DE69535360T2

DE69535360T2 - Synthetische peptide und impfstoffe welche diese beinhalten

Info

Publication number: DE69535360T2
Application number: DE69535360T
Authority: DE
Inventors: Juan Anton Alderley COOPER; Wendy Anne Glebe RELF; Michael Frances The Gap GOOD; Allan James The Gap SAUL
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research; Queensland Institute of Medical Research QIMR; CSL Ltd; University of Melbourne
Current assignee: Council Of Queensland Institute Of Med Au
Priority date: 1994-10-14
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2015-10-17
Also published as: EP0787139A1; ATE350390T1; CA2202504A1; JPH10512543A; AU3645595A; EP0787139A4; JP2009067810A; US6174528B1; CA2202504C; DE69535360D1; EP0787139B1; AUPM885194A0; ES2281900T3; WO1996011944A1; AU704688B2; CN1118474C; CN1168674A; JP4463877B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf chimäre Peptide, die eines oder mehrere Schutzepitope einer Konformation aufweisen, welche immunologische Interaktivität aufweisen, und weiters auf Impfstoffzusammensetzungen, die diese Peptide aufweisen. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf ein chimäres Peptid gerichtet, welches in der Lage ist, schützende Antikörper gegen Streptokokken der Gruppe A zu induzieren.
Bibliographische Details der Publikationen, auf welche in dieser Beschreibung über die Autoren Bezug genommen wurde, sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst. Sequenzidentifizierungsnummern (SEQ ID NRn.) für die Aminosäuresequenzen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen sind, sind nach der Bibliographie definiert.
Sofern der Text nichts anderes verlangt, soll das Wort „aufweist" oder Variationen wie „aufweisen" oder „aufweisend" in dieser Beschreibung durchgehend so zu verstehen sein, dass es die Einbeziehung eines bestimmten Elementes oder einer Ganzzahl oder Gruppe von Elementen oder Ganzzahlen, aber nicht den Ausschluss von irgendeinem anderen Element oder Ganzzahl oder Gruppen von Elementen oder Ganzzahlen bedeutet.
Viele Proteine, die gegen verschiedene Krankheiten hilfreiche Impfstoffe sein können, haben eine Coiled-Coil-Struktur, die ein wesentliches strukturelles und biologisch häufiges Motiv ist, das in einer diversen Gruppe von Proteinen zu finden ist (Cohen und Parry, 1990, 1986). Für mehr als 200 Proteinen wurde vorausgesagt, dass sie Coiled-Coil-Domänen enthalten (Lupas et al., 1991). Dies schließt Oberflächenproteine von bestimmten Bakterien wie Streptokokken-Protein A und M Proteine; Viren wie Influenza Hämagglutinin und menschliches Immundefizienz-Virus (HIV) Glycoprotein gp45; und Protozon wie VSG von Trypanosomen ein. Alle Coiled-Coil Motive besitzen gemeinsam eine charakteristische Wiederholung von sieben Aminosäurereste-Wiederholung (a-b-c-d-e-f-g)_n. Die Röntgenstruktur von mehreren Coiled-Coil-Domänen wurden entziffert und diese enthalten den Leucin-Ziperabschnitt des Hefetranskriptionsfaktors GCN4 Dimer (O'Shea et al. 1991), das Wiederholungsmotiv von α-Spectrin (Yan, 1993), zusammen mit dem GCN4 Leucin-Zipper Trimer (Harbury et al., 1994) und Tetramer (Harbury et al., 1993) Mutanten.
Bei der Entwicklung eines auf diesen Proteinen basierenden Impfstoff aus Untereinheiten ist es im Allgemeinen schwierig, die Epitope innerhalb der Coiled-Coil Struktur zu kartieren. Ferner kann es nötig sein, Schutzepitope in der richtigen Konformation für eine immunologische Erkennung so wie bei der Antikörperbindung zu präsentieren. Dies ist insbesondere wichtig bei der Festlegung eines stabilen Minimalepitops und der Verwendung derselben als Impfstoff.
Streptokokken der Gruppe A (hiernach immer als „GAS" bezeichnet) sind ursächliche Erreger für verschiedene menschliche Krankheiten und können zu akutem rheumatischem Fieber führen, welches schwerwiegende Herzerkrankungen verursacht. Rheumatisches Fieber kann eine Autoimmun-Krankheit darstellen, welche durch Kreuzinteraktivität zwischen dem Streptokokken M Protein und den Herzantigenen ausgelöst ist (Beachey et al., 1988). Das M Protein enthält eine sieben-Resteperiodizität, die stark daraufhin deutet, dass die zentrale Stammregion des Moleküls in einer Coiled-Coil-Konformation vorliegt (Manula und Fischetti, 1980). Es wurden überlappende Peptide hergestellt, die diese Region überspannen (siehe Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU93/00131 [ WO 93/21220 ]) und gegen ein synthetisches 20mer Peptid (bezeichnet „p145") aus der hoch konservierten C-terminalen Region gezüchtete Mausantikörper können Multiple Isolate von GAS opsonisieren und töten (Pruksakorn et al., 1994a). Zusätzlich kann p145 in vitro das durch menschliches Serum mediierte Abtöten inhibieren. Zu beachten ist, dass p145 auch Herz-Kreuz-reaktive T-Zellen stimulieren kann (Pruksakorn et al., 1992; 1994b). Von dem B Zellen Epitop innerhalb p145 wird gelehrt, dass sie konformativ sind, weil verkürzte Peptide scheitern, eine Schutzantikörperreaktion (Pruksakorn, 1994) auszulösen. Es ist daher der Bedarf gegeben, die Minimalregion von p145 zu bestimmen, welche benötigt wird, um opsonische Antikörper zu induzieren; dies kann dann die Basis für einen Impfstoff bilden. Ein solches Verfahren würde die Identifikation von Minimalepitop Regionen einer Auswahl von Proteinen von Pathogenen zu ermöglichen.
Ein Verfahren, das eingesetzt wurde, um Minimalepitope von Antigenen zu kartieren, ist das PEPSCAN-Verfahren (Geysen et al., 1987). Allerdings zeigten die verwendeten kurzen Peptide nur sequenzielle oder kontinuierliche Epitope auf. Andere Verfahren zur Bestimmung von konformativen Epitopen, dass sind Epitope die durch die Tertiärstruktur von dem Protein gebildet sind, beruhen auf Mimotop-Strategien. Ein Mimotop ist eine Nachahmung eines Epitops, welches den Antikörper induziert. Peptide können an Polypropylenstäben synthetisiert werden, welche das gesamte Repertoire von Octapeptiden umfassen, welche unter Verwendung der 20 gebräuchlichen Aminosäuren hergestellt werden können, dass sind 20⁸ Peptide (Geysen et al. 1987). Alternativ dazu kann eine Epitopbibliothek, welche eine ausgedehnte Mischung von filamentösen Phagen-Klonen, wobei jeder eine Peptidsequenz auf der Virionenoberfläche zeigt, aufweist, auf die Antikörpererkennung geprüft werden (Scott und Smith, 1990).
Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden überlappende Peptide, die von einem Konformationsepitop abgeleitet sind, innerhalb eines Peptids mit einer ähnlichen nativen Konformation, eingebettet. Dieser Versuch hat das Potential, in der Kartierung einer Reihe von Konformationsepitopen und in den Bau von Minimalepitopen als Impfstoffkandidaten gegen GAS und eine Vielzahl von anderen Pathogenen Verwendung zu finden.
WO 94/06465 betrifft ein Fusionsprotein, welches ein passendes Trägerprotein und ein oder mehrere Epitope aufweist, welche in der Lage sind, opsonische Antikörper gegen spezifische Gruppe A Streptokokken Serotypen zu entwickeln. WO 94/06421 betrifft einen multivalenten Hybrid M Protein Impfstoff gegen multiple Gruppen A Streptokokken Serotypen. Pruksakorn et al. (1992) identifiziert konservierte Epitope innerhalb der Nterminalen Region des streptokokkalem M Proteins, welche in der Lage sind, Antikörper mit minimaler Kreuzreaktivität zum menschlichen Herzgewebe zu entwickeln. Zusätzlich beschreiben Relf et al. (1994) die Antigen-Diversität innerhalb einer Familie von M Proteinen von Gruppe A Streptokokken. Allerdings beschreibt keines dieser Dokumente Verfahren zum Kartieren einer Auswahl von Konformations-Epitopen durch Beschaffung von Mitteln, welche sicherstellen, dass die native Konformation des Epitops beibehalten wird.
WO 93/21220 betrifft synthetische Peptide, welche wenigstens ein B Zellepitop des Carboxy Terminus des M Proteins von Streptokokken aufweisen, in welchen ein Antikörper der mit dem B Zellepitop reaktiv ist, hinsichtlich menschlichem Herzgewebe nur minimal reaktiv ist. Charalambos et al. (Eur. J. Immunol., 1992, 22, 2675-2680) betrifft den Einfluss der Orientierung und der Anzahl von Kopien von T und B Zellepitopen auf die Spezifität und Affinität von Antikörpern, die durch chimäre Peptide induziert sind. Es offenbart die Fusion von T und B Zellepitopen, welche von dem M Protein der Streptokokken Pyrogene stammen.
Dementsprechend erwägt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein chimäres Peptid, welches aufweist:

(i) eine erste Aminosäure-Sequenz, welche in ihren nativen Zustand ein Konformationsepitop präsentiert, wobei das genannte Konformationsepitop in der ersten Aminosäure Sequenz in einem isolierten Zustand nicht vorhanden ist;
(ii) eine zweite Aminosäure-Sequenz, welche in der Lage ist, in eine Rahmenwerk Coiled-Coil-Konformation zu falten, welche der nativen Konformation der ersten Aminosäure-Sequenz ähnlich ist;

In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung bildet die zweite Aminosäuresequenz ein „Rahmen-Peptid" und schafft eine passende Konformation für das Chimäre Peptid. Ein Rahmenpeptid ist ausgewählt oder auf andere Weise zusammengestellt, um eine ähnliche Konformation zu der ersten Aminosäure-Sequenz zu bilden, wie diese in der natürlich vorkommenden Form aufweist. In ihrer am meisten bevorzugten Ausführungsform nimmt das Rahmenpeptid eine α-helikale Coiled-Coil-Konformation ein und ist daher nützlich bei der Präsentation der Epitope, die in der ersten Aminosäure-Sequenz in einer ähnlichen Konformation vorhanden sind, d.h. eine α-helikale Coiled-Coil-Konformation.
Gemäß diesem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein chimäres Peptid vorgesehen, welches eine erste Aminosäuresequenz aufweist, welche ein Konformationsepitop aufweist, das innerhalb einer zweiten Aminosäure-Sequenz eingesetzt ist, wobei die genannte zweite Aminosäure-Sequenz sich in eine α-helikale Coiled-Coil-Konformation faltet.
Die vorliegende Erfindung ist hierin insbesondere durch die erste Aminosäure-Sequenz veranschaulicht, welche von dem streptokokkalen M Protein abgeleitet ist und insbesondere ein B-Zell Konformationsepitop von innerhalb der folgenden Aminosäure-Sequenz (unter Verwendung des Einbuchstaben-Abkürzungscodes für Aminosäurereste aufweist):
L R R D L D A S R E A K K Q V E K A L E (SEQ.ID.NR.1),
oder funktionale und/oder chemische Äquivalente von einem oder mehreren dieser Aminosäurereste.
Dementsprechend ist eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf ein chimäres Peptid gerichtet, welches aufweist:

(i) eine erste Aminosäure-Sequenz, welche in ihren nativen Zustand ein Konformationsepitop präsentiert, wobei das Konformationsepitop in der ersten Aminosäure-Sequenz in ihren isolierten Zustand nicht vorhanden ist.
(ii) eine zweite Aminosäure-Sequenz, welche in der Lage ist, in eine Rahmenwerk Coiled-Coil-Konformation zu falten, welches ähnlich ist der nativen Konformation der ersten Aminosäure-Sequenz;

