ES2201551T3 - Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas. - Google Patents
Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas.Info
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Abstract
Una composición que comprende una emulsión de aceite en agua y una saponina, en la que dicho aceite es un aceite metabolizable, caracterizado porque la relación del aceite metabolizable:saponina (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y 200:1.
Description
Emulsiones de aceite en agua que contienen
saponinas.
La presente invención se refiere a una
composición de vacunas en emulsión de aceite en agua. En particular
la presente invención a una formulación de adyuvantes de vacunas a
base de una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite
metabolizable y una saponina. La invención además se refiere a
procedimientos para preparar la emulsión y su uso en medicina.
Inducción de respuestas de células T citotóxicas
(abreviadamente CTL) se produce naturalmente durante la infección
de una célula diana, o síntesis no controlada de un antígeno
tumoral, en el que la degradación enzimática de un antígeno diana
tiene lugar en el citoplasma de la célula. Este fenómeno permite que
los péptidos citoplásmicos derivados del patógeno, o antígeno
específico del tumor entren en la ruta de Th1 (procesamiento del
antígeno endógeno) y se presenten en la superficie de la célula
asociada con una molécula MHC de clase 1. Si un antígeno de vacuna
no entra en el citoplasma de la célula hospedadora, entonces pudiera
que los tomase la célula y se introdujera en la ruta de
procesamiento del antígeno exógeno y por último presentarse en la
superficie de la célula asociada a una molécula MHC de clase II.
Esta vía alternativa generalmente da como resultado respuestas de
auxiliares T y respuestas de anticuerpo específico de antígeno.
Después de la vacunación convencional con
subunidades o vacunas no vivas, el antígeno en general no entra en
el citoplasma de una célula hospedadora y, por lo tanto, no entrará
en la ruta del procesamiento del antígeno endógeno y por ultimo no
inducirá a una respuesta de CTL. La inducción de CTL se cree que se
correlaciona con las respuestas del perfil de citoquina
Th-1, específicamente con secreción de
IFN-\gamma y IL-2. La secreción
de IFN-\gamma se asocia con respuestas protectoras
contra patógenos intracelulares, que incluyen parásitos, bacterias
y virus. La activación de leucocitos mediante
IFN-\gamma potencia la muerte de patógenos
intracelulares e incrementa la expresión de receptores de Fc.
También se puede producir la citotoxicidad directa, especialmente en
sinergia con linfotoxina (otro producto de células TH1).
IFN-\gamma es también tanto un inductor como un
producto de células NK, que son los efectores innatos principales de
protección. Las respuestas de tipo TH1, bien mediante
IFN-\gamma u otros mecanismos, proporcionan ayuda
preferencial para IgG2a de tipo murino e isotipos de
inmunoglobulina IgG1 humana.
La solicitud de patente internacional Nº WO
95/17210 describe un sistema de emulsión de adyuvantes a base de
escualeno, \alpha-tocoferol y monooleato de
sorbitán polioxietilenado (TWEEN80), formulado con la QS21
inmunoestimulante, opcionalmente con 3D-MPL. Esta
formulación de adyuvantes es un inductor muy potente de un amplio
intervalo de respuestas inmunes.
Las fracciones de saponina inmunológicamente
activas (por ejemplo, Quil A) que tienen actividad adyuvante
derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria
Molina se conocen en la técnica. Los derivados de Quil A, por
ejemplo QS21 (una fracción purificada por HPLC derivada de Quil A)
y el procedimiento de su producción se describe en la patente de
Estados Unidos Nº 5.057.540. Entre QS21 (conocida como QA21) se
describen también otras fracciones tales como QA17. El uso de
dichas saponinas en aislamiento se acompaña con desventaja a causa
de necrosis total, es decir, muerte de tejido localizado, se
produce en el sitio de inyección, por lo tanto conduciendo al
dolor.
Las fracciones de saponina inmunológicamente
activas que tienen actividad adyuvante derivada de la corteza del
árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina se conocen en la
técnica. Por ejemplo QS21, una fracción purificada por HPLC del
árbol Quillaja Saponaria Molina y el procedimiento de su producción
(conocido como QA21) se describe en la patente de Estados Unidos Nº
5.057.540. El uso de dichas saponinas en acompaña con una
desventaja debido a necrosis total, es decir, muerte de tejido
localizado, se produce en el sitio de inyección, que conduce al
dolor.
Lípido A monofosforilo 3
De-O-acilado es un adyuvante bien
conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Químicamente a
menudo se suministra en forma de una mezcla de lípido A
monofosforilo 3 De-O-acilado bien
con 4, 5, ó 6 cadenas aciladas. Se puede preparar mediante
procedimientos enseñados en el documento GB 2122204B. Una forma
preferida de lípido A monofosforilo 3
De-O-acilado está en forma de una
emulsión que tiene un tamaño de partícula menor que 0,2 \mum en
diámetro y su procedimiento de fabricación se describe en la
patente europea
Nº EP 0 671 948 B1.
Nº EP 0 671 948 B1.
Con el fin de que cualquier composición de aceite
en agua sea adecuada para administración humana, la fase oleosa del
sistema de emulsión tiene que comprender un aceite metabolizable.
El significado de la expresión aceite metabolizable se conoce bien
en la técnica. Metabolizable se puede definir como "que es capaz
de transformarse mediante metabolismo" (Dorland's Illustrated
Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, edición 25 (1974)). El
aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado,
animal o sintético, que no sea tóxico para el receptor y sea capaz
de transformarse mediante metabolismo. Las nueces, semillas y
granos son comúnmente fuentes de aceites vegetales. Los aceites
sintéticos son también parte de esta invención y pueden incluir
aceites comercialmente disponibles tales como NEOBEE® y otros. El
escualeno
(2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno)
es un aceite insaturado que se encuentra e grandes cantidades en el
aceite de hígado de tiburón y en cantidades menores en aceite de
oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz y
levadura, y es un aceite particularmente preferido para uso en esta
invención. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del
hecho que es un intermedio en la biosíntesis de colesterol (Merck
index, edición 10, entrada Nº 8619).
Las emulsiones de aceite en agua se conocen
per se en la técnica, y se ha sugerido que son útiles como
composiciones de adyuvantes (documento EPO 399843).
Las respuestas inmunológicas a la administración
de antígeno formulado en las emulsiones de aceite en agua descritas
en la solicitud de patente internacional Nº WO 95/17210, se pueden
caracterizar porque se observan tanto la respuesta de Th2 como la
de Th1. Dado que en muchos casos las respuestas de tipo Th1 se han
identificado como críticas para la profilaxis y tratamiento de
enfermedad, es, por lo tanto, deseable que se desarrolle un
adyuvante desviado de Th1. Más sorprendentemente esto se ha llevado
a cabo por los presentes inventores, no mediante adición de
inmunoestimuladores extra, sino mediante una reducción de uno de
los componentes originales.
Las emulsiones de adyuvante de aceite en agua
descritas en la solicitud de patente internacional Nº WO 95/17210
tienen una relación alta de escualeno:saponina (p/p). Las
realizaciones de la presente invención tienen la relación de
escualeno:QS21 en el intervalo de 1:1 a 200:1, se prefiere también
el intervalo 20:1 a 200:1, preferiblemente 20:1 a 100:1 y más
preferible sustancialmente 48:1. Esta reducción de uno de los
componentes tiene el efecto sorprendente de mejorar
cualitativamente la respuesta inmune resultante. Usando esta nueva
formulación de adyuvantes se mantienen las respuestas fuertes de
tipo Th2, pero además dichas formulaciones provocan una respuesta
inmune potenciada asociada específicamente con respuestas de tipo
Th1, caracterizadas por respuestas altas de
IFN-\gamma, proliferativas de células T y CTL.
Una realización preferida de la presente
invención es un adyuvante o una formulación farmacéutica que
comprende Quil A o derivado de la misma, tal como QS21 y una
emulsión de aceite en agua, en la que la emulsión de aceite en agua
comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno y un
polisorbato (que incluye monooleato de sorbitán polioxietilenado,
TWEEN 80™), dichas emulsiones se caracterizan porque la reacción
del aceite:QS21 está en el intervalo de 20:1 a 200:1 (p/p). En otra
realización preferente, la formulación de adyuvantes comprende
además otros inmunomoduladores, que incluyen
\alpha-tocoferol y 3D-MPL.
Dichas formulaciones una vez combinadas con un
antígeno o preparación antigénica son adecuadas para un amplio
intervalo de vacunas monovalentes o polivalentes. Adicionalmente la
emulsión de aceite en agua puede contener trioleato de sorbitán
polioxietilenado (SPAN 85). Una forma preferida de lípido A
monofosforilo 3 De-O-acilado se
describe en la solicitud de patente internacional publicada en el
Nº 92116556-SmithKline Beecham Biologicals s.a.
Preferiblemente las formulaciones de vacunas de
la presente invención contienen un antígeno o composición
antigénica capaz de provocar una respuesta inmune contra un
patógeno humano, dicho antígeno o composición antigénica se deriva
de VIH-1, (tal como tal, nef, gp120 o gp160), los
virus herpes humanos, tales como gD o derivados de los mismos o
proteína temprana inmediata tal como ICP27 de VSH1 o VSH2,
citomegalovirus ((esp de tipo humano) (tal como gB o derivados del
mismo), rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), virus Epstein
Barr (tal como gp350 o derivados del mismo), virus varicela Zóster
(tal como gpI, II e IE63), o de un virus de hepatitis tal como
virus de hepatitis B (por ejemplo antígeno de superficie de
hepatitis B o un derivado del mismo), virus de hepatitis A, virus
de hepatitis C y virus de hepatitis E, o de otros patógenos virales
tales como paramixovirus: virus sincitial respiratorio (tales como
proteínas F y G o derivadas de las mismas), virus de parainfluenza,
virus del sarampión, virus de las paperas, virus de papiloma
humano, (por ejemplo VPH6, 11, 16, 18,...), flavivirus (por
ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus dengue, virus de la
encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la encefalitis
japonesa) o virus de influenza, o derivadas de bacterias patógenas
tales como Neisseria spp, incluyendo N. gonorrhea y
N. meningitidis (por ejemplo polisacáridos capsulares y
conjugados de los mismos, proteínas de unión a transferrina,
proteínas de unión a lactoferrina, PilC, adhesinas); Steptococcus
spp, incluyendo S. pneumoniae (por ejemplo polisacáridos
capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina,
proteínas de unión a colina), S. pyogenes (por ejemplo
proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos
lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans;
Haemophilus spp, incluyendo H. influenzae tipo B (por
ejemplo, PRP y conjugados de la misma), H. influenzae no
caracterizable (por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso
molecular, P5, P6, lipoproteína D), H. ducreyi; Moraxella
spp incluyendo M. catarrhalis, también conocida como
Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasinas
de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, incluyendo
B. pertussis (por ejemplo, pertactina , toxina de pertussis
o derivados de las mismas, hemaglutinina filamentosa, ciclasa de
adenilato, fimbrias), B. parapertussis y B.
bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M.
tuberculosis (por ejemplo ESAT6, antígeno 85a, -B o -C), M.
