 것으로 예측된다. 특정한 백신에 대한 최적량은 피험자에서 적당한 면역 반응의 관찰을 포함한 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후에, 피험자는 적당한 간격으로 1회 또는 수회의 추가항원자극 면역법을 받을 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 원인물질 유래의 항원을 함유한 백신을 제형화하는데 사용될 것으로 예상된다. 예컨대, 항원은 GnRH 및 IgE 펩티드, 재조합적으로 제조된 단백질 또는 펩티드, 및 키메라 융합 단백질을 포함하여, 인간, 세균, 또는 바이러스 핵산, 병원체 유도된 항원 또는 항원성 제제, 종양 유도된 항원 또는 항원성 제제, 숙주 유도된 항원을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 경구적 경로를 통하여 투여될 수도 있다. 이러한 경우 약제학적으로 허용가능한 부형제는 알칼리성 완충액, 또는 장용성 캡슐 또는 마이크로과립을 포함할 수도 있다. 본 발명의 백신은 질 경로에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 경우에, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 유화제, 카르보폴(CARBOPOL)과 같은 중합체, 질 크림제 및 좌제의 기타 공지된 안정화제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 백신은 직장 경로에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 경우, 부형제는 직장 좌제 형성용으로 당해 분야에서 공지된 왁스 및 중합체를 포함할 수도 있다.

본 발명의 제형은 예방 및 치료 목적 양자 모두를 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 감염성 질환 또는 암, 또는 앨러지, 또는 자가면역 질환에 걸리기 쉽거나 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 측면에서, 의약용으로 본원에서 기술한 백신을 제공한다. 백신 제제는 Voller et al.[University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A, 1978]에 의해 발행된 New Trends and Developments in Vaccines에 일반적으로 기재되어 있다.

본 발명은 화학식(Ⅰ)의 계면활성제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 애쥬번트 제형의 제조에 있어서 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 화학식(Ⅰ)의 계면활성제 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 및 항원을 포함하는 백신 제형의 제조에 있어서 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도에 관한 것이다. 또한, 콜레스테롤을 함유하지 않는 상기 애쥬번트 제형 또는 백신의 제조에 있어서 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 비소포형 용액 또는 현탁액인 상기 상기 애쥬번트 제형 또는 백신의 제조에 있어서 화학식(Ⅰ)의 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도에 관한 것이다.

적당한 약제학적으로 허용가능한 부형제의 예는 물, 인산염 완충 식염수, 등장 완충 용액을 포함한다.

폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르의 다른 용어 또는 명칭이 CAS 등록에 기재되어 있다. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르의 CAS 등록 번호는 CAS 등록 번호 9002-92-0이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되지만 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항원 특이적 항체(Ab) 반응을 측정하기 위해 사용된 기술

OspA 특이적 혈청 IgG의 측정을 위한 ELISA:

Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS로 희석된 1㎍/㎖의 항원 OspA 50㎕/웰(플레이트의 B 내지 H열), 또는 PBS에서 1㎍/㎖의 정제된 염소 항-마우스 Ig(Boerhinger)(A열)로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트상의 빈 부위를 포화 완충액: 1% BSA, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN20), 및 4% 정상 소 혈청(NBS)을 함유한 PBS를 사용하여 블로킹하였다(1시간, 37℃). 그 다음에, 포화 완충액(웰당 50㎕)에 희석된 IgG 이소타입 혼합물의 일련의 2배 희석액(포화 완충액, 50㎕/웰)을 표준 곡선으로서 첨가하였고(Sigma로부터 입수한 마우스 모노클로날 항체 IgG1, IgG2a 및 IgG2b 혼합물을 200ng/ml에서 시작하여 A열에 놓았다) 혈청 샘플을 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN20))으로 세척(3회)하였다. 그 다음에, 포화 완충액으로 1/5000 희석된 비오틴화된 염소 항-마우스 IgG(Amersham)를 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다(50㎕/웰). 3회 세척 및 후속하여 스트렙트아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트 (Amersham)를 첨가한 후, 플레이트를 5회 세척하여 실온에서 20분간 시현 완충액(50mM pH 4.5 시트레이트 완충액중 OPDA 0.4mg/ml(Sigma) 및 H₂O₂0.03%) 50㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. 50㎕/웰 H₂SO₄2N을 첨가하여 시현을 중지시켰다. 광학 밀도를 492 및 630nm에서 Biorad 3550 면역판독기를 사용하여 판독하였다. 항체 역가를 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용한 4 파라미터 수학적 방법에 의해 계산하였다.