Alternativ dazu können nicht zusammenhängende Aminosäure-Reste wie solche auf der Außenseite der Helix ausgewählt werden und welche für die Aktivität erforderlich oder notwendig sind.
Die Konstruktion eines Rahmenpeptids ist auf einer Wiederholung von sieben Aminosäure-Resten basiert:
(a-b-c-d-e-f-g)_n
wobei a und d Positionen bevorzugt große apolare Reste besitzen und die Positionen b, c und f im Allgemeinen polar und geladen sind und die Positionen e und g im Allgemeinen ionische Interaktionen zwischen den Ketten favorisieren. Ein besonders bevorzugtes Rahmenpeptid basiert auf der Struktur eines Peptids, welches dem GCN4 Leucin Zipper entspricht (O'Shea et al., 1989; 1991) oder des Trimer (Harbury et al., 1994) oder Tetramer (Harbury et al., 1993) und das Wiederholungsmotiv von α-Spectrin (Yan, 1993). Der GCN4 Leucin Zipper wird im Allgemeinen bevorzugt und eine Model Heptad-Wiederholung, die von dem Konsensusmerkmalen des GCN4 Leucin Zipper Peptids abgeleitet ist, weist die Sequenz auf
V K Q L E D K (SEQ ID NR:2),
welches ein Rahmenpeptid von vier Heptad-Wiederholungen ergibt, die hierin als (GCN4)₄ bezeichnet wird. Wenn es erforderlich ist, könnte das Rahmenpeptid länger als vier Wiederholungen sein, oder dies benötigen.
Die erste Aminosäure-Sequenz wird dann in das Coiled-Coil-Rahmenpeptid eingebettet, um ein chimäres Peptid zu ergeben.
Die chimären Peptide der vorliegenden Erfindung können durch rekombinante Verfahren hergestellt werden oder können chemisch synthetisiert werden durch zum Beispiel stufenweise Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten in festgelegter Reihenfolge unter Verwendung von Festphasenpeptidsynthetisierungstechniken. Wo die Peptide mit in Kombination mit anderen Proteinen synthetisiert werden müssen, dann sind sie durch chemisches Schneiden danach zu isolieren oder alternativ dazu können die Peptide oder polyvalente Peptide in multiplen Wiederholungseinheiten synthetisiert werden. Die Peptide können natürlich vorkommende Aminosäurereste aufweisen oder können auch nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste enthalten, wie bestimmte D-Isomere oder chemisch modifizierte natürlich auftretende Reste. Diese letztgenannten Reste können erforderlich sein, um beispielsweise Konformationsbeschränkungen und/oder Begrenzungen für die Peptide zu erleichtern oder vorzusehen. Die Auswahl der Verfahren zur Herstellung der gegenständlichen Peptide werden von Faktoren wie beispielsweise benötigter Typ Menge und Reinheit der Peptide sowie Leichtigkeit der Herstellung und Zweckmäßigkeit abhängen.
Die chimären Peptide der vorliegenden Erfindung können zum Ersten ihre chemische Modifikation für ihren Gebrauch in vivo benötigen, da die Peptide als solche nicht genügend lange Serum- und/oder Gewebe-Halbwertszeit aufweisen. Chemische Modifikation der gegenständlichen Peptide kann auch wesentlich sein, um ihre Antigenizität zu verbessern einschließlich der Fähigkeit von bestimmten Regionen der Peptide als B und/oder T Zellen Epitope zu dienen. Solche chemisch modifzierten chimären Peptide werden hierin als „Analoge" bezeichnet. Der Begriff „Analoga" erstreckt sich auf jedes funktionale chemische oder rekombinante Äquivalent der chimären Peptide der vorliegenden Erfindung, welche in einer meisten bevorzugten Ausführungsform durch das Vorliegen von wenigstens einem B Zell Epitop von dem M Protein von GAS gekennzeichnet sind, und wobei ein Antikörper, der mit dem B Zell Epitop reaktiv ist, nur minimal mit einem menschlichen Herzgewebe reakiv ist. Der Terminus „Analoga" wird hierin auch verwendet, um sich auf alle Aminosäurederivate von Peptiden, wie oben beschrieben, zu erstrecken.
Analoga der chimären Peptide, die hierin abgehandelt werden, schließen ohne darauf beschränkt zu sein, Modifikationen der Seitenketten, Einlagerung von nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren und/oder deren Derivate während der Peptidsynthese ein sowie die Verwendung von Vernetzen und anderen Verfahren, welche konformationelle Beschränkungen der Peptide und ihre Analoga erzwingen.
Die Beispiele von Seitenketten-Modifikationen, die durch die vorliegende Erfindung erwogen werden, schließen Modifikationen von Aminogruppen ein, wie beispielsweise reduktive Alkylierung durch die Reaktion mit einem Aldehyd gefolgt von einer Reduktion mit NaBH₄; Amidinierung mit Methylacetimidat; Acylierung mit Essigsäureanhydrid; Carbamoylierung von Aminogruppen mit Cyanat, Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzensulphonsäure (TNBS); Acylierung von Aminogruppen mit Bernsteinsäure-Anhydrid und Tetrahydrophthalanhydrid; und Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5'-phosphat gefolgt durch eine Reduktion mit NaBH₄.
Die Guanidin Gruppen von Argininresten können durch Bildung von heterocyklischen Kondensationsprodukten mit Reagenzien wie 2,3-Butanedion, Phenylglyoxal und Glyoxal modifiziert werden.
Die Carboxylgruppe kann durch Carbodiimid Aktivierung über O-Acylisoharnstoffbildung gefolgt von darauffolgender Derivatisierung zum Beispiel auf ein korrespondierendes Amid modifiziert werden.
Sulphydryl Gruppen können durch Verfahren modifiziert werden, wie beispielsweise Carboxymethylierung mit Iodessigsäure oder Iodacetamid; Perameisensäure Oxidation zu Cysteinsäure; Bildung eines gemischten Disulfids mit anderen Thiolverbindungen; Reaktion mit Maleimid, Malein-Anhydrid oder anderen substituierten Maleimid; Bildung von Quecksilberderivaten unter Verwendung von 4-Chlormercuribenzoat, 4-Chlormercuriphenylsulphonsäure, Phenylquecksilberchlorid, 2-Chlorquecksilber-4-nitrophenol oder andere Quecksilbersalze; Carbamoylierung mit Cyanat oder alkalischem pH.
Tryptophan Reste können modifiziert werden durch zum Beispiel Oxidation mit N-Bromsuccinimid oder Alkylierung des Indolrings mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulphenyl-Halogenoide. Tyrosin Reste andererseits können durch Nitrierung mit Tetranitromethan verändert werden, um ein 3-Nitrotyrosin Derivat zu bilden.
Die Modifikation des Imidazolrings eines Histidinrestes kann durch Alkylierung mit Iodessigsäure Derivaten oder N-Carbethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat durchgeführt werden.
Beispiele der Inkorporierung von nichtnatürlichen Aminosäuren und Derivaten während der Peptidsynthese schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein, die Verwendung von Norleucin, 4-Aminobuttersäure, 4-Amino-3-hydroxy-5-phenylpentansäure, 6-Aminohexansäure, t-Butylglycin, Norvalin, Phenylglycin, Ornithin, Sarcosin, 4-Amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure, 2-Thienylalanin und/oder D-Isomere von Aminosäuren.
Vernetzungsmittel können zum Beispiel verwendet werden, um 3D Konformationen zu stabilisieren, unter Verwendung von homo-bifunktionalen Vernetzungsmitteln, wie bifunktionale Imidoester, welche (CH₂)_n Abstandhaltergruppen mit n = 1 bis n = 6, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimid Ester und heterobifunktionelle Reagenzien, die üblicherweise einen aminoreaktiven Anteil aufweisen, wie N-Hydroxysuccinimid und einen anderen gruppenspezifisch reaktiven Anteil wie Maleimido oder Dithio-Anteil (SH) oder Carbodiimid (COOH). Zusätzlich können Peptide konformationsmäßig eingeengt werden durch z.B. Einbau von C_α und N_α-Methylaminosäuren, Einbringung von Doppelbindungen zwischen C_α und C_β Atomen von Aminosäuren und die Bildung von zyklischen Peptiden oder Analoga durch Einbringen von kovalenter Bindungen wie die Bildung einer Amidbindung zwischen dem N und C Terminus zwischen zwei Seitenketten oder zwischen einer Seitenkette und dem N oder C Terminus.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Konformationsepitop bereit, wie beispielsweise von streptokokkalen M Protein in einem Hybridmolekül, so dass das Epitop in einem funktionellen Konformationszustand vorgelegt wird, so dass es in der Lage ist, immunologisch interaktiv zu sein.
In einem verwandten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren vorgesehen für das Kartieren von Regionen von amphipathischen Helices auf einem Peptid, Polypeptid oder Protein, welcher durch Antikörper erkannt werden und/oder zum Bestimmen eines Minialepitops auf einem Peptid, Polypeptid oder Protein, wobei das Verfahren, das Bestimmen der nativen Konformation von dem genannten Polypeptid, Polypeptid oder Protein oder eines Teils davon, welches ein putatives Epitop trägt; Herstellen von Peptidfragmenten auf genanntem Peptid, Polypeptid oder Protein; Einsetzen oder anderwärtiges Präsentieren von Peptidfragmenten in einem zweiten Peptid, das abgeleitet ist oder basiert auf einem anderen Peptid, Polypeptid oder Protein, welches in der Lage ist, in eine Rahmen Coiled-Coil-Konformation, die ähnlich der nativen Konformation zum erstgenannten Peptid, Polypeptid oder Protein ist, zu falten, wobei die Peptidfragmente in die Coiled-Coil-Konformation des zweiten Peptids eingesetzt werden, so dass das putative Epitop auf dem Peptidfragment in einer Konformation präsentiert wird, die in der Lage ist, immunologische Interaktivität zu zeigen, und dann das genannte Peptidfragment auf immunologische Interaktivität zu screenen.
Amphipathische Helices, welche durch Antikörper erkennbar sind, können wertvolle Impfstoffkandidaten werden. Eine amphipatische Helix ist ein mehr übliches strukturelles Element in Proteinen und kann an der Oberfläche ausgesetzt werden (antigen) oder spielt eine Rolle in den Interaktionen mit anderen Proteinen. Ein helikales Coiled-Coil ist eine eher komplexe Form von Helix, welche interagiert, um Homo-, Dimere, Trimere und Tetramere zu bilden.
Unter „immunologische Interaktivität" ist jede Form von Interaktion mit Immunzellen oder Immuneffektorzellen und/oder jede Art von Immunresponse gemeint. Allgemein wird immunologische Interaktivität durch Antikörperbindung oder Interaktivität mit dem Peptidfragment gemessen. Allerdings betrifft die immunologische Aktivität auch die Messung zellularer Immunreaktionen.
Bei der therapeutischen und diagnostischen Entwicklung ist es wichtig, die Minimalepitope zu bestimmen, die in der Lage sind, immunologische Interaktivität zu bilden und für die Therapie in der Lage sind, Schutzimmunreaktionen hervorzurufen. Dementsprechend sind die chimären Peptide der vorliegenden Erfindung einschließlich der Verfahren ihrer Herstellung besonders nützlich in der Impfstoffentwicklung. Nochmals, die vorliegende Erfindung in ihrer beispielhaften und bevorzugten Form ergibt chimäre Peptide für die Verwendung als Impfstoff gegen GAS. Dies wird mit dem Verständnis getan, dass sich die vorliegende Erfindung auf chimäre Peptide erstreckt, die für die Initiierung einer Schutzimmunreaktion gegen pathogene Mikroorganismen einschließlich Bakterien, Parasiten, Hefe, Pilze und Protozoen oder gegen Viren wie Retroviren, Influenza Viren, Hepatitis Viren und Immunschwäche Viren und insbesondere HIV nützlich sind.
Dementsprechend sieht ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Impfstoff der gegen Gruppe A Streptokokken hilfreich ist vor, wobei dieser Impfstoff ein chimäres Peptid aufweist, welches aufweist:

(i) eine erste Aminosäuresequenz, welche in ihrem nativen Zustand ein Konformationsepitop darbietet, wobei das genannte Konformationsepitop in der ersten Aminosäuresequenz in einem isolierten Zustand nicht vorliegt; und
(ii) eine zweite Aminosäuresequenz, welche in der Lage ist, in ein Rahmenwerk Coiled-Coil-Konformation zu falten, die ähnlich ist der nativen Konformation der ersten Aminosäuresequenz;

