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JP2015518845A - 髄膜炎菌血清群ｘコンジュゲート - Google Patents

髄膜炎菌血清群ｘコンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、典型的には、（ａ）莢膜多糖内の第一ヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を有する酸化多糖をもたらすこと、および（ｂ）酸化多糖を、アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすことによって作製される。コンジュゲートは免疫原性組成物の一部であってよい。この組成物は、１種または複数種のさらなる抗原、特に、血清群Ａ、Ｗ１３５、ＣおよびＹ由来の莢膜多糖ならびにそのコンジュゲートした形態を含んでよい。組成物は水性製剤の状態であってよい。組成物は、ワクチン、例えば、哺乳動物において免疫応答を生じさせるためのワクチンとして有用である。本発明は、コンジュゲートを作製するためのプロセスも提供する。

Description

関連出願
本願は、２０１２年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／６５０，０２５号；２０１２年９月９日に出願された米国仮特許出願第６１／６９８，６７７号；および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９９，５２８号の利益を主張する。上述の出願の全体の内容は、あらゆる目的のために本明細書中に参考として援用される。
技術分野
本発明は、細菌莢膜糖、特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｘ莢膜多糖の分野にある。コンジュゲートを形成するために、多糖をキャリアとコンジュゲートすることができる。多糖およびコンジュゲートは、特に、水性製剤の状態で、免疫のために有用である。
背景技術
細菌の莢膜糖は、長年にわたり、莢膜形成菌（ｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対するワクチンに使用されている。しかし、糖はＴ細胞非依存性抗原であるので、免疫原性が低い。キャリアとコンジュゲートすることにより、Ｔ細胞非依存性抗原をＴ細胞依存性抗原に変換し、それにより、記憶応答を増強し、防御免疫の発生を可能にすることができる。したがって、最も有効な糖ワクチンは、複合糖質に基づくものであり、プロトタイプのコンジュゲートワクチンはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するものであった［例えば、参考文献８６の１４章を参照されたい］。
生物体の莢膜多糖に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群が１２種（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）同定されている。群Ａは、サハラ以南のアフリカにおいて流行性疾患に最も頻繁に関係づけられる病原体である。血清群ＢおよびＣは、ＵＳＡおよび大部分の先進国における症例の大部分に関与する。血清群Ｗ１３５およびＹは、ＵＳＡおよび先進国における残りの症例に関与する。血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５由来の莢膜多糖の四価ワクチンが長年公知である［１、２］。これは、青年および成人においては有効であるが、多糖は、追加免疫され得ない弱い免疫応答を誘導するＴ細胞非依存性抗原であるので、誘導される免疫応答が不十分であり、保護持続時間が短く、また、乳児には使用することができない［例えば、参考文献３］。このワクチンにおける多糖はコンジュゲートしていない［４］。血清群Ｃに対するコンジュゲートワクチンはヒトへの使用が承認されており、それらとしてＭｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）［５］、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）およびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）が挙げられる。血清群Ａ＋Ｃ由来のコンジュゲートの混合物が公知であり［６〜８］、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ由来のコンジュゲートの混合物が報告されている［９〜１３］。
群Ｘ莢膜多糖の構造は、１９７０年代以後公知であり［１４］、この血清群は、例えば、サハラ以南のアフリカおよび中国におけるいくつもの髄膜炎菌性疾患の大発生に関連づけられている［１５、１６］。血清群Ｘは、５歳未満の小児の間で血清群Ａよりも罹患率が有意に高いことが公知である。この血清群に対するワクチンの必要性は長年にわたって認識されているが［１７］、有効なワクチンは開発されていない。血清群Ｘに対するコンジュゲートワクチンが提唱されてきたが［１７、１８］、そのようなコンジュゲートが免疫原性であるまたはこの血清群に対して防御的であるかどうかは依然として不明である。
したがって、血清群Ｘ莢膜多糖のコンジュゲートが依然として必要である。さらに、この血清群によって引き起こされる疾患に対するワクチン接種のために使用することができるコンジュゲートが依然として必要である。
群Ｘ莢膜多糖の構造は、Ｏ−アセチル基を伴わない、α１−４ホスホジエステル結合によって結びついたＮ−アセチルグルコサミン−４−リン酸残基からなる［１９］：｛→４）−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−α−（１→ＯＰＯ３→｝（図１）。それらの構造間の類似性に基づいて、ＭｅｎＡ莢膜多糖とＭｅｎＸ莢膜多糖の間の生合成の関係が仮定されている［１４］。ＭｅｎＡ莢膜多糖は水溶液中で著しく加水分解する傾向がある［２０］。この不安定性は、マンノサミンのアノマー位が関与するホスホジエステル結合および２位のＮ−アセチル基が存在し、これによりホスホモノエステル基の離脱が補助されることによって引き起こされると考えられている［２１］。別の可能性は、６Ａ型肺炎球菌の莢膜多糖［２２］およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型の莢膜多糖［２３］において認められるように、Ｎ−アセチルマンノサミンサブユニットの４位のヒドロキシル基がホスホジエステル基と相互作用し、これにより内部の関与機構を介した加水分解が容易になることである。ＭｅｎＸ莢膜多糖とＭｅｎＡ莢膜多糖の構造が類似していること、特に、それらのアノマーホスホジエステル結合が共通であることは、ＭｅｎＸ多糖が水溶液中で同様の安定性問題にさらされ得ることを意味する。ＭｅｎＡ莢膜多糖が水溶液中で内因的に不安定であることは、ＭｅｎＡ莢膜多糖がワクチン（例えば、多糖ワクチンＭｅｎｃｅｖａｘ（商標）およびコンジュゲートワクチンＭｅｎＡｆｒｉＶａｃ（商標）、Ｍｅｎｖｅｏ（商標）およびＮｉｍｅｎｒｉｘ（商標））に含有される場合、多くの場合、凍結乾燥した形態で存在することを意味する。ＭｅｎＸ莢膜多糖は、同様に、その安定性を改善するために凍結乾燥した形態で存在し得るが、水性製剤がより都合がよい。水性製剤中にＭｅｎＡ莢膜多糖コンジュゲートを含有する唯一のワクチンはＭｅｎａｃｔｒａ（商標）であるが、このワクチンは、低い温度で貯蔵することが必要である。そのような低温貯蔵は費用がかかり、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＸの大発生が一般的な国の多く（例えば、サハラ以南のアフリカ）では実用的に困難である。
したがって、血清群Ｘ莢膜多糖およびそのコンジュゲートの水性製剤、特に、冷蔵を必要としない水性製剤が必要とされている。
ＭｅｎＸに対するワクチンの開発には、インプロセスアッセイとして使用することができる多糖定量化のためのおよび／または最終的なワクチンの特徴付けのための方法が必要である。ＭｅｎＸ莢膜多糖にリン酸基が存在することは、総リン含量を測定する比色定量方法［２４］によって多糖を定量化することができることを意味する。しかし、この方法は選択性を欠き、したがって、ある特定のインプロセス適用、例えば、リン酸緩衝液中で、またはリン酸を含有する不純物の存在下で多糖を分析するためには適さない。ＮＭＲがより選択的な方法であり、これはＭｅｎＸ多糖定量化のためにすでに提唱されている［２５］。しかし、この手法には純粋な試料および大量の材料が必要である。参考文献２６では、ＮＭＲよりも感度が高く、リン酸含量の測定よりも選択的である、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによってＭｅｎＸ多糖を定量化する代替の手法が実証されている。参考文献２６の著者らは、試料を加水分解してグルコサミンを生じさせ、放出されるグルコサミンの量を、Ｎ−アセチル−グルコサミン−６−リン酸定量標準物質から導かれた較正曲線に対して比較することによってＭｅｎＸ多糖を定量化した。しかし、グルコサミンは、コンタミネーションに起因して存在する可能性があり、これにより不正確な結果が導かれる。したがって、ＭｅｎＸ多糖をアッセイするための代替のまたは改善された方法、特に、ＭｅｎＸに対してより選択的な方法が必要とされている。
国際公開第２００５／０００３４５号 国際公開第０２／０５８７３７号 国際公開第０３／００７９８５号 国際公開第２００４／０１３４００号
発明の開示
本発明は、一部、血清群Ｘ莢膜多糖をキャリア分子とコンジュゲートするための方法に基づく。本発明者らは、生じるコンジュゲートが免疫原性であり、殺菌性抗体応答を誘導することができることを見いだした。したがって、血清群Ｘコンジュゲートは、免疫原性組成物、特にワクチンにおいて有用である。本発明者らは、血清群Ｘ莢膜多糖抗原、例えば血清群Ｘコンジュゲートを、他の抗原と、血清群Ｘに対する免疫応答を失うことなく組み合わせることが可能であることも発見した。詳細には、血清群Ｘコンジュゲートを他のコンジュゲート、例えば、他の細菌莢膜糖抗原を含むコンジュゲートと組み合わせることができる。血清群Ｘコンジュゲートは、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群、例えば血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来の莢膜糖抗原を含むコンジュゲートとの組合せに特に適している。これらの組合せでは、血清群Ｘコンジュゲートがその免疫原性を保持するだけでなく、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹコンジュゲートもそれらの免疫原性を保持する。さらに、本発明者らは、構造が血清群Ａ莢膜多糖と類似しているにもかかわらず、血清群Ｘ由来の莢膜多糖が驚いたことに 溶液中で安定であることも見いだした。したがって、血清群Ｘ莢膜多糖およびそのコンジュゲートは、水性製剤に使用するために特に適し得る。
第１の態様では、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを提供する。本発明者らは、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子の特に安定なコンジュゲートを、下記の本発明の第２の態様の第１の実施形態のプロセスを使用して作製することができることを見いだした。例えば、コンジュゲートは、３７℃で２８日後に５０％未満の遊離糖を含有してよい。％遊離糖は、下の安定性試験（２）に記載の通り決定することができる。したがって、本発明の第１の態様の中で、本発明は、３７℃で２８日後に５０％未満の遊離糖を含む血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを提供する。詳細には、コンジュゲートは、２５％未満の遊離糖、特に、２０％未満の遊離糖、より詳細には１５％未満の遊離糖、例えば、約１０％遊離糖を含んでよい。
第２の態様では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセス、特に、下記の第１の実施形態、第２の実施形態および第３の実施形態のプロセスを提供する。第２の態様は、下記の第４の実施形態のプロセスも提供する。本発明の第１の態様のコンジュゲートは、典型的には、これらのプロセスの１つによって得られたまたは得ることができる。しかし、その代わりに、第１の態様のコンジュゲートは、任意の適切な方法によって作製することができる。本発明のコンジュゲートをこれらの他の方法の１つによって作製する場合、当該方法は、典型的には、ａ）多糖をリンカーとカップリングさせて、多糖−リンカー中間体を形成するステップであって、リンカーの遊離末端がエステル基であり、詳細には、カップリングが、間接的に、すなわち多糖をリンカーとカップリングする前に誘導体化するために使用される追加的なリンカーを用いて起こるステップ；およびｂ）多糖の還元末端のカルボニル基とリンカーの一方の末端の第一アミン基を反応させることによって還元的アミノ化を行うステップの一方または両方を伴わない。
第３の態様では、本発明は、（ａ）血清群Ｘ莢膜多糖、特に本発明の第１の態様のコンジュゲートの形態の血清群Ｘ莢膜多糖と、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。組成物は、典型的には水性製剤の状態である。
他の態様では、本発明は、本発明のプロセスにおいて有用な中間体およびこれらの中間体を調製するためのプロセスを提供する。本発明は、例えば免疫原性組成物、特にワクチンへの、および哺乳動物において免疫応答を上昇させるための、本発明のコンジュゲートの使用も提供する。
本発明の第２の態様の第１の実施形態では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、（ａ）莢膜多糖内の第一ヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を有する酸化多糖をもたらすステップと、（ｂ）酸化多糖を、アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスを提供する。このプロセスは、比較的長い多糖、例えば、重合度（ＤＰ）が２０から２００の間、特に、６０から１００の間（例えば、７０から９０の間、特に、約８０）である多糖に特に適していると考えられている（例えば、収率に関して）。また、このプロセスは、含まれるステップが比較的少なく、それにより工業的設定にスケールアップすることが容易である。また、生じたコンジュゲートは、特に、多糖がその還元末端を介してキャリアに連結しているコンジュゲートと比較してより安定であり得る。ステップ（ｂ）におけるカップリングは、典型的には直接的であり、例えば、アルデヒド基とキャリア分子の第一アミン基の間の還元的アミノ化によるものである。本発明の第１の態様の一部として、本発明は、このプロセスによって得られたまたは得ることができるコンジュゲートも提供する。本発明は、このプロセスの個々のステップ（ａ）および（ｂ）、ならびにこのプロセスのステップ（ａ）によって得られたまたは得ることができる酸化多糖中間体も提供する。
本発明の第２の態様の第２の実施形態では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、（ａ）莢膜多糖の還元末端の還元的アミノ化を行って、末端サブユニットのＣ−１原子に第一アミン基が共有結合によって結合した改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）改変多糖を、第一アミン基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスを提供する。このプロセスは、比較的短い多糖、例えば、ＤＰが５から５０の間、特に１０から２０の間、例えば、約１５である多糖に特に適している。ステップ（ｂ）におけるカップリングは、典型的には間接的であり、例えば、リンカーを介する。本発明の第１の態様の一部として、本発明は、このプロセスによって得られたまたは得ることができるコンジュゲートも提供する。本発明は、このプロセスの個々のステップ（ａ）および（ｂ）、ならびに、このプロセスのステップ（ａ）によって得られたまたは得ることができる改変多糖中間体も提供する。
本発明の第２の態様の第３の実施形態では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、（ａ）莢膜多糖の還元末端を還元して、末端に２つの隣接するヒドロキシル基を有する改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）隣接するヒドロキシル基の酸化的切断を行って、末端にアルデヒド基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｃ）アルデヒド基の還元的アミノ化を行って、末端に第一アミン基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｄ）さらなる改変多糖を、第一アミン基を介してキャリア分子にカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスを提供する。このプロセスにより、特に、比較的短い多糖、例えば、ＤＰが５から５０の間、特に１０から２０の間、例えば、約１５である多糖に関して、第１の実施形態および第２の実施形態のプロセスよりもよい収率がもたらされ得る。ステップ（ｄ）におけるカップリングは、典型的には間接的であり、例えば、リンカーを介する。本発明の第１の態様の一部として、本発明は、このプロセスによって得られたまたは得ることができるコンジュゲートも提供する。本発明は、このプロセスの個々のステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）ならびにステップ（ａ）と（ｂ）の組合せ、ステップ（ｂ）と（ｃ）の組合せ、ステップ（ｃ）と（ｄ）の組合せ、ステップ（ａ）と（ｂ）と（ｃ）の組合せおよびステップ（ｂ）と（ｃ）と（ｄ）の組合せ、ならびにこのプロセスのステップ（ａ）、（ｂ）または（ｃ）によって得られたまたは得ることができる改変多糖中間体も提供する。
本発明の第２の態様の第４の実施形態では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、（ａ）莢膜多糖の還元末端を還元して、末端に２つの隣接するヒドロキシル基を有する改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）隣接するヒドロキシル基の酸化的切断を行って、末端にアルデヒド基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｃ）キャリア分子の第一アミン基でのアルデヒド基の還元的アミノ化によってさらなる改変多糖とキャリア分子を直接カップリングして、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスを提供する。本発明の第１の態様の一部として、本発明は、このプロセスによって得られたまたは得ることができるコンジュゲートも提供する。本発明は、このプロセスの個々のステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）ならびにステップ（ａ）と（ｂ）の組合せおよびステップ（ｂ）と（ｃ）の組合せ、ならびに、このプロセスのステップ（ａ）または（ｂ）によって得られたまたは得ることができる改変多糖中間体も提供する。
本発明者らは、血清群Ｘ莢膜多糖をアッセイするための方法も開発した。当該方法は、ＭｅｎＸ多糖に特徴的であり、通常は不純物には存在しないグルコサミン−４−リン酸を検出することを伴う。したがって、なおさらなる態様では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖を含有する疑いがある試料をアッセイするための方法であって、（ｉ）試料中の任意の血清群Ｘ莢膜多糖を加水分解して、加水分解産物をもたらすステップと、（ｉｉ）加水分解産物を液体クロマトグラフィーに供するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において分離された任意のグルコサミン−４−リン酸を検出するステップとを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−リン酸を調製するために有用なプロセスおよび試薬を提供する。この化合物を、上記の血清群Ｘ莢膜多糖をアッセイするための方法において分析標準物質として使用することができる。
莢膜多糖
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｘの莢膜多糖に関する。群Ｘ莢膜多糖の構造は、Ｏ−アセチル基を伴わない、α１−４ホスホジエステル結合によって結びついたＮ−アセチルグルコサミン−４−リン酸残基からなる［１９］：｛→４）−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−α−（１→ＯＰＯ３→｝（図１）。
莢膜多糖は、公知の技法によって、例えば、参考文献１９に記載されている方法によって精製することができる。一般に、髄膜炎菌性の莢膜多糖は、多糖沈殿（例えば、陽イオン界面活性剤を使用して）、エタノール分画、低温フェノール抽出（タンパク質を除去するため）および超遠心分離（ＬＰＳを除去するため）のステップを含むプロセスによって調製される［例えば、参考文献２７］。しかし、血清群Ｘ莢膜多糖に対して好ましいプロセスは参考文献１０に記載されている。このプロセスは、多糖沈殿、続いて、低級アルコールを使用して沈殿した多糖を可溶化することを伴う。沈殿は、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）、または臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩などの陽イオン界面活性剤を使用して実現することができる。典型的には臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）が使用される［２８］。沈殿した材料の可溶化は、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどの低級アルコールを使用して実現することができるが、ＣＴＡＢ−多糖複合体の可溶化にはエタノールが特に適している。エタノールは、沈殿した多糖に、最終的なエタノール濃度（エタノールおよび水の総含量に基づいて）が５０％から９５％の間になるように添加することが好ましい。
再可溶化後、多糖をさらに処理して混入物を除去することができる。これは、軽微なコンタミネーションさえも許容されない状況において（例えば、ヒト用ワクチンを作製するために）特に重要である。これは、典型的には、１つまたは複数の濾過のステップ、例えば、活性炭を通した濾過を使用することができる深層濾過、サイズ濾過および／または限外濾過を伴う。
濾過して混入物を除去したら、多糖を、さらに処理および／または加工するために沈殿させることができる。これは、陽イオンを交換すること（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩を添加することによって）によって都合よく実現することができる。
しかしながら、本発明は、天然の供給源から精製された多糖に限定されず、多糖は、全合成または部分合成などの他の方法によって、例えば、参考文献２９に記載されている酵素的合成によって得ることができる。
多糖は、天然に見いだされる莢膜多糖と比較して化学的に改変することができる。例えば、多糖は、脱Ｎ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（部分的にまたは完全に）などを受け得る。脱アセチル化は、コンジュゲーションの前、その間、またはその後に行うことができるが、典型的にはコンジュゲーションの前に行う。本発明において使用される血清群Ｘ莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、または９５〜１００％であってよい。典型的には、Ｎ−アセチル化の程度は１００％である。多糖のＮ−アセチル化の程度は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、プロトンＮＭＲ（例えば、参考文献３０および３１に記載されているとおり）によって決定することができる。
一般に、莢膜多糖はオリゴ糖の形態で使用される。これらは、精製された莢膜多糖を断片化し（例えば、加水分解によって）、通常その後に所望のサイズの断片を精製することによって都合よく形成される。
多糖の断片化は、オリゴ糖の最終の平均重合度（ＤＰ）が２０から２００の間、特に、６０から１００の間（例えば、７０から９０の間、特に、約８０）になるように実施されることが好ましい。本発明者らは、この長さの多糖が上記の第１の実施形態のプロセスにおいて使用するために特に適していることを見いだした。しかし、本発明者らは、それよりも短い多糖、例えば、ＤＰが５から５０の間、特に、１０から２０の間、例えば、約１５である多糖も使用することができることを見いだした。本発明者らは、この長さの多糖が上記の第２の実施形態および第３の実施形態のプロセスにおいて使用するために特に適していることを見いだした。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィー、ＮＭＲによって、または比色定量アッセイによって都合よく測定することができる［３２］。
多糖は、所望の範囲の多糖サイズが得られるようなサイズにすることができる［３３］。これは、限外濾過し、その後イオン交換クロマトグラフィーを行うなどの種々のやり方で実現することができる。
キャリア分子
本発明は、典型的にはタンパク質であるキャリア分子の使用に関する。一般に、糖とキャリアの共有結合性コンジュゲーションにより、Ｔ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原に変換されるので、糖の免疫原性が増強され、したがって、免疫学的記憶を刺激することが可能になる。コンジュゲーションは小児用ワクチンに対して特に有用であり［例えば、参考文献３４］、周知の技法である［例えば、参考文献３５〜４３に概説されている］。
好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素、例えば、ジフテリアまたは破傷風の毒素、またはそのトキソイドもしくは変異体、特に、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどである。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［４４］が特に適していることを見いだした。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［４５〜４７］も使用することができる。
