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CN107849119A - 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗 - Google Patents

用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗 Download PDF

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CN107849119A
CN107849119A CN201680038699.8A CN201680038699A CN107849119A CN 107849119 A CN107849119 A CN 107849119A CN 201680038699 A CN201680038699 A CN 201680038699A CN 107849119 A CN107849119 A CN 107849119A
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Abstract

公开了用于预防或治疗免疫球蛋白E(IgE‑)相关疾病的疫苗，其包含与药学上可接受的载体结合的肽，其中所述肽选自QQQGLPRAAGG(SEQ ID No.109；p9347)、QQLGLPRAAGG(SEQ ID No.110；p8599)、QQQGLPRAAEG(SEQ ID No.111；p8600)、QQLGLPRAAEG(SEQ ID No.112；p8601)、QQQGLPRAAG(SEQ ID No.113；p9338)、QQLGLPRAAG(SEQ ID No.114；p9041)、QQQGLPRAAE(SEQ ID No.115；p9042)、QQLGLPRAAE(SEQ ID No.116；p9043)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)、HSGQQLGLPRAAGG(SEQ ID No.118；p8596)、HSGQQQGLPRAAEG(SEQ ID No.119；p8597)、HSGQQLGLPRAAEG(SEQ ID No.120；p8598)、QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)、GSAQSQRAPDRVL(SEQ ID No.122；p7577)和WPGPPELDV(SEQ ID No.125；p7585)。

Description

用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗
本发明作为产品专利涉及用于治疗和预防IgE相关疾病的主动疫苗接种。
IgE介导致敏个体中对微量变应原的速发型超敏反应。变态反应的功效基于IgE的局部存在、粘膜中肥大细胞上高亲和力IgE受体的上调和IgE与其受体的特别缓慢的解离。然而，该最罕见的免疫球蛋白同种型不仅构成“变应原-受体”，而且还在寄生物感染、肿瘤免疫和自身免疫疾病中起作用。随着多种过敏性疾病和并存病中临床抗IgE试验的出现，一系列IgE依赖性和IgE相关性疾病正在得到鉴定[Holgate，2014]。在工业化社会中，变态反应的发生率目前达到10-30％。因此，多方面努力来致力于开发靶向IgE途径，特别是IgE分子本身的新药物。最近，有证据表明IgE也可能在炎症和变态反应相关疾病(包括慢性荨麻疹、特应性皮炎、过敏性胃肠病和各种(自身)免疫介导的疾患)的扩展领域中发挥作用[Holgate 2014]。因此，已认为治疗性和预防性IgE靶向是越来越多疾病面临的主要挑战。因此，对负担得起且广泛适用的抗IgE治疗剂的需求日益增加。
IgE主要作为可溶性血浆蛋白、或者作为被例如肥大细胞或嗜碱性粒细胞上其高亲和力IgE-受体或低亲和力受体捕获的受体结合蛋白存在。或者，在罕见的IgE转换细胞，如膜IgE阳性B细胞上发现该分子为B细胞受体(即IgE-BCR)，所述IgE转换细胞在抗原或变应原刺激后将最终分化为产生IgE的浆细胞。因而，受体结合的IgE介导效应细胞如例如肥大细胞上的过敏性应答，而IgE-BCR是B细胞刺激或抑制所需要的膜整合受体，这分别取决于共刺激信号的存在或缺乏。
在变态反应中，可溶性血浆IgE通过其可变区识别多价变应原，并通过其恒定链与IgE受体结合。因此，IgE受体信号传导通过携带IgE受体的细胞而介导器官特异性和全身性变应性反应。因此，通过原型(prototypic)抗IgE抗体阻断IgE/IgE-受体相互作用有效降低血浆IgE水平，从而减轻变态反应患者的临床症状[Milgrom 1999]。当靶向IgE/IgE-受体竞争时需要非常高的亲和力。另一方面，为了将IgE结合限制于IgE的可溶性形式，而不是例如嗜碱性粒细胞和肥大细胞上存在的IgE的受体结合形式(其可能触发不想要的严重过敏反应(anaphylaxia))，需要高特异性。随着的发展，这种靶向原理已经发展成为得到充分验证的治疗性和商业上成功的治疗方法，用于治疗严重的疗法抗性哮喘。同时，利用越来越多的使用的标签外(off label)探索性试验[Incorvaia 2014]扩展了IgE靶向领域。预期的是，针对新的IgE相关的临床适应症，特征为改善的功效和药物特性的第二代治疗性抗IgE抗体将迅速进展[Holgate 2014]。
尽管取得了成功，但是几种局限性已经阻止了应用于更广泛的IgE相关的适应症。这包括儿科疾患、食物变态反应、变态反应的较轻度表现，如过敏性鼻结膜炎和过敏性哮喘的轻度表现中的应用，或者在另一个极端情况下，在非常高的IgE-疾病中的应用。用于治疗性抗体的产品成本通常较高，并且需要例如对于对具有400-500IU/ml IgE血浆水平的70-80kg患者每两周一次375mg s.c.注射。由于此类剂量，该药物未批准用于非常高IgE患者或重度和超重患者，并且对于广泛的疾病，例如过敏性鼻结膜炎而言负担不起。限制使用的其它原因包括在某些疾患，例如食物变态反应中不利的风险收益比、功效缺乏或患者依从性或者仅仅是在哮喘患者亚组中缺乏功效。按照定义，被动施用的抗可溶性IgE抗体如需要固有的高剂量以满足药效学需求。
预计给药方案的修改将不会显著减轻目前抗IgE疗法的给药限制或降低财务负担[Lowe等，2015]。由于这些限制，已经开发和验证了备选的IgE靶向机制，其解决IgE供应而不是受体/配体相互作用：
与可溶性IgE相反，IgE的膜形式代表IgE-BCR。这种形式是由IgE重链转录物的3’末端处的可变剪接延伸产生的，所述重链转录物在分化的IgE转换细胞中表达[Achatz2008综述]。可变剪接编码包含位于第四个免疫球蛋白结构域的C末端的三个额外结构域的蛋白质的延伸变体，其包含所谓的细胞外近膜端结构域(EMPD)，随后是受体分子的跨膜和胞内域。IgE-EMPD对于IgE-BCR是独特的，因此仅存在于IgE转换的B细胞上。通过IgE-BCR的信号传导最终将导致B细胞分化成产生IgE的浆细胞，而所述产生IgE的浆细胞继而会在正反馈循环中激起IgE介导的过敏反应。
先前已经显示，BCR的交联诱导细胞凋亡[Benhamou 1990]，并且当应用交联IgE-BCR的抗体以抑制IgE产生时，类似的构思可以用于例如变态反应中的治疗目的[Chang1990；Haba 1990]。基于该建议，通过针对膜IgE的组分的被动或主动免疫来靶向抗体应该是可行的，所述抗体不会与可溶性IgE或固定在例如肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE(其会提供肥大细胞释放反应和过敏反应的风险)反应。之前已经在各种模型中使用针对IgE-BCR的EMPD区的单克隆或多克隆抗体[WO 1998/053843 A1；Chen 2002；Feichtner 2008；Brightbill 2010]提供了这个构思的体外和体内证据[Inführet等2005]。或者，显示来自针对膜IgE-EMPD免疫的小鼠的免疫血清能够在膜IgE-EMPD表达细胞中促进体外细胞凋亡和ADCC，由此表明这种方法也可以通过主动免疫代替被动免疫来完成(如Lin等2012；WO2004/000217 A2；EP 1 972 640 A1；US 2014/0220042 A1以前提出)。
在早期，例如在US5,274,075A、WO 1996/012740 A1和WO 1998/053843 A1中进一步提出了通过针对IgE EMPD区域的主动疫苗接种来解决IgE-BCR的构思。最初的想法是在没有共刺激信号的情况下，IgE-BCR的交联最终导致通过各种细胞机制抑制IgE产生[Wu2014]。另外的细胞机制可能有助于IgE-BCR靶向策略的体内作用模式。这些机制包括无反应性(anergy)[Batista 1996]、细胞凋亡[Poggianella 2006]、补体依赖性细胞溶解[Chen2002]或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)[Chen 2010]。总之，IgE EMPD靶向有效降低血浆IgE，如过敏性疾患中所证实[Gauvreau 2014]。与可溶性IgE靶向(例如用)相反，膜IgE靶向解决IgE供应而不是通过其受体进行的效应器功能或清除游离血浆IgE。
WO 2010/097012 A1公开了抗CεmX抗体对β淋巴细胞上人m/gE的结合。WO 2008/116149 A2涉及细胞凋亡性抗IgE抗体。WO 69/12740 A1公开了用于治疗变态反应的合成IgE膜锚定肽免疫原。
尽管抗体治疗剂获得了成功，但当使用重组大型治疗性分子如抗体或相关支架时，被动免疫的普遍担忧仍然是抗药物抗体(ADA)的诱导。根据定义，抗IgE疗法需要重复给药的长期治疗。同时，当大量的重组蛋白必须在较长的治疗期间内重复施用时，ADA诱导的风险变得特别相关。迄今为止，特别当重组生物药物与人血浆混合时倾向于聚集时，不能可靠地预测针对大蛋白质治疗剂的ADA诱导的风险。因此，需要进行广泛的临床试验，同时，关于由抗药物抗体(ADA)引起的问题以及现代生物制剂的免疫原性的原因和结果的公开讨论受到来自工业的商业和战略利益的限制[Deehan 2015]。另一方面，T细胞免疫原性需要严格的临床前评估[Jawa 2013]。此外，大生物制剂的产品成本继续对公共卫生系统构成挑战，尤其是若生物药物如例如单克隆抗体应当应用于“较轻度”适应症，例如过敏性鼻炎和结膜炎或非过敏性疾患，如例如慢性荨麻疹，其中IgE途径在发病机制中起促进作用。
本发明的目的是为所有类型的IgE介导的疾病，特别是也对于那些下述疾病提供有效的、成本有效的、安全的和长效的预防或治疗方案，所述疾病目前由于成本原因、患者依从性或由于注射重组生物药物如人源化单克隆抗体引起的不良反应而不用被动免疫治疗。另一方面，如果选择主动免疫作为此类方案，则还希望避免针对靶标本身的细胞毒性和辅助性T细胞反应，以消除自身免疫样副作用的风险。该方案必须对疾病具有特异性，而患者免疫系统的正常免疫表现不应受到药物施用的妨碍。
因此，本发明提供了用于预防或治疗免疫球蛋白E(IgE-)相关疾病的疫苗，其包含与药学上可接受的载体结合的至少一种肽，其中所述肽选自QQQGLPRAAGG(SEQ ID No.109；p9347)、QQLGLPRAAGG(SEQ ID No.110；p8599)、QQQGLPRAAEG(SEQ ID No.111；p8600)、QQLGLPRAAEG(SEQ ID No.112；p8601)、QQQGLPRAAG(SEQ ID No.113；p9338)、QQLGLPRAAG(SEQ ID No.114；p9041)、QQQGLPRAAE(SEQ ID No.115；p9042)、QQLGLPRAAE(SEQ IDNo.116；p9043)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)、HSGQQLGLPRAAGG(SEQ IDNo.118；p8596)、HSGQQQGLPRAAEG(SEQ ID No.119；p8597)、HSGQQLGLPRAAEG(SEQ IDNo.120；p8598)、QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)、GSAQSQRAPDRVL(SEQ IDNo.122；p7577)和WPGPPELDV(SEQ ID No.125；p7585)(下文称为“本发明的肽”或“本发明肽”)。