Bovis, M. leprae, M. avium, M.
paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp,
incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo
E. coli enterotóxica (por ejemplo, factores de colonización,
toxina termolábil o derivadas de la misma, toxina termoestable o
derivadas de la misma), E. coli enterohemorrágica, E.
coli enteropatogénica (por ejemplo toxina de tipo toxina shiga
o derivados de la misma); Vibrio spp, incluyendo V.
cholera (por ejemplo toxina de cólera o derivados de la misma);
Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S.
dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp,
incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo proteína Yop),
Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter
spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas,
adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp,
incluyendo S. Typhi, S. paratyphi, S.
choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp,
incluyendo L. monpcytogenes; Helicobacter spp,
incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina
de vacuolación); Pseudomonas spp, incluyendo P.
aeruginosa; Staphylococcus spp. incluyendo S.
aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp.,
incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium
spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina de
tétanos y derivadas de la misma), C. botulinum (por ejemplo
toxina botulínica y derivadas de la misma), C. difficile
(por ejemplo toxinas A y B de clostridium y derivadas de las
mismas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por
ejemplo toxina botulínica y derivadas de la misma);
Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por
ejemplo toxina diftérica y derivadas de la misma); Borrelia
spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo (OspA,
OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por jemplo (OspA, OspC, DbpA,
DbpB); B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB),
B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.
hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el
agente de ehrlichiosis granulocítica humana; Rickettsia spp.
incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo
C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a
heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP proteínas de
unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp.,
incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo
T. pallidum (por ejemplo las proteínas de membrana exterior
raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivadas
de parásitos tales como Plasmodium spp., incluyendo P.
falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii
(por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo
E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B.
microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi;
Giarda spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania
spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp.,
incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo
T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S.
mansoni, o derivadas de levaduras tales como Candida
spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp.,
incluyendo C. neoformans.
Los derivados del antígeno de superficie de la
hepatitis B se conocen bien en la técnica e incluyen, entre otros,
los antígenos PreS1, PreS2 expuestos y descritos en las solicitudes
de patentes europeas EP-A-414 374;
EP-A-0304 578 y EP
198-474. En un aspecto preferido la formulación de
vacunas de la invención comprende el antígeno de
VIH-1, gp 120, especialmente cuando se expresan en
células CHO. En una realización adicional, la formulación de vacunas
de la invención comprende gD2t como se ha definido anteriormente en
esta memoria descriptiva.
En una realización preferida de la presente
invención las vacunas que contienen el adyuvante reivindicado
comprenden los virus VPH considerados responsables de verrugas
genitales, (VPH 6 o VPH 11 y otros) y los virus VPH responsables del
cáncer cervical (VPH 16, VPH 18 y otros). Formas particularmente
preferidas de vacuna comprenden partículas L1 o capsómeros, y
proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos
seleccionados de las proteínas E6, E7, L1 y L2 del VPH 6 y del VPH
11. Las formas más preferidas de proteínas de fusión son: L2E7 como
se describe en el documento GB 95 15478.7, y la proteína D
(1/3)-E7 descrita en el documento GB 9717953.5.
Las vacunas de la presente invención comprenden
además antígenos derivados de parásitos que ocasionan la malaria.
Por ejemplo, los antígenos preferidos de Plasmodium
falciparum incluyen RTS,S y TRAP. RTS es una proteína híbrida
que comprende sustancialmente toda la porción terminal C de la
proteína del circumsporocito (abreviadamente CS) de P.
falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la porción
preS2 del antígeno de superficie de hepatitis B al antígeno de
superficie (S) del virus de hepatitis B. Su estructura completa se
describe en la solicitud de patente internacional Nº
PCT/EP92/02591, publicada en el documento Nº WO 93/10152 que
reivindica prioridad de la solicitud de patente de Reino Unido Nº
9124390.7. Cuando se expresa en RTS de levadura se produce en forma
de una partícula de lipoproteína y cuando se coexpresa con el
antígeno S de VBH produce una partícula mezclada conocida como
RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente
internacional Nº PCT/GB89/00895, publicada en el documento WO
90/01496. Una realización preferida de la presente invención es una
vacuna de malaria en la que la preparación antigénica comprende una
combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de
plasmodios que son probables candidatos a ser componentes de una
vacuna de fase múltiple de malaria son P. falciparum MSP1,
AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332,
LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16,
Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp.
Las formulaciones también pueden contener un
antígeno antitumoral y son útiles para los cánceres de tratamiento
inmunoterapéutico. Por ejemplo, la formulación de adyuvantes
encuentra utilidad con antígenos de rechazo tumoral tal como los
cánceres de próstata, mama, colorrectal, pulmón, pancreático, renal
o melanoma. Los antígenos ejemplares incluyen antígenos MAGE 1 y
MAGE 3 u otro MAGE para el tratamiento de melanoma, PRAME, BAGE o
GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8,
pp. 628-636; Van der Eynde y col., International
Journal of Clinical & Laboratory Research (presentado 1997);
Correale y col., (1997), Journal of the National Cancer Institute
89, p 293. Sin duda estos antígenos se expresan en un amplio
intervalo de tipos de tumores tales como melanoma, carcinoma de
pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga. Otros antígenos específicos
de tumores son adecuados para uso con adyuvante de la presente
invención e incluyen, pero no se restringen a antígeno prostático
específico (abreviadamente PSA) o Her-2/neu, KSG
(GA733), MUC-1 y antígeno carcinoembriónico
(abreviadamente CEA). Por consiguiente en un aspecto de la presente
invención se proporciona una vacuna que comprende una composición de
adyuvantes según la presente invención y un antígeno de rechazo
tumoral.
Se prevé que las composiciones de la presente
invención se utilizarán para formular vacunas que contienen
antígenos derivados Borrelia sp., Por ejemplo, los antígenos
pueden incluir ácido nucleico, antígeno o preparaciones antigénicas
derivadas de patógenos, proteínas o péptidos producidas
recombinantemente y proteínas de fusión quiméricas. En particular
el antígeno es OspA. El OspA puede ser una proteína madura completa
y una forma lípida en virtud de la célula hospedadora (E.
coli) llamada (Lipo-OspA) o un derivado no
lípido. Tales derivados no lípidos incluyen la proteína de fusión no
lípida NS1-OspA que tiene los primeros 81
aminoácidos N terminal de la proteína no estructural
(abreviadamente NS1) del virus de influenza, y la proteína completa
OspA, y otras, MDP-OspA es un a forma no lípida de
OspA que lleva 3 aminoácidos N-terminal
adicionales.
Las vacunas de la presente invención se pueden
utilizar para la profilaxis o terapia de alergia. Dichas vacunas
comprenderían antígenos específicos de alérgenos (por ejemplo Der
p1) y no específicos de alérgenos (por ejemplo el decapéptido de
Stanworth).
La relación QS21: 3D-MPL (p/p) en
una realización preferida de la presente invención estará
típicamente en el, orden de 1 : 10 a 10 : 1, preferiblemente 1 : 5
a 5 : 1 y a menudo sustancialmente 1 : 1. El intervalo preferido
para sinergia óptima está entre 2,5: 1y 1:1 de
3D-MPL:QS21. Típicamente las dosificaciones de QS21
y 3D-MPL en una vacuna para administración humana
estará en el intervalo entre 1 \mug y 1000 \mug,
preferiblemente 10 \mug-500 \mug, y más
preferiblemente 10-100 \mug por dosis.
Típicamente el aceite comprenderá entre 2 y 10% de escualeno, entre
2 y 10% de \alpha-tocoferol y entre 0,4 y 2% de
monooleato de sorbitán polioxietilenado (TWEEN 80).
Preferiblemente la relación de escualeno:
\alpha-tocoferol es igual o menor que 1 ya que
esto proporciona una emulsión más estable. El trioleato de sorbitán
polioxietilenado (SPAN 85) puede también estar presente a un nivel
de 0,5-1%. En algunos casos puede ser ventajoso que
las vacunas de la presente invención contengan adicionalmente un
estabilizador, por ejemplo otros emulsionantes/tensioactivos que
incluyen ácido caprílico (merck index edición 10, entrada nº 1739),
del que tricaprilina es una realización particularmente
preferida.
Por lo tanto, otra realización de esta invención
es una vacuna que contiene QS21 y una emulsión aceite en agua que
cae dentro de la relación deseada, que se formula en presencia de
un esterol, preferiblemente colesterol, con el fin de reducir la
reactogenicidad local conferida mediante la QS21. La relación de la
QS21 a colesterol (p/p), presente en una realización específica de
la presente invención se prevé que esté en el intervalo de 1:1 a
1:20, sustancialmente 1:10.
Las emulsiones previas utilizadas en la solicitud
de patente internacional Nº WO 95/17210 mantienen obviamente
algunas ventajas sobre los adyuvantes convencionales que inducen no
Th-1.
Sin embargo, la inclusión de QS21 ha hecho hasta
ahora este potente adyuvante reactogénico, por lo tanto,
conduciendo al dolor. Se ha observado que la formulación del QS21
en liposomas que contienen colesterol puede ayudar a prevenir la
necrosis que se produce en el lugar de la inyección. Esta
observación está sujeta a la solicitud de patente internacional Nº
PCT/EP96/01464.
En las realizaciones de la presente invención el
esterol preferido es colesterol. Otros esteroles que se podrían
utilizar en realizaciones de la presente invención incluyen
\beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol,
ergocalciferol y colesterol. Los esteroles se conocen bien en la
técnica. El colesterol se conoce bien y se describe, por ejemplo, en
Merck Index, edición 11, página 341, como un esterol que se procuce
naturalmente encontrado en la grasa animal.
Se sabe que la QS21 en solución acuosa degenera
con el tiempo en una forma inactiva de adyuvante,
QS21-H, cuya degeneración está mediada por
hidrólisis ^{-}OH en el medio acuoso. Dicha degeneración se puede
producir cuando la QS21 está presente en la fase acuosa de un
adyuvante de aceite en agua. Sorprendentemente se ha encontrado que
la adición de colesterol a la fase oleosa de la emulsión de aceite
en agua tiene el efecto de mantener la QS21 en su forma activa, con
beneficios obvios para la estabilidad en almacenamiento de la
formulación adyuvante/vacuna. La presente invención proporciona un
procedimiento de estabilización de una preparación de saponina,
preferiblemente, QS21, en su forma activa de adyuvante no
hidrolizada, cuando la QS21 está presente en una emulsión de aceite
en agua a base de adyuvante. Este procedimiento comprende la
adición de un esterol, preferiblemente colesterol, en la fase oleosa
de una emulsión de aceite en agua.