他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［４８］、合成ペプチド［４９、５０］、熱ショックタンパク質［５１、５２］、百日咳タンパク質［５３、５４］、サイトカイン［５５］、リンフォカイン［５５］、ホルモン［５５］、増殖因子［５５］、ヒト血清アルブミン（典型的には組換え型）、種々の病原体由来の抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［５６］、例えばＮ１９［５７］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［５８］、ニューモリシン［５９］またはその無毒性誘導体［６０］、鉄取り込みタンパク質（ｉｒｏｎ−ｕｐｔａｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）［６１］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［６２］、ＧＢＳタンパク質［６３］、ＧＡＳタンパク質［６４］などが挙げられる。
他の適切なキャリアタンパク質は参考文献６５に記載されており、特に、当該文献の配列番号９のキャリアタンパク質である。これらのキャリアタンパク質は参考文献６６にも記載されており、下の「例示的なキャリアタンパク質」の節でさらなる詳細が提供される。
酸化
上記の第１の実施形態のプロセスのステップ（ａ）では、莢膜多糖内の第一ヒドロキシル基が酸化されてアルデヒド基がもたらされる。第一ヒドロキシル基は、ＭｅｎＸ莢膜多糖サブユニットのＣ−６原子に共有結合によって結合しており、したがって、ステップは以下の通り進行する：
このステップは２つ以上のそのような第一ヒドロキシル基の酸化が関与し得、その結果、多糖鎖に沿って２つ以上のアルデヒド基が導入される。例えば、本発明者らは、血清群Ｘ多糖内の残基の１〜５０％の間、特に、１〜２０％、および、より詳細には１〜１０％、例えば、約４〜８％の第一ヒドロキシル基を酸化することによって適切なコンジュゲートを調製することができることを見いだした。ヒドロキシル基は種々の酸化反応（例えば、Ｓｗｅｒｎ酸化、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ酸化、ＣｒＶＩ酸化など）によってアルデヒドに変換することができる。しかし、本発明者らは、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシラジカル）媒介性酸化が特に適切であることを見いだした。ＴＥＭＰＯ媒介性酸化は参考文献６７に記載されている。アルデヒド基が酸化してカルボキシル基になることを防ぐために、非水系条件で、例えば、参考文献６８に記載されているＤＭＦ溶媒を使用してＴＥＭＰＯ媒介性酸化を行うことが好ましい。当業者は酸化に適した条件を同定することができよう。例えば、本発明者らは、多糖を、０℃で一晩、ＴＥＭＰＯ（ＭｅｎＸ反復サブユニットに対して０．０６ｅｑ）、ＮａＨＣＯ３（ＭｅｎＸ反復サブユニットに対して９ｅｑ）およびＴＣＣ（トリクロロイソシアヌル酸、ＭｅｎＸ反復サブユニットに対して２ｅｑ）を用いて処理することが適していることを見いだした。
酸化的切断
上記の第３の実施形態および第４の実施形態のプロセスのステップ（ｂ）では、莢膜多糖の２つの隣接するヒドロキシル基が酸化的切断を受けて、アルデヒド基がもたらされる：
酸化的切断（例えば、ＮａＩＯ４、Ｐｂ（ＯＡｃ）４などを使用する）は当技術分野において周知である。本発明者らは、ｐＨ７．２、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液中６〜８ｍｇ／ｍｌの多糖を、ＮａＩＯ４（ＭｅｎＸの分子量に対して１０ｅｑ、固体）と室温で１．５時間反応させることが適していることを見いだした。
還元
上記の第３の実施形態および第４の実施形態のプロセスのステップ（ａ）では、莢膜多糖の還元末端を還元して、末端に２つの隣接するヒドロキシル基を有する改変多糖をもたらす：
多糖の還元（例えば、ＮａＢＨ４などを使用する）は当技術分野において周知である。本発明者らは、ｐＨ８、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液中１５ｍｇ／ｍｌの多糖を、ＮａＢＨ４（ＭｅｎＸの分子量に対して１２ｅｑ、固体）と室温で１．５時間反応させることが適していることを見いだした。
還元的アミノ化
上記の第２の実施形態のプロセスのステップ（ａ）では、莢膜多糖の還元末端を還元的アミノ化に供して、末端サブユニットのＣ−１原子に第一アミン基が共有結合によって結合した改変多糖をもたらす：
還元的アミノ化は有機化学における標準技法である。例えば、アンモニアを使用して、還元末端のアルデヒド基を第一アミン基に変換することができる。これは、アンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウムまたは酢酸アンモニウム）を適当な還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ３ＣＮなど；ボラン−ピリジン；トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム；水素化ホウ素交換樹脂）と組み合わせて使用して都合よく実現することができる。当業者は、還元的アミノ化に適した条件を同定することができよう。
還元的アミノ化は、上記の第３の実施形態のプロセスのステップ（ｃ）においても、末端に第一アミン基を有する改変多糖をもたらすために行われる。例えば、アルデヒド基を上記の通り第一アミン基に変換することができる。したがって、還元的アミノ化により、第一アミン基が末端サブユニットのＣ−５原子に共有結合によって結合した改変多糖がもたらされる：
しかし、第３の実施形態の他の例では、還元的アミノ化は、アルデヒド基とリンカーの末端第一アミン基の間のものである。リンカーは、アルデヒド基と反応させるための第１の末端第一アミン基、および改変多糖の末端の第一アミン基としての機能を果たす第２の末端第一アミン基をもたらす二官能性リンカーである。例えば、式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の二官能性リンカーをリンカーとして使用することができ、式中、Ｘ１はアルデヒド基と反応することができる第一アミン基を含み、Ｘ２は第一アミン基を含み、Ｌはリンカーの連結部分である。典型的なＬ基は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）、特に、−（ＣＨ２）４−である。式Ｘ−Ｌ−Ｘのホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーがリンカーとして特に適しており、式中、２つのＸ基は互いに同じであり、Ｌはリンカーの連結部分である。典型的なＸ基は−ＮＨＮＨ２基である。Ｌは、典型的には式−Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’−を有し、式中、Ｌ’はカルボニルである。典型的なＬ２基は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）、特に、−（ＣＨ２）４−である。したがって、典型的なリンカーはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である。それよりも短いリンカー、例えば、カルボジヒドラジン（ＣＤＨ、すなわちＸ−Ｌ−Ｘ、式中、Ｘは−ＮＨＮＨ２であり、Ｌはカルボニルである）も使用することができる。
還元的アミノ化は、上記の第４の実施形態のプロセスのステップ（ｃ）においても、コンジュゲートをもたらすために行われる。還元的アミノ化は、さらなる改変多糖のアルデヒド基とキャリア分子の第一アミン基の間のものである。
キャリア分子とのカップリング
上記の第１の実施形態のステップ（ｂ）における酸化多糖とキャリア分子のアルデヒド基を介したカップリングは、直接的でもリンカーを介してもよい。しかし、カップリングは、必要な合成ステップが少ないので、直接的であることが好ましい。上記の第２の実施形態のステップ（ｂ）における改変多糖とキャリア分子の第一アミン基を介したカップリングはまた、直接的でもリンカーを介してもよい。この実施形態では、典型的には、多糖とキャリア分子の間に空間をもたらすために、リンカーが使用される。上記の第３の実施形態のステップ（ｄ）における改変多糖とキャリア分子の第一アミン基を介したカップリングはまた、直接的でもリンカーを介してもよい。この実施形態では、典型的には、同様に、多糖とキャリア分子の間に空間をもたらすために、リンカーが使用される。３つの実施形態全てについて、任意の適切なコンジュゲーション反応を、所望であれば任意の適切なリンカーを用いて使用することができる。
多糖またはリンカー誘導体化多糖のキャリアへの結合は、典型的には、例えば、リシンの側鎖またはキャリアタンパク質の残基、またはアルギニン残基の第一アミン（−ＮＨ２）基を介する。キャリアへの結合は、例えば、システイン残基の側鎖のスルフヒドリル（−ＳＨ）基を介するものであってもよい。
上記の第１の実施形態のプロセスについて、本発明者らは、直接カップリングを、酸化多糖のアルデヒド基とキャリアのアミン基を還元的アミノ化によって反応させることによって都合よく実現することができることを見いだした。したがって、この実施形態では、この種の直接カップリングが好ましい。上記の通り、還元的アミノ化は、標準技法であり、ワクチンに使用するための莢膜多糖のコンジュゲートの作製において広範囲にわたって使用されている。１つの手法では、酸化多糖のアルデヒド基とキャリアのアミン基を反応させる。これは、適当な還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ３ＣＮなど；ボラン−ピリジン；トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム；水素化ホウ素交換樹脂など）の存在下で多糖とキャリアとを組み合わせることによって都合よく実現することができる。当業者は、還元的アミノ化に適した条件を同定することができよう。例えば、本発明者らは、酸化多糖を、ｐＨ７．２、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液中、ｗ／ｗ比４：１の１０ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７およびｗ／ｗ比１：１のＮａＢＨ３ＣＮを用いて処理することが適していることを見いだした。この混合物を３７℃でゆっくり撹拌しながら７２時間放置して、還元的アミノ化を実施することができる。この実施形態では、所望であれば、例えば、酸化多糖のアルデヒド基とリンカーのアミン基を還元的アミノ化によって反応させることによって、またはリンカーの結合のためのアミン基をもたらすために還元的アミノ化によってアルデヒド基をアミン基に変換することによって、リンカーを介したカップリングを使用することができる。
全ての実施形態のプロセスにおいて、任意の公知の手順を使用してリンカーを介したカップリングを行うことができる。例えば、多糖が、アルデヒド基（例えば、上記の第１の実施形態のプロセスのステップ（ａ）において生じたアルデヒド基）を含む場合、二官能性リンカーを使用して、アルデヒド基とカップリングするための第１の基およびキャリアとカップリングするための第２の基をもたらすことができる。例えば、式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の二官能性リンカーを使用することができ、式中、Ｘ１はアルデヒドと反応することができ、Ｘ２はキャリアと反応することができ、Ｌはリンカーの連結部分である。典型的なＸ１基はアミン基である。典型的なＬ基は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）例えば、−（ＣＨ２）４−または−（ＣＨ２）３−である。同様に、多糖が第一アミン基（例えば、第２の実施形態のプロセスのステップ（ａ）において生じた第一アミン基または第３の実施形態のプロセスのステップ（ｃ）において生じた第一アミン基）を含む場合、二官能性リンカーを使用して、アミン基とカップリングするための第１の基およびキャリアとカップリングするための（典型的には、キャリアのアミンとカップリングするための）第２の基をもたらすことができる。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘのホモ二官能性リンカーを使用することができ、式中、２つのＸ基は互いに同じであり、アミンと反応することができ、また、式中、Ｌはリンカーの連結部分である。典型的なＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、典型的には式−Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’−を有し、式中、Ｌ’はカルボニルである。典型的なＬ２基は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）例えば、−（ＣＨ２）４−である。したがって、典型的なリンカーは、アジピン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）：
である。
他のＸ基は、ＨＯ−Ｌ−ＯＨと組み合わせるとエステルを形成するもの、例えば、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。本発明で使用するための、アミンと反応するさらなる二官能性リンカーとしては、アクリロイルハロゲン化物（例えば、塩化物）［７０］、ハロアシルハライド［７１］、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］などが挙げられる。
リンカーは、一般に、多糖に対してモル過剰で加えられる。リンカーは典型的には水に不溶性であるので、リンカー／多糖反応は一般に非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、酢酸エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）など）中で行われる。しかし、水溶性リンカーを使用する場合には、水などのプロトン性溶媒を含めたより広い範囲の溶媒が利用可能である。適切なリンカーとしては、スルホン化された形態、例えば、スルホン化ＳＩＤＥＡ：
が挙げられる。
リンカーを使用する場合、コンジュゲートはリンカー部分を含む。この部分は多糖にもキャリアにも由来せず、コンジュゲート調製の間に使用される第３の分子であり、最終のコンジュゲート生成物において多糖およびキャリアタンパク質のどちらとも容易に区別することができる。リンカー部分は、炭素、水素、酸素および／または窒素などの原子を含んでよい。炭素および水素を含むリンカーが典型的であり、酸素および／または窒素をさらに含むリンカーも典型的には使用される。窒素原子を含むリンカーでは、窒素原子と結合した炭素原子を含んでよく、その窒素原子が今度は第２の炭素原子と結合している（−Ｃ−Ｎ−Ｃ−）。酸素原子を含むリンカーは、典型的には、酸素原子をカルボニル基の一部として含む。分子量が３０〜５００Ｄａの間のリンカー部分が一般的である。２つのカルボニル基を含有するリンカーも一般的である。
特に有用なリンカー部分は−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−であり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。ｎの値は典型的には４である。このリンカーの末端−ＮＨ−は通常、多糖部分由来の炭素原子に結合する。末端−Ｃ（Ｏ）−は通常、キャリアのアミノ酸の側鎖の窒素原子に結合する。好ましいリンカー部分は、多糖の−ＮＨ２基と、二酸（ｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）（例えば、アジピン酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ）のジエステル（例えば、ジスクシンイミジルエステル）である二官能性リンカーとの反応、およびその生成物の還元的アミノ化を伴うプロセスによって都合よく導入することができる（図６参照［６９］）。
リンカーを多糖の−ＮＨ２基に結合させるために使用することができる他の化学作用としては、以下が挙げられる：
−アクリロイル化（例えば、アクリロイル塩化物との反応による）、続いて、アミノ酸の側鎖のε−ＮＨ２またはシステイン側鎖の−ＳＨのいずれかへのマイケル付加［７０］。生じるリンカーは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−（プロピオンアミド）である。
−ハロアシルハライドとの反応、続いて、アミノ酸の側鎖のε−ＮＨ２またはシステイン側鎖の−ＳＨとの反応［７１］。リンカーは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−である。
典型的には、多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）が１：２０（すなわち、タンパク質過剰）から２０：１（すなわち、多糖過剰）の間であるコンジュゲートが本発明の方法によって作製される。１：１０〜１：１の比、特に、１：２から１：１の間の比が好ましく、約１：１．５が最も好ましい。本発明の第２の態様の第１の実施形態のプロセスによって作製されるコンジュゲートに関しては、典型的な比は、０．１から１．０の間、より詳細には０．２から０．４の間、例えば、約０．３５である。本発明の第２の態様の第２の実施形態のプロセスによって作製されるコンジュゲートに関しては、典型的な比は、０．１から１．０の間、より詳細には０．１から０．３の間、例えば、約０．２２である。本発明の第２の態様の第３の実施形態のプロセスによって作製されるコンジュゲートに関しては、典型的な比は、０．１から１．０の間、より詳細には０．１から０．３の間、例えば、約０．２１である。
組成物は、少量の遊離キャリアを含んでよい［７２］。所与のキャリアタンパク質が本発明の組成物において遊離の形態とコンジュゲートした形態の両方で存在する場合、コンジュゲートしていない形態は、組成物全体中のキャリアタンパク質の総量の５％以下であることが好ましく、２重量％未満で存在することがより好ましい。
コンジュゲーション後に、遊離多糖およびコンジュゲートした多糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーションなどを含めた多くの適切な方法が存在する［参考文献７３＆７４なども参照されたい］。
コンジュゲートと他の抗原の組合せ
本発明は、上記の個々のコンジュゲートを提供するだけでなく、本発明のコンジュゲートと１種または複数種のさらなる抗原とを含む組成物も提供する。組成物は、典型的には免疫原性組成物である。
さらなる抗原（複数可）は、さらなるコンジュゲートを含んでよい。これらの実施形態では、例えばキャリア抑制のリスクを低下させるために、組成物中の異なるコンジュゲートに対して２種以上のキャリアを使用することが可能である。典型的には、本発明のコンジュゲートを含めた全てのコンジュゲートに対して同じキャリアを使用する。しかし、本発明者らは、本発明のコンジュゲートに対して異なるキャリアを使用することにより、コンジュゲートをさらなるコンジュゲート（複数可）と組み合わせた際の免疫干渉を低下させることができることを見いだした。したがって、一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートに１種のキャリア（特に、破傷風トキソイドまたは参考文献６５および参考文献６６の配列番号９）を使用し、一方、さらなるコンジュゲート（複数可）には異なるキャリア（特に、ＣＲＭ１９７）を使用する。
単一のキャリアタンパク質に２種以上の多糖抗原を保有させることができる［７５、７６］。この目標を実現するために、異なる多糖をコンジュゲーションプロセスの前に混合することができる。しかし、典型的には、各多糖について別々のコンジュゲートが存在し、異なる多糖をコンジュゲーション後に混合する。別々のコンジュゲートは、典型的には、上記の通り同じキャリアに基づく。
さらなる抗原（複数可）は、詳細には、血清群Ａ莢膜多糖、血清群Ｃ莢膜多糖、血清群Ｙ莢膜多糖および血清群Ｗ１３５莢膜多糖からなる群から選択することができる。典型的には、この群から選択されるさらなる抗原（複数可）を、それぞれ別々にキャリアタンパク質とコンジュゲートする。好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素、例えば、ジフテリアまたは破傷風の毒素、またはそのトキソイドもしくは変異体、特に、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドである。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体が特に適していることを見いだした。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄも使用することができる。典型的には、必要に応じて本発明のコンジュゲートを含めた全てのコンジュゲートに対して同じキャリアタンパク質を使用する。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体が特に適していることを見いだしたが、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドも使用することができる。上記の通り、本発明者らは、本発明のコンジュゲートに対して異なるキャリアを使用することにより、コンジュゲートをさらなるコンジュゲート（複数可）と組み合わせた際の免疫干渉を低下させることができることを見いだした。したがって、一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートに１種のキャリア（特に、破傷風トキソイドまたは参考文献６５および参考文献６６の配列番号９）を使用し、一方、さらなるコンジュゲート（複数可）には異なるキャリア（特に、ＣＲＭ１９７）を使用する。
以下の組合せが、特に本発明において使用されることが想定される：
１）本発明のコンジュゲートおよび血清群Ａ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート；
２）本発明のコンジュゲートおよび血清群Ｗ１３５莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート；
３）本発明のコンジュゲート、血清群Ａ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート、および血清群Ｗ１３５莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート；ならびに
４）本発明のコンジュゲート、血清群Ａ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート、血清群Ｃ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート、血清群Ｗ１３５莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート、および血清群Ｙ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲート。
血清群Ｘおよび血清群Ａおよび／または血清群Ｗ１３５由来の抗原を含めることによって、組合せ１）〜３）を含む組成物により、アフリカにおけるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ疾患の大多数を引き起こしている血清群に対する防御をもたらすことができる。したがって、そのような組合せが特に好ましい。さらなる抗原、例えば、組合せ４）に含まれる血清群Ｃおよび血清群Ｙ由来の抗原を添加することにより追加的な防御がもたらされ得るが、それに伴う追加的な費用にこの追加的な防御の利益がまさることができない。したがって、本発明の一部の実施形態では、組成物は、血清群Ｃ由来の抗原、詳細には血清群Ｃ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲートを含有しない。同様に、本発明の同じまたは他の実施形態では、組成物は、血清群Ｙ由来の抗原、詳細には血清群Ｙ莢膜多糖とキャリアタンパク質とのコンジュゲートを含有しない。
さらなる抗原（複数可）は、追加的な細菌抗原、ウイルス抗原または寄生虫抗原を含んでよい。これらは以下から選択することができる：
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、参考文献７７〜７９；参考文献８６の２２章＆２３章］。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、不活化ウイルス［例えば、８０、８１；参考文献８６の１５章］。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、表面抗原および／またはコア抗原［例えば、８１、８２；参考文献８６の１６章］。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、８３］。
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じて、パータクチンおよび／または凝集原２および３の組み合わせ［例えば、参考文献８４＆８５；参考文献８６の２１章］。
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献８６の１３章］。
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイドなど［例えば、参考文献８６の２７章］。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖抗原［例えば、参考文献８６の１４章］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、９４］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、９５］。
−ポリオ抗原（複数可）［例えば、９６、９７；参考文献８６の２４章］、例えば、ＩＰＶ。
−狂犬病抗原（複数可）［例えば、９８］ 例えば、凍結乾燥不活化ウイルス［例えば９９、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］。