根据本发明的肽用于主动抗EMPD疫苗接种，用于治疗和预防IgE相关疾病。IgE相关疾病包括过敏性疾病，如季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒物植物、药剂/药物、昆虫、蝎子或蜘蛛毒液、乳胶或粉尘变态反应、宠物变态反应、过敏性支气管哮喘(allergic asthmabronchiale)、非过敏性哮喘、Churg-Strauss综合征、过敏性鼻炎和结膜炎、特应性皮炎、鼻息肉病、木村氏病(Kimura’s disease)、对粘合剂、抗菌剂、香料、染发剂、金属、橡胶组分、局部药剂、松香、蜡、抛光剂、粘固剂和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎(chronicrhinosinusitis)、特应性湿疹、其中IgE起作用的自身免疫疾病(“自体变态反应”)、慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症、过敏性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应、免疫治疗、嗜酸性粒细胞相关疾病如嗜酸性粒细胞性哮喘、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、嗜酸性粒细胞性中耳炎和嗜酸性粒细胞性食管炎(参见例如Holgate 2014、US 8,741,294B2、Usatine 2010)。此外，根据本发明的肽用于治疗淋巴瘤或预防抗酸治疗的敏化副作用，所述抗酸治疗特别是用于胃或十二指肠溃疡或返流。对于本发明，术语“IgE相关疾病”包括术语“IgE依赖性疾病”或“IgE介导的疾病”或与其同义使用。
响应于被动施用的生物制剂的限制，因此，本发明提供了安全的主动疫苗接种方法。根据本发明，在患者中诱导抗IgE EMPD应答，其提供长效IgE抑制。与紧密配合的被动免疫方案相反，主动免疫以更低成本需要更少的注射。“治疗性”或“预防性”主动接种方法的优点在于开发机体自身的体液免疫应答，以避免施用大量“外来”重组蛋白质或生物药物，其可能因为它们的分子大小和抗原性而诱导不需要的抗药物抗体(ADA)。此外，安全性前提条件要求疫苗制剂，其将抗IgE EMPD免疫严格限于体液系统(即疫苗诱导的抗体)，同时避免针对IgE EMPD的细胞毒性或辅助性T细胞反应。在此背景下，先前提出使用乙型肝炎病毒核心抗原缀合的肽疫苗来主动诱导抗膜IgE-EMPD靶向免疫应答[Lin 2012]。主动抗IgE-EMPD疫苗的这项提议当在IgE的相关疾病中通过主动接种作为治疗方式解决IgE EMPD时并没有考虑到自身反应性T细胞的安全问题。例如，可以在使用肽疫苗接种以在多发性硬化的EAE动物模型中有意诱导实验性脑炎时观察自身反应性T细胞诱导[Petermann 2011]。由疫苗肽诱导的不希望的T细胞反应的另一个例子是例如使用含有Abeta肽的T细胞表位的失败的临床疫苗试验[Pride 2008]。迄今为止，不能排除针对IgE EMPD(作为自身抗原)的可能的自身反应性T细胞应答的高风险。因此，与现有技术提议相比，与本发明的疫苗一样避免任何类型的辅助性、细胞毒性或抑制性T细胞应答的疫苗显然是有利的：治疗性肽疫苗的想法是严格绕过任何“天然的”、“自身”T细胞表位以避免不可控制的自身反应性T细胞，其可能引起不期望的自身免疫样疾患。相反，应该有效诱导产生与期望目标如IgE EMPD有效交叉反应的抗体的体液免疫应答。
与先前提出的抗IgE-EMPD活性疫苗肽和蛋白质不同，本发明的疫苗含有更短的肽，其不含任何不期望的T细胞表位。尤其是与载体如例如KLH或CRM或病毒体、基于VLP或聚合物的载体组合，所述载体暴露高密度的B细胞表位及与之组合的用于T细胞刺激的确定T细胞表位。或者，可以使用颗粒，其包括含有脂质体、胶束或聚合物纳米颗粒(例如在专利WO2007127221中提出)的载体部分。它们基本上能够由于抗原肽的密集暴露而诱导抗EMPD特异性B细胞应答，而T细胞的帮助仅由载体上或内部存在的T细胞表位，而不是在疫苗制剂的B细胞表位(即本发明的肽本身)贡献。如果在此类优选实施方案中(并且与Lin 2012提出的病毒样颗粒(VLP)相反)，肽通过惰性接头连接至载体表面而不是作为重组VLP蛋白的整合部分，那么没有获得针对IgE的特异性且非意图的T细胞应答。此外，基于其短的大小，开发了本发明的疫苗肽，从而不诱导不期望的脱靶应答，如在本实施例中观察到的，或者利用靶向膜IgE EMPD的不同表位的现有技术抗体所观察到的[Chowdhury 2012]。
总之，本发明提出了在携带IgE-BCR的靶细胞上特异性诱导抗体介导的效应器功能例如IgE-BCR交联、ADCC和细胞凋亡的特异性抗IgE EMPD疫苗肽。与先前提出的疫苗相反，本发明提供了下述疫苗肽，其(1)缺乏T细胞表位和(2)在保持相当大的生物学/细胞活性的同时缺乏诱导脱靶抗体的增加的风险。
因此(以及如在下面的实施例部分中广泛地显示)，根据本发明的肽作为活性B细胞疫苗比现有技术中先前提出的掺入载体蛋白或与之组合的肽或其它EMPD衍生蛋白或肽序列优越。这些优越的性质从实施例部分明显可见，在所述实施例部分中将本发明的肽的优越性与现有技术疫苗候选物(例如Lin等2012；WO 2004/000217 A2；EP 1972640 A1；US2014/0220042 A1)比较。这些结果显示那些现有的提议不如根据本发明的肽那样适合于主动B细胞疫苗接种。
例如，根据本发明的肽不与I类HLA结合，因此不能诱导I类HLA限制性细胞毒性T细胞应答。
具体而言，根据本发明的11和12聚体的肽根据定义不能有效地结合II类HLA，因为它们太短，并因此通常不会诱导II类HLA限制性T辅助应答。
根据本发明的肽是免疫原性的并且与其它肽相比，诱导的抗体更好地结合膜IgE-BCR膜IgE-EMPD。与之前提出的肽相反，本发明的肽在诱导脱靶效应和非特异性结合例如来自PBMC的未知细胞表面蛋白质的抗体方面是安全的(Lobert，2013；McIntush，2013；Ahmed，2015)。根据本发明的肽能够诱导介导功能膜IgE-BCR交联的抗体应答，所述功能膜IgE-BCR交联经由BCR诱导信号传导以驱使细胞凋亡。与源自IgE EMPD区域的其它短肽相比，本发明的肽在膜IgE-BCR交联中比现有技术衍生的长肽更有效，并且至少与现有技术衍生的长肽一样有效。它们的交联有效性可以通过组合两种或更多种短肽来增强。
根据本发明的肽具有诱导ADCC/CDC的潜能，这两者都有助于其功能活性(如之前针对其它抗EMPD抗体所证明)。
根据本发明的肽能够诱导对EMPD肽显示出亲和力的抗体。这与在与长肽产生的抗体相似的范围内膜IgE交联/信号诱导关联起来。
根据本发明的肽能够抑制自源自携带人EMPD取代内源性EMPD序列的转基因小鼠的小鼠脾细胞的IgE分泌。
而且，本发明的肽能够抑制来自人PBMC的IgE分泌。
本发明的肽还包含天然序列的肽变体其含有与天然序列相比提供相似或改进的免疫原性、安全性、特异性和功能活性的某些氨基酸取代。例如，甚至特定的双重氨基酸取代(例如p9347(SEQ ID No.109)所示例的)与天然序列相比显示出显著改善的性质。
由根据本发明的肽(和)引发的抗体特异性针对人IgE-EMPD。主动免疫优于单克隆抗体的被动免疫的主要优点在于个体和/或健康护理系统的成本较低，在完成该方案后推测较长的免疫应答持续时间以及由于应答的多克隆性质引发抗药物抗体的较低可能性。
根据本发明的疫苗由与药学上可接受的载体结合的膜IgE特异性肽组成。该载体可以直接与根据本发明的肽偶联。也可以在肽和载体之间提供某些接头分子。提供此类接头可以导致疫苗的有益特性，例如，改善的免疫原性、改善的特异性或改善的处理(例如由于改善的溶解度或配制能力)。根据优选的实施方案，根据本发明的肽含有至少一个半胱氨酸残基，其作为接头与肽的N-或C-末端结合。尽管肽的两个取向(即N-或C-末端连接的变体)对于实施本发明是可接受的，但是对于一些肽来说可以优选使用N-或C-末端变体，因为这些变体之一与另一个相比可以提供有利的作用(例如关于HLA结合性质)。尤其优选的实例是根据SEQ ID No.1至14和17的肽。然后可以使用该半胱氨酸残基将肽与载体共价偶联(“连接”)。
因此，在根据本发明的优选疫苗中，肽通过接头与载体结合。接头可以是药学上合适且可接受的任何共价或非共价结合的化学连接部分。根据优选的实施方案，接头是肽接头，特别是具有1-5个氨基酸残基的肽接头。优选的肽接头是已经在疫苗技术中应用和/或批准的肽接头；包含半胱氨酸残基或由半胱氨酸残基组成的肽接头是特别优选的，例如Gly-Gly-Cys、Gly-Gly、Gly-Cys、Cys-Gly和Cys-Gly-Gly。或者，可以将这些肽接头氨基酸替换为带电荷的氨基酸或与带电荷的氨基酸组合，以保证溶解性或肽表位与载体的物理间隔。
其它优选的接头部分是化学偶联分子，其已经在药物制剂中使用(并且已知是安全的)，并且保护根据本发明的肽和药学上可接受的载体之间的有效连接。也已经预见此类接头在提出或用于药物制剂的缀合物中作为“间隔物”来提供两个化学部分(本文：在肽和载体之间)之间的空间距离。例如，具有两个不同的化学反应性基团(第一个对于载体是特异的；第二个对于肽是特异的)的双特异性低分子量(例如MW 500Da或更低，优选300Da或更低，特别是100Da或更低)分子可以用作接头。通过疏水相互作用或例如利用生物素/(链霉)亲合素系统将肽与载体偶联也是可能的。
本发明还包括肽组合，其包含(a)与一种或多种根据现有技术的候选肽(例如，现有技术中已经提示用于预防或治疗IgE相关疾病的IgE肽(或mIgE-EMPD肽)组合的一种或多种本发明的肽或者包含(b)根据本发明的两种或更多种肽。优选地，肽组合包括来自IgE的不同区域的两个肽(例如，天然氨基酸残基8-21和/或22-32，特别是选自QQQGLPRAAGG(SEQID No.109；p9347)、QQLGLPRAAGG(SEQ ID No.110；p8599)、QQQGLPRAAEG(SEQ ID No.111；p8600)和QQLGLPRAAEG(SEQ ID No.112；p8601)的肽，以及来自IgE分子的另一区域的肽，特别是选自QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)、GSAQSQRAPDRVL(SEQ ID No.122；p7577)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)和WPGPPELDV(SEQ ID No.125；p7585)的肽。因此，特别优选的是包含SEQ ID No.109、110、111、112、113、114、115或116和SEQ IDNo.117、121、122或125(或具有SEQ ID No.117、121、122或125的13、12、11、10、9、8、7或6个氨基酸残基长度的片段)的至少一个的组合，尤其是包含SEQ ID No.109和121的组合。本发明还指单独或与根据本发明的其它肽组合(尤其是用合适的接头氨基酸或接头肽、载体以及在如本文公开的制剂中)的具有SEQ ID No.121的13、12、11、10、9、或8、7或6个氨基酸残基长度的p7580(QSQRAPDRVLCHSG；SEQ ID No.121)的片段。
因此，与现有技术对IgE疫苗的提议相比，本肽具有显著的区别特征，使得它们作为活性B细胞疫苗比在疫苗制剂中掺入或组合有载体的先前提出的肽或其它EMPD衍生的蛋白质或肽序列优越。
