ES2298316T3 - Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas. - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende una emulsión de aceite en agua y una saponina, en la que dicho aceite es un aceite metabolizable, caracterizada porque la proporción del aceite metabolizable : saponina (p/p) es sustancialmente de 48:1.
Description
Emulsiones de aceite en agua que contienen
saponinas.
La presente invención se refiere a una
composición de vacuna de emulsión de aceite en agua. En particular,
la presente invención se refiere a una formulación de adyuvante para
vacuna basada en una emulsión de aceite en agua que comprende un
aceite metabolizable y una saponina. La invención se refiere además
a procedimientos para preparar la emulsión y a su uso en
medicina.
La inducción de respuestas de células T
citotóxicas (CTL) se produce de manera natural durante la infección
de una célula diana, o la síntesis no controlada de un antígeno
tumoral, en la que la degradación enzimática del antígeno diana
tiene lugar en el citoplasma celular. Este fenómeno permite a los
péptidos citoplásmicos derivados del patógeno, o antígeno
específico de tumor, entrar en la ruta Th1 (procesamiento de
antígenos endógenos) y presentarse sobre la superficie de la célula
asociados con una molécula del MHC de clase 1. Si un antígeno de
vacuna no entra en el citoplasma de la célula huésped, entonces
puede captarse por la célula y entrar en la ruta del procesamiento
de antígenos exógenos y en última instancia presentarse sobre la
superficie de la célula asociado con una molécula del MCH de clase
II. Esta ruta alternativa generalmente da como resultado respuestas
de células de células T auxiliares y respuestas de anticuerpos
específicos de antígenos.
Tras la vacunación convencional con vacunas
inactivadas o de subunidades, el antígeno generalmente no entra en
el citoplasma de una célula huésped, y por tanto no entrará en la
ruta del procesamiento de antígenos endógenos y en última instancia
no inducirá una respuesta de CTL. Se cree que la inducción de CTL
está correlacionada con las respuestas del perfil de citocinas
Th-1, específicamente con la secreción de
IFN-\gamma e IL-2. La secreción
de IFN-\gamma está asociada con las respuestas
protectoras contra los patógenos intracelulares, incluyendo
parásitos, bacterias y virus. La activación de leucocitos mediante
IFN-\gamma potencia la destrucción de patógenos
intracelulares y aumenta la expresión de receptores de Fc. También
puede producirse la citotoxicidad directa, especialmente en
sinergia con linfotoxina (otro producto de las células TH1). El
IFN-\gamma también es tanto un inductor como un
producto de las células NK, que son efectores innatos principales de
la protección. Las respuestas de tipo TH, a través de
IFN-\gamma o bien de otros mecanismos,
proporcionan una ayuda preferencial para los isotipos de
inmunoglobulina IgG1 humana e IgG2a
murina.
murina.
La solicitud de patente internacional número WO
95/17210 da a conocer un sistema de emulsión adyuvante a base de
escualeno, \alpha-tocoferol y monooleato de
polioxietilensorbitano (TWEEN80), formulado con el inmunoestimulador
QS21, opcionalmente con 3D-MPL. Esta formulación de
adyuvante es un inductor muy potente de una amplia gama de
respuestas inmunitarias.
En la técnica se conocen fracciones de saponinas
inmunológicamente activas (por ejemplo Quil A) que tienen actividad
de adyuvante derivadas de la corteza del árbol sudamericano Quillaja
Saponaria Molina. Derivados de Quil A, por ejemplo QS21 (una
fracción purificada mediante HPLC derivada de Quil A), y el
procedimiento de su producción se dan a conocer en la patente
estadounidense número 5.057.540. Entre QS21 (conocida como QA21)
también se dan a conocer otras fracciones tales como QA17. El uso de
tales saponinas en el aislamiento va acompañado de una desventaja
porque se produce necrosis local, es decir, muerte localizada del
tejido, en el sitio de la inyección, conduciendo así al dolor.
En la técnica se conocen fracciones de saponinas
inmunológicamente activas que tienen actividad de adyuvante
derivadas de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria
Molina. Por ejemplo, QS21, una fracción purificada mediante HPLC
del árbol Quillaja Saponaria Molina, y el procedimiento de su
producción (conocida como QA21) se dan a conocer en la patente
estadounidense número 5.057.540. El uso de tales saponinas va
acompañado de una desventaja porque se produce necrosis local, es
decir, muerte localizada del tejido, en el sitio de la inyección,
lo que conduce al dolor.
El monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado es
un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana.
Químicamente se suministra con frecuencia como una mezcla de
monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado con
cadenas 4, 5 o bien 6 aciladas. Puede prepararse mediante
procedimientos enseñados en el documento GB 2122204B. Una forma
preferida de monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado está
en forma de una emulsión que tiene un tamaño de partícula pequeño
inferior a 0,2 \mum de diámetro, y su procedimiento de fabricación
se da a conocer en la patente europea número EP 0 671 948 B1.
Con el fin de que cualquier composición de
aceite en agua sea adecuada para la administración a seres humanos,
la fase de aceite del sistema de emulsión tiene que comprender un
aceite metabolizable. En la técnica se conoce bien el significado
de la expresión aceite metabolizable. Metabolizable puede definirse
como "que puede transformarse por el metabolismo" (Dorland's
Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25ª Edición
(1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de
pescado, aceite animal o aceite sintético, que no es tóxico para el
receptor y puede transformarse por el metabolismo. Los frutos secos,
las semillas y cereales son fuentes comunes de aceites vegetales.
Los aceites sintéticos también son parte de esta invención y pueden
incluir aceites disponibles comercialmente tales como NEOBEE® y
otros. El escualeno
(2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno)
es un aceite insaturado que se encuentra en grandes cantidades en
el aceite de hígado de tiburón, y en menores cantidades en el
aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de grano de arroz
y levadura, y es un aceite particularmente preferido para su uso en
esta invención. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud
del hecho de que es un producto intermedio en la biosíntesis del
colesterol (Merck index, 10ª Edición, entrada número 8619).
En la técnica se conocen bien las emulsiones de
aceite en agua en sí, y se ha sugerido que son útiles como
composiciones de adyuvantes (documento EPO 399843).
Las respuestas inmunológicas frente a la
administración de un antígeno formulado en las emulsiones de aceite
en agua descritas en la solicitud de patente internacional número WO
95/17210, pueden caracterizarse porque se observan repuestas tanto
de Th2 como de Th1. Dado que en muchos casos las respuestas de tipo
Th1 se han identificado como críticas para la profilaxis y el
tratamiento de la enfermedad, es por tanto deseable que se
desarrolle un adyuvante más sesgado de Th1. Esto se ha conseguido de
la manera más sorprendente por los presentes inventores no mediante
la adición de inmunoestimuladores adicionales, sino mediante una
reducción de uno de los componentes
originales.
originales.
Las emulsiones adyuvantes de aceite en agua
descritas en la solicitud de patente internacional número WO
95/17210 tienen una alta proporción de escualeno:saponina (p/p) de
240:1. La presente invención tiene la proporción de escualeno:QS21
de sustancialmente 48:1. Esta reducción de uno de los componentes
tiene el efecto sorprendente de mejorar cualitativamente la
respuesta inmunitaria resultante. Usando esta formulación de
adyuvante novedosa se mantienen fuertes respuestas de tipo Th2,
pero además tales formulaciones provocan una respuesta inmunitaria
potenciada asociada específicamente con respuestas de tipo Th1,
caracterizada por altas respuestas de IFN-y,
proliferativas de células T y CTL.
Una realización preferida de la presente
invención es una formulación farmacéutica o adyuvante que comprende
QuilA o un derivado de la misma, tal como QS21 y una emulsión de
aceite en agua, en la que la emulsión de aceite en agua comprende
un aceite metabolizable, tal como escualeno, y un polisorbato
(incluyendo monooleato de polioxietilensorbitano, TWEEN 80^{TM}),
caracterizándose dichas emulsiones porque la proporción del
aceite:QS21 es sustancialmente de 48:1. En otra realización
preferida, la formulación de adyuvante comprende además otros
inmunomoduladores, incluyendo \alpha-tocoferol y
3D-MPL.
Tales formulaciones, una vez combinadas con un
antígeno o una preparación antigénica son adecuadas para una amplia
gama de vacunas monovalentes o polivalentes. Adicionalmente, la
emulsión de aceite en agua puede contener trioleato de
polioxietilensorbitano (SPAN 85). Una forma preferida de de
monofosforil-lípido A
3-des-O-acilado se
da a conocer en la solicitud de patente internacional publicada con
el número 92116556 - SmithKline Beecham Biologicals s.a.