−麻疹抗原、流行性耳下腺炎抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献８６の１９章、２０章および２６章］。
−インフルエンザ抗原（複数可）［例えば、参考文献８６の１７章＆１８章］、例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１００］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１０１、１０２、１０３］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、６４、１０４〜１０６］。
−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献１０７、１０８および１０９に記載のＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株およびＳＥ−１０株から得ることができるＩ型莢膜多糖、ＩＩ型莢膜多糖および／またはＩＩＩ型莢膜多糖。
糖または炭水化物抗原を使用する場合、典型的には免疫原性を増強するためにキャリアとコンジュゲートする。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、髄膜炎菌性糖抗原および肺炎球菌糖抗原のコンジュゲーションが周知である。
毒性のタンパク質抗原は、必要な場合には解毒することができる（例えば、化学的手段および／または遺伝学的手段による百日咳毒素の解毒［８５］）。
組成物中にジフテリア抗原が含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれることが一般的である。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含まれることが一般的である。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが一般的である。
抗原は、アルミニウム塩に吸着させることができる。
組成物中の抗原は、典型的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を引き出すために十分な濃度である。
本発明の組成物においてタンパク質抗原を使用することに対する代替として、抗原をコードする核酸を使用することができる［例えば、参考文献１１０〜１１８］。したがって、本発明の組成物のタンパク質構成成分を、そのタンパク質をコードする核酸（通常ＤＮＡ、例えばプラスミドの形態で）で置き換えることができる。
実際面で、本発明の組成物に含める抗原の数には上限があり得る。本発明の組成物における抗原の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、または３未満であり得る。
医薬組成物および方法
本発明は、（ａ）特に本発明のコンジュゲートの形態の血清群Ｘ莢膜多糖と、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物を提供する。典型的な「薬学的に許容されるキャリア」としては、それ自体は組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、典型的には、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸共重合体、スクロース［１１９］、トレハロース［１２０］、ラクトース、および脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソームなど）である。そのようなキャリアは、当業者に周知である。ワクチンは、例えば、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含有してよい。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが存在してよい。滅菌された、発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水が典型的なキャリアである。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な考察が参考文献１２１において入手可能である。
本発明の組成物は水性製剤（すなわち、液剤または懸濁剤）であってもよく、乾燥した形態（例えば、凍結乾燥）であってもよい。本発明者らは、血清群Ｘ莢膜多糖は驚いたことに水性環境で安定であることを見出したので、水性製剤が好ましい。乾燥ワクチンを使用する場合には、それを注射前に水性製剤に再構成する。コンジュゲートワクチンの凍結乾燥は当技術分野で公知であり、例えば、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）製品は凍結乾燥形態で存在するが、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）およびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）は水性形態で存在する。凍結乾燥中のコンジュゲートを安定化するために、糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）を、例えば、１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約２５ｍｇ／ｍｌ）で組成物に含めることが典型的であり得る。これらの安定剤は再構成後の水性製剤中に存在してよい。
組成物はバイアル中に存在してもよく、充填済み（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジ中に存在してもよい。シリンジは、針を伴ってまたは伴わずに供給することができる。シリンジは組成物の単回用量を含むが、バイアルは単回用量を含んでも複数回用量を含んでもよい。
本発明の水性製剤は、他のワクチンを凍結乾燥形態から再構成するためにも適している。本発明の組成物がそのような即時再構成のために使用するためのものである場合、本発明は、バイアルを２つ含んでもよく、充填済みシリンジを１つとバイアルを１つ含み、シリンジの内容物が、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために使用されるものであってもよいキットを提供する。
本発明の組成物は、単位用量形態または複数回用量形態に包装することができる。複数回用量形態については、バイアルがプレフィルドシリンジよりも好ましい。有効な投与量の体積は常套的に確立することができるが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射については体積０．５ｍｌである。
組成物のｐＨは、典型的には、６から８の間、例えば、約７である。安定なｐＨは緩衝液を使用することによって維持することができる。例えば本発明の水性製剤において使用するための典型的な緩衝液はリン酸塩である。例えば、無水リン酸二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムの混合物が一般的である。適切な濃度は、１０ｍＭの無水リン酸二ナトリウムと１０ｍＭのリン酸二水素ナトリウムである。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが一般的である［１２２］。組成物は滅菌されており、かつ／または発熱物質を含まないものであってよい。本発明の組成物はヒトに関して等張性であってよい。
本発明の組成物は免疫原性であり、ワクチン組成物であることがより好ましい。本発明によるワクチンは予防的なもの（すなわち、感染症を予防するためのもの）であっても治療的なもの（すなわち、感染症を処置するためのもの）であってもよいが、典型的には、予防的なものである。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）、ならびに、必要に応じて任意の他の構成成分を含む。「免疫学的有効量」とは、その量を単回用量で、または連続的なものの一部として個体に投与することが処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体的状態、年齢、処置される個体の分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況に関する処置担当医師の評価、および他の関連する因子に応じて変動する。この量は、常套的な検査によって決定することができる比較的広範な範囲に入ることが予想される。
各用量の範囲内で、個々の糖抗原の分量は、一般に、１〜５０μｇの間（糖の質量として測定する）、例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇになる。
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、体の種々の領域に影響を及ぼし、したがって、本発明の組成物は、さまざまな形態で調製することができる。例えば、組成物は、注射剤として、水溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。組成物は、肺内投与するために、例えば、細末または噴霧剤を使用する吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）として調製することができる。組成物は、坐薬または膣坐薬として調製することができる。組成物は、鼻、耳または眼への投与のために、例えば、噴霧剤、滴剤、ゲル剤または粉剤として調製することができる［例えば、参考文献１２３＆１２４］。肺炎球菌糖［１２５、１２６］、Ｈｉｂ糖［１２７］、ＭｅｎＣ糖［１２８］、ならびにＨｉｂおよびＭｅｎＣ糖コンジュゲートの混合物［１２９］の経鼻投与の成功が報告されている。
本発明の組成物は、特に複数回用量形式で包装される場合には、抗菌剤を含んでよい。
本発明の組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０を含んでよい。界面活性剤は、一般に、低レベル、例えば、＜０．０１％で存在する。
本発明の組成物は、張度をもたらすためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでよい。２〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌまたは約５±１ｍｇ／ｍｌ（特に、約４．２５ｍｇ）の濃度のＮａＣｌが一般的である。
本発明の組成物は、一般に緩衝液を含む。リン酸緩衝液が一般的である。本発明の組成物は、一般に、他の免疫調節剤と併せて投与される。詳細には、組成物は通常、１種または複数種のアジュバントを含む。そのようなアジュバントとしては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
Ａ．無機質含有組成物
本発明においてアジュバントとして使用するために適した無機質含有組成物としては、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩類が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、硫酸塩などの無機塩類［例えば、参考文献１３０の８章＆９章を参照されたい］、または異なる無機化合物の混合物（例えば、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物、必要に応じて過剰リン酸塩を含む）を含み、化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、塩（複数可）に吸着していることが一般的である。無機質含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化することもできる［１３１］。
アルミニウム塩を本発明のワクチンに、Ａｌ３＋の用量が用量当たり０．２ｍｇから１．０ｍｇの間になるように含めることができる。
典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、１ｍｌ当たりＡｌ３＋０．６ｍｇで含まれ、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４から０．９２の間である非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムを用いた吸着を、例えば、用量当たりコンジュゲート当たり５０μｇから１００μｇの間のＡｌ３＋で使用することができる。リン酸アルミニウムを使用し、抗原をアジュバントに吸着させないことが望まれる場合、溶液中に遊離リン酸イオンを含めることが好ましい（例えば、リン酸緩衝液を使用することによって）。
Ｂ．オイルエマルション
本発明においてアジュバントとして使用するために適したオイルエマルション組成物としては、スクアレン−水エマルション、例えば、ＭＦ５９（マイクロフルダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５）が挙げられる［参考文献１３０の１０章； 参考文献１３２〜１３４も参照されたい］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおいてアジュバントとして使用されている。
組成物に使用するために特に有用なアジュバントはサブミクロン水中油エマルションである。本明細書で使用するために好ましいサブミクロン水中油エマルションは、必要に応じてさまざまな量のＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルション、例えば、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）ならびに、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油エマルションである。組成物に使用するためのサブミクロン水中油エマルション、それを作製する方法およびムラミルペプチドなどの免疫賦活剤は、参考文献１３２＆１３５〜１３６に詳しく記載されている。
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。
Ｃ．サポニン製剤［参考文献１３０の２２章］
サポニン製剤も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。サポニンは、広い範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見いだされるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根）から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント製剤は、ＱＳ２１などの精製された製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤を含む。
サポニン組成物はＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技法を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含めた特定の精製画分が同定されている。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の作製方法は参考文献１３７に開示されている。サポニン製剤は、コレステロールなどのステロールも含んでよい［１３８］。
サポニンとコレステロールの組合せを使用して、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される独特の粒子を形成することができる［参考文献１３０の２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つまたは複数を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献１３８〜１４０にさらに記載されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、追加的な界面活性剤（複数可）を欠いていてもよい［１４１］。
サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説は、参考文献１４２＆１４３において見いだすことができる。
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。これらの構造は、一般に、ウイルス由来の１つまたは複数のタンパク質を、必要に応じてリン脂質と組み合わせてまたはそれと一緒に製剤化して含有する。これらは、一般に、非病原性、非複製性であり、一般には、いかなるネイティブなウイルスゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えによって作製することもでき、ウイルス全体から単離することもできる。ビロソームまたはＶＬＰに使用するために適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質、麻疹ウイルスに由来するタンパク質、シンドビスウイルスに由来するタンパク質、ロタウイルスに由来するタンパク質、口蹄疫ウイルスに由来するタンパク質、レトロウイルスに由来するタンパク質、ノーウォークウイルスに由来するタンパク質、ヒトパピローマウイルスに由来するタンパク質、ＨＩＶに由来するタンパク質、ＲＮＡ−ファージに由来するタンパク質、Ｑβ−ファージに由来するタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡ−ファージに由来するタンパク質、ｆｒ−ファージに由来するタンパク質、ＡＰ２０５ファージに由来するタンパク質、およびＴｙに由来するタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献１４４〜１４９においてさらに考察されている。ビロソームは、例えば、参考文献１５０においてさらに考察されている。
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において使用するために適したアジュバントとして、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体が挙げられる。
ＬＰＳの無毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４つ、５つまたは６つのアシル化された鎖を有する３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は参考文献１５１に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過されるのに十分に小さい［１５１］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９が挙げられる［１５２、１５３］。
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えばＯＭ−１７４が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献１５４＆１５５に記載されている。
本発明においてアジュバントとして使用するために適した免疫賦活オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンと連結したメチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。
ＣｐＧは、ヌクレオチド改変／類似体、例えば、ホスホロチオエート改変を含んでよく、また、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。参考文献１５６、１５７および１５８には、可能性のある類似体置換、例えば、グアノシンを２’−デオキシ−７−デアザグアノシンで置き換えることについて開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１５９〜１６４においてさらに考察されている。
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどを対象とするものであってよい［１６５］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的なもの、例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであってもよく、Ｂ細胞応答の誘導により特異的なもの、例えばＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮであってもよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１６６〜１６８において考察されている。ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであることが好ましい。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用可能になるように構築することが好ましい。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端に結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献１６５＆１６９〜１７１を参照されたい。
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を本発明におけるアジュバントとして使用することができる。タンパク質はＥ．ｃｏｌｉに由来するもの（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラに由来するもの（「ＣＴ」）、または百日咳に由来するもの（「ＰＴ」）であることが好ましい。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用が参考文献１７２に記載されており、非経口アジュバントとしての使用が参考文献１７３に記載されている。毒素またはトキソイドは、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットは解毒性変異を含有することが好ましく、Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２であることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１７４〜１８１において見いだすことができる。アミノ酸置換についての数字で表された参考文献は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる参考文献１８２に記載されているＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
Ｆ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして使用するために適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１８３］など）［１８４］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。
Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［１８５］または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体が挙げられる。キトサンおよびその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる［１８６］。
Ｈ．微小粒子
微小粒子も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。生分解性であり、無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を用いて形成され、必要に応じて、負に荷電した表面を有するように処理した（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面を有するように処理した（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン界面活性剤を用いて）微小粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径が約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径が約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましい。
Ｉ．リポソーム（参考文献１３０の１３章＆１４章）
アジュバントとして使用するために適したリポソーム製剤の例は、参考文献１８７〜１８９に記載されている。
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル製剤およびポリオキシエチレンエステル製剤
本発明において使用するために適したアジュバントとして、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［１９０］。そのような製剤は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性物質［１９１］ならびにオクトキシノールなどの少なくとも１種の追加的な非イオン性界面活性物質と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性物質［１９２］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ製剤は、例えば、参考文献１９３および１９４に記載されている。
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとして使用するために適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
Ｍ．イミダゾキノロン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物。
本発明におけるアジュバントとして使用するために適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその相同体（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）が挙げられ、これは参考文献１９５および１９６にさらに記載されている。