항-TT, 항-FHA 및 항-인플루엔자 IgG 역가를 OspA 코팅 항원을 TT, FHA, 또는 전체 인플루엔자 항원으로 대체함으로써 유사한 기술을 사용하여 측정하였다. TT를 상업적으로 입수가능한 공급원(Behring)에 의해 제공받았다. FHA를 EP 0 427 462 B에 기재된 방법에 의해 제조 및 정제하였다. β-프로피오락톤(BPL)으로 불활성화된 전체 인플루엔자 바이러스를 SSD GmBH(Dresden Germany)에 의해 공급받았다.

마우스에서 S. 뉴모니아(pneumoniae) 폴리사카라이드(PS14 및 PS19) 특이적 혈청 IgG의 측정을 위한 ELISA:

Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS로 희석된 5㎍/㎖(PS14) 또는 20㎍/㎖(PS19) 항원 100㎕/웰로 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN20))으로 세척(3회)하였다. 그 다음에, PS14 또는 PS19 특이적 모노클로날 Ab(mAb) IgG1의 일련의 2배 희석액(PBS TWEEN20, 웰당 100㎕)을 표준 곡선으로서 첨가하였고(PS14에 대하여는 785ng/ml 또는 PS19에 대하여는 2040ng/ml에서 시작하여 A열에 놓았다) 혈청 샘플(1/20 희석에서 시작하여 B 내지 H열에 놓았다)을 20℃에서 교반하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트에 첨가하여 희석하기 전에, 비특이적 반응을 제거하기 위하여 mAb 대조 및 혈청 샘플을 보통 폴리사카라이드(CPS)로 1시간 동안 37℃에서 프리인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS TWEEN20)으로 세척(3회)하였다. 그 다음에, PBS TWEEN20으로 1/5000 희석된 퍼옥시다아제-콘쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgG(Jackson)를 20℃에서 교반하에 30분 동안 인큐베이션하였다(100㎕/웰). 3회 세척 후에, 플레이트를 실온에서 15분간 시현 완충액(50mM pH 4.5 시트레이트 완충액중 OPDA 0.4mg/ml(Sigma) 및 H₂O₂0.03%) 100㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. 50㎕/웰 HCl 1N을 첨가하여 시현을 중지시켰다. 광학 밀도를 492 및 630nm에서 Biorad 3550 면역판독기를 사용하여 판독하였다. 항체 역가를 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용한 4 파라미터 수학적 방법에 의해 계산하였다.

원숭이에서 OspA 특이적 혈청 Ig Abs의 측정을 위한 ELISA:

Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS로 희석된 1㎍/㎖의 OspA 50㎕/웰로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트상의 빈 부위를 포화 완충액: 1% BSA, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN20)를 함유한 PBS를 사용하여 블로킹하였다(1시간, 37℃). 그 다음에, 대조 혈청의 일련의 2배 희석액(포화 완충액, 50㎕/웰)을 표준 곡선으로서 첨가하였고(60000 ELISA 단위/ml의 중간 역가를 가진 혈청, 12EU/ml에서 시작하여 B 내지 H열에 놓았다), 혈청 샘플을 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN20))으로 세척(3회)하였다. 그 다음에, 포화 완충액으로 1/3000 희석된 비오틴화된 염소 항-인간 Ig(Amersham)를 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다(50㎕/웰). 3회 세척, 및 후속하여 스트렙트아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(Amersham)를 첨가한 후, 플레이트를 5회 세척하여 실온에서 20분간 시현 완충액(50mM pH 4.5 시트레이트 완충액중 OPDA 0.4mg/ml(Sigma) 및 H₂O₂0.03%) 50㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. 50㎕/웰 H₂SO₄2N을 첨가하여 시현을 중지시켰다. 광학 밀도를 492 및 630nm에서 Biorad 3550 면역판독기를 사용하여 판독하였다. 항체 역가를 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용한 4 파라미터 수학적 방법에 의해 계산하였다.

항-인플루엔자 면역글로불린 역가를, OspA 코팅 항원을 β-프로피오락톤 (BPL)으로 불활성화되고, SSD GmBH(Dresden Germany)에 의해 공급받은 전체 인플루엔자 바이러스 항원으로 대체함으로써 유사한 기술을 사용하여 측정하였다.