Dichas preparaciones se utilizan como sistemas de
adyuvantes de vacunas y una vez formulada junto con antígeno o
preparaciones antigénicas para vacunas potentes. Ventajosamente,
preferentemente inducen una respuesta Th1.
Los sistemas de emulsión de la presente invención
tienen un tamaño de gota de aceite pequeño en el intervalo
submicrónico. Preferiblemente los tamaños de la gota de aceite
estarán en el intervalo entre 120 y 750 nm, y más preferiblemente
entre 120 y 600 nm de diámetro.
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin efectos secundarios significativos adversos en
las vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de qué
inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta. En general, se
espera que cada dosis comprenderá 1-1000 \mug de
proteína, preferiblemente 1-500 \mug,
preferiblemente 1-100 \mug, más preferiblemente 1
a 50 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna particular se
puede determinar mediante estudios estándar que implican la
observación de respuestas inmunes adecuadas en sujetos. Después de
una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir uno o varias
inmunizaciones reforzadoras espaciadas adecuadamente.
Las formulaciones de la presente invención se
pueden utilizar tanto para propósitos profilácticos como
terapéuticos. En un aspecto adicional de la presente invención se
proporciona una vacuna para uso en medicina como se ha descrito en
esta memoria descriptiva. La preparación de vacunas se describe en
general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por
Voller y col., University Park Press, Baltimore, Maryland, Estados
Unidos 1978.
Se prevé que las composiciones de la presente
invención se usarán para formular vacunas que contienen antígenos
derivados de una amplia diversidad de fuentes. Por ejemplo, los
antígenos pueden incluir un antígeno o preparaciones antigénicas
humanas, bacterianas, o de ácido nucleico viral, derivadas de
patógenos, antígeno o preparaciones antigénicas derivadas de
tumores, antígenos derivados de hospedadores, incluyendo el
decapéptido liberador de histamina de IgE (conocido como decapéptido
de Stanworth), proteína o péptidos producidos recombinantemente y
proteínas de fusión quiméricas.
\newpage
Las preparaciones de vacunas de la presente
invención se pueden utilizar para proteger o tratar un mamífero
susceptible a, o que padece una enfermedad, mediante la
administración de dicha vacuna mediante vía sistémica o a la mucosa.
Estas administraciones pueden incluir inyección mediante las vías
intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o
mediante la administración a la mucosa de los tractos
oral/alimentario o respiratorio.
Las formulaciones de adyuvantes de emulsión de
aceite en agua usadas en los ejemplos siguientes se preparan
comprendiendo cada una el siguiente componente de emulsión de
aceite en agua: 5% de escualeno, 5% de
\alpha-tocoferol, 2,0% de monooleato de sorbitán
polioxietilenado (TWEEN 80).
Se preparó la emulsión como sigue en una forma
dos veces concentrada. Todos los ejemplos utilizados en los
experimentos inmunológicos se diluyen con la adición de componentes
y diluyentes extra para proporcionar bien una concentración 1 x
(equivalente a una relación de escualeno:QS21 (p/p) de 240:1) o
diluciones adicionales de los mismos.
Brevemente, se disuelve el TWEEN 80 en solución
salina tamponada con fosfato (abreviadamente PBS) para proporcionar
una solución de 2% en el PBS. Para proporcionar 100 ml de una
emulsión concentrada dos veces, se agitan con vórtice 5 ml de
alfatocoferol DL y 5 ml de escualeno hasta mezclar completamente. Se
añaden 95 ml de solución PBS/TWEEN al aceite y se mezclan
completamente. Después la emulsión resultante se pasa a través de
una aguja de jeringa y finalmente se microfluidifica utilizando una
máquina Microfluidics M110S. Las gotas de aceite resultantes tienen
un tamaño de aproximadamente 145-180 nm (expresado
como media de z medido por PCS) y se denomina "dosis completa"
de SB62.
Se añaden los otros componentes de
adyuvantes/vacunas (QS21, 3D-MPL o antígeno) a la
emulsión en una mezcla única.
Las vacunas que contienen antígenos usadas en
esta memoria descriptiva se formulan bien con dosis completa de
adyuvante SB62 para proporcionar una relación alta (240:1) de
escualeno:QS21 o con una cantidad inferior de SB62 para proporcionar
una formulación de relación inferior (48:1), estas formulaciones de
adyuvantes se llaman SB62 y SB62' respectivamente. Opcionalmente se
pueden formular otras vacunas con la adición de colesterol a la
fase oleosa de la emulsión (designadas mediante la adición de la
letra "c").
Se llevó a cabo un estudio en ratones Balb/C con
el fin de comparar la inmunogenicidad de diversas formulaciones que
contienen S,L*. S,L* es un antígeno compuesto que comprende una
proteína (L*) de antígeno L de superficie modificado y una proteína
S ambas derivadas del virus de la hepatitis B (abreviadamente HB).
Este antígeno compuesto es el sujeto de la solicitud de patente
europea Nº EP 0 414 374. Este esquema de inmunización usado en el
modelo de ratones transgénicos HB que se ha mostrado previamente que
soporta la inducción de CTL en ratones Balb/c.
Las diferentes formulaciones de adyuvantes, que
utilizan los sistemas de emulsiones descritos en el ejemplo 1, con
diferentes relaciones de escualeno:QS21, y que comprenden
opcionalmente colesterol (relación de QS21:colesterol p/p de 1:10),
se combinaron con S,L* y se compararon en su capacidad para inducir
respuestas inmunes humorales y mediadas por células (producción de
citoquina y CTL). S,L* adsorbido en hidróxido de aluminio
(AlOH_{3}) se utilizó como un control inductor de Th1.
Brevemente, se inmunizaron intramuscularmente
grupos de 10 ratones 4 veces a intervalos de 3 semanas con 2 \mug
de S,L* liofilizado combinado con diversos sistemas de emulsiones
de aceite en agua (SB62). 14 días después de la cuarta inmunización
se analizó la producción de citoquinas (IL5 e
IFN-\gamma) y la actividad de CTL después de
reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios
linfáticos con antígeno S,L*. La respuesta de anticuerpo a S,L* y
el perfil isotópico inducido se controlaron mediante ELISA a los 21
días después de II y 14 días después de IV.
Se inmunizaron intramuscularmente grupos de 10
ratones Balb/C con formulaciones descritas más adelante. SB62 se
formuló junto con el antígeno a una relación alta (240:1, SB62) o
baja (48:1, SB62') de escualeno:QS21, opcionalmente con la adición
de colesterol (c).
| Grupo | Antígeno S,L* | Nombre de adyuvante | Composición de formulación |
| de adyuvantes | |||
| GR 1 | 2 \mu | SB62 | 25 \mul de SB62/ 5 \mug de QS21/ |
| 5 \mug de 3D-MPL | |||
| GR 2 | 2 \mu | SB62c | 25 \mul de SB62c/ 5 \mug de QS21/ |
| 5 \mug de 3D-MPL | |||
| GR 3 | 2 \mu | SB62' | 5 \mul de SB62/ 5 \mug de QS21/ |
| 5 \mug de 3D–MPL | |||
| GR 4 | 2 \mu | SB62'c | 5 \mul de SB62c/ 5 \mug de QS21/ |
| 5 \mug de 3D-MPL | |||
| GR 5 | 2 \mu | Alum | 50 \mug de AlOH_{3} |
Se inmunizaron los animales intramuscularmente en
la pata (50 \mul para todos los grupos excepto para el grupo 5
donde se inyectó 100 \mul) en los días 0, 21, 42 y 63. Se tomó
sangre del seno retroorbital en varios instantes después de las
inmunizaciones. El día 77, se sacrificaron los animales de cada
grupo, se retiraron los bazos y ganglios linfáticos que drenan el
lugar de la inyección (ganglios linfáticos ilíacos) para
reestimulación in vitro. Se obtuvieron conjuntos de 3 ó 4
bazos y 1 conlunto de 10 LN para cada grupo y se trataron
separadamente en los ensayos in vitro.
La cuantificación de los anticuerpos
anti-HBs se realizó mediante ELISA utilizando
antígeno de superficie de HB como antígeno de recubrimiento. Las
soluciones de antígeno y anticuerpo se utilizaron a 50 \mul por
pocillo. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 1
\mug/ml en PBS y se adsorbió durante una noche a 4ºC a los
pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después las placas
se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina
sérica bobina al 1% y TWEEN 20 (tampón de saturación) al 0,1%. Las
diluciones dos veces de sueros (comenzando en dilución 1/100) en el
tampón de saturación se añadieron a las placas recubiertas con los
HBs y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las
placas cuatro veces con PBS 0,1% de TWEEN 20 y se añadió a cada
pocillo IgG1, IgG2a, IgG2b o Ig anti-ratón conjugado
con biotina (Amersham, Reino Unido) diluido 1/1000 en tampón de
saturación y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Después de
una etapa de lavado, se añadió complejo
estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham,
Reino Unido) diluida 1/5000 en tampón de saturación durante 30
minutos adicionales a 37ºC. Se lavaron las placas como se ha
indicado anteriormente y se incubaron durante 20 minutos con una
solución de o-fenilendiamina (Sigma) al 0,04% H_{2}O_{2}
al 0,03% en 0,1% de TWEEN 20 tampón citrato 0,05 M pH 4,5. Se
detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 492/620 nm.
Se calcularon los títulos ELISA a partir de una referencia de
SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresó
en UE/ml.
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificaron los ratones, se retiraron asépticamente el bazo y
los ganglios linfáticos en conjuntos (3 ó 4 órganos por conjunto de
células esplénicas, 1 conjunto de 10 órganos por células de ganglios
linfáticos (abreviadamente LNC)). Las suspensiones celulares se
prepararon en medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía
L-glutamina 2 mM, antibióticos,
2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y 1% de suero de
ratón normal singénico. Se cultivaron las células a una
concentración final de 2 x 10^{6} células/ml (para LNC o células
de bazo (abreviadamente SPC)) en 200 \mul en placas de 96
pocillos de fondo redondo con diferentes concentraciones
(10-0,03 \mug/ml) de antígeno S,L* (25D84). Cada
ensayo se llevó a cabo por cuadruplicado. Después de 96 horas de
cultivo a 37ºC en CO_{2} al 5%, se pulsaron las células durante
18 h con ^{3}H-timidina (Amersham, Reino Unido,
5Ci/mmol) a 0,5 \muCi/pocillo y después se recogieron en filtros
de fibra de vidrio con un recolector de células. Se midió la
radiactividad incorporada en un contador de centelleo líquido. Los
resultados se expresan en cpm (media de cpm en pocillos
cuadriplicados) o como índices de estimulación (media de cpm en
cultivos de células con antígeno / media de cpm en cultivo de
células sin antígeno).
