CN113166733B

CN113166733B - 活减毒流感b病毒组合物及其制备和使用方法

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Publication number: CN113166733B
Application number: CN201880099539.3A
Authority: CN
Inventors: 陈鸿霖; 王培�; 袁国勇
Original assignee: Versitech Ltd
Current assignee: Versitech Ltd
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2024-12-31
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: EP3880805A1; CA3119857A1; EP3880805A4; US12156910B2; US20220016232A1; AU2018449744A1; WO2020097923A1; CN113166733A

Abstract

流感病毒的NS1蛋白是一种关键的毒力元件，在病毒复制中具有多种功能，并且作为一种强的干扰素(IFN)拮抗剂起作用。提供了使用主骨架的活减毒病毒(LAIV)，其含有流感B(HK8038)病毒并且包括NSI编码区域的缺失(DelNS1)。该LAIV基于新型适应性突变，其支持DelNS1流感B活减毒病毒(LAIV)在疫苗产生细胞中的复制。DelNS1流感B LAIV显示了自发的冷适应，具有在30至33℃生长但在37至39℃受限的偏好。该LAIV可以用于针对抗原性不同的流感B病毒的致死性攻击保护有需要的受试者。具有用于在疫苗产生系统中生长的适应性突变的DelNS1‑LAIV是制备高减毒和免疫原性活减毒流感疫苗的重要策略，所述疫苗具有诱导对季节性流感的广泛交叉保护性免疫的能力。

Description

活减毒流感B病毒组合物及其制备和使用方法

技术领域

本发明一般性涉及活减毒流感病毒(LAIV)B和包括LAIVB的免疫原性组合物、以及使用此类组合物诱导对由病毒基因组编码的抗原的免疫应答的方法。

背景技术

基于病毒核蛋白(NP)和基质蛋白中的差异，将流感病毒分类为A型、B型和C型。根据具有血凝素活性(HA)或神经氨酸酶活性(NA)的包膜糖蛋白，将A型病毒进一步细分为不同的亚型。有18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。(分别为H1至H18和N1至N11。)没有将流感B病毒分为亚型，但可以进一步划分为谱系和株。目前流行的流感B病毒属于两个谱系中的一个：B/Yamagata和B/Victoria。流感B和C病毒主要感染人类，然而流感A病毒感染一系列哺乳动物和禽类物种。只有A型和B型才会引起任何关注的人类疾病。流感发生在世界各地，估计每年全球成人发病率为5至10％，并且儿童发病率为20至30％(Thompsomn等人，JAMA 292,1333-1340(2004)；WOrld Health Organization Influenza(seasonal)fact sheet.World Health Organization(online)http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en(2014))，导致2百万至5百万严重疾病，并且每年有多达650,000病例死亡(Iuliano等人，Lancet 391,1285-1300(2018)；Whord HealthOrganization,2016 Influenza(seasonal)fact sheet 211)。www.who.int./mediacentre/factsheets/fs211/en)。接种流感疫苗被认为是减轻由季节性流感造成的疾病负担和死亡率以及防止未来在人类中大流行的最有效方式。

目前有三种类型的灭活疫苗可用：全病毒疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。在裂解病毒疫苗中，病毒已用洗涤剂破坏。在亚单位疫苗中，通过去除其它病毒组分对HA和NA进行进一步的纯化。活减毒流感疫苗是基于冷适应和温度敏感的变异疫苗病毒株的，这些病毒株在上呼吸道的鼻咽中复制良好，但在下呼吸道中复制较差(Jin等人，Curr TopMicrobiol Immunol 386,181-204(2015))。目前获得许可的流感疫苗是三价(三组分)或四价(四组分)的。基于世界卫生组织(WHO)流感网络实验室的监测数据，由抗原构成的三价流感疫苗衍生自两种流感A H1N1和H3N2亚型病毒，和衍生自Victoria或Yamagata谱系的流感B病毒的任一株。四价流感疫苗于2012年在美国首次获得许可，并且于2013至2014年流感季节可用。WHO于2013年推荐四价疫苗，该四价疫苗含有用于预防流感A H1N1、H3N2亚型病毒以及流感B病毒的两个谱系的抗原，但让每个国家/州决定使用三价或四价疫苗。根据由WHO流感疫苗合作网络实验室的监测项目收集的数据，每年选择流感疫苗毒株。不同流感病毒株引起的人类疾病存在差异，其中流感B在儿童中更为常见而H3N2在老年人中更为常见(Caini等人，BMC Infect Dis 18,269(2018))。虽然先前认为流感B病毒主要引起大龄儿童的疾病，但已注意到，自2005年以来在所有年龄组中，流感B病毒有关疾病负担的流行模式逐渐发生改变(Glezen等人，Am J Public Health 103,e43-51(2013))。由于流感B病毒只在人类中传播，因此有效的流感B病毒疫苗可以最终将流感B病毒从人类根除。类似于H1N1和H3N2亚型的传播，两种抗原性不同的流感B病毒(Yamagata和Victoria谱系)交替地在人类中传播，每年的趋势难以准确预测。对于每个季节流感病毒传播的易变性质而言，目前的季节性流感疫苗都是次优的。进一步地，尽管活减毒流感病毒(LAIV)因为能诱导体液和细胞免疫二者而具有优势，但由于对年幼儿童的安全性考虑以及对高龄组的不确定功效，目前可用的LAIV疫苗仅获得许可在2至49岁年龄组中使用。流感病毒NS1蛋白具有多种功能，并且是毒力的决定性因素，使得其缺失成为活疫苗研究的关注重点。然而，NS1缺失严重地影响病毒复制，使得难以产生用于疫苗应用的高滴度减毒病毒。

Talon等人，PNAS,97(8):4309-1314(2000)公开了流感B/201和B/234病毒变体的生长特征。流感B/201和流感B/AWBY/234(B/234)病毒是流感B/Yamagata/1/73的实验室变体，与野生型流感B/Yamagata的NS1 ORF相比，这些变体含有NS1 ORF中的变化。B/201或B/234的NS基因中的核苷酸缺失引起读框移位，从而导致生成缩短的NS1蛋白。流感B/201和B/234病毒NS1蛋白分别含有对应于B/Yamagata病毒NS1蛋白的N末端的110和89个氨基酸。尽管滴度低于B/Yamagata病毒，但B/201和B/234病毒二者都生长在6日龄的卵中。然而，虽然B/Yamagata病毒在8日龄的卵中生长同样良好，但在该年龄的胚胎中，其它两种病毒的生长明显降低。Talon等人，PNAS,97(8):4309-1314(2000)。

Hai等人，J.Virol.,82(21):10580-10590(2008)公开了流感B/Yamagata/88的流感B病毒截短突变体。为了生成不同的NS1截短突变体，通过使用pDZ质粒构建了总计三个流感B/Yamagata/88病毒NS1突变体：deltaNS1、NS1-80和NS1-110。流感B/Yamagata/88病毒NS1基因的编码区域的长度为846个核苷酸(对应于282个氨基酸)。在该片段中进行了对应于NS1 C末端的缺失和序列截短，从而产生了对NS1蛋白的氨基酸1至16(deltaNS1)、1至80(NS1-80)或1至110(NS1-110)进行编码的三种构建体。在这些构建体中，NEP(核输出蛋白)的开放阅读框没有改变。根据Hai等人，尽管deltaNS1病毒在Vero细胞中比在MDCK细胞中生长更高效，但在IFN缺乏型Vero细胞中以及在MDCK细胞中，突变病毒表现出比rWT病毒更低的峰值滴度。

Pica等人，J.Virol.,86(19):10293-10301(2012)公开了重组病毒表达的全长NS1蛋白(野生型[WT]PR8)或前126个氨基酸(NS1-126)。

开发更有效的针对流感B病毒疫苗的新型策略是有必要的，该疫苗具有提供广泛交叉保护活性的特性。

本发明的一个目的是提供更安全和更有效的活减毒流感B疫苗。

本发明的一个目的还是提供在流感疫苗产生系统中生成具有改进的复制能力的突变流感B病毒的方法。

本发明的进一步目的是提供对可用于疫苗应用的高滴度活减毒流感B病毒进行复制的方法。

本发明的进一步目的是提供在哺乳动物中引起针对流感病毒B的免疫应答的方法。

本说明书中已包括的关于文件、法案、材料、器械、物品等的任何讨论，不应因为其在本申请的每个权利要求的优先权日期之前已存在，就被认为是承认，任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者是与本公开相关的领域中的公知常识。

在整个本说明书中，单词“包含”或者如“包括”或“含有”等变体将被理解为是暗示包括所陈述的元件、整数、步骤或者元件组、整数组或步骤组，但并不排除任何其它元件、整数、步骤或者元件组、整数组或步骤组。

发明内容

提供了来自Victoria谱系的具有病毒毒力元件NS1(非结构蛋白1)缺失的活减毒流感病毒(LAIV)B“LAIVB”)，即LAVIB/DelNS1。LAIVB/DelNS1另外地包括片段3以及5-7中的适应性核苷酸突变(AM)，如下所述：PA(T210C)、NA T(1424C)、NP(C182T)和M(A281G)。这些突变在DNA序列中被突出显示。具有适应性突变的LAIB/DelNS1在本文中被称为AM/LAVIB/DelNS1。AM/LAVIB/DelNS1优选地不能在例如A549细胞等干扰素感受态细胞中复制，并且优选地在如低于37℃的温度、更优选地在30℃与33℃之间且最优选地在约33℃的低温下复制。在特别优选的实施方案中，公开的LAIVB的特征在于，当与其在MDCK细胞中于33℃的复制相比时，其在MDCK细胞中于37℃复制较差。在特别优选的实施方案中，突变的LAIVB/DelLNS1能够在例如卵或MDCK细胞等疫苗产生系统中以与相同株的野生型流感病毒相当的水平复制。例如，LAIVB/DelLNS1能够以大于10⁷空斑形成单位(pfu/ml)(例如，在10⁷-10⁸pfu/ml之间)的水平复制。

还公开了用于制备具有病毒毒力元件NS1蛋白的缺失和适应性突变的LAIVB(即AM/LAVIB/DelNS1)的方法，该适应性突变允许突变的株在疫苗产生系统(如卵和MDCK细胞)中生长。优选的病毒株包括B/Yamagata和B/Victoria。优选的适应性突变是Victoria株中的PA(T210C)、NA T(1424C)、NP(C182T)和M(A281G)。该方法包括(a)通过将DelNS1流感B病毒转染到一种或多种疫苗产生细胞中来生成具有NS1编码区域缺失的流感B病毒(b)拯救LAVIB/DelNS1以及(c)将拯救的病毒在一种或多种疫苗产生细胞中进行传代直到病毒滴度稳定，以获得AM/LAVIB/DelNS1。

公开的方法优选地包括反向遗传学。在特别优选的实施方案中，将含有缺失的NS1片段(DelNS1)以及衍生自流感B病毒株的其它七个基因组片段的质粒转染到293T/MDCK细胞混合物中。将拯救的病毒在MDCK细胞中进行传代，直到病毒滴度稳定，其中三次连续传代病毒滴度保持没有明显改变。如本文所用，没有明显改变是指包括无改变或无统计上显著改变的改变。对生长适应型DelNS1流感B病毒的全序列进行分析，并且鉴定获取的突变，如图1B所呈现。对病毒进行测序，以确定适应性突变。

还提供了药物组合物。该药物组合物包括根据所公开方法产生的所公开的免疫原性AM/LAVIB/DelNS1。该药物组合物通常包括有效量的病毒，以在给药至有需要的受试者时诱导该受试者中的免疫应答。该药物组合物可以包括另外的试剂，例如增强免疫应答的佐剂。在一些实施方案中，该药物组合物不包括佐剂。在一个实施方案中，该组合物包括来自Victoria谱系流感的有效量的AM/LAVIB/DelNS1，具有NS1缺失和片段3以及5-7中的突变如下：PA(T210C)、NA T(1424C)、NP(C182T)和M(A281G)。