Preferiblemente, las formulaciones de vacuna de
la presente invención contienen un antígeno o una composición
antigénica que puede provocar una respuesta inmunitaria contra un
patógeno humano, cuyo antígeno o composición antigénica se deriva
de VIH-1, (tal como tat, nef, gp120 o gp160), virus
del herpes humano, tales como gD o derivados del mismo o proteína
inmediata temprana tal como ICP27 de VHS-1 o
VHS-2, citomegalovirus ((esp. humana) (tal como gB
o derivados del mismo), rotavirus (incluyendo virus vivos
atenuados), virus de Epstein-Barr (tal como gp350 o
derivados del mismo), virus varicela-zóster (tal
como gpI, II e IE63), o de un virus de la hepatitis tal como el
virus de la hepatitis B (por ejemplo, antígeno de superficie de la
hepatitis B o un derivado del mismo), virus de la hepatitis A,
virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E, o de otros
patógenos virales, tales como paramixovirus: virus sincitial
respiratorio (tal como proteínas F y G o derivados de las mismas),
virus Parainfluenza, virus del sarampión, virus de las
paperas, virus del papiloma humano (por ejemplo, VPH6, 11, 16, 18,
...), flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus
del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas,
virus de la encefalitis japonesa) o virus Influenza, o se
deriva de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp,
incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis (por
ejemplo, polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos,
proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión a
lactoferrina, PilC, adhesinas); Streptococcus spp, incluyendo
S. pneumoniae (por ejemplo, polisacáridos capsulares y
conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de
unión a colina), S. pyogenes (por ejemplo, proteínas M o
fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos),
S. agalactiae, S. mutans; Haemophilus spp,
incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo, PRP y
conjugados del mismo), H. influenzae no clasificable (por
ejemplo, OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6,
lipoproteína D), H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo
M catarrhalis, también conocida como Branhamella
catarrhalis (por ejemplo, invasinas y adhesinas de alto y bajo
peso molecular); Bordetella spp, incluyendo B.
pertussis (por ejemplo, pertactina, toxina de pertussis o
derivados de la misma, hemaglutinina filamentosa, adenilato
ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B.
bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M.
tuberculosis (por ejemplo, ESAT6, antígeno 85A, -B o -C), M.
bovis, M. leprae, M. avium, M.
paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp,
incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp,
incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo, factores de
colonización, toxina termolábil o derivados de la misma, toxina
termoestable o derivados de la misma), E. coli
enterohemorrágica, E. coli enteropatógena (por ejemplo,
toxina similar a la toxina shiga o derivados de la misma); Vibrio
spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo, toxina del
cólera o derivados de la misma); Shigella spp, incluyendo
sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii:
Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por
ejemplo, una proteína Yop), Y. pestis, Y.
pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C.
jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C.
coli; Salmonella spp, incluyendo S. typhi, S.
paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis;
Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes;
Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo,
ureasa, catalasa, toxina vacuolizante); Pseudomonas spp,
incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp.,
incluyendo aureus, S. epidermidis; Enterococcus
spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium;
Clostridium spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo,
toxina del tétanos y derivados de la misma), C. botulinum
(por ejemplo, toxina botulínica y derivado de la misma), C.
difficile (por ejemplo, toxinas clostridiales A o B y derivados
de las mismas); Bacillus spp., incluyendo B.
anthracis (por ejemplo, toxina botulínica y derivados de la
misma); Corynebacterium spp., incluyendo C.
diphtheriae (por ejemplo, toxina de la difteria y derivados de
la misma); Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi
(por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por
ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo,
OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo, OspA,
OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp.,
incluyendo equi y el agente de la erliquiosis granulocítica
humana; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii;
Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por
ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae
(por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C.
psittaci; Leptospira spp., incluyendo L.
interrogans; Treponema spp., incluyendo T.
pallidum (por ejemplo las proteínas de membrana externa poco
frecuentes), T. denticola, T. hyodysenteriae; o se
deriva de parásitos tales como Plasmodium spp., incluyendo
P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T.
gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp.,
incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo
B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T.
cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia;
Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis
spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp.,
incluyendo T. vaginalis; Schistosoma spp.,
incluyendo mansoni, o se deriva de levadura tal como
Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus
spp., incluyendo C. neoformans.
En la técnica se conocen bien derivados de
antígeno de superficie de la hepatitis B e incluyen, entre otros,
aquellos antígenos PreS1, PreS2, S expuestos descritos en las
solicitudes de patente europea
EP-A-414 374;
EP-A-0304 578 y EP
198-474. En un aspecto preferido, la formulación de
vacuna de la invención comprende el antígeno del
VIH-1, gp120, especialmente cuando se expresa en
células CHO. En otra realización, la formulación de vacuna de la
invención comprende gD2t según se definió anteriormente en el
presente documento.
En una realización preferida de la presente
invención las vacunas que contienen el adyuvante reivindicado
comprenden los virus VPH que se consideran responsables de los
condilomas acuminados, (VPH 6 o VPH 11 y otros) y los virus VPH
responsables del cáncer de cuello uterino (VPH16, VPH18 y otros).
Las formas particularmente preferidas de vacuna comprenden
partículas de L1 o capsómeros y proteínas de fusión que comprenden
uno o más antígenos seleccionados de las proteínas E6, E7, L1 y L2
de VPH 6 y VPH 11. Las formas más preferidas de proteína de fusión
son: L2E7 tal como se da a conocer en el documento GB 95 15478.7 y
la proteína D (1/3)-E7 dada a conocer en el
documento GB 9717953.5.
Las vacunas de la presente invención comprenden
además antígenos derivados de parásitos que producen la malaria.
Por ejemplo, los antígenos preferidos de Plasmodia falciparum
incluyen RTS,S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende
sustancialmente toda la parte C-terminal de la
proteína del circumsporozoito (CS) de P. falciparum unida
mediante cuatro aminoácidos de la parte preS2 del antígeno de
superficie de la hepatitis B al antígeno de superficie (S) del
virus de la hepatitis B. Su estructura completa se da a conocer en
la solicitud de patente internacional número PCT/EP92/02591,
publicada con el número WO 93/10152 que reivindica prioridad a
partir de la solicitud de patente británica número 9124390.7. Si se
expresa en levaduras, RTS se produce como una partícula de
lipoproteína, y si se coexpresa con el antígeno S del VHB produce
una partícula mixta conocida como RTS,S. Los antígenos TRAP se
describen en la solicitud de patente internacional número
PCT/GB89/00895, publicada con WO 90/01496. Una realización preferida
de la presente invención es una vacuna contra la malaria en la que
la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos
RTS,S y TRAP. Otros antígenos de plasmodios que son posibles
candidatos a ser componentes de una vacuna contra la malaria de
múltiples fases son MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2,
secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1,
Pfs25, Pfs28, PFS27/25, PfsI6, Pfs48/45, Pfs230 de P.
faciparum y sus análogos en Plasmodium spp.
Las formulaciones también pueden contener un
antígeno antitumoral y ser útiles para el tratamiento
inmunoterapéutico de cánceres. Por ejemplo, la formulación de
adyuvante puede utilizarse con antígenos de rechazo tumoral tales
como aquéllos para cánceres de próstata, de mama, colorrectal, de
pulmón, pancreático, renal o de melanoma. Los antígenos a modo de
ejemplo incluyen MAGE 1 y MAGE 3 u otros antígenos MAGE para el
tratamiento de melanoma, PRAME, BAGE o GAGE (Robbins y Kawakami,
1996, Current Opinions in Immunology 8, páginas
628-636; Van den Eynde et al., International
Journal of Clinical & Laboratory Research (presentado en 1997);
Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer
Institute 89, página 293. De hecho, estos antígenos se expresan en
una amplia gama de tipos de tumores tales como melanoma, sarcoma,
carcinoma de pulmón y carcinoma de vejiga. Otros antígenos
específicos de tumor son adecuados para su uso con el adyuvante de
la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, antígeno
específico de la próstata (PSA) o Her-2/neu, KSA
(GA733), MUC-1 y antígeno carcinoembrionario (CEA).
En consecuencia, en un aspecto de la presente invención se
proporciona una vacuna que comprende una composición de adyuvante
según la invención y un antígeno de rechazo tumoral.
Se prevé que se usarán las composiciones de la
presente invención para formular vacunas que contienen antígenos
derivados de Borrelia sp. Por ejemplo, los antígenos pueden
incluir preparaciones antigénicas o antígenos derivados de
patógenos, ácidos nucleicos, péptidos o proteína producidos de
manera recombinante y proteínas de fusión quiméricas. En particular
el antígeno es OspA. El OspA puede ser una proteína madura completa
en forma lipidada en virtud de la célula huésped (E. Coli)
denominada (Lipo-OspA) o un derivado no lipidado.
Tales derivados no lipidados incluyen la proteína de fusión
NS1-OspA no lipidada que tiene los primeros 81
aminoácidos de extremo N-terminal de la proteína no
estructural (NS1) del virus Influenza, y la proteína OspA
completa, y otra, MDP-OspA es una forma no lipidada
de OspA que porta 3 aminoácidos de extremo
N-terminal adicionales.
\newpage
Las vacunas de la presente invención pueden
usarse para la profilaxis o el tratamiento de la alergia. Tales
vacunas comprenderían antígenos específicos de alérgeno (por ejemplo
Der p1) y no específicos de alérgeno (por ejemplo el decapéptido de
Stanworth).
La proporción de QS21:3D-MPL
(p/p) en una realización preferida de la presente invención será
normalmente del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1
y con frecuencia sustancialmente de 1:1. El intervalo preferido
para la sinergia óptima es MPL: QS21 desde 2,5:1 hasta 1:1 3D.
Normalmente, las dosificaciones de QS21 y 3D-MPL en
una vacuna para la administración a seres humanos estarán en el
intervalo de 1 \mug - 1000 \mug, preferiblemente de 10 \mug -
500 \mug y lo más preferiblemente de 10 \mug - 100 \mug por
dosis. Normalmente el aceite en agua comprenderá desde el 2% hasta
el 10% de escualeno, desde el 2% hasta el 10% de
\alpha-tocoferol y desde el 0,4% hasta el 2% de
monooleato de polioxietilensorbitano (TWEEN 80). Preferiblemente la
proporción de escualeno:\alpha-tocoferol es igual
o inferior a 1 ya que ésta proporciona una emulsión más estable. El
trioleato de polioxietilensorbitano (SPAN 85) también puede estar
presente a un nivel del 0,5% - 1%. En algunos casos puede ser
ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además
un estabilizador, por ejemplo otros emulsionantes/tensioactivos,
incluyendo ácido caprílico (Merck index, 10ª Edición, entrada
número 1739), del que tricaprilina es una realización
particularmente preferida.
Por tanto, otra realización de esta invención es
una vacuna que contiene QS21 y una emulsión de aceite en agua que
entra dentro de la proporción deseada, que se formula en presencia
de un esterol, preferiblemente colesterol, con el fin de reducir la
reactogenicidad local conferida por la QS21. Se prevé que la
proporción de QS21 a colesterol (p/p), presente en una realización
específica de la presente invención, está en el intervalo de 1:1 a
1:20, sustancialmente de 1:10.
Las emulsiones previas utilizadas en la
solicitud de patente internacional número WO 95/17210 mantienen
obviamente algunas ventajas con respecto a los adyuvantes no
inductores de Th1 convencionales.