\newpage
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificaron los ratones, se retiraron asépticamente el bazo y
los ganglios linfáticos en conjuntos (3 ó 4 órganos por conjunto
para células esplénicas, 1 conjunto de 10 órganos para LNC). Se
prepararon las suspensiones de células en medio RPMI 1640 (GIBCO)
que contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos,
2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y 5% de suero de
ternera fetal. Se cultivaron las células a una concentración final
de 2,5 a 5 x 10^{6} células/ml (respectivamente para LNS o SPC)
en 1 ml, en 24 pocillos de fondo plano con diferentes
concentraciones (1-0,01 \mug/ml) de S,L*
(25D84). Se recogieron los sobrenadantes 96 horas más tarde y se
congelaron hasta ensayo para la presencia de IFNg e
IL-5 mediante ELISA.
La cuantificación de IFN-\gamma
se realizó mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Las
soluciones de muestras y anticuerpos se utilizaron a 50 \mul por
pocillo. Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos
(Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) durante
una noche a 4ºC con 50 \mul de IFNg de hámstaer
anti-ratón diluido en 1,5 \mug/ml en tampón
carbonato pH 9,5. Después las placas se incubaron durante 1 hora a
37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina sérica
bovina y 0,1% de TWEEN 20 (tampón de saturación). Las diluciones dos
veces de los sobrenadantes de estimulación in vitro
(comenzando a ½) en tampón de saturación se añadieron a las placas
recubiertas con anti-IFNg y se incubaron durante 1
hora 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas 4 veces con PBS TWEEN
al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió a cada pocillo IFNg de cabra
anti-ratón conjugado con biotina diluido en tampón
de saturación a una concentración final de 0,5 \mug/ml y se incubó
durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió
conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación
durante 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas como se ha indicado
anteriormente y se incubaron con 50\mul de TMB (Biorad) durante
10 minutos. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se
leyó a 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una
curva estándar (estándar de IFN\gamma de ratón) de SoftmaxPro
(ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml.
Se realizó la cuantificación de IL5 mediante
ELISA uilizando reactivos de Pharmingen. Se utilizaron soluciones de
muestras y anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Las placas de
microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) se recubrieron
durante una noche a 4ºC con 50 \mul de IL5 de rata
anti-ratón diluida a 1 \mug/ml en tampón
carbonato pH 9,5. Después las placas se incubaron durante 1 hora a
37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina
y 0,1% de TWEEN 20 (tampón de saturación). Se añadieron las
diluciones dos veces de sobrenadantes de estimulación in
vitro (comenzando a ½) en tampón de saturación a las placas
recubiertas con anti-IL5 y se incubaron durante 1
hora 30 minutos a 37ºC, Se lavaron las placas 4 veces con PBS TWEEN
al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió a cada pocillo IL5 de rata
anti-ratón conjugado a biotina diluida en tampón de
saturación a una concentración final de 1 \mug/ml y se incubó
durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió
conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación
durante 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cono se ha
indicado anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad)
durante 15 minutos. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N
y se leyó a 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando
una curva estándar (IL5 de ratón recombinante) de SoftmaxPro
(ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml.
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificaron los ratones, se retiraron asépticamente los bazos
en conjuntos de 3 ó 4 ratones (2 conjuntos de 3 y un conjunto de
cuatro ratones por grupo). Se prepararon las suspensiones de células
en medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía L-glutamina
2 mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol
5 x 10^{-5} M y 5% de suero de ternera fetal. Se cultivaron las células a una concentración final de 2 x 10^{6} células/ml en 10 ml de medio que contenía 2 \mug/ml de SL* y 1,25% de ConA sup (matraces Falcon de 25 cm^{2}) y se incubaron durante 8 días a 37ºC en 5% de CO_{2}.
5 x 10^{-5} M y 5% de suero de ternera fetal. Se cultivaron las células a una concentración final de 2 x 10^{6} células/ml en 10 ml de medio que contenía 2 \mug/ml de SL* y 1,25% de ConA sup (matraces Falcon de 25 cm^{2}) y se incubaron durante 8 días a 37ºC en 5% de CO_{2}.
El día antes del ensayo de CTL (d 7), se
prepararon las células diana mediante incubación de células P815
(10^{6} células/ml) con S,L* (lote 25D84) o péptido
S_{28-39} a 10 \mug/ml. Después de 1 hora de
incubación en tubos Falcon de15 ml en un pequeño volumen, se
transfirieron las células a placas de 24 pocillos y se incubaron
durante una noche a 37ºC.
El día del ensayo, 2 x 10^{6} células P815 se
pulsaron con S,L* y S_{28-39} y las
P815-S se centrifugaron, se resuspendieron en 50
\mul de FCS y se incubaron con 75 \mul de ^{51}Cr (375
\muCi) durante 1 hora a 37ºC (agitando cada 15'). Después las
células se lavaron cuatro veces con 10 ml de medio completo y se
incubaron durante 30' a 4ºC después del cuarto lavado. Después las
células se centrifugaron y se volvieron a suspender a una
concentración de 2 x 10^{4} células/ml.
Después las células efectoras se centrifugaron,
se contaron y se volvieron a suspender a 2 x 10^{6} células/ml.
Se realizaron diluciones en serie tres veces de las células
efectoras en placas de 96 pocillos con fondo en V, comenzando a una
concentración de 2 x 10^{5} células/pocillo/100 \mul.
\newpage
Se añadieron 2 x 10^{3} células diana en 100
\mul a las células efectoras por triplicado. Se valoró la
liberación espontánea y máxima mediante la incubación de células
diana con medio o Tritón X100 al 3% respectivamente.
Se centrifugaron las placas 3' a 700 rpm y se
incubaron durante 4 horas a 37ºC. Después del tiempo de incubación,
se transfirieron 50 \mul de sobrenadante desde cada pocillo a
placas Luma y se secaron durante una noche antes de contar en un
contador de centelleo Top-count.
Los resultados se expresan como lisis específica
y se calcularon como sigue:
% de SR = (media de cpm de la
muestra-media de cpm del medio / media de
cpm
máxima-media de cpm del medio) x
100
Las respuestas humorales (isotipos Ig e IgG) se
midieron mediante ELISA utilizando antígeno de superficie de HB como
antígeno de recubrimiento. Solamente se muestran los datos de los
21 días del instante después de II.
Los resultados se muestran en las figuras 1 y
2.
Figura 1, muestra las respuestas de anticuerpo de
Ig específica de Hbs medidas en ambos sueros de ratones
individuales y media del grupo, 14 días después de II.
Figura 2, muestra la distribución de subtipos de
Ig específica de Hbs en el suero de los ratones vacunados.
- \bullet
- Como se puede ver en la figura 1, las formulaciones relativas a SB62 inducen títulos de anticuerpos mucho más altos que la formulación de S,L* Alum.
- \bullet
- El análisis estadístico en sueros individuales (Anova 1 test de Newman Keuls) no muestran diferencia significativa en títulos de anticuerpos inducidos por SB62 y SB62'c o igualmente entre los títulos de anticuerpos inducidos por SB62 y SB62'c. Por lo tanto, los títulos de anticuerpos anti-S,L* resultantes son independientes del la relación escualeno:QS21.
- \bullet
- El perfil de la distribución subisotípica (como se muestra en la figura 2) es comparable para todas las formulaciones relativas a SB62 (25-30% de IgG2a) mientras que las de Alum inducen solamente 4% de IgG2a.
Las respuestas inmunes mediadas por células
(linfoproliferación, producción de IFN\gamma / IL5 y CTL) se
midieron a los 14 días después de IV después de reestimulación
in vitro de células esplénicas y de ganglios linfáticos
ilíacos con antígeno S,L*.
La producción de citoquinas (IFN\gamma e
IL-5) se ha medido después de las 96 horas de
reestimulación in vitro de células esplénicas y células de
ganglios linfáticos ilíacos con S,L*. Estos resultados se
representan en las figuras 3 a 6.
Figura 3, muestra los resultados de la producción
de IFN-\gamma por las células esplénicas (media
de los datos obtenidos con tres conjuntos / grupo).
Figura 4, muestra los resultados de la producción
de IL-5 por las células esplénicas (media de los
datos obtenidos con tres conjuntos / grupo).
Figura 5, muestra los resultados de la producción
de IFN-\gamma por las células de los ganglios
linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres conjuntos
/ grupo).
Figura 6, muestra los resultados de la producción
de IL-5 por las células de los ganglios linfáticos
ilíacos (media de los datos obtenidos con tres conjuntos /
grupo).
| Reestimulación | Grupos | ||||
| GR 1 | GR 2 | GR 3 | GR 4 | GR 5 | |
| 10 \mug/ml de S,L* | 22,9 | 10,7 | 51,7 | 17,0 | 0,9 |
- \bullet
- Pequeñas cantidades de emulsión son beneficiosas para la producción de IFN-\gamma. Niveles muy altos de IFN-\gamma se producen después de la reestimulación de células esplénicas de animales inmunizados con formulaciones que contienen la emulsión de baja relación. Estos niveles son significativamente mayores que los obtenidos después de la vacunación con las formulaciones correspondientes utilizando una emulsión de dosis completa. La producción más fuerte de IFN-\gamma se obtiene después de la reestimulación de células esplénicas de animales inmunizados con S,L* SB62 y SB62'c.
- \bullet
- El efecto beneficioso de las formulaciones de relación baja (grupos 3 y 4 en las figuras 5 y 6) es mucho más marcado cuando se miran las células derivadas de los ganglios linfáticos que drenan (ganglios linfáticos ilíacos) comparado con los cogidos del bazo.
- \bullet
- Una relación IFN-\gamma: IL-5 > 1 claramente sugiere que se induce una respuesta pro TH1 por todas las formulaciones relativas a SB62 (véase tabla 1).
- \bullet
- Los animales inmunizados con formulaciones de S,L* SB62c producen niveles más altos de IL-5 que los inmunizados con formulaciones de S,L*SB62 que no contienen colesterol. Los animales inmunizados con S,L* Alum son los que producen los más altos niveles de IL-5.
- \bullet
- Se observa una producción más fuerte de IFN-\gamma cuando se usan las formulaciones (SB62' y SB62'c) de relación baja de escualeno: QS21.
Las respuestas de CTL anti-S,L*
se proporcionan en la figura 7.
Figura 7, muestra la actividad de CTL de las
células T esplénicas estimuladas in vitro durante 7 días con
antígeno S,L* (media de % de lisis específica de tres
conjuntos).
- \bullet
- Se obtiene lisis específica con todas las formulaciones de emulsiones de aceite en agua.
- \bullet
- Se observa una respuesta más fuerte de CTL con formulaciones que contienen emulsiones de SB62' cuando se mira la relación limitante de E/T tal como 3/1.
- 1.
- La producción más fuerte de IFN-\gamma se observa después de la inmunización con emulsiones de SB62'.