本疫苗含有下述形式的根据本发明的肽，其中肽与药学上可接受的载体结合。根据本发明，用于携带本肽的任何合适的载体分子可以用于根据本发明的疫苗，只要该载体是药学上可接受的，即只要有可能在药物制剂中提供此类载体以施用于该疫苗的人受体。根据本发明的优选载体是蛋白质载体，特别是匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、流感嗜血杆菌蛋白D(蛋白D)或白喉毒素(DT)。优选的载体也是无毒的白喉毒素突变体，特别是CRM197、CRM176、CRM228、CRM45、CRM9、CRM102、CRM103和CRM107(参见例如Uchida，1973)，其中CRM197是特别优选的。
载体蛋白与其它载体，如VLP载体相比具有特定的优势，因为连接的肽严格诱导B细胞应答，而T细胞应答仅由载体蛋白贡献。而且，载体偶联肽的密度为B细胞激活和分化提供有效的BCR激活。这与Lin等人提出的基于VLP的疫苗形成对比，其中肽表位被整合到重组蛋白质中并且不一定被设计成仅诱导B细胞应答。将肽表位整合到重组蛋白质结构中意味着肽将在结构上受到限制，这可能改变其抗原特性和表位暴露。因此，优选仅在一个末端连接本发明的肽，以保证疫苗肽的结构灵活性。
除了常规载体蛋白如KLH或CRM等之外，还可以使用现代支架或细胞靶向实体，其通过将两个或更多个靶标例如细胞或这些细胞上的受体，如抗原呈递细胞、T细胞和B细胞带到一起而起作用。作为药物活性载体，此类实体能够靶向和/或刺激例如抗原加工、抗原加工、B细胞或T细胞刺激中涉及的受体和/或细胞。这种(多)功能性载体可以作为融合蛋白或多特异性实体来提供，例如在Kreutz，2013中示例，其使用DC靶向经由不同的靶向部分，如例如AB、scFv、替代的支架，例如基于抗体的双特异性蛋白质或多特异性蛋白质或融合蛋白质(Weidle 2014)或天然或替代支架(Weidle 2013)或血型抗原、糖、病毒及其部分或受体配体如CD40L，其能够连接不同的功能性，例如两种甚至更多不同类型的结构域、配体或受体以引发免疫学事件。Liu等，2014例如已经使用亲脂性白蛋白结合实体用于淋巴结靶向目的。或者，Silva等2013显示了用于处理DC的纳米颗粒的使用。
根据本发明的疫苗是适合应用于人个体的疫苗制剂或组合物(就此而言，术语“疫苗”、“疫苗组合物”和“疫苗制剂”在本文中可互换使用，并且鉴定了药物制剂，其包含与药学上可接受的载体结合的根据本发明的肽与佐剂的组合)。
根据优选的实施方案，根据本发明的疫苗与佐剂一起配制，优选其中与载体结合的肽吸附到明矾。
根据本发明的疫苗优选配制用于静脉内、皮下、真皮内或肌肉内施用，特别是用于皮下或真皮内施用。
根据本发明的疫苗组合物优选含有0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg的量的根据本发明的肽。本发明的疫苗可以通过任何合适的应用模式施用，例如，i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下、经皮、真皮内等以及任何合适的递送装置(O'Hagan等,Nature Reviews,Drug Discovery 2(9),(2003),727-735)。因此，本发明的疫苗优选配制用于静脉内、皮下、真皮内或肌内施用(参见例如“Handbook of PharmaceuticalManufacturing Formulations”,Sarfaraz Niazi,CRC Press Inc,2004)。
根据本发明的疫苗在药物组合物中包含0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg，或者可选地，例如，100fmol-10μmol，优选10pmol-1μmol，特别是100pmol-100nmol的量的根据本发明的肽。通常，疫苗还可以含有辅助物质，例如缓冲液、稳定剂等
通常，本发明的疫苗组合物还可以包含辅助物质，例如缓冲液、稳定剂等。优选地，以0.1至99％(重量)，更优选5至80％(重量)，尤其是10至70％(重量)的量含有该辅助物质，例如药学上可接受的赋形剂，如水、缓冲液和/或稳定剂。可能的施用方案包括每周一次、每两周一次、每四周一次(每月一次)或两月一次治疗约1至12个月；然而，也可以是2至5次，特别是3至4次初次疫苗施用(在一个月或两个月内)，随后优选6至12个月之后甚至几年之后加强疫苗接种(除了已经提示用于其它疫苗的其它方案外)。
根据本发明的优选实施方案，疫苗中的肽以每次免疫0.1ng至10mg，优选0.5至500μg，更优选1至100μg的量施用于个体。在优选的实施方案中，这些量是指存在于本发明的疫苗组合物中的所有肽。在另一个优选的实施方案中，这些量是指组合物中存在的每种单一肽。当然可以提供其中各种不同肽以不同或等量存在的疫苗。然而，可选地，本发明的肽可以以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至300μg/kg体重的量施用于个体(作为单一剂量)。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的肽量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。组合物的剂量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及抗体在个体中引起期望的反应的能力而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每天施用几个分剂量，或者如通过治疗情况的紧急情况所示，可以按比例减少剂量。疫苗的剂量也可以变化，以根据情况提供最佳的预防剂量应答。例如，本发明的疫苗可以以几天、一周或两周或甚至数月或数年的间隔向个体施用，这总是取决于由施用本发明的组合物诱导的抗体的水平。
在本发明的优选实施方案中，疫苗组合物以2至10，优选2至7，甚至更优选至多5，并且最优选至多4次应用。免疫的此数目可以导致基础免疫。在特别优选的实施方案中，后续疫苗接种之间的时间间隔选择在2周至5年之间，优选1个月至至多3年，更优选2个月至1.5年之间。示例性疫苗接种时间表可以包括在6至8周和至多6个月的时间段内3至4次初始接种。此后，可以每两到十年重复疫苗接种。本发明的疫苗的重复施用可以将治疗性疫苗接种的最终效果最大化。
根据本发明的优选实施方案，疫苗与至少一种佐剂一起配制。
“佐剂”是增强对抗原(即根据本发明的)的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可主要作为递送系统，主要作为免疫调节剂或具有两者的强特征而起作用。合适的佐剂包括适用于哺乳动物，包括人的那些佐剂。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，如本文定义的疫苗组合物中使用的至少一种佐剂能够刺激先天性免疫系统。
先天性免疫应答在细胞表面上由Toll样受体(TLR)以及在细胞内由Nod-LRR蛋白(NLR)介导，并且分别由D1和D0区介导。先天性免疫应答包括响应于TLR激活的细胞因子产生和响应于某些NLR(包括Ipaf)的胱天蛋白酶-1的激活和IL-1β分泌。该响应不依赖特定的抗原，但可以作为抗原特异性的适应性免疫应答的辅助起作用。
已经表征了许多不同的TLR。这些TLR结合不同的配体并被不同的配体激活，这些配体又位于不同的生物体或结构上。能够在特定TLR中引发响应的免疫增强剂化合物的开发在本领域中是感兴趣的。例如，US 4,666,886描述了某些脂肽分子，其为TLR2激动剂。WO2009/118296、WO 2008/005555、WO 2009/111337和WO 2009/067081各自描述了TLR7的小分子激动剂的种类。WO 2007/040840和WO 2010/014913描述了用于治疗疾病的TLR7和TLR8激动剂。这些各种化合物包括小分子免疫增强剂(SMIP)。
能够刺激先天性免疫系统的至少一种佐剂优选包含下列各项或由下列各项组成：Toll样受体(TLR)激动剂，优选TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8或TLR9激动剂，特别优选TLR4激动剂。
Toll样受体的激动剂在本领域是公知的。例如，TLR2激动剂是Pam3CysSerLys4、肽聚糖(Ppg)、PamCys，TLR3激动剂是IPH 31XX，TLR4激动剂是磷酸氨基烷基氨基葡糖苷、E6020、CRX-527、CRX-601、CRX-675、5D24.D4、RC-527，TLR7激动剂是咪喹莫特(Imiquimod)、3M-003、Aldara、852A、R850、R848、CL097，TLR8激动剂是3M-002，TLR9激动剂是鞭毛蛋白(Flagellin)、VaxImmune、CpG ODN(AVE0675、HYB2093)、CYT005-15AllQbG10、dSLIM。
根据本发明的优选实施方案，TLR激动剂选自单磷酰脂质A(MPL)、3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)、聚I:C、GLA、鞭毛蛋白、R848、咪喹莫特和CpG。
本发明的组合物可以包含MPL。MPL可以是合成产生的MPL或从天然来源获得的MPL。当然，也可以向本发明的组合物中加入化学修饰的MPL。这种MPL的实例在本领域中是已知的。
根据本发明进一步优选的实施方案，至少一种佐剂包含皂苷，优选QS21，油包水乳剂和脂质体或由皂苷，优选QS21，油包水乳剂和脂质体组成。
至少一种佐剂优选选自MF59、AS01、AS02、AS03、AS04、氢氧化铝和磷酸铝。
可用于人的已知合适的递送系统型佐剂的实例包括但不限于明矾(例如磷酸铝、硫酸铝或氢氧化铝)、磷酸钙、脂质体、水包油乳剂如MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v聚山梨酯80(吐温80)、0.5％w/v三油酸山梨坦(Span 85))、油包水乳剂如Montanide和聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒或纳米颗粒。
可用于人的已知合适的免疫调节型佐剂的实例包括但不限于来自阿奎拉树(Aquilla tree)的树皮的皂苷提取物(QS21，Quil A)、TLR4激动剂如MPL(单磷酰脂质A)、3DMPL(3-O-脱酰基化MPL)或GLA-AQ、LT/CT突变体、细胞因子如各种白介素(例如IL-2，IL-12)或GM-CSF等。
可用于人的具有递送和免疫调节特征两者的已知合适的免疫调节型佐剂的实例包括但不限于ISCOMS(参见例如等(1998)J.Leukocyte Biol.64:713；WO90/03184、WO96/11711、WO 00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO06/134423和WO07/026,190)或GLA-EM(其为Toll样受体激动剂如TLR4激动剂和水包油乳剂的组合)。