원숭이에서 OspA 특이적 비강내 Ig Abs의 측정을 위한 ELISA:

Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS로 희석된 1㎍/㎖의 항원 OspA 50㎕/웰(플레이트의 B 내지 H열), 또는 PBS에서 5㎍/㎖의 정제된 염소 항-마우스 Ig(Boerhinger)(A열) 50㎕로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트상의 빈 부위를 포화 완충액: 1% BSA, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (TWEEN20), 및 4% 정상 소 혈청(NBS)을 함유한 PBS를 사용하여 블로킹하였다(1시간, 37℃). 그 다음에, 대조 분비물의 일련의 2배 희석액(포화 완충액, 웰당 50㎕)을 표준 곡선으로서 첨가하였고(3000 ELISA 단위/ml의 중간 역가를 가진 분비물, 30EU/ml에서 시작하여 A열에 놓았다), 비강 스웝(1/5 희석에서 시작, B 내지 H열에 놓았다)을 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.1% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN20))으로 세척(3회)하였다. 그 다음에, 포화 완충액중 0.2㎍/㎖의 비오틴화된 염소 항-인간 IgA(ICN)를 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다(50㎕/웰). 3회 세척, 및 후속하여 스트렙트아비딘-홀스래디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(Amersham)를 첨가한 후, 플레이트를 5회 세척하여 실온에서 10분간 시현 완충액(TMB, Biorad) 50㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. 50㎕/웰 H₂SO₄0.4N을 첨가하여 시현을 중지시켰다. 광학 밀도를 450 및 630nm에서 Biorad 3550 면역판독기를 사용하여 판독하였다. 항체 역가를 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용한 4 파라미터 수학적 방법에 의해 계산하였다. 샘플의 IgA 역가가 검정의 컷오프를 초과하는 경우(0.3EU/ml) 양성으로 간주한다.

lipo-OspA에 대한 혈청 LA2 유사 항체 역가의 측정을 위한 저해 검정

백신중의 항체 역가를 LA2 유사 특이성에 관하여 시험하였다. LA2는 세균의 표면에서 형태적 OspA 에피토프를 인지하는 쥐과동물 모노클로날 항체이며, 시험관내에서 B. 부르그도르페리(burgdorferi)를 죽일 수 있을 뿐만 아니라 실험실-증식된 스피로헤타(spirochete)와의 챌런지에 대하여 마우스를 보호하는 것으로 나타났다[Schaible UE et al. 1990. Proc Natl Acad Sci USA 87:3768-3772]. 또한, LA2 mab는 살균성 항체와 관련이 있는 것으로 나타났으며, 인간 혈청에 관한 연구는 또한 총 항-OspA IgG 역가 및 LA2 역가(ELISA에 의해 측정) 사이에 우수한 상관성을 밝혔다.

Maxisorp Nunc 면역플레이트를 PBS로 희석된 0.5㎍/㎖의 항원 lipo OspA 50㎕/웰로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅하였다. 플레이트상의 빈 부위를 포화 완충액으로 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다(포화 완충액 100㎕/웰: PBS/BSA 1%/Tween20 0.1%/NBS 4%). 4㎍/㎖에서 사작한 LA2 모노클로날 Ab(mAb)의 일련의 2배 희석액을 포화 완충액에서 희석하여(웰당 50㎕) 표준 곡선을 형성하였다. 백신으로부터 혈청 샘플의 희석액(1/10희석액에서 시작)을 또한 첨가하였고, 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 인큐베이션 후에 PBS/TWEEN20(0.1%)으로 3회 세척하였다. 포화 완충액에 희석된 LA2 mAb-퍼옥시다아제 콘쥬게이트 (1/10,000)를 각 웰에 첨가하여(50㎕/웰), 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 5회 세척 후에, 플레이트를 실온에서(어두운 상태에서) 20분간 시현 완충액(50mM pH 4.5 시트레이트 완충액중 OPDA 0.4mg/ml(Sigma) 및 H₂O₂0.03%) 50㎕/웰을 사용하여 인큐베이션하였다. H₂SO₄2N로 반응 및 색 형성을 중지시켰다. 광학 밀도를 492 및 630nm에서 Biorad 3550 면역판독기를 사용하여 판독하였다. LA2 유사 Ab 역가를 SoftMaxPro 소프트웨어를 사용한 4 파라미터 수학적 방법에 의해 계산하였다. LA2 유사 항체 역가를 표준 곡선과 비교하여 결정하였다.

실시예 2 OspA 항원을 사용한 마우스의 비강내 추가항원자극

8주된 암컷 Balb/c 마우스(군당 8마리)를 50㎍ 명반상의 1㎍의 항원 lipo-OspA로 근육내 면역시켰다. 3개월 후, 마우스를 A: 5㎍ lipo-OspA; B: 36% tween-20, 10% Imwitor 742중의 5㎍ lipo-OspA; C: 36% tween-20중의 5㎍ lipo-OspA; D: 18% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르중의 5㎍ lipo-OspA 어느 하나를 함유하는 용액(비공당 5㎕, 피펫으로 소적으로 투여) 10㎕로 비강내 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, IgG 및 LA2 항-OspA ELISA 에 의해 lipo-OspA에 대한 Abs에 대하여 혈청을 검정하였다(실시예 1 참조). 그 결과는(도 1 참조) 비강내 투여된 lipo-OspA가 전신적인 lipo-OspA 특이적 IgG 역가를 추가자극할 수 있음을 나타낸다. 이러한 추가자극은 단지 tween-20에 더하여 Imwitor 742 또는 tween-20의 존재에 의해 한도적으로 증가한다. 한편, 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르는 매우 현저한 추가자극을 유도한다. 유사한 패턴이 LA2 반응에 대해서 관찰된다(도 2 참조).