Ｎ．チオセミカルバゾン化合物。
本発明においてアジュバントとして使用するために完全に適したチオセミカルバゾン化合物、ならびに化合物を製剤化する、製造する、およびスクリーニングする方法の例としては、参考文献１９７に記載されているものが挙げられる。ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生に関してヒト末梢血単核細胞を刺激することにおいてチオセミカルバゾンが特に有効である。
Ｏ．トリプタントリン化合物。
本発明においてアジュバントとして使用するために完全に適したトリプタントリン化合物、ならびに化合物を製剤化する、製造する、およびスクリーニングする方法の例としては、参考文献１９８に記載されているものが挙げられる。ＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生に関してヒト末梢血単核細胞を刺激することにおいてトリプタントリン化合物が特に有効である。
本発明は、上で同定されたアジュバントの１つまたは複数の態様の組合せも含んでよい。例えば、以下の組合せを本発明におけるアジュバント組成物として使用することができる：（１）サポニンおよび水中油エマルション［１９９］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［２００］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［２０１］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルションの組合せ［２０２］；（６）マイクロフルイダイズしてサブミクロンのエマルションにしたか、またはボルテックスして粒子径がより大きなエマルションにした、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ。（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁の骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたは複数の細菌の細胞壁構成成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１つまたは複数の無機塩類（例えばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）。
免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、参考文献１３０の７章に開示されている。
アルミニウム塩アジュバントの使用が特に有用であり、一般に、抗原をそのような塩に吸着させる。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）およびＮｅｉｓＶａｃ（商標）コンジュゲートには水酸化物アジュバントが使用され、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ（商標）にはリン酸塩アジュバントが使用されている。本発明の組成物では、一部の抗原を水酸化アルミニウムに吸着させ、他の抗原をリン酸アルミニウムに結びつけることが可能である。しかし、典型的には、単一の塩、例えば、水酸化物またはリン酸塩のみを使用するが、両方は使用しない。全てのコンジュゲートを吸着させる必要はない、すなわち、一部または全てが溶液中で遊離していてよい。
処置方法
本発明は、本発明の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための方法も提供する。免疫応答は、防御的なものであることが好ましく、抗体を伴うことが好ましい。当該方法により、追加免疫応答が生じ得る。
哺乳動物はヒトであることが好ましい。ワクチンが予防的に使用するためのものである場合、ヒトは小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーであることが好ましく、ワクチンが治療的に使用するためのものである場合、ヒトは成人であることが好ましい。小児用ワクチンを、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与することもできる。
本発明は、医薬として使用するための本発明の組成物も提供する。医薬は、哺乳動物において免疫応答を生じさせることができる（すなわち、免疫原性組成物である）ことが好ましく、ワクチンであることがより好ましい。
本発明は、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための医薬の製造における本発明のコンジュゲートの使用も提供する。
本発明の好ましい組成物により、患者に抗体価を付与することができ、その抗体価は、各抗原性構成成分に対する、許容できる百分率のヒト被験体の抗体保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の基準よりも優れている。それを超えると宿主が抗原に対して抗体陽転すると考えられる関連する抗体価を伴う抗原は周知であり、そのような力価はＷＨＯなどの機関により公開されている。好ましくは統計的に有意な被験体の試料の８０％超、より好ましくは９０％超、さらにより好ましくは９３％超、最も好ましくは９６〜１００％が抗体陽転する。
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔に）によって、または直腸投与、経口投与、膣内投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与、耳への投与、肺への投与または他の粘膜への投与によって達成することができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば、皮下針）を介してもよいが、無針注射を代わりに使用することもできる。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
本発明を使用して、全身性の免疫および／または粘膜免疫を引き出すことができる。
投与処置は、単回用量スケジュールであっても複数回用量スケジュールであってもよい。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用することができる。一次用量スケジュールの後に追加免疫用量スケジュールを行うことができる。初回刺激投薬間（例えば、４〜１６週間）、および初回刺激と追加免疫の間の適切なタイミングは、常套的に決定することができる。
例示的なキャリアタンパク質
上記の通り、本発明者らは、参考文献６５および参考文献６６に記載されているキャリアタンパク質、特に、これらの文献の配列番号９（本明細書においても配列番号９である）のタンパク質が本発明におけるキャリア分子として使用するために特に適することを見いだした。
これらのキャリア分子は、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む。典型的には、キャリア分子は、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として含む。ｓｐｒ００９６抗原、ｓｐｒ２０２１抗原およびハイブリッドポリペプチドの性質を以下でより詳細に記載する。
ｓｐｒ００９６抗原
元の「ｓｐｒ００９６」ポリペプチド配列は、参考文献２０３において「仮想タンパク質」とアノテートされた（ＧＩ：１５９０２１４０参照）。参照のために、Ｒ６株において見いだされる全長ｓｐｒ００９６のアミノ酸配列が本明細書において配列番号１として示されている。
本発明のｓｐｒ００９６抗原は、少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞はＢリンパ球を援助して抗原に対する抗体を産生させる［２０４］。Ｔ細胞エピトープは経験的に同定することもでき（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［２０５、２０６］または同様の方法を使用して）、予測することもできる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標［２０７］、マトリックスに基づく手法［２０８］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２０９］、神経回路網［２１０］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２１１、２１２］、ＡＤＥＰＴ［２１３］、Ｔｓｉｔｅｓ［２１４］、親水性［２１５］、抗原性指標［２１６］または参考文献２１７に開示されている方法などを使用して）。
本発明で使用するために好ましいｓｐｒ００９６抗原は、（ａ）配列番号１に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号１の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含み、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）であるアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ００９６ポリペプチドは、配列番号１のバリアント（例えば、配列番号２；以下を参照されたい）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１由来の少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１のＣ末端からの１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個もしくはそれより多い）および／またはＮ末端からの１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個もしくはそれより多い）を欠くが、配列番号１の少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを保持する。他の断片では、１つまたは複数のタンパク質ドメインが省かれている。１つの適切な断片は、天然のリーダーペプチド配列が省かれている配列番号１４である。ｓｐｒ００９６抗原は、配列番号１由来の単一のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープからなってよい。
配列番号１と比較してＣ末端の近くに挿入を有するｓｐｒ００９６のバリアント形態は本明細書における配列番号２である。このバリアントの免疫への使用が参考文献２１８において報告されており（そこでは配列番号１５０）、そこではこのバリアントはＬｙｓＭドメインタンパク質とアノテートされている。したがって、本発明で使用するためのｓｐｒ００９６抗原は、（ａ）配列番号２に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号２の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含み、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）であるアミノ酸配列を含んでよい。これらのポリペプチドは配列番号２のバリアントを含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２由来の少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２のＣ末端からの１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個もしくはそれより多い）および／またはＮ末端からの１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個もしくはそれより多い）を欠くが、配列番号２の少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを保持する。他の断片では、１つまたは複数のタンパク質ドメインが省かれている。１つの適切な断片は、天然のリーダーペプチド配列が省かれている配列番号１５である。配列番号２の免疫原性断片は、参考文献２１８の表１において同定されている。ｓｐｒ００９６抗原は、配列番号２由来の単一のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープからなってよい。
ｓｐｒ００９６抗原は、二量体、例えばホモ二量体の形態で使用することができる。
ｓｐｒ２０２１抗原
元の「ｓｐｒ２０２１」ポリペプチド配列は、参考文献２０３において「一般的なストレスタンパク質ＧＳＰ−７８１」とアノテートされた（ＧＩ：１５９０４０６２参照）。参照のために、Ｒ６株において見いだされる全長ｓｐｒ２０２１のアミノ酸配列が本明細書において配列番号３として示されている。
本発明のｓｐｒ２０２１抗原は、少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。
本発明で使用するための好ましいｓｐｒ２０２１抗原は、（ａ）配列番号３に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号３の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含み、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）であるアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ２０２１ポリペプチドは配列番号３のバリアントを含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３由来の少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号３のＣ末端からの１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個もしくはそれより多い）および／またはＮ末端からの１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個もしくはそれより多い）を欠くが、配列番号３の少なくとも１種のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを保持する。他の断片では、１つまたは複数のタンパク質ドメインが省かれている。１つの適切な断片は、天然のリーダーペプチド配列が省かれている配列番号４である。ｓｐｒ００９６抗原は、配列番号３由来の単一のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープからなってよい。
参考文献２１８では、ｓｐｒ２０２１がＧｂｐＢとの相同性を有する分泌型４５ｋＤａタンパク質とアノテートされており、また、免疫原としてのその使用が開示されている（そこでは配列番号２４３；ＳＰ２２１６）。ｓｐｒ２０２１の免疫原性断片は参考文献２１８の表１（７３頁）において同定されている。ｓｐｒ２０２１の別の有用な断片は参考文献２１９の配列番号１として開示されている（本明細書では配列番号３のアミノ酸２８〜２７８）。
ハイブリッドポリペプチド
典型的には、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原は、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として表される。ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨで表すことができ、式中、Ａは任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは２以上の整数（例えば、２、３、４、５、６など）であり、各Ｘは、ｓｐｒ００９６抗原またはｓｐｒ２０２１抗原のアミノ酸配列であり（上記の通り）、少なくとも１つのＸがｓｐｒ００９６抗原であり、少なくとも１つのＸがｓｐｒ２０２１抗原であり、Ｌは任意選択のリンカーアミノ酸配列である。通常、ｎは２である。ｎが２である場合、Ｘ１は通常、ｓｐｒ００９６抗原であり、Ｘ２は通常、ｓｐｒ２０２１抗原である。ｎが２を超える場合、各ｓｐｒ００９６抗原（２つ以上存在する場合）は同じであっても異なってもよく、各ｓｐｒ２０２１抗原（２つ以上存在する場合）は同じであっても異なってもよい。
各Ｘのアミノ酸配列であるｓｐｒ００９６抗原またはｓｐｒ２０２１抗原は上で定義されている通りである。これらの抗原を（ａ）所与の配列に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有すること；および／または（ｂ）所与の配列の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含み、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）であることに関して定義する場合、（ａ）の同一性のレベルおよび（ｂ）の「ｎ」個の値は、各Ｘについて同じであってよい。
野生型の各−Ｘ−部分内のリーダーペプチド配列はハイブリッドタンパク質に含まれていても省かれていてもよい。一部の実施形態では、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチド以外のリーダーペプチドは欠失させる、すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２…Ｘｎのリーダーペプチドは省かれる。これは、全てのリーダーペプチドを欠失させ、Ｘ１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと等しい。
｛−Ｘ−Ｌ−｝の各ｎの場合について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は存在してもしなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドはＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、典型的には短い（例えば、２０アミノ酸以下、すなわち、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、１アミノ酸）。例は、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くを含む）、およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多く）を含む。他の適切なリンカーアミノ酸配列は当業者には明らかである。有用なリンカーはＧＳＧＧＧＧ（配列番号５）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号６）であり、ＢａｍＨＩ制限部位からＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドが形成され、したがって、クローニングおよび操作の助けになり、また、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは典型的なポリグリシンリンカーである。他の適切なリンカー、特に最後のＬｎとして使用するためのリンカーは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕジペプチドまたは配列番号７である。
−Ａ−は、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば、４０アミノ酸以下、すなわち、４０アミノ酸、３９アミノ酸、３８アミノ酸、３７アミノ酸、３６アミノ酸、３５アミノ酸、３４アミノ酸、３３アミノ酸、３２アミノ酸、３１アミノ酸、３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、１アミノ酸）。例として、タンパク質輸送を導くためのリーダー配列、またはクローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は当業者には明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−はＮ末端メチオニンをもたらすオリゴペプチド（例えば、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸または８アミノ酸を有する）、例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または単一のＭｅｔ残基であることが好ましい。
−Ｂ−は、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば、４０アミノ酸以下、すなわち、３９アミノ酸、３８アミノ酸、３７アミノ酸、３６アミノ酸、３５アミノ酸、３４アミノ酸、３３アミノ酸、３２アミノ酸、３１アミノ酸、３０アミノ酸、２９アミノ酸、２８アミノ酸、２７アミノ酸、２６アミノ酸、２５アミノ酸、２４アミノ酸、２３アミノ酸、２２アミノ酸、２１アミノ酸、２０アミノ酸、１９アミノ酸、１８アミノ酸、１７アミノ酸、１６アミノ酸、１５アミノ酸、１４アミノ酸、１３アミノ酸、１２アミノ酸、１１アミノ酸、１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸、７アミノ酸、６アミノ酸、５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、１アミノ酸）。例として、タンパク質輸送を導く配列、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い、例えば、配列番号８を含む）、またはタンパク質安定性を増強する配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は当業者には明らかである。
ハイブリッドの例としては、ｓｐｒ００９６−ｓｐｒ２０２１（例えば、配列番号９）またはｓｐｒ２０２１−ｓｐｒ００９６（例えば、配列番号１０）のアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。ハイブリッドは、配列番号９または配列番号１０に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するアミノ酸配列も含んでよい。典型的には、ハイブリッドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。ハイブリッドは、配列番号９に対して５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有するアミノ酸配列も含んでよい。
特定の実施形態では、キャリア分子は、（ａ）配列番号２由来の１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つなど）のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ；および（ｂ）配列番号３由来の１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つなど）のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む。
試料をアッセイするための方法
特定の態様では、本発明は、血清群Ｘ莢膜多糖を含有する疑いがある試料をアッセイするための方法であって、（ｉ）試料中の任意の血清群Ｘ莢膜多糖を加水分解して、加水分解産物をもたらすステップと、（ｉｉ）加水分解産物を液体クロマトグラフィーに供するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において分離された任意のグルコサミン−４−リン酸を検出するステップとを含む方法を提供する。
当該方法は、試料中の血清群Ｘ莢膜多糖を定量化するために使用することができる。このように、試料中の多糖の濃度を決定することが可能である。典型的には、定量化は、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−リン酸標準物質と比較することを伴う。しかし、グルコサミン−６−リン酸を含めた他の標準物質を使用することができる。
当該方法は、血清群Ｘ莢膜多糖のために開発されたが、構造内にグルコサミン−４−リン酸を有する物質、例えば、細菌リピドＡのいずれにも適している。したがって、本発明は、構造内にグルコサミン−４−リン酸を有する物質を含有する疑いがある試料をアッセイするための方法であって、（ｉ）試料中のその構造内にグルコサミン−４−リン酸を有する任意の物質を加水分解して加水分解産物をもたらすステップと、（ｉｉ）加水分解産物を液体クロマトグラフィーに供するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において分離された任意のグルコサミン−４−リン酸を検出するステップとを含む方法も提供する。
試料
試料は、例えば、当該方法をワクチン製品の特徴付けにおける多糖定量化に使用する場合は、典型的にはワクチンである。しかし、当該方法は、ワクチン製造の間のインプロセスアッセイとして使用することもできる。これらの実施形態では、試料は製造プロセスからのプロセス中間体になる。本発明の方法により、非常に低い濃度の血清群Ｘ莢膜多糖（≧０．５μｇ／ｍｌ）を定量化することができ、したがって、本発明の方法は、例えば、製造プロセスの間にインプロセスで取得される小さな試料中の血清群Ｘ莢膜多糖をアッセイするために適している。また、当該方法は、不純物が存在する場合でさえ、血清群Ｘ莢膜多糖に特異的である。したがって、試料は、発酵ブロス、または発酵ブロスから取得した上清であってよい。
試料は、遊離の（コンジュゲートしていない）血清群Ｘ莢膜多糖および／またはコンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖を含有してよい。したがって、当該方法は、細菌から調製した多糖、精製後の多糖、コンジュゲーション前の多糖、および／またはコンジュゲーション後の多糖をアッセイするために使用することができる。
コンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖を含有する試料では、試料中の総多糖に対する遊離の多糖のレベルの比較（すなわち、コンジュゲートしていない多糖：（コンジュゲートしていない＋コンジュゲートした）多糖の比）を使用して、安定性を決定することができる。コンジュゲートしていない多糖が高レベルであることは望ましくない。そのようなアッセイの時系列により、例えば、貯蔵の間にコンジュゲートが安定であるかどうかを示すことができる。遊離の多糖のレベルは、コンジュゲーション反応が完了したかどうかを確認するためにも使用することができる。
