DE69526665T2

DE69526665T2 - Antigen bindende peptide (abtides) aus peptidbibliotheken

Info

Publication number: DE69526665T2
Application number: DE69526665T
Authority: DE
Inventors: Vernon L. Alvarez
Original assignee: Cytogen Corp
Current assignee: Cytogen Corp
Priority date: 1994-09-21
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2015-09-21
Also published as: CZ85597A3; US6015561A; AU3719395A; EP0789783B1; ATE217344T1; DE69526665D1; IL115373A0; CA2200684A1; EP0789783A1; JPH10506463A; EP0789783A4; WO1996009411A1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Peptide, die imstande sind, Liganden von Interesse spezifisch zu binden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Peptide, die imstande sind, die spezifische Bindung eines Rezeptors an seinen Liganden, eines Antikörpers an sein Antigen und dergleichen nachzuahmen. Derartige Peptide sind als "Abtide" bekannt. Abtide werden im ersten und im zweitem Schritt eines Screenings von Peptidbibliotheken identifiziert. Der erste Screening-Schritt verwendet einen Antikörper oder Rezeptor als ersten Target- Liganden und identifiziert Peptidsequenzen ("Mimetope"), die spezifisch an den Antikörper oder den Rezeptor binden. Die Mimetope werden dann in einen zweiten Target-Liganden in einem zweiten Screening-Schritt eingearbeitet, um Abtide zu identifizieren, die das Mimetop binden. Abtide ahmen die Bindungsspezifität des Antikörpers (für sein Antigen) oder des Rezeptors (für seinen Liganden) nach, der als erster Target-Ligand im ersten Screening-Schritt verwendet wurde. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Abtiden anstelle von Antikörpern in Testverfahren. Die Erfindung stellt auch Abtid-Zusammensetzungen für einen Einsatz in der Therapie und der Diagnose von Krankheiten bereit.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

2.1. PEPTIDBIBLIOTHEKEN

Der Einsatz von Peptidbibliotheken ist in diesem Fachgebiet gut bekannt. Solche Peptidbibliotheken werden derzeit allgemein mittels eines von zwei Ansätzen konstruiert. Gemäß dem einen Ansatz werden Peptide chemisch in vitro in unterschiedlichen Formaten synthetisiert. Beispielsweise beschreiben Fodor et al., 1991, Science 251: 767-773, den Einsatz einer komplexen instrumentellen Ausrüstung, von Photochemie und einer Computergesteuerten Bestandskontrolle für die Synthese eines bekannten Arrays kurzer Peptide auf einem einzelnen mikroskopischen Objektträger. Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86 beschreiben Mischungen freier Hexapeptide, bei denen der erste und der zweite Rest eines jeden Peptids individuell und spezifisch definiert waren. Lam et al., 1991, Nature 354: 82-84 beschreiben einen "One bead, one peptide"-Ansatz, bei dem ein System einer Festphasen-Splitsynthese eine Bibliothek von Peptiden erzeugte, wobei auf jedem Kügelchen der Kollektion eine einzelne Zufallssequenz von Aminosäureresten immobilisiert war. Der überwiegende Teil der Systeme zur chemischen Synthese ist auf die Erzeugung von Arrays aus kurzkettigen Peptiden ausgerichtet, allgemein von weniger als ungefähr 10 Aminosäuren, und insbesondere von ungefähr 6 bis 8 Aminosäuren. Ein direktes Sequenzieren der Aminosäuren, für sich allein oder in Kombination mit einem komplexen Protokollierungssystem der Peptid-Syntheseschemata, ist erforderlich, wenn diese Bibliotheken verwendet werden sollen.
Gemäß einem zweiten Ansatz unter Einsatz gentechnologischer Verfahren wurden Peptide in biologischen Systemen entweder als lösliche Fusionsproteine oder als Viruscapsid- Fusionsproteine exprimiert.
Verschiedene Peptidbibliotheken gemäß dem zweiten Ansatz haben den M13-Phagen verwendet. M13 ist ein filamentärer Bakteriophage, der in den letzten 20 Jahren in molekularbiologischen Laboratorien als Arbeitspferd gedient hat. Die Teilchen des M13-Virus bestehen aus 6 verschiedenen Capsid-Proteinen und einer Kopie des viralen Genoms in Form eines einzelsträngigen, ringförmigen DNA-Moleküls. Nach der Einführung der M13-DNA in eine Wirtszelle wie E. coli wird sie in eine doppelsträngige, ringförmige DNA umgewandelt. Die virale DNA trägt einen zweiten Replikationsorigin, der für die Erzeugung der einzelsträngigen DNA, die man in den Virusteilchen findet, verwendet wird. Während der Morphogenese des Virus kommt es zu einer geordneten Zusammensetzung der einzelsträngigen DNA und der viralen Proteine, und die Virusteilchen werden in einem Prozess, der einer Sekretion sehr ähnlich ist, aus den Zellen abgegeben. Das M13-Virus ist, im Gegensatz zu anderen Bakteriophagen (beispielsweise λ), weder lysogen noch lytisch; die Zellen setzen nach der Infektion chronisch Viren frei. Dieses Merkmal führt in infizierten Kulturen zu hohen Virustitern, d. h. 10¹² pfu/ml.
Das Genom des M13-Phagen ist ~8000 Nucleotide lang und wurde vollständig sequenziert. Das Viruscapsid-Protein, das Protein III (pIII), ist für Infektion von Bakterien verantwortlich. Bei E. coli tritt das Pillin-Protein, das durch den F-Faktor codiert wird, mit dem pIII-Protein in Wechselwirkung und ist für die Aufnahme des Phagen verantwortlich. Deshalb werden alle E.- coli-Wirtszellen für das M13-Virus als männlich betrachtet, da sie den F-Faktor tragen. Verschiedene Forscher haben über Mutationsanalysen nachgewiesen, dass das 406 Aminosäuren lange pIII Capsid-Protein zwei Domänen aufweist. Der C-Terminus verankert das Protein auf der Virushülle, während Abschnitte des N-Terminus von pIII für die Wechselwirkung mit dem Pillin-Protein von E. coli essentiell sind (Crissman und Smith, 1984, Virology 132: 445-455). Es wurde zwar gezeigt, dass der N-Terminus des pIII-Proteins für die Virusinfektion erforderlich ist, aber das extreme N-terminale Ende des reifen Proteins toleriert Veränderungen. 1985 publizierte George Smith Experimente, in denen die Verwendung des pIII-Proteins des Bakteriophagen M13 als experimentelles System für die Expression eines heterologen Proteins auf der Oberfläche der Virushülle berichtet wurde (Smith, 1984, Science 228: 1315-1317). Später wurde unabhängig voneinander von zwei Gruppen erkannt, dass das Gen-Display-System des pIII des M13-Phagen ein nützliches System für die Kartierung von Antikörperepitopen sein könnte. De la Cruz et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 4318-4322 klonierten und exprimierten Abschnitte der cDNA, die für das Oberflächenhüllprotein von Plasmodium falciparum codiert, in das bzw. im pIII-Gen, und rekombinante Phagen wurden bezüglich einer Immunreaktivität mit einem polyklonalen Antikörper getestet. Parmley und Smith, 1988, Gene 73: 305-318 klonierten und exprimierten Segmente des β-Galactosidase-Gens von E. coli in das bzw. im pIII-Gen und identifizierten Rekombinanten, die das Epitop eines monoklonalen Antikörpers gegen β-Galactosidase trugen. Die letzteren Autoren beschrieben auch einen Prozess, den sie "biopanning" nannten, bei dem Mischungen rekombinanter Phagen mit biotinylierten monoklonalen Antikörpern inkubiert wurden, und Komplexe aus Phagen und Antikörper konnten spezifisch mit Streptavidin-beschichteten Plastikschalen gewonnen werden.
1989 schlugen Parmley und Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218, vor, dass kurze, synthetische DNA-Segmente, die in das pIII-Gen kloniert sind, eine Bibliothek von Epitopen darstellen könnten. Diese Autoren argumentierten, dass es, da lineare Epitope oft eine Länge von ~6 Aminosäuren haben, möglich sein sollte, eine rekombinante Zufalls-DNA-Bibliothek zur Expression aller möglichen Hexapeptide für eine Isolierung von Epitopen, die an Antikörper binden, zu verwenden.
Scott und Smith, 1990, Science 249: 386-390, beschreiben die Konstruktion und Expression einer "epitope library" von Hexapeptiden auf der Oberfläche von M13. Die Bibliothek wurde erzeugt, indem eine mit Bgl I verdaute Oligonucleotidsequenz von 33 Basenpaaren in einen mit Sfi I verdauten Phagen fd-tet, d. h. fUSE5 RF, insertiert wurde. Das Fragment von 33 Basenpaaren enthält eine zufällige oder "degenerierte" codierende Sequenz (NNK)&sub6;, wobei N für G, A, T oder C steht und K für G oder T steht. Die Autoren stellten fest, dass die Bibliothek aus 2 · 10&sup8; Rekombinanten bestand, die 4 · 10&sup7; verschiedene Hexapeptide exprimierten; theoretisch exprimierte diese Bibliothek 69% der 6,4 · 10&sup7; möglichen Peptide (20&sup6;). Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, beschrieben ebenfalls eine ähnliche Bibliothek von Hexapeptiden, die als Fusionen des pIII-Gens des M13-fd-Phagen exprimiert wurden. Die PCT-Veröffentlichung WO 91/19818 vom 26. Dezember 1991 von Dower und Cwirla beschreibt eine ähnliche Bibliothek von pentameren bis octameren Zufallsaminosäuresequenzen.
Devlin et al., 1990, Science, 249: 404-406 beschreiben eine Peptidbibliothek von ungefähr 15 Resten, die unter Verwendung eines NNS-Codierungsschemas für die Oligonucleotidsynthese erzeugt wurde, wobei S für G oder C steht.
Christian und seine Kollegen haben eine Phage-Display-Bibliothek beschrieben, die Decapeptide exprimiert (Christian et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718). Die Ausgangs-DNA wurde mittels eines Oligonucleotids erzeugt, das die degenerierten Codons [NN(G/T)]&sub1;&sub0; mit einem selbst-komplementären 3'-Terminus umfasste. Diese Sequenz erzeugt, indem sie eine Haarnadelstruktur bildet, durch ein Selbst-Priming eine Replikationsstelle, die von der T4-DNA- Polymerase zur Erzeugung des komplementären Stranges verwendet werden konnte. Die doppelsträngige DNA wurde für die Klonierung in den fUSE5-Vektor, der von Scott und Smith, vgl. oben, beschrieben worden war, an den Sfi-I-Stellen am 5'-Terminus und an der Haarnadelstruktur gespalten.
Andere Forscher haben andere Viruscapsid-Proteine für die Expression nicht-viraler DNA auf der Oberfläche von Phagen-Partikeln verwendet. Das Protein pVIII ist ein Haupt-Viruscapsidprotein des M13-Phagen und tritt mit der einzelsträngigen DNA der M13-Viruspartikel an seinem C-Terminus in Wechselwirkung. Es ist 50 Aminosäuren lang und kommt in ungefähr 2 700 Kopien pro Partikel vor. Der N-Terminus des Proteins liegt frei und toleriert Insertionen, obwohl von großen Inserten berichtet wurde, dass sie den Zusammenbau der pVIII-Fusionsproteine zu Viruspartikeln verhindern (Cesareni, 1992, FEBS Lett. 307: 66-70). Zur Minimierung der negativen Wirkungen der pVIII Fusionsproteine wurde ein Phagemid-System eingesetzt. Bakterienzellen, die das Phagemid tragen, werden mit einem Helferphagen infiziert, und sie sekretieren Viruspartikel, die eine Mischung aus Wildtyp-Molekülen und pVIII-Capsid- Fusionsmolekülen tragen. pVIII hat auch als Ort für die Expression von Peptiden auf der Oberfläche von M13-Viruspartikeln gedient. Sequenzen von vier und sechs Aminosäuren, die verschiedenen Abschnitten des Haupt-Oberflächenantigens von Plasmodium falciparum entsprachen, wurden in das vergleichbare Gen des filamentären Bakteriophagen fd kloniert und exprimiert (Greenwood et al., 1991, J. Mol. Biol. 220: 821-827).
Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149-157, beschreibt die Konstruktion einer Bibliothek über einen mühsamen Prozess, der das Hybridisieren von Oligonucleotiden von ungefähr 17 oder 23 degenerierten Basen mit einer palindromischen Sequenz von 8 Nucleotiden Länge an ihren 3'-Enden umfasst. Das führte zur Expression von Zufalls-Hexa- oder -Octapeptiden als Fusionsproteine mit dem β-Galactosidase-Protein in einem bakteriellen Expressionsvektor. Die DNA wurde dann mit Klenow-DNA-Polymerase in eine doppelsträngige Form umgewandelt, mit stumpfen Enden in einen Vektor ligiert und dann in Form von Hind-III-Fragmenten frei gesetzt. Diese Fragmente wurden dann in einem Expressionsvektor an den C-Terminus einer verkürzten β-Galactosidase kloniert, so dass 10&sup7; Rekombinanten erzeugt wurden. Die Kolonien wurden dann lysiert, auf Nitrocellulose-Filterer geblottet (10&sup4;/Filter) und bezüglich einer Immunreaktivität mit mehreren verschiedenen monoklonalen Antikörpern getestet. Durch wiederholte Testrunden wurden verschiedene Klone isoliert und anschließend sequenziert.
Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869, beschrieben ein System, bei dem Zufallspeptide mit dem Carboxy-Terminus des lac-Repressors fusioniert wurden. Die Fusionsproteine enthielten einen intakten lac-Aminoterminus (der für die spezifische Bindung des lac-Repressors an die DNA-Sequenzen verantwortlich ist, die die Stellen des lac-Operators ausmachen). Die Nucleotid-Sequenzen, die für das Fusionsprotein codierten, wurden in ein Plasmid kloniert, das Kopien der lac-Operatorstelle enthielten. Somit wurde das Fusionsprotein, wenn es in Bakterien exprimiert wurde, an die Operatorstelle des Plasmids, das für es codierte, gebunden. Das führte zu einer physikalischen Verknüpfung zwischen den Fusionsproteinen und dem Gen, das für es codierte. Wenn Bakterien, die das Plasmid enthielten, mit Liganden gescreent wurden, für die Bindungspartner isoliert werden sollten, dann wurden die Fusionsproteine, die Peptide umfassten, die spezifisch den Liganden banden, isoliert, und sie trugen die Gene mit sich, die für diese Fusionsproteine codierten.
WO 94/18318 beschreibt Bibliotheken aus sogenannten TSARs ("Totally Synthetic Afflnity Reagents"), die einen ausgewählten Liganden binden. Ein TSAR wird als ein konkateniertes heterofunktionelles Protein, Polypeptid oder Peptid beschrieben, das wenigstens zwei funktionelle Bereiche enthält. Ein Bereich ist eine bindende Domäne mit einer Affinität für einen ausgewählten Liganden, der andere ist eine Effektordomäne. Die bindende Domäne wird durch ein Oligonucleotid codiert, das unvorhersagbare Nucleotide umfasst, wobei die unvorhersagbaren Nucleotide als eine durchgehende Sequenz oder mehrere durchgehende Sequenzen angeordnet sind, und wobei die Gesamtzahl der unvorhersagbaren Nucleotide größer als oder ungefähr gleich 60 und kleiner als oder ungefähr gleich 600 ist. Die Effektordomäne wird durch eine Oligonucleotidsequenz codiert, die für ein Protein oder ein Peptid codiert, das die Expression oder den Nachweis der Bindungsdomäne verstärkt bzw. erleichtert. Eine Bibliothek aus TSARs kann unter Verwendung des gewählten Liganden gescreent werden.
Eine umfassende Übersicht über verschiedene Typen von Peptidbibliotheken findet sich bei Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233-1251.