실시예 3 OspA 항원을 사용한 마우스의 비강내 추가항원자극

마우스군을 실시예 2에 기술된 바와 같이 초회항원자극시켰다. 그 다음에, 마우스를 5㎍ lipo-OspA 단독(A 및 C군)으로 또는 B: 1% 타우로콜산 나트륨; D: 1% 도데실-말토사이드; E: 36% tween 20 또는 F: 18% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 존재하에 추가항원자극시켰다(실시예 2에서 기술된 방법을 사용). A 및 B군에서의 실험이 C, D, D 및 F군에서의 실험과 다른 시기에 수행되었기 때문에, 이들은 이하 도면 상에서 분리한다(도 3 참조). 1% 타우로콜산 나트륨이 항원 단독에 있어서 얻어진 것을 초과하여 현저하게 추가항원자극을 보조하지 않는 것은 명백하다. 1%의 도데실-말토사이드, 또는 36%의 tween-20은 약한 애쥬번트 효과를 제공하지만, 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르만이 IgG 반응의 매우 현저한 중가를 제공한다. 유사한 효과가 LA2 반응에 대하여 관찰된다(도 4 참조).

실시예 4 마우스의 비강내 추가항원자극-투여량 범위 시험

상기 실시예에서 관찰된 비강 애쥬번트활성을 제공하는데 필요한 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 농도를 평가하기 위하여 본 발명자들은 투여량 범위 검정을 수행하였고, 이러한 효과가 기타 폴리옥시에틸렌 에테르를 사용하여 얻어질 수 있는 지를 증명하기 위하여 폴리옥시에틸렌-23 라우릴 에테르의 사용에 대하여 조사하였다. 실시예 1에서와 같이 초회항원자극된 마우스를 A: PBS; B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르; C: 2% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르; D: 5% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르; E: 1% 폴리옥시에틸렌-23 라우릴 에테르 또는; F: 10% 폴리옥시에틸렌-23 라우릴 에테르중 어느 하나에 5㎍ lipo-OspA를 함유한 10㎕로 비강내 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, 실시예 2에서와 같이 혈청을 분석하였다.

이하 도 5 및 6은 1%의 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 농도가 면역 반응의 매우 현저한 증가를 나타냄을 증명한다.

폴리옥시에틸렌-23 라우릴 에테르도 비강내 항원추가자극 반응을 현저하게 증가시킨다.

실시예 5 조합 백신-비강내 추가항원자극

비강내 추가항원자극 후에 전신 면역 반응의 증가에 대한 폴리옥시에틸렌의 적응성을 검토하기 위하여, 암컷 balb/c 마우스를 시판용 DTPa 백신(디프테리아, 파상풍, 악셀루라 백일해 백신: INFANRIX^TMSmithKline Beecham, Belgium)으로 근육내로 초회항원자극시켰다. 마우스를 인간 투여량의 20%에 상당하는 2X50㎕ 주사로 1회 근육내 초회항원자극시켰다. 3개월 후에, 마우스를 A: PBS; B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르중의 파상풍 독소(TT: 5㎍) 또는 필라멘트형 헤마글루틴(FHA: 5㎍)으로 비강내 추가항원자극(실시예 2에서와 같음); 또는; C: DTPa 백신(2X50㎕)을 근육내주사하여 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, TT 및 FHA 특이적 IgG에 대하여 혈청을 분석하였다. 역가를 도 7 및 8에 도시한다.

TT에 있어서, 단백질 그자체는 현저한 추가항원자극을 유도하지 않으나, 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르는 면역 반응을 현저하게 증가시킬 수 있다는 것은 분명하다. 놀랍게도, 이러한 애쥬번트의 존재하에서 비강내 추가항원자극에 의해 얻어진 반응은 면역 반응의 근육내 추가항원자극 후에 얻어진 것 보다 크다. FHA 그 자체의 투여는 애쥬번트로서 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 첨가에 의해 현저히 증가하는 면역 반응을 일으킨다.