試料は、典型的には水性であるが、乾燥した形態から、例えば、凍結乾燥物から水性形態に再構成されたものであってよい。したがって、試料は、凍結乾燥安定剤を含有してよい。これらの安定剤としては、糖アルコール（例えば、マンニトールなど）、二糖（例えば、スクロース、トレハロースなど）、および他の単純な糖類などの物質が挙げられる。本発明の方法の利点は、多糖と不純物の前分離を全く必要とせずに血清群Ｘ莢膜多糖を不純物のバックグラウンドに対してアッセイすることができることである。
試料は、分析前に希釈することができる。次いで、分析後に、試料中の多糖のレベルを元の希釈していない材料中のレベルに関連づけることができる。希釈は、例えば、試料の分析により較正曲線の所望のポーション内の結果がもたらされることを確実にするために有用である。
血清群Ｘ莢膜多糖に加えて、試料は、他の細菌莢膜糖、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型由来の細菌莢膜糖、他の髄膜炎菌の血清群（例えば、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ）由来の細菌莢膜糖、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の細菌莢膜糖などを含有してよい。
試料は、多くの場合ワクチンに見いだされる非抗原構成成分などの他の構成成分も含んでよい。例えば、これらとして、上記の通り、キャリア、アジュバント、賦形剤、バッファなどを挙げることができる。
いくつかの状況では、試料を既知量の問題の分析物でスパイクすること、例えば、既知の分量の血清群Ｘ莢膜多糖をコンジュゲートした形態またはコンジュゲートしていない形態のいずれかで添加することが有用である。スパイク試験は、較正のため、および感度、変動性、回収率などを試験するために有用であり得る。
加水分解
当該方法は、血清群Ｘ莢膜多糖の加水分解を伴う。典型的な加水分解方法は、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用した酸加水分解を伴う。本発明者らは、特に有効な条件は、２ＭのＴＦＡを用い、１００℃で２時間〜３時間（例えば、２．５時間）にわたって処理することであることを見いだした。これらの条件により、多糖の単量体サブユニットを、分解させることなく良好に放出させることが可能になる。しかし、それよりも短いまたはより長い処理、例えば、１時間〜６時間にわたる処理も可能である。
総血清群Ｘ莢膜多糖は、コンジュゲートした多糖を含む試料から、試料全体を上記の通り加水分解に供することによって調製することができる。しかし、コンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖のみまたはコンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖のみの測定が望まれる場合には、加水分解の前にコンジュゲートした多糖とコンジュゲートしていない多糖を互いから分離するべきである。適切な分離技法としては、選択的沈殿、サイズに基づく方法、固相抽出［２２０］などが挙げられる。
液体クロマトグラフィー
血清群Ｘ莢膜多糖加水分解の結果は液体クロマトグラフィーによって分析される。したがって、本発明の方法は、典型的には、液体クロマトグラフィーカラムを利用し、そのようなカラムの産出物（ｏｕｔｐｕｔ）を分析することを伴う。
種々の液体クロマトグラフィーカラムを使用することができるが、本発明は、典型的には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と共に使用される。本発明は、高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）による、または高速陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＣＥＣ）による分離の結果を分析するために特に有用である。ＨＰＡＥＣは、糖を特徴付けるために使用される一般的な技法であり、多くの場合、多糖を検出し、定量化するためのパルス電流滴定検出（ｐｕｌｓｅｄ ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＰＡＤ）［２２１、２２２］と組み合わせて使用される。適切なＨＰＡＥＣ−ＰＡＤシステムは、Ｄｉｏｎｅｘ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）から提供され、例えば、ＢｉｏＬＣ（商標）システムである。これらのシステムでは、ＨＰＡＥＣカラムからの溶出物を、ＰＡＤを使用して、すなわち、電流に基づいて分析する。適切な（高い）ｐＨで、陽電位を印加することによって炭水化物を電極の表面で電気触媒的に酸化させることができる。このように生成された電流は炭水化物濃度に比例し、これにより、炭水化物を電流滴定によって検出し、定量化することが可能になる。単純な電流滴定検出と比較して、ＰＡＤでは、標準の検出電位と共にクリーニング電位および再生電位の短いパルスを分散させ、それにより、分析物の酸化生成物により電極が汚染されると生じる問題を回避する。
溶出物を分析するために、非電流滴定的方法をＰＡＤと組み合わせることができる。例えば、参考文献２２３を参照されたい。
したがって、加水分解された血清群Ｘ莢膜多糖を、分離のためにＨＰＡＥＣに供することができ、分離された材料を検出し、必要に応じてＰＡＤによって定量化することができる。下の例において示されているように、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより、加水分解されたグルコサミン−４−リン酸残基を試料中の他のバックグラウンド材料から分離することができる。
好ましいカラムは、糖類がそのカラムから溶出されなければならないように糖類を自然に保持するカラムである。クロマトグラフィーカラムからの溶出は均一溶媒溶出であっても勾配溶出であってもよい。水酸化物および／または酢酸塩を含む溶出物は、糖類のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析の間に使用される典型的な溶出物である。しかし、硝酸、塩化物などの陰イオンを使用することも可能である。典型的にはナトリウム塩が使用される。分析物をＡＥＣカラムから溶出させるためには、溶出物は一般に、塩基性であり、例えば、ｐＨは＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２、＞１３などである。水酸化物塩（例えばＮａＯＨ）を使用して所望のｐＨを実現することができる。
特に、使用される分析検出技法にイオンが干渉する場合には、溶出物を水酸化物イオンの化学的抑制に供することができる。Ｄｉｏｎｅｘ（商標）からのＭＭＳ製品などの微小膜（ｍｉｃｒｏｍｅｍｂｒａｎｅ）抑制因子を都合よく使用することができる。「ＭＭＳ ＩＩＩ」製品では連続的な化学的抑制を使用して分析物の伝導率を増強しながら、溶出物の伝導率を減少させ、広い濃度範囲にわたる均一溶媒溶出または勾配溶出を使用したイオン交換適用を用いて直接伝導率検出を可能にする。
本発明で使用するための適切なＨＰＡＥＣカラムは、Ｄｉｏｎｅｘにより販売されている「ＣａｒｂｏＰａｃ」カラム、例えば、ＰＡ１［直径１０μｍ、ジビニルベンゼンと２％架橋結合したポリスチレン基材、５００ｎｍのミクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）第四級アンモニウム官能化ラテックス（５％架橋結合）で凝集］、ＰＡ１００、ＰＡ２０、ＰＡ１０［直径１０μｍ、ジビニルベンゼンと５５％架橋結合したエチルビニルベンゼン基材、４６０ｎｍのミクロビーズ二官能第四級アンモニウムイオン（５％架橋結合）で凝集］、ＰＡ２００またはＭＡ１カラムである。
分析用ＨＰＡＥＣカラムをプレカラムおよび／またはトラップカラムと併せて使用することができる。例えば、ＰＡ１０分析カラムをインラインのＰＡ１０ガードカラム、および／またはインラインのトラップ（前処理）カラムと併せて使用することができる。そのようなカラムにより、他の方法で分析に干渉する材料を除去することができる。例えば、「ＡｍｉｎｏＴｒａｐ」カラムにより、糖分析の前にアミノ酸を除去することができる。ホウ酸トラップも使用することができる。典型的な「ＡｍｉｎｏＴｒａｐ」樹脂は、二官能第四級アンモニウム陰イオン交換部位を接合した直径１０μｍの基材（ジビニルベンゼンと５５％架橋結合したエチルビニルベンゼン）であり、典型的な「ＢｏｒａｔｅＴｒａｐ」はホウ酸に対する選択性が非常に高い直径２０μｍの高性能樹脂を有する。
ＰＡ１カラムおよびＰＡ１０カラムはどちらも、単糖および二糖の高分解能分離をもたらすためにＰＡＤで使用されるように設計された陰イオン交換カラムであり、どちらの樹脂も、官能化ミクロビーズの細かいラテックスで覆われた直径１０μｍの非多孔性ビーズである。それらの薄膜樹脂構造により、優れた物質移動が可能になり、高分解能クロマトグラフィーおよび急速な再平衡化がもたらされる。一方ＰＡ１は種々のマトリックスにおいて単糖および二糖を決定するために適した汎用カラムであり、直鎖状の多糖の高分解能分離のために選択されるカラムであり、ＰＡ１０は、哺乳動物の糖タンパク質の炭水化物部分に見いだされるアミノ単糖、中性単糖、および酸性単糖を決定するために最適化されている。ＰＡ１カラムとＰＡ１０カラムの間の主要な差異は、ＰＡ１の樹脂はジビニルベンゼンと２％架橋結合したポリスチレンであるが、ＰＡ１０の樹脂はジビニルベンゼンと５５％架橋結合したエチルビニルベンゼンであることである。
現在まで、血清群Ｘ莢膜多糖に対する最も好ましいＨＰＡＥＣ分離方法は、Ｇｕａｒｄ ＰＡ１プレカラム（４×５０ｍｍ）と組み合わせたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を伴う。
溶出および検出の後、本発明は、試料において同定された任意の血清群Ｘ莢膜多糖の特性、例えば、そのＤＰ（典型的には、平均ＤＰ）、その分子量、その純度などを決定するさらなるステップを含んでよい。
Ｎ−アセチルグルコサミン−４−リン酸の調製
さらなる態様では、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−リン酸を調製するために有用なプロセスおよび試薬を提供する。上記の通り、この化合物を、血清群Ｘ莢膜多糖をアッセイするための方法における分析標準物質として使用することができる。
この態様の第１の実施形態では、本発明は、式Ａの化合物をＮ−脱保護するステップと、脱保護された化合物をＮ−アシル化して式Ｂの化合物をもたらすステップとを含むプロセスを提供する。
式中、ＰＧは酸素保護基であり、ＰＧＮは窒素保護基であり、全てのＰＧ基が同じものである。ＰＧおよびＰＧＮは、例えば、参考文献２２４に記載されている任意の適切な保護基であってよい。
この態様の第２の実施形態では、本発明は、有機リン酸エステル基（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）を式Ｂの化合物に導入して式Ｃの化合物をもたらすためのプロセスを提供する：
式中、ＲＰ基はどちらも同じであり、ＲＰは、Ｈまたは例えば参考文献２２４に記載されているアリールメチルホスフェート保護基のいずれかであるか、ＲＰ基は一緒になって単一のアリールメチル保護基、例えば、ｏ−キシレニルを形成する。ＰＧは上で定義されている通りであり、全てのＰＧ基が同じものである。ＲＰがＨである場合、式Ｂの化合物は典型的にはリン酸化試薬および酸化剤と反応する。リン酸化剤は、典型的にはピリジンおよび塩化ピバロイルの存在下で、サリチルクロロホスファイトであってよい。リン酸化剤はＰＣｌ３、続いて、水または水性ＮａＨＣＯ３であってもよい。酸化剤はＩ２またはｍＣＰＢＡであってよく、典型的にはＩ２である。ＲＰ基が一緒になって単一の保護基を形成している場合、式Ｂの化合物は、典型的にはｏ−キシレン含有有機リン試薬と反応し、次いで酸化剤と反応する。ｏ−キシレン含有有機リン試薬は、典型的にはＮ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，３，４−ベンゾジオキサホスフィン（ｂｅｎｚｏｄｉｏａｘａｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）−３−アミンなどのホスホラミダイトである。酸化剤はＩ２またはｍＣＰＢＡであってよく、典型的にはｍＣＰＢＡである。ＲＰ基が一緒になって単一の保護基を形成していない場合には、式Ｂの化合物は、典型的には、ＲＰ基を含有するピロリン酸試薬と反応する。適切なピロリン酸試薬はテトラベンジルピロホスフェート（ｔｅｔｒａｂｅｎｚｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐａｔｅ）であり、その場合、ＲＰはベンジル基である。
この態様の第３の実施形態では、本発明は、式Ｃの化合物を脱保護してＮ−アセチルグルコサミン−４−リン酸をもたらすステップを含むプロセスを提供する：
ＰＧおよびＲＰは上で定義されている通りであり、全てのＰＧ基が同じものである。典型的には、Ｒｐがリン酸保護基である場合、全てのＰＧ基およびＲＰ基を同じステップにおいて、例えば、水素化分解によって除去する。
この態様のさらなる実施形態では、本発明は、第１の実施形態、その後に第２の実施形態；第２の実施形態、その後に第３の実施形態、および第１の実施形態、その後に第２の実施形態、その後に第３の実施形態を含むプロセスを提供する。これらの実施形態が第１の実施形態を含む場合、下記のさらなる実施形態が第１の実施形態に先行してよい。
この態様のさらなる実施形態では、本発明は、上記の式Ａの化合物を作製するためのプロセスであって、式Ｚの化合物を還元して式Ａ’の化合物をもたらすステップを含むプロセスを提供する：
式中、Ｒ１はフェニル、または、メチルもしくはエチルなどのアルキル；Ｏ−メチルなどのＯ−アルキル；およびニトロから選択される１つもしくは複数の基で置換されたフェニルであり、したがって式Ａ’のＲ１ＣＨ２−部分は置換または非置換ベンジルエーテル酸素保護基である。保護基は、例えば、参考文献２２４に記載されている任意の適切な保護基であってよい。詳細には、保護基は、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、２，６−ジメトキシベンジル、Ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジルであってよく、典型的にはベンジルである。ＰＧＮは、上で定義されている窒素保護基である。典型的なＰＧＮ基は、フタルイミド；ＢｏｃおよびＦｍｏｃなどのカルバミン酸；ノシル、トシルおよびメシルである。特に、ＰＧＮはフタルイミドである。典型的には、反応は、式Ｚの化合物（式中、Ｒ１はフェニルであり、ＰＧＮはフタルイミド（ｐｔｈａｌｉｍｉｄｅ）基である）とホウ素含有化合物およびルイス酸を有機溶媒中で反応させて式Ａ’の化合物をもたらすステップを含む。ホウ素含有化合物は、水素化ホウ素（ｂｏｒｏｈｙｄｉｒｄｅ）試薬、例えば、トリアルキルアミノボラン、特に、トリエチルアミノボランまたはトリメチルアミノボランであってよく、典型的には、トリメチルアミノボランである。ルイス酸はＡｌＣｌ３またはホウ素含有ルイス酸、例えば、三フッ化ホウ素複合体であってよく、典型的にはＢＦ３・Ｅｔ２Ｏである。有機溶媒は、塩素化有機溶媒、例えば、ＣＨＣｌ３もしくはＣＨ２Ｃｌ２または非塩素化溶媒であってよく、典型的にはアセトニトリルである。反応は、約−１０〜約１０℃、約−５〜約５℃の温度範囲、典型的には、約０℃で行うことができる。
この態様の第１の実施形態の例は、式Ａ’の化合物をＮ−脱保護するステップｉ）と、脱保護された化合物をＮ−アシル化して式Ｂ’の化合物をもたらすステップｉｉ）とを含む：
式中、Ｒ１およびＰＧＮは上で定義されている通りである。典型的には、反応は、ステップｉ）において式Ａ’の化合物（式中、ＰＧＮはフタルイミドである）と１，２−ジアミノエタンをアルコール溶媒、例えば、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨ、典型的にはＥｔＯＨ中で反応させることを含む。ステップｉ）は、通常、室温と溶媒の還流点の間、例えば、約２５℃以上、約２５〜約８０℃、約３５〜約８０℃、約４５〜約８０℃、約５５〜約８０℃、約６５〜約８０℃、約７５〜約８０℃の温度、典型的には、約８０℃または溶媒の還流点付近で行う。ステップｉｉ）は、アシル化剤を添加することを含む。アシル化剤は、任意の適切なアシル化剤であってよく、典型的には、ピリジンまたはトリエチルアミンまたはイミダゾールなどのアミン塩基を有するＡｃ２Ｏである。あるいは、アシル化剤はＥｔＯＨ：Ａｃ２Ｏの約４：１混合物であってよい。ステップｉｉ）は、室温付近、例えば、約２５℃で行うことができる。典型的には、ステップｉ）とステップｉｉ）の間に精製ステップは存在せず、例えば、ステップｉ）由来の溶媒のみをステップｉｉ）を実施する前に除去する。
この態様の第２の実施形態の例は、有機リン酸エステル基を式Ｂ’の化合物に導入して式Ｃ’の化合物をもたらすステップを含む：
式中、Ｒ１は上で定義されている通りである。典型的には、式Ｂ’の化合物をまずｏ−キシレン含有有機リン試薬、例えば、ホスホラミダイト、例えば、Ｎ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，３，４−ベンゾジオキサホスフィン（ｂｅｎｚｏｄｉｏａｘａｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）−３−アミンと、アミン塩基、典型的には１Ｈ−テトラゾールの存在下、有機溶媒、例えば、ＴＨＦまたはＣＨ２Ｃｌ２、典型的には、ＣＨ２Ｃｌ２中で反応させる。次いで、酸化剤、例えば、ピリジンおよび水中Ｉ２またはｍＣＰＢＡを添加する。ｍＣＰＢＡは通常、約−２０℃〜約２０℃、約−１５℃〜約１５℃、約−１０℃〜約１０℃、約−５℃〜約５℃の温度、典型的には約０℃で使用される。ｍＣＰＢＡは通常、第１のステップで使用したものと同じ反応溶媒に添加される。第１のステップの完了は、例えばＴＬＣ分析によって、ｍＣＰＢＡを添加する前に検出することができる。
この態様の第２の実施形態のさらなる例は、有機リン酸エステル基を式Ｂ’の化合物に導入して式Ｃ’’の化合物をもたらすステップを含む：
式中、Ｒ１は上で定義されている通りである。典型的には、式Ｂ’の化合物をピロリン酸試薬、例えば、テトラベンジルピロホスフェートと反応させる。反応は塩基の存在下で行い、適切な塩基はＬＤＡまたはＬｉＨＭＤＳなどのリチウムアミドである。反応は、有機溶媒、例えば、ＣＨ２Ｃｌ２などの塩素化溶媒またはエーテル溶媒、典型的には、ジエチルエーテルまたはＴＨＦ中で行う。典型的には、反応は、約０℃未満、例えば、約−１０℃、約−２０℃、約−３０℃、約−４０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃で行い、約−８０℃、次いで約−３０℃で行うことが適切である。
この態様の第２の実施形態のさらなる例は、有機リン酸エステル基を式Ｂ’の化合物に導入して式Ｃ’’’の化合物をもたらすステップを含む：
式中、Ｒ１は上で定義されている通りである。典型的には、式Ｂ’の化合物を、適切なリン酸化試薬および酸化剤を用いてリン酸化する。典型的なリン酸化試薬はサリチルクロロホスファイトまたはＰＣｌ３および水もしくは水性ＮａＨＣＯ３である。リン酸化剤がサリチルクロロホスファイトである場合、反応は、典型的にはピリジン溶媒中で行い、典型的には塩化ピバロイルが存在する。反応は通常、室温、例えば、約２５℃で行う。次いで、酸化剤、例えば、ピリジンおよび水中Ｉ２、またはｍＣＰＢＡ、典型的にはＩ２を添加する。典型的には、酸化剤（ｏｘｉｄａｎｔ）を添加する前に反応物を約０℃未満、例えば、約−１０℃、約−２０℃、約−３０℃、約−４０℃、約−５０℃、典型的には、約−４０℃に冷却する。酸化は、典型的には、約０℃の温度で完了する。Ｉ２は典型的には、ピリジン／水中溶液として添加される。溶液の濃度は、典型的には、約０．１〜１Ｍ、約０．２〜０．９Ｍ、約０．３〜０．８Ｍ、約０．４〜０．７Ｍであり、約０．５Ｍであることが適切である。ピリジンと水の比は、典型的には、約１０：１〜３０：１、約１２：１〜約２８：１、約１４：１〜約２６：１、約１６：１〜約２４：１、約１８：１〜約２２：１であり、約１９：１であることが適切である。酸化剤は通常、第１のステップで使用したものと同じ反応溶媒に添加される。第１のステップの完了は、例えばＴＬＣ分析によって、酸化剤を添加する前に検出することができる。式Ｃ’’’の化合物は通常、塩、典型的にはジトリエチルアンモニウム塩として単離される。
リン酸化剤がＰＣｌ３および水または水性ＮａＨＣＯ３である場合、反応は、典型的には、ＭｅＣＮなどの有機溶媒中で行う。ＰＣｌ３の後に水または水性ＮａＨＣＯ３を添加し、これは室温で行われることが適切である。次いで、Ｉ２またはｍＣＰＢＡなどの酸化剤、典型的にはＩ２を添加する。通常、酸化剤を添加する前に溶媒を除去し、新しい溶媒を添加する。新しい溶媒は、典型的には、ピリジンとトリエチルアミンの混合物である。ピリジンとトリエチルアミンの比は、典型的には、約２：１〜約８：１であり、約４：１であることが適切である。Ｉ２は、典型的にはピリジン水（ｐｙｒｉｄｉｎｅ ｗａｔｅｒ）中溶液として添加される。溶液の濃度は、典型的には、約０．１〜１Ｍ、約０．２〜０．９Ｍ、約０．３〜０．８Ｍであり、約０．４Ｍであることが適切である。式Ｃ’’’の化合物は通常、塩、典型的にはジトリエチルアンモニウム塩として単離される。
この態様の第３の実施形態の例は、式Ｃ’の化合物を、典型的には水素化分解によって脱保護してＮ−アセチルグルコサミン−４−リン酸をもたらすステップを含む：
式中、Ｒ１は上で定義されている通りである。典型的には、式Ｃ’の化合物を、パラジウム触媒、例えば、アルコール溶媒、例えば、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨ、典型的には、ＭｅＯＨ中１０％Ｐｄ／Ｃまたはパールマン触媒Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃの存在下でＨ２と反応させる。反応は通常、約１〜約５ａｔｍ、約１〜約４ａｔｍ、約１〜約３ａｔｍ、約〜約２ａｔｍ、典型的には約１ａｔｍの圧力で行う。
この態様の第３の実施形態のさらなる例は、式Ｃ’’の化合物を、典型的には水素化分解によって脱保護してＮ−アセチルグルコサミン−４−リン酸をもたらすステップを含む：
式中、Ｒ１は上で定義されている通りである。典型的には、式Ｃ’’の化合物をパラジウム触媒、例えば、アルコール溶媒、例えば、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨ、典型的にはＭｅＯＨ中１０％Ｐｄ／Ｃまたはパールマン触媒Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃの存在下でＨ２と反応させる。反応は通常、約１〜約５ａｔｍ、約１〜約４ａｔｍ、約１〜約３ａｔｍ、約〜約２ａｔｍ、典型的には約１ａｔｍの圧力で行う。
この態様の第３の実施形態のさらなる例は、式Ｃ’’’の化合物、またはそのジトリエチルアンモニウム塩を、典型的には水素化分解によって脱保護してＮ−アセチルグルコサミン−４−リン酸をもたらすステップを含む：
式中、Ｒ１は上で定義されている通りである。典型的には、式Ｃ’’’の化合物をパラジウム触媒、例えば、アルコール溶媒、例えば、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨ、典型的にはＭｅＯＨ中１０％Ｐｄ／Ｃまたはパールマン触媒Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃの存在下でＨ２と反応させる。反応は通常、約１〜約５ａｔｍ、約１〜約４ａｔｍ、約１〜約３ａｔｍ、約〜約２ａｔｍ、典型的には約１ａｔｍの圧力で行う。
Ｎ−アセチルグルコサミン−４−リン酸は、例えば、結晶化、またはより典型的にはクロマトグラフィー、特に、疎水性に改質されたシリカ固定相を使用したクロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ）によって精製することができる。
本発明は、この態様のプロセスの化合物および中間体、詳細には、式Ｃの化合物、より詳細には式Ｃ’、式Ｃ’’および式Ｃ’’’の化合物も提供する。
さらなる実施形態では、この態様のプロセスは以下の通りであってよい：
この実施形態に適した反応条件は下の「発明を実施するための形態」の節（例えば、スキーム１）において提供される。
一般
本発明の実施には、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲に入る化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、参考文献２２５〜２３２などを参照されたい。
上記では「ＧＩ」番号付けが使用されている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」とは、配列がデータベースに加えられる際にＮＣＢＩにより処理される、各配列記録に連続的に割り当てられた一連の数字（ｄｉｇｉｔ）である。ＧＩ番号には、配列記録の受託番号との類似点はない。配列が更新されると（例えば、修正のため、またはより多くのアノテーションもしくは情報を加えるために）、新しいＧＩ番号が与えられる。したがって、所与のＧＩ番号に関連づけられる配列は変化しない。
抗原「ドメイン」が省かれる場合、シグナルペプチドの省略、細胞質ドメインの省略、膜貫通ドメインの省略、細胞外ドメインの省略などが含まれ得る。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよく、追加的な何かを含む、例えばＸ＋Ｙであってもよい。
「約」という用語は、数値ｘとの関連では、例えば、ｘ±１０％を意味する。
「実質的に」という単語は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要な場合、「実質的に」という単語は本発明の定義から省くことができる。
本発明が複数の逐次的なステップを伴うプロセスを提供する場合、本発明は、ステップの総数未満を伴うプロセスも提供し得る。同様に、出発多糖材料がすでに部分的に処理されている場合には、本発明は、方法の後期のステップのみを伴うプロセスを包含する。これらの異なるステップは、全く異なる時間に、異なる人により、異なる場所で（例えば、異なる国で）実施されてよい。
糖環は開いた形態で存在しても閉じた形態で存在してもよいこと、および本明細書の構造式において閉じた形態が示されていても、開いた形態も本発明に包含されることが理解されよう。同様に、糖はピラノース型で存在してもフラノース型で存在してもよいこと、および本明細書の構造式においてピラノース型が示されていても、フラノース型も包含されることが理解されよう。糖の種々のアノマー型も包含される。