还提供了通过将该药物组合物给药至有需要的受试者来治疗该受试者的方法。该方法可以是疫苗方案。因此，在一些实施方案中，将该药物组合物给药至受试者，以单独地提供针对病毒本身(例如，自身抗原)的预防性或治疗性保护，或与针对来自另一病毒、优选另一流感病毒A或B株的感染的保护组合提供。通过皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、口服或鼻内给药；或通过注射或通过吸入，将根据本文所公开方法生成的所公开的AM/LAVIB/DelNS1给药至有需要的哺乳动物。在其它方面，鼻内给药所述株。将AM/LAVIB/DelNS1给药至需要针对流感感染的保护性免疫的哺乳动物。

附图说明

图1A和1B示出了DelNS1流感B活减毒病毒疫苗的生成和表征。图1A是通过反向遗传学生成DelNS1-8308B流感B病毒的图示。将含有DelNS1片段以及衍生自B/Hong Kong/8038/2011(Victoria)病毒的其它七个基因组片段的pHW2000质粒转染到293T/MDCK细胞混合物中。将拯救的病毒在MDCK细胞中进行传代，直到病毒滴度稳定。图1B示出了生长适应型DelNS1-8308B流感B病毒中的鉴定的适应性突变。鉴定了PA(T210C)、NA T(1424C)、NP(C182T)和M(A281G)中的四种突变。

图2A至2D示出了对DelNS1病毒分别于37℃(图2A和2C)和33℃(图2B和2D)在MDCK(图2A和2B)和A549(图2C和2D)细胞中的生长动力学进行估算。DelNS1流感B病毒不能在A549细胞中复制，并且于37℃在MDCK细胞中复制不佳。然而，DelNS1流感B病毒能够在MDCK细胞中于33℃以与野生型流感B病毒相当的水平复制。

图3A和3B示出了DelNS1流感B疫苗在小鼠遭受致死性攻击之后的保护，其依据接种后的体重来测量。用DelNS1流感B疫苗(Victoria谱系，2x10⁶pfu)通过滴鼻剂对小鼠接种一次。三周后，用小鼠适应流感B病毒B/Florida/4/2006(Yamagata谱系，5x10⁵ TCID₅₀)(图3A)或B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系，5x10⁶ TCID₅₀)(图3B)中的任何一种对接种疫苗的小鼠进行攻击。持续2周记录小鼠的体重和存活率。图3C和3D示出了接种有DelNS1流感B疫苗或PBS并且受到B/Florida/4/2006(图3C)或B/Brisbane/60/2008(图3D)攻击的小鼠的存活百分率。

图4A和4B示出了在感染流感B小鼠适应病毒B/Florida/4/2006(图4A)或B/Brisbane/60/2008(图4B)后第3日，用DelNS1流感B活减毒疫苗和对照(PBS模拟接种)免疫的小鼠的肺中病毒滴度的比较。

发明详述

I.定义

材料

公开了材料、组合物和组分，它们可以用于所公开的方法和组合物、可以与其结合使用、可以在其的制备中使用或是其的产物。本文公开了这些和其它材料，并且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可以不明确地公开这些化合物的每种不同的单个和集体的组合和排列的具体引用，但在本文中每种组合和排列都得到了具体的考虑和描述。例如，如果公开和讨论了适体，并且讨论了可以对多个包括该适体的分子或组合物进行的多个修饰，则除非具体有相反的指示，否则该适体和这些修饰可能的每一种组合和排列都得到了具体的考虑。因此，如果公开了一类分子A、B和C，还公开了一类分子D、E和F以及组合分子的实例A-D，则即使没有单个地列举出每种组合，每种组合也都得到了单个或集体的考虑。因此，在该实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一种都得到了具体的考虑，并且应当被认为是根据A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D的公开内容而公开的。同样，还对这些的子集或组合进行了具体的考虑和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组得到了具体的考虑，并且应当被认为是根据A、B和C；D、E和F；以及实例组合A-D的公开内容而公开的。此外，如上所考虑和公开的材料、组合物、组分等中的每一种也可以具体地和独立地包括或不包括在此类材料的任何组、子组、列表、集合等中。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多个额外步骤，则应当理解，这些额外步骤中的每一个可以与所公开方法的实施方案的任何具体实施方案或组合一起进行，并且每种此种组合都得到了具体的考虑并且应当被认为是公开的。

如本文所用，术语“佐剂”是指增强免疫应答的化合物或混合物。

如本文所述，“减毒”是指弱化病原物(病原体)的程序。减毒病毒是一种弱化的、活力低的病毒。抗病毒性疾病的疫苗可以由该病毒的减毒低毒性株、能够刺激免疫应答并产生免疫力但不会引起疾病或不严重疾病的病毒制备。可以使用本领域技术人员已知的方法，通过对病原体进行化学处理、通过辐射或通过基因修饰来实现减毒。减毒可能导致增殖下降、附着于宿主细胞、或者毒素产生或强度下降。

如本文所用，“自体”意指衍生自自身的。

术语“儿童”意味着年龄在0个月至18岁之间的人或哺乳动物，并且“年幼儿童”是指年龄小于5岁的儿童。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或减轻所治疗的疾病状态中的一个或多个症状或以其它方式提供期望的药理学效果的用量。确切用量将根据如受试者因变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病和受试者年龄等多个因素而变化。

如本文所用，术语“基因”是指核酸(例如，DNA或RNA)序列，其包括产生多肽、RNA(例如，包括但不限于mRNA、tRNA和rRNA)或前体所必需的编码序列。多肽、RNA或前体可以由全长编码序列或其任何部分进行编码。该术语还涵盖结构基因的编码区域以及相邻于5'端和3'端二者上的编码区域定位的序列，在每端相邻约1kb的距离，使得该基因对应于全长mRNA的长度。术语“基因”涵盖可以由DNA或RNA构成的基因的cDNA和基因组形式二者。基因的基因组形式或克隆可能含有由被称为“内含子”或“干预区域”或“干预序列”的非编码序列中断的编码区域。内含子是被转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可能含有调控元件，如增强子。将内含子从核或初级转录物中去除或“拼接出来”；因此，信使RNA(mRNA)转录物中缺少内含子。在翻译期间，mRNA发挥功能以指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。

术语“免疫原性组合物”或“组合物”意味着该组合物可以诱导免疫应答并且因此具有抗原性。“免疫应答”意指通过免疫系统的任何反应。这些反应包括机体免疫系统响应于抗原的活性改变，并且可以涉及例如抗体产生、细胞介导免疫的诱导、补体激活、或免疫耐受的形成。

术语“鼻腔给药”是指任何形式的给药，由此将活性成分推进或以其它方式引入到受试者的鼻腔通道中，使得其接触鼻腔空腔的呼吸上皮，并从中被吸收到全身循环中。鼻腔给药还可以涉及接触定位在每个主要鼻腔通道的中央鼻腔中隔与侧壁之间的鼻腔空腔的顶部处的嗅上皮。紧紧围绕嗅上皮的鼻腔空腔区域没有气流。因此，通常必须采用专门的方法来实现嗅上皮上的显著吸收。

术语“口服”、“肠内”、“肠内地”、“口服地”、“非胃肠外”、“非胃肠外地”等是指通过沿消化道的路径或模式将化合物或组合物给药至个体。组合物“口服”给药途径的实例包括但不限于从口中吞咽液体或固体形式的疫苗组合物、通过鼻空肠或胃造口术管给药疫苗组合物、十二指肠内给药疫苗组合物、以及直肠给药(例如，使用释放本文描述的活细菌疫苗株的栓剂)。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人类和非人类二者，并且包括但不限于人类、非人类灵长类、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

术语“局部给药”是指将药物制剂施用于皮肤或粘膜(包括鼻、肺和口的表面膜)的外表面，使得制剂穿过皮肤或粘膜的外表面并且进入下面的组织。局部给药可以导致制剂在皮肤和周围组织中的有限分布，或者，当制剂通过血流从治疗区去除时，导致制剂的全身分布。在优选的形式中，通过透皮递送(例如，使用透皮贴剂)来递送制剂。透皮递送是指制剂在充当屏障且很少有制剂能够渗透的皮肤(角质层和表皮)上的扩散。与此相反，真皮对于许多溶质和药物的吸收是可渗透的，并且因此局部给药更容易通过擦掉或以其它方式剥离表皮来暴露真皮的皮肤而发生。在施用于皮肤之前，可以通过将活性制剂与油状承载物(如例如Remington's Pharmaceutical Sciences,current edition,Gennaro等人，eds.中所描述的例如乳膏、润肤剂、渗透增强剂等)组合来增强通过完整皮肤的吸收(一种被称为涂抹的过程)。

如本文所用，术语“肽”是指一类由化学地结合在一起的氨基酸构成的化合物。一般而言，氨基酸是经由酰胺键(CONH)化学地结合在一起的；然而，氨基酸可以通过本领域已知的其它化学键结合在一起。例如，氨基酸可以通过胺键结合。如本文所用，肽包括氨基酸寡聚体以及小肽和大肽，包括多肽。

如本文所用，“重组DNA”是指从不同来源提取且化学地连接在一起的DNA分子；例如，包括来自一个来源的基因的DNA可以与来自另一来源的DNA重组。重组DNA可以是所有异源DNA、或同源DNA与异源DNA的组合。重组DNA可以整合到细胞的染色体中并且从中表达，或者可以针对另外的染色体阵列(如质粒)而表达。

如本文所用，“变异的”或“突变的”多核苷酸或多肽与相应的野生型或亲本多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽序列相比，含有至少一个多核苷酸或多肽序列改变。突变可以是天然的、故意的或意外的。突变包括替换、缺失和插入。

II.组合物

提供了包括活减毒流感B(LAIVB)病毒的免疫原性组合物。该组合物是免疫原性的，因为它们可以用于引起针对一种或多种由LAIVB编码的抗原的免疫应答。LAIVB具有改进的安全性，这是由于其具有改善其在疫苗产生系统中的生长的NS1片段(DelNS1)编码区域缺失以及自适应突变(AM)。具有这些突变组合的流感B病毒在本文中被称为AM/LAVIB/DelNS1。实施例表明，即使当用最高剂量的病毒进行攻击时，AM/LAVIB/DelNS1病毒对小鼠也是没有毒性的(图3A和3B)。AM/LAVIB/DelNS1可以包括在用于给药的配制品中、包括在载体中、并且在一些实施例中与佐剂组合。佐剂可以用作载体。在一些实施方案中，含有所公开的AM/LAVIB/DelNS1的免疫原性组合物不包括佐剂。

A.活减毒病毒

流感B病毒基因组各自包含八个负义单链病毒RNA(vRNA)片段。两种病毒的最小vRNA片段编码非结构NS1蛋白。流感B病毒从病毒NS片段的非拼接转录物中表达281个氨基酸的非结构蛋白(被称为NS1-B)。所公开的LAIVB优选地包括LAIVB基因组中NS1编码区域完全缺失。AM/LAVIB/DelNS1可以是Yamagata或Victoria谱系。1988年至1989年期间，在用感染后的雪貂血清进行的血凝抑制试验中，发现了两种高度不同的B型流感抗原变体。这些病毒与B/Victoria/2/87(最近的参考株)或B/Yamagata/16/88(1988年5月在日本分离出的一种变体)在抗原上相关。1988年至1989年冬季流行期间，在美国分离出的所有流感B病毒与B/Victoria/2/87在抗原上相关。不同的流感B病毒株公开在Influenza ResearchDatabase中。Zhang等人，Nucleic Acids Research,Volume 45(D1):D466–D474,2017。