- 2.
- Una respuesta CTL ligeramente mejor se induce mediante formulaciones que contenían emulsiones SB62' en comparación con la correspondiente formulación que usa una emulsión de dosis completa.
- 3.
- El perfil de tipo TH1 de la respuesta inmune inducida por todas las formulaciones relativas a SB62 se confirma adicionalmente mediante la relación IFN-\gamma / IL-5.
- 4.
- No se observa ninguna diferencia significativa entre títulos de anticuerpos inducidos después de la inmunización con SB62c o SB62'c.
- 5.
- No se observa ninguna diferencia significativa entre títulos de anticuerpos inducidos después de la inmunización con SB62c y SB62'.
- 6.
- Un perfil isotópico comparable (25-30% de IgG2a) se obtiene con todas las formulaciones relativas a SB62 que sugieren la inducción de una respuesta inmune específica de HBs de tipo TH1.
| Parámetro | Formulaciones que contienen S,L* | ||||
| inmune | SB62 | SB62c | SB62' | SB62'c | Alum |
| Títulos de | +++ | +++ | ++ | +++ | + |
| Anticuerpo | |||||
| Tipo de TH | TH1 | TH1 | TH1 | TH1 | TH2 |
| (% de IgG2a) | (29) | (26) | (29) | (30) | (4) |
| IFN-\gamma (SPC) | + | ++ | +++ | ++++ | + |
| IL – 5 (SPC) | - | + | + | ++ | +++ |
| CTL | + | + | ++ | ++ | - |
Los experimentos de inmunización que utilizan los
antígenos de malaria de Plasmodium falciparum TRAP y RTS,S en
combinación con diversos adyuvantes, cada uno a base de un sistema
de emulsión de aceite en agua. La RTS es una proteína híbrida que
comprende sustancialmente toda la porción terminal C de la proteína
del circumsporocito (abreviadamente CS) de P. falciparum
unido mediante cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno
de superficie de Hepatitis B al antígeno de superficie (S) del
virus de la hepatitis B. Su estructura completa se describe en la
solicitud de patente internacional Nº PCT/EP92/02591, publicado en
el documento número WO 93/10152 que reivindica prioridad de la
solicitud de patente de Reino Unido Nº 9124390.7. Cuando se expresa
en RTS de levadura se produce en forma de una partícula de
lipoproteína y cuando se coexpresa con el antígeno S de VBH produce
una partícula mezclada conocida como RTS,S.
Los antígenos TRAP se describen en la solicitud
de patente internacional Nº PCT/GB89/00895, publicada en el
documento WO 90/01496. Los antígenos TRAP son polipéptidos, también
llamados proteínas anónimas relativas a trombospondina, que
comparten homología con diversas proteínas de P.
falciparum.
Las formulaciones de adyuvantes diferentes que
utilizan los sistemas de emulsión se describen en el ejemplo 1, con
diferentes relaciones de escualeno:QS21, y comprendiendo
opcionalmente colesterol (relación QS21:colesterol p/p de 1:10), se
combinaron con los antígenos de malaria y se compararon en su
capacidad para inducir respuestas inmunes humorales y mediadas por
células (proliferación de células T y producción de citoquinas).
SB62 se formuló junto con el antígeno en una relación alta (240:1,
SB62) o baja (48:1, SB62') de escualeno:QS21, opcionalmente con la
adición de colesterol.(c).
Se inmunizaron dos veces (en volúmenes de 2 x 50
\mul) grupos de 5 ratones (hembras de ratones de seis semanas de
edad, raza C57/BL6 x CBA/J [H-2k]) en la
almohadilla de la pata trasera, con espacio de 14 días, bien
con
10 \mug de RTS,S o con 4 \mug de TRAP combinado con diversos sistemas de emulsiones de aceite en agua (SB62). Catorce días después de la segunda inmunización la producción de citoquinas (IL 5 e IFN-\gamma) y proliferación de células T se analizó después de reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios linfáticos con los antígenos de malaria. La respuesta de anticuerpos a RTS,S y TRAP y el perfil isotópico que se indujo se investigó mediante ELISA.
10 \mug de RTS,S o con 4 \mug de TRAP combinado con diversos sistemas de emulsiones de aceite en agua (SB62). Catorce días después de la segunda inmunización la producción de citoquinas (IL 5 e IFN-\gamma) y proliferación de células T se analizó después de reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios linfáticos con los antígenos de malaria. La respuesta de anticuerpos a RTS,S y TRAP y el perfil isotópico que se indujo se investigó mediante ELISA.
| Nº de grupo | Antígeno | Adyuvante |
| 1 | RTS,S | SB62 / QS21 / 3D - MPL |
| 2 | TRAP | SB62 / QS21 / 3D - MPL |
| 3 | RTS,S /TRAP | SB62 / QS21 / 3D - MPL |
| 4 | RTS,S | AlOH / QS21 / 3D - MPL |
| 5 | RTS,S /TRAP | AlOH / QS21 / 3D - MPL |
| 6 | RTS,S | SB62c / QS21 / 3D - MPL |
| 7 | RTS,S /TRAP | SB62c / QS21 / 3D - MPL |
| 8 | RTS,S | SB62c' / QS21 / 3D - MPL |
| 9 | RTS,S /TRAP | SB62c' / QS21 / 3D - MPL |
| 10 | - | SB62 / QS21 / 3D - MPL |
| 11 | Vir. Vac. 3D7 |
Dosis completa de emulsión de aceite en agua de
SB62.
Emulsión de aceite en agua de SB62' ejemplificada
en las figuras como dosis 1/5 de SB62.
Emulsión de aceite en agua de SB62c o SB62'c
(cualquier dosis) más colesterol en la fase oleosa.
Vir. Vac. 3D7 = una construcción de virus
vaccinia recombinante que expresa la proteína de CS y administrada
a 10^{6} UFP por ratón.
Células de bazo o de ganglios linfáticos
poplíteos se retiraron asépticamente y se lavaron. Se cultivaron
100 \mul de células en medio RPMI (1% de suero normal de ratón
inactivado por calor, NMS) que contenía 2 x 10^{6}/ml de células
en placas de fondo redondo en presencia de antígenos RTS,S o TRAP.
Después de la estimulación durante 96 horas con 0,1, 0,5 y 2,5
\mug de antígeno, o 48 horas con 2 \mug/ml de ConA, se marcaron
las células con
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) durante 16 horas antes de que se recogieran y se contaran en un contador \beta.
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) durante 16 horas antes de que se recogieran y se contaran en un contador \beta.
RPMI 1640 sin L-glutamina (Life
technologies Nº 31870025), L-glutamina 2mM (Life
technologies Nº 25030024), 2-mertcaptoetanol 50
\muM (Life technologies Nº 11360039), piruvato sódico 1 mM (Life
technologies Nº 11360039), aminoácidos no esenciales 1 x MEM (10 x
solución madre, Life technologies Nº11140035), penicilina 100
UI/ml-estreptomicina 100 \mug/ml (Life
technologiesNº 15140114).
Células de bazo o de ganglios linfáticos
poplíteos se retiraron asépticamente y se lavaron. Se cultivaron
1000 \mul de células en medio RPMI (5% de suero de ternera fetal
inactivado por calor, FCS) que contenía 5 x 10^{6}/ml de células
en placas de fondo plano de 24 pocillos en presencia de antígenos
RTS,S o TRAP. Después las placas se incubaron (37ºC, 5% de
CO_{2}) durante un número de horas con 0,5 y 2,5 \mug de
antígeno, o 4 \mug/ml final de ConA.
La duración del tiempo durante las que se
incubaron las células depende de la citoquina particular a
detectar, la
IL-2 se estimuló durante 72 horas, la IL-5 durante 72 ó 96 horas e IFN-\gamma durante 96 horas. Cada citoquina se detectó utilizando kits de ELISA disponible comercialmente (IL-2 e IFN-\gamma, Duoset Genzyme Nº 80-3573-00 y 80-3931-00 respectivamente; IL-5 se detectó utilizando el kit Pharmingen).
IL-2 se estimuló durante 72 horas, la IL-5 durante 72 ó 96 horas e IFN-\gamma durante 96 horas. Cada citoquina se detectó utilizando kits de ELISA disponible comercialmente (IL-2 e IFN-\gamma, Duoset Genzyme Nº 80-3573-00 y 80-3931-00 respectivamente; IL-5 se detectó utilizando el kit Pharmingen).
Se analizaron los anticuerpos dirigidos contra
TRAP utilizando un sándwich ELISA. Un antisuero oveja
anti-TRAP se recubrió en placas de ELISA que se utilizó para capturar antígeno TRAP añadido a 0,5 \mug/ml. Las titraciones de suero reunido de grupos experimentales se añadieron y se incubaron. Finalmente, se utilizaron anticuerpos específicos de isotipos anti-ratón biotinilados seguido de estreptavidina-peroxidasa para detectar anticuerpos unidos específicos de TRAP.
anti-TRAP se recubrió en placas de ELISA que se utilizó para capturar antígeno TRAP añadido a 0,5 \mug/ml. Las titraciones de suero reunido de grupos experimentales se añadieron y se incubaron. Finalmente, se utilizaron anticuerpos específicos de isotipos anti-ratón biotinilados seguido de estreptavidina-peroxidasa para detectar anticuerpos unidos específicos de TRAP.
Las respuestas humorales anti VBH se analizaron
mediante un ELISA directo, HBsAg se recubrió en la placa de ELISA a
1 \mug/ml. Suero reunido de los diferentes grupos experimentales
se titraron y se detectaron anticuerpos unidos como se ha descrito
anteriormente.
Las respuestas proliferativas en respuesta al
antígeno se puede ver en las figuras 8 a 11. Todas las
preparaciones de vacunas estimularon células en el ganglio
linfático poplíteo local que eran capaces de proliferar in
vitro en respuesta al antígeno, la magnitud de la cual era
independiente de la adición de colesterol.
Todas las preparaciones de vacunas eran capaces
de estimular células esplénicas que proliferaban in vitro en
respuesta al antígeno. Cuando se consideran los índices de
estimulación, las preparaciones que provocaron las respuestas más
altas en el bazo eran las que tenían la relación escualeno:QS21
baja (48:1 o dosis 1/5 de SB62).
Figura 8, muestra las respuestas proliferativas
de células de ganglios linfáticos poplíteos (en forma de conteo
bruto por minuto (abreviadamente CPM)) derivadas de los grupos
experimentales después de estimulación con antígenos TRAP y
RTS,S.
Figura 9, muestra las respuestas proliferativas
de células esplénicas (en forma de conteo bruto por minuto
(abreviadamente CPM)) derivadas de los grupos experimentales
después de estimulación con antígenos TRAP y RTS,S.
Figura 10, que muestra las respuestas
proliferativas de células de ganglios linfáticos poplíteos (índice
de estimulación) derivadas de los grupos experimentales después de
estimulación con antígenos TRAP y RTS,S.