2.2. LIGANDEN FÜR DAS SCREENEN VON PEPTIDBIBLIOTHEKEN

Das Screening von Peptidbibliotheken ist generell auf die Verwendung einer beschränkten Zahl von Liganden beschränkt gewesen. Am häufigsten war der Ligand ein Antikörper (Parmley und Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott und Smith, 1990, Science 249: 386-390). In vielen Fällen besteht das Ziel des Screenings darin, Peptide aus der Bibliothek zu identifizieren, die die Epitope nachahmen, gegen die die Antikörper gerichtet sind. Somit sind, bei einem verfügbaren Antikörper, Peptidbibliotheken ausgezeichnete Quellen für eine Identifizierung von Epitopen oder epitopartigen Molekülen dieses Antikörpers (Yayon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10643-10647).
Frühere Studien haben zwar erfolgreich Epitope und epitopartige Molekül aus Peptidbibliotheken identifiziert, aber nach dem derzeitigen Stand des Wissens ist noch nicht realisiert worden, dass dieser Ansatz dadurch erweitert werden könnte, dass die identifizierten Epitope in einer weiteren Runde eines Screenings einer Peptidbibliothek zur Identifizierung antikörperartiger Moleküle eingesetzt werden könnten.
Wenn es gewünscht war, antikörperartige Moleküle zu erhalten, wurden nach dem bisherigen Stand der Technik Peptidbibliotheken eingesetzt, die natürlich vorkommende Antikörpersequenzen enthalten. Das beruhte wahrscheinlich auf der Tatsache, dass man weiß, dass eine spezifische Bindung durch Antikörper von einer komplexen Struktur abhängt, die verschiedene "Complementarity Determining Regions" (CDRs) umfasst, und zwar oft sowohl der schweren als auch der leichten Antikörperketten. Von kurzen Peptiden würde man nicht erwarten, dass sie derartige Strukturen nachahmen könnten, und von längeren Peptiden nahm man an, dass sie für eine Expression in den am häufigsten verwendeten Bibliotheken ungeeignet seien.
McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554, verwendeten die PCR zur Amplifizierung der Gene der variablen (V) Bereiche von Immunglobulinen, und sie klonierten diese Gene in Phagen-Expressionsvektoren. Die Autoren schlugen vor, dass Phagenbibliotheken der V-, der Diversitäts- (D) und der Joining-Bereiche (J) mit einem Antigen gescreent werden könnten. Die Phagen, die an das Antigen binden, könnten dann in den Antigen-bindenden Schleifen der Antikörpergene mutiert werden und erneut gescreent werden. Der Vorgang könnte mehrere Male wiederholt werden und letztlich zu Phagen führen, die das Antigen fest binden.
Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597, verwendeten ebenfalls die PCR zur Amplifizierung der Gene der variablen (V) Bereiche von Immunglobulinen, und sie klonierten diese Gene in Phagen-Expressionsvektoren.
Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-4366, erzeugten einen Phagemid-Vektor, der zur Expression der V-Bereiche und der konstanten (C) Bereiche der schweren und der leichten Ketten eines Antikörpers, der für ein Antigen spezifisch ist, verwendet werden konnte. Die V-C-Bereiche der schweren und der leichten Kette wurden so konstruiert, dass sie sich im Periplasma zusammenlagern und ein antikörperartiges Molekül mit einer funktionellen Antigen-bindenden Stelle bilden. Die Infektion von Zellen, die dieses Phagemid enthielten, mit einem Helferphagen resultierte in der Inkorporation des antikörperartigen Moleküls auf der Oberfläche des Phagen, der die Phagemid-DNA enthielt. Das ermöglichte die Identifizierung und Anreicherung dieses Phagen durch das Screenen mit dem Antigen. Es wurde vorgeschlagen, dass der angereicherte Phage mutiert und weiteren Screening-Runden unterzogen werden könnte, was zur Isolierung von antikörperartigen Molekülen führen würde, die imstande wären, das Antigen noch stärker zu binden.
Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137 schlugen vor, dass Gene normaler Antikörper in Phage-Display-Bibliotheken kloniert werden könnten. Daran würde sich eine Zufallsmutation der klonierten Antikörpergene zur Erzeugung von Varianten hoher Affinität anschließen.
Nach dem bisherigen Stand der Technik wurden Peptidbibliotheken mit Rezeptoren gescreent, um Peptide, die Rezeptorliganden ähneln, zu identifizieren, aber Peptidbibliotheken wurden nicht für die Identifizierung von solchen Liganden-bindenden Peptiden wie denjenigen, die Rezeptoren nachahmen, als nützlich erachtet.
Bass et al., 1990, Proteins: Struct. Fung. Genet. 8: 309-314 fusionierten das humane Wachstumshormon (hGH) mit dem Carboxy-Terminus des Proteins des Gens III des Phagen fd. Dieses Fusionsprotein wurde in einen Phagemid-Vektor eingebaut. Wenn Zellen, die das Phagemid trugen, mit einem Helferphagen infiziert wurden, exprimierten ungefähr 10% der erzeugten Phagenpartikel das Fusionsprotein auf ihren Oberflächen. Diese Phagenpartikel wurden durch das Screenen mit Kügelchen, die mit dem hGH-Rezeptor beschichtet waren, angereichert. Es wurde vorgeschlagen, dass dieses System zur Entwicklung von hGH-Mutanten mit veränderten Rezeptor-Bindungscharakteristika verwendet werden könnte.
Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838 verwendeten eine verbesserte Version des oben beschriebenen Systems von Bass et al. für die Selektion von mutierten hGH- Proteinen mit extrem hoher Affinität für den hGH-Rezeptor. Die Autoren führten eine Zufallsmutagenese der hGH-pIII-Fusionsproteine an Stellen in der Nachbarschaft der 12 Aminosäuren des hGH, von denen zuvor festgestellt worden war, dass sie für Rezeptorbindung wichtig sind, durch.
Balass et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10638-10642 verwendeten eine Phage-Display-Bibliothek zur Isolierung linearer Peptide, die ein konformationsabhängiges Epitop des nicotinischen Acetylcholin-Rezeptors nachahmten. Das erfolgte durch das Screenen der Bibliothek mit einem monoklonalen Antikörper, der für das konformationsabhängige Epitop spezifisch war. Von dem verwendeten monoklonalen Antikörper wurde angenommen, dass er spezifisch für die Bindungsstelle des Acetylcholin-Rezeptors für dessen natürlichen Liganden Acetylcholin war.
Die Zitierung oder Angabe irgend einer Literaturstelle soll nicht als Eingeständnis ausgelegt werden, dass diese Literaturstelle als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung verfügbar ist.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Abtide. Wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich "Abtide" auf Peptide, die die Bindungsspezifität eines größeren Moleküls, beispielsweise eines Antikörpers oder Rezeptors, nachahmen. Abtide binden spezifisch einen Liganden von Interesse, wobei der Ligand ein spezifischer Bindungspartner des größeren Moleküls ist (beispielsweise eines Antikörpers oder Rezeptors). Zur Identifizierung der Abtide gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptidbibliotheken in einen Prozess aus zwei Schritten gescreent. Der erste Screening-Schritt verwendet einen Antikörper (oder ein Antigen-bindendes Derivat von diesem) oder einen Rezeptor (oder ein Liganden-bindendes Derivat von diesem) als ersten Target-Liganden. Dieser Schritt identifiziert Peptidsequenzen, die als "Epitope" oder "Mimetope" bezeichnet werden und spezifisch den ersten Target-Liganden binden. In dem Fall, bei dem ein Antikörper oder ein Derivat von diesem als erster Target-Ligand verwendet wird, ähnelt ein Mimetop häufig, entweder funktionell bezüglich seiner Bindungsfähigkeit und/oder strukturell hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz, dem Epitop, das vom Antikörper, der als erster Ligand verwendet wird, erkannt wird. Ein Epitop oder Mimetop wird dann als zweiter Target-Ligand in einem zweiten Screening-Schritt zur Identifizierung einer Peptidsequenz eingesetzt, die das Epitop oder Mimetop spezifisch bindet. Derartige Peptide sind als "Abtide" bekannt. Überraschenderweise wurde von den Erfindern dieser Erfindung gefunden, und es wird hier gezeigt, dass Abtide Bindungsspezifitäten besitzen, die denjenigen der ersten Target- Liganden (üblicherweise Antikörpern oder Rezeptoren), die oben beschrieben wurden, auffallend ähnlich sind.
Abtide sind nützlich, da sie die Bindungsspezifitäten von Antikörpern oder Rezeptoren nachahmen. Somit können sie in vielen Fällen verwendet werden, in denen Antikörper oder Rezeptoren verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Abtiden anstelle von Antikörpern in Tests, beispielsweise den vielen Arten von Immunoassays, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Abtide können anstelle der Antikörper in derartigen Tests eingesetzt werden, beispielsweise in Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) oder in Sandwich-Immunoassays. Die Erfindung betrifft auch Abtid-Zusammensetzungen für eine Verwendung in der Therapie oder Diagnose. Bei einem spezifischen Beispiel wurde entdeckt und gezeigt, dass Abtide anstelle von Antikörpern in Enzyme-linked Immunosorbent Assays und bei der In-vivo-Lokalisierung des Prostatakarzinoms in einem Xenotransplantat-Modell nützlich sind.
Die Verwendung von Abtiden hat gegenüber der Verwendung von Antikörpern oder Rezeptoren viele potenzielle Vorteile: die geringere Größe der Abtide ermöglicht ihre leichtere Erzeugung bei niedrigeren Kosten und verringerter Immunogenität, und sie kann ihre Verabreichung in vivo erleichtern, wenn eine solche gewünscht ist; biologische Reaktionen und Funktionen, die durch die konstanten Domänen von Antikörpern vermittelt werden, und ein Vernetzen von Antikörpern/Rezeptoren und die resultierenden biologischen Wirkungen können, wenn es gewünscht ist, vermieden werden.