用于增强本发明疫苗组合物的有效性的其它示例性佐剂包括但不限于：(1)水包油型乳剂制剂(具有或不具有其它特异性免疫刺激剂如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组分)，如例如(a)SAF，包含10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普流罗克(pluronic)阻断聚合物L121和thr-MDP，其微流体化成亚微米乳剂或者涡旋振荡以产生更大的颗粒大小乳剂，和(b)RIBITM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.)，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分(如单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DETOXTM)；(2)可以使用皂苷佐剂，如QS21、STIMULONTM(CambridgeBioscience,Worcester,Mass.)、(Isconova,Sweden)或(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)，或由其产生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激复合物)，所述ISCOMS可以没有额外的洗涤剂例如，WO00/07621；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基化MPL(3dMPL)(参见例如GB-2220221、EP-A-0689454)，当与肺炎球菌糖一起使用时任选在基本不存在明矾(参见例如WO00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合(参见例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231)；(7)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见例如WO99/52549)；(8)与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(WO01/21207)或与至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯聚醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)；(9)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(10)免疫刺激剂和金属盐颗粒(参见例如WO00/23105)；(11)皂苷和水包油乳剂，例如WO99/11241；(12)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选地+甾醇)例如WO98/57659；(13)充当免疫刺激剂起作用以增强组合物功效的其它物质。胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正丙酰胺-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)等。
本发明特别优选的组合物包含含有或不含Toll样受体激动剂的水包油乳剂，以及含有或不含Toll样受体激动剂的脂质体和/或含皂苷的佐剂作为佐剂。本发明的组合物还可以包含含有或不含有Toll样受体激动剂的氢氧化铝作为佐剂。
本发明通过以下实施例和附图进一步描述，但本发明不限于此。
附图简述
图显示：
图1A：从人IgE-BCR EMPD区的22位开始，具有12个或更少氨基酸的长度的疫苗肽显示比例如来自先前提出的活性抗膜IgE EMPD疫苗的邻近EMPD衍生序列更低的I类HLA结合预测分数。
图1B：组装来自图1A预测的候选肽并且使用类HLA肽结合测定分析以确定其掺入HLA分子的水平。
图2A：所有注射的肽都是免疫原性的。
图2B：与其免疫原性相反，并不是所有的免疫血清都能识别HEK细胞上表达的膜IgE-EMPD。
图2C：通过疫苗诱导的抗体对细胞表面上膜IgE-BCR的识别限于少数肽疫苗。
图3：本发明的肽诱导IgE EMPD特异性抗体，其与先前提出的活性疫苗相反，不显示与人PBMC的非特异性脱靶结合。
图4A：鉴定短的免疫肽，其通过特异性结合EMPD来诱导能够交联IgE-BCR的抗体。
图4B：鉴定疫苗肽，其与含有人EMPD的中等和大尺寸片段的现有技术免疫原诱导具有类似的IgE-BCR交联活性的抗EMPD抗体。
图5：疫苗诱导的抗体的解离率与IgE-BCR交联活性相关。本发明的短肽(例如p9347、p8599、p8600、p8601、p9041、p9042、p9043)与长和中等大小的现有技术衍生肽(p8492、p8494和p8495)相比实现了相似的结合特性。
图6：免疫原性或功能上等同的p9347的变体肽。
图7A：用本发明的短肽免疫转基因小鼠降低体内总的IgE水平。
图7B：用本发明的短肽免疫转基因小鼠降低体内卵清蛋白特异性IgE水平。
实施例
实施例1：鉴定源自人IgE EMPD区的I类HLA结合肽。
如由独立的HLA结合算法所预测，来自人膜IgE-EMPD的几种肽可潜在地结合常见的I类HLA等位基因(图1A)。这还包括之前公开的用于主动抗IgE-EMPD疫苗接种的肽(例如先前公开于Lin等2012和US2014/0220042A1的PPA-9中的一种序列，以及EP1972640A1中的肽topEMPD-2)。由于不能准确预测这些特定的肽将在何种程度上由膜IgE表达细胞产生并随后由细胞表面上的I类HLA分子呈递，所以如上所讨论，它们可能具有诱导不希望的T细胞应答的风险。因此，如图1B所示，预测结合I类HLA(图1A)的13个之前公布的肽中的6个证实在体外与HLA分子结合。相反，本发明的几种新设计的肽(包括p9347-2至-4、p8599-2至-4、p8600-1和-2)不结合图1B中列出的I类HLA等位基因，并因此不会在这些等位基因中诱导针对表达膜IgE-EMPD的B细胞的不期望的T细胞应答。
通过本发明的短肽结合II类HLA是不太可能的，因为11聚体(mer)和12聚体处于通常的II类HLA结合剂的下限[Hemmer等2000]。
图1A显示通过不同结合预测算法分析的7个相关的I类HLA等位基因的预测分数，对于SYFPEITHI[Rammensee等1999]、netMHC[Lundegaard等2008]、PREDEP(Schueler-Furman等2000]分别由字母S、N和P指示，以获得改善的预测灵敏性和特异性。
这种组合判断当与本发明的疫苗肽(组4)，源自本发明要求保护的肽(包括p9347、p8599、P8600、p8601、p9338、p9041和p9042)的片段进行比较时允许清楚区分(组1)源自整个EMPD区的最佳HLA结合候选物(顶部EMPD肽)、(组2)源自pPA-9的片段，含有Lin等，2012和US2014/0220042A1的pPA-9序列(现有技术I肽)的人EMPD衍生的VLP疫苗和(组3)Lin等2012的用于VLP疫苗的源自p8495序列的片段和WO 1996/012740 A1的PPA-1(现有技术II肽)。每列中排名前两位的I类HLA结合分数(按照指示的预测方法)用灰色突出显示，指出以前提出的具有长肽的活性疫苗(参见组(1)-(3))与显示显著较低风险的具有短肽的本发明的肽(参见组(4))之间的差异。肽topEMPD-2是专利EP1972640A1所要求保护的序列(肽PPA-13)的一部分。
将与I类HLA分子的结合与已知的T细胞表位/阳性参照肽(定义为100％)进行比较。测试的等位基因列在列中，按照指示分组的行中列出测试的肽。此外，源自p7577、p7580和p7575序列的三个肽(其通过SYFPEITHI预测具有最高得分)各自在如上的一些I类HLA等位基因中在体外作为合并物进行测试。认为高于来自人丙型肝炎病毒(HCV)的已知T细胞表位的观察值(Lauer 2004)67.5％的值是“结合肽”，并突出显示。未测定一些组合，并且表示为“n.d.”。
总之，本发明要求保护的疫苗肽不结合图1B所示的I类HLA等位基因。
表1：整合的肽和序列表，其指示如所示的本专利提交的肽的来源、序列和用途/目的。在序列后面的“C-”或前面的“-C”指示将肽附着到载体所需要的半胱氨酸不是原始蛋白质序列的一部分，而序列前后的“C”指示天然存在的半胱氨酸(同样适用于甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸接头(“-ggC”、“Cgg-”)或其它接头)；由于相同的核心序列，C-偶联肽和不添加C的肽的肽名称(“pXXXX”)是相同的。
实施例2：肽疫苗诱导的免疫血清的免疫原性和靶标可接近性。
肽p7577、p7580和p7575在Ramos细胞上提供最高的MFI比率，尽管其滴度与其它肽之一相同(或更低)，如图2A中所示。出乎意料地，因此，肽p7577、p7580和p7575以及后者的衍生物(p9347、p8599、p8600、p8601)是用于基于载体蛋白的肽疫苗的最合适候选物。
通过标准ELISA程序测试小鼠血浆以确定针对与BSA偶联的注射肽的滴度，所述小鼠血浆在4次每两周注射抗人EMPD肽疫苗(由与作为佐剂的明矾混合的具有KLH或CRM的肽-载体缀合物组成)后采集。滴度使用四参数曲线拟合通过其稀释的EC50来计算，并且主要显示10^4至10^5之间的数值(y轴上的灰色区间)。每个点表示一只动物的滴度，水平线显示来自用x轴上所示的肽免疫的每个动物组的几何平均值。覆盖整个人EMPD序列以及单一和双重氨基酸交换(p8599、p8600、p8601)的所有测试肽一起在小鼠中是免疫原性的，并因此可以认为是用于主动抗EMPD疫苗接种的可能的免疫原。如图2A所示，所有注射的肽都是免疫原性的。
与图2A中相同的免疫血清用于亲和纯化多克隆抗体，使用用于免疫的相同肽(如图2A中所示的肽)进行，以允许在HEK wt(背景信号)或HEK-C2C4(特异信号)表达细胞上进行不依赖滴度的染色。根据这些群体的染色强度(MFI)，根据在材料和方法下描述的公式计算特异性指数(SI)并在y轴上进行绘制。较高的SI反映靶标结合的更高特异性(例如在右侧的阳性对照mAB抗IgE Le27和BSW17)，而在1附近的SI表明HEK-wt和HEK-C2C4细胞被同样良好地识别，表明缺乏特异性靶标相互作用(在y轴上描绘为“特异性阈值”)，如例如小鼠IgG对照，从右边数第三、第四和第五个样品。对显示出强背景信号的HEK wt细胞给予0.2的SI值。每个点代表来自一只动物的亲和纯化的抗体或对照AB，水平线显示如x轴所示用肽免疫的每个组的平均值。引人注目地，虽然所有注射的肽都具有相似的免疫原性(图2A)，但在细胞背景下EMPD的不同区段的可接近性仅限于几个区域，如例如p7580和p7575或p7572、p7593和p7585(图2B)。这种不可预测的特征在表达IgE EMPD的“天然”形式的替代物的细胞模型中进一步得到证实，即在如图2C中所示的Ig-α和Ig-β链存在的情况下。
使用与图2B中相同的样品，以不依赖滴度的方式使用给定的亲和纯化的抗体浓度(25ug/ml)对EMPD的膜IgE C2C4阴性或膜IgE C2C4阳性Ramos细胞进行染色。通过膜IgEC2C4表达细胞上的染色强度(MFI)除以来自非诱导细胞的膜IgE-C2C4阴性背景信号计算y轴上染色强度的比率。约1或低于1的MFI比率(在y轴上标记为“特异性阈值”[虚线])反映没有靶标的特异性染色。阴性对照(右样品块，以“无一抗”开始)和阳性对照(右样品块，以“抗IgE(Le27)”开始)分别显示约1或高于5的MFI比率。高于1的MFI比率表明特异的细胞表面信号(如例如阳性对照mAB抗IgE Le27和BSW17；小图的右侧)。
由于与HEK细胞不同，Ramos细胞表达与Igα和Igβ相关的内源性BCR，因此它们反映了在比没有Ig-α和-β的情况下更天然的结构背景下某些EMPD表位的可接近性。先前由Chen等，2010描述了肽p7572、p7593和p7585覆盖的区域被Igα和Igβ的表达所遮蔽或负面影响，并因此在Ramos细胞上不被识别，这与不表达这些辅助蛋白质的HEK细胞上的信号相反。每个点代表一只动物，线显示如x轴上所示用肽免疫的每个组的平均值(在对照AB的情况下，每个符号代表独立的生物学重复)。
实施例3：本发明要求保护的肽缺乏针对人PBMC的脱靶结合免疫血清的诱导。
通过靶向p7570(图2)或pPA-4(Chowdhuy等，2012)的区域中的人EMPD的某个区域的mAB已经观察到对广泛表达的蛋白质(ARAP3、pPA-3)的脱靶结合。因此有必要对目前的疫苗肽评估其诱导类似于这些mAB的脱靶免疫应答的风险。