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung erwägt einen Impfstoff, der in der Entwicklung von humoraler Immunität gegen M Protein, jedoch nur schwach kreuzreaktiv mit Herzgewebe ist, und wobei der Impfstoff ein chimäres Peptid aufweist, welches eine erste Aminosäuresequenz, die zumindest ein B-Zell Epitop vom M Protein aufweist, wobei ein Antikörper, der mit dem genannten B-Zell Epitop reaktiv ist, nur minimal mit Herzgewebe reaktiv ist, wobei die genannte erste Aminosäuresequenz in eine zweite Aminosäuresequenz eingesetzt ist, welche fähig ist, in eine α-helikale Coiled-Coil-Formation zu falten und wobei der genannte Impfstoff weiters einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält.
Der Impfstoff kann einen einzigen Peptidtyp enthalten oder aber einen Bereich von Peptiden, die unterschiedliche oder ähnliche Epitope aufweisen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann ein einziges Polypeptid mit mehreren Epitopen vorgesehen sein. Der letzte Typ von Impfstoffen wird als polyvalenter Impfstoff bezeichnet. Ein multiples Epitop enthält zwei oder mehr wiederholende Epitope.
Die Ausbildung von Impfstoffen ist allgemein im Stand der Technik bekannt und es kann einfach auf Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA hingewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrachtet daher eine pharmazeutische Komposition oder Impfstoff-Zusammensetzung, die eine zur Entwicklung einer humoralen Immunität wirksame Menge eines chimären Peptids (wie oben beschrieben) oder seiner Derivate, Analoga oder Homologe und/oder Kombinationen davon einschließlich anderer aktiver Moleküle und einem oder mehreren pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel aufweist. Die aktiven Inhaltsstoffe einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die chimäre Peptide enthält, sind hierin betrachtet, dass sie gute therapeutische Aktivität entwickeln zum Beispiel bei der Entwicklung von Antikörpern gegen M Protein von Streptokokken aber das jene Antikörper nur minimalreaktiv mit Herzgewebe sind, wenn sie in einer Menge verabreicht werden, welche von dem speziellen Fall abhängt. Zum Beispiel kann von 0,5 μg bis 20 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Dosierungsregimen können abgeändert werden, um die beste therapeutische Reaktion zu erhalten. Zum Beispiel können verschiedene geteilte Dosen täglich verabreicht werden, oder aber die Dosis kann proportional reduziert werden, wie dies durch die Dringlichkeit der therapeutischen Situation gegeben ist. Der aktive Wirkstoff kann in herkömmlicher Weise, wie orale, intravenöse (wo wasserlöslich), intramuskuläre, subkutane, intranasale, intradermale oder über suppositorische Routen oder Implantate (zum Beispiel unter Verwendung von Molekülen mit langsamer Freigabe) verabreicht werden. In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg kann es für die aktiven Inhaltsstoffe, die ein chimäres Peptid enthalten, erforderlich sein mit einem Material überzogen zu werden, um diese Inhaltsstoffe von der Wirkung von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen Konditionen, die die genannten Inhaltsstoffe inaktivieren können, zu schützen. Zum Beispiel wird die geringe Lipophilizität von chimären Peptiden zulassen, dass sie im gastrointestinal Trakt durch Enzyme zerstört werden, die in der Lage sind, Peptidbindungen zu spalten und im Magen durch Säure-Hydrolyse. Um chimäre Peptide anders als durch parenterale Administration zu verabreichen, werden sie mit einem Material beschichtet, welches die Inaktivierung verhindert oder aber mit diesem Material gemeinsam verabreicht. Beispielsweise können chimäre Peptide in einem Adjuvans verabreicht werden, oder mit Enzyminhibitoren oder mit Liposomen gemeinsam verabreicht werden. Adjuvans wird in seinem breitesten Sinn verwendet, und enthält jede immunstimulierende Verbindung wie z. B. Interferon. Hier ins Auge gefasst, Adjuvantien schließen Resorcinole, nicht-ionische Oberflächen-aktive Substanzen wie Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylen-Ether ein. Enzym-Inhibitoren schließen pankreatische Trypsin Inhibitoren, Diisopropylfluorphosphat (DFP) und Trasylol ein. Liposome schließen Wasser-in-Öl-in-Wasser Emulsionen sowie auch konventionelle Liposome ein.
Die aktiven Verbindungen können sowohl parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Dispersionen können auch in Glycerol, flüssigem Polyethylenglycol und Mischungen daraus und in Ölen hergestellt werden. Unter üblichen Konditionen der Lagerung und des Gebrauches enthalten diese Zusammensetzungen Konservierungsstoffe, um das Umsatzwachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, die für die Injektion geeignet sind, schließen sterile wässrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Präparation von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss bis zu jenem Grad flüssig sein, dass eine leichte Spritzbarkeit vorliegt. Sie muss unter den Konditionen der Herstellung und der Lagerung stabil sein und muss gegen die Kontaminierungswirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Fungi konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, welches beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen) sowie passende Mischungen davon und Pflanzenöle aufweist. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzuges, wie Licithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen aufrecht erhalten werden. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifugale Wirkstoffe wie zum Beispiel Parabene, Chlorbutan, Phenol, Sorbinsäure, Thirmerosal und dergleichen durchgeführt. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Wirkstoffe zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid anzuwenden. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Wirkstoffen in den Zusammensetzungen, die die Absorption verzögern, wie zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine vorgenommen werden.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbringen der Wirkstoffverbindungen in der benötigen Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit verschiedenen anderen Zusatzstoffen, wie oben genannt, nach Bedarf und durch eine Filtrationssterilisierung hergestellt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel hergestellt, welches das Basisdispersionsmedium und die benötigten anderen Inhaltsstoffe von den oben aufgezählten enthalten. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen ist die bevorzugte Methode der Herstellung Vakuumtrocknung und die Gefriertrocknungstechnik, welche ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffes plus irgendwelchen zusätzlich gewünschten Inhaltsstoffen aus vorher steril filtrierten Lösungen daraus ergeben.
Wenn die chimären Peptide entsprechend, wie oben beschrieben, geschützt sind, kann der aktive Wirkstoffe oral, beispielsweise in einem inerten Lösungsmittel oder einem vergleichbaren essbaren Trägern erfolgen oder er kann in Hart- oder Weichgelatine-Kapseln eingeschlossen sein oder er kann in Tabletten gepresst sein oder kann direkt in der Nahrungskost eingeschlossen sein. Für orale therapeutische Verabreichung kann der aktive Wirkstoff mit Exzipienten verbunden sein und in Form von verdaubaren Tabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixire, Suspensionen, Sirupe, Waffeln und dergleichen verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparationen sollte wenigstens 1 Gew.- % der aktiven Verbindung enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzung und Präparationen kann natürlich variiert werden und kann in geeigneter Weise zwischen etwa 5 bis etwa 80 Gew.-% der Einheit betragen. Die Menge von aktiver Verbindung in solchen therapeutischen nützlichen Zusammensetzungen ist derart, dass eine geeignete Dosierung erreicht werden kann. Bevorzugte Zusammensetzungen oder Präparationen gemäß der vorliegenden Erfindung sind so hergestellt, dass eine orale Dosierungseinheitsform zwischen etwa 0,1 μg und 2000 mg der aktiven Verbindung enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können auch folgendes enthalten: Ein Bindemittel, wie Tragantgummi, Akazie, Maisstärke oder Gelatine; Exzipienten, wie Dicalciumphosphat; ein Sprengmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dergleichen; ein Gleitmittel wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Saccharin kann zugesetzt werden oder ein Geschmackgebendes Mittel wie Pfefferminz, Moosbeeren-Öl oder Kirschengeschmack. Wenn die Dosierungseinheitsform eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien der obgenannten Art einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Überzüge oder für anderweitige Modifizierungen der physikalischen Form der Dosiseinheit vorhanden sein. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beiden beschichtet sein. Ein Sirup oder Elixir kann die aktive Verbindung, Saccharose als Süßungsmittel, Methyl und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und Geschmacksstoff, wie Kirschen oder Orangengeschmack enthalten. Natürlich soll jedes Material, dass zur Herstellung einer Dosierungseinheitsform verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den angewendeten Mengen im Wesentlichen nicht toxisch sein. Zusätzlich kann die aktive Verbindung in Präparationen und Formulierungen mit verzögerter Freisetzung eingebaut sein.
Wie hierin verwendet, enthält „pharmazeutisch akzeptabler Träger und/oder Verdünnungsmittel" alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung von solchen Medien und Wirkstoffen für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist im Stand der Technik wohl bekannt. Mit Ausnahme jener konventioneller Medien oder Wirkstoffe die mit dem aktiven Wirkstoff inkompatibel sind, ist die Verwendung davon in therapeutischen Zusammensetzungen ins Auge gefasst. Zusätzliche aktive Inhaltsstoffe können ebenso in die Kompositionen eingebaut sein.
Es ist speziell vorteilhaft, parenterale Zusammensetzung in Dosierungseinheitsform zur leichten Verabreichung und Einheit der Dosierung zu formulieren. Dosierungseinheitsform, wie hierin verwendet, betrifft physikalisch getrennte Einheiten, die als Einheitsdosierungen für die Behandlung von Säugetieren geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorgegebene Menge von aktivem Material, welches berechnet ist, um den gewünschten therapeutischen Effekt im Zusammenhang mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger zu ergeben. Die Spezifizierung für die neuen Dosierungseinheitsformen wird diktiert durch und ist direkt abhängig von (a) den einzigartigen Charakteristika des aktiven Materials und dem speziellen therapeutischen Effekt, welcher zu erreichen ist und (b) die inhärenten Beschränkungen in der Weise der Komponierung von einem solchen aktiven Material zur Behandlung von Krankheiten in lebenden Subjekten, die einen Krankheitszustand aufweisen, in welchen die Körpergesundheit, wie hierin im Detail dargelegt wird, beeinträchtigt ist.
Der hauptsächliche aktive Inhaltsstoff ist für angenehme und wirksame Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem passenden pharmazeutisch akzeptablen Träger in Dosierungseinheitsform, wie vorstehend beschrieben, vermischt. Eine Dosierungseinheitsform kann zum Beispiel den Hauptwirkstoff in Mengen enthalten, die von etwa 0,5 μg bis etwa 2000 mg reichen. Ausgedrückt in Mengenverhältnissen ist die aktive Verbindung von etwa 0,5 μg bis etwa 2000 mg/ml des Trägers vorhanden. Im Falle, dass die Komposition zusätzliche aktive Wirkstoffe enthält, werden die Dosierungen durch Bezugnahme auf die übliche Dosis und die Art der Verabreichung dieser Ingredienzien bestimmt.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf Antikörper gegen chimäre Peptide gerichtet. Solche Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können von natürlich vorkommenden Antikörpern gegen das M Protein ausgewählt sein oder spezifisch gegen chimäre Peptide gezüchtet sein. Im letzteren Fall kann es nötig sein, dass die Peptide zuerst mit einem Trägermolekül assoziiert werden. Die Antikörper und/oder chimären Peptide der vorliegenden Erfindung sind insbesondere nützlich für Immuntherapie und Impfung und können auch als diagnostische Werkzeuge für die Infektion oder für das Beobachten des Fortschrittes einer Impfung oder therapeutischen Regimen nützlich sein.