4. LEGENDEN DER FIGUREN

Die vorliegende Erfindung kann durch die Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beschreibungen der Erfindung, die Beispiele spezifischer Ausführungsformen der Erfindung sowie die beigefügten Figuren besser verstanden werden.
Fig. 1 zeigt als schematisches Diagramm ein allgemeines Verfahren zur Identifizierung eines Abtids durch einen zweistufigen Screening-Prozess. Siehe Abschnitt 5.3 bezüglich einer Diskussion dieses Verfahrens.
Fig. 2 zeigt die Bindung des biotinylierten monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 an das immobilisierte Mimetop-Peptid 7E11-9.5. Siehe Abschnitt 6.1.2.2 bezüglich Details und Abschnitt 6.1.1 bezüglich einer Definition des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5.
Fig. 3 zeigt die Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenzen der CDR2L- und CDR3L- Abschnitte des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 und der 7E11-C5-Abtide aus der Tabelle 2. Die Zahl der Aminosäuren in den Abtiden, die denjenigen der CDRs ähnlich sind, ist in Klammern angegeben, zusammen mit der prozentualen Homologie. Striche bezeichnen Lücken, die eingefügt wurden, um die Homologie zu verbessern. Im Falle der Klone 13 und 16 war die Homologie mit CDR2L am größten, wenn die Sequenz von CDR2L umgedreht wurde. Die für den Klon 14 gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 1; die für den Klon 17 gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 2; die für den Klon 15 gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 3; die für den Klon 13 gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 4; die für den Klon 16 gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 5; die für CDR3L gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 6; die für CDR2L gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 7; und die für CDR2L(rev) gezeigte Sequenz ist die SEQ ID NO: 8.
Fig. 4 zeigt die Bindung der Abtide an das Mimetop-Peptid 7E11-9.5 in einem Dot-Blot- Assay, wie er im Abschnitt 6.1.2.1 beschrieben wird. Die Zahlen entlang der linken Seite der Figur beziehen sich auf das 7E11-C5-Abtid, das in der angegebenen Position aufgetragen wurde. Die Zahl 351 bezieht sich auf den monoklonalen Antikörper 7E11-C5, der als Positivkontrolle verwendet wurde. Die Zahlen entlang der Oberseite der Figur beziehen sich auf die verschiedenen Verdünnungen des Abtids oder des monoklonalen Antikörpers, die verwendet wurden.
Fig. 5 zeigt die Bindung biotinylierter Mimetope an immobilisierte Abtide. stellt die Bindung des Mimetop-Peptids Biotin-LYANPGMYSRLHSPA-NH&sub2; an den Klon 14 des 7E11-C5- Abtids dar; o stellt die Bindung des Mimetop-Peptids Biotin-LYANPGMYSRLHSPA-NH&sub2; an den Klon 17 des 7E11-C5-Abtids dar; stellt die Bindung des Mimetop-Peptids Biotin-GMYSRLH- NH&sub2; an den Klon 14 des 7E11-C5-Abtids dar; Δ stellt die Bindung des Mimetop-Peptids Biotin- GMYSRLH-NH&sub2; an den Klon 17 des 7E11-C5-Abtids dar. Siehe Abschnitt 6.1.2.2 bezüglich Details.
Fig. 6 zeigt die Bindung eines Antigens aus einem Lysat von LNCaP-Tumorzellen durch den monoklonalen Antikörper 7E11-C5 und den Klon 14 des 7E11-C5-Abtids. Siehe Abschnitt 6.1.3 bezüglich Details.
Fig. 7 zeigt die biologische Verteilung des DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klons 14 in SCID-Mäusen, die Xenotransplantat-Tumoren des menschlichen Prostatakarzinoms LNCaP tragen, und zwar 2 Stunden ( , linke Säule jedes Säulenpaars) oder 4 Stunden ( , rechte Säule jedes Säulenpaars) nach der Injektion von 2 ug des Peptids mit einer spezifischen Aktivität von 32 uCi/ug. Siehe Abschnitt 6.1.4 bezüglich Details.
Fig. 8 zeigt die biologische Verteilung des DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klons 17 in SCID-Mäusen, die Xenotransplantat-Tumoren des menschlichen Prostatakarzinoms LNCaP tragen, und zwar 2 Stunden ( , linke Säule in jeder Gruppe von vier Säulen, Maus 1; , zweite Säule von links in jeder Gruppe von vier Säulen, Maus 6) oder fünf Stunden ( , dritte Säule von links in jeder Gruppe von vier Säulen, Maus 2); , Säule ganz rechts in jeder Gruppe von vier Säulen, Maus 4) nach der Injektion von 0,02 ug des Peptids mit einer spezifischen Aktivität von 2,4 uCi/ng. Siehe Abschnitt 6.1.4 bezüglich Details.
Fig. 9 zeigt die biologische Verteilung eines irrelevanten, ¹¹¹In-markierten Kontrollpeptids in SCID-Mäusen, die Xenotransplantat-Tumoren des menschlichen Prostatakarzinoms LNCaP tragen, und zwar 2 Stunden ( , linke Säule in jeder Gruppe von fünf Säulen; , zweite Säule von links in jeder Gruppe von fünf Säulen) oder fünf Stunden ( , dritte Säule von links in jeder Gruppe von fünf Säulen; , vierte Säule von links in jeder Gruppe von fünf Säulen; Säule ganz rechts in jeder Gruppe von fünf Säulen) nach der Injektion von 1,5 ug des Peptids mit einer spezifischen Aktivität von 30 uCl/ug. Siehe Abschnitt 6.1.4 bezüglich Details.
Fig. 10 illustriert schematisch die Konstruktion der R26-TSAR-Bibliothek. Die R26- Expressionsbibliothek wurde im wesentlichen so wie die TSAR-9-Bibliothek konstruiert, d. h. wie es in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben wurde, abgesehen von den in der Fig. 10 dargestellten Modifikationen. Der Prozess des Zusammenbaus der Oligonucleotide, der in der Fig. 10 dargestellt ist, führt zur Expression von Peptiden mit der folgenden Aminosäuresequenz:
S(S/R)X&sub1;&sub2;πAδX&sub1;&sub2;Sr (SEQ ID NO: 89), wobei π = S, P, T oder A; und δ = V, A, D, E oder G.
Fig. 11 illustriert schematisch die Konstruktion der D38-TSAR-Bibliothek. Die D18- Expressionsbibliothek wurde im wesentlichen so konstruiert, wie es für die TSAR-9-Bibliothek beschrieben wurde, die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben wurde, abgesehen von den in der Fig. 11 dargestellten Modifikationen.
Fig. 12 illustriert schematisch die Konstruktion der DC43-TSAR-Bibliothek. Die DC43- Expressionsbibliothek wurde im wesentlichen so konstruiert, wie es für die TSAR-9-Bibliothek beschrieben wurde, die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben wurde, abgesehen von den in der Fig. 12 dargestellten Modifikationen.
Fig. 13 illustriert schematisch die Oligonucleotide, die zur Konstruktion der TSAR-Bibliothek für die Sättigungsmutagenese des Abtids des polymorphen epithelialen Mucins verwendet wurden (siehe Abschnitt 6.2.2).

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Abtide. Wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich "Abtide" auf Peptide, die die Bindungsspezifität eines größeren Moleküls, beispielsweise eines Antikörpers oder Rezeptors, nachahmen. Abtide binden spezifisch einen Liganden von Interesse, wobei der Ligand ein spezifischer Bindungspartner des nachgeahmten größeren Moleküls ist (beispielsweise eines Antikörpers oder Rezeptors). Zur Identifizierung von Abtiden gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptidbibliotheken typischerweise in einen Prozess aus zwei Schritten gescreent (siehe Fig. 1). Der erste Screening-Schritt verwendet einen Antikörper (oder ein Antigen-bindendes Derivat von diesem) oder einen Rezeptor (oder ein Liganden-bindendes Derivat von diesem) als ersten Target-Liganden. Dieser Schritt identifiziert Peptidsequenzen, die als "Epitope" oder "Mimetope" bezeichnet werden und spezifisch den ersten Target-Liganden binden. Wenn beim ersten Screening-Schritt ein Antikörper eingesetzt wird und das identifizierte Peptid die Aminosäuresequenz des natürlichen Antigens, das für die spezifische Bindung des Antigens an den Antikörper verantwortlich ist, enthält, dann wird das identifizierte Peptid als Epitop bezeichnet; wenn das identifizierte Peptid die Sequenz des natürlichen Antigens nicht enthält, dann wird das identifizierte Peptid als Mimetop bezeichnet. In dem Fall, bei dem ein Antikörper oder ein Derivat von diesem als erster Target-Ligand verwendet wird, ähnelt ein Mimetop häufig, entweder funktionell bezüglich seiner Bindungsfähigkeit und/oder strukturell hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz, dem Epitop, das vom Antikörper, der als erster Ligand verwendet wird, erkannt wird.
Ein Mimetop wird dann als zweiter Target-Ligand in einem zweiten Screening-Schritt zur Identifizierung einer Peptidsequenz eingesetzt, die das Epitop oder Mimetop spezifisch bindet. Derartige Peptide sind als "Abtide" bekannt. Abtide besitzen Bindungsspezifitäten, die denjenigen der ersten Target-Liganden (üblicherweise Antikörpern oder Rezeptoren), die oben beschrieben wurden, ähnlich sind.
Bei einer spezifischen Ausführungsform erkennt der Antikörper oder dessen Derivat, der bzw. das im ersten Screening-Schritt eingesetzt wird, ein Tumor-Antigen, vorzugsweise ein menschliches Tumor-Antigen, am bevorzugtesten dasjenige eines malignen Tumors. Beispielsweise kann der monoklonale Antikörper 7E11-C5, der durch das Hybridom 7E11-C5 (ATCC HB 10494) erzeugt wird, im ersten Screening-Schritt eingesetzt werden, um ein Prostatakrebs- Antigen zu erkennen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum erfolgreichen Screenen sehr kleiner Peptide oder Protein-Targets, beispielsweise 5 bis 40 Aminosäuren, und vorzugsweise 10 bis 20 Aminosäuren, bereit. Bis jetzt war das Screenen bezüglich derartiger Targets nicht erfolgreich. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass das erhaltene Abtid sein Target auf komplexe oder strukturabhängige Weise bindet.
Abtide sind nützlich, da sie die Bindungsspezifitäten von Antikörpern oder Rezeptoren nachahmen. Somit können sie in vielen Fällen verwendet werden, in denen Antikörper oder Rezeptoren verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von Abtiden anstelle von Antikörpern in Tests, beispielsweise den vielen Typen von Immunoassays, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Abtide können anstelle der Antikörper in derartigen Tests eingesetzt werden, beispielsweise in Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) oder in Sandwich-Immunoassays. Die Erfindung stellt auch Abtid-Zusammensetzungen für eine Verwendung in der Therapie oder der Diagnose von Krankheiten bereit. Bei einem spezifischen Beispiel wurden Abtide erzeugt, und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie anstelle von Antikörpern in Enzyme-linked Immunosorbent Assays und bei der In-vivo-Lokalisierung des Prostatakarzinoms in Xenotransplantat-Modellen von Nutzen sein können.
Die Verwendung von Abtiden hat gegenüber der Verwendung von Antikörpern oder Rezeptoren viele potenzielle Vorteile: die geringere Größe der Abtide ermöglicht ihre leichtere Erzeugung bei niedrigeren Kosten und verringerter Immunogenität, und sie erleichtert ihre Verabreichung in vivo, wenn eine solche gewünscht ist; biologische Reaktionen und Funktionen, die durch die konstanten Domänen von Antikörpern vermittelt werden, und ein Vernetzen von Antikörpern/Rezeptoren und die resultierenden biologischen Wirkungen können, wenn es gewünscht ist, vermieden werden.