KLH/肽疫苗免疫小鼠的相同免疫血清和抗体纯化与图2B和2C中的相同。测试了它们与细胞表面抗原的不希望的脱靶结合。作为容易接近的血浆暴露的人细胞的替代物，源自两名健康供体的PBMC用于流式细胞术染色(在y轴上显示的PBMC结合[MFI])。由于IgE-BCR阳性B细胞在外周血中几乎检测不到，因此在这种分析中，它们下降得低于常规的FACS检测限[Davies等，2013]。如中央三组样品(如x轴上所示的可用免疫血清)中所示，来自所有测试的p7575衍生的免疫血清的PBMC结合信号保持在背景水平内，而大的肽衍生的免疫血清(参见左侧块区“p8492、p8494、p8495”)产生清晰的阳性信号，其反映了与未限定的细胞表面抗原的非特异性脱靶结合。每组四个柱形代表分别针对来自三名健康供体的PBMC的B细胞和非B细胞用一份血浆样品的脱靶测量，如小图中不同阴影的柱形所示。浅灰色柱形反映了与B220阳性B细胞的非特异性结合，深灰色柱形反映了与B220阴性细胞(即PBMC中的非B细胞)的脱靶结合。在右侧显示了同种型对照和用作阳性染色对照的抗人HLA-DR。
如图3所示，本发明的肽诱导IgE EMPD特异性抗体，与先前提出的活性疫苗(例如由Lin等2012或US2014/0220042A1提出的那些)相反，其不显示与人PBMC的非特异性脱靶结合。
实施例4：要求保护的疫苗肽的IgE-BCR交联活性。
对与图2B和2C中相同的抗体、免疫血清和亲和纯化预先选择它们的IgE EMPD特异性和它们交联IgE-BCR的能力。作为抗体对功能性IgE-BCR交联的替代物，将表达膜IgEC2C4的Ramos细胞(如实施例2C中)与测试或对照抗体温育，并测量功能性增殖抑制，如通过相对于对照IgG(设定为100％)的相对EdU掺入(在y轴上绘制)测量。如小图右侧所示，使用结合Ramos细胞的内源性表达的BCR的抗IgM作为通过BCR交联的增殖抑制的阳性对照。每个点代表亲和纯化的抗EMPD或源自一只动物的对照抗体的相对增殖抑制活性(以％表示)(在抗-IgM的情况下，每个符号代表独立的生物学重复)。水平线描绘了每个接种疫苗的动物组的平均交联活性，如x轴上的各肽名称所示。总之，发现与其它EMPD疫苗肽相比时，肽p7575具有最强的交联活性。
为了提供不含任何T细胞表位的疫苗肽，有必要使用短肽(例如在<12-15AA的范围内)代替可能含有I类HLA和/或II类HLA结合T细胞表位的长肽(例如>20AA)。然而，同时，缩短免疫肽是否会产生维持有效的IgE-BCR交联活性的抗体应答是不明显的。为此目的，在图4B中，对如图2B、2C和3B中的短肽诱导的免疫血清筛选其交联IgE-BCR的能力(如在表达IgEC2C4的Ramos细胞中所证实)。作为功能读数的替代物，相对增殖抑制活性如图4A所示表示，并绘制在y轴上。奎利珠单抗(Quilizumab，其为识别和交联人EMPD的人源化mAB)用作另外的阳性对照。出乎意料地，本发明的短11聚体(p9338、p9041、p9042、p9043)和12聚体肽p9347、p8599、p8600、p8601)与先前公布的大肽诱导产生相当的交联活性的免疫血清，所述大肽由于其T细胞表位而不适合于疫苗接种(如现有技术衍生的肽p8492、p8494和p8495所示例)。因此，本发明的短肽含有足够的表位信息以允许诱导IgE-BCR-交联抗体，尽管其尺寸减小。符号、肽和对照在如图4A中的x轴上表示。
为了测试利用图4C中多种EMPD肽接种疫苗时的协同作用，在相反的体侧上给兔同时注射p9347和p7580。如图4A和4B中，纯化抗体并测试交联活性。作为诱导抗体的功能性IgE BCR交联的替代物，将表达膜IgE C2C4的Ramos细胞(如实施例4A和4B中)与测试或对照抗体温育，并测量功能性增殖抑制，如通过相对于对照血清IgG(设定为100％)的相对EdU掺入(在y轴上绘制)测量。如所预期的，针对单一表位的抗体显示出中等交联活性，而它们的组合导致出乎意料的协同效应(在与单一表位相同的总浓度下)。使用抗IgM(与Ramos细胞的内源表达的BCR结合)和抗FLAG(与诱导的IgE C2C4蛋白上的FLAG标签结合)抗体用作阳性对照。符号、肽和对照在如图4A中的x轴上表示。
总之，发现通过针对EMPD的两个不同区域进行免疫来组合一只动物中诱导的抗体，所得到的交联作用协同成比单独的单一表位更强的增殖抑制作用。
图4A总结了短免疫肽的鉴定，所述短免疫肽诱导能够通过特异性结合EMPD交联IgE-BCR的抗体；图4B显示下述疫苗肽的鉴定，所述疫苗肽比现有技术的含有人EMPD的中等和大尺寸片段的免疫原诱导具有相似的IgE-BCR交联活性的抗EMPD抗体。图4C显示了将不同表位组合用于疫苗接种时的协同作用。
实施例5：交联活性与对人EMPD的亲和力之间的相关性。
通过表面等离子体共振对KLH-肽疫苗诱导的免疫血清(如图2、4A和4B中所示)分析其对覆盖除了5个C端氨基酸之外的整个人EMPD区域的肽(p9267)的解离速率。计算的解离速率(以1/s表示；在x轴上指示)定义亲和力的一个参数。在Ramos细胞中的功能性IgE-BCR交联(如通过如图4中的增殖抑制活性所反映)绘制在y轴上。总之，根据本发明的短疫苗肽，如最优选p9347(*)、p8599、p8600、p8601、p9338(*)、p9041、p9042、p9043而且还有p7575、p8596、p8597诱导下述抗体，所述抗体显示它们的解离速率和功能性IgE-BCR交联活性的良好相关性(Pearson r＝-0,4725；p值(双尾)<0,0001；R2＝0,2232)。
图5显示疫苗诱导的抗体的解离速率与IgE-BCR交联活性相关。本发明的短肽(例如p9347、p8599、p8600、p8601、p9338、p9041、p9042、p9043)比长和中等大小的现有技术衍生肽(p8492、p8494和p8495)实现相似的结合性质。
实施例6：要求保护的肽的修饰。
如实施例6中用肽p8599，以及在相同的限定位置(框示，如“Q”最初指出)包含单一氨基酸交换的类似肽免疫小鼠。交换基于氨基酸的物理化学性质进行。为了比较各个变体的免疫原性，通过ELISA对免疫血清分析其针对注射肽(灰色点)的滴度(EC50)并绘制在y轴上。诱导的免疫血清与原始肽的交叉反应性(EC50)用实心三角形绘出。每个符号表示针对p9347的原始序列或来自一只动物的注射肽的滴度，水平线显示来自每个动物组的几何平均值，所述动物组用具有x轴上指示的相应的交换的肽免疫。
出乎意料的是，如x轴上所示的氨基酸取代(*)保持或甚至改善了免疫应答，所述免疫应答可通过原始序列(p9347)以通过物理化学或任何其它参数不可预测的方式实现。类似地，与肽p8600和p8601(实施例2、4、5和6)的结合和交联数据证明，也可以将p9347的倒数第二个位置从G取代为E，由此在双重取代(例如对于p8601所显示)中维持全部功能性。
实施例7：在动物模型中证明体内IgE抑制。
从p9347-疫苗免疫小鼠获得的亲和纯化的抗血清的被动施用(如图2中)分别抑制总的IgE和卵清蛋白(Ova)特异性IgE，如图8A和B所示。为了诱导IgE，用Ova(Sigma)处理小鼠三次(疫苗接种方案的第2、15和23天)。在第27天采集血浆，并且如y轴上所示，通过ELISA(分别为Biolegend和Cayman Chemical)对总量和Ova特异性小鼠IgE进行定量。通过每周被动转移到新产生的纯合IgE-huEMPD敲入小鼠模型中测试抗体的体内功能活性，在所述小鼠模型中在Balb/c背景下使用Znf策略已经将内源小鼠IgE-EMPD编码外显子替换为同源人序列(长变体；待分配的SEQ ID NO:126:GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQQGLPRAAGGSVPHPRCHCGAGRADWPGPPELDVCVEEAEGEA)。乱序(scrambled)对照肽(称为“乱序的”；p9553:CLAGQGRQPQGA；待分配的SEQ ID NO:127)和单克隆对照抗体mAB IgG2a(同种型对照；Biolegend)和mAB47H4作为阳性参考(EP2132230B1、US8632775B2和US20090010924；的小鼠祖先)用于对照目的。每个点表示来自一只动物的IgE水平。水平线描绘了每个接种疫苗的动物组的平均IgE水平，如x轴上各肽名称(或mAB)所示。总之，p9347特异性抗血清的被动转移减少总IgE(图8A)和Ova特异性IgE(图8B)。这些数据提供了抗体如何抑制总IgE和体内抑制Ova诱导的IgE作为变应原特异性IgE的替代物的实例，所述抗体由根据本发明的基于肽p9347的疫苗诱导。
材料与方法
实施例1-材料和方法：
图1A：为了获得合理的HLA结合预测灵敏度，使用三种在线预测程序(SYFPEITHI[http://www.syfpeithi.de]；netMHC[http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/]；PREDEP[http://margalit.huji.ac.il/Teppred/mhc-bind/index.html])应用2种或3种最独特的MHC结合预测方法，所述预测程序基于不同的算法，分别包括基序矩阵、ANN回归和线程(threading)。如图1A所示，这允许鉴定源自疫苗肽的潜在共同HLA-A和-B结合9聚体肽。为了提供灵敏的策略，对于HLA结合剂鉴定，也通过其余程序分析任何程序中具有最高预测的肽。对SYFPEITHI预测给予从0(无结合)到36(最大结合)的分数到达。netMHC估计亲和力(以nM计)，其中0至50nM认为是强结合剂，并且弱结合剂阈值分数是500nM。PREDEP计算“能量分数”(最低值＝最大结合)。对于一些测试的等位基因，PREDEP不能预测给定肽长度的结合，并因此以下一个更短的肽长度使用。
图1B：对于HLA结合的生化确认，应用体外结合测定。高通量ProImmune结合测定确定每种候选肽结合一种或多种I类HLA等位基因并稳定化HLA-肽复合物的能力。[Schwabe等2008]。通过比较测试肽的结合与高亲和力参考T细胞表位的结合，可以鉴定蛋白质序列中最有可能免疫原性的肽。检测是基于MHC-肽复合物的天然构象的存在或不存在。根据计划说明书，将来自图1A的候选肽与图1A所示的等位基因组装在一起，并使用ProImmune MHC-肽结合测定进行分析，以确定它们掺入MHC分子的水平。将与MHC分子的结合与具有非常强的结合特性的已知T细胞表位(阳性对照肽)的结合进行比较。通过与相关阳性对照的结合比较来计算每种MHC-肽复合物的ProImmune结合分数。可能具有免疫学意义或需要作为良好结合剂进一步研究的肽认为是具有与已知T细胞表位(使用HCV E1 207-214)得分相等或更高的得分的那些肽[Lauer2004]。通过三重阳性对照结合实验获得实验标准误差。下面报道了该对照的标准误差，作为可以在ProImmune MHC-肽结合测定中获得的误差程度的说明。
在第二组实验中，对三种给定肽的等摩尔混合物的实验合并物测试在如所示的来自图1的某些等位基因上，和另外在A*01:01、A*24:02、A*29:02、B*08:01、B*14:01、B*40:01上的结合。
实施例2-材料和方法：
ELISA方案在96孔Nunc MaxiSorp板中进行，所述板用10mM在PBS中稀释的合适的肽-BSA缀合物(具有GMBS Applichem的牛BSA Sigma)包被，然后用PBS中的1％BSA在室温下封闭1小时，同时在4℃振荡过夜。将血浆稀释物加入到孔中，在1×PBS、0.1％BSA、0.1％Tween-20中连续稀释，并在室温下振荡温育1小时，然后用1×PBS 0.1％Tween-20洗涤3次。为了检测，将生物素化的抗小鼠IgG1(H+L)(Southern Biotech.1:2000稀释)在振荡的情况下在室温下添加1小时，用1×PBS 0.1％Tween-20洗涤3次，随后将与链霉亲合素(Roche，0.1U/ml)偶联的辣根过氧化物酶在37℃添加30分钟。为了可视化，在用1xPBS 0.1％Tween-20洗涤3次后加入底物ABTS(BioChemica，AppliChem)。在室温下振荡温育30分钟后，用1％SDS终止反应。用微孔板读数仪(Sunrise,Tecan,Switzerland)在405nm测量光密度。使用Graphpad(Prism)通过四参数曲线拟合的非线性回归分析来计算称为肽滴度的EC50。