Zum Beispiel können chimäre Peptide verwendet werden, um auf natürlich vorkommende Antikörper gegen M Protein zu screenen. Alternativ dazu können spezifische Antikörper verwendet werden, um nach M Protein zu screenen. Techniken für solche Untersuchungen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen zum Beispiel Sandwich Assays und ELISA ein.
In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die chimären Peptide insbesondere für das Screenen auf Antikörper gegen M Protein nützlich und schaffen damit ein diagnostisches Protokoll für die Ermittlung von Streptokokken Infektion. Alternativ dazu können biologische Proben wie Blutproben, Sputum, Gewebe und Gewebeextrakte direkt auf M Protein gescreent werden und zwar unter Verwendung von Antikörpern die gegen das chimäre Peptid gezüchtet sind.
Dementsprechend ist ein Verfahren für die Diagnose von Streptokokken Infektion in einem Lebewesen vorgesehen, welches Verfahren das Kontaktieren einer biologischen Probe von dem genannten Lebewesen mit einer Antikörperbindung wirksamen Menge eines chimären Peptides für eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen um einen Antikörperchimäres Peptid-Komplex zu formen, und dann diesen Komplex zu ermitteln.
Die Gegenwart von M Protein Antikörpern im Blutserum, Geweben, Gewebeextrakt, oder anderen Körperflüssigkeiten eines Patienten kann durch Verwendung einer großen Auswahl von Immunoassay Techniken ermittelt werden, wie jene, die in den US-Patenten Nr. 4,016,043, 4,424,279 und 4,018,653 beschrieben sind. Diese schließen sowohl einseitige als auch zweiseitige, oder „Sandwich", Assays von nicht-kompetitiven Typen sowie auch herkömmliche kompetitive Bindungsassays ein. Die Sandwich-Assays sind unter diesen die am meisten nützlich und am meisten verwendeten Assays ein und sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung favorisiert. Es gibt eine Anzahl von Sandwich Assays Techniken und alle sind vorgesehen, um von der vorliegenden Erfindung umfasst zu sein. In einer typischen Vorwärtsuntersuchung wird kurz gesagt ein chimäres Peptid auf einen festen Substrat immobilisiert, um einen ersten Komplex zu bilden und die auf M Protein Antikörpern zu untersuchende Probe wird in Kontakt mit dem gebundenen Molekül gebracht. Nach einer angemessenen Inkubationszeit, also einer Zeitdauer, die ausreicht, um die Bildung eines chimären Peptid-Antikörpers sekundären Komplex zu bilden. Ein Antiimmunoglobulin-Antikörper, der mit einem zur Bildung eines ermittelbaren Signals fähigen Reportermolekül markiert ist, wird dann zugesetzt und inkubiert, wobei genügend Zeit gelassen wird, um einen tertiären Komplex von chimären Peptid-Antikörpern-markierter Antikörper zu bilden. Jedes nicht reagierte Material wird weggewaschen und die Gegenwart des ersten Antikörpers wird durch Beobachtung eines Signals, das durch das Reportermolekül produziert wird, bestimmt. Die Ergebnisse können entweder qualitativ durch bloße Beobachtung eines sichtbaren Signals oder kann auch quantitativ durch Vergleich mit einer Kontrollprobe, welche einen bekannten Gehalt von Hapten aufweist, bestimmt werden. Abänderungen von der Vorwärtsuntersuchung schließen einen gleichzeitigen Assay mitein, in welchem sowohl die Probe als auch der markierte Antikörper gleichzeitig zu dem gebundenen Antikörper zugesetzt werden oder eine Rückwärtsuntersuchung, in welcher der markierte Antikörper und die zu untersuchende Probe zuerst kombiniert werden, dann inkubiert werden und dann gleichzeitig zu dem gebundenen Antikörper zugesetzt werden. Diese Techniken sind wohl bekannt für die Fachleute und die Möglichkeit von kleineren Variationen werden leicht erkennbar sein. Ein ähnlicher Versuch wird angenommen, um M Protein aufzufinden. Die Antikörper, die oben verwendet werden, können monoklonal oder polyklonal sein.
Das feste Substrat ist üblicherweise Glas oder ein Polymer, wobei das üblicherweise am meisten verwendete Polymer Zellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen ist. Die festen Träger können in Form von Rohren, Perlen, Scheiben oder Mikroplatten oder jeder anderen Oberfläche, welche für die Ausführung eines Immunoassays passend ist, sein. Die Bindungsverfahren sind im Stand der Technik wohl bekannt und bestehen im Allgemeinen von quervernetzter kovalenter Bindung oder physikalischer Absorption von Molekül an den unlöslichen Träger.
Unter „Reporter-Molekül", wie es in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, ist ein Molekül zu verstehen, welches durch seine chemische Natur ein analytisch identifizierbares Signal produziert, welches die Auffindung von Antigen-gebundenem Antikörper ermöglicht. Die Auffindung kann entweder qualitativ oder quantitativ sein. Die am meisten verwendeten Reporter-Moleküle in dieser Art von Untersuchungen sind entweder Enzyme, Fluorophore oder Radionuklid enthaltende Moleküle (d.s. Radioisotope). Im Falle eines Immunoassays wird ein Enzym an einen zweiten Antikörper konjugiert, und zwar im Allgemeinen durch Glutaraldehyd oder Periodat. Allerdings, wie klar erkannt werden wird, gibt es eine große Vielzahl von verschiedenen Konjugationstechniken, welche für den Fachmann leicht zur Verfügung stehen. Üblicherweise verwendete Enzyme schließen Meerettichperoxidase, Glukoseoxidase, β-Galaktosidase und alkalische Phosphatase unter anderem ein. Die Substrate, die mit den spezifischen Enzymen zu verwenden sind, sind allgemein ausgewählt für die Produktion einer detektierbaren Farbveränderung aufgrund der Hydrolyse durch das entsprechende Enzym. Es ist auch möglich, fluorogene Substrate anzuwenden, welche ein fluoreszierendes Produkt ergeben.
Alternativ dazu können fluoreszierende Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch an Antikörper gebunden werden ohne deren Bindungskapazität zu verändern. Wenn sie durch Beleuchtung mit einem Licht von spezieller Wellenlänge aktiviert werden, absorbieren die Fluorochrom-markierten Antikörper die Lichtenergie, induzieren den Erregungsstatus in dem Molekül, welcher durch die Emission von Licht einer charakteristischen Farbe gefolgt ist, welche visuell mit einem Lichtmikroskop ermittelbar ist. Wie in der EIA wird dem Fluoreszenz-markierten Antikörper ermöglicht, an den ersten Antikörper-Hapten Komplex zu binden. Nach dem Wegwaschen von ungebundenem Reagenz, wird der verbleibende ternäre Komplex dem Licht einer entsprechenden Wellenlänge ausgesetzt, wobei die beobachtete Fluoreszenz die Gegenwart des Haptens von Interesse anzeigt. Immunfluoreszenz und EIA Techniken sind beide gut im Stand der Technik etabliert und sind für das vorliegende Verfahren besonders bevorzugt. Jedoch können auch andere Reporter-Moleküle wie Radioisotope, chemilumineszente oder biolumineszente Moleküle verwendet werden. Es ist für den Techniker klar erkennbar, in welcher Weise das Verfahren abzuändern ist, um für den erforderlichen Zweck zu passen. Es wird auch erkennbar sein, dass das vorstehend beschriebene auch verwendet werden kann, um chimäre Peptide zu markieren und diese direkt bei der Detektion von M Protein Antikörpern zu verwenden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von den chimären Peptiden, wie sie hierin beschrieben sind bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung als Impfstoff gegen GAS.
In einer verwandten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Mittel vor, welches ein hierin beschriebenes chimäres Peptid enthält, das als Impfstoff gegen GAS nützlich ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden nicht limitierenden Figuren und Beispiele beschrieben.
In den Figuren:
1 Aminosäuresequenzen von chimären Peptiden. Alle gezeigten Sequenzen beziehen sich auf die α-helikale Coiled-Coil-Heptad Wiederholung (a-b-c-d-e-f-g), wie unten gezeigt. A. Sequenz des Modell GCN4 Peptids, das von dem α-helikalen Coiled-Coil GCN4 Leucin Zipper Peptid abgeleitet ist (O'Shea et al. 1991). B. Sequenz des streptokokkalen M Protein Peptids p145 (Pruksakorn et al. 1992) in Ausrichtung mit der putativen Coiled-Coil-Heptad Wiederholung. C. Sequenz der chimären J Peptide (J1-9). Überlappung des 12-mer Fragments des p145 Peptids, wie es im Fettdruck gezeigt ist. Die konservativen Aminosäure-Rest Ersetzungen sind unterstrichen wiedergegeben. D. Sequenz des Kontroll-GCN4 Modellpeptids Jcon (G).
2 Reaktivität von Anti-p145 Mäuse-Sera gegen J Peptide, wobei die Reaktivität als mittlerer Absorptionswert bei 405 nm Wellenlänge dargestellt ist. Die Sera sind 1:100 verdünnt und die Repräsentanten sind gezeigt. Die Sera, die mit Diptherid Toxoid (DT) konjugiert sind, sind angegeben. NMS, normales Maus-Serum.
3 Reaktivität von Hochtiter Anti-p145 menschlichem Serum gegen J Peptide. Mittlerer Absorptionswert (405 nm) ist für ein Serum, das 1:100 verdünnt ist, gezeigt. Repräsentative Proben sind gezeigt (GBD, MT, MY, FL, TB, MG). NHS sind normale menschliche Sera.
4 ist eine graphische Wiedergabe von Zikulardichroismus Spektra von Peptiden in Gegenwart des α-Helix induzierenden Lösungsmittels, Trifluorethanol (TFE) bei 50% wiedergegeben. A, J_I1; B, J2; C, Jcon; D, p145. θ, molare Elliptizität. Die Peptide zeigten eine α-helikale Formation in wässriger Lösung nicht. Peptide J1, J3 und J4 wurden auch überprüft und diese zeigten ähnliche Profile wie J2.
5 ist eine graphische Wiedergabe die die ELISA Kartierung des nativen Epitops zeigt. Synthetische Peptid-Fragmente von C. elegans unc-15 (Tabelle 7B) wurden auf eine Mikrotiter-Platte (2 μg pro Vertiefung) als Schicht aufgebracht, mit monoklonalem Antikörper (mAb) NE1-6B2 inkubiert und der gebundene Antikörper wurde mit einem Antimaus-Antikörper und OPD kolorimetrischen Untersuchung bei 450 nm gemessen.
6 ist eine graphische Wiedergabe, die die ELISA Kartierung des chimären Epitops zeigt. Überlappende Fragmente von C. elegans unc-15, die in ein helikales Modellpeptid (Tabelle 8) eingebettet sind, wurden auf einer Mikrotiter-Platte (2 μg pro Vertiefung) als Schicht aufgebracht, inkubiert mit mAb NE1-6B2 und der gebundene Antikörper wird mit Antimaus-Antikörper und OPD kolorimetrischen Untersuchung bei 450 nm ermittelt. Peptide bd10, bd11, bc18, bc23, bd14, bd15 versetzt um 5 Reste ermittelt. Peptide bc17 bis bc25 wurden um 1 Rest versetzt. Die Kontrollpeptide av85, av86 und ba48 enthalten nur die helikale Modellpeptidreste.
7A ist eine graphische Darstellung, die die ELISA-Kartierung von chimären Minimal-Epitop zeigt. Verkürzte Fragmente von C. elegans unc-15, die in ein helikales Modellpeptid eingebettet sind (Tabelle 9A) wurden als Schicht auf einer Mikrotiter-Platte (2 μg pro Vertiefung) aufgebracht, mit mAb NE1-6B2 inkubiert und der gebundene Antikörper wurde mit Antimaus-Antikörper und OPD kolorimetrischen Untersuchung bei 450 nm ermittelt. Peptid c1 besteht nur aus dem 15mer Epitop. Kontrollpeptide av85, av86 und ba48 enthalten nur helikale Modellpeptidreste.
7B ist eine graphische Wiedergabe, die ELISA-Kartierung von chimären Epitop-Substitutionen zeigt. Chimäre Peptide, die von bc20 abgeleitet sind, wobei jeder Rest seinerzeit durch einen konservativen Ersatz (Tabelle 9B) substituiert wurde, wurde auf einer Mikrotiter-Platte (2 μg pro Vertiefung) als Schicht aufgebracht, inkubiert mit mAb NE1-6B2 und der gebundene Antikörper mit Antimaus-Antikörper und OPD kolorimetrische Untersuchung bei 450 nm detektiert.
8A ist eine Karte von C. elegans unc-15 Epitop, welches durch MAb NE1-6B2 erkannt wurde. Unter putativen Heptad-Wiederholungspositionen a und d indizierten oben stehend native unc-15 Sequenz. Epitope, die durch mAb NE1-6B2 erkannt wurden, sind in Fettdruck gezeigt.
8B ist eine zylindrische Netzdarstellung von C. elegans unc-15 Helix mit 3,5 Resten je Umdrehung, welche die polare Seite zeigt. Die Helix läuft von links nach rechts. Schraffierte Reste interagieren mit dem mAb NE1-6B2; durchgezogene Kreise zeigen einen kritischen Rest; strichlierte Kreise sind weniger kritische Reste.
In 9 ist eine graphische Wiedergabe, welche eine ELISA-Untersuchung von Antikörper-Reaktion auf chimäres Peptid zeigt. Chimäre Peptide bc20, ba39, bd1, bd2 und Peptid c1 wurden auf einer Mikrotiter-Platte ((2 μg pro Vertiefung) schichtmäßig aufgetragen und mit Maus-Antisera gegen bd1 (Anti-bd1) oder bd2 (Anti-bd2) oder Präimmun-Mausesera (präimmun) inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mit Antimaus-Antikörper und OPD kolorimetrischer Untersuchung bei 450 nm ermittelt.