5.1. PEPTIDBIBLIOTHEKEN ZUR VERWENDUNG BEI DER IDENTIFIZIERUNG VON ABTIDEN

Abtide können gemäß der vorliegenden Erfindung in einer chemisch synthetisierten Peptidbibliothek oder einer biologisch exprimierten Peptidbibliothek identifiziert werden. Wenn eine biologische Peptid-Expressionsbibliothek verwendet wird, dann kann die Nucleinsäure, die für das Peptid codiert, das den Liganden der Wahl bindet, gewonnen werden und dann zur Bestimmung seine Nucleotidsequenz sequenziert werden, woraus sich die Aminosäuresequenz ableiten lässt, die die Bindung vermittelt. Alternativ kann die Aminosäuresequenz der entsprechenden Bindungsdomäne durch die direkte Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Peptids bestimmt werden, das aus einer Peptidbibliothek ausgewählt ist, die chemisch synthetisierte Peptide enthält. Bei einem weniger bevorzugten Aspekt kann auch eine direkte Aminosäuresequenzierung eines bindenden Peptids durchgeführt werden, das aus einer biologischen Peptid-Expressionsbibliothek ausgewählt ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Peptide vorteilhafterweise in Zufalls-Peptidbibliotheken identifiziert. Typischerweise werden Zufalls- Peptidbibliotheken durch synthetischen Oligonucleotide codiert, wobei viele unterschiedliche Nucleotidpositionen das Potenzial zur Codierung aller 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren besitzen. Die Sequenz der durch die variierenden Nucleotide codierten Aminosäuren ist unvorhersagbar und im wesentlichen zufällig. Die Begriffe "unvorhergesagt", "unvorhersagbar" und "im wesentlichen zufällig" werden bezüglich der codierten Aminosäuren austauschbar verwendet, und sie sollen bedeuten, dass variierende Nucleotide in jeder beliebigen Position von der Art sind, dass nicht vorhergesagt werden kann, welche der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren in dieser Position erscheint. Diese variierenden Nucleotide sind das Ergebnis einer zufälligen chemischen Synthese. Zu den biologischen Zufalls-Peptidbibliotheken, die für die Verwendung vorgesehen sind, gehören diejenigen, bei denen ein Bias in die Zufallssequenz eingeführt wurde, beispielsweise um die Verwendung eines Stopp-Codons weniger zu begünstigen.

5.1.1. CHEMISCH SYNTHETISIERTE PEPTIDBIBLIOTHEKEN

Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Peptidbibliotheken können Bibliotheken sein, die chemisch in vitro synthetisiert werden. Beispiele derartiger Bibliotheken werden bei Fodor et al., 1991, Science 251: 767-773 gebracht, die die Synthese eines bekannten Arrays kurzer Peptide auf einem einzelnen mikroskopischen Objektträger beschreiben; bei Houghten et al., 1991, Nature 354: 84-86, die Mischungen freier Hexapeptide, bei denen der erste und der zweite Rest eines jeden Peptids individuell und spezifisch definiert waren, beschreiben; bei Lam et al., 1991, Nature 354: 82-84, die ein Schema einer Splitsynthese beschreiben; bei Medynski, 1994, Bio/Technology 12: 709-710, der ebenfals Splitsynthese- und T-Bag-Synthese-Verfahren beschreibt. Siehe auch Gallop et al., 1994, J. Medicinal Chemistry 37: 1233-1251.
Die PCT-Veröffentlichung WO 91/05058 vom 18. April 1991 zielt auf Zufallsbibliotheken ab, die halb zufällige Nucleotid-Sequenzen enthalten. Die halb zufälligen Nucleotid-Sequenzen werden in vitro unter Bedingungen transkribiert, dass Polysomen gebildet werden. Die Polysomen werden bezüglich einer Bindung an eine Substanz von Interesse gescreent. Diejenigen Polysomen, die an die Substanz von Interesse binden, werden gewonnen. Die RNA dieser Polysomen wird zur Konstruktion einer cDNA verwendet, die zur Erzeugung von Polypeptiden exprimiert wird.
Das Screening zur Identifizierung von Peptiden, die an einen Liganden der Wahl binden, kann mittels Verfahren durchgeführt werden, die in diesem Gebiet bekannt sind.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist die Gesamtzahl der unvorhersagbaren Aminosäuren in den Polypeptiden der chemischen Bibliothek, die für das Screening verwendet wird, größer oder gleich 5 und kleiner oder gleich 25; bei anderen Ausführungsformen liegt die Gesamtzahl im Bereich von 5 bis 15 oder 5 bis 10 Aminosäuren, vorzugsweise zusammenhängenden Aminosäuren.
Es kann zwar eine bindende Domäne aus chemisch synthetisierten Peptidbibliotheken identifiziert werden, aber eine derartige Domäne würde klein sein (d. h. kürzer als 10 Aminosäuren, und am wahrscheinlichsten 5 bis 6 Aminosäuren). Deshalb ist die Verwendung einer chemisch synthetisierten Peptidbibliothek für den zweiten Screening-Schritt, der in die Isolierung von Abtiden involviert ist, weniger bevorzugt als die Verwendung im zweiten Schritt des Screenings biologischer Peptidbibliotheken, die unvorhersagbare Sequenzen größerer Länge enthalten und unten beschrieben werden.