疫苗接种方案：通过FMOC固相肽合成(EMC microcollections GmbH，>95％纯度)合成肽，一些具有另外的N或C末端半胱氨酸用于偶联(如果必要的话)。使用N-γ-马来酰亚胺基丁酰基-氧代琥珀酰亚胺酯(GMBS,Applichem)将肽偶联至载体蛋白质钥孔血蓝蛋白(KLH,Biosyn GmbH或Sigma Aldrich)或C-反应性重组CRM197白喉毒素突变蛋白(CRM临床前级，PFEnex，San Diego)。将肽-载体缀合物吸附到作为佐剂的氢氧化铝(Alum，Brenntag)上。疫苗剂量含有30μg肽加0.1％明矾。8-12周龄的雌性野生型Balb/c(Janvier，St.Berhevin)以两周间隔皮下(s.c.)注射到体侧4次。最后一次注射后两周取血浆。
膜IgE C2C4人EMPD细胞模型：在5％CO2/37℃下，在RPMI-1640培养基，10％FCS，抗生素中培养人伯基特氏淋巴瘤来源的Ramos细胞(Ramos-ERHB，ECACC号85030804)。通过基因合成构建含有N-末端FLAG-标签，然后是IgE重链恒定链(结构域2-4，随后是人IgE-BCR的人EMPD、TM和IC区域)的膜IgE-C2C4的TET诱导型表达，将其克隆到TET诱导型表达载体中，并与适当的调节构建体一起稳定转染到Ramos细胞中。所得到的细胞系表达诱导型IgE-BCR模型，并提供在存在Ig-α和-β的情况下细胞表面上的天然人EMPD暴露的模型，从而允许评估膜IgE交联和细胞信号传导。通过添加500ug/ml多西环素(Doxycyclin)(Clontech)过夜诱导膜IgE C2C4表达，其在整个文本中被命名为“C2C4”。相反，未诱导的细胞(称为“wt”)不表达膜IgE C2C4。此外，HEK Freestyle细胞(FreeStyleTM293-F细胞，Invitrogen)在振荡Erlenmeyer Freestyle培养基(Gibco)中在37℃下培养(称为“wt”)。使用驱动与诱导型Ramos细胞中相同构建体的CMV驱动的哺乳动物表达载体来产生稳定的HEK-Freestyle膜IgE-C2C4表达细胞克隆。
从血浆亲和纯化多克隆AB：对于染色和交联实验，根据制造商的指导方针通过半胱氨酸(1□m BcMag碘乙酰基活化的,Bioclone)偶联注射的肽与磁珠从小鼠/兔血浆中亲和纯化肽疫苗诱导的抗体，然后在恒定的搅拌下将50μl小鼠血浆在室温温育2小时。结合后，将珠洗涤8次，并随后用0.2M甘氨酸，0.15M NaCl，pH 1.9洗脱，随后用1M HEPES(pH7,9)中和。最后，将洗脱的抗体浓缩并使用Spin-Xr UF500(Millipore)柱再次缓冲到PBS中，并储存在4℃。通过Nanodrop ND-1000(Thermo Scientific)定量蛋白质含量。
用于流式细胞术并测定“特异性指数”和MFI比率的细胞染色：用25ug/ml亲和纯化的抗体染色HEK-Freestyle wt和膜IgE-C2C4细胞，在FACS缓冲液中洗涤并与山羊抗小鼠IgG生物素(1：500，Southern Biotech)和Strep-PE(1:40，RDSystems)温育。用兔抗FLAG(Sigma 9ug/ml)和PerCP山羊抗兔F(ab’)2(2.5μg/ml，Jackson Immuno Research)同时染色C2C4细胞。
确定特异性指数(SI)：(1)相对于平均PerCP信号，即膜IgE构建体的表达标准化除了对照非结合剂之外的所有样品。(2)相对于小鼠IgG1同种型对照的PE强度标准化两个亚群的PE值。(3)如果wt细胞的值为2或更高(与wt细胞高度结合)，则SI值设定为0.2。(4)对于所有其它样品，通过将C2C4阳性细胞的标准化PE值除以从wt细胞获得的背景值来获得SI。
用疫苗诱导的亲和纯化的抗体或对照AB以25ug/ml对Ramos(表达-wt和-C2C4)细胞进行染色，在FACS缓冲液(PBS 1％FCS)中洗涤并与AlexaFluor 488山羊抗小鼠IgG F(ab‘)2(3μg/ml，Jackson Immuno Research)温育。用兔抗FLAG(Sigma 9ug/ml)和PerCP山羊抗兔F(ab’)2(2.5μg/ml，Jackson Immuno Research)同时染色C2C4细胞。在FACScan(BD)上获取细胞，并在FlowJo(Treestar)中进行评估，获得活wt、FLAG阴性细胞和活C2C4、FLAG阳性群体的MFI，以允许确定MFI比[MFI(膜IgE-C2C4阳性细胞/MFI(C2C4阴性细胞)]。
实施例3-材料和方法：
如实施例2所述，将来自接种疫苗的小鼠的血浆用于多克隆抗体的亲和纯化。
PBMC的流式细胞术分析：纯化来自健康供体的血沉棕黄层的PBMC(Ficoll梯度)并在液氮中冷冻。将细胞在含有10％FCS(Gibco)和抗生素的RPMI-1640培养基中培养过夜，并与来自小鼠的疫苗诱导的亲和纯化的抗体或对照AB以25ug/ml(小鼠IgG1，来自Biolegend和Biogenes，IgG2a和抗-HLA-DR，均以0.04μg/ml来自Biolegend作为技术对照)温育，在FACS缓冲液(PBS 1％FCS)中洗涤并与PE驴抗小鼠IgG(Fab`)2(2,5ug/ml,Jackson ImmunoResearch)温育。另外用FITC-抗小鼠/人CD45R/B220(10ug/ml，Biolegend)或同种型对照对B细胞进行染色。在FACScan(BD)上获取细胞并通过评估活淋巴细胞亚群(B细胞：CD45R/B220阳性，非B细胞：CD45R/B220阴性)的MFI在FlowJo(Treestar)中进行评估。
实施例4-材料和方法：
膜IgE交联测定：将Ramos细胞(wt和C2C4；参见实施例2)每个样品接种50万，并与10μg/ml疫苗诱导的亲和纯化的抗体或如实施例2中的对照抗体在完全培养基中温育1h。将细胞旋转沉降并具有相同浓度的二级交联剂山羊抗小鼠或抗兔IgG，Fcγ片段特异的，来自亲和纯化的抗体的F(ab')2片段(Jackson Immuno Research)的完全培养基(对于C2C4细胞，具有Doxycyclin)中重悬浮并温育过夜以诱导BCR交联。在CHO细胞中表达Quilizumab(其为结合人EMPD的原型、人源化单克隆AB(Brightbill等人，2010))用于实验目的，作为具有小鼠IgG2a恒定重链的重新工程化的小鼠/人嵌合AB，通过蛋白A纯化并用作1ug/ml的阳性抑制对照。分别以3ug/ml和10ug/ml使用山羊抗IgM(Southern Biotech)和兔抗FLAG(Sigma)作为阳性对照。
如实施例2中对于小鼠所述，用CRM-p9347(30ug)和KLH-p7580(100ug)在相反体侧上免疫新西兰白兔(White New Zealand rabbit)。
根据制造商的说明，通过 EdU Alexa 488流式细胞术测定试剂盒(Invitrogen)对增殖进行定量。简言之，在固定和显色之前加入10μM EdU 1小时。在FACScan(BD)上采集样品，并通过评估％EdU阳性细胞在FlowJo(Treestar)中进行评估。通过将来自血浆的IgG的EdU阳性细胞的比例(通常为约40％)设定为100％来计算作为交联活性的替代物的增殖抑制。
实施例5-材料和方法：
通过BiaCore测定亲和力：使用Biacore 2000仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振(SPR)分析疫苗诱导的抗体的解离速率。将生物素标记的抗原p9267(EMC，Tübingen，Germany)固定在链霉亲合素包被的-传感器芯片的表面上，使用HEPES-缓冲盐水，pH 7.4(HBS)作为运行缓冲液进行。将最少50个响应单位(RU)的肽加载到芯片上，将流动池1留空并用作参考(背景信号)。随后，用游离生物素(Sigma-Aldrich)和未处理血浆(1:100)封闭游离的链霉亲合素结合位点。以30μl/分钟的流速注入100μl每种未纯化的血浆样品(在HBS中1:100稀释)，并在每次注射血浆后用15μl10mM甘氨酸，pH<＝2.2再生芯片表面。在每次运行之后，从由以下配体结合的流动池获得的信号中减去第一流动池的背景信号。通过重复注射对照抗体来控制芯片表面的稳定性。为了评价，将质粒注射末期的RU值用作结合抗体总量的指标。使用BIA评估软件(用于解离的1:1Langmuir相互作用模型)计算解离速率值(1/s)。解离速率描述了抗体与配体的解离速度，并且构成并由此反映(除结合速率以外)由单独血液样品导出的亲和力测定的重要参数。一致的是，针对人EMPD肽的较低的抗体解离速率与细胞读出系统中相对较强的IgE-BCR交联活性相关。
膜IgE交联测定：如实施例4中。
实施例6-材料和方法：
基于相似或不相似的物理化学性质选择从原始EMPD序列开始的单氨基酸交换。如实施例2所述对小鼠接种疫苗。在如图2A中的注射的和原始的肽上分析免疫血清。
实施例7-材料和方法：
通过以每周间隔施用血清或单克隆抗体(47H4或同种型对照)被动免疫人IgE-EMPD上纯合的小鼠，所述血清来自注射了载体蛋白上的指定肽的小鼠。
此外，在第2、15和23天给各组注射卵清蛋白(Sigma)。在第27天采集血浆，并通过ELISA(分别为Biolegend和Cayman Chemical)分析总和卵清特异性IgE含量。
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序列表
<110> 阿费里斯股份公司(AFFIRIS AG)
<120> 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗
<130> R 69438
<150> ep 15175562.6
<151> 2015-07-07
<160> 127
<170> 专利版本3.5
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<213> 智人
<400> 67
Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Cys
1 5 10
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Cys
1 5 10
<210> 69
<211> 13
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<213> 智人
<400> 69
Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Cys
1 5 10
<210> 70
<211> 13
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Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Cys
1 5 10
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Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Cys
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Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Cys
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Cys Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp
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<210> 74
<211> 12
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<400> 74