Sin embargo, la inclusión de QS21, hasta el
momento, ha hecho reactógeno a este potente adyuvante, conduciendo
así al dolor. Se ha observado que la formulación de la QS21 en
liposomas que contienen colesterol puede ayudar a prevenir la
necrosis que se produce en el sitio de la inyección. Esta
observación está sujeta a la solicitud de patente internacional
número PCT/EP96/01464.
En las realizaciones de la presente invención el
esterol preferido es colesterol. Otros esteroles que podrían usarse
en las realizaciones de la presente invención incluyen
\beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol,
ergocalciferol y colesterol. En la técnica se conocen bien los
esteroles. El colesterol se conoce bien y se da a conocer, por
ejemplo, en el Merck Index, 11ª Edición, página 341, como un esterol
que se produce en la naturaleza que se encuentra en la grasa
animal.
Se sabe que la QS21 en disolución acuosa se
degenera con el tiempo dando una forma inactiva en adyuvante,
QS21-H, cuya degeneración está mediada por la
hidrólisis de OH por el medio acuoso. Tal degeneración puede
producirse cuando la QS21 está presente en la fase acuosa de un
adyuvante de aceite en agua. Sorprendentemente se ha encontrado que
la adición de colesterol a la fase de aceite de la emulsión de
aceite en agua tiene el efecto de mantener la QS21 en su forma
activa, con beneficios obvios para la vida útil de almacenamiento de
la formulación de adyuvante/vacuna. La presente invención
proporciona un procedimiento de estabilizar una preparación de una
saponina, preferiblemente QS21, en su forma activa en adyuvante no
hidrolizada, cuando la QS21 está presente en un adyuvante a base de
emulsión de aceite en agua. Este procedimiento comprende la adición
de un esterol, preferiblemente colesterol, a la fase de aceite de
una emulsión de aceite en agua.
Tales preparaciones se usan como sistemas
adyuvantes para vacunas y, una vez formulados junto antígeno o
preparaciones antigénicas, para vacunas potentes. De manera
ventajosa inducen preferiblemente una respuesta de Th1.
Los sistemas de emulsión de la presente
invención tienen un tamaño de gota de aceite pequeño en el intervalo
submicrónico. Preferiblemente los tamaños de gota de aceite estarán
en el intervalo de 120 nm a 750 nm, y lo más preferiblemente desde
120-600 nm de diámetro.
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos, significativos
en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué
inmunógeno específico se emplea y de cómo se presenta. Generalmente,
se espera que cada dosis comprenda 1-1000 \mug de
proteína, preferiblemente 1-500 \mug,
preferiblemente 1-100 \mug, lo más preferiblemente
de 1 \mug a 50 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna
particular puede determinarse mediante estudios convencionales que
implican la observación de las respuestas inmunitarias apropiadas en
los sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden
recibir una o varias inmunizaciones de recuerdo separadas de manera
adecuada.
Las formulaciones de la presente invención
pueden usarse para fines tanto profilácticos como terapéuticos. En
otro aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna tal
como se describe en el presente documento para su uso en medicina.
La preparación de vacunas se describe en general en New Trends and
Developments in Vaccines, editado por Voller et al.,
University Park Press, Baltimore, Maryland, EE.UU. 1978.
Se prevé que las composiciones de la presente
invención se usarán para formular vacunas que contienen antígenos
derivados de una amplia variedad de fuentes. Por ejemplo, los
antígenos pueden incluir antígeno o preparaciones antigénicas
derivados de patógenos, ácidos nucleicos humanos, bacterianos o
virales, antígeno o preparaciones antigénicas derivados de tumores,
antígenos derivados del huésped, incluyendo el decapéptido de
liberación de histamina de IgE (conocido como el decapéptido de
Stanworth), péptidos o proteína producidos de manera recombinante y
proteínas de fusión quiméricas.
Las preparaciones de vacuna de la presente
invención pueden usarse para proteger o tratar a un mamífero
propenso a, o que padece, una enfermedad, por medio de la
administración de dicha vacuna por vía sistémica o a través de la
mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección por vías
intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o la
administración a través de la mucosa a las vías respiratorias o
boca/tubo digestivo.
Se prepararon cada una de las formulaciones de
adyuvante de emulsión de aceite en agua utilizadas en los ejemplos
posteriores comprendiendo el siguiente componente de emulsión de
aceite en agua: 5% de escualeno, 5% de
\alpha-tocoferol, 2,0% de monooleato de
polioxietilensorbitano (TWEEN 80).
Se preparó la emulsión tal como sigue como un
concentrado de 2 veces. Todos los ejemplos usados en los
experimentos inmunológicos se diluyen con la adición de componentes
y diluyentes adicionales dando una concentración 1x (que
corresponde a una proporción de escualeno:QS21 (p/p) de 240:1) o
bien otras diluciones de los mismos.
En resumen, se disuelve el TWEEN 80 en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) dando una disolución al 2% en la
PBS. Para proporcionar 100 ml de una emulsión de concentrado de dos
veces, se agitan con vórtex 5 ml de
DL-alfa-tocoferol y 5 ml de
escualeno para mezclarlos meticulosamente. Se añaden 95 ml de
disolución de PBS/TWEEN al aceite y se mezcla meticulosamente.
Entonces se hace pasar la emulsión resultante a través de una aguja
de jeringuilla y finalmente se microfluidiza usando una máquina
M110S Microfluidics. Las gotas de aceite resultantes tienen un
tamaño de aproximadamente 145-180 nm (expresado como
promedio de Z medida mediante PCS (espectroscopía de correlación de
fotones)) y se denomina SB62 de "dosis completa".
Se añaden los otros componentes de
adyuvante/vacuna (QS21, 3D-MPL o antígeno) a la
emulsión en mezcla sencilla.
Las vacunas que contienen el antígeno utilizadas
en el presente documento se formula con adyuvante de SB62 de dosis
completa dando una alta proporción de escualeno:QS21 (240:1) o bien
con una cantidad inferior de SB62 dando una formulación de baja
proporción (48:1), estas formulaciones de adyuvante se denominan
SB62 y SB62' respectivamente. Opcionalmente pueden formularse otras
vacunas con la adición de colesterol a la fase de aceite de la
emulsión (indicado mediante la adición de la letra "c").
Se llevó a cabo un estudio en ratones Balb/c con
el fin de comparar la inmunogenicidad de diversas formulaciones que
contenían S,L*. S,L* es un antígeno compuesto que comprende una
proteína L (L*) de antígeno de superficie modificado y una proteína
S, ambas derivadas del virus de la hepatitis B (HB). Este antígeno
compuesto es el objeto de la solicitud de patente europea número EP
0 414 374. Este esquema de inmunización utilizado en el modelo de
ratón transgénico con HBs que se ha demostrado anteriormente que
apoya la inducción de CTL en ratones Balb/c.
Se combinaron diferentes formulaciones de
adyuvante, usando los sistemas de emulsión tal como se describieron
en el ejemplo 1, con proporciones diferentes de escualeno:QS21, y
que comprenden opcionalmente colesterol (proporción QS21:colesterol
p/p de 1:10), con S,L* y se comparó su capacidad para inducir
respuestas inmunitarias humorales y mediadas por células
(producción de citocinas y CTL). Se usó S,L* adsorbido sobre
hidróxido de aluminio (AlOH_{3}) como control inductor de
Th2.
En resumen, se inmunizaron grupos de 10 ratones
por vía intramuscular 4 veces a intervalos de 3 semanas con 2
\mug de S,L* liofilizado combinado con diversos sistemas de
emulsión de aceite en agua (SB62). 14 días tras la cuarta
inmunización, se analizó la producción de citocinas (IL5 e
IFN-\gamma) y la actividad de CTL tras la
reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios
linfáticos con antígeno S,L*. La respuesta de anticuerpos frente a
S,L* y el perfil isotípico inducido se monitorizaron mediante ELISA
a los 21 días posteriores a II y 14 días posteriores a IV.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones Balb/C por
vía intramuscular con las formulaciones descritas a continuación.
Se formuló SB62 junto con el antígeno a una proporción alta (240:1,
SB62) o baja (48:1, SB62') de escualeno:QS21, opcionalmente con la
adición de colesterol (c).
Se inmunizaron los animales por vía
intramuscular en la pata (50 \mul para todos los grupos excepto
para el grupo 5 al que se le inyectaron 100 \mul) en los días 0,
21, 42 y 63. Se extrajo sangre del seno retroorbital en diferentes
momentos posteriores a las inmunizaciones. En el día 77, se
sacrificaron los animales de cada grupo, se extirparon los bazos y
ganglios linfáticos que drenan el sitio de inyección (ganglios
linfáticos ilíacos) para la reestimulación in vitro. Se
obtuvieron conjuntos de 3 ó 4 bazos y 1 conjunto de 10 GL para cada
grupo y se trataron por separado en los ensayos in vitro.
Se realizó la cuantificación de anticuerpo
anti-HBs mediante Elisa usando antígeno de
superficie de HB como antígeno de recubrimiento. Se usaron
disoluciones de antígeno y anticuerpo a 50 \mul por pocillo. Se
diluyó el antígeno a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS
y se adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de las placas
de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Entonces se
incubaron las placas durante 1 h a 37ºC con PBS que contenía
albúmina de suero bovino al 1% y TWEEN 20 al 0,1% (tampón de
saturación). Se añadieron diluciones de dos veces de sueros
(empezando en dilución de 1/100) en el tampón de saturación a las
placas recubiertas con HBs y se incubaron durante 1 h 30 min. a
37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS, TWEEN 20 al 0,1%
y se añadió IgG1, IgG2a, IgG2b o Ig anti-ratón
conjugada con biotina (Amersham, RU) diluida 1/1000 en tampón de
saturación a cada pocillo y se incubó durante 1 h 30 min. a 37ºC.