5.1.2. BIOLOGISCHE PEPTIDBIBLIOTHEKEN

Bei einer anderen Ausführungsform werden biologische Peptidbibliotheken zur Identifizierung von Abtiden verwendet. Es sind in diesem Fachgebiet viele geeignete biologische Peptidbibliotheken bekannt, die verwendet werden können.
Gemäß diesem zweiten Ansatz, der gentechnologische Verfahren beinhaltet, wurden Peptide in biologischen Systemen entweder als lösliche Fusionsproteine oder als Viruscapsid- Fusionsproteine exprimiert.
Verschiedene Peptidbibliotheken gemäß diesem Ansatz haben den M13-Phagen eingesetzt. Es wurde zwar vom N-Terminus des viralen Capsid-Proteins, Protein III (pIII), gezeigt, dass er für die Virusinfektion erforderlich ist, aber der extreme N-Terminus des reifen Proteins toleriert Veränderungen wie Insertionen. Dementsprechend sind verschiedene Peptidbibliotheken, bei denen unterschiedliche Peptide als pIII-Fusionsproteine exprimiert werden, in diesem Gebiet bekannt. Diese Bibliotheken können zur Identifizierung von Abtiden verwendet werden. Beispiele derartiger Bibliotheken werden unten beschrieben.
Scott und Smith, 1990, Science 249: 386-390, beschreiben die Konstruktion und Expression einer "epitope library" von Hexapeptiden auf der Oberfläche von M13. Die Bibliothek wurde erzeugt, indem eine mit Bgl I verdaute Oligonucleotidsequenz von 33 Basenpaaren in einen mit Sfi I verdauten Phagen fd-tet, d. h. fUSES RF, insertiert wurde. Das Fragment von 33 Basenpaaren enthält eine zufällige oder "degenerierte" codierende Sequenz (NNK)&sub6;, wobei N für G, A, T oder C steht und K für G oder T steht. Die Autoren stellten fest, dass die Bibliothek aus 2 · 10&sup8; Rekombinanten bestand, die 4 · 10&sup7; verschiedene Hexapeptide exprimierten; theoretisch exprimierte diese Bibliothek 69% der 6,4 · 10&sup7; möglichen Peptide (20&sup6;). Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, beschrieben ebenfalls eine ähnliche Bibliothek von Hexapeptiden, die als Fusionen des pIII-Gens des M13-fd-Phagen exprimiert wurden. Die PCT-Veröffentlichung WO 91/19818 vom 26. Dezember 1991 von Dower und Cwirla beschreibt eine ähnliche Bibliothek von pentameren bis octameren Zufallsaminosäuresequenzen.
Devlin et al., 1990, Science, 249: 404-406 beschreiben eine Peptidbibliothek von ungefähr 15 Resten, die unter Verwendung eines NNS-Codierungsschemas für die Oligonucleotidsynthese erzeugt wurde, wobei S für G oder C steht.
Christian und seine Kollegen haben eine Phage-Display-Bibliothek beschrieben, die Decapeptide exprimiert (Christian et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718). Die Ausgangs-DNA wurde mittels eines Oligonucleotids erzeugt, das die degenerierten Codons [NN(G/T)]&sub1;&sub0; mit einem selbst-komplementären 3'-Terminus umfasste. Diese Sequenz erzeugt, indem sie eine Haarnadelstruktur bildet, durch ein Selbst-Priming eine Replikationsstelle, die von der T4-DNA- Polymerase zur Erzeugung des komplementären Stranges verwendet werden konnte. Die doppelsträngige DNA wurde für die Klonierung in den fUSE5-Vektor, der von Scott und Smith, vgl. oben, beschrieben worden war, an den Sfi-I-Stellen am 5'-Terminus und an der Haarnadelstruktur gespalten.
Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152: 149-157, beschreibt die Konstruktion einer Bibliothek über einen mühsamen Prozess, der das Hybridisieren von Oligonucleotiden von ungefähr 17 oder 23 degenerierten Basen mit einer palindromischen Sequenz von 8 Nucleotiden Länge an ihren 3'-Enden umfasst. Das führte zur Expression von Zufalls-Hexa- oder -Octapeptiden als Fusionsproteine mit dem β-Galactosidase-Protein in einem bakteriellen Expressionsvektor. Die DNA wurde dann mit Klenow-DNA-Polymerase in eine doppelsträngige Form umgewandelt, mit stumpfen Enden in einen Vektor ligiert und dann in Form von Hind-III-Fragmenten frei gesetzt. Diese Fragmente wurden dann in einem Expressionsvektor an den C-Terminus einer verkürzten β-Galactosidase kloniert, so dass 10&sup7; Rekombinanten erzeugt wurden.
Zu anderen biologischen Peptidbibliotheken, die verwendet werden können, gehören diejenigen, die im US-Patent Nr. 5 270 170 vom 14. Dezember 1993 und in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/19818 vom 26. Dezember 1991 beschrieben wurden. Ebenfalls geeignet sind diejenigen des US-Patents Nr. 5 096 815, des US-Patents Nr. 5 198 346 und des US-Patents Nr. 5 223 409, alle an Ladner et al.
Die oben diskutierten biologischen Peptidbibliotheken sollen als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung verstanden werden. Einem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass viele andere biologische Peptidbibliotheken, die in verschiedenen Veröffentlichungen offenbart wurden, für den Einsatz bei der Durchführung in der vorliegenden Erfindung geeignet sein können.
Das Protein pVIII ist ein Haupt-Capsidprotein des Virus M13, das auch als Ort für die Expression von Peptiden auf der Oberfläche von M13-Viruspartikeln bei der Konstruktion von Zufalls-Peptidbibliotheken dienen kann.
Es ist zwar einem Fachmann auf diesem Gebiet klar, dass lediglich fünf Aminosäuren eine Bindungsdomäne darstellen können, aber die durchschnittliche funktionelle Domäne in einem natürlichen Protein ist nach allgemeiner Ansicht ungefähr 40 Aminosäuren lang. Somit codieren die Zufalls-Peptidbibliotheken, aus denen die Abtide der vorliegenden Erfindung vorzugsweise identifiziert werden, für Peptide, die im Bereich von 5 bis 200 variierende Aminosäuren aufweisen. Obwohl man sich vorstellt, dass biologisch exprimierte Zufalls-Peptidbibliotheken, die kurze Zufallsinserts (d. h. mit einer Länge von weniger als 20 Aminosäuren) aufweisen, zur Identifizierung der erfindungsgemäßen Abtide verwendet werden könnten, sind die am stärksten bevorzugten biologisch exprimierten Zufalls-Peptidbibliotheken für eine Verwendung in der Erfindung diejenigen, bei denen das exprimierte Peptid 20 oder mehr unvorhersagbare Aminosäuren aufweist, d. h. vorzugsweise 20 bis 100 und am bevorzugten 20 bis 50 Aminosäuren, wie beispielweise die TSAR-Bibliotheken, die in der PCT-Veröffentlichung WO 91/12328 vom 22. August 1991 und der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben werden.
Zur Identifizierung der Abtide, insbesondere beim zweiten Screening-Schritt, verwendet die Erfindung vorzugsweise Bibliotheken größerer Komplexität, als sie üblicherweise auf diesem Gebiet eingesetzt werden. Die übliche Lehrmeinung auf dem Gebiet der Zufalls-Peptidbibliotheken ist die, dass die Länge der insertierten Oligonucleotide so kurz gehalten werden sollte, dass sie vorzugsweise für weniger als 15, und am bevorzugtesten für ungefähr 6 bis 8 Aminosäuren codieren. Jedoch können nicht nur Bibliotheken, die für mehr als ungefähr 20 Aminosäuren codieren, konstruiert werden, sondern derartige Bibliotheken können auch vorteilhaft gescreent werden, um Peptide zu identifizieren, die eine Bindungsspezifität für verschiedene Liganden aufweisen. Derartige Bibliotheken mit Inserts größerer Länge werden beispielhaft durch die TSAR-Bibliotheken verkörpert, die in der PCT-Veröffentlichung W 91/12328 vom 22. August 1991 und der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben werden.
Diese PCT-Veröffentlichungen offenbaren, dass die Verwendung von Bibliotheken, die aus Oligonucleotiden größerer Länge bestehen, mit vielen Vorteile verbunden ist.