Die folgenden Einzel- und Drei-Buchstabenabkürzungen werden für die Aminosäure-Reste verwendet:

Aminosäure	Drei-Buchstabenabkürzung	Ein-Buchstabensymbol
Alanin	Ala	A
Arginin	Arg	R
Asparagin	Asn	N
Asparaginsäure	Asp	D
Cystein	Cys	C
Glutamin	Gln	Q
Glutaminsäure	Glu	E
Glycin	Gly	G
Histidin	His	H
Isoleucin	Ile	I
Leucin	Leu	L
Lysin	Lys	K
Methionin	Met	M
Phenylalanin	Phe	F
Prolin	Pro	P
Serin	Ser	S
Threonin	Thr	T
Tryptophan	Trp	W
Tyrosin	Tyr	Y
Valin	Val	V
Jeglicher Rest	Xaa	X

BEISPIEL 1
CHEMIKALIEN
Alle Chemikalien und Lösungsmittel, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, waren analytisch Reagenz-Güteklasse, außer es ist anderweitig festgestellt. Polysterol (1 % Vol./Vol.-% Divinylbenzol) p-Methylbenzhydrylaminhydrochlorid Harz (0,81 mäq/g oder Harz-Substitution), tert-Butyloxycarbonyl (t-Boc) Aminosäuren, 1,3-Diisopropylcarbodiimid (DIC), N-Hydroxybenzotriazol (HOBT), Trifluoressigsäure (TFA) wurden von Auspep (Australien) gekauft.
BEISPIEL 2
LEBEWESEN
Lebewesen aus der Gruppe der australischen Ureinwohner, einige mit gegenwärtiger oder vergangener Geschichte von RF/RHD, die Bewohner der streptokokkalen endemischen Gemeinden des Northern Territorys, Australien waren, wurden studiert. Es wurde gefunden, dass über 90 % dieser Lebewesen natürlich auftretende Antikörper gegen p145 besitzen (Pruksakorn et al, 1994a). Serum von Spendern wurde bei –20°C bis zum Gebrauch gelagert.
BEISPIEL 3
MÄUSE
B10.BR Mäuse (Animal Resources Centre, Willetton, Western Australia) von welchen gezeigt ist, das sie auf p145 reagieren, wurden für Immunisierungsstudien verwendet.
BEISPIEL 4
PEPTIDSYNTHESE
Peptide wurden durch manuelle Festphasentechniken unter Verwendung der gleichzeitigen Mehrfachpeptid-Synthese „Teebeutel" Methode von Houghten (1985) synthetisiert. Das Start-Harz war p-Methylbenzhydrylaminhydrochlorid und herkömmliche N-tert-Butyloxycarbonyl (t-Boc) Chemie wurde verwendet (Merrifield, 1963). Alle Aminosäure-Gruppen wurden an der α-Amin Position mit der t-Boc Gruppe geschützt und die folgenden Seitenketten Schutzgruppen wurden verwendet; Benzylester (Glu, Asp), 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (Lys), Benzyl (Ser), Tosyl (Arg).
Aminosäure-Kopplungen wurden mit 1,3-Diisopropylcarbodiimid in Dichlormethan ausgeführt und t-Boc Gruppen wurden in jedem Durchgang mit 55 % Vol./Vol.-% TFA/Dichlormethan entfernt. N-Hydroxybenzotriazol war in den Kopplungen mit Asn und Gln einbezogen. Die Peptide wurden von dem Harz durch Behandeln mit Fluorwasserstoff abgespalten, mit Diethylether ausgefällt und aus 10 Vol./Vol.-% Essigsäure lyophilisiert.
Die Roh-Peptide wurden auf einer semi-präparativen C18 Umkehrphasen HPLC Säule (Biorad) unter Verwendung eines Linear-Gradienten von 2 % Vol./Vol. Acetonitril in Wasser zu 100 % Vol./Vol. Acetonitril (beide Lösungsmittel enthalten 0,1 % Vol./Vol. TFA) gereinigt. Die gereinigten Peptide waren homogen, wie es durch Umkehrphasen HPLC und Laser-Desorption Flugzeitmassenspektometrie (LaserMat, FinniganMat, UK) bestimmt.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisierten Peptide sind in den Tabellen 1A, 1B und 1C gezeigt. Peptide 144, 145 und 146 sind überlappende Peptide, die in der konservierten C-terminalen Region des M Proteins enthalten sind. Jcon ist ein Modell-Peptid, das auf einer Haptad-Wiederholung des Hefe-Proteins GCN4 basiert. Die Peptide J1-J9 sind Hybrid-Peptide, die auf dem Jcon-Peptid und p145 basieren. 145.1-145.5 und J_I1-J_I9 stellen kürzere Sequenzen innerhalb der p145 Sequenz dar. Die Peptide 169 und 171 sind vom menschlichen Herzmuskel Myosin (Liew et al, 1990) bzw. menschlichen Skelettmuskel Myosin (Saez et al, 1986) abgeleitet und zeigten die größte Homologie zwischen diesen Proteinen und p145.
BEISPIEL 5
T-ZELL PROLIFERATIONSUNTERSUCHUNGEN
Zur Sensibilisierung von murinen T-Zellen wurden die Tiere an der Schwanzbasis mit 30 μg von emulgierten Peptid immunisiert und abfließende Lymphknotenzellen wurden am Tag 8 genommen und in vitro mit Antigen, wie früher beschrieben, stimuliert (Pruksakorn et al 1994b). Nach vier Tagen wurden die Kulturen mit 0,5 μCi von ³H-Thymidin gepulst, um das Ausmaß der Proliferation zu bestimmen. Lymphozyten Aktivierung wurde durch Abschätzen des Stimulationsindex [SI] (Proliferation in Gegenwart von spezifischem Peptid/Proliferation in Abwesenheit von Peptid) gemessen.
Menschliche Peptid-spezifischen T-Zellen Proliferation wurde durch Kultivieren von menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL) mit Peptid (oder ohne Peptid zur Kontrolle) bestimmt und die Lymphozyten Proliferation wurde nach sechs Tagen bestimmt, wie beschrieben (Pruksakorn et al 1994b). Die Lymphozyten-Aktivierung wurde wie zuvor für Mäuse-Untersuchungen bestimmt.
BEISPIEL 6
VERGLEICH VON PROTEIN-SEQUENZEN
Die Protein-Sequenzen für menschliches Herzmuskel-Myosin und menschliches Skelettmuskel-Myosin wurden auf ihre Homologie mit den 20 Aminosäure-Sequenzen für p145 unter Verwendung des GCG (Wisconsin) Programms, BESTFIT untersucht. Die Homologie-Regionen mit p145 sind durch zwei Peptide 169 und 171 (Tabelle 1C) repräsentiert.
BEISPIEL 7
ZIRKULARDICHROISMUS (CD) SPEKTREN
Diese wurden bei Raumtemperatur mit einem Aviv 62DS CD Spektrometer (Lakewood, NJ) aufgezeichnet. Die Peptide waren in einer Konzentration von 20 mM oder 40 mM in 10 mM Na Phosphat-Puffer, pH 7,0, 50 % Vol./Vol. Trifluorethanol. Die Daten wurden bei 1 nm Intervallen von 250 nm bis 190 nM gesammelt. Die Elliptizität ist als mittlere Rest-Elliptizität [θ] wiedergegeben.
BEISPIEL 8
PRODUKTION von MAUS-ANTISEREN
B10.BR und B10.D2 Mäuse wurden subkutan an der Schwanzbasis (Pruksakorn et al, 1992) immunisiert. Ein 50 μL Gesamtvolumen wurde verabreicht, welches 30 μg Peptid aufgelöst in PBS und in komplettem Freund's Adjuvans emulgiert enthält. Peptide 145.1-145.5 wurden mit Diphtherie Toxoid (DT) konjugiert unter Verwendung von Glutaraldehyd Fixierung vor der Immunisierung, wogegen alle anderen Peptide unkonjugiert verabreicht wurden. Die Mäuse wurden mit 30 μg von konjugierten Peptid in PBS aufgefrischt.
BEISPIEL 9
ELISA
Die Protokolle für ELISA wurden früher beschrieben (Pruksakorn et al 1992; 1994a). Die Peptide wurden mit einer Konzentration von 0,5 μg/ml beschichtet, mit Ausnahme der Peptide 145.1-145.5 und J_I1-J_I9 wo 1 μg/ml verwendet wurde.
Die Titer für Maus- und Menschenseren wurden als signifikant bewertet, wenn sie größer als drei Standardabweichungen oberhalb des Mittelwertes für normale Maussera oder oberhalb des Hintergrunds (ohne Serum) für menschliche Sera sind. Peptid-spezifische Antikörper-Depletions-Assays wurden mit menschlichen Sera durch Inkubation in Peptid (p145)-beschichteten Platten ausgeführt bis die spezifische Bindung nahe zu verbraucht war. Als negative Kontrolle wurden Sera in Plattenähnlich inkubiert, welche mit einem irrelevanten Schistosomen Peptid beschichtet waren. Die p145 mangelhaften bzw. schistosomen-mangelhaften Sera wurden dann auf Platten transferiert, die mit einem Test-Peptid beschichtet waren, um die Gegenwart von Antikörpern gegen das Test-Peptid zu bestimmen. Alle Reaktionen wurden mit OPD-Substrat Kit (Sigma Chemical Co) entwickelt und die Absorption bei 450 nm gelesen.
BEISPIEL 10
PEPTID INHIBIERUNG von OPSONISATION
Menschliche Sera wurden bei 60°C für 15 Minuten hitzeinaktiviert. Das Serum wurde dann mit 100 μg Peptid oder PBS für 30 Minuten vor der Zugabe von GAS und frischem Spender heparinisiertem Vollblut inkubiert. Der Prozentsatz der Inhibierung wurde durch Vergleich der koloniebildenden Einheiten, die mit oder ohne Peptid gewachsen sind, und relativ zur Kontrolle von nicht zugegeben menschlichen Serum berechnet.
BEISPIEL 11
GRUNDPRINZIP FÜR DIE KONSTRUKTION VON CHIMÄREN PEPTIDEN
Wenn von einem Epitop bekannt ist, dass es innerhalb einer speziellen Protein-Struktur-Konformation vorkommt, wie beispielsweise einer α-helikalen Coiled-Coil, dann kann ein Modellpeptid synthetisiert werden, um zu dieser Konformation zu falten. Dieses Peptid wird das Rahmenpeptid. Modell-Peptide, die in eine α-helikale Coiled-Coil falten, wurden studiert. Bei der Konstruktion eines parallel zweisträngigen Coiled-Coil-Motivs sind verschiedene allgemeine Erwägungen wesentlich (Cohen und Parry, 1990). Die a und d Positionen haben große apolare Reste, die Positionen b, c und f sind im Allgemeinen polar und geladen, die Positionen e und g favorisieren üblicherweise ionische Zwischenketten Interaktionen (d.h. das Säure/Basen Paar von Glu/Lys). Es wurde festgestellt, dass, wenn die Positionen a und d durch V und L, oder I und L besetzt sind, ein Coiled-Coil-Dimer favorisiert ist, wogegen I und I die Trimer-Formation favorisiert und L und I Tetramer-Interaktionen favorisieren (Harburg et al. 1994).
Ein α-helikales Coiled-Coil Modellpeptid wurde basierend auf der Struktur eines Peptids, welches mit dem GCN4 Leucin-Zipper korrespondiert (O'Shea et al. 1989; 1991) hergestellt. Dieses Peptid hat eine sieben Reste Leucin-Wiederholung (in der d-Position) und ein Konsensus Val in der α-Position. Das erste Heptad enthält die Sequenz:
M K Q L E D K (SEQ ID NR.:3),
welche verschiedene der Merkmale, die in einer stabilen Coiled-Coil Heptad-Wiederholung gefunden wurden, aufweist. Diese enthält ein Säure/Basenpaar (Gly/Lys) an den Positionen e und g, polare Gruppen in den Positionen b, c und f (in Übereinstimmung mit der Vorhersage von Lupas et al (1991)). Eine Modell-Heptad-Wiederholung wurde von den Konsensus-Merkmalen von dem GCN4 Leucin-Zipper-Peptid abgeleitet:
V K Q L E D K (SEQ ID NR.:2),
welche, wenn sie wiederholt wurden, ein Modellpeptid ergeben würde, (VKQLEDK)_n, wobei diese das Potenzial besitzt eine α-helikale Coiled-Coil zu bilden. Ein solches Modell-Peptid, welches vier Heptad Wiederholungen aufweist, wird (GCN4)₄ [1A] genannt. Überlappende Fragmente eines zu prüfenden Konformations-Epitops werden dann innerhalb des Modells Coiled-Coil Peptids eingebettet, um mit der Heptad-Wiederholung zusammenzupassen, um ein chimäres Peptid zu ergeben.
BEISPIEL 12
STREPTOKOKKALE M PROTEIN PEPTIDE
Das streptokokkale M Protein Peptid p145 wurde wie vorstehend beschrieben (Pruksakorn et al., 1992, Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/AU93/00131 [ WO 93/21220 ]) hergestellt, wie auch die verkürzten Fragmente 145.1, 145.2, 145.4, 145.5, 145.12, 145.13, 145.14 (Pruksakorn, 1994), welche in den Tabellen 1A und 1B wiedergegeben sind.
Die Sequenz von streptokokkalen M Protein im Bereich des Peptids p145 wurde auf Coiled-Coil Heptad Wiederholungen analysiert und die putative Heptad-Positionen a bis g zugeordnet (1B). Peptid p145 wurden in neun 12mer Peptide aufgesplittet, welche durch einen Rest überlappen und Hinzufügen von flankierenden GCN4 Peptide, die in das (GCN4)₄ Rahmenpeptid eingebettet sind, um neun J chimäre Peptide (J1-J9), wie in 1C gezeigt, zu ergeben. Konservative Aminosäure-Sustitutionen wurden in das J Peptid eingebaut, wo immer ein identischer Rest sowohl in dem GCN4-Modellpeptid als auch in der p145 Sequenz gefunden wurde. Ein Kontrollpeptid (Jcon), welches auf dem GCN4 Modell-Peptid, das in 1A gezeigt ist, basiert, wurde synthetisiert, welches auch alle diese konservativen Aminosäure-Substitutionen (1D) enthält.
Die chimären Peptide J1-4 und Kontroll-Peptid Jcon wurden HPLC gereinigt. Die Peptide J5-9 wurden so verwendet, wie sie synthetisiert wurden.
BEISPIEL 13
DAS IMMUNDOMINANTE EPITOP AUF PEPTID 145 IST KONFORMATIV