Tras una etapa de lavado, se añadió complejo de estreptavidina -
peroxidasa biotinilada (Amersham, RU) diluido 1/5000 en tampón de
saturación durante 30 min. adicionales a 37ºC. Se lavaron las placas
tal como anteriormente y se incubaron durante 20 min. con una
disolución de o-fenilendiamina (Sigma) al 0,04%,
H_{2}O_{2} al 0,03% en TWEEN 20 al 0,1%, tampón citrato 0,05 M
pH 4,5. Se paró la reacción con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a
492/620 nm. Se calcularon los títulos de ELISA a partir de una
referencia mediante SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro
parámetros) y se expresaron en UE/ml.
2 semanas tras la segunda inmunización se
sacrificaron los ratones, se retiraron el bazo y los ganglios
linfáticos de manera aséptica en conjuntos (3 ó 4 órganos por
conjunto para esplenocitos, 1 conjunto de 10 órganos para LNC). Se
prepararon suspensiones celulares en medio RPMI 1640 (GIBCO) que
contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos,
2-mercaptoetanol 5x10^{-5} M y suero de ratón
normal singénico al 1%. Se cultivaron células a una concentración
final de 2x10^{6} células/ml (para LNC o SPC) en 200 \mul en
placas de 96 pocillos de fondo redondo con diferentes
concentraciones (10-0,03 \mug/ml) de antígeno S,L*
(25D84). Se llevó a cabo cada prueba por cuadruplicado. Tras 96 h
de cultivo a 37ºC bajo CO_{2} al 5%, se administró a las células
un pulso durante 18 h de 3H-timidina (Amersham, UK,
5 Ci/mmol) a 0,5 \muCi/pocillo y luego se recogieron sobre filtros
de fibra de vidrio con un colector de células. Se midió la
radiactividad incorporada en un contador de centelleo líquido. Los
resultados se expresan en cpm (cpm media en pocillos por
cuadruplicado) o como índices de estimulación (cpm media en
cultivos de células con antígeno/cpm media en cultivos de células
sin antígeno).
2 semanas tras la segunda inmunización, se
sacrificaron los ratones, se retiraron el hígado y los ganglios
linfáticos de manera aséptica en conjuntos (3 ó 4 órganos por
conjunto para esplenocitos, 1 conjunto de 10 órganos para LNC). Se
prepararon suspensiones celulares en medio RPMI 1640 (GIBCO) que
contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos,
2-mercaptoetanol 5x10^{-5} M y suero de ternero
fetal al 5%. Se cultivaron las células a una concentración final de
2,5 a 5x10^{6} células/ml (respectivamente para LNC o SPC) en 1
ml, en placas de 24 pocillos de fondo plano con diferentes
concentraciones (1-0,01 \mug/ml) de S,L* (25D84).
Se recogieron los sobrenadantes 96 h más tarde y se congelaron
hasta que se sometieron a prueba para detectar la presencia de
IFN-\gamma e IL-5 mediante
Elisa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la cuantificación de
IFN-\gamma mediante Elisa usando reactivos de
Genzyme. Se usaron disoluciones de muestras y anticuerpos a 50
\mul por pocillo. Se recubrieron placas de microtitulación de 96
pocillos (placa de inmunización Maxisorb, Nunc, Dinamarca) durante
la noche a 4ºC con 50 \mul de IFN-\gamma de
hámster anti-ratón diluido a 1,5 \mug/ml en tampón
carbonato pH 9,5. Entonces se incubaron las placas durante 1 h a
37ºC con 100 \mul de PBS que contenía albúmina de suero bovino al
1% y TWEEN 20 al 0,1% (tampón de saturación). Se añadieron
diluciones de dos veces de sobrenadante de la estimulación in
vitro (empezando a 1/2) en tampón de saturación a las placas
recubiertas con anti-IFN-\gamma y
se incubaron durante 1 h 30 a 37ºC. Se lavaron las placas 4 veces
con PBS TWEEN al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió
IFN-\gamma de cabra anti-ratón
conjugado con biotina diluido en tampón de saturación a una
concentración final de 0,5 \mug/ml a cada pocillo y se incubaron
durante 1 h a 37ºC. Tras una etapa de lavado, se añadió conjugado de
AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación durante 30
min. a 37ºC. Se lavaron las placas tal como anteriormente y se
incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 10 min. Se paró la
reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450 nm. Se
calcularon las concentraciones usando una curva patrón (patrón de
IFN-\gamma de ratón) mediante SoftmaxPro
(ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la cuantificación de IL5 mediante
Elisa usando reactivos de Pharmingen. Se usaron disoluciones de
muestras y anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Se recubrieron las
placas de microtitulación de 96 pocillos (placa de inmunización
Maxisorb, Nunc, Dinamarca) durante la noche a 4ºC con 50 \mul de
IL5 de rata anti-ratón diluida a 1 \mug/ml en
tampón carbonato pH 9,5. Entonces se incubaron las placas durante 1
h a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía albúmina de suero
bovino al 1% y TWEEN 20 al 0,1% (tampón de saturación). Se
añadieron diluciones de dos veces de sobrenadante de la estimulación
in vitro (empezando a 1/2) en tampón de saturación a las
placas recubiertas con anti-IL5 y se incubaron
durante 1 h 30 a 37ºC. Se lavaron las placas 4 veces con PBS TWEEN
al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió IL5 de rata
anti-ratón conjugada con biotina diluida en tampón
de saturación a una concentración final de 1 \mug/ml a cada
pocillo y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Tras una etapa de
lavado, se añadió conjugado de AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en
tampón de saturación durante 30 min. a 37ºC. Se lavaron las placas
tal como anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad)
durante 15 min. Se paró la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se
leyó a 450 nm. Se calcularon las concentraciones usando una curva
patrón (IL5 de ratón recombinante) mediante SoftmaxPro (ecuación de
cuatro parámetros) y se expresaron en pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
2 semanas tras la segunda inmunización, se
sacrificaron los ratones, se retiraron los bazos de manera aséptica
en conjuntos de 3 ó 4 ratones (2 conjuntos de 3 y un conjunto de 4
ratones por grupo). Se prepararon suspensiones celulares en medio
RPMI 1640 (GIBCO) que contenía L-glutamina 2 mM,
antibióticos, 2-mercaptoetanol 5x10^{-5} M y
suero de ternero fetal al 5%. Se cultivaron las células a una
concentración final de 2 x 10^{6} células/ml en 10 ml de medio
que contenía SL* 2 \mug/ml y ConA sup al 1,25% (frascos Falcon de
25 cm^{2}) y se incubaron durante 8 días a 37ºC bajo CO_{2} al
5%.
\vskip1.000000\baselineskip
El día anterior al ensayo de CTL (d7), se
prepararon las células diana mediante incubación de células P815
(10^{6} células/ml) con S,L* (lote 25D84) o péptido
S_{28-39} a 10 \mug/ml. Tras 1 h de incubación
en tubos Falcon de 15 ml en un volumen pequeño, se transfirieron
las células a placas de 24 pocillos y se incubaron durante la noche
a 37ºC. El día del ensayo, se centrifugaron 2 x 10^{6} S,L* y
células P815 sometidas a pulso de S_{28-39} y
P815-S, se resuspendieron en 50 \mul de FCS y se
incubaron con 75 \mul de ^{51}Cr (375 \muCi) durante 1 h a
37ºC (agitando cada 15'). Entonces se lavan las células 4 veces con
10 ml de medio completo y se incuban durante 30' a 4ºC tras el 4º
lavado. Entonces se centrifugan las células y se resuspenden a una
concentración de 2 X 10^{4} células/ml. Entonces se centrifugan
las células efectoras, se cuentan y se resuspenden a 2 x 10^{6}
células/ml. Se realizan diluciones en serie de tres veces de células
efectoras en placas de 96 pocillos con fondo en V, empezando a una
concentración de 2 X 10^{5} células/pocillo/100 \mul. Se añaden
2 x 10^{3} células diana en 100 \mul a las células efectoras por
triplicado. Se evalúan la liberación espontánea y máxima incubando
las células diana respectivamente con medio o Triton X100 al 3%. Se
centrifugan las placas durante 3' a 700 rpm y se incuban durante 4 h
a 37ºC. Tras el tiempo de incubación, se transfieren 50 \mul de
sobrenadante de cada pocillo a placas Luma y se seca durante la
noche antes del recuento en el contador de centelleo
Top-count. Los resultados se expresan como lisis
específica y se calculan tal como sigue:
% de RC = (cpm
media de la muestra - cpm media del medio / cpm media máx. - cpm
media del medio) x
100
Se midieron las respuestas humorales (isotipos
IgG e Ig) mediante ELISA usando antígeno superficial de HB como
antígeno de recubrimiento. Sólo se muestran los datos de los 21 días
posteriores al momento II. Estos resultados se facilitan en las
figuras 1 y 2.
La figura 1 muestra respuestas de anticuerpo Ig
específico de Hbs medidas tanto en los sueros de ratones
individuales como en el promedio del grupo, 14 días posteriores a
II.
La figura 2 muestra la distribución de
subisotipos de IgG específica de Hbs en el suero de ratones
vacunados.
- \bullet
- Tal como puede observarse en la figura 1, las formulaciones relacionadas con SB62 inducen títulos de anticuerpo mucho más altos que la formulación de alúmina de S,L*.
- \bullet
- Los análisis estadísticos en los sueros individuales (test de Anoval - Newman Keuls) no muestran una diferencia significativa en los títulos de anticuerpo inducidos por SB62c y SB62'c o igualmente entre los títulos de anticuerpo inducidos por SB62 y SB62'c. Los títulos de anticuerpo anti anti-S,L* resultantes son, por tanto, independientes de la proporción de escualeno:QS21.
- \bullet
- El perfil de distribución subisotípica (tal como se muestra en la figura 2) es comparable para todas las formulaciones relacionadas con SB62 (IgG2a al 25-30%) mientras que la alúmina induce sólo IgG2a al 4%.
Se midieron las respuestas inmunitarias mediadas
por células (linfoproliferación, producción de
IFN-\gamma/IL5 y CTL) a los 14 días posteriores a
IV tras la reestimulación in vitro de esplenocitos y células
de ganglios linfáticos ilíacos con antígeno S,L*.