실시예 6 AGMs의 비강내 추가항원자극

많은 애쥬번트가 소형 설치류에서 연구된 것으로 나타났으나, 보다 큰 포유동물에서 시험된 경우 효과가 없는 것으로 나타났다. 폴리옥시에틸렌 에테르가 보다 큰 종에서 수행된 경우, 비강내 추가항원자극에 대하여 애쥬번트 효과를 나타낼 수 있는지를 검토하기 위하여, 아프리카 녹색 원숭이(AGMs: 군당 4마리)를 근육내 주사에 의해 명반(500㎍)상 lipo-OspA(10㎍)으로 근육내 초회항원자극시켰다. 10분 후에 동물들을 A: PBS; 또는 B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르중 어느 하나에 60㎍의 ipo-OspA을 함유한 200㎕(마취하에서 Pffeiffer GmBH, Germany의 2회투여량 스프레이 장치로 비공당 100㎕ 투여)를 사용하여 비강내 추가항원자극시켰다. 14일 후에, 항-OspA 면역글로불린, 및 LA2 역가에 대하여 혈청을 검사하였다. 도 9 및 10은 각 군에 대한 기하 평균 역가를 나타낸다. 초회항원자극 및 추가항원자극 모두를 명반상 lipo-OspA의 근육내 주사에 의해 받은 10AGMs로 구성된 C군을 항-OspA 면역글로불린 반응에 대하여 검정하였다(LA2 역가에 대해서만 기하 평균 역가를 도시, 도 10).

lipo-OspA 단독은 원숭이에게 비강내 투여되는 경우 전신 반응을 증가시킬 수 있으나, 이러한 항원추가자극은 1% 폴리옥시에틸렌 9 라우릴 에테르의 첨가에 의하여 매우 현저하게 증가된다. 놀랍게도, 폴리옥시에틸렌 9 라우릴 에테르의 존재하에 비강내 추가항원자극후 얻어진 역가는 또한 근육내 주사후 얻어진 것보다 크다(C군).

실시예 7 AGNs의 비강내 초회항원자극 및 추가항원자극

상기 실시예에서, 본 발명자들은 폴리옥시에틸렌 에테르가 전신 반응의 비강내 추가항원자극을 보조할 수 있음을 설명하였다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 약한 동물을 전신 면역 반응을 일으키기 위하여 비강 경로에 의해 초회항원자극 및 추가항원자극할 수 있는지를 검토한다. 또한, 이러한 애쥬번트의 보다 큰 동물에 대한 적응성을 조사하기 위하여, 이러한 실험을 아프리카 녹색 원숭이(AGMs)에서 수행하였다.

아프리카 녹색 원숭이(AGMs: 군당 3마리)를 A: PBS; 또는 B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 200㎕(Pffeiffer GmBH, Germany의 2회투여량 스프레이 장치로 비공당 100㎕ 투여)로 투여되는 60㎍의 lipo-OspA를 사용하여 비강내 초회항원자극 및 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, 항-OspA 특이적 면역글로불린에 대하여 혈청을 검사하였다. 도 11은 lipo-OspA가 보조되지 않은 경우, 비강내 초회항원자극 및 추가항원자극후 전신 면역 반응이 검출될 수 없음을 보여준다. 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르가 애쥬번트로서 사용되는 경우, 이러한 백신접종 계획은 현저한 항-OspA 역가를 유도하였다.

실시예 8 영장류에서 lipo OspA 항원에 대한 전신 및 비강 체액성 면역 반응의 유도에 대한 CpG의 비강내 애쥬번트 효과

이 모델은 영장류의 초회항원자극 및 추가항원자극 모델에서 추가적인 면역자극제의 존재 여부에 따른 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르(POE-9LE)의 초회항원자극 및 추가항원자극 효과를 조사하기 위하여 고안하였다. 혈청 및 비강내 면역글로불린 반응을 측정하였다. 본 시험에서 사용된 면역자극제는 실시예 9에서 기술된 바와 같은 CpG 1001이었다.

실험 방법

아프리카 녹색 원숭이를 0일(pⅠ) 및 14일(pⅡ)에 비강내 초회항원자극 및 추가항원자극시켰다. 백신을 Pffeiffer사의 2회투여량 스프레이 장치를 사용하여 투여하였다(마취하에, 각 비공당 100㎕). 시험한 조성물은 하기와 같다:

lipo OspA에 대한 Ig Ab 역가는 14일째 후-pⅡ에 채취된 혈청에서 측정하였다. 항원 특이적 비강 IgA는 동시에 채취한 비강 스웝에서 매우 감도높은 ELISA를 사용하여 측정하였고, 동물은 이들의 IgA 역가가 기저 수준을 현저하게 초과한 미리지정된 수준을 초과하는 경우 양성인 것으로 간주하였다.