Figura 11, que muestra las respuestas
proliferativas de células esplénicas (índice de estimulación)
derivadas de los grupos experimentales después de estimulación con
antígenos TRAP y RTS,S.
Las figuras 1 y 2, claramente muestran que todas
las formulaciones de vacunas estimulan las células linfoides que
son capaces de proliferar in vitro en presencia de antígeno
en una forma dependiente de dosis. Los datos de conteo bruto
sugieren que la inclusión de colesterol en las formulaciones de
adyuvantes no tienen efecto en la magnitud de las respuestas
proliferativas (por ejemplo, una comparación entre los grupos 1 y
6, denominados RTS,S/MPL/QS21/SB62 y RTS,S/MPL/QS21/SB62c
respectivamente).
El examen de las cpm junto con los resultados de
índice de estimulación (obtenidos dividiendo el conteo bruto para
la proliferación específica de antígeno por la que se deriva de la
proliferación específica de no antigénica (medio solo)) muestra que
la formulación de vacunas que genera las respuestas proliferativas
más altas depende del origen del linfocito medido. Las
formulaciones de adyuvantes que contienen la relación de
escualeno:QS21 baja (48:1) generan las respuestas proliferativas más
altas en el bazo.
La producción de citoquinas, medias in
vitro en respuesta a antígeno, puede ser tanto una medida
cuantitativa como cualitativa de la inducción de respuestas inmunes
in vivo. En general se toman niveles altos de
IFN-\gamma e IL-2 para que sean
una medida de las repuestas inmunes de tipo Th1, e
IL-5 se considera que es una citoquina de tipo Th2.
Las figuras siguientes (figura 12 a 14) demuestran el uso de SB62',
que contiene una relación reducida de escualeno:QS21 (denominada
dosis 1/5 de SB62), tenia un efecto marcado para potenciar la
producción de IFN-\gamma (figura 6).
Además, existe evidencia de que la adición de
colesterol no tiene efectos cualitativos o cuantitativos en el
perfil de citoquinas producidas in vitro en respuesta a
antígeno. Este efecto puede tener consecuencias significativas en la
inducción de respuestas inmunes de tipo Th1 y también
inmunoterapéuticas.
Figura 12, muestra producción de
IL-2 de células esplénicas después de estimulación
con antígeno TRAP o RTS,S. 14 días después de VII.
Figura 13, muestra producción de
IFN-\gamma mediante células esplénicas después de
estimulación con antígeno TRAP o RTS,S. 14 días después de VII.
Figura 14, muestra producción de
IL-5 mediante células esplénicas después de
estimulación con antígeno TRAP o RTS,S. 14 días después de VII.
Otra medida de inmunidad que puede
correlacionarse con una respuesta inmune de tipo Th1, o
alternativamente de un tipo Th2 es el subisotipo de IgG que se
provoca. Una estimulación preferencial del subisotipo IgG1 se toma
generalmente para que sea una medida de la inducción de la
respuesta inmune de tipo Th2, y recíprocamente IgG2a e IgG2b se
toma para que sea una medida de la respuesta inmune de tipo Th1.
Los estudios de ELISA se realizaron en suero de
ratón en conjunto y se determinaron los títulos de punto medio tanto
para anticuerpos específicos de HBsAg como TRAP. Para estas figuras
se calculó la relación de los títulos de punto medio de IgG1 e IgG2
específicos de antígeno y se tomó para que fuera una medida del
balance Th1/Th2 de la respuesta inmune humoral (los resultados se
muestran en la tabla 4).
| Relación de títulos de punto medio de IgG1 : IgG2a | ||
| Grupo | HBsAg | TRAP |
| 1 | 0,44 | |
| 2 | 0,36 | |
| 3 | 1,46 | 1,68 |
| 4 | 0,37 | |
| 5 | 0,39 | 11,83 |
| 6 | 0,28 | |
| 7 | 0,2 | 7,21 |
| 8 | 0,66 | |
| 9 | 0,3 | 0,77 |
Se analizaron conjuntos de suero de ratón de cada
grupo y se encontraron que habían estimulado exitosamente
anticuerpos específicos de HBsAg y TRAP. En general, títulos de
punto medio de anticuerpos contra HBsAg eran más altos que los
encontradas contra TRAP. La distribución de isotipo difería entre
los dos antígenos. RTS,S en todas las formulaciones provocaba una
configuración clara de Th1, como se indicaba mediante una relación
IgG1:IgG2a inferior a 1.
En contraste, los anticuerpos específicos de TRAP
mostraban una configuración de isotipos de tipo Th2. Las únicas
excepciones a esta observación eran los grupos 2, que recibieron
TRAP únicamente, y el grupo 9, que recibió TRAP/RTS,S en una
formulación SB62' (que contenía una relación baja de escualeno:QS21,
denominada dosis 1/5 de SB62). Por lo tanto, el uso de SB62' puede
ser útil en el diseño de vacunas que inducen Th1 con antígenos que
se sabe preferentemente que inducen respuestas inmunes de tipo
Th2.
Este experimento investigó el uso potencial de
adyuvantes de emulsiones de aceite en agua para el tratamiento
terapéutico de virus de papiloma humano (abreviadamente VPH) que
expresa tumores. Se inocularon células tumorales (TC1), que se sabe
que expresan la proteína E7 de VPH 16, en ratones C57BL/6 de
6-8 semanas de edad. Estas células tumorales si se
dejan sin tratar se desarrollaban en tumores de tamaño mensurable.
Se investigó el potencial de las vacunas que comprenden E7, a base
de adyuvantes de emulsiones de aceite en agua, para evitar el
establecimiento de estos tumores. Se evaluó en el modelo de tumor
TC1-E7 el potencial terapéutico de diversas
emulsiones de aceite en agua (para detalles véase el ejemplo 1)
dosis completa de SB62, 1/5 de SB62, dosis completa de SB62c y 1/5
de SB62c en combinación con antígeno recombinante ProtD1/3 E7 VPH
16. Además, se comparó la contribución de los programas de
vacunación.
Brevemente, grupos de 8-10
ratones C57BL/6 se provocaron 5 x 10^{5} células tumorales (en el
costado). Después los grupos de ratones se inmunizaron dentro de la
almohadilla de la pata con 5 \mug de ProtD1/3 E7 combinada con
diversas formulaciones, 7 y 14 días después de la provocación
tumoral subcutánea.
Se compararon otros esquemas de vacunación: 2
vacunaciones con 5 \mug de ProtD1/3 E7 en SB62 (días 14 y 21
después de la provocación de tumores); y 4 vacunaciones con 5 \mug
de ProtD1/3 E7 en SB62 (7, 14, 21, 28 días después de la
provocación de tumores).
Las respuestas de anticuerpo a E7 se controlaron
mediante ELISA en los instantes 2 y 4 semanas después de la segunda
vacunación. Se analizó la respuesta linfoproliferativa mediante
reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios
linfáticos durante 72 horas con la proteína E7 (10, 1, 0,1
\mug/ml) 2 y 4 semanas después de la segunda vacunación. Las
respuestas de CTL se midieron después de reestimulación in
vitro de células esplénicas con células tumorales irradiadas
(TC1) o un péptido derivado de E7. El ensayo de liberación de cromo
se realizó en células TC1, en una línea de células tumorales
singénicas : EL4 pulsadas o no con un péptido derivado de E7 o
infectadas bien con un virus vaccinia recombinante de E7 o con el
virus vaccinia de tipo salvaje.
| Grupo | Programa de vacunación | Antígeno (VPH 16) | Excipiente |
| (días después de provocación) | |||
| A | 7, 14 | - | PBS |
| b | 7, 14 | ProtD1/3 E 7 | PBS |
| c | 7, 14 | ProtD1/3 E 7 | DQ |
| d | 7, 14 | - | DQ |
| e | 7, 14 | ProtD1/3 E 7 | SB62 |
| f | 7, 14 | - | SB62 |
| g | 7, 14 | ProtD1/3 E 7 | SB62' |
| h | 7, 14 | - | SB62' |
| i | 7, 14 | ProtD1/3 E 7 | SB62c |
| j | 7, 14 | - | SB62c |
| k | 7, 14 | ProtD1/3 E 7 | SB62'c |
| l | 7, 14 | - | SB62'c |
| m | 7, 14, 21, 28 | ProtD1/3 E 7 | SB62 |
| n | 14, 21 | ProtD1/3 E 7 | SB62 |
- \bullet
- Se inyectaron subcutáneamente en el costado de ratones C57BL/6 inmunocompetentes 5 x 10^{5} células tumorales que expresan TC1-E7 (200 \mul).
- \bullet
- Las vacunaciones se realizaron en cualquiera de los días 7, 14, 21 ó 28 días después del la provocación de tumores, con 5 \mug de ProtD1/3 E 7 VPH 16 inyectada en la almohadilla de la pata (100 \mul : 50 \mul / almohadilla de pata). Cada vacuna se formuló en presencia de diferentes adyuvantes: SB62, SB62c, SB62' o SB62'c.
\newpage
- \bullet
- Dos y cuatro semanas después de la segunda inmunización se sacrificaron los ratones y se cogieron los bazos o ganglios linfáticos poplíteos y se analizaron en ensayos de linfoproliferación o CTL.
Se incubó antígeno ProtD1/3-E7 (5
\mug) 30 minutos con MPL (5 \mug) antes de la adición de tampón
en forma de una mezcla 10 veces concentrada de PBS pH 7,4 y
H_{2}O. Después de 30 minutos se añadió QS21 (5 \mug) a la
formulación mezclada con liposomas en una relación de peso
QS21/Colesterol de 1:5 (denominada DQ). Se añadieron 50 \mug/ml
de tiomersal a la formulación como conservante 30 minutos después
de la adición de la QS21. Todas las incubaciones se llevaron a cabo
a temperatura ambiente con agitación.
Células TC1 (obtenidas de la Universidad de John
Hopkin) o EL4 se desarrollaron en RPMI 1640 (Bio Whittaker) que
contenía 10% de FCS y aditivos: L-glutamina 2 mM, 1%
de antibióticos (10000 U/ml de penicilina, 10000 \mug/ml de
estreptomicina) 1% de aminoácidos no esenciales 100 x, 1% de
piruvato sódico (Gibco), 2-mercaptoetanol
5 x 10^{-5} M. Antes de la inyección en un costado de los ratones, las células TC1 se tripsinizaron y se lavaron en medio exento de suero.
5 x 10^{-5} M. Antes de la inyección en un costado de los ratones, las células TC1 se tripsinizaron y se lavaron en medio exento de suero.
Se siguió el desarrollo individual tumoral
durante el tiempo. Se midieron los dos principales diámetros (A, B)
utilizando calibres dos veces por semana, A x B representa la
"superficie tumoral" y se expresa como la media de los 5
valores en cada grupo.