Se ha medido la producción de citocinas
(IFN-\gamma e IL-5) tras 96 h de
reestimulación in vitro de esplenocitos y células de
ganglios linfáticos ilíacos con S,L*. Estos resultados se
representan en las figuras 3 a 6.
La figura 3, muestra los resultados de la
producción de IFN-\gamma por los esplenocitos
(media de los datos obtenidos con tres conjuntos/grupo).
La figura 4, muestra los resultados de la
producción de IL-5 por los esplenocitos (media de
los datos obtenidos con tres conjuntos/grupo).
La figura 5, muestra los resultados de la
producción de IFN-\gamma por las células de
ganglios linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres
conjuntos/grupo).
La figura 6, muestra los resultados de la
producción de IL-5 mediante las células de ganglios
linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres
conjuntos/grupo).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Son beneficiosas cantidades más pequeñas de emulsión para la producción de IFN-\gamma. Se producen niveles muy altos de IFN-\gamma tras la reestimulación de los esplenocitos de animales inmunizados con formulaciones que contienen la emulsión de baja proporción. Estos niveles son significativamente mayores que los obtenidos tras la vacunación con las formulaciones correspondientes usando una emulsión de dosis completa. Se obtiene la mayor producción de IFN-\gamma tras la reestimulación de los esplenocitos de animales inmunizados con SB62 y SB62'c de S,L*.
- \bullet
- El efecto beneficioso de las formulaciones de baja proporción (grupos 3 y 4 en las figuras 5 y 6) es mucho más marcado cuando se observan células derivadas del ganglio linfático drenante (ganglio linfático ilíaco) en comparación con las tomadas del bazo.
- \bullet
- Una proporción de IFN-\gamma:IL-5 >1 sugiere claramente que se induce una respuesta pro TH1 mediante todas las formulaciones relacionadas con SB62 (véase la tabla 1).
- \bullet
- Se producen niveles más altos de IL-5 por animales inmunizados con formulaciones de SB62c de S,L* que con formulaciones de SB62 de S,L* que no contienen colesterol. Los animales inmunizados con alúmina de S,L* producen los niveles más altos de IL-5.
- \bullet
- Se observa una producción de IFN-\gamma mayor cuando se usan las formulaciones (SB62' y SB62'c) de baja proporción de escualeno:QS21.
\vskip1.000000\baselineskip
Las respuestas de CTL anti-S,L*
se facilitan en la figura 7.
La figura 7 muestra la actividad CTL de células
T de bazo estimuladas in vitro durante 7 días con antígeno
S,L* (% de lisis específica media de tres conjuntos).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Se obtiene la lisis específica con todas las formulaciones de emulsión de aceite en agua.
- \bullet
- Se observa una respuesta de CTL mayor con formulaciones que contienen emulsiones de SB62' cuando se observa una proporción de E/T limitante tal como 3/1.
\vskip1.000000\baselineskip
- 1.
- Se observa la mayor producción de IFN-\gamma tras la inmunización con emulsiones de SB62'.
- 2.
- Se induce una respuesta de CTL ligeramente mejor mediante formulaciones que contienen emulsiones de SB62' en comparación con la formulación correspondiente usando una emulsión de dosis completa.
- 3.
- El perfil de tipo TH1 de la respuesta inmunitaria inducida por todas las formulaciones relacionadas con SB62 se confirma además por la proporción de IFN-\gamma / IL-5.
- 4.
- No se observa una diferencia significativa entre los títulos de anticuerpo inducidos tras la inmunización con SB62c de dosis completa o SB62'c.
- 5.
- No se observa una diferencia significativa entre los títulos de anticuerpo inducidos tras la inmunización con SB62c y SB62'.
- 6.
- Se obtiene un perfil isotópico comparable (IgG2a al 25-30%) con todas las formulaciones relacionadas con SB62 lo que sugiere la inducción de una respuesta inmunitaria específica de HBs de tipo TH1.
Experimentos de inmunización usando los
antígenos de la malaria por Plasmodium falciparum TRAP y
RTS,S en combinación con diversos adyuvantes, basado cada uno en un
sistema de emulsión de aceite en agua. RTS es una proteína híbrida
que comprende sustancialmente toda la parte
C-terminal de la proteína del circumsporozoito (CS)
de P. falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la
parte preS_{2} del antígeno de superficie de la hepatitis B al
antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su
estructura completa se da a conocer en la solicitud de patente
internacional número PCT/EP92/02591, publicada con el número WO
93/10152 que reivindica prioridad a partir de la solicitud de
patente británica número 9124390.7. Si se expresa en levaduras, RTS
se produce como una partícula de lipoproteína y si se coexpresa con
el antígeno S del VHB produce una partícula mixta conocida como
RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente
internacional número PCT/GB89/00895, publicada con WO 90/01496. Los
antígenos TRAP son polipéptidos, denominados proteínas anónimas
relacionadas con trombospondina (Thrombospondin Related Anonymous
Proteins), que comparten homología con diversas proteínas de P.
falciparum.
Se combinaron diferentes formulaciones de
adyuvante, usando los sistemas de emulsión tal como se describieron
en el ejemplo 1, con proporciones diferentes de escualeno:QS21 y que
comprenden opcionalmente colesterol (proporción de QS21:colesterol
p/p de 1:10), con los antígenos de la malaria y se comparó su
capacidad para inducir respuestas inmunitarias humorales y mediadas
por células (proliferación de células T y producción de citocinas).
Se formuló SB62 junto con el antígeno a una alta (240:1, SB62) o
baja (48:1, SB62') proporción de escualeno:QS21, opcionalmente con
la adición de colesterol (c).
Se inmunizaron grupos de 5 ratones (ratones
hembra de seis semanas de edad, cepa C57/BL6 x CBA/J
[H-2k]) dos veces (en volúmenes de 2 x 250 \mul)
en la almohadilla de la pata trasera, separadas 14 días, con 10
\mug de RTS,S o 4 \mug de TRAP combinado con diversos sistemas
de emulsión de aceite en agua (SB62). 14 días tras la segunda
inmunización se analizó la producción de citocinas (IL5 y
IFN-\gamma) y la proliferación de células T tras
la reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios
linfáticos con antígenos de la malaria. Se investigó mediante ELISA
la respuesta de anticuerpos frente a RTS,S y TRAP y el perfil
isotópico que se indujo.
- \quad
- Dosis completa de emulsión de aceite en agua - SB62
- \quad
- Emulsión de aceite en agua - SB62' mostrada a modo de ejemplo en las figuras como 1/5 de la dosis de SB62
- \quad
- Emulsión de aceite en agua - SB62c o SB62'c (cualquier dosis) más colesterol en la fase de aceite. Vac.Vir. 3D7 = un constructo de virus vaccinia recombinante que expresa proteína CS y administrado a 10^{6} UFP por ratón.
Se retiraron las células de bazo o de ganglios
linfáticos poplíteos y se lavaron. Se cultivaron 100 \mul de
células en medio RPMI (suero de ratón normal inactivado por calor al
1%, SRN) que contenía 2 x 10^{6}/ml de células en placas de fondo
redondo en presencia de antígenos RTS,S o TRAP. Tras la estimulación
durante 96 horas con 0,1 \mug, 0,5 \mug y 2,5 \mug de
antígeno, o 48 horas con ConA 2 \mug/ml, se marcaron las células
con ^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) durante 16
horas antes de recoger y realizar el recuento en un contador
\beta.
RPMI 1640 sin L-glutamina (Life
technologies Nº 31870025), L-glutamina 2 mM (Life
technologies Nº 25030024), 2-mercaptoetanol 50
\muM (Life technologies Nº 1 1360039), piruvato de sodio 1 mM
(Life technologies Nº 11360039), 1xMEM con aminoácidos no
esenciales (10 x disolución madre, Life technologies Nº 11140035),
penicilina
100 UI/ml - estreptomicina 100 \mug/ml (Life technologies Nº 15140114).
100 UI/ml - estreptomicina 100 \mug/ml (Life technologies Nº 15140114).
Se retiraron las células de bazo o de ganglios
linfáticos poplíteos y se lavaron. Se cultivaron 1000 \mul de
células en medio RPMI (suero de ternero fetal inactivado por calor
al 5%, FCS) que contenía 5 x 10^{6} / ml de células en placas de
fondo plano de 24 pocillos en presencia de antígenos RTS,S o TRAP.
Entonces se incubaron las placas (37ºC, CO_{2} al 5%) durante
varias horas con 0,5 \mug y 2,5 \mug de antígeno o 4 \mug/ml
final de ConA.
La duración del tiempo que se incubaban las
células dependía de la citocina particular que se iba a detectar,
IL-2 se estimuló durante 72 horas,
IL-5 durante 72 horas ó 96 horas e
IFN-\gamma durante 96 horas. Se detectó cada
citocina usando kits de ELISA disponibles comercialmente
(IL-2 e IFN-y, Duoset Genzyme Nº
80-3573-00 y
80-3931-00 respectivamente;
IL-5 se detectó usando el kit de Pharmingen).
Se analizaron anticuerpos dirigidos contra TRAP
usando un ELISA de tipo sándwich. Se recubrió un antisuero de oveja
anti-TRAP sobre placas de ELISA que se usó para
capturar el antígeno TRAP añadido a 0,5 \mug/ml. Se añadieron
valoraciones de los sueros reunidos de los grupos experimentales y
se incubaron. Finalmente, se usaron anticuerpos específicos de
isotipo anti-ratón biotinilados seguidos de
estreptavidina-peroxidasa, para detectar
anticuerpos específicos de TRAP unidos.
Se analizaron las respuestas humorales
anti-VHB mediante un ELISA directo, se recubrió
HBsAg sobre la placa de ELISA a 1 \mug/ml. Se valoraron los
sueros reunidos de los diferentes grupos experimentales y se
detectaron los anticuerpos unidos según lo descrito
anteriormente.