２つのアミノ酸配列間の百分率配列同一性への言及は、アラインメントした際に、２つの配列の比較においてアミノ酸の百分率が同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献２３３の７．７．１８節に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより、ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭ行列６２を用いたアフィンギャップ検索を使用して決定する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは参考文献２３４に開示されている。
本発明の特定の実施形態
本発明の特定の実施形態は以下を含む：
１．Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲート。
２．（ａ）莢膜多糖内の第一ヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を有する酸化多糖をもたらすステップと、（ｂ）酸化多糖を、アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスによって得ることができる実施形態１に記載のコンジュゲート。
３．ステップ（ａ）における酸化が莢膜多糖内の残基の１〜１０％の間にある第一ヒドロキシル基の酸化である、実施形態２に記載のコンジュゲート。
４．酸化が莢膜多糖内の残基の４〜８％の間にある第一ヒドロキシル基の酸化である、実施形態３に記載のコンジュゲート。
５．ステップ（ａ）における酸化がＴＥＭＰＯ媒介性酸化である、実施形態２から４のいずれかに記載のコンジュゲート。
６．ステップ（ｂ）におけるカップリングが直接的である、実施形態２から５のいずれかに記載のコンジュゲート。
７．ステップ（ｂ）におけるカップリングがアルデヒド基とキャリア分子の第一アミン基の間の還元的アミノ化によるものである、実施形態６に記載のコンジュゲート。
８．（ａ）莢膜多糖の還元末端の還元的アミノ化を行って、末端サブユニットのＣ−１原子に第一アミン基が共有結合によって結合した改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）改変多糖を、第一アミン基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスによって得ることができる、実施形態１に記載のコンジュゲート。
９．ステップ（ｂ）におけるカップリングがリンカーを介する、実施形態８に記載のコンジュゲート。
１０．（ａ）莢膜多糖の還元末端を還元して、その末端に２つの隣接するヒドロキシル基を有する改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）隣接するヒドロキシル基の酸化的切断を行って、末端にアルデヒド基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｃ）アルデヒド基の還元的アミノ化を行って、末端に第一アミン基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｄ）さらなる改変多糖を、第一アミン基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスによって得ることができる、実施形態１に記載のコンジュゲート。
１１．第一アミン基が末端サブユニットのＣ−５原子に共有結合によって結合している、実施形態１０に記載のコンジュゲート。
１２．ステップ（ｃ）における還元的アミノ化がアルデヒド基と式Ｘ１−Ｌ−Ｘ２の二官能性リンカーの末端第一アミン基の間のものであり、式中、Ｘ１は末端第一アミン基を含み、Ｘ２はさらなる末端第一アミン基を含み、Ｌは、連結部分である、実施形態１０に記載のコンジュゲート。
１３．Ｘ１基およびＸ２基がどちらも−ＮＨＮＨ２である、実施形態１２に記載のコンジュゲート。
１４．ステップ（ｄ）におけるカップリングがリンカーを介する、実施形態１０から１３のいずれかに記載のコンジュゲート。
１５．カップリングが、第一アミン基とカップリングするための第１の基およびキャリア分子のアミンとカップリングするための第２の基を有する二官能性リンカーを介する、実施形態９または１４に記載のコンジュゲート。
１６．二官能性リンカーが式Ｘ−Ｌ−Ｘのホモ二官能性リンカーであり、２つのＸ基が互いに同じであり、第一アミンと反応することができ、Ｌがリンカーの連結部分である、実施形態１５に記載のコンジュゲート。
１７．Ｘ基がＮ−オキシスクシンイミドである、実施形態１６に記載のコンジュゲート。
１８．Ｌが式−Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’−を有し、Ｌ’がカルボニルである、実施形態１２、１３、１６または１７のいずれかに記載のコンジュゲート。
１９．Ｌ２が−（ＣＨ２）４−である、実施形態１８に記載のコンジュゲート。
２０．莢膜多糖がオリゴ糖である、前記の実施形態のいずれかに記載のコンジュゲート。
２１．オリゴ糖の重合度が６０から１００の間または１０から２０の間である、実施形態２０に記載のコンジュゲート。
２２．キャリア分子が、ジフテリアトキソイドもしくは破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７またはタンパク質Ｄである、前記の実施形態のいずれかに記載のコンジュゲート。
２３．キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む、実施形態１から２１のいずれかに記載のコンジュゲート。
２４．ｓｐｒ００９６抗原が、配列番号１または配列番号２に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２３に記載のコンジュゲート。
２５．ｓｐｒ２０２１抗原が配列番号３に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２３または実施形態２４に記載のコンジュゲート。
２６．キャリア分子が、ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を単一のポリペプチド鎖として含む、実施形態２３から２５のいずれかに記載のコンジュゲート。
２７．ポリペプチド鎖が式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨのポリペプチド鎖であり、式中、Ａが任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂが任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎが２以上の整数であり、各Ｘがｓｐｒ００９６抗原またはｓｐｒ２０２１抗原のアミノ酸配列であり、少なくとも１つのＸがｓｐｒ００９６抗原であり、少なくとも１つのＸがｓｐｒ２０２１抗原であり、Ｌが任意選択のリンカーアミノ酸配列である、実施形態２６に記載のコンジュゲート。
２８．ｎが２である、実施形態２７に記載のコンジュゲート。
２９．Ｘ１がｓｐｒ００９６抗原であり、Ｘ２がｓｐｒ２０２１抗原である、実施形態２８に記載のコンジュゲート。
３０．ポリペプチド鎖が、配列番号９に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、特に、配列番号９のアミノ酸配列を含む、実施形態２９に記載のコンジュゲート。
３１．血清群Ｘ莢膜多糖を、特に前記の実施形態のいずれかに定義されているコンジュゲートの形態で含む免疫原性組成物。
３２．１種または複数種のさらなる抗原をさらに含む、実施形態３１に記載の免疫原性組成物。
３３．血清群Ａ莢膜多糖をさらに含む、実施形態３１または実施形態３２に記載の免疫原性組成物。
３４．血清群Ａ莢膜多糖がキャリア分子とコンジュゲートしている、実施形態３３に記載の免疫原性組成物。
３５．血清群Ｗ１３５莢膜多糖をさらに含む、実施形態３１から３４のいずれかに記載の免疫原性組成物。
３６．キャリア分子とコンジュゲートした血清群Ａ莢膜多糖を含む、実施形態３５に記載の免疫原性組成物。
３７．血清群Ｗ１３５莢膜多糖がキャリア分子とコンジュゲートしている、実施形態３５または実施形態３６に記載の免疫原性組成物。
３８．キャリア分子が実施形態２２に定義されている通りである、実施形態３４、３６または３７に記載の組成物。
３９．血清群Ｃ莢膜多糖をさらに含む、実施形態３１から３８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４０．血清群Ｙ莢膜多糖をさらに含む、実施形態３１から３９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４１．莢膜多糖がキャリア分子とコンジュゲートしている、実施形態３９または実施形態４０に記載の免疫原性組成物。
４２．キャリア分子が実施形態２２に定義されている通りである、実施形態４１に記載の組成物。
４３．水性製剤の状態である、実施形態３１から４２のいずれかに記載の免疫原性組成物。
４４．実施形態３１から４３のいずれかに記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
４５．哺乳動物に実施形態３１から４４のいずれかに記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
４６．実施形態２から１９のいずれかに定義されている通りである、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセス。
４７．コンジュゲートが実施形態２０から３０のいずれかに定義されている通りである、実施形態４６に記載のプロセス。
４８．（ａ）血清群Ｘ莢膜多糖と（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含み、水性製剤の状態である医薬組成物。
４９．血清群Ｘ莢膜多糖が実施形態１から３０のいずれかに定義されているコンジュゲートの形態である、実施形態４８に記載の医薬組成物。
５０．実施形態３２から４２のいずれかに定義されている１種または複数種のさらなる抗原をさらに含む、実施形態４８または実施形態４９に記載の医薬組成物。
５１．血清群Ｘ莢膜多糖を含有する疑いがある試料をアッセイするための方法であって、（ｉ）試料中の任意の血清群Ｘ莢膜多糖を加水分解して、加水分解産物をもたらすステップと、（ｉｉ）加水分解産物を液体クロマトグラフィーに供するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において分離された任意のグルコサミン−４−リン酸を検出するステップとを含む方法。
５２．試料が、コンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖および／またはコンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖を含有する、実施形態５１に記載の方法。
５３．試料中のコンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖とコンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖を、ステップ（ｉ）の前に互いと分離させる、実施形態５１または実施形態５２に記載の方法。
５４．分離に固相抽出を使用する、実施形態５３に記載の方法。
５５．ステップ（ｉｉ）が高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を伴う、実施形態１から５４のいずれかに記載の方法。
５６．ステップ（ｉｉｉ）がパルス電流滴定検出（ＰＡＤ）を伴う、実施形態１から５５のいずれかに記載の方法。
５７．ステップ（ｉ）が酸加水分解を伴う、実施形態１から５６のいずれかに記載の方法。
５８．ステップ（ｉｉｉ）が定量的なものである、実施形態１から５７のいずれかに記載の方法。
５９．試料を、検体中のコンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖とコンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖を分離し、コンジュゲートしていない材料を試料として使用することによって調製する、前記の実施形態のいずれかに記載の方法。
６０．総血清群Ｘ莢膜多糖含量を、実施形態５３を除く実施形態５１から５９のいずれかに記載の方法によって測定し、コンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖含量を、実施形態５３から５９のいずれか１つに記載の通り測定し、したがって、コンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖の総血清群Ｘ莢膜多糖に対する比を算出することができる、血清群Ｘ莢膜多糖を含有する疑いがある検体を分析するための方法。
図１は、血清群Ｘ莢膜多糖の反復単位を示す図である。
図２は、ネイティブな血清群Ｘ莢膜多糖および加水分解された血清群Ｘ莢膜多糖についての超高速液体クロマトグラムを示す。
図３は、ＴＥＭＰＯ酸化、続いて還元的アミノ化による血清群Ｘ莢膜多糖とＣＲＭ１９７のコンジュゲーションについてのスキーム、および得られたコンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。
図４は、リン酸緩衝食塩水を用いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラムに流したコンジュゲーション混合物のクロマトグラムを示す。
図５は、ＳＩＤＥＡリンカーを介した血清群Ｘ莢膜多糖とＣＲＭ１９７のコンジュゲーションについてのスキーム、および得られたコンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。
図６は、異なる方法を使用した、ＳＩＤＥＡリンカーを介した血清群Ｘ莢膜多糖とＣＲＭ１９７のコンジュゲーションについてのスキーム、および得られたコンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。
図７は、異なるリンカーを使用して作製した血清群Ｘ莢膜多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。
図８は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ｘ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｘに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図９は、同じ実験からの血清群Ａ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ａに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図１０は、同じ実験からの血清群Ｃ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｃに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図１１は、同じ実験からの血清群Ｗ１３５莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｗ１３５に対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図１２は、同じ実験からの血清群Ｙ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｙに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図１３は、酸加水分解によって生成したＭｅｎＡオリゴ糖（ａ）およびＭｅｎＸオリゴ糖（ｂ）について４００ＭＨｚおよび２５±０．１℃で記録した２Ｄ １Ｈ−３１Ｐ ＨＭＢＣ ＮＭＲスペクトルを示す。ピーク割り当てが標識されている。
図１４は、３７℃および４５℃においてＭｅｎＡ莢膜多糖およびＭｅｎＸ莢膜多糖について収集した、時間の関数としてのａ）ａｖＤＰおよびｂ）ｐＨならびにＣ）ＭｅｎＡ莢膜多糖のみについてのＯ−アセチルの状態を示す図である。
図１５は、３７℃および４５℃における安定性試験について、ａ）ＭｅｎＡ莢膜多糖およびｂ）ＭｅｎＸ莢膜多糖について、４５℃で（ａ）０日、（ｂ）７日、（ｃ）１０日、（ｄ）１４日、（ｅ）２１日の時点、および３７℃で（ｆ）７日、（ｇ）１４日、（ｈ）２１日、（ｉ）２８日の時点で収集した、時間の関数としてのａｖＤＰのプロファイルを示す図である。さらに、酸性処理（酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、８０℃で約４時間）によって得た、実験的に分解させたＭｅｎＸ莢膜多糖のプロファイルがｂ）（ｌ）に示されている。
図１６は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ｘ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｘに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図１７は、さらなる方法を使用した血清群Ｘ莢膜多糖とＣＲＭ１９７のコンジュゲーションについてのスキーム、および得られたコンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。
図１８は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ａ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ａに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図１９は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ｃ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｃに対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図２０は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ｗ１３５莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｗ１３５に対する血清殺菌抗体価を示す図である。
図２１は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ｙ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価を示す図である。
図２２は、種々のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓコンジュゲートを用いて免疫した後の血清群Ｘ莢膜多糖に対する高親和性ＩｇＧ抗体価を示す図である。
発明の実施するための態様
血清群Ｘ莢膜多糖産生のための細菌の成長
血清群Ｘ莢膜多糖の産生および上清中への放出のために最適な細菌の成長条件を同定するために、ＭｅｎＸ５９６７（ＳＴ７５０）株を使用して３つの異なる培地を試験した。異なる成長をフラスコ内で実施し、プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ ＮＭＲ）によってモニターした。培養上清を、拡散フィルターを用いたＮＭＲシーケンスによって分析して、低分子量（ＭＷ）種に由来するシグナルをカットオフし、高ＭＷ血清群Ｘ莢膜多糖のシグナルを強調した。対応するペレットの１Ｈ 高分解能マジック角回転ＮＭＲ（ＨＲ−ＭＡＳ ＮＭＲ）による固体状態でのさらなる分析では血清群Ｘ莢膜多糖シグナルは示されず、これにより、多糖の大部分が上清中に放出されたことが示された（このアッセイの検出限界を考慮すると、細菌に残っている多糖の最大量は出発量の１／８のはずである）。３つの培地で同様の結果が得られた。
ＮＭＲ方法体系に加えて、清澄化された培養ブロス中の血清群Ｘ莢膜多糖を定量化するためのより正確な方法を、パルス電流滴定検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用して開発した（以下を参照されたい）。下記の表に示されているように、培地＃３で最高量の多糖がもたらされた。したがって、これをより大規模な（１８Ｌ）発酵のために選択し、これにより上清中に３５６μｇ／ｍＬの血清群Ｘ莢膜多糖がもたらされた。
血清群Ｘ莢膜多糖の精製
血清群Ｘ莢膜多糖を精製するためのプロセスは、参考文献２３５から適合させた方法によって精製した。
コンジュゲートの作製および特徴付け
鎖長が異なる多糖および異なるコンジュゲーション化学反応を使用してコンジュゲートを作製した。
酸化および還元的アミノ化によるコンジュゲーション（方法Ａ）：
精製した血清群Ｘ莢膜多糖を５０ｍＭの酢酸ナトリウム中、ｐＨ４．７、１００℃で１時間加水分解した（図２）。ＮＭＲにより、生じたオリゴ糖の平均重合度は８０であると決定され、これは分子量２５〜３０ｋＤａに対応した。多糖の解重合をインプロセスで超高速液体クロマトグラフィー−サイズ排除クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＵＰＬＣ−ＳＥＣ）およびリン（３１Ｐ）ＮＭＲ分光法によってモニターし、所望のａｖＤＰに達したところで、それを中和によってクエンチした。緩衝液をテトラブチルアンモニウムブロミドと交換してジメチルホルムアミド溶媒中で糖を溶解させた。次いで、糖を、ＴＥＭＰＯ（ＭｅｎＸ反復サブユニットに対して０．０６ｅｑ）、ＮａＨＣＯ３（ＭｅｎＸ反復サブユニットに対して９ｅｑ）、ＴＣＣ（ＭｅｎＸ反復サブユニットに対して２ｅｑ）を用いて０℃で一晩酸化させた。この酸化により、個々のサブユニットのＣ−６位にアルデヒド基が生成される（図３）。酸化された糖を、アセトン／ＮａＣｌを用いた沈殿およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５カラムを使用したゲル濾過によって精製した。糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを使用して定量化し、ＮＭＲを使用してその構造的同一性を確認した。鎖当たりおよそ４．５個の基が酸化され、これは、約８０残基鎖にわたっておよそ６％の程度の酸化に対応した。酸化された糖の分子量分布をＵＰＬＣ−ＳＥＣによって測定した。
還元的アミノ化によってキャリアタンパク質ＣＲＭ１９７とコンジュゲートするためにアルデヒド基を使用した（図３）。簡単に述べると、糖をｗ／ｗ比４：１の１０ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７およびｗ／ｗ比１：１のＮａＢＨ３ＣＮと、ｐＨ７．２、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液中で混合した。混合物を３７℃でゆっくり撹拌しながら７２時間放置した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００カラムでリン酸緩衝食塩水を用いてコンジュゲートを精製し、画分をプールへと収集した（図４）。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってコンジュゲーションを検証した（図３）。精製されたコンジュゲート（プール１）の特質が下に示されている：
この方法により、多糖が酢酸ナトリウムで加水分解されておらず、したがって、ネイティブな平均重合度を有するコンジュゲートも作製した。平均重合度が１３０である多糖を含有するさらなるコンジュゲートを作製した。
この方法により、キャリアタンパク質が破傷風トキソイド（ＴＴ）または配列番号９（ＳＥＱ９）であるコンジュゲートも作製した。これらのコンジュゲート内の多糖の平均重合度は１３０であった。これらのコンジュゲートの他の特性が下に示されている：
還元的アミノ化、続いてＳＩＤＥＡリンカーとの反応によるコンジュゲーション（方法Ｂ）：
精製した血清群Ｘ莢膜多糖を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム中、ｐＨ４．７、１００℃で２時間加水分解した（図２）。ＮＭＲにより、生じたオリゴ糖の平均重合度は１５であると決定され、これは分子量５ｋＤａに対応した。次いで、糖を、３７℃で５日にわたり、３００ｍｇ／ｍｌのＮＨ４ＯＡｃおよび４９ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ３ＣＮを含む、５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５中、５ｍｇ／ｍｌで可溶化した。このステップにより、末端アルデヒド基が還元的アミノ化され第一アミン基が生成した（図５）。次いで、反応混合物を１ＭのＮａＣｌおよび水に対する２００ｃｍ２のＨｙｄｒｏｓａｒｔ（セルロース）２ｋＤａ−カットオフ膜を用いた接線流濾過によって精製した。次いで、第一アミン基を、ＳＩＤＥＡを用いた活性化およびその後のキャリアタンパク質ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションのために使用した（図５）。簡単に述べると、改変糖を、ＮＥｔ３（ＮＥｔ３：総ＮＨ２基のモル比５：１で）を含む９：１（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ／水中に、１２：１のＳＩＤＥＡのｍｏｌ：ＮＨ２基の総ｍｏｌで、室温で３時間にわたって溶解させた。次いで、反応混合物を、９０％ジオキサン（ｖ／ｖ）を用いた沈殿によって精製した。次いで、ＳＩＤＥＡ−改変糖を２５ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７と、２５ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７．２中、１３：１（活性なエステル基：ＣＲＭ１９７のモル比）の比で反応させた。混合物を室温でゆっくり撹拌しながら５時間放置した。コンジュゲートを、（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いた沈殿によって精製した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってコンジュゲーションを検証した（図５）。これらのコンジュゲートの１つのロットの特質が下に示されている：