Es wurde ursprünglich versucht, das Minimal-Epitop p145 unter Verwendung von überlappenden Acht-mer und 12-mer Peptide innerhalb p145 (Peptide 145.1-145.5, J_I1, J_I5, J_I7 (Tabelle 1A und 1B)) zu kartieren. Mause-Anti-p145 Antisera erkannten das überlappende p146 (Tabelle 1C) nicht und auch nicht jegliches andere kürzere Peptid innerhalb p145, obwohl eine p145-spezifische Immun-Reaktion in Mäusen unter Verwendung von zwei kürzeren Peptiden (145.1, 145.5) konjugiert mit Diphtherietoxoid (Tabelle 2) erzeugt werden konnte. Die Resultate waren ähnlich, ob immunisierende Peptide mit Diphtherie Toxoid konjugiert waren oder nicht konjugiert waren. Während mehr als 90 % von Menschen in Gegenden leben, in welchen man der GAS stark ausgesetzt war, Antikörper gegen p145 zeigen, reagierten die Mehrzahl dieser menschlichen Sera mit hohen Titern (> 6.400) gegen p145 nicht mit kürzeren Peptiden (J_I1-J_I9) (Tabellen 1B, 3). Diese Resultate deuteten darauf hin, dass obwohl eines oder mehrere lineare Epitope innerhalb von p145 existierten es auch ein dominantes Konformations-Epitop gab, das nach Immunisieren mit p145 oder nach natürlicher Aussetzung gegen GAS erkannt wird. Zirkulardichroismus deutet darauf hin, das obwohl p145 helikale Neigung (in 50 % TFE) zeigt, ein kürzeres 12-mer Peptid (J_I1: LRRDLDASREAK [SEQ ID NR: 23] nicht weiter vorschlug (4), dass das immundominante Epitop, das durch p145 exprimiert wird, konformativ ist.
BEISPIEL 14
KARTIEREN DES KONFORMATIONS-EPITOPS
Es wurde dann eine Strategie entwickelt, um ein nichtverwandtes Protein zu verwenden, das auch Heptad-Periodizität ähnlich dem M Protein mit hydrophoben und Helix unterstützenden Resten aufweist und um diese Sequenz von p145 innerhalb dieses anderen Peptids einzunisten. Das gewählte Peptid wurde auf dem Leucin-Zipper Motiv in GCN4, dem DNA Bindungsprotein von Hefe (O'Shea et al, 1991) basiert. Die Konsensus-Sequenz von der Heptad-Wiederholung, die in GCN4 vorhanden ist, ist Val-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys und ein 28 Aminosäure-Peptid basierend auf diese Wiederholung wurde geschaffen mit wenig Substitutionen um das „Jcon" genannte Peptid (Tabelle 1B) zu ergeben. Ein 12 Aminosäure-Fenster der Peptid 145 Sequenz wurde in das Jcon Peptid inseriert in einer Weise, um jegliche potentielle helikale Struktur zu konservieren. Das Fenster wurde, jeweils um einen Rest verschoben, um die neun Peptide (J1→J9) zu ergeben, was die gesamte p145 Sequenz repräsentiert. Die korrespondierenden 12 Aminosäure Insert-Sequenzen (J_I1→J_I9) wurden ebenso für Kontrollzwecke (Tabelle 1B) synthetisiert.
P145 Maus-Antikörper zeigten einen Bereich von Reaktivität zu J chimären Peptiden (2). Einige dieser J-Peptide (d.h. J7, J8) enthielten die gleichen 12mer Sequenzen wie oben angeführt (145.12, 145.13, 145.14), aber waren innerhalb des GCN4-Rahmens gegenwärtig (d.h. J1, J5, J7). Einige Sera reagierten mit J-Peptiden, welche die N-terminalen Reste von p145 repräsentieren (d.h. J1, J2), einige mit C-terminalen Resten und einige mit beiden (d.h. J1, J2, J4, J7, J8) (2). Keine der Seren reagierte mit Jcon-Sequenz.
Menschliche Sera, die einen hohen Titer von 145 Antikörper enthielten, zeigten ein ähnliches Spektrum der Spezifität gegenüber den J-Peptiden und ergaben einen „Fingerprint" von Peptid-spezifischen Antikörpern. Alle menschlichen Seren reagierten mit J2 (3). Zwei Sera reagierten sowohl mit allen J-Peptiden als auch mit dem Jcon Peptid. In diesen Fällen können spezifische Reaktionen mit den J-Peptiden durch Kreuzreaktivität mit einer GCN4-ähnlichen Struktur maskiert werden. Alle verbleibenden menschlichen Seren scheiterten mit dem G-Peptid zu reagieren, was spezielle Reaktionen mit den p145-Sequenzen andeutet.
Seren von Menschen, die in einer Region mit hoher Streptokokken Exposition leben und von Mausen, die mit p145 immunisiert werden, wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, diese chimären Peptide zu binden. Bei dreiundzwanzig menschlichen Seren, deren Titer gegen Peptid 145 6.400 überstiegen, wurden getestet (Tabelle 3). Antikörper in 19 dieser Sera banden ein oder mehr chimäre Peptide mit ähnlich hohen Titer, erkannten jedoch irgendeinen der überlappenden 8-mer Peptide 145.1→145.5 überhaupt nicht. Vier Seren reagierten mit einem (J_I3) der 9 überlappenden getesteten 12-mer Peptide (J_I1-J_I9) mit einem Titer von > 3.200 (Tabelle 3). Keines der 11 getesteten Seren, die nicht Antikörper gegen p145 enthielten, enthielten Antikörper gegen irgendeines der chimären Peptide, was stark darauf hinweist, dass Antikörper, die mit p145 reagieren auch mit den chimären Peptiden reagieren. Das chimäre Peptid, das am häufigsten durch Antipeptid 145+ve Antisera erkannt wurde, war J2, das mit einiger Erkennung von J1 und J3 (Tabelle 3). Um zu bestätigen, dass P145-spezifische Antikörper J2 erkannten, wurden p145 Absorptionsstudien durchgeführt und es konnte gezeigt werden, dass p145-abgereicherte humane Seren die Fähigkeit verloren haben, an das J2 chimäre Peptid, das ursprünglich erkannt wurde (Tabelle 4), zu binden. Somit bestanden die erkannten Kernreste aus RRDLDASREAKK [SEQ ID NR:24], obwohl für einige Individuen (die J2 jedoch nicht J1 noch J3 erkannten) die Kernreste RDLDASREAK [SEQ ID NR:25] waren. Diese Spanne korrespondiert zwischen 3 und 3,3 Windungen einer Alpha Helix. Der Antikörper-Fußabdruck erkennt in ähnlicher Weise unzusammenhängende Reste, die durch helikales Falten der Peptide zusammengebracht wurden. Zirkulardichroismus deutet darauf hin, dass die chimären Peptide J1→J4 die Neigung für eine helikale Formation in 50 % TFE (4) besitzen.
Da Myosin auch ein Coiled-Coil Molekül ist und Peptide, die vom menschlichen Muskel abgeleitet wurden, die Sequenz ähnlich mit p145 (Tabelle 1B) aufweisen, haben die menschlichen Sera das Potential, kreuzreaktive Epitope zu erkennen. Nur zwei Sera reagierten mit diesen Peptiden (169 und 171) (Tabelle 3) und, somit gibt es nur eine geringe Kreuzreaktion zwischen Antikörpern, die p145 und J2 mit p169 und p171 erkennen.
BEISPIEL 15
KONFORMATIONSMÄSSIG BEIBEHALTENES PEPTID J2 KANN OPSONISCHE ANTIKÖRPER BINDEN
Um zu bestimmen, ob menschliche Antikörper, die für das Peptid J2 spezifisch sind, Opsonisation vermitteln können, wurde untersucht, ob freie J2-Peptide Opsonisierung durch menschliche Anti-Sera inhibieren. Diese Untersuchung wurde verwendet, um zu demonstrieren, dass p145 selbst das Ziel von opsonischen menschlichen Antikörpern ist. J2 (100 μg/ml) wurde so mit zum Serum zugesetzt, das hohe Titer von Antikörpern gegen p145 aufweist, um seine Wirkung auf Opsonisation zu bestimmen und es wurde gefunden, dass die Opsonisation durch drei von drei Seren inhibiert wurde, welche Antikörper gegen J2 (Tabelle 5) aufweisen, jedoch nicht durch Seren ohne Anti-J2-Antikörper. Ein irrelevantes 20-mer Peptid, das eine nicht-streptokokkale Sequenz kopiert, inhibierte die Opsonisation nicht.
BEISPIEL 16
DAS T ZELL EPITOP AUF PEPTID 145 KANN VON DEM B-ZELL EPITOP UNTERSCHIEDEN WERDEN
Um zu bestimmen, ob T-Zellen die gleiche Region des Peptids wie die kritischen Antikörper-Bindungspeptide erkennen, wurden die B10.BR Responder-Mäuse mit p145 immunisiert und Lymphknoten Drainage-Zellen mit p145, J2 und J_I2 stimuliert. Es gab eine signifikant geringere Erkennung von J2 und J_I2 (Tabelle 6). Periphere Blut T-Zellen von 21 RHD Patienten aus australischen Ureinwohnern und 8 Kontrolllebewesen aus australischen Ureinwohnern wurden ebenfalls auf die Reaktion gegen Peptid J2 getestet. Keine Reaktion wurde von der Kontrollgruppe auf das Peptid ermittelt und keines davon reagierte auf das Peptid J2.
BEISPIEL 17
MENSCHLICHE ANTIKÖRPER GEGEN P145, J2 UND J7 KÖNNEN GRUPPE A STREPTOKOKKEN IN DER GEGENWART VON MENSCHLICHEN NEUTROPHILEN OPSONISIEREN
Antikörper gegen p145 wurden unter Verwendung einer Säule affinitätsgereinigt, die multiple Kopien von p145 aufwies. Protein A gereinigte Antikörper wurden dann durch die Säule passieren gelassen, und p145-spezifische Antikörper eluiert. Vor dem Durchleiten über die Säule waren Antikörper, die p145 und Tetanus-Toxoid erkannten, in der Immunglobulin Präparation enthalten. Nach dem Durchgang waren die Antikörper gegen p145 nach wie vor anwesend, jedoch die Antikörper gegen Tetanus-Toxoid waren nicht mehr erkennbar. Diese Antikörper und eine Kontrollzusammensetzung der gleichen Menge von menschlichen Antikörpern ohne Reaktivität gegen p145 wurden dann in einer Opsonisierungsuntersuchung verwendet. Wie in Tabelle 10 gezeigt, konnten gereinigte Anti-p145-Antikörper die Anzahl von Kolonien des Typs 5, Gruppe A Streptokokken zwischen 58 und 94 % (Mittelwert: 80 %) in Bezug auf die Kontroll-Immunglobuline reduzieren.
Verschiedene synthetische Peptide wurden dann zu diesen gereinigten Antikörpern zugesetzt und ihre Wirkung auf Opsonisation wurde bestimmt (Tabelle 11). Die Peptide, die verwendet wurden, waren p145, J2, J7 und nicht-spezifische Peptide, die eine schistosomale Sequenz kopieren. Freies p145 konnte Opsonisation um 73 bis 88 % (Mittel: 83 %) im Vergleich zu nicht-spezifischen Peptiden inhibieren, freies J2 konnte Opsonisation um 89-93 % (Mittel: 92 %) inhibieren und freies J7 konnte Opsonisation um 82-86 % (Mittel: 84 %) inhibieren. Diese Daten deuten an, dass menschliche Antikörper, die für p145, J2 und J7 spezifisch sind, in der Lage sind, Gruppe A Streptokokken zu opsonisieren.
BEISPIEL 18
Um einen Versuch zur Kartierung von Epitopen in α-helikalen Coiled-Coil Proteinen zu illustrieren wurde eine Region innerhalb des Caenorhabditis elegans Paramyosin Proteins im Detail studiert. Wie es für andere Coiled-Coil enthaltende Proteine üblich ist, enthält Nematode-Paramyosin eine sieben-Reste Periodizität, was stark darauf hindeutet, dass ein großer Anteil des Moleküls in einer Coiled-Coil Konformation vorliegt. Paramyosin, ein Kernprotein des dicken Filaments in vielen wirblosen Tieren, ist in C. elegans durch ein einziges Gen kodiert, unc-15 (Waterston et al, 1977). Verschiedene unc-15 Mutanten besitzen veränderte Phänotypen, was zu hoch desorganisierten Muskel-Strukturen führt. Von einer von diesen, Allel e1215, wurde gezeigt, dass es einen schwach unkoordinierten Phänotyp aufweist und die Analyse des Gens deutet auf eine einzelne Aminosäure-Substitution ⁸⁰⁹Q gegen R (Gengyo-Ando und Kagawa, 1991) hin. Das durch den monoklonalen Antikörper (mAb) NE1-6B2 erkannte Epitop, was an einer Reaktion mit Paramyosin von den e1215 Mutante scheiterte, wurde an dieser Punkt-Mutation kartiert.
Der angewendete Versuch lag darin, überlappende Peptide, die von einem α-helikalen Coiled-Coil Konformations-Epitop stammen, zu verwenden und diese Peptide zwischen helikalen Flankierungspeptiden einzubauen, welche von völlig unverwandten Proteinen mit einer ähnlichen nativen Konformation stammen. Die resultierenden chimären Peptide können auf ihre immunologische Aktivität getestet werden, d.h. Antigenität (Erkennung durch mAb) oder Immunogenität (Produktion von entsprechender Antikörper-Reaktion). In dem Fall von C. elegans Paramyosin Protein, unc-15, wird von der Struktur angenommen, das sie ein α-helikales Coiled-Coil ist und diese Konformation kann notwendigerweise vorhanden sein für eine optimale immunologische Reaktion in Bezug auf das Epitop, das durch mAb erkannt ist. Eine Serie von chimären Peptiden, die auf unc-15 basieren, ermöglichte eine feine Kartierung des Minimal B-Zell Epitops, das durch mAb NE1-6B2 erkannt wird. Dieser Versuch hat das Potential, Konformations-Epitope zu kartieren und Minimal-Epitope für die Verwendung als Impfstoff-Kandidaten zu entwerfen.