Las respuestas proliferativas en respuesta al
antígeno pueden observarse en las figuras 8 a 11. Todas las
preparaciones de vacuna estimularon las células en el ganglio
linfático poplíteo local que podían proliferar in vitro en
respuesta al antígeno, magnitud de lo cual era independiente de la
adición de colesterol.
Todas las preparaciones de vacuna podían
estimular los esplenocitos que proliferaron in vitro en
respuesta al antígeno. Si se consideran los índices de
estimulación, las preparaciones que provocan las respuestas más
altas en el bazo fueron las que tenían la proporción baja de
escualeno:QS21 (48:1 o 1/5 de la dosis de SB62).
La figura 8, muestra las respuestas
proliferativas de las células de ganglios linfáticos poplíteos (en
forma de cuentas por minuto (CPM) sin procesar) derivadas de los
grupos experimentales tras la estimulación con antígenos TRAP y
RTS,S.
La figura 9, muestra las respuestas
proliferativas de los esplenocitos (en forma de cuentas por minuto
(CPM) sin procesar) derivadas de los grupos experimentales tras la
estimulación con antígenos TRAP y RTS,S.
La figura 10 muestra las respuestas
proliferativas de las células de ganglios linfáticos poplíteos
(índice de estimulación) derivadas de los grupos experimentales
tras la estimulación con antígenos TRAP y RTS,S.
La figura 11, muestra las respuestas
proliferativas de los esplenocitos (índice de estimulación)
derivadas de los grupos experimentales tras la estimulación con
antígenos TRAP y RTS,S.
Las figuras 1 y 2 muestran claramente que todas
las formulaciones de vacuna estimulan las células linfáticas que
pueden proliferar in vitro en presencia de antígeno de una
manera dependiente de la dosis. Los datos de cpm sin procesar
sugieren que la inclusión de colesterol en las formulaciones de
adyuvante no tiene ningún efecto sobre la magnitud de las
respuestas proliferativas (por ejemplo una comparación entre los
grupos 1 y 6, denominados RTS,S/MPL/QS21/SB62 y
RTS,S/MPL/QS21/SB62c, respectivamente).
El examen de los resultados de cpm junto con el
índice de estimulación (obtenidos dividiendo las cpm sin procesar
para la proliferación específica de antígeno entre las derivadas de
la proliferación no específica de antígeno (medio solo)) muestra
que la formulación de vacuna que genera las respuestas
proliferativas más altas depende del origen del linfocito medido.
Las formulaciones de adyuvante que contienen la proporción baja de
escualeno:QS21 (48:1) generan las respuestas proliferativas más
altas en el bazo.
La producción de citocinas, medida in
vitro en respuesta al antígeno, puede ser una medida tanto
cuantitativa como cualitativa de la inducción de respuestas
inmunitarias in vivo. En general se considera que niveles
altos de IFN-\gamma e IL-2 son una
medida de las respuestas inmunitarias de tipo Th1 y se considera que
IL-5 es una citocina de tipo Th2. Las siguientes
figuras (figuras 12 a 14) demuestran que el uso de SB62', que
contiene una proporción reducida de escualeno:QS21 (denominado 1/5
de la dosis de SB62), tenía un efecto notable para potenciar la
producción de
IFN-\gamma (figura 6).
IFN-\gamma (figura 6).
Además, existen pruebas de que la adición de
colesterol no tiene efectos cualitativos ni cuantitativos sobre el
perfil de citocinas producido in vitro en respuesta al
antígeno. Este efecto puede tener consecuencias significativas en
la inducción de respuestas inmunitarias de tipo Th1 y también en la
inmunoterapia.
La figura 12, muestra la producción de
IL-2 de células de bazo tras la estimulación con
antígeno TRAP o RTS,S 14 días tras VII.
La figura 13, muestra la producción de
IFN-\gamma por las células de bazo tras la
estimulación con antígeno TRAP o RTS,S 14 días tras VII.
La figura 14, muestra la producción de
IL-5 por células de bazo tras la estimulación con
antígeno TRAP o RTS,S 14 días tras VII.
Otra medida de la inmunidad que puede
correlacionarse con una respuesta inmunitaria de tipo Th1, o como
alternativa de tipo Th2, es el subisotipo de IgG que se provoca.
Generalmente se considera que una estimulación preferente del
subisotipo IgG1 es una medida de la inducción de una respuesta
inmunitaria de tipo Th2 y, a la inversa, se considera que IgG2a e
IgG2b son una medida de una respuesta inmunitaria de tipo Th1.
Se realizaron estudios de ELISA sobre sueros de
ratón reunidos y se determinaron los títulos de punto medio para
los anticuerpos específicos tanto de HBsAg como de TRAP. A partir de
estas figuras, se calculó la proporción de los títulos de punto
medio de IgG 1 y IgG2a específicas de antígeno y se consideró que
era una medida del equilibrio de Th1/Th2 de la respuesta
inmunitaria humoral (los resultados se muestran en la tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron los conjuntos de suero de ratón de
cada grupo y se encontró que se había estimulado satisfactoriamente
los anticuerpos específicos de HBsAg y TRAP. En general, los títulos
de medio punto de anticuerpos frente a HBsAg eran más altos que los
encontrados frente a TRAP. La distribución de isotipos difería entre
los dos antígenos. En todas las formulaciones, RTS,S provocaba un
patrón de Th1 claro, según lo indicado mediante una proporción de
IgG1:IgG2a inferior a 1.
Por el contrario, los anticuerpos específicos de
TRAP mostraban un patrón isotípico de tipo Th2. Las únicas
excepciones de esta observación fueron los grupos 2, que recibieron
TRAP solo, y el grupo 9, que recibió TRAP/RTS,S en una formulación
de SB62' (que contenía una proporción baja de escualeno:QS21,
denominado 1/5 de la dosis de SB62). El uso de SB62' puede ser, por
tanto, útil, en el diseño de vacunas inductoras de Th1 con antígenos
que se sabe que inducen preferentemente respuestas inmunitarias de
tipo Th2.
Este experimento investigaba el posible uso de
adyuvantes de emulsión de aceite en agua para el tratamiento
terapéutico de tumores que expresan el virus del papiloma humano
(VPH). Se inocularon células tumorales (TC1), que se sabe que
expresan la proteína E7 del VPH 16, en ratones C57BL/6 de
6-8 semanas de edad. Si se dejaban estas células
tumorales sin tratar crecían dando tumores de tamaño medible. Se
investigó el potencial de vacunas que comprenden E7, a base de
adyuvantes de emulsión de aceite en agua, para prevenir el
establecimiento de estos tumores. Se evaluó el potencial
terapéutico de diversas emulsiones de aceite en agua (para detalles
véase el ejemplo 1) de dosis completa de SB62, 1/5 de SB62, dosis
completa de SB62c y 1/5 de SB62c en combinación con antígeno
recombinante ProtD1/3 E7 de VPH16, en el modelo tumoral
TC1-E7. Además, se comparó la contribución de los
programas de vacunación.
En resumen, se expusieron grupos de
8-10 ratones C57BL/6 a 5x10^{5} células tumorales
TC1 (en el costado). Entonces se inmunizaron los grupos de ratones
en el interior de la almohadilla de la pata con 5 \mug de
ProtD1/3 E7 combinada con diversas formulaciones, 7 y 14 días tras
una exposición tumoral subcutánea.
Se compararon otros esquemas de vacunación: 2
vacunaciones con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 en SB62 (días 14 y 21
tras la exposición tumoral); y 4 vacunaciones con 5 \mug de
ProtD1/3 E7 en SB62 (7, 14, 21, 28 días tras la exposición
tumoral).
Se monitorizaron las respuestas de anticuerpos
frente a E7 mediante ELISA en los momentos, 2 y 4 semanas
posteriores a la segunda vacunación. Se analizó la respuesta
linfoproliferativa mediante la reestimulación in vitro de
células de bazo y de ganglios linfáticos durante 72 h con la
proteína E7 (10, 1, 0,1 \mug/ml) 2 y 4 semanas posteriores a la
segunda vacunación. Se midieron las respuestas de CTL tras la
reestimulación in vitro de células de bazo con células
tumorales irradiadas (TC1) o un péptido derivado de E7. Se realizó
el ensayo de liberación de cromo sobre células TC1, en una línea de
células tumorales singénicas: EL4 sometidas a pulsos o no con un
péptido derivado de E7 o infectadas con un virus vaccinia
recombinante de E7 o bien con el virus vaccinia de tipo
natural.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Se inyectaron 5x10^{5} células tumorales TC1 que expresan E7 por vía subcutánea (200 \mul) en el costado de ratones C57BL/6 inmunocompetentes
- \bullet
- Se realizaron las vacunaciones a los 7, 14, 21 o bien 28 días tras la exposición tumoral, con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 de VPH16 inyectado en el interior de la almohadilla de la pata (100 \mul:50 \mul/almohadilla de la pata). Se formuló cada vacuna en presencia de diferentes adyuvantes: SB62, SB62c, SB62' o SB62'c.
- \bullet
- Se sacrificaron los ratones 2 y 4 semanas tras la segunda inmunización y se extrajeron los bazos o ganglios linfáticos poplíteos y se sometieron a ensayo en ensayos de linfoproliferación o de CTL.
Se incubó el antígeno
ProtD1/3-E7 (5 \mug) durante 30 min. con MPL (5
\mug) antes de la adición del tampón como una mezcla PBS
concentrado 10 veces pH 7,4 y H_{2}O. Tras 30 min., se añadió QS21
(5 \mug) a la formulación mezclada con liposomas en una
proporción en peso de QS21/colesterol de 1:5 (denominada DQ). Se
añadieron 50 \mug/ml de tiomersal a la formulación como
conservante 30 min. tras la adición de QS21. Se llevaron a cabo
todas las incubaciones a temperatura ambiente con agitación.
Se hicieron crecer células TC1 (obtenidas de la
Universidad John Hopkin), o EL4 en RPMI 1640 (Bio Whittaker) que
contenía FCS al 10% y aditivos: L-glutamina 2 mM,
antibióticos al 1% (penicilina 10000 U/ml, estreptomicina 10000
\mug/ml) de aminoácido no esencial al 1% 100x, piruvato de sodio
al 1% (Gibco), 5 2-mercaptoetanol
10e-5 M. Antes de la inyección en el costado de los
ratones, se tripsinizaron las células TC y se lavaron en medio
libre de suero.