결과

혈청 OspA 특이적 면역글로불린

도 12는 14일째 후-pⅡ에 관찰된 혈청 항-lipo-OspA 면역글로불린 반응의 수준을 도시한다. 초회항원자극 및 추가항원자극 조성물로서 단독 투여된 lipo-OspA는 검출가능한 혈청 면역글로불린을 유도하지 않았다. 이러한 반응은 CpG의 존재하에서 개선되지 않았다. 0.5% 투여량이 이와 관련하여 훨씬 보다 효율적일지라도, 0.25% 및 0.5%의 POE-9 LE의 투여량은 CpG 단독으로 백신접종한 후에 관찰된 것 보다 더 큰 면역 반응을 나타내었다. 그러나, CpG와 조합된 경우, 0.25% 투여량은 0.5% 투여량에서 얻어진 것과 유사한 크기의 Ab 반응을 유도하며이는 CpG 및 POE 성분의 상승 효과를 의미한다.

비강 OspA 특이적 IgA

혈청 Ig 반응에 대하여 관찰된 바와 같이, lipo OspA를 단독 또는 CpG와 조합하여 함유한 백신은 검출가능한 비강 IgA Abs를 나타낼 수 없다(모든 비강 반응에 대한 개요에 관하여는 도 13 참조). 0.25% 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르과 조합하여 lipo OspA를 투여받은 동물의 25%만이 "비강 IgA" 양성인 것으로 나타났다(0.5% POE-9 LE에서는 50%). CpG가 0.25% POE 조성물에 첨가되는 경우, 100%의 동물이 IgA 반응을 나타낸다. 따라서, CpG 및 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르간의 상승작용은 점막 항체의 유도에 대하여도 얻어진다.

따라서, CpG 및 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르간의 상승작용은 항원 특이적 혈청 면역글로불린 및 비강 IgA의 유도에 있어서 원숭이에서 얻어진다.

실시예 9 lipo OspA 항원에 대한 전신 체액성 면역 반응의 추가면역자극에 대한 CpG의 비강내 애쥬번트 효과

하기 실시예는 쥐과동물 추가항원자극 모델에서 폴리옥시에틸렌 에테르(POE-9 LE) 애쥬번트 시스템에서 기타 면역자극제 첨가의 효과를 조사하기 위하여 고안하였다. CpG는 PCT WO96/02555에서 기술된 공지된 면역조절성 올리고누클레오티드이다. 이러한 백신 조성물에 의해 추가항원자극된 면역반응은 종래의 근육내 추가항원자극 백신접종에 의해 유도된 것 이상으로 높았다. 또한 조성물을 잘 알려진 비강내 애쥬번트인 대장균 유래의 열불안정성 엔테로톡신과 비교하였다.

본 실험에서 사용된 CpG 서열은 CpG 1001(TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT), CpG 1002(TCT CCC AGC GTG CGC CAT), 및 음성 대조인 비면역자극성 서열 CpG 1005(TCC ATG AGC TTC CTG AGC TT)이었다.

실험 방법

balb/c 마우스를 0일째에 50㎍ 수산화 알루미늄에 흡착시킨 1㎍ lipo OspA를 함유한 백신 100㎕의 근육내 투여에 의하여 초회항원자극시켰다. 107일 째에, 마취하에서 마이크로피펫으로 비강 점적 투여에 의해 10㎕(각 비공당 5㎕)로 비강내 추가항원자극을 제공하였다. 6마리 마우스 군을 하기 백신 조성물을 사용하여 비강내(i.n.) 또는 근육내(i.m.)로 추가항원자극시켰다:

추가항원자극일, 및 추가항원자극 후 14일째에(pⅡ) 출혈을 실시하였다. OspA 및 LA2 역가에 대한 특이적 혈청 IgG 역가를 각 혈청에 대하여 ELISA에 의해 결정하였다.

결과

도 14(항원 특이적 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 OspA 특이적 혈청 IgG를 도시), 및 도 15(혈청중 살균성 LA2 역가를 도시)에서 도시된 바와 같이, CpG 단독에 의해서는 혈청 OspA 특이적 Ab 반응의 개선이 제공되지 않았다. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와의 OspA 조성물은 결과적인 IgG 및 LA2 역가를 증가시켰다. lipo-OspA가 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 및 양자 모두와 함께 제형화될 때 최상의 반응이 관찰되었다.

실시예 10 투여량 시험

실시예 4에서 기술된 바와 같이, 1%의 폴리옥시에틸렌 라우릴-9 에테르의 농도는 면역 반응의 매우 현저한 증가를 나타낸다. 상기 실시예에서 관찰된 비강 애쥬번트활성을 제공하기 위해 필요한 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 농도를 검토하기 위하여, 보다 낮은 투여량으로 투여량 범위 검정을 실시하였다.

실시예 2에서와 같이 초회항원자극된 마우스를 A: PBS; B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르; C: 0.5% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르; D: 0.25% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르중 어느 하나에 5㎍ lipo-OspA를 함유한 10㎕로 비강내 추가항원자극시키거나; 또는; E: 50㎍ 명반상에 흡착된 1㎍ lipo-OspA의 근육내 주사에 의해 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, 실시예 1에서와 같이 혈청을 분석하였다.