(i) Grundprinzip für die Konstruktion von chimären Peptiden
Wenn von einem Epitop bekannt ist, das es in spezieller Proteinstruktur Konformation enthalten ist, d.h. eine α-Helix, dann kann ein Modellpeptid synthetisiert werden, um in diese Konformation zu falten. Dieses Peptid wird das Rahmenpeptid. Modellpeptide, die in ein α-helikales Coiled-Coil Stadium falten, sind gut bekannte Studien. In der Konstruktion von parallel zwei-strängigen Coiled-Coil Motiven (a-b-c-d-e-f-g), sind verschiedene generelle Erwägungen wichtig (Cohen und Parry, 1990). Die a und d Position hat große apolare Reste, die Positionen b, c, f sind generell polar und geladen, und die Positionen e und g werden üblicherweise zwischen Ketten, ionische Interaktionen favorisieren (d.s. Säure/Basenpaare Glu/Lys). Es wurde erkannt, dass wenn die Positionen a und d durch V und L oder I und L besetzt sind, ein Coiled-Coil Dimer favorisiert ist, wogegen I und I eine Trimer-Formation favorisieren und L und I Tetramer Interaktionen favorisieren (Harbury et al 1994).
Ein Modell α-helikales Coiled-Coil Peptid, was auf der Struktur eines Peptids basiert, das dem GCN4 Leucin Zipper entspricht (O'Shea et al 1989, 1991), wurde konstruiert. Dieses Peptid hat eine sieben-Reste Leucin-Wiederholung (in der d Position) und ein Konsensus Valin (in der a Position). Das erste Heptad enthält die Sequenz: M K Q L E D K [SEQ ID NR:3] welche verschiedene der Merkmale, die in einer stabilen Coiled-Coil Heptad-Wiederholung vorhanden sind, zeigen. Diese beinhalten ein Säure/Basenpaar (Gly/Lys) bei Positionen e und g, und polare Gruppen in Positionen b, c, f. Eine Modell Heptad-Wiederholung wurde von den Konsensus-Merkmalen des GCN4 Leucin-Zipper Peptids: V K Q L E D K [SEQ ID NR:3] abgeleitet, welches wenn wiederholt wird, ein Modell-Peptid (V K Q L E D K)_n ergeben würde mit dem Potential ein α-helikales Coiled-Coil zu bilden. Überlappende Fragmente eines zu untersuchenden Konformations-Epitops kann innerhalb des Modell Coiled-Coil Peptids eingebettet werden, um ein chimäres Peptid zu ergeben.
(ii) Native Peptid-Epitop Kartierung von überlappenden Fragmenten von unc-15
Die Sequenz von C. elegans unc-15 Paramyosin-Protein in der Region des Epitops, das durch den mAb NE1-6B2 erkannt wird, wurde auf Coiled-Coil Heptad-Wiederholungen analysiert und die putative Heptad-Positionen a an g übertragen (Tabelle 7A).
In einem anfänglichen Versuch, das mAb NE1-6B2 Epitop innerhalb des unc-15 Proteins zu kartieren, wurden überlappende 21mer Peptide, die um 1 Aminosäure-Rest versetzt waren, synthetisiert (Tabelle 7B) und durch ELISA untersucht. Peptid ba39 hatte die höchste ELISE-Reaktivität was nahe legt, das ein 21mer Peptid lang genug ist, um das Epitop zu erkennen. Monoklonale Antikörper-Reaktivität war auf die Peptide ba37 bis c9 (5) beschränkt. Die negative Reaktivität von mAb für Peptid ba36 schreibt die Erstreckung des Epitops zum C-Terminus des Proteins hin und bestätigt die Notwendigkeit des ⁸⁰⁹Q Restes innerhalb des Epitops (Gengyo-Ando und Kagawa, 1991). Die Antikörper-Reaktivität nimmt ab, wenn die Peptide vom N Terminus her verkürzt sind, wobei das Peptid C9 nur schwach erkannt wird, was darauf hindeutet, das die Minimal-Epitopreste zwischen der Überlappung der Peptide ba37 und c8: das 14mer Peptid ADRLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NR: 26). Allerdings wurde die größte Reaktivität mit dem Peptid ba39 gefunden, einen weit längeren 21mer Peptid MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID NR:43], von welchen angenommen werden kann, dass es das optimale native Epitop ist.
(ii) Chimäre Peptid-Epitop-Kartierung von unc-15
Die unc-15 Protein-Region, die das mAb NE1-6B2 Epitop enthält, wurde in sechs 15-mer Peptide, die um 5 Reste versetzt sind, aufgesplittet und durch Hinzufügen von Hexamer helikalen Flankierungspeptiden in ein α-helikales Coiled-Coil Rahmenwerk eingebettet, um chimäre Peptide bd10, bd11, bc18, bc23, bd14 und bd15 (Tabelle 8A) zu ergeben. Das gleitende Fenster von 15 Resten würde über vier komplette Windungen einer α-Helix (3,5 Reste pro Windung) enthalten. Die Peptide bc18, bc23 und bd14 enthalten den wesentlichen Rest ⁸⁰⁹Q. Die helikalen Flankierungspeptide basieren auf dem Modell α-helikalen Coiled-Coil Peptid (VKQLEDK)_n und wurden in den Rahmen mit der Periodizität der Coiled-Coil Protein Heptad-Wiederholung von unc-15 eingesetzt. Konservative Aminosäure-Substitutionen wurden in das chimäre Peptid eingearbeitet, wenn immer ein identischer Rest in beiden helikalen Modell-Peptiden und der unc-15 Sequenz gefunden wurde. Diese Ersetzungen wurden konstruiert, um eine korrekte helikale Coiled-Coil Konformation (Cohen und Parry, 1990) sicherzustellen. Die folgenden Substitutionen wurden verwendet: Position a, V zu I (hydrophober Rest, dimere Bevorzugung); b, K zu R (ähnlich geladene funktionelle Gruppe); c, Q zu N (gleiche funktionelle Gruppe); d, L zu A (hydrophober Rest); e, E zu Q (ähnlich großer Rest); f, D zu E (die gleiche geladene funktionelle Gruppe); g, K zu R (ähnlich geladene funktionelle Gruppe). Alle diese Austauschreste werden üblicherweise an ihrer entsprechenden Position in Coiled-Coil Proteinen gefunden (Lupas et al, 1991). Nur das chimäre Peptid bc18 wurde in ELISA durch mAb NE1-6B2 (6) erkannt. Diese Roh-Epitop-Kartierung legt nahe, dass die 25mer Peptid-Überlappung zwischen ⁷⁹⁰V und ⁸¹⁴E, abgeleitet von den Peptiden bd11 und bc23, das Epitop enthielt. Kontrollpeptide, av85 und av86 basiert auf dem (V K Q L E D K)_n Modellpeptid und (V K Q L E D K)₃ (Peptid ba48) wurden durch den mAb NE1-6B2 nicht erkannt.
Das unc-15 Protein wurde nun in 15mer Peptide mit einer Verschiebung von einem Rest aufgesplittet, um das mAb NE1-6B2 Epitop noch genauer zu kartieren. Wieder wurde jedes Fragment innerhalb der helikalen Flankierungspeptide eingesetzt, um die chimären Peptide, die in der Tabelle 8B aufgelistet sind, zu ergeben. Die höchste ELISA Reaktivität mit mAb NE1-6B2 wurde für das Peptid bc20 (6) erhalten. Die Aktivität war nach Entfernung des ⁸⁰⁹Q-Restes (Peptid bc17) am C Terminus und des 798_R Restes (Peptid bc 22) an dem N Terminus des unc-15 Peptids, in innerhalb der chimären Peptide eingebettet sind, minimal. Dies deutet daraufhin, dass das minimale Epitop zwischen den Resten 798_R und 809_Q ein 12meres Peptid: RLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NR:27], angeordnet ist. Dieses Epitop ist 2 Reste kürzer, als jenes, das durch die native Epitop-Kartierung oben (5) definiert ist.
(iii) Chimäres Peptid Minimal-Epitop-Kartierung von unc-15
Unter Verwendung des chimären Peptid-Versuches wurde das optimale Epitop, das innerhalb des Peptids bc20 enthalten war, verkürzt, um das Minimal-Epitop besser zu definieren, das durch mAb NE1-6B2 erkannt wird. Die synthetisierten chimären Peptide sind in Tabelle 9A aufgelistet. Die Verkürzung des eingebetteten Peptids vom C Terminus (Peptide bd3, bd4) verminderte die ELISA-Reaktivität, wie es die Verkürzung vom N Terminus her (Peptid be39) (7A) ebenfalls tat. Eine weitere Abspaltung der Reste entweder vom N oder C Terminus des Epitops (Peptide bd5, bd6, c4, c5) wurde nicht wirklich toleriert. Allerdings war das Peptid c6, welches die Reste ⁸⁰¹E bis 811_A enthielt, nach wie vor ELISA reaktiv. Obwohl die überlappende Fragment-Epitop-Kartierung nahe legen würde, dass RLTEKLNIQKRQ das Minimal-Epitop sei, deutet die Verkürzungskartierung darauf hin, dass die Reste ⁷⁹⁷D, ⁸¹⁰L und ⁸¹¹A, die die Region flankieren, kritisch sind. Dies definiert die Sequenz DRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID NR:95] als das Minimum optimal Epitop. Weiters wurde ein 15mer Peptid, das aus dem Optimal-Epitop ⁷⁹⁷D bis ⁸¹¹A (Peptid c1) bestand, zu einem geringeren Grad erkannt, als das gleiche Peptid, das in das chimäre Peptid bc20 eingebettet war. Dies hebt die Bedeutung der flankierenden Region, um maximale Reaktivität sicherzustellen hervor.
Die Kartierung von kritischen Resten, die in dem mAb NE1-6B2 Epitop für ELISA-Reaktivität notwendig sind, wurde durch konservative Ersetzung von einzelnen Resten erreicht. Die Substitutions-Kartierung wurde auf dem chimären Peptid bc20 (enthält das optimale-Epitop) basiert und die synthetisierten Peptide sind in Tabelle 9B aufgelistet. Die helikalen Rahmenwerk-Reste wurden für die Epitop-Reste entsprechend dem Modellpeptid-Regeln, wie oben angeführt, ersetzt; Position a, V; b, K; c, Q; d, L; e, E; f, D; g, K. Für den Fall, dass identische Reste an der gleichen Position zwischen dem Rahmenwerk-Peptid und der Epitop-Sequenz aufgefunden wurden, wurden konservative Ersatzreste substituiert (siehe chimäre Peptid Epitop Kartierung oben). Die ELISA-Reaktivität war aufgehoben, wenn Substitutionen für die Reste ⁷⁹⁸R, ⁸⁰¹E, ⁸⁰⁵I, ⁸⁰⁸R und ⁸⁰⁹Q in den Peptiden be40, be43, be47, be50 bzw. be51 (7B) vorgenommen wurden. Eine Verminderung der Epitop-Reaktivität wurde für zwei andere Substitutionen gefunden, nämlich ⁷⁹⁷D und ⁸¹¹A in den Peptiden be39 bzw. be53. Von Interesse war, dass die Substitution bei ⁸⁰²K (K zu D) und ⁸¹⁰L (L zu V) die Reaktivität erhöht hat. Diese Resultate sind in der 8A wiedergegeben. Wenn die Sequenz unc-15, welche das mAb NE1-6B2 Epitop enthält bildlich als zylindrisches Netz (8B) gezeigt wird, sind alle kritischen Reste an der hydrophilen Seite der Helix zu finden.
(iv) Immunogenität von chimären Peptiden
Quackenbush-Mäuse wurden mit chimären Peptiden immunisiert, um die Fähigkeit eine Epitop spezifische Antikörper-Reaktion auszulösen, zu bestimmen. Das chimäre Peptid bc20 wurde mit einem N-terminalen Zysteinrest für das Koppeln an Diphtherie-Toxoid über eine MCS Verbindung (Peptid bd1, CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID NR:28] synthetisiert. Die Mäuse wurden intra pertioneal mit dem Äquivalent von 125 μg des Peptids immunisiert, das an Diphtherie-Toxoid, das in kompletten Freund's Adjuvans emulgiert war, konjugiert ist. Eine Auffrischung von 125 μg Äquivalent Peptid-Diptherie-Konjugat in unvollständigem Freund's Adjuvans wurde nach vier Wochen verabreicht. Antisera, die gegen das Peptid bd1 entstanden sind, erkannten das Peptid bc20, nicht aber das Peptid ba39 oder das Peptid c1 (9). Während Antisera, die gegen ein Kontroll-chimäres- Peptid gezüchtet sind, das auf dem helikalen Modellpeptid, mit passenden Aminosäure-Substitutionen basiert (Peptid bd2, CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK) gezüchtet sind, Peptid bc20 erkannte, nicht jedoch das Peptid ba39 oder das Peptid c1. Daher war die Antikörper-Reaktion, die mit dem chimären Peptid bd1 ausgelöst wurde, gegen ein Konformations-Epitop, das nur in den Peptiden bc20 und ba39 zu finden ist.
Fachleute werden erkennen, dass die hierin beschriebene Erfindung für Variationen oder Abänderungen anders als die spezifisch beschriebenen zugänglich ist. Es ist zu verstehen, dass die Erfindung alle solche Variationen und Modifikationen umfasst. Die Erfindung schließt auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzung und Verbindungen ein, die in der Beschreibung angeführt sind oder auf welche in der Beschreibung hingewiesen wird und zwar individuell oder kollektiv, und auch jegliche und alle Kombinationen von irgendwelchen zwei oder mehr der genannten Schritte oder Merkmale. TABELLE 1A Liste der überlappenden synthetischen Fragmente von p145