流感B病毒的八个片段(并且按长度递减顺序进行编号)(表1)。片段1、3、4和5中的每个片段只编码一种蛋白：PB2、PA、HA和NP蛋白。

表1.流感B病毒片段及其编码的蛋白

所有流感病毒均编码片段2上的聚合酶亚单位PB1。

本文公开的突变的流感B病毒包括NS1缺失和以下突变：PA(T210C)、NA(T1424C)、NP(C182T)和M(A281G)。所公开的LAIV B可以容易地与美国专利号8592196中描述的病毒区分开。

可以将类似的突变引入到其它流感B病毒的各别片段中；其片段序列已经被公开。例如，各种流感B病毒片段7核苷酸序列的GenBank登录号为：DQ792908.1(流感B病毒(B/Lee/40)冷适应M1蛋白(M1)和BM2蛋白(BM2)基因，完整cds)；M20175.1(流感B/Ann Arbor/1/66(冷适应)膜蛋白M1(片段7)RNA，完整cds)；CY018758.1(流感B病毒(B/Victoria/02/1987)片段7，完整序列)；CY018686.1(流感B病毒(B/Hong Kong/1434/2002)片段7，完整序列。

B.佐剂

所公开的LAIV可以与其它免疫调节剂(包括佐剂)结合给药。有用的佐剂包括但不限于下文中阐述的一种或多种：

含有佐剂组合物的无机物包括无机盐，如铝盐和钙盐。示例性无机盐包括氢氧化物(例如，羟基氢氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等、或不同无机化合物的混合物(例如，磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地具有过量的磷酸盐)，其中化合物采取任何适当形式(例如，凝胶、晶体状、非晶态等)，并且优选对盐的吸附。含有组合物的无机物也可以被被配制为金属盐颗粒(WO/0023105)。可以将铝盐包括在本发明的组合物中，使得Al³⁺的剂量为每剂量在0.2至1.0mg之间。

适合于用作本发明中佐剂的油乳状液佐剂可以包括角鲨烯-水乳状液，如MF59(5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85，使用微流控器配制成亚微米颗粒)。参见，例如，WO90/14837和Podda,Vaccine 19:2673-2680,2001。用于组合物的附加佐剂是亚微米水包油乳状液。本文中使用的亚微米水包油乳状液的实例包括任选地含有不同量的MTP-PE的角鲨烯/水乳状液，如含有4至5％w/v角鲨烯、0.25至1.0％w/v Tween 80(单油酸聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯)和/或0.25至1.0％Span 85(三油酸脱水山梨糖醇酯)、以及任选地N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-s--N-丙三基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳状液，例如，被称为“MF59”的亚微米水包油乳状液(国际公开号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325，通过引用以其整体并入本文。MF59可以含有4至5％w/v角鲨烯(例如，4.3％)、0.25至0.5％w/v Tween 80和0.5％w/v Span 85，并且任选地含有不同量的MTP-PE，使用如110Y型微流控器(Microfluidics,Newton,Mass.)等微流控器配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE可以以约0至500μg/剂量、或0至250μg/剂量、或0至100μg/剂量的量存在。亚微米水包油乳状液、制备其的方法、以及用于该组合物的免疫刺激制剂(如胞壁酰肽)详细地描述在国际公开号WO90/14837和美国专利号6,299,884和6,451,325中。

完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)也可以用作本发明的佐剂。

皂苷佐剂配制品也可以用作本发明的佐剂。皂甙是存在于多种植物物种的茎皮、叶、茎、根、甚至花中的甾醇糖甙和三萜糖苷的异源组。来自皂树(Quillaia saponariaMolina)的皂甙作为佐剂已被广泛研究。皂甙也可以商购于Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)和Saponaria officianalis(soap root)。皂甙佐剂配制品可以包括如QS21等纯化的配制品、以及如免疫刺激复合物(ISCOMs；参见下文)等脂质配制品。已使用高效薄层色谱法(HPLC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对皂甙组合物进行了纯化。已鉴定了用这些技术纯化的特定部分，其包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。产生QS21的方法公开在美国专利号5,057,540中。皂甙配制品还可以包含甾醇，如胆固醇(参见WO96/33739)。皂甙与胆固醇的组合物可以用来形成被称为ISCOMs的独特颗粒。ISCOMs通常还包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂甙都可以用于ISCOMs。例如，ISCOM可以包括Quil A、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOMs描述在EP0109942、WO96/11711和WO96/33739中。任选地，ISCOMs可以不含附加洗涤剂。参见WO00/07621。对基于皂甙的佐剂的发展的描述可以见于Barr等人，"ISCOMs and other saponinbased adjuvants",Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-27,1998。而且，可以见于Sjolander等人，"Uptake and adjuvant activity of orally delivered saponin andISCOM vaccines",Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338,1998。

病毒体和病毒样颗粒(VLPs)也可以用作佐剂。这些结构通常含有来自病毒的任选地与磷脂结合或一起配制的一种或多种蛋白。它们通常是非致病性的、非复制性的，并且通常不含有本地病毒基因组中的任何一种。病毒蛋白可以重组地产生或从全病毒中分离出来。适用于病毒体或VLPs的这些病毒蛋白包括衍生自以下各项的蛋白：流感病毒(如HA或NA)、肝炎B病毒(如核心蛋白或衣壳蛋白)、肝炎E病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、反转录病毒、诺沃克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA噬菌体、QB噬菌体(如外壳蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白pl)。

适于用作佐剂的细菌或微生物衍生物包括：(i)肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物；(ii)脂质衍生物，(iii)免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物，(iv)ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物。LPS单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰化MPL(3dMPL)的无毒衍生物的实例。3dMPL是3个脱-O-酰化单磷酰脂质A与4、5或6个酰化链的混合物。3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的“小颗粒”形式的实例公开在EP 0 689 454中。3dMPL的此类“小颗粒”小至足以通过0.22微米的膜而进行无菌过滤(参见EP 0 689 454)。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，例如，RC-529(Johnson等人，BioorgMed Chem Lett,9:2273-2278,1999)。脂质A衍生物的实例可以包括来自大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A的衍生物，如OM-174。例如，OM-174描述在Meraldi等人，"OM-174,a New Adjuvant with a Potential for Human Use,Induces a ProtectiveResponse with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310fromthe circumsporozoite protein ofPlasmodium berghei",Vaccine 21:2485-2491,2003；以及Pajak等人，"The Adjuvant OM-174induces both the migration and maturationof murine dendritic cells in vivo",Vaccine 21:836-842,2003中。含有CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸核苷酸序列(一种含有未甲基化胞嘧啶的序列，该胞嘧啶后接鸟苷并通过磷酸键连接)的实例。含有回文或多聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也已示出为具有免疫刺激性。

CpG's可以包括核苷酸修饰/类似物(如硫代磷酸修饰)，并且可以是双链的或单链的。任选地，鸟苷可以被类似物(如2'-脱氧-7-去氮鸟苷)替代。类似物替换的实例参见Kandimalla等人，"Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern:design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotideagents with distinct cytokine induction profiles",Nucleic Acids Research 31:2393-2400,2003；WO02/26757和WO99/62923。在Krieg,Nature Medicine(2003)9(7):831-835；McCluskie等人，FEMS Immunology and Medical Microbiology(2002)32:179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116以及美国专利号6,429,199中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效果。可以将CpG序列指向Toll样受体(TLR9)，如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等人，"Toll-like receptor 9:modulation ofrecognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs",BiochemicalSociety Transactions(2003)31(part 3):654-658。CpG序列可以特异性地用于诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或者其可以更特异性地用于诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。在Blackwell等人，J.Immunol.170:4061-4068,2003；Krieg,TRENDS in Immunology 23:64-65,2002；以及WO01/95935中讨论了CpG-A和CpG-B ODNs。在一些方面，可以构建CpG寡核苷酸，使得5'端易于受体识别。任选地，两个CpG寡核苷酸序列在它们的3'端处可以被附接，以形成“免疫体”。参见，例如，Kandimalla等人，BBRC 306:948-95,2003；Kandimalla等人，Biochemical Society Transactions 31:664-658,2003；Bhagat等人，"BBRC 300:853-861,2003；以及WO03/035836。细菌ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。例如，毒素可以衍生自大肠杆菌(E.coli)(即，大肠杆菌不耐热肠毒素(LT))、霍乱(CT)或百日咳(PTX)。脱毒ADP核糖基化毒素作为粘膜佐剂的用途描述在WO95/17211中，并且作为胃肠外佐剂的用途描述在WO98/42375中。在一些方面，佐剂可以是脱毒LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP核糖基化毒素及其脱毒衍生物(特别是LT-K63和LT-R72)作为佐剂的用途可以见于以下引用，其中每一个都通过引用以其整体明确地并入本文：Beignon等人，Infection and Immunity70:3012-3019,2002；Pizza等人，Vaccine 19:2534-2541,2001；Pizza等人，Int.J.Med.Microbiol 290:455-461,2003；Scharton-Kersten等人，,Infection and Immunity 68:5306-5313,2000；Ryan等人，Infection and Immunity 67:6270-6280,2003；Partidos等人，Immunol.Lett.67:09-216,1999；Peppoloni等人，Vaccines 2:285-293,2003；以及Pine等人，J.Control Release 85:263-270,2002。

生物粘合剂和粘液粘合剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂可以包括酯化透明质酸微球(Singh等人，J.Cont.Rel.70:267-276,2001)或粘液粘合剂，如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯醇吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。例如在WO99/27960中公开的壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂。

佐剂微颗粒：微颗粒也可用作佐剂。由可生物降解和/或无毒材料(例如，聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成的微颗粒(即直径约100nm至约150μm、或直径200nm至约30μm、或直径约500nm至约10μm的颗粒)，其中预想了聚(丙交酯-共-乙交酯)，任选地被处理成具有带负电荷的表面(例如，用SDS)或带正电荷的表面(例如用阳离子洗涤剂，如CTAB)。

适合用作佐剂的脂质体配制品的实例描述在美国专利号6,090,406、美国专利号5,916,588和EP 0 626 169中。

另外的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯。WO99/52549。此类配制品可以进一步包括与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(WO 01/21207)、以及与至少一种附加非离子型表面活性剂(如辛苯聚醇)组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)。在一些方面，聚氧乙烯醚可以包括：聚氧乙烯-9-月桂基醚醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-甾基醚、聚氧乙烯-8-甾基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚、或聚氧乙烯-23-月桂基醚。

用作佐剂的PCPP配制品描述例如在Andrianov等人，Biomaterials 19:109-115,1998.1998中。适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的实例可以包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-nor-胞壁酰基-1-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰基-1-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺基-1-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰基-s--n-丙三基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)。适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的实例可以包括进一步描述在Stanley,"Imiquimod and theimidazoquinolones:mechanism of action and therapeutic potential"Clin ExpDermatol 27:571-577,2002和Jones,"Resiquimod 3M",Curr Opin Investig Drugs 4:214-218,2003中的咪喹莫特及其同系物。适合用作本发明佐剂的人类免疫调节剂可以包括细胞因子，如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如，干扰素γ)、巨噬细胞集落刺激因子、以及肿瘤坏死因子。

佐剂组合物：佐剂作为组合物使用在优选的实施方案中。例如，佐剂组合物可以包括：皂甙和水包油乳状液(WO99/11241)；皂甙(例如，QS21)加无毒LPS衍生物(例如，3dMPL)(参见WO94/00153)；皂甙(例如，QS21)加无毒LPS衍生物(例如，3dMPL)加胆固醇；皂甙(例如，QS21)加3dMPL加IL-12(任选地加甾醇)(WO98/57659)；3dMPL与例如QS21和/或水包油乳状液的组合物(参见欧洲专利申请0835318、0735898和0761231)；SAF，其含有10％角鲨烷、0.4％Tween 80、5％Plronic嵌段聚合物L121、以及thr MDP，或微流控成亚微米乳状液或涡旋化以生成更大粒径乳状液。含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80、以及一种或多种细菌细胞壁组分的Ribi佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，该细菌细胞壁组分来自由单磷酰基脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成的组，优选MPL+CWS(Detox)；以及一种或多种无机盐(如，铝盐)加LPS无毒衍生物(如3dPML)。