Se realizó la linfoproliferación en bazos
individuales y en conjuntos de ganglios linfáticos. La suspensión
celular se incubó con cloruro amónico tamponado con Tris durante 4
minutos a 4ºC con el fin de lisar los glóbulos rojos Se sembraron en
placas por triplicado 2 x 10^{5} células de bazo o células de
ganglios linfáticos poplíteos, en microplacas de 96 pocillos, en
medio RPMI que contenía 1% de suero de ratón normal. Después de 72
horas de incubación con diferentes cantidades de E7
(10-1-0,1 \mug/ml), 100 \mul de
sobrenadante de cultivo se retiraron y se reemplazaron por medio
reciente que contenía 1 \muCi de
^{3}H-timidina. Después de pulsar durante 16
horas, se recogieron las células en placas de filtro. Se contó la
radiactividad incorporada en un contador \beta. Los resultados se
expresan en cuentas por minuto (CPM, media de pocillos triplicados)
o como índices de estimulación (media de CPM en cultivos con
antígeno \div media de CPM en cultivos sin antígeno).
Se cultivaron 2 x 10^{6} células de bazo junto
con 2 x 10^{6} células TC1 irradiadas (18000 rads) durante 7
días. Las células diana eran bien células TC1 cargadas (1 hora a
37ºC) con Cr^{51} (DuPont NEN 37MBq/ml) o células EL4 (células
tumorales singénicas) infectadas con un virus vaccinia recombinante
de E7 (recibido de T. C. Wu de la Universidad de John Hopkins). Los
resultados derivados de estas células se compararon con los de las
dianas de EL4 que se habían infectado con el virus vaccinia de tipo
salvaje (la infección de vaccinia de realizó a una MOI
(multiplicidad de infección) de 10 en un volumen pequeño de medio
exento de suero, durante 1 hora a 37ºC en un incubador de CO_{2}.
Se añadió medio reciente y se incubaron las células durante una
noche antes de uso). Se usaron 10 \mug/ml de péptido derivado de
E7 (49-57) (QCB) para pulsar células El4 durante 1
hora a 37ºC mientras se realizaba la carga de las células con
Cr^{51}. Se añadieron 2000 células diana a cada pocillo de placa
de 96 pocillos (nunc 2-45218 de fondo en V) siendo
la relación más alta efector/diana 100/l. Los controles de
liberación máxima de Cr^{51} se realizaron por sextuplicado y eran
dianas en medio o en triton al 1,5%. Todas las placas se
centrifugaron suavemente y se incubaron durante 4 horas a 37ºC en
CO_{2} al 7%. Se depositaron 50 \mul del sobrenadante en
Lumaplate de 96 pocillos (Packard) se dejaron secar durante una
noche y se contaron en un contador Top Count. Los datos se expresan
como porcentaje de lisis específica que se calcula a partir de las
c. p. m. mediante la fórmula (liberación
experimental-liberación espontánea) \div
(liberación máxima-liberación espontánea) x
100.
La cuantificación de anticuerpo anti E7 se
realizó mediante ELISA utilizando E7 como antígeno de
recubrimiento. Las soluciones de antígeno y anticuerpo se
utilizaron a 50 \mul por pocillo. Se diluyó el antígeno a una
concentración final de 3 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5 y se
adsorbió durante una noche a 4ºC a los pocillos de las placas de
microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después las placas
se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía 1% de
albúmina sérica bovina y 1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se
añadieron diluciones dos veces de suero (comenzando a dilución
1/100) en el tampón de saturación a las placas recubiertas con E7 y
se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las
placas 3 veces con PBS 1% de Tween 20 y se añadió IgG1, IgG2a, IgG2b
o IgGtot anti-ratón conjugado con biotina
(Amersham, Reino Unido) diluido 1/5000 en tampón de saturación a
cada pocillo y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Después
de una etapa de lavado, se añadió complejo
estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham,
Reino Unido) diluida 1/5000 en tampón de saturación durante 30
minutos adicionales a 37ºC. Se lavaron las placas como se ha
indicado anteriormente y se incubaron durante 10 minutos con TMB
(Tetrametilbencidina). Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 4
N y se leyó a 450 nm. Se calcularon diluciones de punto medio
mediante SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros).
Se retiraron los tumores y se fijaron en acetona
y paraformaldehído antes de seccionar. Después las secciones en
criostato de 5 \mum de espesor se investigaron y se tiñeron para
CD4, CD8 y CD3 que expresan infiltración de células T. Antes de la
adición de los anticuerpos monoclonales teñidos, se lavaron las
secciones y se saturaron con 0,5% de albúmina sérica bovina
(abreviadamente BSA), 5% de suero de conejo normal (abreviadamente
NRS) en PBS. Después de esta etapa los anticuerpos monoclonales de
rata anti-CD3, CD4 y CD8 se añadieron y se incubaron
durante una noche a 4ºC. Después las secciones se lavaron y se
reveló la unión de los anticuerpos monoclonales de rata con Ig
conejo anti-rata biotinilado. Después de la
incubación durante 30 minutos, a temperatura ambiente
(abreviadamente TA), se añadió
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y se
incubó durante otros 30 minutos a TA. La unión de
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante se
reveló con DAB durante 10 minutos a TA. Después las secciones se
tiñeron en contraste con hematoxilina y se deshidrataron con etanol,
isopropanol y finalmente xilol.
Desarrollo tumoral (para una representación del
crecimiento medio tumoral /grupo véase la figura 15)
Figura 15, muestra el desarrollo medio tumoral
después de la provocación y vacunación los días 7 y 14 con diversas
formulaciones que contienen ProtD1/3 E7.
Figura 16, muestra el desarrollo tumoral medio
observado durante un período de 4 semanas para los grupos que
reciben el antígeno en formulaciones de DQ y SB62, también se
representan los resultados que comparan los programas diferentes de
vacunaciones. Estas vacunas se administraron los días 7 y 14; o los
días 14 y 21; o los días 7, 14, 21 y 28.
Figura 16, comparación con las formulaciones
comparativas y otros programas de vacunaciones.
con el antígeno ProtD1/3 E7.
- \bullet
- La vacunación bien con ProtD1/3 E7o adyuvante solo no tiene ningún efecto en el desarrollo de la TC1-E7 que expresa tumor.
- \bullet
- El análisis del desarrollo individual tumoral mostró un rechazo completo tumoral en diversos grupos:
| Grupo | Porcentaje de rechazo tumoral |
| c | 40% |
| e | 40% |
| g | 60% |
| j | 20% |
| l | 10% |
La mejor formulación para inducir rechazo tumoral
se formuló con la dosis baja de emulsión de aceite en agua de
SB62'.
- \bullet
- Se observó un efecto terapéutico después de 4 vacunaciones mejor que el visto después de 2. El análisis del desarrollo individual tumoral mostró que 60% de los animales rechazaron completamente su tumor después de 4 vacunaciones con formulaciones a base de SB62 mientras que solamente 40% de ratones que habían recibido 2 vacunaciones mostraron completa regresión.
- \bullet
- Si se retrasa la primera vacunación hasta el día 14 después de la provocación de tumores, no se pudo observar ningún rechazo completo. Sin embargo, el desarrollo tumoral parecía estar suprimido.
\newpage
- \bullet
- No se observó respuesta proliferativa en este experimento tanto con células esplénicas como de ganglios linfáticos que recibieron ProtD1/3 E7 o adyuvantes solos.
- \bullet
- La linfoproliferación específica de antígeno se incremento en los grupos de ratones que recibieron ProtD1/3 E7 en presencia de adyuvantes. Se observaron respuestas proliferativas altas tanto con DQ como SB62' en el bazo. Véase la figura 17 y 18.
Figura 17, linfoproliferación observada en
células esplénicas, 2 semanas después de la segunda vacunación.
Figura 18, linfoproliferación observada en
células esplénicas 2 semanas después de la segunda vacunación.
- \bullet
- Respuesta de anticuerpo anti E7: se midieron IgG total y subisotipos (IgG1, IgG2a, IgG2b) mediante ELISA utilizando la proteína E7 como antígeno de recubrimiento. Los títulos de Ig anti-E7 observados 2 semanas después de la segunda vacunación se proporcionan en la tabla 6. La figura 19 muestra el porcentaje relativo de los diferentes isotipos de IgG en el suero de ratones vacunados 2 semanas después de la segunda vacunación.La respuesta débil de anticuerpo inducida después de dos vacunaciones con la ProtD1/3 E7 sola se incrementó fuertemente en animales que recibieron un adyuvante. La respuesta más fuerte se obtuvo SB62.
- \bullet
- La respuesta débil de anticuerpo inducida después de dos vacunaciones con la ProtD1/3 E7 sola se incrementó fuertemente en animales que recibieron un adyuvante. La respuesta más fuerte se obtuvo SB62.
- \bullet
- El subisotipo predominante de anticuerpo específico de E7 inducido por todas las formulaciones de vacunas fue IgG2b (80-90% del total de las IgG).
| Grupo | Título de subtipos de Ig | ||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | |
| a | 0 | 0 | 0 |
| b | 1420 | 0 | 4070 |
| c | 7850 | 1110 | 70170 |
| d | 0 | 0 | 0 |
| e | 11880 | 470 | 86610 |
| f | 0 | 0 | 0 |
| g | 13670 | 1580 | 62560 |
| h | 0 | 0 | 0 |
| i | 13073 | 1650 | 89930 |
| j | 0 | 0 | 0 |
| k | 260 | 0 | 2630 |
| l | 0 | 0 | 0 |
Figura 19, porcentaje relativo de los diferentes
isotipos de IgG en el suero de ratones vacunados 2 semanas después
de la segunda vacunación.
\newpage
- \bullet
- Una respuesta de CTL se podría detectar en los instantes 2 y 4 semanas después de la vacunación final.
- \bullet
- No se observó lisis cuando los ratones recibieron la proteína o el adyuvante solo. La mejor lisis específica se observó cuando los ratones recibieron el antígeno en DQ o SB62' (véase tabla 7).
| Grupo | Anti-E7 CTL (relación de E:T 100:1) |
| a | - |
| b | - |
| c | +++ |
| d | - |
| e | ++ |
| f | - |
| g | ++++ |
| h | - |
| i | + |
| k | ++ |
| l | + |
Se retiraron los tumores de los ratones (2
ratones por grupo) y se congelaron las secciones. Las secciones
criogénicas de los tumores se tiñeron con anticuerpos
anti-CD4 y anti-CD8. Los resultados
de la infiltración tumoral observada por células CD4 y CD8+ve se
proporcionan en la tabla 8.
| Grupo (Nº de ratón) | Control negativo | Infiltración de | Infiltración de |
| linfocitos CD4+ve | linfocitos CD8+ve | ||
| a (1) | - | - | +/- |
| a (2) | - | - | +/- |
| b (1) | - | +/- | + |
| b (2) | - | - | + |
| c (1) | - | + | +++ |
| c (2) | - | + | +++ |
| d (1) | - | - | +/- |
| d (2) | - | +/- | + |
TABLA 8
(continuación)
| Grupo (Nº de ratón) | Control negativo | Infiltración de | Infiltración de |
| linfocitos CD4+ve | linfocitos CD8+ve | ||
| e (1) | - | +/- | +++ |
| e (2) | - | +/- | +++ |
| f (1) | - | - | +/- |
| f (2) | - | - | +/- |
- \bullet
- Los tumores de regresión, en los grupos de ratones que recibieron la ProtD-1/3 E7 en DQ o SB62, mostraron una infiltración masiva con células CD8+ y poca de células CD4+.