Cys Gly Gly Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg
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<211> 12
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Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Gly Gly Cys
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Cys Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu
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<400> 77
Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys
1 5 10
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Cys Gly Gly Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu
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Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Cys
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Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg
1 5 10
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<213> 智人
<400> 81
Cys Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro
1 5 10 15
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<211> 14
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Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys
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Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Ala Gly
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Cys Val Pro His Pro Arg Ala His Ala Gly Ala Gly Arg Ala
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His Pro Arg Ala His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro
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Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val Gly Gly Cys
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Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val Cys Val Glu Glu
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Asp Val Ala Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Gly Gly Cys
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Leu Asp Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Pro Trp
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Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Pro Trp
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His Ser Gly Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Cys
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Cys Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Cys Lys
1 5 10 15
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<400> 96
Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln
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Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu
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Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly
35 40 45
Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val Cys Val
50 55 60
Glu Glu Lys
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<400> 97
Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser
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<400> 98
Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly Ser
1 5 10 15
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20
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Cys Gln Gln Ile Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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<211> 12
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<400> 100
Cys Gln Gln Val Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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<400> 101
Cys Gln Gln Phe Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
1 5 10
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Cys Gln Gln Met Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
1 5 10
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<400> 103
Cys Gln Gln Asn Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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<400> 104
Cys Gln Gln Ala Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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Cys Gln Gln Gly Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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Cys Gln Gln Ser Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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Cys Gln Gln Thr Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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Cys Gln Gln Pro Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
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<400> 110
Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
1 5 10
<210> 111
<211> 11
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Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly
1 5 10
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<211> 11
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<213> 智人
<400> 112
Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly
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<211> 10
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<400> 113
Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly
1 5 10
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<211> 10
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<400> 114
Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly
1 5 10
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<400> 115
Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu
1 5 10
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Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu
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<211> 14
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<213> 智人
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His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
1 5 10
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His Ser Gly Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
1 5 10
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His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly
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<400> 120
His Ser Gly Gln Gln Leu Gly Leu Pro Arg Ala Ala Glu Gly
1 5 10
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<211> 14
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<400> 121
Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu Cys His Ser Gly
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val Leu
1 5 10
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<213> 智人
<400> 123
Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Ala Gly Arg Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val
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<400> 125
Trp Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val
1 5
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<211> 65
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<400> 126
Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val
1 5 10 15
Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Ser Val Pro His Pro Arg Cys His Cys Gly Ala Gly Arg Ala Asp Trp
35 40 45
Pro Gly Pro Pro Glu Leu Asp Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu
50 55 60
Ala
65
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<211> 12
<212> PRT
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<400> 127
Cys Leu Ala Gly Gln Gly Arg Gln Pro Gln Gly Ala
1 5 10

Claims (14)

1.用于预防或治疗免疫球蛋白E(IgE-)相关疾病的疫苗，其包含至少一种与药学上可接受的载体结合的肽，其中所述肽选自QQQGLPRAAGG(SEQ ID No.109；p9347)、QQLGLPRAAGG(SEQ ID No.110；p8599)、QQQGLPRAAEG(SEQ ID No.111；p8600)、QQLGLPRAAEG(SEQ IDNo.112；p8601)、QQQGLPRAAG(SEQ ID No.113；p9338)、QQLGLPRAAG(SEQ ID No.114；p9041)、QQQGLPRAAE(SEQ ID No.115；p9042)、QQLGLPRAAE(SEQ ID No.116；p9043)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)、HSGQQLGLPRAAGG(SEQ ID No.118；p8596)、HSGQQQGLPRAAEG(SEQ ID No.119；p8597)、HSGQQLGLPRAAEG(SEQ ID No.120；p8598)、QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)、GSAQSQRAPDRVL(SEQ ID No.122；p7577)和WPGPPELDV(SEQ ID No.125；p7585)。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述IgE相关疾病选自过敏性疾病，优选季节性、食物、花粉、霉菌孢子、毒物植物、药剂/药物、昆虫、蝎子或蜘蛛毒液、乳胶或房尘螨变态反应、宠物变态反应、过敏性鼻炎和结膜炎、过敏性结膜炎、过敏性支气管哮喘、非过敏性哮喘、Churg-Strauss综合征、特应性皮炎、鼻息肉病、木村氏病、对粘合剂、抗菌剂、香料、染发剂、金属、橡胶组分、局部药剂、松香、蜡、抛光剂、粘固剂和皮革的接触性皮炎、慢性鼻窦炎、特应性湿疹、IgE相关的自身免疫疾病，优选慢性(特发性)和自身免疫性荨麻疹、胆碱性荨麻疹、肥大细胞增多症，特别是皮肤肥大细胞增多症、过敏性支气管肺曲霉病、慢性或复发性特发性血管性水肿、间质性膀胱炎、过敏反应，特别是特发性和运动诱发的过敏反应、免疫治疗、嗜酸性粒细胞相关疾病，优选嗜酸性粒细胞性哮喘、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、嗜酸性粒细胞性中耳炎和嗜酸性粒细胞性食管炎；淋巴瘤，抗酸治疗的敏化副作用，所述抗酸治疗优选用于胃或十二指肠溃疡或返流。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其中至少一个半胱氨酸残基作为接头与所述肽的N-或C-末端结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗，其中至少一个半胱氨酸残基作为接头与所述肽的N-末端结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的疫苗，其中所述载体是蛋白质载体。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述蛋白质载体选自钥孔血蓝蛋白(KLH)、Crm-197、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素(DT)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗与佐剂一起配制，优选其中与所述载体结合的肽吸附到明矾上。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的疫苗，其配制成用于静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的疫苗，其中所述肽以0.1ng至10mg，优选10ng至1mg，特别是100ng至100μg的量包含在所述疫苗中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的疫苗，其中所述肽通过接头，优选肽接头，特别是具有2至5个氨基酸残基的肽接头与所述载体结合。
11.根据权利要求10所述的疫苗，其中所述肽接头选自Gly-Gly-Cys、Gly-Gly、Gly-Cys、Cys-Gly和Cys-Gly-Gly。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的疫苗，其包含至少两种肽，其中所述疫苗包含(a)与一种或多种IgE肽组合的根据权利要求1的一种或多种肽或包含(b)根据权利要求1的两种或更多种肽。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其包含选自QQQGLPRAAGG(SEQ ID No.109；p9347)、QQLGLPRAAGG(SEQ ID No.110；p8599)、QQQGLPRAAEG(SEQ ID No.111；p8600)和QQLGLPRAAEG(SEQ ID No.112；p8601)的肽，和选自QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)、GSAQSQRAPDRVL(SEQ ID No.122；p7577)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)和WPGPPELDV(SEQ ID No.125；p7585)的肽，特别是包含QQQGLPRAAGG(SEQ ID No.109；p9347)和QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)。
14.肽，其任选地与药学上可接受的载体结合，其中所述肽选自QQQGLPRAAGG(SEQ IDNo.109；p9347)、QQLGLPRAAGG(SEQ ID No.110；p8599)、QQQGLPRAAEG(SEQ ID No.111；p8600)、QQLGLPRAAEG(SEQ ID No.112；p8601)、QQQGLPRAAG(SEQ ID No.113；p9338)、QQLGLPRAAG(SEQ ID No.114；p9041)、QQQGLPRAAE(SEQ ID No.115；p9042)、QQLGLPRAAE(SEQ ID No.116；p9043)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)、HSGQQLGLPRAAGG(SEQID No.118；p8596)、HSGQQQGLPRAAEG(SEQ ID No.119；p8597)、HSGQQLGLPRAAEG(SEQ IDNo.120；p8598)、QSQRAPDRVLCHSG(SEQ ID No.121；p7580)、GSAQSQRAPDRVL(SEQ IDNo.122；p7577)、HSGQQQGLPRAAGG(SEQ ID No.117；p7575)和WPGPPELDV(SEQ ID No.125；p7585)。
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