還元、酸化および還元的アミノ化、続いてＳＩＤＥＡリンカーとの反応によるコンジュゲーション（方法Ｃ）：
精製された血清群Ｘ莢膜糖を、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ８中、１５ｍｇ／ｍｌで、ＮａＢＨ４（ＭｅｎＸの分子量に対して１２ｅｑ、固体）と、室温で１．５時間反応させた。このステップにより、糖が還元された。次いで、還元した糖を、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７．２中、６〜８ｍｇ／ｍｌで、ＮａＩＯ４（ＭｅｎＸの分子量に対して１０ｅｑ、固体）と室温で１．５時間反応させた。これらの二段階の組合せ効果により、糖の還元末端にアルデヒド基が生成される（図６）。次いで、改変糖を還元的アミノ化に供して、ＳＩＤＥＡを用いた活性化およびその後のキャリアタンパク質ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションのために使用することができる第一アミン基をもたらす（図６）。簡単に述べると、改変糖を、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７中、３００ｍｇ／ｍｌのＮＨ４ＯＡｃおよび４９ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ３ＣＮを用いて３７℃で５日にわたり、４〜５ｍｇ／ｍｌで可溶化した。次いで、改変糖を、ＮＥｔ３（ＮＥｔ３：総ＮＨ２基のモル比５：１で）を含む９：１（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ／水に、１２：１のＳＩＤＥＡのｍｏｌ：ＮＨ２基の総ｍｏｌで、室温で３時間にわたって溶解させた。次いで、反応混合物を、８０％アセトン（ｖ／ｖ）を用いた沈殿によって精製した。次いで、生じたＳＩＤＥＡ−改変糖を、１００ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７．２中、２５ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７と１３：１（活性なエステル基：ＣＲＭ１９７のモル比）の比で反応させた。混合物を室温でゆっくり撹拌しながら一晩放置した。コンジュゲートを、（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いた沈殿によって精製した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってコンジュゲーションを検証した（図６）。これらのコンジュゲートの１つのロットの特質が下に示されている：
代替のリンカーを介したコンジュゲーション（方法Ｄ）：
また、上記のとおりに、平均重合度が１５である精製された血清群Ｘ莢膜多糖を、ＵＳ６１／５３４，７５１の図７の方法に従い、異なるリンカーを使用してＣＲＭ１９７とコンジュゲートした。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってコンジュゲーションを検証した（本明細書では図７）。
還元、酸化および還元的アミノ化によるキャリアとのコンジュゲーション（方法Ｅ）：
精製された血清群Ｘ莢膜糖を、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ８中、１５ｍｇ／ｍｌで、ＮａＢＨ４（ＭｅｎＸの分子量に対して１２ｅｑ、固体）と室温で２時間にわたって反応させた。このステップにより、糖が還元された。次いで、還元した糖を、１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７．２中、６〜８ｍｇ／ｍｌでＮａＩＯ４（ＭｅｎＸの分子量に対して１０ｅｑ、固体）と室温で１．５時間にわたって反応させた。これらの二段階の組合せ効果により、糖の還元末端にアルデヒド基が生成される（図１７）。次いで、改変糖を、キャリアタンパク質ＣＲＭ１９７を用いた還元的アミノ化に供する。簡単に述べると、改変糖を、３００ｍＭのＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ８（糖：ＣＲＭ１９７の重量比８：１）およびＮａＢＨ３ＣＮ（糖：ＮａＢＨ３ＣＮの重量比４：１）中で、３７℃で４日にわたり、２ｍｇ／ｍｌで溶解させた。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってコンジュゲーションを検証した（図１７）。
免疫試験（１）
一般的なアッセイプロトコール：Ｂａｌｂ／ｃマウスを、下記のスケジュールに従って皮下注射によって免疫した。注射体積は２００μｌであり、注射は、ミョウバンリン酸塩アジュバント（ａｌｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）（用量当たり１２０μｇ）を含有した。注射は１日目、１４日目および２８日目に行い、０日目（免疫前血清）、２８日目（第２の免疫後の血清）および４２日目（第３の免疫後の血清）に採血した。
ＭｅｎＡＣＷＹ＝参考文献１０に従って調製したＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７、ＭｅｎＷ１３５−ＣＲＭ１９７およびＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７の混合物。
第３の免疫後の血清群Ｘ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｘ Ｚ９６１５株に対する血清殺菌抗体価が図８に示されている。血清群Ｘコンジュゲートは、免疫原性であり、かつ誘導性殺菌性の抗体であった。用量を１０分の１（０．１μｇ）に減少させた場合、応答は減弱しなかった。コンジュゲートを血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに由来するコンジュゲートと組み合わせた場合、応答はわずかに低下したが、それでも対照を十分に上回った。したがって、これらのコンジュゲートと血清群Ｘコンジュゲートの間の免疫干渉は比較的小さいようである。
第３の免疫後の血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価およびこれらの血清群に対する血清殺菌抗体価（それぞれＦ８２３８株、１１株、２４００７０株および８６０８００株を使用）も群５、６、７および８について測定した。結果が図９〜１２に示されている。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹコンジュゲートに対する応答は、一般に、血清群Ｘコンジュゲートと組み合わせた場合、減弱しなかった。再度、これらの結果により、これらのコンジュゲートと血清群Ｘコンジュゲートの間の免疫干渉がわずかであることが示唆される。
抗血清群Ｘ莢膜多糖ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ単位は、ＩｇＭからＩｇＧへの有効なアイソタイプスイッチングに起因して、コンジュゲートワクチンについて予想された通り、全てのコンジュゲートについて低いことが見いだされた。
改変ＥＬＩＳＡを用いてアビディティが高いＩｇＧ抗体のみを測定した（図２２）。改変ＥＬＩＳＡでは、カオトロピック塩を使用してアビディティが高いＩｇＧ抗体のみを選択し、検出する。抗血清群Ｘ莢膜多糖ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ単位は、第２の投薬後および第３の投薬後のどちらにおいても、全てのコンジュゲートについて、標準のＥＬＩＳＡによる単位と比較して低かったが、第３の投薬後に、全てのコンジュゲートについて統計的に有意な追加免疫効果が観察された（Ｐ＝０．０００６〜＜０．０００１）。
以下の表には、プールされた第３の免疫後の血清からの、種々の株に対するウサギ補体血清殺菌抗体価が要約されている。
免疫試験（２）
一般的なアッセイプロトコール：Ｂａｌｂ／ｃマウスを、下記のスケジュールに従って皮下注射によって免疫した。注射体積は２００μｌであり、注射はミョウバンリン酸塩アジュバントを含有した。
ＭｅｎＡＣＷＹ＝参考文献１０に従って調製したＭｅｎＡ−ＣＲＭ１９７、ＭｅｎＣ−ＣＲＭ１９７、ＭｅｎＷ１３５−ＣＲＭ１９７およびＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７の混合物。
第３の免疫後の血清群Ｘ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ｘ Ｚ９６１５株に対する血清殺菌抗体価が図１６に示されている。血清群Ｘコンジュゲートは、免疫原性であり、かつ誘導性殺菌性の抗体であった。ＭｅｎＸ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに由来するコンジュゲートと組み合わせた場合、応答はわずかに低下したが、それでも対照を十分に上回った。対照的に、ＭｅｎＸ−ＴＴまたはＭｅｎＸ−ＳＥＱ９コンジュゲートをこれらのコンジュゲートと組み合わせた場合には低下はわずかであるか、または全く認められなかった。したがって、ＭｅｎＸ多糖に対して異なるキャリアタンパク質を使用することは、血清群Ｘコンジュゲートとこれらのコンジュゲートの間のいかなる免疫干渉をも低下させるために役立ち得る。
ＭｅｎＸコンジュゲートを血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに由来するコンジュゲートと混合した場合の、第３の免疫後の血清群Ａ莢膜多糖に対するＩｇＧ抗体価および血清群Ａ Ｆ８２３８株に対する血清殺菌抗体価が図１８に示されている。血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹについての対応するデータが図１９〜２１に示されている。
安定性試験（１）
材料：精製されたＭｅｎＡ多糖およびＭｅｎＸ多糖を参考文献１０の方法に従って得た。多糖調製物の純度を、残留するタンパク質および核酸の含量を推定することによって評価し、これは、糖の１％ｗ／ｗよりも低かった。
ＮＭＲ分析：１Ｈ ＮＭＲ実験、１３Ｃ ＮＭＲ実験および３１Ｐ ＮＭＲ実験を、高精度温度制御器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ分光計で、５ｍｍの広帯域プローブ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して記録した。データの取得および処理のために、ＴｏｐＳｐｉｎバージョン２．６ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、２５±０．１℃で、１０ｐｐｍスペクトル幅にわたって３２ｋデータポイントを用い、１２８回のスキャンを蓄積しながら収集した。スペクトルを０．２Ｈｚ線幅拡大で重み付けし、フーリエ変換した。トランスミッターを、参照シグナルとして使用した水の周波数（４．７９ｐｐｍ）に設定した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、１００．６ＭＨｚおよび３７±０．１℃で、２００ｐｐｍスペクトル幅にわたって３２ｋデータポイントを用い、４ｋ回のスキャンを蓄積しながら記録した。スペクトルを０．２Ｈｚ線幅拡大で重み付けし、フーリエ変換した。トランスミッターを、参照シグナルとして使用したアセトンの周波数（３０．８９ｐｐｍ）に設定した。３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、１６１．９ＭＨｚ、２５±０．１℃で、２０ｐｐｍスペクトル幅にわたって３２ｋデータポイントを用い、およそ１ｋ回のスキャンを蓄積しながら記録した。スペクトルを３．０Ｈｚ線幅拡大で重み付けし、フーリエ変換した。酸化重水素（ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｏｘｉｄｅ）中８５％リン酸を外部標準として使用した（０ｐｐｍ）。１Ｈ ＮＭＲスペクトルおよび３１Ｐ ＮＭＲスペクトルは全て、各シグナルの完全な回収を確実にするための総再利用時間（５×縦緩和時間Ｔ１）を使用して定量的に得た。ＭｅｎＡ莢膜多糖およびＭｅｎＸ莢膜多糖の分解機構を確認し、したがって、３１Ｐ ＮＭＲピークを割り当てるために、２次元の１Ｈ−３１Ｐ異核多結合相関（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｂｏｎｄ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）（ＨＭＢＣ）実験を、予め、それぞれ５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８（糖濃度約１０ｍｇ／ｍＬ）中、７３℃で約２．５時間、およびｐＨ４．０、８０℃で約５．５時間（糖濃度約２．５ｍｇ／ｍＬ）、酸加水分解することによって生成したＭｅｎＡオリゴ糖（ｏｌｉｇｏｓａｃｃａｒｉｄｅ）試料およびＭｅｎＸオリゴ糖試料に関して得た。ＭｅｎＡオリゴ糖およびＭｅｎＸオリゴ糖の平均重合度（ａｖＤＰ）は、３１Ｐ ＮＭＲ分析によって推定したところ、それぞれ約１２および約１０であった（下の安定性実験の段落を参照されたい）。これらのＮＭＲ分析用試料を、乾燥糖およそ１０ｍｇを酸化重水素（９９．９％Ｄ原子−Ａｌｄｒｉｃｈ）０．７５ｍＬに標準のパルス−プログラムを用いて可溶化することによって調製した。Ｆ２次元およびＦ１次元でそれぞれ４０９６データポイントおよび５１２データポイントを収集した。６４回のスキャンを蓄積した後にフーリエ変換して、Ｆ２およびＦ１において、それぞれポイントあたり０．２Ｈｚおよび５．０Ｈｚのデジタル分解能を得た。
ＨＰＬＣ分析：ＨＰＬＣ分析を、パルス電流滴定検出器（Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備えたＩＣＳ ３０００ Ｄｉｏｎｅｘシステムに接続した、ガードカラム（４ｍｍ×５０ｍｍ；Ｄｉｏｎｅｘ）を伴うＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２００カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ；Ｄｉｏｎｅｘ）を使用して行った。カラム平衡化のために１００ｍＭのＮａＯＨ＋１０ｍＭの硝酸ナトリウム緩衝液を使用し、溶出のために硝酸ナトリウムの量を増加させる３段階勾配（１００ｍＭのＮａＯＨ＋１０ｍＭの硝酸ナトリウム、２５０ｍＭの硝酸ナトリウム、５００ｍＭの硝酸ナトリウムをそれぞれ８０分、１５分および３分）を使用した。１２０分の実行中ずっと０．４ｍＬ／分の流速を使用した。試料２０μＬをおよそ１ｍｇ／ｍＬの濃度で注射した。流出液を、電気化学的検出器をパルス電流滴定モードで使用し、金作用電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用いてモニターした。炭水化物に対して四重電位波形（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗａｖｅｆｏｒｍ）を適用した。得られたクロマトグラフィーデータを、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア６．８（Ｄｉｏｎｅｘ）を使用して処理した。
安定性実験：重水を用いて調製した１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０中およそ１ｍｇ／ｍＬの濃度のＭｅｎＡ多糖溶液およびＭｅｎＸ多糖溶液をそれぞれ３７℃および４５℃でインキュベートした。種々の時点において試料を取り出し、ＮＭＲおよびＨＰＬＣによって分析した。ｐＨも各時点でモニターした。多糖安定性に関してＭｅｎＡおよびＭｅｎＸのａｖＤＰをモニターした。３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを積分し、［（Ｐｄｅ／Ｐｍｅ）＋１］（式中、Ｐｄｅは鎖基内のホスホジエステルのモル濃度であり、Ｐｍｅはホスホモノエステル末端基のモル濃度である）として表すことによってａｖＤＰ値を算出した。３１Ｐ ＮＭＲアッセイによって収集されたより正確な安定性評価を確認するために、ＨＰＬＣプロファイルも半定量的に評価した。
ＭｅｎＡ多糖およびＭｅｎＸ多糖の分解機構
穏やかな酸加水分解によって生成したＭｅｎＡオリゴ糖に関するＮＭＲ １Ｈ−３１Ｐ ＨＭＢＣデータが図１３（ａ）に報告されている。マンノサミン残基のＣ３およびＣ４にＯ−アセチル基が存在することに起因して、いくつかのスピンシステムが検出され、割り当てられた：（ｉ）３−Ｏ−アセチル化残基または４−Ｏ−アセチル化残基のＣ１におけるプロトン（Ｈ１−Ｐｄｅ）３／４ＯＡｃ；（ｉｉ）脱Ｏ−アセチル化残基のＣ１におけるプロトン（Ｈ１−Ｐｄｅ）ｄｅＯＡｃ；（ｉｉｉ）Ｏ−アセチル基のＣ３およびＣ４ジェミナルにおけるプロトン（Ｈ３／Ｈ４−Ｐｄｅ）３／４ＯＡｃ；（ｉｖ）３−Ｏ−アセチル化残基のＣ２におけるプロトン（Ｈ２−Ｐｄｅ）３ＯＡｃ；（ｖ）４−Ｏ−アセチル化残基のＣ２におけるプロトン（Ｈ２−Ｐｄｅ）４ＯＡｃ；（ｖｉ）脱Ｏ−アセチル化残基のＣ２におけるプロトン（Ｈ２−Ｐｄｅ）ｄｅＯＡｃ；（ｖｉｉ）３−Ｏ−アセチル化残基または４−Ｏ−アセチル化残基のＣ５およびＣ６におけるプロトン（Ｈ５／６−Ｐｄｅ）３／４ＯＡｃ；（ｖｉｉｉ）脱Ｏ−アセチル化残基のＣ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６におけるプロトン（Ｈ３／４／５／６−Ｐｄｅ）ｄｅＯＡｃ。ホスホモノエステルと、３−Ｏ−アセチル化残基または４−Ｏ−アセチル化残基のＣ６におけるプロトンとのクロスピーク（Ｈ６−Ｐｍｅ）３／４ＯＡｃ、および脱Ｏ−アセチル化残基のＣ６におけるプロトンとのクロスピーク（Ｈ６−Ｐｍｅ）ｄｅＯＡｃによって確認されたＣ６におけるリン酸の結合により、加水分解の間にホスホジエステル結合が切断され、それにより非還元末端に結合したリン酸基が離れることが示され、これは、リン酸−Ｃ１連結の安定性が低いことと一致する。他の１Ｈ−３１Ｐスカラー相関が検出されなかったので、加水分解の間にＣ４またはＣ３における遊離のヒドロキシル基が関与するリン酸の移動は起こらなかった。ＭｅｎＸオリゴ糖に関する１Ｈ−３１Ｐ ＨＭＢＣ（図１３（ｂ））によっても、リン酸−Ｃ１連結の安定性が低いことが示され、この場合、非還元末端はＣ４に結合したリン酸基を有する：リン酸モノエステルはＣ４のプロトンとのみ相互相関を示す。ＭｅｎＸについても、加水分解の間にＣ３またはＣ６における遊離のヒドロキシル基が関与するリン酸の移動は起こらなかった。３１Ｐスピンシステムの全てが割り当てられ、ホスホジエステルシグナルおよびホスホモノエステルシグナルはそれぞれ−１．４０ｐｐｍおよび４．６５ｐｐｍであった。このスカラーカップリングに起因してピーク構造を減少させる３１Ｐ−デカップリングスペクトルを収集することによってもプロトンＮＭＲプロファイルを割り当てた。スペクトルの割り当ては全て、主に１３Ｃ ＮＭＲ分析に基づく、公開されている結果（参考文献３０）と一致した。ＭｅｎＸ莢膜多糖の１３Ｃ ＮＭＲ化学シフトは、以下の表１に示されている通り、公開されているデータ（参考文献１４）と一致した：
表１：ＭｅｎＸ莢膜多糖の１３Ｃ ＮＭＲ化学シフト。
ＭｅｎＡ多糖およびＭｅｎＸ多糖の熱安定性。ホスホジエステル結合における加水分解の結果としてＭｅｎＡ莢膜多糖およびＭｅｎＸ莢膜多糖が分解されることにより、新しく形成されたホスホモノエステル末端基が露出した、ａｖＤＰが低い断片が生じる。ＮＭＲ実験では、これらのホスホモノエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｎｅｓｔｅｒ）基により、内部のホスホジエステル基によって生じるものよりも高磁場で３１Ｐ共鳴シグナルが生成され、したがって、上の安定性実験において記載されている通りａｖＤＰを算出することが可能になる。貯蔵の間のａｖＤＰの変動は多糖安定性の指標であり、したがって、ＭｅｎＡ莢膜多糖およびＭｅｎＸ莢膜多糖の試料のａｖＤＰを３７℃および４５℃に曝露している間の種々の時点において取得し、３１Ｐ ＮＭＲによって測定した（表２および図１４（ａ））：
表２：３７℃および４５℃の温度で種々の時点においてＭｅｎＡ試料およびＭｅｎＸ試料に関して３１Ｐ ＮＭＲ分析によって推定されたａｖＤＰおよび検出されたｐＨ値。反復単位のｍｏｌ当たりのＯ−アセチル基のｍｏｌとして表したＭｅｎＡ莢膜多糖のＯ−アセチル化の状態も報告されている。
使用した試料濃度において、この技法の感度では、どちらの多糖についても、ａｖＤＰが１００を超える場合にはゼロ時間においてａｖＤＰを測定することが可能にならなかった。各時点の試料について、ｐＨを７．０±０．１の範囲内に維持した（図１４（ｂ））。
３７℃では、２８日間インキュベートした後にＭｅｎＡ莢膜多糖がａｖＤＰ２２．９まで分解されたが、４５℃では、分解は加速され、２１日後にａｖＤＰが５．１になった。同じ条件下でＭｅｎＸ莢膜多糖では分解が示されなかった（どちらのインキュベーション温度でも全ての時点でａｖＤＰ＞１００；アッセイ感度に基づく、１００は検出可能な最大ａｖＤＰ値である）。３７℃で、および４５℃でインキュベートしたＭｅｎＡ莢膜多糖のＨＰＬＣプロファイル（図１５）では、次第に短いオリゴ糖の強度ピークの増加が示され、これにより、鎖の解重合が示された。比較して、全てのＭｅｎＸ試料に関して収集されたＨＰＬＣプロファイルは、およそ８７分における長鎖多糖に起因して実際に改変されていないままであり、広範なピークを伴い、これにより、この炭水化物の安定性が高いことがさらに実証される。１Ｈ ＮＭＲ分析により、ＭｅｎＡ莢膜多糖およびＭｅｎＸ莢膜多糖を３７℃で、および４５℃でインキュベートすることにより、多糖反復単位の構造は変更されないことが確認された。Ｏ−アセチル化レベル（Ｏ−アセチル基はＭｅｎＡ莢膜多糖にのみ存在する）の、反復単位１ｍｏｌ当たり０．９３２ｍｏｌから、３７℃では０．８８３ｍｏｌまで、４５℃では０．８２６ｍｏｌまでの限られた減少のみがそれぞれ観察された（表２および図１４（ｃ））。総合すると、これらのＮＭＲおよびＨＰＬＣのデータにより、水溶液中のＭｅｎＸ莢膜多糖の安定性がＭｅｎＡ莢膜多糖と比較して高いことが確認される。
安定性試験（２）
材料：上記の方法Ａ、ＢおよびＣに従ってＭｅｎＸ−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを調製した。
方法Ａに従って調製したコンジュゲートは平均重合度が１００である多糖を含有した。このコンジュゲートロットの他の特性が下に示されている：
方法Ｂに従って調製したコンジュゲートは以下の特性を有した：
方法Ｃに従って調製したコンジュゲートは平均重合度が１９である多糖を含有した。このコンジュゲートロットの他の特性が下に示されている：
これらのコンジュゲートの安定性に関する予備情報をもたらすために加速安定性試験を実施した。安定性試験を３７℃で２８日間実施し、測定時点は７日毎であった（０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目）。コンジュゲートから放出される遊離糖を測定することによって試料をモニターした。遊離糖の分離を、溶出緩衝液としてＡＣＮ１０〜２０％＋ＴＦＡ０．０５％を使用し、ＳＰＥ−Ｃ４カートリッジによって実施した。全糖および遊離糖をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によって定量化し、％遊離糖の算出を可能にした。コンジュゲートの３つのロットについての値が下に示されている：
方法Ａを使用して作製したコンジュゲートは、方法Ｂおよび方法Ｃによって作製したコンジュゲートよりも安定であった。
分析試験
材料：ＭｅｎＸ多糖をＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｘ５９６７株（ＳＴ７５０）の細菌成長によって産生させ、参考文献２３５から適合させた方法によって精製した。多糖調製物の純度を、比色定量アッセイを使用して残留するタンパク質および核酸の含量を推定することによって評価し（どちらも糖の＜１％ｗ／ｗで存在していた）、内毒素含量を、ＬＡＬアッセイを使用して評価した（糖１μｇ当たり＜１０ＥＵ）。酢酸ナトリウム塩（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｄｉｏｎｅｘ）、水酸化ナトリウム５０％溶液（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、トリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ）、Ｗａｔｅｒ ＭｉｌｌｉＱ ｇｒａｄｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）はプロアナリシス（ｐｒｏ ａｎａｌｙｓｉｓ）品質のものであった。
一般的な方法：総リン含量を参考文献２４の方法に従って測定した。
シリカゲル６０Ｆ２５４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって反応をモニターし、ＵＶ光の下で試験した後、化合物を１０％（ｖ／ｖ）エタノール性Ｈ２ＳＯ４と一緒に加熱することによって可視化した。予め充填されたシリカカートリッジＲｅｄｉＳｅｐ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ−Ｉｓｃｏ、０．０４０〜０．０６３ｎｍ）を使用してカラムクロマトグラフィーを実施した。別段の指定がない限り、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ−Ｉｓｃｏ）計器において溶出混合物の０→１００％の勾配を適用した。
１Ｈ ＮＭＲ実験、１３Ｃ ＮＭＲ実験および３１Ｐ ＮＭＲ実験を、高精度温度制御器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ分光計で、５ｍｍ広帯域プローブ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して記録した。データの取得および処理のために、ＴｏｐＳｐｉｎバージョン２．６ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用した。
１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、２５±０．１℃で、１０ｐｐｍスペクトル幅にわたって３２ｋデータポイントを用いて収集した。スペクトルを０．２Ｈｚ線幅拡大で重み付けし、フーリエ変換した。化学シフト値は内部Ｍｅ４Ｓｉシグナル（０．００ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）または溶媒シグナル（４．７９ｐｐｍ、Ｄ２Ｏ）と比較してｐｐｍで報告された。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを、１００．６ＭＨｚおよび３７±０．１℃で、２００ｐｐｍスペクトル幅にわたって３２ｋデータポイントを用いて記録した。スペクトルを０．２Ｈｚ線幅拡大で重み付けし、フーリエ変換した。化学シフト値はＣＤＣｌ３のシグナル（７７．０ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）と比較してｐｐｍで報告された。