Se siguió el crecimiento tumoral individual con
el tiempo. Se midieron los 2 diámetros principales (A, B) usando
calibres dos veces a la semana, A X B representa la "superficie
tumoral" y se expresa como el promedio de los 5 valores en cada
grupo.
Se realizó la linfoproliferación en bazos
individuales y en conjuntos de ganglios linfáticos. Se incubó la
suspensión celular con cloruro de amonio tamponado con Tris durante
4 min. a 4ºC con el fin de lisar los glóbulos rojos. Se sembraron
en placa por triplicado 2x10^{5} células de bazo o células de
ganglios linfáticos poplíteos, en una microplaca de 96 pocillos, en
medio RPMI que contenía suero de ratón normal al 1%. Tras 72 h de
incubación con diferentes cantidades de E7
(10-1-0,1 \mug/ml), se retiraron
100 \mul de sobrenadante de cultivo y se sustituyeron por medio
fresco que contenía 1 \muCi de ^{3}H-timidina.
Tras suministrar un pulso durante 16 h, se recogieron las células
en placas con filtro. Se realizó el recuento de la radiactividad
incorporada en un contador \beta. Los resultados se expresan en
cuentas por minuto (CPM, media de los pocillos por triplicado) o
como índices de estimulación (CPM media en cultivos con antígeno
\div CPM media en cultivos sin antígeno).
Se cultivaron conjuntamente 2x10^{6} células
de bazo con 2x10^{6} de células TCl irradiadas (18000 rads)
durante 7 días. Las células diana eran células TC1 cargadas (1 h a
37ºC) con Cr^{51} (DuPont NEN 37MBq/ml) o bien células EL4
(células de tumor singénicas) infectadas con un virus
vaccinia recombinante con E7 (recibido de T.C. Wu de la
Universidad John Hopkins). Se compararon los resultados derivados de
estas células con los de las células diana EL4 que se habían
infectado con el virus vaccinia de tipo natural (se realiza
la infección por vaccinia a una MOI de 10 en un volumen
pequeño de medio sin suero, durante 1 h, a 37ºC en un incubador de
CO_{2}. Se añadió medio fresco y se incubaron las células durante
la noche antes de su uso). Se usaron 10 \mug/ml de péptido
derivado de E7 (49-57) (QCB) para suministrar un
pulso a las células EL4 durante 1 h a 37ºC durante la carga con
Cr^{51} de las células. Se añadieron 2000 células diana a cada
pocillo de la placa de 96 pocillos (nunc 2-45128 con
fondo en V) siendo 100/1 la proporción más alta de efector / diana.
Se realizaron controles para determinar la liberación espontánea o
máxima de Cr^{51} por sextuplicado y fueron dianas en medio o en
tritón al 1,5%. Se centrifugaron cuidadosamente todas las placas y
se incubaron durante 4 h a 37 en CO_{2} al 7%. Se depositaron 50
\mul del sobrenadante en una placa Luma de 96 pocillos (Packard),
se dejó secar durante la noche y se realizó el recuento en un
contador Top Count. Los datos se expresan como porcentaje de lisis
específica que se calcula a partir de las c.p.m. mediante la fórmula
(liberación experimental - liberación espontánea) \div
(liberación máxima - liberación espontánea) X 100.
Se realizó la cuantificación del anticuerpo
anti-E7 mediante Elisa usando E7 como antígeno de
recubrimiento. Se usaron las disoluciones de antígeno y anticuerpo
a 50 \mul por pocillo. Se diluyó el antígeno a una concentración
final de 3 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5 y se adsorbió
durante la noche a 4ºC en los pocillos de placas de microtitulación
de 96 pocillos (placa de inmunización Maxisorb, Nunc, Dinamarca).
Entonces se incubaron las placas durante 1 h a 37ºC con PBS que
contenía albúmina de suero bovino al 1% y Tween 20 al 0,1% (tampón
de saturación). Se añadieron diluciones de dos veces de suero
(empezando a dilución 1/100) en el tampón de saturación a las
placas recubiertas con E7 y se incubaron durante 1 h 30 min. a 37ºC.
Se lavaron las placas 3 veces con PBS y Tween 20 al 0,1% y se
añadió IgGtot, IgG2b o IgG2a o IgG1 anti-ratón
conjugada con biotina (Amersham, RU) diluida 1/5000 en tampón de
saturación a cada pocillo y se incubó durante 1 h 30 min. a 37ºC.
Tras una etapa de lavado se añadió un complejo de
estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham, RU)
diluida 1/5000 en tampón de saturación durante otros 30 min. a
37ºC. Se lavaron las placas tal como anteriormente y se incubaron
durante 10 min. con TMB
(tetra-metil-bencidina). Se paró la
reacción con H_{2}SO_{4} 4 N y se leyó a 450 nm. Se calculó la
dilución de punto medio mediante SoftmaxPro (usando una ecuación de
cuatro parámetros).
Se cortaron tumores y se fijaron en acetona y
paraformaldehído antes de seccionar. Entonces se investigaron las
secciones criostáticas de 5 \mum de espesor y se tiñeron para la
infiltración de células T que expresan CD4, CD8 y CD3. Antes de la
adición de los anticuerpos monoclonales de tinción, se lavaron las
secciones y se saturaron con albúmina de suero bovino (BSA) al 5%,
suero de conejo normal (NRS) al 5% en PBS. Tras esta etapa se
añadieron los anticuerpos monoclonales de rata
anti-CD3, CD4 y CD8 y se incubaron durante la noche
a 4ºC. Entonces se lavaron las secciones y se reveló la unión de los
anticuerpos monoclonales de rata con Ig de conejo
anti-rata biotinilada. Tras la incubación durante 30
min., a temperatura ambiente (TA), se añadió
estreptavidina-peroxidasa de rábano y se incubó
durante otros 30 min. a TA. Se reveló la unión de
estreptavidina-peroxidasa de rábano con DAB durante
10 minutos a TA. Entonces se contratiñeron las secciones con
hematoxilina y se deshidrataron con etanol, isopropanol, y
finalmente,
xilol.
xilol.
\newpage
Crecimiento tumoral (para una representación del
crecimiento tumoral medio / grupo véase la figura 15)
La figura 15 muestra el crecimiento tumoral
medio tras la exposición y vacunación en los días 7 y 14 con
diversas formulaciones que contienen ProtD1/3 E7.
La figura 16 muestra el crecimiento tumoral
medio observado durante un periodo de 4 semanas para los grupos que
recibieron el antígeno en formulaciones de DQ y SB62, también se
representan los resultados que comparan los diferentes programas de
vacunación. Estas vacunas se administraron en los días 7 y 14; o
días 14 y 21; o días 7, 14, 21 y 28.
La figura 16 es la comparación con formulaciones
comparativas y otros programas de vacunación.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el antígeno ProtD1/3 E7.
- \bullet
- La vacunación con ProtD1/3E7 o bien adyuvante solo no tiene ningún efecto sobre el crecimiento del tumor que expresa TC1-E7.
- \bullet
- El análisis del crecimiento tumoral individual mostró rechazo del tumor completo en varios grupos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La mejor formulación para inducir el rechazo del
tumor se formuló con la emulsión aceite en agua de SB62' a baja
dosis.
- \bullet
- Se observó un mejor efecto terapéutico tras 4 vacunaciones que el observado tras 2. El análisis del crecimiento tumoral individual mostró que el 60% de los animales rechazaron completamente su tumor tras 4 vacunaciones con una formulación a base de SB62 aunque sólo el 40% de ratones que habían recibido 2 vacunaciones mostró una regresión completa.
- \bullet
- Si se retrasaba la primera vacunación hasta el día 14 tras la exposición tumoral, no podía observarse un rechazo completo. Sin embargo parecía anularse el crecimiento tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- No se observó ninguna respuesta proliferativa en este experimento ni con las células de bazo ni con las células de ganglios linfáticos de ratones que recibieron ProtD1/3 E7 o adyuvantes solos.
- \bullet
- Se aumentó la linfoproliferación específica de antígeno en los grupos de ratones que recibieron ProtD 1/3 E7 en presencia de adyuvantes. Se observaron altas respuestas proliferativas tanto con DQ como SB62' en el bazo. Véanse las figuras 17 y 18.
- \quad
- Figura 17, se observó linfoproliferación en las células de bazo 2 semanas tras al segunda vacunación.
- \quad
- Figura 18, se observó linfoproliferación en las células de bazo 2 semanas tras la segunda vacunación.
Respuesta de anticuerpos
anti-E7: se midieron la IgG total y los subisotipos
(IgG1, IgG2a, IgG2b) mediante ELISA usando la proteína E7 como
antígeno de recubrimiento. Los títulos de Ig anti-E7
observados 2 semanas tras la segunda vacunación se dan en la tabla
6. La figura 19 muestra el porcentaje relativo de los diferentes
isotipos IgG en el suero de ratones vacunados 2 semanas tras la
segunda vacunación.
- \bullet
- Se aumentó mucho la respuesta de anticuerpos débil inducida tras 2 vacunaciones con ProtD1/3 E7 solo en animales que recibieron un adyuvante. La mayor respuesta de anticuerpos se obtuvo con SB62.
- \bullet
- El subisotipo predominante de anticuerpo específico de E7 inducido por todas las formulaciones de vacuna sometidas a prueba fue IgG2b (el 80-90% de las IgG totales).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 19, porcentaje relativo de los
diferentes isotipos IgG en el suero de ratones vacunados 2 semanas
tras la segunda vacunación.
- \bullet
- Pudo detectarse una respuesta de CTL en momentos 2 y 4 semanas tras la vacunación final.