결과

하기 도 16 및 17은 0.25%의 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르가 매우 현저한 면역 반응의 증가를 나타냄을 도시한다. 이러한 낮은 투여량의 애쥬번트에서도, 달성된 Ab 반응은 비경구적 백신에 의해 나타난 것과 유사하다.

실시예 11 마우스에서 항-인플루엔자 백신접종

비강내 추가항원자극후 전신 항-인플루엔자 면역 반응의 증가에 대한 폴리옥시에틸렌 에테르의 적응성을 검토하기 위하여, 암컷 Balb/c 마우스를 고전적인 1가의 스플릿 인플루엔자 백신으로 근육내로 초회항원자극시켰다. 마우스를 0일째 및 14일째에 A/싱가포르/6/86 스플릿 모노벌크의 1.5㎍ 당량 헤마글루티닌 A(HA)를 함유한 100㎕ 주사로 2회 근육내 초회항원자극시켰다. 3개월 후에, 마우스를 A: PBS; B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르중 불활성화된 전체 A/싱가포르/6/86 바이러스의 1.5㎍ 당량 HA로 비강내 추가항원자극시키거나(실시예 2에서와 같음); 또는; C: 스플릿 A/싱가포르/6/86 백신(.5㎍ 당량 HA)의 근육내 주사에 의해 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, A/싱가포르/6/86 바이러스 특이적 IgG에 대하여 혈청을 분석하였다.

결과

역가는 도 18에 도시한다. 단순한 항원 그 자체는 현저한 추가항원자극을 유도하지 않으나, 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르는 면역 반응을 현저하게 증가시킬 수 있다. 이러한 애쥬번트의 존재 하에서 도달된 Ab 역가는 비경구적 백신에 의해 나타난 것 이상이다.

실시예 12 원숭이에서 항-인플루엔자 백신접종

실시예 11에서, 본 발명자들은 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르가 마우스에서 인플루엔자 항원의 면역원성을 증가시키는 것을 증명하였다. 이러한 계면활성제가 보다 큰 종에서 유사한 애쥬번트 효과를 나타낼 수 있는지를 검토하기 위하여, 아프리카 녹색 원숭이(AGMs: 군 및 혈액 채취일당 2마리)를 A: PBS; B: 0.5% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르 200㎕중에 불활성화된 전체 A/베이징/262/95 바이러스의 50㎍ 당량 HA로 비강내 초회항원자극 및 추가항원자극시켰다(실시예 6에서와 같음). 추가항원자극 2, 7 및 14일에, A/베이징/262/95 바이러스 특이적 Ig Abs에 대하여 혈청을 분석하였다. 도 19는 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르가 애쥬번트로서 사용되는 경우, 인플루엔자 항원에 대한 면역 반응이 개선되는 것을 명백히 나타낸다.

실시예 13 폴리사카라이드 항원을 사용한 백신접종 시험

상기 실시예는 단백질 유형 항원에 대해 나타내는 면역 반응을 보조하는 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 능력을 설명한다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 본 애쥬번트가 비경구적으로 초회항원자극된 마우스에서 비강 도달된 폴리사카라이드 항원의 항원자극 효과를 증가시킬 수 있는지를 검토하였다. 마우스를 단백질 D 담체에 콘쥬게이팅된 S. 뉴모니아 PS14 및 PS19 폴리사카라이드를 함유한 100㎕ 주사액으로 피하로 1회 초회항원자극하였다. 2개월 후에, 마우스를 A: NaCl 150mM pH 6.1; B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르중 어느 하나에 1㎍ PS14 및 1㎍ PS19 콘쥬게이트를 함유한 용액 40㎕(0시간에서 비공당 10㎕ 투여한 다음 30분후 다시 비공당 10㎕ 투여)로 비강 추가항원자극시켰다(마취 하에서). 추가항원자극 14일 후에, 혈청을 PS14 및 PS19 특이적 IgG Abs에 대하여 검정하였다.

결과

도 20 및 21에 도시한 바와 같이, PS14 또는 PS19 자체의 투여는 애쥬번트로서 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 첨가에 의해 더욱 증가되는 추가항원자극반응을 유도한다.

실시예 14 폴리옥시에텔렌-8 스테아릴 에테르

폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르의 애쥬번트 효과가 다른 폴리옥시에틸렌 에테르를 사용하여 달성될 수 있는 것을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 폴리옥시에틸렌-8 스테아릴 에테르의 사용을 검토하였다.