铝盐和MF59是用于可注射流感疫苗的佐剂的实例。细菌毒素和生物粘合剂是用于粘膜递送疫苗(如鼻腔疫苗)的佐剂的实例。可以使用本领域公知的技术来配制上述所有佐剂以及本领域普通技术人员普遍已知的其它佐剂，以用于鼻内给药。

C.配制品和载体

本发明的组合物可以被配制成药物组合物。除一种或多种毒株之外，这些药物组合物还可以包含药物上可接受的赋形剂、载体、缓冲液、稳定剂、或本领域普通技术人员熟知的其它材料。此类材料通常应该是无毒的，并且通常不应该干扰活性成分的功效。载体或其它材料的确切性质可以取决于给药途径，如口服、静脉内、皮肤或皮下、鼻腔、肌内或腹膜内途径。

用于口服给药的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可以包括固体载体(如明胶)或佐剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇(如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。术语“载体”是指用于给药药物组合物(例如，免疫原性或疫苗配制品)的稀释剂、佐剂、赋形剂或承载物。盐溶液、以及水性葡萄糖和丙三醇溶液也可以用作液体载体，特别是可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、粉状物、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂乳粉、丙三醇、乙醇等。合适的药物载体的实例描述在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。应该根据给药模式选择配制品。

对于静脉内、皮肤或皮下注射、或疼痛位点注射，活性成分将以于胃肠外可接受的水溶液的形式存在，该水溶液不含热原，并且具有合适的pH值、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员将能够很好地使用例如等渗承载物(如氯化钠注射液、林格注射液或乳酸钠林格注射液)来制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其它添加剂。

优选地以“治疗有效量”或“预防有效量”(尽管预防可以被认为是治疗，但视情况而定)给药，这足以示出对个体的益处。实际给药量、给药率和给药时间进程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。拟定治疗方案(例如，决定剂量等)是全科医师和其它医生的责任，并且通常要考虑要治疗的疾病、个体患者的症状、递送位点、给药方法、以及医师已知的其它因素。上述技术和方案的实例可以见于最新版的Remington's PharmaceuticalScience,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(“Remington's”)。

III.制备方法

提供工程化改造AM/LAVIB/DelNS1病毒的方案。该方案包括(a)通过将八种质粒(优选pHW2000质粒)转染到一种或多种疫苗生产细胞中，生成NS1基因的编码区域从其基因组去除的流感B病毒，其中该八种质粒含有DelNS1流感B病毒的基因组，包括表达NS1蛋白的质粒(b)拯救LAVIB/DelNS1病毒(c)将拯救的病毒分别在33℃和37℃传代到一种或多种疫苗生产细胞中，直到病毒滴度稳定(例如，当病毒滴度连续三代保持不变时)，以获得AM/LAVIB/DelNS1，以及(c)对期望突变的存在进行分析。

对生长适应型DelNS1流感B病毒的全序列进行分析并且将其与亲本株的序列进行比较，鉴定获取的突变。将NS1基因的编码区域从病毒基因组中去除，而不影响用于病毒复制的其它必需基因的表达(如图1A所示)。在优选的实施方案中，将步骤b中的病毒在两种或更多种细胞(例如，293T/MDCK细胞)的混合物中进行培养。用于制备LAIVB的所公开的方法导致病毒毒力元件NS1蛋白缺失和适应性突变，该适应性突变允许突变的株在疫苗产生系统(如卵和MDCK细胞)中生长。优选的适应性突变是PA(T210C)、NA T(1424C)、NP(C182T)和M(A281G)突变。所公开的方法优选地包括反向遗传学。将含有缺失的NS1片段(DelNS1)以及衍生自流感B病毒株的基因组片段的其它七个质粒转染到293T/MDCK细胞混合物中。优选的病毒株包括B/Yamagata和B/Victoria拯救病毒，将其在MDCK细胞中进行传代直到病毒滴度稳定，直到获得高水平的病毒滴度并且至少连续三代保持不变。对病毒进行测序以确定适应性突变。

可以使用本领域已知的方法去除NS1基因的编码区域。将靶向突变引入到基因组中或在病毒学背景下引入到病毒中的方法归结在术语反向遗传学(RG)下，并且例如在Hoffmann等人，Proc Natl Acad Sci USA,97(11):6108-13 Zheng等人，J.Virol.89(20):10273-85和Dauber等人，J.Virol.,78(4):1865-1872(2004)中描述,其材料和方法通过引用并入本文。本文概括和总结了如Dauber等人所公开的生成具有NS1编码区域缺失的流感病毒的方法。

生成去除NS1基因的编码区域的流感B病毒

RT-PCR及质粒的构建

可以根据制造商的方案使用RNeasy试剂盒(Qiagen)，以从流感B病毒库存中提取病毒RNA。通过反转录酶PCR(RT-PCR)扩增单个病毒RNA片段以及将所得cDNAs克隆到质粒pHW2000中，构建八种反向遗传质粒：pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA、pHW-M1和pHW-NS1(表1)。所有八种质粒都可以用于生成野生型流感B病毒。PCR扩增中使用的引物在以下表2中列出：

表2

Flub-pb1-lic-S(SEQ ID NO：9)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCGGAGC
		Flub-pb1-lic-as(SEQ ID NO：10)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACACGAGC
Flub-pb2-lic-S(SEQ ID NO：11)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCGGAGC
		Flub-pb2-lic-as(SEQ ID NO：12)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACACGAGC
Flub-pa-lic-S(SEQ ID NO：13)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCGGTGC
		Flub-pa-lic-as(SEQ ID NO：14)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACACGTGC
Flub-ha-lic-S(SEQ ID NO：15)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCAGAGC
		Flub-ha-lic-as(SEQ ID NO：16)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC
Flub-na-lic-S(SEQ ID NO：17)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCAGAGC
		Flub-na-lic-as(SEQ ID NO：18)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC
Flub-np-lic-S(SEQ ID NO：19)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCACAGC
		Flub-np-lic-as(SEQ ID NO：20)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAACAGC
Flub-m-lic-S(SEQ ID NO：21)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCACGCACTT
		Flub-m-lic-as(SEQ ID NO：22)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGAAACAACGCACTT
Flub-ns-lic-S(SEQ ID NO：23)	CcgaagttgggggggAGCAGAAGCAGAGGATT
		Flub-ns-lic-as(SEQ ID NO：24)	GGCCGCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGGATT
Flub-delns1-F(SEQ ID NO：25)	CTCAAT TT GTGTTGTGGTC ATG
		Flub-delns1-R(SEQ ID NO：26)	TGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTC

流感B病毒NS1蛋白的编码区域与从病毒NS基因片段的移接转录物中表达的NEP/NS2蛋白的阅读框部分地重叠。为了生成NS1缺乏型流感病毒，制备了NS反向遗传质粒的衍生物(被称为pHW-Lee-ΔNS1-B)，其中使指定NS1蛋白的序列缺失，而保留所有NEP/NS2编码序列和末端非编码区域。例如，为了生成pHW-DelNS1-B质粒，通过使用用于RT-PCR扩增的Oligotex direct mRNA Midi/Maxi Kit(Qiagen)和NS片段特异性引物，从流感B病毒感染的MDCK细胞中提取聚腺苷酸化RNA。用QiaEx II凝胶提取试剂盒(Qiagen)对扩增的NEP/NS2片段进行纯化，用BsmBI消解，并且克隆到pHW2000中。

这些质粒促进了负义病毒RNAs和正义mRNAs的双向转录，因为所克隆的病毒cDNAs的上游侧接有人类RNA聚合酶I启动子，并且下游侧接有RNA聚合酶II特异性启动子。简而言之，通过使用与所有八个病毒RNA片段的保守3′端互补的通用性九核苷酸引物(UNI-9)、首先用Moloney鼠源性白血病病毒反转录酶(Promega)对病毒RNAs进行反转录。在37℃下进行RT反应60分钟，然后在70℃下进行15分钟。随后，通过PCR来扩增单个基因片段，该PCR使用Pfu Turbo聚合酶(Roche Diagnostics)以及在5′端处携带BsmBI(PB1、PB2、PA、NA、M和NS)、BspMI(NP)或AarI(HA)限制位点序列的片段特异性引物。pHW-NS-Xho是pHW-NS的衍生物，其是用QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)、通过在病毒NS片段的核苷酸262至267处引入新型XhoI识别位点来构建的。将转染病毒的NS片段工程化改造成携带经工程化改造的遗传标记位点，使得相应的cDNA易于被限制性内切酶XhoI切割，从而验证分离物的重组性质。

重组流感B病毒的转染介导回收。

为了生成重组流感B野生型病毒，将八种质粒pHW-PB2、pHW-PB1、pHW-PA、pHW-HA、pHW-NP、pHW-NA、pHW-M和pHW-NS-XhoI(每种0.5μg)用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染到悬浮的10⁶ 293T细胞中。在转染后72小时，将转染细胞的上清液接种到11日龄鸡卵的尿囊腔中，以增长重组病毒的库存。可以将携带突变质粒的转染细胞上清液传代到6日龄鸡卵中。可以通过对表示病毒NS片段的RT-PCR产物进行凝胶电泳分析来验证重组流感B病毒的回收。

优选地将质粒转染到细胞(例如，293T/MDCK细胞)的混合物中，以增长重组病毒的库存。图1A除了将pHW-NS-XhoI由pHW-ΔNS1-B替代并且将0.5μg的NS1表达载体(例如，pcDNA-NS1)添加到转染混合物中以外，可以通过基本上相同的程序来拯救DelNS1病毒。为了构建质粒pcDNA-NS1-B，可以用pHW-leen-NS作为模板对NS1 cDNA进行PCR扩增，并且将其在pcDNA3的HindIII/XhoI位点之间进行克隆。

公开在Dauber等人，J.Virol.,78:1865-1872(2004)中的完全缺乏NS1 ORF的流感B病毒在Vero细胞中未有效地复制(分别地，使用0.1的moi且滴度为1.7-2.5*10²FFU/ml，在moi为0,001时没有可检测出的滴度)。由氨基末端的16个氨基酸组成的流感B NS1缺失突变体在复制中也高度地减毒，最大滴度为大约10⁴FFU/ml。(Hai等人；Journal of Virology；November 2008,p.10580-90)

培养拯救的病毒以获得具有与野生型相当的生长的流感B病毒

在病毒产生细胞中对拯救的DelNS1病毒进行培养，直到病毒滴度稳定，稳定的证据为在MDCK细胞和卵中至少三次连续传代病毒滴度保持不变。参照图1A，收集72小时后的转染细胞上清液并且将其在MDCK细胞中进行传代。

用于传代的优选细胞是MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞。然而，用于使用培养基培养病毒的细胞可以是可在合成培养基中体外生长且可用于病毒繁殖的细胞。这些可以是例如BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠源性细胞、人类细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0、PerC6(人类视网膜细胞)、鸡胚细胞或衍生物、含胚卵细胞、含胚鸡卵或其衍生物。

用于产生病毒的培养基可以是现有技术中已知的适用于病毒培养的任何培养基。优选的培养基是合成培养基。这可以是例如基础培养基，如改良的Eagle培养基MEM、最小必需培养基MEM、Dulbecco改良的Eagle培养基D-MEM、D-MEM-F12培养基、William’s E培养基、RPMI培养基及其类似物和衍生物。这些也可以是专门的细胞培养和病毒生长培养基，如VP-SFM、OptiPro^TM SFM、AIM培养基、HyQ SFM4 MegaVir^TM、EX-CELL^TM Vero SFM、EPISERF、ProVero、任何293或CHO培养基及其类似物和衍生物。这些培养基可以补充有现有技术中已知的适用于细胞和病毒培养的任何添加剂，例如，动物血清及其部分或类似物、氨基酸、生长因子、激素、缓冲剂、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸钠、维生素、L-谷氨酰胺和生物缓冲液。优选的培养基是补充有L-谷氨酰胺和胰蛋白酶的OptiPRO^TM SFM。