Bibliotheken, die aus Oligonucleotiden größerer Länge bestehen, bieten die Möglichkeit, Peptide zu identifizieren, bei denen eine kurze Aminosäuresequenz einer Zahl von Peptiden, die einen gegebenen Liganden darstellen, gemeinsam ist oder von ihnen geteilt wird, d. h. die Mitglieder der Bibliothek haben gemeinsame Bindungsmotive. Die Verwendung von Bibliotheken größerer Länge bietet auch die Möglichkeit zur Identifizierung von Peptiden, die keine gemeinsamen Sequenzen mit anderen Peptiden aufweisen, aber die trotzdem eine Bindungsspezifität für den gleichen Liganden besitzen.
Beim Screening mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bieten Bibliotheken, die große insertierte Oligonucleotidsequenzen aufweisen, nicht nur die Möglichkeit zur Identifizierung oder Kartierung von Bindungsstellen, die sich über wenige zusammenhänge Aminosäurereste erstrecken, d. h. von einfachen Bindungsstellen, sondern auch von solchen, die sich über diskontinuierlich angeordnete Aminosäuren erstrecken, d. h. von komplexen Bindungsstellen, und sie können die komplexe Bindungscharakteristik von Antikörpern und rezeptorartigen Molekülen bereit stellen.
Außerdem bietet die große Länge der insertierten synthetisierten Oligonucleotide bestimmter Bibliotheken die Möglichkeit zur Ausbildung einer Sekundär- und/oder Tertiärstruktur in den potenziellen bindenden Peptiden und in Sequenzen, die die tatsächliche Bindungsstelle in der bindenden Domäne flankieren. Die Sekundärstruktur und die Tertiärstruktur beeinflussen die Fähigkeit einer Sequenz zur Vermittlung einer Bindung sowie die Stabilität und die Spezifität einer erfolgten Bindung häufig signifikant. Derartige komplexe Wirkungen einer Struktur sind nicht möglich, wenn nur Oligonucleotide kurzer Länge in Bibliotheken verwendet werden. Es kann sein, dass Sekundärstrukturen und Tertiärstrukturen besonders für die Identifizierung von Abtiden wichtig sind, da Abtide die Bindung großer Moleküle wie Antikörper nachahmen. Es ist gut bekannt, dass die Antigen-bindenden Eigenschaften von Antikörpern in den meisten Fällen von verschiedenen unterschiedlichen Bereichen der schweren Kette (complementarity determining regions) und auch von Bereichen abhängen, die von der leichten Kette beigesteuert werden.
Man stellt sich deshalb vor, dass die am stärksten bevorzugten bindenden Domänen für die Identifizierung der Abtide gemäß der vorliegenden Erfindung in biologisch exprimierten Zufalls-Peptidbibliotheken diejenigen sind, bei denen das exprimierte Peptid eine Länge von 20 oder mehr Aminosäuren hat. Beispiele für derartige Zufalls-Peptidbibliotheken sind die TSAR- Bibliotheken, die in der PCT-Veröffentlichung WO 91/12328 vom 22. August 1991 und der PCT- Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben werden.
Bei einer Ausführungsform ist die in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Bibliothek eine lineare, uneingeschränkte Bibliothek. Wie einem Fachmann auf diesem Gebiet, der die vorliegende Offenbarung gelesen hat, klar sein wird, könnten bei einer anderen spezifischen Ausführungsform "eingeschränkte", "strukturierte" oder "halb starre" Zufalls-Peptidbibliotheken in den vorliegenden Verfahren ebenfalls zur Identifizierung von Abtiden eingesetzt werden. Diese Bibliotheken exprimieren typischerweise Peptide, die im wesentlichen zufällig sind, aber innerhalb der Zufallssequenzen oder der Sequenzen, die die Zufallssequenzen flankieren, einen kleinen prozentualen Anteil unveränderlicher Reste enthalten, die dazu führen, dass dem Peptid eine Struktur oder ein gewisses Ausmaß an starrer Konformation verliehen wird. Bei einer halb starren Peptidbibliothek exprimiert die Mehrzahl der synthetischen Oligonucleotide Peptide, die alle nur eine Konformation oder nur eine sehr kleine Zahl unterschiedlicher Konformationen annehmen können, die durch die Anordnung der Codons, die für bestimmte Aminosäuren, die strukturelle Eigenschaften verleihen, in den synthetisierten variierenden oder unvorhergesagten Oligonucleotiden oder in den diese Oligonucleotide flankierenden Bereichen eingeschränkt wird bzw. werden. Im Gegensatz zu linearen, nicht-eingeschränkten Bibliotheken, bei denen die Mehrzahl der exprimierten Proteine potenziell Tausende kurzlebiger, unterschiedlicher Konformationen annimmt, kann in einer halb starren Peptidbibliothek die Mehrzahl der exprimierten Proteine nur eine Konformation oder nur eine sehr kleine Zahl von Konformationen annehmen. Derartige Bibliotheken werden beispielhaft durch die TSAR-13- und TSAR-14-Bibliotheken verkörpert, die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben werden; durch eine Bibliothek von Sequenzen aus zufälligen 6 Aminosäuren, die alle von unveränderlichen Cystein-Resten flankiert werden (O'Neil et al., 1992, Proteins 14: 509-515); und durch diejenigen Bibliotheken, die in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO/ 94/11496 vom 26. Mai 1994 (Huse) offenbart wurden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine biologische Peptidbibliothek, bei der es sich um eine "TSAR"-Bibliothek aus Zufalls-Peptiden handelt, zur Identifizierung eines Abtids gescreent. TSARs ist ein Akronym für "Totally Synthetic Affinity Reagents", wie es in der PCT- Veröffentlichung WO 91/12328 vom 22. August 1991 und der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben wird. TSAR-Bibliotheken, ihre Konstruktion und Verwendung sowie spezifische Beispiele für TSAR-Bibliotheken werden detailliert in diesen PCT-Veröffentlichungen beschrieben. Nucleinsäuren, die für TSARs oder einen TSAR-Abschnitt codieren, der die Bindung an den Liganden vermittelt, der für das Screenen verwendet wird, können zur Identifizierung der Abtide der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein TSAR kann ein heterofunktionelles Fusionsprotein sein, wobei das genannte Fusionsprotein umfasst (a) eine bindende Domäne, die durch ein Oligonucleotid codiert wird, das unvorhersagbare Nucleotide umfasst, wobei die unvorhersagbaren Nucleotide in einer zusammenhängenden Sequenz oder in mehreren zusammenhängenden Sequenzen angeordnet sind, wobei die Gesamtzahl der unvorhersagbaren Nucleotide größer oder gleich ungefähr 60 und kleiner als oder gleich ungefähr 600 ist, und gegebenenfalls (b) eine Effektordomäne, die durch eine Oligonucleotidsequenz codiert wird, die ein Protein oder Peptid ist, das die Expression oder den Nachweis der bindenden Domäne verstärkt bzw. erleichtert.
Alternativ kann ein TSAR ein heterofunktionelles Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wurde, sein, wobei jedoch die zusammenhängenden Sequenzen von unveränderlichen Resten flankiert werden, die so gewählt sind, dass sie für Aminosäuren codieren, die der bindenden Domäne des exprimierten heterofunktionellen Fusionsproteins eine gewünschte Struktur verleihen.
Neben den TSAR-Bibliotheken können andere Bibliotheken für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung diejenigen sein, bei denen die Bibliothek eine Bibliothek aus rekombinanten Vektoren ist, die eine Vielzahl heterofunktioneller Fusionsproteine exprimieren, wobei die genannten Fusionsproteine eine Bindungsdomäne aufweisen, die durch ein Oligonucleotid codiert wird, das unvorhersagbare Nucleotide umfasst, wobei die unvorhersagbaren Nucleotide in einer zusammenhängenden Sequenz oder in mehreren zusammenhängenden Sequenzen angeordnet sind, wobei die Gesamtzahl der unvorhersagbaren Nucleotide größer oder gleich ungefähr 15 und kleiner oder gleich ungefähr 600 ist.