실시예 2에서와 같이 초회항원자극된 Balb/c 마우스를 A: PBS; B: 1% 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르; C: 1% 폴리옥시에틸렌-8 스테아릴 에테르중 어느 하나에 5㎍의 lipo-OspA를 함유한 10㎕로 비강내 추가항원자극시키거나; 또는; 50㎍ 명반에 흡착시킨 1㎍의 lipo-OspA의 근육내 주사에 의해 추가항원자극시켰다. 추가항원자극 14일 후에, 실시예 1에서와 같이 혈청을 분석하였다.

결과

도 22 및 23은 폴리옥시에틸렌-8 스테아릴 에테르가 항원에 대한 추가항원자극반응을 증가시키는데 폴리옥시에틸렌-9 라우릴 에테르와 같은 효능이 있음을 나타낸다. 두 폴리옥시에틸렌 에테르를 사용하여 도달된 Ab 역가는 비경구적 백신에 의해 나타난 것과 유사하다.

Claims

약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스테르, 및 항원 또는 항원성 조성물을 포함하는 백신 조성물로서, 폴리옥시에틸렌 또는 에스테르가 소포의 형태가 아닌 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
하기 화학식(Ⅰ)의 계면활성제, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 및 항원 또는 항원성 조성물을 포함하는 백신 조성물로서, 계면활성제가 소포의 형태가 아닌 것을 특징으로 하는 백신 조성물:

상기식에서,

n은 1 내지 50이고,

A는 결합선 또는 -C(O)-이며,

R은 C_1-50알킬 또는 페닐 C_1-50알킬이다.
제 2항에 있어서, n이 4 내지 24인 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항에 있어서, n이 9인 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, R이 C_8-20알킬 또는 페닐 C_8-20알킬인 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, R이 C₁₂알킬 또는 페닐 C₁₂알킬인 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, A가 결합선이어서 에테르를 형성하는 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, A가 -C(O)-이어서 에스테르를 형성하는 화학식(Ⅰ)의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 2항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제의 농도가 0.1 내지 10% 범위인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제의 농도가 0.25 내지 1% 범위인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 또는 항원성 조성물이 인간 면역결핍증 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 타입 1, 단순 헤르페스 바이러스 타입 2, 인간 거대세포바이러스, 뎅구 바이러스, A, B, C 또는 E형 간염 바이러스, 호흡기 합포 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 힙(Hib), 수막염 바이러스, 살모넬라, 나이세리아, 보렐리아, 클라미디아, 보르데텔라, 스트렙토콕커스, 마이코플라스마, 마이코박테리아, 헤모필루스, 플라스모디움 또는 톡소플라스마, 스탠워스 데카펩티드 또는 종양 관련 항원(TMA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2neu, LnRH, CEA, PSA, KSA, 및 PRAME로 구성된 군으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 기타 애쥬번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, LT, CT, MLP, CpG 및 QS21로 구성된 군으로부터 선택된 기타 애쥬번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 15항에 있어서, CpG 애쥬번트가 TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 군중 어느 하나로 구성된 비히클을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물:

카이토산 또는 다른 다가양이온성 중합체, 폴리락티드 및 폴리락티드 코글리콜라이드 입자, 폴리사카라이드 또는 화학적으로 수식된 폴리사카라이드로 구성된 입자, 또는 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자.
애쥬번트 조성물 제조에 있어서, 비소포형 형태로 애쥬번트 조성물내에 존재하는 것을 특징으로 하는 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르의 용도.
애쥬번트 조성물 제조에 있어서, 비소포형 형태로 애쥬번트 조성물내에 존재하는 것을 특징으로 하는 화학식(Ⅰ)의 계면활성제의 용도.
바이러스성, 세균성, 기생충성 감염, 앨러지, 또는 암의 치료용 백신의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 백신 조성물의 용도.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 조성물을 안전 및 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 병원체성 감염, 또는 암, 또는 앨러지를 앓거나 걸리기 쉬운 포유동물의 치료 방법.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 조성물을 안전 및 유효량으로 점막 투여하는 단계를 포함하는, 병원체성 감염, 또는 암, 또는 앨러지를 앓거나 걸리기 쉬운 포유동물의 치료 방법.
제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 조성물을 안전 및 유효량으로 비강내 투여하는 단계를 포함하는, 병원체성 감염, 또는 암, 또는 앨러지를 앓거나 걸리기 쉬운 포유동물의 치료 방법.
폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 및 항원 또는 항원성 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는, 제 1항의 백신 조성물의 제조 방법.
화학식(Ⅰ)의 계면활성제, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 및 항원 또는 항원성 조성물을 혼합하는 단계를 포함하는, 제 2항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 백신 조성물의 제조 방법.
폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르를 포함하는 애쥬번트 조성물로서, 애쥬번트 조성물이 소포의 형태가 아닌 것을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
의약용임을 특징으로 하는 본원에 청구된 백신 또는 애쥬번트.