因此，所公开的方法包括对病毒进行培养达有效量的时间以获得稳定的病毒滴度。在优选的实施方案中，将拯救的病毒在病毒产生细胞(例如，MDCK细胞)中传代一段时间，直到连续传代3次病毒滴度保持不变。该培养期可以在10至50次传代的范围内，优选地，在33℃下20次传代以上。培养的时间和条件导致适应性突变，这允许LAIVB在疫苗产生系统(如蛋或MDCK)中进行复制。

实施例展示了PA(T210C)、NA(T1424C)、NP(C182T)和M(A281G)中的突变，这些突变支持在用于被测试病毒株的鸡胚卵或疫苗生产细胞系MDCK细胞中的DelNS1流感B病毒复制(图1B)。具有适应性突变的DelNS1流感B活减毒病毒能够在疫苗产生系统(卵或MDCK细胞)中复制到与野生型病毒相当的水平(图2B)。DelNS1活减毒不能在干扰素感受态细胞A549中复制。这是一种安全属性，可以防止接种疫苗的人感染病毒(图2C和2D)。DelNS1流感B病毒优选在较低的温度(如模拟上呼吸道的33℃)下复制，但复制在模拟下呼吸道的37℃(图2C)受到限制。用作人类疫苗的DelNS1流感B病毒的该属性是附加安全特性(图2C)。

IV.使用方法

所公开的AM/LAVIB/DelNS1可以用于在需要其的受试者中有效地增加病毒滴度或引起免疫应答。在一些方面，受试者可以包括老年人(例如，大于65岁)、年幼儿童(例如，小于5岁)。用于使用佐剂型配制品改进儿童免疫应答的方法公开例如在美国公开号2017/0202955中。

通常可以直接将LAIVB给药至需要其的哺乳动物，以增加该哺乳动物中的病毒滴度并引发免疫应答。实施例表明，流感B疫苗的一个谱系(Victoria谱系)的免疫，能够保护小鼠免受小鼠适应型流感B病毒的Victoria或Yamagata谱系的致死性攻击(图3A和3B)。

通常以药物组合物的形式将病毒给药至需要其的患者中。含有病毒的药物组合物可以用于全身或局部给药。可以配制用于通过胃肠外(肌内(IM)、腹膜内(IP)、静脉内(IV)或皮下注射(SC))、或透粘膜(鼻腔、阴道、肺或直肠)给药途径给药的剂型。在最优选的实施方案中，通过鼻内或通过肌内注射外周地递送免疫病毒，并且通过局部注射递送治疗性病毒。

可以通过胃肠外注射(例如，皮下地、腹膜内地、皮内、静脉内地、肌内地、或至组织的间质空间)、或粘膜给药(如通过直肠、口服(例如片剂、喷剂)、阴道、局部、透真皮(参见例如WO99/27961)或透皮(参见例如WO02/074244和WO02/064162)、吸入、鼻内(参见例如WO03/028760)、眼、耳、肺或其它粘膜给药)来实现直接递送。还可以通过直接转移将组合物局部给药至皮肤表面。可以在不采用任何器械的情况下、或通过采用绷带或绷带样器械使裸皮肤与组合物接触来实现局部给药(参见，例如美国专利号6,348,450)。在一些方面，给药模式是胃肠外的、粘膜的、或粘膜免疫与胃肠外免疫的组合。在其它方面，给药模式是胃肠外的、粘膜的、或相距1至3周总计接种1至2次的粘膜免疫与胃肠外免疫的组合。在相关方面，给药途径包括但不限于鼻内递送。

1.有效量

通常以有效量给药组合物，以诱导对由病毒编码的一种或多种抗原的免疫应答。例如，有效量的病毒通常导致产生杀死或限制病毒的增殖或感染的抗体和/或活化的T细胞。

组合物通常可以用于引起全身和/或粘膜免疫，例如引起增强的全身和/或粘膜免疫。例如，免疫应答可以通过诱导血清IgG和/或肠内IgA免疫应答来表征。通常，针对流感感染的保护水平可以为50％以上，例如，60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一个方面，保护水平可以为100％。

本发明诱导的免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2应答中的一种或两种。免疫应答可以是改进的或增强的或改变的免疫应答。免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答中的一种或两种。例如，免疫应答可以是增强的全身和/或粘膜应答。增强的全身和/或粘膜免疫反映在增强的TH1和/或TH2免疫应答中。例如，增强的免疫应答可以包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生增加。在另一方面，粘膜免疫应答可以是TH2免疫应答。例如，粘膜免疫应答可以包括IgA产生增加。

通常，活化TH2细胞增强抗体产生，并且因此在应对细胞外感染方面具有价值。活化TH2细胞通常可以分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答还可以导致产生IgG1、IgE、IgA和/或记忆B细胞，以用于未来的保护。一般而言，TH2免疫应答可以包括与TH2免疫应答相关联的一种或多种细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)增加或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产生增加中的一种或多种。例如，增强的TH2免疫应答可以包括IgG1产生增加。TH1免疫应答可以包括CTLs增加、与TH1免疫应答相关联的一种或多种细胞因子(如IL-2、IFN-γ和TNF-α)增加、活化巨噬细胞增加、NK活性增加或IgG2a产生增加中的一种或多种。例如，增强的TH1免疫应答可以包括IgG2a产生增加。

LAIVB株可以单独地或与其它制剂组合使用，任选地与能够引起Th1和/或Th2应答的免疫调节剂组合使用。

2.剂量

确切剂量将根据如受试者因变量(例如，年龄、免疫系统健康等)以及要治疗的受试者的年龄等多个因素而变化。考虑到接受者的治疗背景、年龄和总体健康，适当的剂量可以由本领域技术人员来确定。所选择的剂量取决于期望的治疗效果、给药途径和期望的治疗持续时间。在确定为预防而要给药的病毒的有效量时，医师可以评估循环血浆中的病毒水平和/或针对抗原的现有抗体的产生。活性病毒也可以根据空斑形成单位(PFU)来测量。空斑形成单位可以被定义为在单层细胞培养中、在覆盖条件下、由单个病毒颗粒感染引发的细胞溶解(CPE)的区域。一般地，给药至人类的病毒的剂量水平在10²至10¹²pfu之间。在不同的实施方案中，剂量范围为10⁴至10¹⁰pfu、10⁵至10⁹pfu、10⁶至10⁸pfu、或这些所陈述范围内的任何剂量。当要给药一种以上疫苗(即以组合疫苗的形式)时，每种疫苗制剂的量可以在其所描述的范围内。

通常以液体悬浮液的形式给药病毒，取决于给药途径，其体积范围在10μl至100μl之间。普遍应用的疫苗体积范围为0.1mL至0.5mL。一般地，与全身给药或输注相比，局部注射的剂量和体积将会更低。

可以以单剂量或多剂量格式给药疫苗组合物。疫苗可以在给药前数小时或数天用佐剂制备，但需确定稳定缓冲液和合适的佐剂组合物。通常，局部给药的剂量为100μl多剂量，而经由皮下、肌内、器官内、静脉内或鼻内给药的全身或区域给药可以为例如10至100μl。

V.试剂盒

还提供包括所公开的LAIVB的试剂盒。试剂盒可以包括含有合适载体、稀释剂或赋形剂的单独容器，另外，试剂盒可以包括用于混合或组合成分和/或给药的说明书。组合物可以是液体形式或者可以是冻干的。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(包括玻璃或塑料)形成。容器可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉输液袋或小瓶)。

试剂盒可以进一步包括第二容器，该第二容器包含药物上可接受的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。该第二容器还可以含有可用于最终用户的其它材料，其包括其它药物上可接受的配制溶液(如缓冲液、稀释剂)、过滤器、针、以及注射器或其它递送器械。试剂盒可以进一步包括包含佐剂的第三组分。

试剂盒还可以包括药品说明书，该药品说明书含有诱导免疫、预防感染或治疗感染的方法的书面指导。该药品说明书可以是未经批准的药品说明书草案，或可以是Foodand Drug Administration(FDA)或其它监管机构批准的药品说明书。

本发明还提供预充满有本发明组合物的递送器械。

组合物通常被配制为无菌的、基本上等渗的、并且完全符合U.S.Food and DrugAdministration的所有良好生产规范(GMP)规定。

实施例

材料和方法

细胞和病毒

B/HK/8038/11株从Queen Mary Hospital获得，DelNS1 B/HK/8038/11的全基因组序列已登记在GenBank中，登录号为MH636851-MH636858。所有细胞系从ATCC获得。将人胚肾细胞(293T)和肺腺癌细胞(A549)保持在补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素(Life Technologies)的Dulbecco最小必需培养基(DMEM)中。将犬MDCK细胞在补充有等量血清和抗生素的Eagle最小必需培养基(MEM)中进行培养。通过反向遗传学拯救流感B病毒B/HK/8038/11。根据本文和先前报告(Zheng等人，J.Virol.,89:10273-10285(2015))中描述的方案构建B DelNS1(Flu B)LAIVs并对其进行拯救。对病毒基因片段进行扩增并将其克隆到pHW2000质粒中，得到八种pHW2000质粒，这些质粒被转染到293T/MDCK细胞中。将拯救的病毒在MDCK细胞或鸡胚卵中进行扩增。

质粒的构建

如之前所描述(Zheng等人，J.Virol.,89:10273-10285(2015))，构建NS1缺失质粒pHW2000-DelNS1。使用pHW2000-8038-NS(流感B)质粒作为模板，进行反向PCR以使NS1基因缺失。然后使用标准方案对PCR产物进行凝胶纯化、磷酸化和自连接。流感B DelNS1 424反向PCR的引物是5’-CTCAAT TT GTGTTGTGGTC ATG-3’(SEQ ID NO：25)(Flub-DelNS1-F)和5’-TGGAGGATGAAGAAGA TGGCCATCGG ATCCTC-3’(SEQ ID NO:26)(Flub-DelNS1-R)。

实施例1.DelNS1流感B活减毒病毒疫苗的生成和表征。

在这些实验中使用临床分离物B/Hong Kong/8038/2011，其通过序列分析被证实为Victoria谱系。将NS1基因的编码区域从病毒基因组中去除，而不影响用于病毒复制的其它必需基因的表达(图1A)。

将含有DelNS1片段和其它7个流感病毒片段的八种pHW2000质粒与NS1表达质粒一起转染到293T/MDCK细胞混合物中并孵育过夜。将DNA混合物去除，并且添加补充有1μg/mlN-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(Sigma)的MEM。72小时后收集病毒上清液并且将其指定为第0代(P0)病毒，并且随后在MDCK细胞或鸡胚卵中进行传代。

从在37℃转染72小时的293T细胞中获得的初始拯救的DelNS1-8308B流感B病毒仅在MDCK细胞或卵中复制不佳。将拯救的病毒于33℃在MDCK细胞中传代10次。对于所有DelNS1病毒，NS1基因的缺失通过RT-PCR和测序来证实。将拯救的病毒(DelNS1-8308B流感B病毒)分别于33℃和30℃在MDCK细胞中传代20次以上，直到病毒滴度稳定，其测量标准为三次连续传代病毒滴度保持不变。在此之后，对生长适应型DelNS1-8308B流感B病毒中的适应性突变进行鉴定。对PA(T210C)、NA T(1424C)、NP(C182T)和M(A281G)中的四种突变进行鉴定。命名为流感B病毒DeINS1-B8038HK的DelNS1-8308B流感B病毒已保藏在美国典型培养物保藏中心，并且其ATCC保藏号为PTA-125209。