5.2. ABTIDE

Ein Abtid ist typischerweise ein Peptid, das bezüglich seiner Bindungsspezifität und möglicherweise anderer Charakteristika (beispielsweise der Bindungsaffinität, Sequenz etc.) ein großes Molekül, beispielsweise einen Antikörper oder einen Rezeptor, nachahmt. Jedoch ist ein Abtid im allgemeinen viel kleiner als ein Antikörper oder Rezeptor. Ein Abtid ist im allgemeinen ein Peptid von ungefähr 5 bis 200 Aminosäuren. Vorzugsweise ist ein Abtid ein Peptid von ungefähr 10 bis 100 Aminosäuren. Am bevorzugtesten ist ein Abtid ein Peptid von ungefähr 20 bis 50 Aminosäuren. Zusätzlich zu den Aminosäuresequenzen, die für die spezifischen Bindungseigenschaften des Abtids verantwortlich sind, kann ein Abtid mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen oder weiteren Sequenzen, die nicht aus Aminosäuren bestehen, verbunden sein. Derartige zusätzliche Sequenzen können bei der Identifizierung oder Isolierung des Abtids hilfreich sein. Oder sie können die biologische Verteilung, die Stabilität oder die diagnostische oder therapeutische Wirksamkeit des Abtids unterstützen, wenn das Abtid diagnostisch oder therapeutisch eingesetzt wird.
Die Abtide können mit einer Vielzahl von Gruppen, die keine Peptide sind, verknüpft werden. Zu derartigen Gruppen könnten Toxine gehören; Arzneimittel; Polysaccharide; Nucleotide; Oligonucleotide; Markierungen wie radioaktive Substanzen (beispielsweise ¹¹¹In, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, 99mTc, ²¹²B, &sup9;&sup0;Y, ¹&sup8;&sup6;Rh); Biotin; fluoreszierende Markierungen; Reagenzien für ein Imaging (beispielsweise diejenigen, die im US-Patent Nr. 4 471 900 und im US-Patent Nr. 5 326 856) beschrieben wurden; Kohlenwasserstoff-Brücken (beispielsweise eine Alkyl-Gruppe oder Derivate von dieser), die mit einer Gruppe verbunden sind, die eine Befestigung an einem festen Träger ermöglicht, oder mit einer Gruppe, die eine leichte Abtrennung ermöglicht (beispielsweise ein Hapten, das von einem Antikörper, der an ein magnetisches Kügelchen gebunden ist, erkannt wird) etc. Die Verknüpfung des Peptids mit der Gruppe, die kein Peptid ist, kann mittels eines beliebigen der vielen Verfahren, die in diesem Fachgebiet gut bekannt sind, erfolgen.
Außerdem können bei einer Ausführungsform, bei der ein Abtid einen freien Amino- oder Carboxy-Terminus aufweist, diese Termini mittels bekannter Verfahren modifiziert werden, um beispielsweise eine größere Wiederstandsfähigkeit gegenüber einem Abbau, eine erhöhte Zellpermeabilität, eine erhöhte Löslichkeit etc. bereit zu stellen, beispielsweise durch Acetylierung, Biotinylierung, Acylierung mit Fettsäuren des Amino-Terminus etc. Amidierung des Carboxy- Terminus; oder das Abtid kann durch die Einarbeitung von D-Aminosäuren, unnatürlichen Aminosäuren oder Glycosyl-Aminosäuren etc. stabilisiert werden.
Die Abtide werden vorzugsweise durch allgemein bekannte Verfahren der chemischen Synthese hergestellt, beispielsweise wie es anhand von Beispielen im Abschnitt 5.6. und dessen Unterabschnitten beschrieben wird.
Alternativ können Peptide (oder Abschnitte davon) durch die rekombinante Expression einer Nucleinsäure, die für das gewünschte Abtid codiert, in einem geeigneten Wirt mittels allgemein bekannter Verfahren erhalten werden.
Gelegentlich kann es sein, dass nicht alle der Aminosäuren im identifizierten Peptid für die Bindungsfunktion eines Abtids erforderlich sind. Wenn es gewünscht ist, die Größe des Abtids zu vermindern, können Verfahren eingesetzt werden, um Abschnitte der bestimmten synthetischen Aminosäure- oder Nucleotidsequenz, die die Bindung vermitteln bzw. die für die Sequenzen codieren, die die Bindung vermitteln, zu identifizieren, wie es im Abschnitt 5.4. unten beschrieben wird.
Bei einer spezifischen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Abtid bereit, das ein Molekül ist, das ein Peptid mit einer Länge von 17 bis 50 Aminosäuren umfasst, das an Zellen des Prostatakarzinoms bindet, wobei das Peptid die Sequenz WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6) und die Sequenz LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7) umfasst.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist ein Abtid der Erfindung ein Molekül, das ein Peptid mit einer Länge von 19 bis 50 Aminosäuren umfasst, das an Zellen des Prostatakarzinoms bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die folgende Formel dargestellt ist:
R&sub1;XR&sub2;
wobei:
R&sub1; = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);
R&sub2; = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7) und
X = eine Sequenz aus beliebigen 2 bis 33 Aminosäuren.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist ein Abtid der Erfindung ein Molekül, das ein Peptid mit einer Länge von 19 bis 50 Aminosäuren umfasst, das an Zellen des Prostatakarzinoms bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die folgende Formel dargestellt ist:
R&sub1;XR&sub2;
wobei:
R&sub1; = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6), YNAYVPGFT (SEQ ID NO: 89), WFMSPYT (SEQ ID NO: 90), FPGVSTPY (SEQ ID NO: 91), WGISYPF (SEQ ID NO: 92) oder FPS;
R&sub2; = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7), LVSNESG (SEQ ID NO: 93), LSRNLDFG (SEQ ID NO: 94), LSGNYNIFG (SEQ ID NO: 95), TNIRNDIL (SEQ ID NO: 96) oder GSDPRL (SEQ ID NO: 97); und
X = eine Sequenz von wenigstens 2 beliebigen Aminosäuren.
Bei einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist ein Abtid der Erfindung ein Molekül, das ein Peptid mit einer Länge von 19 bis 50 Aminosäuren umfasst, das an Zellen des Prostatakarzinoms bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die folgende Formel dargestellt ist:
R&sub1;XR&sub2;
wobei:
R&sub1; = eine Sequenz aus 9 Aminosäuren, die wenigstens 50% Homologie mit WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6) aufweist;
R&sub2; = eine Sequenz aus 8 Aminosäuren, die wenigstens 50% Homologie mit LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7) aufweist; und
X = eine Sequenz aus 2 bis 33 beliebigen Aminosäuren.
Für die Zwecke der oben beschriebenen spezifischen Ausführungsform bedeutet eine Homologie zwischen zwei Aminosäureresten, dass eine Aminosäure mit der anderen Aminosäure identisch ist oder bezüglich dieser eine konservative Substitution darstellt. Konservative Substitutionen sind diejenigen Substitutionen, die eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure der gleichen Klasse ersetzen. Beispielsweise gehören zur Klasse der nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu den polaren neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Zu den positiv geladene (basischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Asparaginsäure und Glutaminsäure.