- \bullet
- Los tumores extraídos de los animales que recibieron el PBS, antígeno, o adyuvantes solos, no contenían ninguna infiltración linfocítica de CD8+ve.
- \bullet
- Dos vacunaciones (los días 7 y 14) con 5 \mug de ProtD 1/3 en formulaciones diferentes a base de SB62 indujeron el rechazo de tumores preestablecidos que expresan E7 implantados en un sitio distante.
- \bullet
- El rechazo de tumores se asocia con una respuesta CTL específica de anti E7. Existe una tendencia para que haya una respuesta ligeramente mejor de CTL en los individuos que rechazaron sus tumores.
- \bullet
- La inmunoquímica mostró una infiltración masiva de células T de CD8+ en tumores que vuelven tras la vacunación con ProtD1/3 E7 + DQ y SB62.
- \bullet
- Dos vacunaciones (los días 14 y 21 después de la provocación de tumores) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 VPH 16 en SB62 redujo el desarrollo de estos tumores más grandes pero no indujeron regresión completa.
- \bullet
- Cuatro vacunaciones (los días 7, 14, 21 y 28 después de la provocación de tumores) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 VPH 16 en SB62 indujo el rechazo completo de tumores establecidos en 60% de los animales. Se observó el 40% de rechazo total después de 2 vacunaciones con el mismo adyuvante.
- \bullet
- El uso la dosis baja de adyuvante de SB62' no tenía ningún efecto en la magnitud de los títulos de anticuerpos anti E7, todavía indujo el nivel más alto de proliferación de linfocitos esplénicos y respuestas de CTL anti-E7.
De los ejemplos anteriores está claro que la
presente invención comprende una emulsión de aceite en agua que
induce preferentemente una fuerte respuesta inmune de tipo Th1,
especialmente la producción de IFN-\gamma. Se ha
demostrado que estas formulaciones estimulan respuestas inmunes a
una amplia diversidad de antígenos y, por lo tanto, se prevé que
esta invención presente encontrará utilidad en una amplia diversidad
de patógenos sin limitarse a los encontrados en esta memoria
descriptiva.
Se ha descrito previamente que
QS21-H es producto de hidrólisis de QS21, que ya no
es activo como adyuvante. Se forma mediante escisión de la molécula
de QS21 mediante OH^{-} de la solución acuosa. Esta reacción se
produce cuando el pH del medio acuoso es superior a un valor de
6,5 y se acelera por temperatura más alta. Las emulsiones de aceite
en agua descritas en esta solicitud de patente (por ejemplo SB62) se
sabe que muestran un efecto estabilizante de tal forma que se
inhibe la hidrólisis de QS21 en QS21-H. Tras la
dilución de la emulsión de aceite en presencia de QS21 constante,
pierden su propiedad estabilizante y el QS21 degenera en la forma
inactiva QS21-H. Sorprendentemente, las emulsiones
que contienen colesterol adicional, que a una relación 1/1 no
muestran una estabilidad de QS21 mejorada, mantienen el efecto
estabilizante incluso a una dilución 1/5.
QS21 y QS21-H se ensayan
directamente en la emulsión. Esto se logra mediante derivatización
química de la formulación completa y realizando una etapa de
extracción selectiva que disuelve la QS21, pero deja detrás la
mayoría de los compuestos de matriz que interfieren. El ensayo se
basa en HPLC y los compuestos están dansilados. La dansilación se
realiza secando una muestra de la emulsión y añadiendo 100 \mul
de 3,5 mg de hidracina de dansilo/ml C/M 2/1 y 100 \mul de 1:4 de
ácido acético : C/M 2/1 en ese orden. La mezcla se agita bien con
vórtice y se incuba a 60ºC durante 2 horas. Se seca la mezcla de
reacción en el Speedvac. Se reconstituye en 500 \mul de 30% de
ACN en H_{2}O y se centrifuga dos veces a 14000 rpm durante dos
minutos. Después se recogen los sobrenadantes en un tubo
automuestreador. Se obtiene una curva estándar mediante la
preparación de QS21 y QS21-H en una mezcla que
contiene los mismos compuestos que la emulsión en estudio.
El ensayo de HPLC se desarrolló en una columna
C18 RP de tamaño de partícula 5 \mu Vydac 218TP54, 250* 4,6 mm.
Los disolventes son A: H_{2}O + 0,05% de TFA (ácido
trifluoroacético) y B: acetonitrilo + 0,05% de TFA. La tabla de
gradientes es:
| Tiempo (min) | % de A | % de B |
| 0 | 70 | 30 |
| 2 | 70 | 30 |
| 15 | 50 | 50 |
| 17 | 50 | 50 |
| 17,1 | 10 | 90 |
| 19 | 10 | 90 |
| 21 | 70 | 30 |
| 25 | 70 | 30 |
El caudal es 1 ml/min. La detección es en
fluorescencia, con excitación a 345 nm y emisión a 515 nm. Se
inyectan 50 \mul tanto de la muestra como de los patrones. La
columna más caliente se coloca a 37ºC para esta separación Se
distinguen en el cromatograma los picos para QS21,
QS21-iso y QS21-H.
Se analizó una serie de muestras con la siguiente
composición:
| Composición | SB62 | SB62c | MPL | QS21 |
| SB62 | 250 \mul | - | 50 \mug | 50 \mug |
| SB62' | 50 \mul | - | 50 \mug | 50 \mug |
| SB62c | - | 250 \mul | 50 \mug | 50 \mug |
| SB62'c | - | 50 \mul | 50 \mug | 50 \mug |
Se realizó el ensayo de
QS21/QS21-H después de la incubación de las
muestras en diversos intervalos de tiempo y temperaturas (4ºC y
37ºC). Los datos durante 1 mes a 37ºC en este modelo se
correlacionan bien con la estabilidad de QS21 después de
almacenamiento prolongado a 4ºC (por ejemplo 2 años).
| Composición | 3 meses (4ºC) | 6 meses (4ºC) | 3 meses (4ºC) | 1 mes (37ºC) |
| + 7 días (37ºC) | ||||
| SB62 | 1% | 2% | 3% | 15% |
| SB62' | 1% | 1% | 9% | 31% |
| SB62c | 2% | 2% | 3% | 17% |
| SB62'c | 2% | 2% | 3% | 21% |
Este resultado presentado en la tabla anterior
muestra claramente (tanto durante 7 días como 1 m) el efecto de la
adición de esterol, en este caso colesterol, a SB62' en el
mantenimiento de la estabilidad de QS21.
Claims (26)
1. Una composición que comprende una emulsión de
aceite en agua y una saponina, en la que dicho aceite es un aceite
metabolizable, caracterizado porque la relación del aceite
metabolizable:saponina (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y
200:1.
2. Una composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque la relación del aceite
metabolizable:saponina (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y
100:1.
3. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la saponina se deriva de QuilA,
tal como QS21.
4. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que el aceite metabolizable es
escualeno.
5. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un esterol.
6. Una composición según la reivindicación 5, en
la que el esterol es colesterol.
7. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende además uno o más
inmunomoduladores.
8. Una composición según la reivindicación 7, en
la que dicho inmunomodulador se selecciona del grupo constituido
por: 3D-MPL y
\alpha-tocoferol.
9. Una composición según la reivindicación 3, y
que comprende además 3D-MPL, caracterizada
por que la relación de QS21:3D-MPL (p/p) está entre
1:10 y 10:1.
10. Una composición según la reivindicación 9, en
la que la relación de QS21:3D-MPL (p/p) está entre
1:1 y 1:2,5.
11. Una composición según la reivindicación 1, y
que comprende además colesterol, y en la que la saponina es QS21,
caracterizada porque la relación de QS21:colesterol (p/p)
está en el intervalo entre 1:1 y 1:20.
12. Una composición de vacunas que comprende una
composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,
que comprende además un antígeno o una preparación antigénica.
13. Una composición de vacunas según la
reivindicación 12, en la que el antígeno o preparación antigénica
se prepara a partir del grupo constituido por: virus de
inmunodeficiencia humana; virus Herpes simple tipo 1; virus Herpes
simple tipo 2; citomagalovirus humano; Hepatitis A, B, C, o E; virus
sincitial respiratorio; virus de papiloma humano; virus de
influenza; Salmonella; Neisseria; Borrelia; Chlamydia;
Bordetella; TB; VBE; Plasmodium y Toxoplasma.
14. Una composición de vacunas según la
reivindicación 12, en la que el antígeno o preparación antigénica
es una combinación de los antígenos de malaria RTS,S y TRAP.
15. Una composición de vacunas según la
reivindicación 12, en la que el antígeno o preparación antigénica
es, o se deriva de, un antígeno derivado de tumor u hospedador.
16. Una composición según la reivindicación 1, en
la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite que
tienen un diámetro que es inferior a 1 micra.
17. Una composición según la reivindicación 1, en
la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite que
están en el intervalo entre 120 y 750 nm de diámetro.
18. Una composición según la reivindicación 1, en
la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite que
están en el intervalo entre 120 y 600 nm de diámetro.
19. Una composición de vacunas según una
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que es capaz de invocar
una respuesta de células T de tipo citolítico en un mamífero al
antígeno o composición antigénica.
20. Una composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15 que es capaz de estimular la producción de
interferón-\gamma en un mamífero al antígeno o
composición antigénica.
21. Una composición de adyuvantes de vacunas
según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para uso en
medicina.
\newpage
22. Un procedimiento para fabricar una vacuna
según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende
la mezcla de una emulsión de aceite en agua; QS21; colesterol;
3D-MPL; \alpha-tocoferol; y un
antígeno o preparación antigénica.
23. El uso de una composición según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la fabricación de una
vacuna adecuada para el tratamiento de un ser humano susceptible o
que padece una enfermedad.
24. Un procedimiento para estabilizar una
saponina presente en una composición de la reivindicación 1, que
comprende la adición de un esterol en la fase oleosa de dicha
emulsión de aceite en agua.
25. Un procedimiento según la reivindicación 24
en la que la saponina es QS21.
26. Un procedimiento según la reivindicación 24 ó
25 en la que el esterol es colesterol.
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