实施例2.DelNS1流感B病毒在MDCK和A459细胞中的生长特性

分别于37℃和33℃对DelNS1病毒在MDCK和A549细胞中的生长动力学进行估算。使接种在24孔板上的汇合细胞(A549或MDCK)以指定的感染复数(MOI)感染病毒。吸附1小时之后，将病毒上清液去除，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，然后用含有1μg/ml TPCK胰蛋白酶的MEM覆盖，并且在指示的温度下孵育。在不同的时间点收集上清液447份，并且通过MDCK细胞的空斑测定来确定滴度。

空斑测定：将病毒连续稀释10倍，并且添加到6孔板上的融合MDCK细胞中，然后在37℃下孵育1小时。将上清液去除，并且用PBS洗涤细胞两次，然后用含有1μg/ml TPCK胰蛋白酶的1％MEM琼脂糖覆盖。将板在33℃下孵育48小时，然后用10％PBS缓冲甲醛溶液固定至少2小时。用1％结晶紫溶液染色来使空斑可视化。

具有适应性突变的DelNS1流感B活减毒病毒能够在疫苗产生系统(卵或MDCK细胞)中复制到与野生型病毒相当的水平(图2A)。DelNS1活减毒不能在干扰素感受态细胞A549中复制。这是一种安全属性，可以防止接种疫苗的人中的病毒脱落(图2B)。

对携带适应性突变的DelNS1-8308B流感B病毒于33℃和37℃在MDCK细胞中的生长动力学进行分析。DelNS1流感B病毒优选在较低的温度(如模拟上呼吸道的33℃)下复制，但复制在模拟下呼吸道的37℃受到限制。用作人类疫苗的DelNS1流感B病毒的该属性是附加安全特征(图2B)。

实施例3.DelNS1流感疫苗对小鼠适应型流感B病毒致死性攻击的保护

用DelNS1流感B疫苗(Victoria谱系，2x10⁶pfu)通过滴鼻剂对小鼠接种一次。

三周后，用小鼠适应流感B病毒B/Florida/4/2006(Yamagata谱系，5x10⁵TCID₅₀)和B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系，5x10⁶ TCID₅₀)中的任何一种对接种疫苗的小鼠进行攻击。持续2周记录小鼠的体重和存活率。根据动物伦理准则，体重减轻超过25％的小鼠被实施安乐死。为了评估小鼠肺中的病毒复制，在第3天收集肺并在1ml PBS中进行均质化。通过MDCK细胞的空斑测定来确定病毒滴度。

即使当用最高剂量的病毒进行攻击时，DelNS1流感B病毒对小鼠也是没有毒性的(图3A和3B)。为了评估DelNS1-B8038(一种Victoria谱系流感B病毒)是否能够保护免受流感B病毒的两种谱系的感染，通过鼻腔途径对小鼠免疫一次，然后在三周后，用Yamagata(B/Florida/4/2006)或Victoria(B/Brisbane/60/2008)谱系的小鼠适应型流感B病毒进行攻击。模拟接种PBS的小鼠在6至8天后死亡，而所有DelNS1-B8038 LAIV免疫小鼠都存活(图3C和3D)。与对照组相比，在感染后第三天，接种DelNS1-B8038 LAIV的小鼠的肺部病毒滴度显著降低(图4A和B)。流感B活减毒DelNS1的一个谱系的免疫，即Victoria谱系的DelNS1-B8038，能够保护小鼠免受小鼠适应型流感B病毒的Victoria或Yamagata谱系的致死性攻击(图3A至3D)。

应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能会变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制仅由所附权利要求限制的本发明范围。

应当注意，如本文和所附权利要求所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。因此，例如，对“适体”的引用包括多个此类适体，对“该适体”的引用是对本领域技术人员已知的一个或多个适体及其等效物的引用，如此等等。

在本说明书的整个描述和权利要求中，单词“包含(comprise)”以及该单词的变体(如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”)意指“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或材料可能会或可能不会发生或存在，而且描述包括事件、情况或材料发生或存在的例子以及事件、情况或材料不发生或不存在的例子。

在本文中，范围可以表达为从“约”一个具体值和/或至“约”另一具体值。当表达此种范围时，除非上下文另有明确指示，否则还特别地考虑到和预期到公开了从一个具体值和/或至其它具体值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”而将值表达为近似值时，将理解的是，除非上下文另有明确指示，否则具体值形成应被认为是公开的另一明确考虑的实施方案。将进一步理解的是，除非上下文另有明确指示，否则每个范围的端点相对于其它端点以及独立于其它端点都是显著的。应当理解，除非上下文另有明确指示，否则含在明确公开的范围内的所有单个值以及值的子范围也被明确地考虑并且应当被认为是公开的。最后，应当理解，所有范围是指所列举的范围作为从第一端点(包括第一端点)至第二端点(包括第二端点)的单个数字的范围和集合二者。在后者的情况下，应当理解，可以选择单个数字中的任何一个作为范围所指的数量、值或特征中的一种形式。以该方式，范围描述了从第一端点(包括第一端点)至第二端点(包括第二端点)的一组数字或值，从中可以选择该组的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确地公开了这些实施方案中的一些或所有，前述内容都适用。

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本方法和组合物的实践或测试中可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但如所描述的是特别有用的方法、器械和材料。本文引用的出版物及其引用的材料在此通过引用明确地并入。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明提前公开。不承认任何引用构成现有技术。对引用的讨论陈述了作者的主张，并且申请人保留对所引用文献的准确性和相关性提出质疑的权利。应当清楚地理解，尽管本文引用了许多出版物，但是此种引用并不构成对这些文件中的任何一个形成本领域公知常识的一部分的承认。

尽管对材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但这不应被解释为、并且不是承认此类选项和替代方案彼此等效或者特别是明显的替代方案。因此，例如，不同部分的列表并不指示所列部分彼此明显，也不指示承认等效性或明显性。