３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、１６１．９ＭＨｚ、２５±０．１℃で、２０ｐｐｍスペクトル幅にわたって３２ｋデータポイントを用いて記録した。スペクトルを３．０Ｈｚ線幅拡大で重み付けし、フーリエ変換した。酸化重水素中８５％リン酸を外部標準として使用した（０ｐｐｍ）。
正確な質量を、Ｑ−Ｔｏｆ ｍｉｃｒｏ Ｍａｃｒｏｍａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ）計器を使用してエレクトロンスプレーイオン化カットオフ分光法により測定した。旋光度をＰ−２０００Ｊａｓｃｏ旋光度計で測定した。ベンジル３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド３。出発材料２（参考文献２３６）（１．８ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を窒素下でアセトニトリル（２００ｍｌ）中に溶解させ、トリメチルアミンボラン（１．４ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）およびＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（２．６ｍｌ、１８．４ｍｍｏｌ）を用いて０℃で処理した。０℃で１時間撹拌した後、混合物を外界温度まで到達させ、その時点で反応を完了した（ＴＬＣ、７：３シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）。ＭｅＯＨ（３ｍｌ）およびトリエチルアミン（３ｍｌ）を加え、混合物を濃縮した。水性ＮａＨＣＯ３を用いて残留物を分配し、合わせた有機層を濃縮し、シリカゲル（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）で精製して１．５ｇの生成物３（８３％）がもたらされた。［α］Ｄ ２４＝＋１．９（ｃ０．５、ＣＨＣｌ３）。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）： δ ＝ ７．８０−６．９５ （ｍ， １９ Ｈ， Ｐｈ）， ５．１５ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ１，２ ８．０ Ｈｚ， Ｈ−１）， ４．７８， ４．４７ （２ ｄ， ２ Ｈ， ２Ｊ １２．２ Ｈｚ， ＣＨ２Ｐｈ）， ４．７２， ４．５１ （２ ｄ， ２ Ｈ， ２Ｊ １２．０ Ｈｚ， ＣＨ２Ｐｈ）， ４．６７， ４．５９ （２ ｄ， ２ Ｈ， ２Ｊ １２．０ Ｈｚ， ＣＨ２Ｐｈ）， ４．２６−４．１８ （ｍ， ２ Ｈ， Ｈ−２，３）， ３．８７−３．８８ （ｍ， ３ Ｈ， Ｈ−４，６）， ３．６６−３．６２ （ｍ， １ Ｈ， Ｈ−５）， ２．８９ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ２，ＯＨ ２．３ Ｈｚ， ＯＨ−４）． １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， １００ ＭＨｚ）： δ＝ １６７．８１ （ＣＯ）， １３８．１５， １３７．５９， １３７．１０， １３３．６７， １３１．６１， １２８．１２， １２７．９１， １２７．８６， １２７．８１， １２７．５８， １２７．４０ （Ａｒ）， ９７．３５ （Ｃ−１）， ７８．４９ （Ｃ−３）， ７４．３７， ７４．２４（ＣＨ２Ｐｈ）， ７３．７８ （Ｃ−５）， ７３．４５ （Ｃ−４）， ７０．８０ （ＣＨ２Ｐｈ）， ７０．６９ （Ｃ−６）， ５５．３７ （Ｃ−２）。ＥＳＩ ＨＲ−ＭＳ（Ｃ３５Ｈ３３ＮＯ７）：ｍ／ｚ＝（［Ｍ＋Ｎａ］＋実測値５９７．２５４７；計算値５９７．２６０１）：（［Ｍ＋Ｎａ］＋実測値６１８．１８９５；計算値６１８．１８９４）。
ベンジル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド４。エチレンジアミン１．２ｍｌを含有するＥｔＯＨ（２０ｍｌ）中Ｎ−フタルイミド化合物３（１ｇ、１．７ｍｍｏｌ）の混合物を一晩還流させた。ＴＬＣ（トルエン−ＥｔＯＡｃ４：１）により反応の完了が示された後、混合物を濃縮し、４：１のＥｔＯＨ−Ａｃ２Ｏ（２５ｍｌ）中に再溶解させた。混合物を３時間撹拌し、次いで濃縮した。残留物（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）のクロマトグラフィーにより、７４０ｍｇの単糖４がもたらされ、そのＮＭＲデータは文献［２３７］において最近報告されたものと同一であった。
ベンジル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−４−（１，５−ジヒドロ−３−オキソ−３λ５−３Ｈ−２，４，３−ベンゾジオキサホスフェピン−３−イル）−β−Ｄ−グルコピラノシド５。Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，３，４−ベンゾジオキサホスフェピン−３−アミン（７１７ｍｇ、３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（９ｍｌ）中単糖（５００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液、およびアセトニトリル（９ｍｌ）中０．４５Ｍの１Ｈ−テトラゾールに０℃で加えた。１０分後に氷冷槽を除去し、撹拌を継続した。さらに３時間撹拌した後、反応を完了させた（ＴＬＣ、１：１トルエン−ＥｔＯＡｃ）。混合物を−２０℃に冷却し、ｍ−ＣＰＢＡを加えた。２０分後、いくらかの水性ＮａＨＣＯ３を加えてクエンチした。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水性ＮａＨＣＯ３を用いて分液漏斗中で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、残留物をシリカゲル（シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ）で精製して６３０ｍｇの生成物（９２％）がもたらされた。ＥｔＯＡｃからの白色結晶、ｍ．ｐ．１５９〜１６０℃。＝［α］Ｄ ２４＝＋３４．７（ｃ０．１、ＣＨＣｌ３）。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ４００ ＭＨｚ）： δ＝ ７．４１−７．１２ （ｍ， １８ Ｈ， Ｐｈ）， ５．９０ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ１，２ ７．６ Ｈｚ， Ｈ−１）， ５．１７−５．１２ （ｍ， ２ Ｈ， ２ ＣＨＰｈ）， ５．００−４．７８ （ｍ， ４ Ｈ， ４ ＣＨＰｈ）， ４．６５−４．５８ （ｍ， ５ Ｈ， ４ ＣＨＰｈ， Ｈ−４）， ４．３２ （ｔ， １ Ｈ， Ｊ ９．０ Ｈｚ， Ｈ−３）， ３．８９ （ｄ， １ Ｈ， Ｊ６ａ，５ ９．０ Ｈｚ， Ｈ−６ａ）， ３．７６−３．６９ （ｍ， ２ Ｈ， Ｈ−５，６ｂ）， ３．４６−３．４２ （ｍ， １ Ｈ， Ｈ−２）， １．８０ （ｓ， ３ Ｈ， ＣＨ３ＣＯ）。１３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， １００ ＭＨｚ）： δ＝ １７０．６１ （ＣＯ）， １３８．２６， １３７．３６， １３４．９８， １２８．９４， １２８．３５， １２７．９５， １２７．９８， １２７．８０， １２７．７１， １２７．５７， １２７．５０ （Ａｒ）， ９８．８５ （Ｃ−１）， ７８．７１ （Ｃ−３）， ７６．７２ （Ｃ−４）， ７３．９７ （Ｃ−５）， ７３．７６， ７３．４２， ７０．０９ （ＣＨ２Ｐｈ）， ６９．０４ （Ｃ−６）， ６８．３０， ６０．２５ （ＣＨ２Ｐｈ）， ５６．９５ （Ｃ−２）， ２３．４０ （ＣＨ３ＣＯ）。 ３１Ｐ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， １６２ ＭＨｚ）： δ＝ ０．３２．ＥＳＩ ＨＲ−ＭＳ（Ｃ３７Ｈ４０ＮＯ９Ｐ）：ｍ／ｚ＝（［Ｍ＋Ｈ］＋実測値６７４．２４７６；計算値６７４．２５１９）。
２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシルリン酸６。保護された単糖５（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（３０ｍｇ）で水素化した。混合物を１日撹拌し、次いで、セライトパッドを通して濾過した。溶媒を蒸発させ、回収した粗製材料をＣ−１８ Ｉｓｏｌｕｔｅ ＳＰＥカートリッジで精製した。糖を含有する画分をフリーズドライして４２ｍｇの発泡性生成物６（９５％）がもたらされ、そのＮＭＲデータは、文献［２３８］において報告されているものと一致した。
ＭｅｎＸを定量化するための、パルス電流滴定検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）：ＭｅｎＸ試料を、最終濃度２ＭのＴＦＡで処理して、総体積６００μＬの、０．５〜８μｇ／ｍＬの範囲まで希釈した。試料を閉じたねじ口試験管中１００℃で２．５時間加熱し、次いで２〜８℃で約３０分冷やし、２ＭのＮａＯＨ７００μＬを添加し、０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ（ＰＡＬＬ）フィルターで濾過した後に分析した。比色定量方法によって総リン含量について滴定したＭｅｎＸ ＰＳの純粋な調製物または合成単量体４−ＧｌｃＮＡｃ−４Ｐを、０．５〜８μｇ／ｍＬの範囲の標準物質を用いて設定する較正曲線を確立するために使用した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを、ＰＡ１ガードカラム（４×５０ｍｍ；Ｄｉｏｎｅｘ）と連結したＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ；Ｄｉｏｎｅｘ）を備えたＤｉｏｎｅｘ ＩＣＳ３０００を用いて実施した。試料を、１０分、１００ｍＭのＮａＯＨ中１００ｍＭから５００ｍＭまでのＡｃＯＮａの勾配を使用し、１ｍＬ／分の流速で流した。電気化学的検出器をパルス電流滴定モードで使用し、金作用電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用いて流出液をモニターした。炭水化物に対して四重電位波形を適用した。得られたクロマトグラフィーデータを、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア６．８を使用して処理した。
ＭｅｎＸ多糖およびＧｌｃＮＡｃ−４Ｐの酸加水分解ならびにＮＭＲによる特徴付け：ＭｅｎＸ多糖および合成単量体（１０ｍｇ）に対して大規模酸加水分解を行った。どちらの試料も２ＭのＴＦＡ２ｍＬに溶解させ、１００℃で２．５時間にわたって加水分解した。試料を乾燥させ、Ｄ２Ｏで３回交換した後に分析した。
加水分解条件の選択：ＭｅｎＸ加水分解により単量体サブユニットを完全に放出させ、それらの分解を最小限にすることを可能にするための最適な条件を同定するために、２ＭのＴＦＡ中、１００℃で加水分解を実施する、ＭｅｎＸ多糖の加水分解のための種々の反応時間（１〜６時間）を調査した。比色定量方法によって総リン含量について滴定したＭｅｎＸ多糖の純粋な調製物を２つの異なる濃度（０．５μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬ）で使用した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析によって優勢なピークが１つ検出された。ピークの面積は経時的に増加し、２時間と３時間の間で最大になり、続いて、長い時間で減少した。最終的に２．５時間を加水分解に最適な時間として選択した。
当該方法の直線性を０．５〜８μｇ／ｍＬの範囲で検証した（Ｒ２＝９９．８０７）。当該方法は発酵ブロスを含めた精製プロセス中間体に首尾よく適用され、また、当該方法の正確度を決定するために回収試験を行った。既知量の多糖を標準試料に加え、それを分析に供した。スパイクした試料について決定された総濃度とスパイクしていない試料において見いだされた濃度の間の差異に基づいて回収率を算出した。平均回収率は９８〜１０２％にわたり、これは、正確度が高いことを示している。同じ試料を４回分析することによって、１％のＣＶおよび対応する０．５％の平均ＣＶを有する分析間の再現性が達成された。
４Ｐ−ＧｌｃＮＡｃの合成：スキーム１に示されている通り、標的化合物６の合成を、参考文献２３６に記載されている通りガラクトサミン塩酸塩から調製した保護されたＧｌｃＮ２の位置選択的開環から開始した（９２％収率）。Ｎ−フタルイミド保護のエチレンジアミンによる除去、その後の選択的Ｎ−アセチル化により、既知の化合物４が８７％の収率でもたらされた［２３７］。４とＮ，Ｎ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，３，４−ベンゾジオキサホスフェピン−３−アミンおよび１Ｈ−テトラゾールの反応、ならびにその後のｍ−クロロ過安息香酸（ｍ−ＣＰＢＡ）を用いた酸化により、他の方法を用いて以前報告［２３８］されたものよりも有意に高い収率でリン酸基を導入することが可能になり、結晶性の常温保存可能な化合物５（ｍ．ｐ．１５９〜１６０℃）がもたらされた。４．５８ｐｐｍのＨ−４シグナルと相関する、３１Ｐ ＮＭＲスペクトルにおける０．３２ｐｐｍのホスホモノエステルピークおよび１Ｈ−３１Ｐ ＨＭＢＣ ＮＭＲスペクトルにおけるＣＨシステムの２つのカップリング（それぞれ５．１３、４．９８ｐｐｍおよび５．１４、４．９９ｐｐｍ）により、５の構造を評価することが可能になった。１０％Ｐｄ−Ｃでの最終的な水素化分解により、標的４Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ６が、非保護リン酸が存在する場合に得られた５０％の収率に対して優れた収率（９５％）でもたらされた。最終生成物のＮＭＲデータは、文献［２３９］において報告されたものとよく一致した。
スキーム１．ａ．参考文献２３６；ｂ．トリメチルアミンボラン、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ３ＣＮ、０℃、８３％；ｃ．Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、ＥｔＯＨ、還流；Ａｃ２Ｏ、ピリジン、８７％（２段階を経て）；ｄ．Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，５−ジヒドロ−３Ｈ−２，３，４−ベンゾジオキサホスフェピン−３−アミン、１Ｈ−テトラゾール、ＣＨ２Ｃｌ２；ｍ−ＣＰＢＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、Ｈ２Ｏ，９２％；ｅ．Ｈ２、１０％Ｐｄ−Ｃ、９５％。
ＭｅｎＸ多糖または４Ｐ−ＧｌｃＮＡｃの酸加水分解によって形成された生成物のＮＭＲによる特徴付け：ＭｅｎＸ多糖および合成単量体６を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析について最適化された手順に従って、より大きな規模で加水分解して、生じた種の構造をＮＭＲ分析によって確認した。どちらの場合も、４Ｐ−ＧｌｃＮＨを優勢な種として評価した。
４Ｐ−ＧｌｃＮＡｃ６の１Ｈ ＮＭＲスペクトルにより、それぞれ５．１９ｐｐｍおよび４．７２ｐｐｍにおけるα／βアノマーピーク、ならびに４．００〜３．６９ｐｐｍの範囲にプロトンシグナルが示された。等核ＣＯＳＹ ＮＭＲ相関により、Ｈ−２αおよびＨ−２βが３．９１ｐｐｍシグナルおよび３．７２ｐｐｍシグナルに割り当てられた。０．５８ｐｐｍにおけるリン酸モノエステルについての１つの単一ピークが３１Ｐ ＮＭＲで検出された。
標準物質６およびネイティブなＭｅｎＸ ＰＳの両方を加水分解した後、得られた４Ｐ−ＧｌｃＮの１Ｈ ＮＭＲ分析により、５．４０ｐｐｍおよび４．９２ｐｐｍにおいて、それぞれ比が５．５：４．５および６．７：３．３のα／β混合物に対応する２つの主要なアノマーシグナルが示された。残りの環プロトンシグナルは４．０８ｐｐｍから３．４４ｐｐｍの間に入り、一方、Ｈ−２α（３．９１ｐｐｍにおいてｄｄ、Ｊ３．７および１０．３Ｈｚ）およびＨ−２β（３．０６ｐｐｍにおいてｄｄ、Ｊ８．５および１０．５Ｈｚ）は、アセチル基がないことに起因して高磁場にシフトした。さらに、Ｎ−アセチルＣＨ３シグナルは検出されず、これは、加水分解によって完全な脱Ｎ−アセチル化がもたらされたことを示していた。
２次元の１Ｈ−３１Ｐ ＨＭＢＣ ＮＭＲにより、３１Ｐ ＮＭＲスペクトルの０．６８ｐｐｍおよび０．１４ｐｐｍにおけるリン酸モノエステルシグナルに割り当てられる２つの重複するクロスピークが１Ｈ ＮＭＲでのそれぞれ３．９４ｐｐｍおよび３．９６ｐｐｍにおけるＨ−４αおよびＨ−４βと相関することが証明された。
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによるＭｅｎＸ定量化の標準物質としての４Ｐ−ＧｌｃＮＡｃの使用：合成単量体６を、比色定量方法によって総リン含量について定量化し、次いで、ネイティブなＭｅｎＸ多糖と比較して較正曲線（０．５〜８μｇ／ｍＬの範囲）を確立するために使用した。合成単量体およびネイティブな多糖を、ＭｅｎＸ多糖試料について最適化した同じ加水分解条件に供した後、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって同じピークが検出され、得られた曲線は完全に重複した。未知の試料および多糖精製プロセスの中間体の濃度は、定量化のために使用した曲線とは独立して一致していた（糖濃度値の差異は、試験した試料全てについて＜２％であった）。また、加水分解したＭｅｎＸ多糖と合成単量体の混合物を、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムでのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって１０ｍＭの水酸化ナトリウムを用いて溶出して分析して、使用した加水分解条件におけるＧｌｃＮの最終的な形成を検証した［２６］。ＧｌｃＮの形成はネイティブなＭｅｎＸ試料および合成単量体試料のどちらについてもモルで５％未満であった。
本発明者らは、市販のグルコサミン−６−リン酸（６Ｐ−ＧｌｃＮ）を分析の標準物質として使用する可能性についても、ＭｅｎＸに対して最適化されたものと同じ加水分解条件を使用して検証した。生じた較正曲線はネイティブなＭｅｎＸを用いて得られたものおよびその合成単量体を用いて得られたものとで重複したが、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって検出された、生じたピークの溶出時間は異なり（ＭｅｎＸの９．８８分に対して８．９７分）、これは、４Ｐ−ＧｌｃＮＡｃの利用がより簡単であることを実証した。
ＭｅｎＸ多糖定量化のためのこの方法は、精製プロセス中間体および最終のコンジュゲートワクチンの糖含量をモニターするための極めて重要な分析ツールである。定量化により、プロセス収率の算出が可能になることに加えて、どちらも最終のワクチン製剤の品質および一貫性を検証するための重要なパラメータである、コンジュゲートの糖／タンパク質比および遊離糖の％の算出が可能になる。
合成単量体を使用することは、分析のために多糖のバッチを標準化する必要性がないことを意味する。全体的な方法は迅速なものであり、最低限の試料の浄化で非常に低い濃度の糖（≧０．５μｇ／ｍＬの多糖）を検出することが可能であり、発酵ブロスを含めた精製プロセス中間体の特徴付けのために良好に機能することが検証されている。当該方法は、コンジュゲーションプロセスの中間体を定量化するため、および最終のワクチン製剤を特徴付けるために適し得る。
本発明は、単に例として記載されており、本発明の範囲および主旨の範囲内で改変を行うことができることが理解されよう。
（参考文献）

Claims (25)

  1. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲート。
  2. 請求項１に記載のコンジュゲートであって、
    （ａ）前記莢膜多糖内の第一ヒドロキシル基を酸化して、アルデヒド基を有する酸化多糖をもたらすステップと、（ｂ）該酸化多糖を、該アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、該コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスによって得ることができる、コンジュゲート。
  3. 前記ステップ（ａ）における酸化が、前記莢膜多糖内の残基の１〜１０％の間にある前記第一ヒドロキシル基の酸化である、請求項２に記載のコンジュゲート。
  4. 前記ステップ（ｂ）におけるカップリングが直接的である、請求項２または請求項３に記載のコンジュゲート。
  5. 請求項１に記載のコンジュゲートであって、
    （ａ）前記莢膜多糖の還元末端の還元的アミノ化を行って、該末端サブユニットのＣ−１原子に第一アミン基が共有結合によって結合した改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）該改変多糖を、該第一アミン基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、該コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスによって得ることができる、コンジュゲート。
  6. 請求項１に記載のコンジュゲートであって、
    （ａ）前記莢膜多糖の還元末端を還元して、その末端に２つの隣接するヒドロキシル基を有する改変多糖をもたらすステップと、（ｂ）該隣接するヒドロキシル基の酸化的切断を行って、該末端にアルデヒド基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｃ）該アルデヒド基の還元的アミノ化を行って、該末端に第一アミン基を有するさらなる改変多糖をもたらすステップと、（ｄ）該さらなる改変多糖を、該第一アミン基を介してキャリア分子とカップリングさせて、それにより、該コンジュゲートをもたらすステップとを含むプロセスによって得ることができる、コンジュゲート。
  7. 前記ステップ（ｄ）におけるカップリングがリンカーを介する、請求項５または請求項６に記載のコンジュゲート。
  8. 前記莢膜多糖がオリゴ糖である、前記請求項のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  9. 前記キャリア分子がジフテリアトキソイドもしくは破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７またはタンパク質Ｄである、前記請求項のいずれかに記載のコンジュゲート。
  10. 前記キャリア分子がｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  11. 血清群Ｘ莢膜多糖を、特に、前記請求項のいずれか一項に定義されているコンジュゲートの形態で含む免疫原性組成物。
  12. １種または複数種のさらなる抗原をさらに含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
  13. 血清群Ａ莢膜多糖をさらに含む、請求項１１または請求項２２に記載の免疫原性組成物。
  14. 前記血清群Ａ莢膜多糖がキャリア分子とコンジュゲートしている、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
  15. 水性製剤の状態である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  16. 請求項１１から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
  17. 哺乳動物に請求項１１から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法。
  18. 請求項２から７のいずれか一項に定義されている通りである、血清群Ｘ莢膜多糖とキャリア分子のコンジュゲートを調製するためのプロセス。
  19. 前記コンジュゲートが請求項８から１０のいずれか一項に定義されている通りである、請求項１８に記載のプロセス。
  20. （ａ）血清群Ｘ莢膜多糖と（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含み、水性製剤の状態である医薬組成物。
  21. 前記血清群Ｘ莢膜多糖が請求項１から１０のいずれか一項に定義されているコンジュゲートの形態である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 請求項１３または請求項１４に定義されている１種または複数種のさらなる抗原をさらに含む、請求項２０または請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 血清群Ｘ莢膜多糖を含有する疑いがある試料をアッセイするための方法であって、（ｉ）該試料中の任意の血清群Ｘ莢膜多糖を加水分解して、加水分解産物をもたらすステップと、（ｉｉ）該加水分解産物を液体クロマトグラフィーに供するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において分離された任意のグルコサミン−４−リン酸を検出するステップとを含む方法。
  24. 前記試料中のコンジュゲートした血清群Ｘ莢膜多糖とコンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖を、ステップ（ｉ）の前に互いと分離させる、請求項２３に記載の方法。
  25. 血清群Ｘ莢膜多糖を含有する疑いがある検体を分析するための方法であって、総血清群Ｘ莢膜多糖含量を請求項２２または請求項２３に記載の方法によって測定し、前記コンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖含量を請求項２４に記載の通り測定し、それによって、コンジュゲートしていない血清群Ｘ莢膜多糖の総血清群Ｘ莢膜多糖に対する比を算出することができる方法。
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