- \bullet
- No se observó lisis cuando los ratones recibieron la proteína o el adyuvante solo. Se observó la mejor lisis específica cuando los ratones recibieron el antígeno en DQ o SB62' (véase la tabla 7).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se retiraron los tumores de los ratones (2
ratones por grupo) y se congelaron las secciones. Se tiñó la
criosección de los tumores con anticuerpos anti-CD4
y anti-CD8. Los resultados para la infiltración
tumoral observada mediante las células CD4 y CD8+ve se dan en la
tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- Los tumores de regresión, en los grupos de ratones que recibieron ProtD-1/3 E7 en DQ o SB62, mostraron una infiltración masiva de células CD8+ y algunas células CD4+.
- \bullet
- Los tumores retirados de los animales que recibieron el PBS, antígeno, o adyuvantes solos, no contenían ninguna infiltración linfocítica CD8+ve.
- \bullet
- Dos vacunaciones (en los días 7, 14) con 5 \mug de ProtD 1/3 en diferentes formulaciones a base de SB62 indujeron el rechazo de los tumores que expresan E7 establecidos previamente implantados en un sitio alejado.
- \bullet
- El rechazo del tumor está asociado con una respuesta de CTL específica anti-E7. Existe una tendencia a tener una respuesta de CTL ligeramente mejor en los individuos que rechazaron sus tumores.
- \bullet
- Las pruebas inmunoquímicas mostraron una infiltración masiva de células T CD8+ en tumores que remitieron tras la vacunación con ProtD1/3 E7 + DQ y SB62.
- \bullet
- Dos vacunaciones (en los días 114 y 21 tras la exposición al tumor) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 de VPH16 en SB62 redujeron el crecimiento de estos tres tumores más grandes pero no indujeron una regresión completa.
- \bullet
- Cuatro vacunaciones (días 7, 14, 21 y 28 tras la exposición tumoral) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 de VPH16 en SB62 indujeron el rechazo completo de los tumores establecidos en el 60% de los animales. Se observó un rechazo total del 40% tras 2 vacunaciones con el mismo adyuvante.
- \bullet
- El uso de adyuvante de SB62' a bajas dosis no tuvo ningún efecto sobre la magnitud de los títulos de anticuerpos anti-E7, aún indujo el nivel más alto de respuestas de CTL anti-E7 y la proliferación de linfocitos esplénicos.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los ejemplos anteriores está claro
que la presente invención engloba una emulsión de aceite en agua
que induce preferentemente respuestas inmunitarias fuertes de tipo
Th1, especialmente la producción de IFN-\gamma.
Se ha demostrado que estas formulaciones estimulan respuestas
inmunitarias frente a una amplia variedad de antígenos y, por
tanto, se prevé que esta presente invención se utilizará en una
amplia variedad de patógenos no limitados a los encontrados en el
presente documento.
Se ha descrito previamente que
QS21-H es un producto de la hidrólisis de QS21, que
ya no es activo como adyuvante. Se forma mediante la rotura de la
molécula de QS21 mediante el OH^{-} de la disolución acuosa. Esta
reacción se produce cuando el pH del medio acuoso es superior a un
valor de 6,5 y se acelera mediante temperaturas más altas. Se sabe
que las emulsiones de aceite-en-agua
descritas en esta solicitud de patente (por ejemplo SB62) muestran
un efecto de estabilización tal que se inhibe la hidrólisis de QS21
dando QS21-H. Tras la dilución de la emulsión de
aceite en agua en presencia de QS21 constante, pierden esta
propiedad de estabilización y QS21 se degenera dando la forma
QS21-H inactiva. Sorprendentemente, las emulsiones
que contienen colesterol adicional, que a una proporción de 1/1 no
muestran una estabilidad de QS21 mejorada, mantienen el efecto de
estabilización incluso a una dilución 1/5.
QS21 y QS21-H se someten a
ensayo directamente en la emulsión. Esto se logra mediante la
derivatización química de la formulación completa y realizando una
etapa de extracción selectiva que disuelve QS21, pero no afecta a
la mayoría de los compuestos de matriz que interfieren. El ensayo se
basa en HPLC y los compuestos se dansilan. La dansilación se
realiza secando una muestra de la emulsión y añadiendo 100 \mul de
3,5 mg de dansil-hidrazina/ml de C/M 2/1 y 100
\mul de ácido acético: C/M 2/1 1:4 en ese orden. La mezcla se
agita bien en vórtex y se incuba a 60ºC durante 2 horas. La mezcla
de reacción se seca en el Speedvac.
Se reconstituye en 500 \mul de ACN al 30% en
H_{2}O y se centrifuga dos veces a 14000 rpm durante dos minutos.
Entonces se recogen los sobrenadantes en un tubo de automuestreador.
Se obtiene una curva patrón preparando QS21 y
QS21-H en una mezcla que contiene los mismos
compuestos que la emulsión en estudio.
Se hace pasar el ensayo de HPLC en una columna
C18 RP de 5 \mu de tamaño de partícula Vydac 218TP54, 250*4,6 mm.
Los disolventes son A: H_{2}O + TFA (ácido trifluoracético) al
0,05% y B: acetonitrilo + TFA al 0,05%. La tabla de gradientes
es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El caudal es 1 ml/min. La detección es con
fluorescencia, con excitación a 345 nm y emisión a 515 nm. Se
inyectan 50 \mul tanto de la muestra como de los patrones. El
calentador de la columna se fija a 37ºC para esta separación. Los
picos para QS21, QS21-iso y QS21-H
se diferencian en el cromatograma.
Se analizó una serie de muestras con la
siguiente composición:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el ensayo de
QS21/QS21-H tras la incubación de las muestras a
diversos intervalos de tiempo y temperaturas (4ºC y 37ºC). Los
datos durante 1 mes a 37ºC en este modelo se correlacionan bien con
la estabilidad de QS21 tras un almacenamiento prolongado a 4ºC (por
ejemplo 2 años).
Estos resultados mostrados en la tabla anterior
muestran claramente (tanto para 7 días como 1 mes) el efecto de
añadir un esterol, en este caso colesterol, a SB62' para mantener la
estabilidad de QS21.
Claims (25)
1. Una composición que comprende una emulsión de
aceite en agua y una saponina, en la que dicho aceite es un aceite
metabolizable, caracterizada porque la proporción del aceite
metabolizable:saponina (p/p) es sustancialmente de 48:1.
2. Una composición según la reivindicación 1, en
la que la saponina es QuilA o derivado de la misma, tal como
QS21.
3. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en la que el aceite metabolizable es
escualeno.
4. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un esterol.
5. Una composición según la reivindicación 4, en
la que el esterol es colesterol.
6. Una composición según las reivindicaciones
1 a 5, que comprende además uno o más inmunomoduladores.
7. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además uno o más
inmunomoduladores distintos, inmunomodulador que se selecciona del
grupo que comprende: 3D-MPL y
\alpha-tocoferol.
8. Una composición según la reivindicación 7, en
la que la proporción de QS21:3D-MPL (p/p) es desde
1:10 hasta 10:1.
9. Una composición según la reivindicación 7 u
8, en la que la proporción de QS21:3D-MPL (p/p) es
desde 1:1 a 1:2,5.
10. Una composición según la reivindicación 5,
en la que la proporción de QS21:colesterol (p/p) está en el
intervalo de 1:1 a 1:20.
11. Una composición de vacuna que comprende una
composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que
comprende además un antígeno o una preparación antigénica.
12. Una composición de vacuna según la
reivindicación 11, en la que el antígeno o la preparación
antigénica se prepara a partir del grupo que comprende: virus de la
inmunodeficiencia humana; virus del herpes simple tipo 1; virus del
herpes simple tipo 2; citomegalovirus humano; hepatitis A, B, C o
E; virus sincitial respiratorio, virus del papiloma humano; virus
Influenza; Salmonella; Neisseria; Borrelia;
Chlamydia; Bordetella; TB; VEB; Plasmodium y
Toxoplasma.
13. Una composición de vacuna según la
reivindicación 11, en la que el antígeno o la preparación antigénica
es una combinación de los antígenos de la malaria RTS,S y TRAP.
14. Una composición de vacuna según la
reivindicación 11, en la que el antígeno o la preparación
antigénica es, o se deriva de, un antígeno derivado de huésped o
tumor.
15. Una composición según la reivindicación 1,
en la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite
que tienen un diámetro que es inferior a 1 micrómetro.
16. Una composición según la reivindicación 1,
en la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite
que están en el intervalo de 120 nm a 750 nm de diámetro.
17. Una composición según la reivindicación 1,
en la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite
que están en el intervalo de 120 nm a 600 nm de diámetro.
18. Una composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 11-14 que puede
activar una respuesta de células T citolíticas en un mamífero frente
al antígeno o a la composición antigénica.
19. Una composición de vacuna según una
cualquiera de las reivindicaciones 11-14 que puede
estimular la producción de interferón-\gamma en un
mamífero frente al antígeno o a la composición antigénica.
20. Una composición de adyuvante para vacuna
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en
medicina.
21. Un procedimiento para fabricar una vacuna
según las reivindicaciones 11 y 14, que comprende mezclar una
emulsión de aceite en agua; QS21; colesterol;
3D-MPL; \alpha-tocoferol; y un
antígeno o una preparación antigénica.
22. El uso de una composición según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores en la fabricación de una vacuna
adecuada para el tratamiento profiláctico de un ser humano propenso
a o que padece cualquiera de: virus de la inmunodeficiencia humana;
virus del herpes simple tipo 1; virus del herpes simple tipo 2;
citomegalovirus humano; hepatitis A, B, C o E; virus sincitial
respiratorio, virus del papiloma humano; virus Influenza;
Salmonella; Neisseria; Borrelia; Chlamydia;
Bordetella; TB; VEB; Plasmodium y
Toxoplasma.
23. Un procedimiento de estabilizar una saponina
presente en una composición según la reivindicación 1, que
comprende la adición de un esterol a la fase de aceite de dicha
emulsión de aceite en agua.
24. Un procedimiento según la reivindicación
23, en el que la saponina es QS21.
25. Un procedimiento según las reivindicaciones
23 ó 24, en el que el esterol es colesterol.
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