序列表

<110> 香港大学

<120> 活减毒流感B病毒组合物及其制备和使用方法

<130> FPCH18160103P

<160> 26

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 2426

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 1

agtactggtc gacctccgaa gttggggggg agcagaagcg gagcgttttc aagatgacat 60

tggccaaaat tgaattgtta aaacaactgc taagggacaa tgaagccaaa acagttttga 120

agcaaacaac agtagaccaa tataacataa taagaaaatt caatacatca aggattgaaa 180

agaatccttc actaaggatg aagtgggcca tgtgttctaa ttttcccttg gctctaacca 240

agggcgatat ggcaaacaga atccccttgg aatacaaagg gatacaactc aaaacaaatg 300

ctgaagacat aggaaccaaa ggccaaatgt gctcaatagc agcagttact tggtggaata 360

catatggacc aataggagat actgaaggtt tcgaaagggt ctacgaaagc ttttttctca 420

gaaaaatgag acttgacaac gccacttggg gccgaataac ttttggccca gttgaaagag 480

tgagaaaaag ggtactgcta aaccctctca ccaaggaaat gcctccggat gaggcgagca 540

atgtgataat ggaaatattg ttccctaaag aagcaggaat accaagagaa tccacttgga 600

tacataggga actgataaaa gaaaaaagag aaaaattgaa aggaacaatg ataactccaa 660

tcgtactggc atacatgctt gaaagagaac tggttgctcg aagaagattc ttgccagtgg 720

caggagcaac atcagctgag ttcatagaaa tgctacactg cttacaaggt gaaaattgga 780

gacaaatata tcacccagga gggaataaat taactgagtc caggtctcaa tcaatgatag 840

tagcttgtag aaaaataatc agaagatcaa tagtcgcttc aaacccactg gagctagctg 900

tagaaattgc aaacaagact gtgatagata ctgaaccttt aaagtcatgt ctggcagcca 960

tagacggagg tgatgtagct tgtgacataa taagagctgc attaggacta aagatcagac 1020

aaagacaaag atttggacgg cttgagctaa aaagaatatc aggaagagga ttcaaaaatg 1080

atgaagaaat attaataggg aacggaacaa tacagaagat tggaatatgg gacggggaag 1140

aggagttcca tgtaagatgt ggtgaatgca ggggaatact aaaaaagagt aaaatgaaac 1200

tggaaaaact actgataaat tcagccaaaa aggaggatat gagagattta ataatcttat 1260

gcatggtatt ttctcaagac actaggatgt tccaaggggt gagaggagaa ataaattttc 1320

ttaatcgagc aggccaactt ttatctccaa tgtaccaact ccaacgatat tttttgaata 1380

gaagcaacga cctttttgat caatgggggt atgaggaatc acccaaagca agtgaactac 1440

atgggataaa tgaatcaatg aatgcatctg actatacatt gaaagggatt gtagtgacaa 1500

gaaatgtaat tgacgacttt agctctactg aaacagaaaa agtatccata acaaaaaatc 1560

ttagtttaat aaaaaggact ggggaagtca taatgggagc taatgacgtg agtgaattag 1620

aatcacaagc acagctgatg ataacatatg atacacctaa aatgtgggaa atgggaacaa 1680

ccaaagaact ggtgcaaaac acttatcaat gggtgctaaa aaacttggtg acactgaagg 1740

ctcagtttct tctaggaaaa gaggacatgt tccaatggga tgcatttgaa gcatttgaga 1800

gcataattcc tcagaagatg gctggtcaat acagtggatt tgcaagagca gtgctcaaac 1860

aaatgagaga ccaggaggtt atgaaaactg accagttcat aaagttgttg cctttttgtt 1920

tctcaccacc aaaattaagg agcaatgggg agccttatca attcttaaaa cttgtgttga 1980

aaggaggagg ggaaaatttc atcgaagtaa ggaaagggtc ccctctattt tcctataatc 2040

cacaaacaga agtcctaact atatgcggca gaatgatgtc attaaaaggg aaaattgaag 2100

atgaagaaag gaatagatca atggggaatg cagtattagc aggctttctc gttagtggca 2160

aatatgaccc agatcttgga gatttcaaaa ctattgaaga acttgaaaag ctgaaaccag 2220

gggaaaaggc aaacatctta ctttatcaag gaaaaccagt taaagtagtt aaaaggaaaa 2280

ggtatagtgc tttgtccaat gacatttcac aaggaattaa gagacaaaga atgacagttg 2340

agtccatggg gtgggccttg agctaatata aatttatcca ttaattcaat gaacgcaatt 2400

gagtgaaaaa tgctcgtgtt tctact 2426

<210> 2

<211> 2369

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 2

agcagaagcg gagcctttaa gatgaatata aatccttatt ttctcttcat agatgtgccc 60

gtacaggcag caatttcaac aacattccca tacactggtg ttccccctta ttctcatgga 120

acaggaacag gctacacaat agacaccgtg atcagaacgc atgagtactc aaacaagggg 180

aaacagtaca tttctgatgt tacaggatgc acaatggtag atccaacaaa tggaccatta 240

cccgaagata atgagccgag tgcctatgcg caattagatt gcgttttaga ggctttggat 300

agaatggatg aagaacaccc aggtcttttt caagcagcct cacagaatgc tatggaggcc 360

ctaatggtca caactgtaga caaattaacc caggggagac agacttttga ttggacagta 420

tgcagaaacc aacctgctgc aacggcactg aacacaacaa taacctcttt taggttgaat 480

gatttaaatg gagccgacaa aggtggatta ataccttttt gtcaggatat cattgattca 540

ttagaccgac ctgaaatgac tttcttctca gtaaagaata taaagaaaaa attgcctgcc 600

aaaaacagaa agggtttcct cataaagagg ataccaatga aggtaaaaga caaaataacc 660

aaagtggaat acatcaaaag agcattatca ttaaacacaa tgacaaaaga cgctgaaaga 720

ggcaaattga aaagaagagc gattgccact gctggaatac aaatcagagg gtttgtatta 780

gtagttgaaa acttggctaa aaatatatgt gaaaatctag aacaaagtgg tttaccagta 840

ggtggaaacg agaagaaagc caaactgtca aacgcagtgg ccaaaatgct cagtaactgc 900

ccaccaggag ggattagcat gacagtaaca ggagacaata caaaatggaa tgaatgttta 960

aacccaagaa tctttttggc tatgactgaa agaataacca gagacagccc aatttggttc 1020

agggattttt gtagtatagc accggtcctg ttctccaata agatagcaag attggggaaa 1080

gggtttatga taacaagcaa aacaaaaaga ctgaaggctc aaataccttg tcctgatctg 1140

tttagtatac cattagaaag atataatgaa gaaacaaggg caaaattgaa aaagctaaaa 1200

ccattcttca atgaagaagg aactgcatct ttgtcgcctg ggatgatgat gggaatgttt 1260

aatatgctat ctaccgtgtt gggagtagct gcactaggta tcaagaacat tggaaacaaa 1320

gaatacttat gggatggact gcaatcttct gatgattttg ctctatttgt taatgcaaag 1380

gatgaagaaa catgtatgga aggaataaac gacttttacc gaacatgtaa attattggga 1440

ataaacatga gcaaaaagaa aagttactgt aatgagactg gaatgtttga atttacaagc 1500

atgttctaca gagatggatt tgtatctaat tttgcaatgg aactcccttc gtttggggtt 1560

gctggagtaa atgaatcagc agatatggca ataggaatga caataataaa gaacaacatg 1620

atcaacaatg ggatgggtcc agcaacagca caaacagcca tacagttatt catagctgat 1680

tatagataca cctacaaatg ccacagggga gattccaaag tagaaggaaa gagaatgaaa 1740

atcataaagg agttatggga aaacactaaa ggaagagatg gtctattagt agcagatggt 1800

gggcccaaca tttacaattt gagaaacttg catatcccag aaatagtatt aaagtataat 1860

ctaatggacc ctgaatacaa agggcggtta cttcatcctc aaaatccctt tgtgggacat 1920

ttgtctattg aaggcatcaa agaggcagat ataaccccag cacatggtcc agtaaagaaa 1980

atggactacg atgcggtgtc tggaactcat agttggagaa ccaaaagaaa cagatctata 2040

ctaaacactg atcagaggaa catgattctt gaggaacaat gctacgctaa atgttgcaac 2100

ctatttgagg cctgttttaa cagtgcatca tacaggaagc cagtgggtca acatagcatg 2160

cttgaggcta tggcccacag attaagaatg gatgcacgat tagattatga atcagggaga 2220

atgtcaaagg atgattttga gaaagcaatg gctcaccttg gtgagattgg gtacatataa 2280

gcttcgaaga tgtttatggg gttattggtc accattgaat acatgcgata cacaaatgat 2340

taaaatgaaa aaaggctcgt gtttctact 2369

<210> 3

<211> 2305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

agcagaagcg gtgcgtttga tttgtcataa tggatacttt tattacaaga aacttccaga 60

ctacaataat acaaaaggcc aaaaacacaa tggcagaatt tagtgaagat cctgaattgc 120

aaccagcaat gctattcaat atctgcgtcc atctagaggt ttgctatgta ataagtgaca 180

tgaattttct tgacgaagaa ggaaaagcac atatagcatt agaaggacaa gggaaagaac 240

aaaacttgag accacaatat gaagtaattg agggaatgcc aagaaccata gcatggatgg 300

tccagagatc cttagctcaa gagcatggaa tagagactcc caagtatctg gctgatttgt 360

ttgattataa aaccaaaaga tttatagaag ttggaataac aaaaggattg gctgatgatt 420

acttttggaa aaagaaagaa aagttgggaa atagcatgga actgatgata ttcagctaca 480

atcaagacta ctcgttaagt aatgaatcct cattggatga ggaagggaaa gggagagtgc 540

taagcagact cacagaactt caggctgagt taagtctgaa aaacttatgg caagttctca 600

taggagagga agatgttgaa aagggaattg attttaaact tggacaaaca atatctagac 660

taagggatat atctgttccg gctggttttt ccaattttga aggaatgagg agctacatag 720

acaatataga cccaaaagga gcaatagaga gaaatctagc aaggatgtct cccttagtat 780

cagtcacacc taaaaagtta acatgggagg acctaagacc gatagggcct cacatttatg 840

accatgagct accagaagtt ccatataatg cctttcttct aatgtctgat gaactgggac 900

tggccaatat gactgaggga aaatccaaaa aaccgaagac attagccaaa gaatgtctag 960

aaaagtactc aacactacgg gatcaaactg acccaatatt aataatgaaa agcgaaaaag 1020

ctaacgaaaa tttcctatgg aagctttgga gagactgtgt aaacacaata agtaatgagg 1080

aaacaagtaa cgagttacag aaaaccaatt atgccaaatg ggctacaggg gacggattaa 1140

cataccagaa aataatgaaa gaagtagcaa tagatgacga aacaatgtgc caagaagagc 1200

ctaaaatccc taacaaatgt agagtggctg cttgggttca aacagagatg aatctattga 1260

gcactctgac aagtaaaaga gctctggacc taccagaaat agggccagac atagcacccg 1320

tggagcatgt aggaagtgaa agaaggaaat actttgttaa tgaaatcaac tactgtaagg 1380

cctctacagt tatgatgaag tatgtgcttt ttcacacttc attgttgaat gaaagcaatg 1440

ccagcatggg aaaatacaaa gtaataccaa taaccaatag agtagtaaat gaaaaaggag 1500

aaagtttcga catgctttac ggtctagcgg ttaaaggaca atctcatctg aggggagata 1560

ctgatgttgt aacagttgta actttcgaat ttagtggtac agatccaaga gtggactcag 1620

gaaagtggcc aaaatatact gtgtttagga ttggctccct atttgtgagt gggagggaaa 1680

aatctgtgta cttgtattgc cgagtgaatg gcacaaataa gatccaaatg aaatggggaa 1740

tggaagctag aagatgtttg cttcaatcaa tgcaacaaat ggaggcaatt gttgaacagg 1800

aatcatcaat acaaggatat gacatgacca aagcctgttt caagggagac agagtaaata 1860

gccccaaaac tttcagtatt ggaactcaag aaggaaaact agtaaaagga tcctttggaa 1920

aaacactaag agtaatattt actaaatgct tgatgcacta tgtatttgga aatgcccaat 1980

tggaggggtt tagtgccgag tctaggagac ttctactgtt gattcaagca ttaaaggaca 2040

gaaagggccc ctgggtgttc gacttagagg gaatgtattc tggaatagaa gaatgtatta 2100

gcaacaaccc ttgggtaata cagagtgtat actggttcaa tgaatggttg ggctttgaaa 2160

aggaggggag taaagtgttg gaatcagtgg atgaaataat ggatgaataa aaggaaatgg 2220

tactcaattt ggtactattt tgttcattat gtatctaaac atccaataaa aagaaccaag 2280

aatcaaaaat gcacgtgttt ctact 2305

<210> 4

<211> 1882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

agcagaagca gagcattttc taatatccac aaaatgaagg caataattgt actactcatg 60

gtagtaacat ccaatgcaga tcgaatctgc actgggataa catcgtcaaa ctcaccacat 120

gtcgtcaaaa ctgctactca aggggaggtc aatgtgactg gtgtaatacc actgacaaca 180

acacccacca aatctcattt tgcaaatctc aaaggaacag aaaccagagg gaaactatgc 240

ccaaaatgcc ccaactgcac agatctggac gtagccttgg gcagaccaaa atgcacggga 300

aaaataccct cggcaagagt ttcaatactc catgaagtca gacctgttac atctgggtgc 360

tttcctataa tgcacgacag aacaaaaatt agacagctgc ctaaccttct ccgaggatac 420

gaacatatca gattatcaac tcataacgtt atcaatgcag aaagtgcacc aggaggaccc 480

tacaaaattg gaacctcagg gtcttgccct aacgttacca atggaaacgg atttttcgca 540

acaatggctt gggccgtccc aaaaaacgac aaaaacaaaa cagcaacaga tccattaaca 600

atagaagtac catacatttg tacagaagga gaagaccaaa ttaccgtttg ggggttccac 660

tctgataacg agatccaaat ggcaaagctc tatggggact caaagcccca gaagttcacc 720

tcatctgcca acggagtgac cacacattac gtttcacaga ttggtggctt cccaaatcaa 780

acagaagacg gaggactacc acaaagtggt agaattgttg ttgattacat ggtacaaaaa 840

tctgggaaaa caggaacaat tacctatcaa agaggtattt tattgcctca aaaggtgtgg 900

tgcgcaagtg gcaggagcaa ggtaataaaa ggatccttgc ctttaattgg agaagcagat 960

tgcctccacg aaaaatacgg tggattaaac aaaagcaagc cttactacac aggggaacat 1020

gcaaaggcca taggaaattg cccaatatgg gtgaagacac ccttgaagct ggccaatgga 1080

accaaatata gacctcctgc aaaactatta aaggaaaggg gtttcttcgg agctattgct 1140

ggtttcttag aaggaggatg ggaaggaatg attgcaggtt ggcacggata cacgtcccat 1200

ggggcacatg gagtagcggt ggcagcagac cttaagagca ctcaagaggc cataaacaag 1260

ataacaaaaa atctaaactc tttgagtgag ctggaagtaa agaatcttca aagactaagc 1320

ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctagaactag acgagaaagt agatgatctc 1380