Überlappende Peptide, die die p145 Region des M Proteins von Gruppe A Streptokokken wiedergibt; Aminosäure-Positionen 337 bis 356.

Fußnote: Ein Buchstaben-Aminosäure-Code: A, Alanin, D, Asparginsäure; E, Glutaminsäure; G, Glycin; K, Lysin; L, Leucin; N, Asparagin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; V, Valin; Fettgedruckte Reste repräsentieren die M Protein-Sequenz.

Spezifitäten von menschlichen Sera zu chimären Peptiden
Sera	144	p145	146	J1	J2	J3	J4	J5	J6	J7	J8	J9	J_I1	J_I2	J_I3	J_I4-9	Jeon	MyoPep
AB1	++	+++	-	+++	+++	+++	++	++	-	-	-	-	-	-	++	-	-	-
AB2	+	+++	+	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	++	-	-	-
AB3	-	++	-	-	+++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	++	-	-	-
AB4	+++	+++	+++	-	+++	+++	-	-	-	++	++	-	-	-	-	J,8+	-	-
AB5	+++	+++	-	++	++	++	-	++	-	-	-	+++	+	+	-	J,59+	-	-
AB6	+++	+++	+++	+++	+++	+++	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-
AB7	+++	+++	-	+++	+++	+++	-	-	-	-	-	-	ND	ND	ND	ND	-	-
AB8	+++	+++	-	+++	+++	++	-	-	-	-	-	-	ND	ND	ND	ND	-	-
AB9	+++	+++	+++	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB10	+++	+++	-	++	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB11	+	++	-	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB12	-	+++	-	+++	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB13	-	+++	-	++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-
AB14	-	++	-	+++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB15	-	++	-	++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB16	+++	+++	-	+++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB17	-	+++	-	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB18	-	++	-	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
NAB1	+++	+++	-	-	++	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
NAB2	-	+++	-	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	-	+	+	J,9+	-	-
AB19	++	++	-	-	-		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++
AB20	++	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+++
AB21	+++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB22	-	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB23	++	+++	-	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND		-	-	-	-	-

AB24	+	+	-	++	+++	++	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-
AB25	++	+	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB26	-	+	-	+	-	-	-	-	-	-	-	+		-	-	-	-	-
													-
AB27	+++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

(Fortsetzung)
Eigenschaften von menschlichen Sera zu chimären Peptiden
Sera	144	p145	146	J1	J2	J3	J4	J5	J6	J7	J8	J9	J_I1	J_I2	J_I3	J_I4-9	Jeon	MyoPep
NAB3	++	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB28	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-		171++
AB29	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB30	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB31	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-		-	-	-		-
NAB4	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-		-	-	-	-	-
AB32	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB33	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB34	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
AB36	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-			-	-	-	-	-
+++,Titer ≥ 12800; ++,12800 > Titer≥ 6400; +,6400 > Titer ≥ 3200; -,Titer ≤ 1600

TABELLE 4 Änderungen in J2 Titer nach einer Vorinkubierung mit entweder p145 oder Schistosoma Peptid

Serum	J2 Titer pro Inkubation	J2 Titer nach Absorption mit Schistosoma-Peptid	J2 Titer nach Absorption mit p145
Gumb	> 12,800	6400	400
TB	> 12,800	3200	< 400
ME	> 12,800	3200	400
GW	> 12,800	800	< 400

Fußnote: Die Seren wurden 1:200 verdünnt und auf ELISA-Platten, die entweder mit p145 oder mit einem irrelevanten Schistosoma Peptid inkubiert waren. Die Sera wurden durch fünf nacheinanderfolgenden Runden von Depletion genommen und p145-spezifische Antikörperliter wurden aufgefunden, welche sequenziell mit jeder Runde abnahmen. Die Sera wurden dann auf Platten transferiert, die mit J2 beschichtet sind und die Titer wurden bestimmt. TABELLE 5 Titer gegen Peptid J2

Patient (Zustand) Titer gegen pJ2 CFU¹ kein Peptid CFU Peptid J2 % inhibierung

JL (RHD) 12800 230 940 76

NH (RHD) 6400 90 355 75

ME (RHD) 6400 45 245 82

Fußnote: ¹CFU, mittlere Kolonieanzahl von 2 Platten × Verdünnungsfaktor. M5 GAS Inoculum Größe = 27,5.

Stimulierendes Peptid	Stimulations-Index
p145	29
J2	7.8
J_I2	6.45
Tet tox (-ve Kontrolle)	0,69
PPD (+ve Kontrolle)	22

Fußnote: Die Mäuse wurden mit p145, wie beschrieben, und Drainage Lymphknotenzellen, die in vitro mit Antigenen bei Konzentrationen herausgefordert, die als optimal empfunden wurden, immunisiert. Für synthetische Peptide waren die verwendete Konzentration 30 μg/ml. TABELLE 7 Liste von synthetischen Peptiden, die von nativem C. elegans unc-15 abgeleitet sind

TABELLE 8 Liste von synthetisierten chimären Peptiden, welche Fragmente von C. elegans unc-15 enthalten

TABELLE 9 Liste von synthetischen chimären Peptiden, welche verkürzte oder substituierte Fragmente von C. elegans unc-15 enthalten

TABELLE 10

145 Affinität gereinigtes Tier (Titer gegen p145)	Mittlere CFU	Nicht-opsonischer Donator IgG (Titer gegen p145)	Mittlere CFU	% Differenz in CFU	Gesamt IgG Titer
P101 (3200)	540	C1(<100)	4880	89	3200
P101 (3200)	540	C2(<100)	9000	94	3200
P105 (3200)	2040	C1(<100)	4880	58	3200
P105 (3200)	2040	C2(<100)	9000	77	3200

Bibliographie:

Beachy EH, Bronze M, Dale JB, Kraus W, Poirier T and Sargent S, (1988) Vaccine 6: 192-196.
Cohen C and Parry DAD (1990) Proteins: structure, functional and genetics 7: 1-15.
Cohen C and Parry DAD (1986) TIBS 11: 245-248.
Gengyo-Ando K and Kagawa H (1991) J. Mol. Biol. 219: 429-441.
Geysen HM, Rodda SJ, Mason TJ, Tribbick G and Schoofs PG (1987) J. Immunological Methods 102: 259-274.
Harbury PB, Kim PS and Alber T (1994) Nature 371: 80-83.
Harbury PB, Zhang T, Kim PS and Alber T (1993) Science 262: 1401-1407.
Houghten RA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135.
Liew CC et al (1990) Nucl. Acids. Res. 18: 3647.
Lupas A, van Dyke M and Stock J (1991) Science 252: 1162-1164.
Manula and Fischetti (1980) J. Exp. Med. 151: 695-708.
Merrifield RB, (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154.
O'Shea EK, Rutkowski Rand Kim PS (1989) Science 243: 538-542.
O'Shea EK, Klemm JD, Kim PS and Alber T (1991) Science 254: 539-544.
Pruksakorn S, Galbraith A, Houghten RA and Good MF (1992) J. Immunol. 149: 2729-2735.
Pruksakorn S, (1994) PhD thesis, University of Queensland.
Pruksakorn S, Currie B, Brandt E, Martin D, Galbraith A, Phornphutkul C, Hunsakunachai S,
Manmontri A and Good MF (1994a) Lancet 344: 639-642.
Pruksakorn S, Currie B, Brandt E, Phornphutkul C, Hunsakunachai S, Manmontri A, Robinson
JH, Kehoe MA, Galbraith A and Good MF (1994b) Intl. Immunol. 6: 1235-1244.
Saez, L et al (1990) Nucl. Acids. Res. 14: 2951.
Scott JK and Smith GP, (1990) Science 249: 386-390.
Waterston RH et al (1977) J. Mol. Bio. 177: 679-697.
Yan Y, Winograd E, Viel A, Cronin T, Harrison SC and Branton D, (1993) Science 262: 2027-3030.

SEQUENZPRPOTOKOLL

Claims

Chimäres Peptid, welches aufweist: (i) eine erste Aminosäuresequenz, welche, in ihrem nativen Stadium, ein Konformationsepitop darstellt, wobei dieses Konformationsepitop in der ersten Aminosäuresequenz in einem isolierten Stadium nicht vorliegt; und (ii) eine zweite Aminosäuresequenz, welche in der Lage ist in ein Gerüst der Coiled-Coil-Struktur zu falten, welche der nativen Konformation der ersten Aminosäuresequenz ähnlich ist; wobei die ersten und die zweiten Aminosäuresequenzen von unterschiedlichen Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen abgeleitet sind oder auf diese basieren, wobei die erste Aminosäuresequenz in die Coiled-Coil-Konformation innerhalb der zweiten Aminosäuresequenz eingefügt ist, so dass die erste Aminosäuresequenz das Konformationsepitop darstellt.
Cimäres Peptid nach Anspruch 1, wobei die zweite Aminosäuresequenz eine α-Helix Coiled-Coil Konformation annimmt.
Chimäres Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Aminosäuresequenz von dem Streptokokken-M-Protein ableitet ist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 3, wobei die erste Aminosäuresequenz ein B-Zellen-Konformationsepitop aus innerhalb der Aminosäuresequenz LRRDLDASREAKKQVEKALE [SEQ ID Nr: 1] oder ein funktionelles und/oder chemisches Äquivalent von einem oder mehreren dieser Aminosäurereste aufweist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 4, wobei wenigstens drei Aminosäuren aus der in SEQ ID Nr: 1 wiedergegebenen Aminosäuresequenz ausgewählt sind, welche ein Konformations-B-Zellenepitop bilden.
Chimäres Peptid nach Anspruch 4, wobei wenigsten fünf Aminosäuren aus der in SEQ ID Nr: 1 wiedergegebenen Aminosäuresequenz ausgewählt sind, welche ein Konformations-B-Zellenepitop bilden.
Chimäres Peptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Aminosäuresequenz von Caenorhabditis elegans abgeleitet ist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 7, wobei die erste Aminosäuresequenz von Caenorhabditis elegans Paramyosin Protein unc-15 abgeleitet ist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 7, wobei die erste Aminosäuresequenz ein B-Zellen-Konformationsepitop aus innerhalb der Aminosäuresequenz CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID Nr: 28] oder ein funktionelles und/oder chemisches Äquivalent von einem oder mehreren dieser Aminosäurereste aufweist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 7, wobei die erste Aminosäuresequenz ein B-Zellen-Konformationsepitop aus innerhalb der Aminosäuresequenz MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID Nr: 43] aufweist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 7, wobei die erste Aminosäuresequenz ein B-Zellen-Konformationsepitop aus innerhalb der Aminosäuresequenz ADRLTEKLNIQKRQ [SEQ ID Nr: 26] oder ein funktionelles und/oder chemisches Äquivalent von einem oder mehreren dieser Aminosäurereste aufweist.
Chimäres Peptid nach Anspruch 7, wobei die erste Aminosäuresequenz ein B-Zellen-Konformationsepitop aus innerhalb der Aminosäuresequenz RLTEKLNIQKRQ [SEQ ID Nr: 27] oder ein funktionelles und/oder chemisches Äquivalent von einem oder mehreren dieser Aminosäurereste aufweist.
Impfstoff gegen Gruppe A Streptokokken, welcher ein chimäres Peptid nach Anspruch 5 und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält, wobei die wenigstens drei Aminosäuren aus innerhalb der Aminosäuresequenz LRRDLDASREAKKQVEKALE [SEQ ID Nr: 1] ausgewählt sind und ein B-Zellen-Konformationsepitop von Streptokokken-M-Protein bilden.
Impfstoff gegen Caenorhabditis elegans, welcher ein chimäres Peptid nach Anspruch 8 und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält, wobei die erste Aminosäuresequenz wenigstens drei Aminosäuren aus innerhalb der Aminosäuresequenz CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID Nr: 28] ausgewählt sind und ein B-Zellen-Konformationsepitop von C.elegans unc-15 Protein bilden.
Impfstoff gegen Caenorhabditis elegans, welcher ein chimäres Peptid nach Anspruch 10 und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält, wobei die wenigstens drei Aminosäuren aus innerhalb der Aminosäuresequenz MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID Nr: 43] ausgewählt sind und ein B-Zellen-Konformationsepitop von C.elegans unc-15 Protein bilden.
Impfstoff gegen Caenorhabditis elegans, welcher ein chimäres Peptid nach Anspruch 11 und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält, wobei wenigstens drei Aminosäuren aus innerhalb der Aminosäuresequenz ADRLTEKLNIQKRQ [SEQ ID Nr: 26] ausgewählt sind und ein B-Zellen-Konformationsepitop von C.elegans unc-15 Protein bilden.
Impfstoff gegen Caenorhabditis elegans, welcher ein chimäres Peptid nach Anspruch 12 und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält, wobei die wenigstens drei Aminosäuren aus innerhalb der Aminosäuresequenz RLTEKLNIQKRQ [SEQ ID Nr: 27] ausgewählt sind und ein B-Zellen-Konformationsepitop von C.elegans unc-15 Protein bilden.
Verfahren zum Kartieren von Regionen von amphipathischen Helices auf einem Peptid, Polypeptid oder Protein, welche von Antiköpern erkannt werden, und/oder zum Bestimmen eines Minimalepitops auf einem Peptid, Polypeptid oder Protein, welches Verfahen aufweist: Bestimmung der nativen Konformation des genannten Peptids, Polypeptids oder Proteins oder des Abschnittes davon, der ein mutmaßliches Epitop trägt; Herstellen von Peptidfragmenten des genannten Peptids, Polypeptids oder Proteins; Einsetzen oder anderweitig Darbieten der genannten Peptidfragmente in ein zweites Peptid, welches von einem anderen Peptid, Polypeptid oder Protein stammt oder auf diesen basiert, das in der Lage ist, in ein Gerüst der Coiled-Coil-Struktur zu falten, welche der nativen Konformation des genannten ersten Peptids, Polypeptids oder Proteins ähnlich ist, wobei die Peptidfragmente in die Coiled-Coil-Konformation innerhalb des zweiten Peptids eingefügt werden, so dass das mutmaßliche Epitop auf dem Peptidfragment in einer Konformation präsentiert wird, die zur immunologischen Interaktivität fähig ist, dann Screenen der genannten Peptidfragmente auf ihre immunologische Interaktivität.