agagctgata caataagctc acaaatagaa ctcgcagtcc tgctttccaa tgaaggaata 1440

ataaacagtg aagatgaaca tctcttggcg cttgaaagaa agctgaagaa aatgctgggg 1500

ccctctgctg tagagatagg gaatggatgc tttgaaacca aacacaagtg caaccagacc 1560

tgtctcgaca gaatagctgc tggtaccttt gacgcaggag aattttctct ccccaccttt 1620

gattcactga atattactgc tgcatcttta aatgacgatg gattggataa tcataccata 1680

ctgctttact actcaactgc tgcctccagt ttggctgtaa cactgatgat agctatcttt 1740

gttgtttata tggtctccag agacaatgtt tcttgctcca tctgtctata agggaagtta 1800

agccctgtgt tttcctttgt tgtagtgctt gtttgcttgt tgccattaca aagaaacgtt 1860

attgaaaaat gctcttgtta ct 1882

<210> 5

<211> 1844

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

agcagaagca cagcattttc ttgtgaactt caagcaccag taaaagaact gaaaatcaaa 60

atgtccaaca tggatattga cggtataaac actgggacag ttgacaaaac accggaagaa 120

ataacttctg gaaccagtgg gacaaccaga ccaatcatta gaccagcaac ccttgcccca 180

ctaagcaaca aacgaacccg taacccatcc ccggaaagag caactacaag cagtgaagat 240

gatgtcggaa ggaaaaccca aaagaaacag accccgacag agataaagaa gagcgtctac 300

aacatggtgg tgaaactggg cgaattctat aaccagatga tggtcaaagc tggactcaat 360

gatgacatgg agagaaacct aatccaaaat gcgcatgccg tggaaagaat tctattggct 420

gccactgatg acaagaaaac cgatttccag aagaaaaaga atgccagaga tgtcaaagaa 480

gggaaagaag aaatagatca caacaaaaca ggaggcacct tttataagat ggtaagagat 540

gataaaacca tctactttag ccctataaga attacctttt taaaagaaga ggtgaaaaca 600

atgtacaaaa ccaccatggg gagtgatggc ttcagtggac taaatcacat aatgattggg 660

cattcacaga tgaatgatgt ctgtttccaa agatcaaagg cactaaaaag agttggactt 720

gatccttcat taatcagtac ctttgcggga agcacagtcc ccagaagatc aggtgcgact 780

ggtgttgcaa tcaaaggagg tggaacttta gtggctgaag ccattcgatt tataggaaga 840

gcaatggcag acagagggct attgagagat atcaaagcca agactgccta tgaaaagatt 900

cttctgaatc taaaaaacaa atgctctgcg cctcaacaaa aggctctagt tgatcaagtg 960

atcggaagca gaaatccggg gattgcagac attgaagatc taaccctgct tgctcgtagt 1020

atggtcgttg ttaggccctc tgtggcaagc aaagtggtgc ttcccataag catttacgcc 1080

aaaatacctc aactagggtt caatgttgaa gagtactcta tggttgggta cgaagccatg 1140

gctctttaca atatggcaac acctgtgtcc atattaagaa tgggagatga tgcaaaagat 1200

aaatcgcaat tattcttcat gtcttgcttc ggagctgcct atgaagacct gagagttttg 1260

tctgcattga caggcacaga attcaaacct agatcagcat taaaatgcaa gggtttccat 1320

gttccagcaa aggaacaagt agaaggaatg ggagcagctc tgatgtccat caagctccag 1380

ttttgggctc caatgaccag atctgggggg aacgaagtag gtggagacgg agggtctggc 1440

caaataagct gcagcccagt gtttgcagtg gaaagaccta ttgctctaag caagcaagct 1500

gtaaggagaa tgctatcaat gaatattgag ggacgtgatg cagatgtcaa aggaaatcta 1560

ctcaagatga tgaatgactc aatggctaag aaaaccagtg gaaatgcttt cattgggaag 1620

aaaatgtttc aaatatcaga caaaaacaaa accaatccca ttgaaattcc aattaagcag 1680

accatcccca atttcttctt tgggagggac acagcagagg attatgatga cctcgattat 1740

taaagcaaca aaatagacac tatgactgtg attgtttcaa tacgtttgga atgtgggtgt 1800

ttattcttat taaaataaat ataaaaaatg ctgttgtttc tact 1844

<210> 6

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

agcagaagca gagcatcttc tcaaaattga agcaaatagg ccgaaaatga acaatgctac 60

cctcaactat acaaacgtta accctatttc tcacatcagg gggagtatta ttatcactat 120

atgtgtcagc ttcactgtca tacttactat attcggatat attgctaaaa ttcccatcaa 180

cagaaattac tgcaccaaca atgccattag attgtgcaaa cgcatcaaat gttcaggctg 240

tgaaccgttc tgcaacaaaa ggggtgacac ttcttctccc agaaccggag tggacatacc 300

cgcgtttatc ttgcccgggc tcaacctttc agaaagcact cctaattagc cctcatagat 360

tcggagagac caaaggaaac tcagctccct tgataataag ggaacctttt attgcttgtg 420

gaccaaagga atgcaaacac tttgctctaa cccactatgc agcccaacca gggggatact 480

acaatggaac aagaggagac agaaacaagc tgaggcatct aatttcagtc aaattgggca 540

aaatcccaac agtagaaaac tccattttcc acatggcagc atggagcggg tccgcatgtc 600

atgatggtaa ggaatggaca tatatcggag ttgatggccc tgacaataat gcattgctca 660

aaataaaata tggggaagca tatactgaca cataccattc ctatgcaaac aacatcctaa 720

gaacacaaga aagtgcctgc aattgcatcg gaggaaattg ttatcttatg ataactgatg 780

gctcagcttc aggtgttagt gaatgcagat ttcttaaaat tcgagagggc cgaataataa 840

aagaaatatt tccaacagga agaatacaac atactgaaga atgcacatgc ggatttgcta 900

gcaataaaac catagaatgt gcctgtagag ataacagtta cacagcaaaa agaccctttg 960

tcaaattaaa cgtggagact gatacagcag aaataagatt gatgtgcaca aagacttatt 1020

tggacacccc cagaccagag gatggaagca taactgggcc ttgtgaatct aatggaggca 1080

aagggagtgg aggcatcaag ggaggatttg tccatcaaag aatggcatcc aagattggaa 1140

ggtggtactc tcgaacgatg tctaaaactg aaaggaaggg gatggggctg tatgtcaagt 1200

ataatggaga cccatgggct gacagtgatg cccttgtttt tagtggagta atggtttcaa 1260

tggaagaacc tggttggtac tcctttggct tcgaaataaa agacaagaaa tgtgatgtcc 1320

cctgtattgg gatagagatg gtacatgatg gtggaaaaga gacttggcac tcagcagcta 1380

cagccattta ctgtttaatg ggctcaggac agctgctgtg ggacactgcc acaggtgtta 1440

atatgactct gtaatggagg aatggttgag tctgctctaa accctttgtt cctattttgt 1500

ttgaacaatt gtccttacta aacttaattg tttctgaaaa atgctcttgt tactact 1557

<210> 7

<211> 1190

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

agcagaagca ggcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacttgctt 60

tcattgacag aagatggaga aggcaaacca gaactagcag aaaaattaca ctgttggttt 120

ggtgggaaag aatttgacct agactctgcc ttagaatgga taaaaaacaa aagatgctta 180

actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatatgct ttttaaaacc caaagaccag 240

gaaagaaaaa gaagattcat cacagagccc ttatcaggag tgggaacaac agcaacaaaa 300

aagaaaggcc tgattctggc tgagagaaaa atgagaagat gtgtgagctt tcatgaagca 360

tttgaaatag cagaaggcca tgaaagctca gcgctactat actgtctcat ggtcatgtac 420

ctgaatcctg gaaattattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttgtgcgag 480

aaacaagcat cacattcaca cagagctcat agcagagcag cgagatcttc agtgcctgga 540

gtgagacgag aaatgcagat ggtctcagct atgaacacag caaaaacaat gaatggaatg 600

ggaaaaggag aagacgtcca aaagctggca gaagagctgc aaagcaacat tggagtgctg 660

agatctcttg gggcaagtca aaagaatggg gaaggaattg caaaggatgt aatggaagtg 720

ctaaagcaga gctctatggg aaattcagct cttgtgaaga aatatctata atgctcgaac 780

catttcagat tctttcaatt tgttctttta tcttatcagc tctccatttc atggcttgga 840

caatagggca tttgaatcaa ataaaaagag gaataaacat gaaaatacga ataaaaagtc 900

caaacaaaga gacaataaac agagaggtat caattttgag acacagttac caaaaagaaa 960

tccaggccaa agaaacaatg aaggaagtac tctctgacaa catggaggta ttgagtgacc 1020

acataataat tgaggggctt tctgccgaag aaataataaa aatgggtgaa acagttttgg 1080

agatagaaga attgcattaa attcaatttt tgctgtattt cttactatgc atttaagcaa 1140

attgtaatca atgtcagcaa ataaactgga aaaagtgcgt tgtttctact 1190

<210> 8

<211> 1097

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

agcagaagca gaggatttgt ttagtcactg gcaaacagga aaaatggcga acaacatgac 60

cacaacacaa attgaggtgg gtccgggagc aaccaatgcc accataaact ttgaagcagg 120

aattctggag tgctatgaaa ggctttcatg gcaaagagcc cttgactacc ctggtcaaga 180

ccgcctaaac agactaaaga gaaaattaga gtcaagaata aagactcaca acaaaagtga 240

gcctgaaagt aaaaggatgt cccttgaaga gagaaaagca attggagtaa aaatgatgaa 300

agtactccta tttatggatc cgtctgctgg aattgaaggg tttgagccat actgtatgaa 360

aagttcctca aatagcaact gtacgaaata caattggacc gattaccctt caacaccagg 420

gagatgcctt gatgacatag aagaagaacc agaggatgtt gatggcccca ctgaaatagt 480

attaagggac atgaacaaca aagatgcgag gcaaaagata aaggaggaag taaacactca 540

gaaagaaggg aagttccgtt tgacaataaa aagggatatg cgtaatgtat tgtccttgag 600

agtgttggta aacggaacat tcctcaaaca tcccaatgga tacaagtcct tatcaactct 660

gcatagattg aatgtatatg accagagtgg aaggcttgtt gctaaacttg ttgctactga 720

tgatcttaca gtggaggatg aagaagatgg ccatcggatc ctcaactcac tcttcgagcg 780

tcttaatgaa ggacattcaa agccaattcg agcagctgaa actgcggtgg gagtcttatc 840

ccaatttggt caagagcacc gattatcacc agaagaggga gacaattaga ctggtcacgg 900

aagaacttta tcttttaagt aaaagaattg atgataacat attgttccac aaaacagtaa 960

tagctaacag ctccataata gctgacatgg ttgtatcatt atcattatta gaaacattgt 1020

atgaaatgaa ggatgtggtt gaagtgtaca gcaggcagtg cttgtgaatt taaaataaaa 1080

atcctcttgt tactact 1097

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

ccgaagttgg gggggagcag aagcggagc 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

ggccgccggg ttattagtag aaacacgagc 30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

ccgaagttgg gggggagcag aagcggagc 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

ggccgccggg ttattagtag aaacacgagc 30

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

ccgaagttgg gggggagcag aagcggtgc 29

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

ggccgccggg ttattagtag aaacacgtgc 30

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

ccgaagttgg gggggagcag aagcagagc 29

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

ggccgccggg ttattagtag taacaagagc 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 17

ccgaagttgg gggggagcag aagcagagc 29

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 18

ggccgccggg ttattagtag taacaagagc 30

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 19

ccgaagttgg gggggagcag aagcacagc 29

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 20

ggccgccggg ttattagtag aaacaacagc 30

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 21

ccgaagttgg gggggagcag aagcacgcac tt 32

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 22

ggccgccggg ttattagtag aaacaacgca ctt 33

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 23

ccgaagttgg gggggagcag aagcagagga tt 32

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 24

ggccgccggg ttattagtag taacaagagg att 33

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 25

ctcaatttgt gttgtggtca tg 22

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 26

tggaggatga agaagatggc catcggatcc tc 32

Claims

1.一种活减毒流感病毒B(LAIVB)，所述LAIVB的保藏号为ATCC PTA-125209。

2.根据权利要求1所述的LAIVB，其中所述LAIVB不能在干扰素感受态细胞中复制。

3.根据权利要求2所述的LAIVB，其中所述干扰素感受态细胞是A549细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的LAIVB，其中当与所述LAIVB在MDCK细胞中于33℃的复制相比时，所述LAIVB在MDCK细胞中于37℃复制较差。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的LAIVB，其中所述LAIVB能够在疫苗产生系统中以与相同株的野生型流感病毒相当的水平复制。

6.根据权利要求5所述的LAIVB，其中在病毒产生系统中传代以后，从上清液回收10⁷pfu/ml至10⁸pfu/ml之间的LAIVB。

7.根据权利要求5所述的LAIVB，其中所述疫苗产生系统包含MDCK细胞培养物。

8.根据权利要求6所述的LAIVB，其中所述疫苗产生系统包含MDCK细胞培养物。

9.根据权利要求4所述的LAIVB，其中所述LAIVB能够在疫苗产生系统中以与相同株的野生型流感病毒相当的水平复制。

10.根据权利要求9所述的LAIVB，其中在病毒产生系统中传代以后，从上清液回收10⁷pfu/ml至10⁸pfu/ml之间的LAIVB。

11.根据权利要求9或10所述的LAIVB，其中所述疫苗产生系统包含MDCK细胞培养物。

12.根据权利要求1所述的LAIVB，其中将所述LAIVB给药至有需要的受试者降低了感染流感B病毒的不同株的所述受试者中不同株流感B病毒的病毒滴度。

13.一种活减毒流感病毒B(LAIVB)，其具有病毒毒力元件NS1蛋白的缺失(DelNS1)和适应性突变，所述适应性突变由PA的T210C、NA的T1424C、NP的C182T和M的A281G组成；且所述流感B病毒为B/HK/8038/2011株。

14.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1-12中任一项的LAIVB以诱导对由病毒基因组编码的抗原的免疫应答。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，进一步包含佐剂。

16.根据权利要求14或15所述的药物组合物，适合于鼻腔给药。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的药物组合物在制备用于在受试者中诱导或增强针对流感B病毒的免疫应答的药物中的用途。