5.3. SCREENING VON PEPTIDBIBLIOTHEKEN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON ABTIDEN

Der Prozess der Identifizierung von Abtiden in einer Peptidbibliothek umfasst zwei unterschiedliche Screening-Schritte. Der erste Schritt ist zur Identifizierung von Epitopen oder Liganden ausgelegt, die eine Bindungsspezifität gegenüber größeren Molekülen von Interesse aufweisen, beispielsweise solchen, die Antigene nachahmen, solchen, die Rezeptoren/Liganden nachahmen und dergleichen. Bei diesem ersten Schritt wird eine Peptidbibliothek mit einem Liganden gescreent, der eine spezifische, oft komplexe Bindungsstelle von Interesse besitzt. Diejenigen Peptide in der Bibliothek, die spezifische Bindungspartner des Liganden sind, binden an den Liganden und können aufgrund dieser spezifischen Bindung leicht gewonnen werden. Ein Beispiel für einen Liganden, der für den Einsatz in diesem ersten Screening-Schritt geeignet ist, wäre ein Antikörper, der von Haus aus eine Antigen-bindende Stelle besitzt oder ein Antigen-bindendes Derivat von ihm. Ein weiteres Beispiel wäre ein Rezeptor, beispielsweise der Rezeptor für den Epidermal Growth Factor oder der Rezeptor für den Platelet Derived Growth Factor. Diese spezifischen Rezeptoren besitzen spezifische Bindungsstellen für den Epidermal Growth Factor bzw. den Platelet Derived Growth Factor. Man kennt auf diesem Gebiet weitere Rezeptoren, die ebenfalls potenzielle Liganden sind, beispielsweise den Östrogen-Rezeptor, die verschiedenen Acetylcholin-Rezeptoren, den Rezeptor des menschlichen Wachstumshormons etc.
Moleküle in der Bibliothek, die diese Peptidsequenzen aufweisen und die mittels des ersten Screening-Schrittes identifiziert wurden, werden hier als Epitope oder Mimetope bezeichnet. Beispielsweise würden in dem Fall, bei dem der erste Ligand ein Antikörper ist, die Peptide in der Bibliothek, die als spezifische Bindungspartner des Antikörpers identifiziert werden, als Antigen-Epitope oder -Mimetope bezeichnet.
Die Peptide, die im ersten Screening-Schritt isoliert werden, werden dann vorzugsweise analysiert, beispielsweise durch die Sequenzierung der DNA der bindenden Domäne der Phagen, die für die Peptide codieren, wenn die verwendete Bibliothek eine Phagen-Bibliothek war. Die DNA-Sequenz der bindenden Domäne codiert für die Aminosäuresequenz des Epitop- oder Mimetop-Peptids. Aufgrund der bekannten Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und den von ihnen codierten Aminosäuresequenzen ermöglicht die Kenntnis der DNA-Sequenz des Epitops oder Mimetops die Bestimmung der Aminosäuresequenz des Epitops oder Mimetops. Alternativ kann, wenn die verwendete Bibliothek eine chemische Bibliothek war, eine direkte Sequenzierung der Aminosäuren des Peptid-Epitops oder -Mimetops mittels auf diesem Gebiet gut bekannter Verfahren erfolgen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform können Sequenzen verschiedener Peptid- Mimetope, die im ersten Screening-Schritt identifiziert wurden, zur Bestimmung einer Konsensussequenz des Mimetops verglichen werden.
Sobald die Aminosäuresequenz des Epitops oder Mimetops (oder eines Abschnitts von diesem, der die Bindung vermittelt) bekannt ist, wird ein Molekül erzeugt, vorzugsweise ein Peptid, das die Aminosäuresequenz aufweist, die die Bindung vermittelt. Dieses Peptid kann chemisch synthetisiert werden, oder alternativ kann es mittels gentechnologischer Verfahren erzeugt werden. Dieses Peptid kann z. B. nur die Aminosäuren des Epitops oder Mimetops enthalten, oder es kann vorzugsweise weitere zusätzliche Aminosäuren oder Einheiten, die keine Aminosäuren sind, enthalten, um die Identifizierung oder Gewinnung des Epitop- oder Mimetop- Peptids sowie möglicher neuer, an Peptide bindender Agenzien zu unterstützen, die in dem sich anschließenden Screening-Schritt, der im Folgenden diskutiert wird, gefunden werden.
Beim zweiten Screening-Schritt wird das Epitop oder Mimetop, das im ersten Screening- Schritt identifiziert wurde, als Ligand des zweiten Screening-Schrittes eingesetzt. Der zweite Screening-Schritt identifiziert Peptide mit einer Bindungsspezifität für das Epitop oder Mimetop, die überraschenderweise die Bindungsspezifität des Antikörpers oder Rezeptors nachahmen, der als Ligand im ersten Screening-Schritt verwendet worden war. Mit anderen Worten, der zweite Screening-Schritt liefert Peptide mit Antikörper- oder Rezeptor-artigen Bindungsaktivitäten gegenüber Antigenen oder Rezeptorliganden, die als Abtide bezeichnet werden.
Die Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften Screening-Prozesses aus zwei Schritten, der zur Identifizierung von Abtiden eingesetzt wird.
Bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann es sein, dass das Epitop, an das ein Antikörper spezifisch bindet, bekannt ist. Beispielsweise wurde für den molekularen Antikörper SM-3, der spezifisch das polymorphe epitheliale Mucin (PEM) bindet, das auf humanen Brustkrebszellen vorkommt, gezeigt dass er spezifisch für das Epitop ist, das durch die Aminosäuresequenz VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 9) definiert wirde (Burchell et al., 1989, Int. J. Cancer 44: 691-696). In solchen Fällen kann man auf den oben beschriebenen ersten Screening-Schritt verzichten. Es kann ein Peptid synthetisiert werden, das die Sequenz des Epitops aufweist, für das der Antikörper spezifisch ist, und im oben beschriebenen zweiten Screening-Schritt zur Identifizierung von Abtiden des Antikörpers eingesetzt werden.
Es kann auch sein, dass der Abschnitt eines "Rezeptorliganden" (d. h. eines Liganden, der spezifisch an einen Rezeptor bindet), an den ein Rezeptor spezifisch bindet, bekannt ist. Beispielsweise wurde gezeigt, dass der Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) über die Aminosäuren 88-121 (HCPPTPETSCATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDC [SEQ ID NO: 22]) an den GM-CSF-Rezeptor bindet. Es sollte möglich sein, ein Peptid zu synthetisieren, das dem Abschnitt des Rezeptorliganden entspricht, von dem gezeigt wurde, dass er für die spezifische Bindung an den Rezeptor verantwortlich ist, und ein derartiges Peptid im zweiten Screening-Schritt der erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen, um ein Abtid des Rezeptors zu identifizieren.
Wie der Begriff in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Ligand eine Substanz, für die gewünscht wird, einen spezifischen Bindungspartner aus einer Peptidbibliothek zu isolieren. Ein Ligand kann als ein Schloss fungieren, d. h. als großes Polypeptid oder Protein analog einem Schloss, in das ein kleinerer spezifischer Bindungspartner als Schlüssel passt; oder ein Ligand kann als Schlüssel fungieren, der in ein Schloss passt und spezifisch einen größeren Bindungspartner oder ein Schloss bindet.
In dieser Erfindung ist ein Epitop oder Mimetop typischerweise ein Peptid, das als Schlüssel fungiert; es wird durch das Screening einer Peptidbibliothek bezüglich Peptiden identifiziert, die in eine spezifische Bindungsstelle eines größeren Moleküls, das als Schloss fungiert, passen und dieses binden, beispielsweise eines Antikörpers oder Rezeptors. Wenn das größere Molekül ein Antikörper ist und das identifizierte Peptid den Abschnitt der Aminosäuresequenz des natürlichen Antigens enthält, der für die spezifische Bindung des Antigens an den Antikörper verantwortlich ist, dann bezeichnet man das identifizierte Peptid als ein Epitop; wenn das identifizierte Peptid nicht die Sequenz des natürlichen Antigens enthält, dann bezeichnet man das identifizierte Peptid als Mimetop.
Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein Mimetop durch das Screenen einer Peptidbibliothek mit einem Antikörper oder einem Antikörper-Fragment identifiziert. Die so identifizierten Mimetope ahmen funktionell das Antigen nach, an das der Antikörper bindet, und zwar insofern, als die Mimetope ebenfalls spezifisch an den Antikörper binden. In einigen Fällen können, wenn das Antigen ein Protein oder Polypeptid ist, die Mimetope möglicherweise Aminosäuresequenz-Motive mit dem Antigen gemeinsam haben. Bei einer anderen Ausführungsform wird ein Mimetop über das Screening einer Peptidbibliothek mit einem Rezeptor oder Rezeptorfragment identifiziert. Die so identifizierten Mimetope ahmen funktionell den natürlichen Liganden des Rezeptors nach.
Die Peptidbibliotheken, die im ersten und zweiten Screening-Schritt eingesetzt werden, können die gleichen sein oder sie können verschieden sein. Bei einer Ausführungsform wird eine Peptidbibliothek, die kleine Zufallsinserts enthält (von ungefähr 6 bis ungefähr 15 Aminosäuren), im ersten Screening-Schritt eingesetzt.
Beim zweiten Screening-Schritt kann es wünschenswert sein, eine größere Peptidbibliothek zu verwenden. Solche größeren Bibliotheken exprimieren vorzugsweise Peptide von 20 bis 200 zufälligen Aminosäuren. Beispiele für solche größeren Bibliotheken sind die TSAR- Bibliotheken, die in der PCT-Veröffentlichung WO 91/12328 vom 22. August 1991 und in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben wurden.
Biologische oder chemisch synthetisierte Peptidbibliotheken können entweder beim ersten oder beim zweiten Screening eingesetzt werden. Die Peptidbibliotheken, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können eine Vielzahl von Resten, die zufällig sind, aufweisen, d. h. Reste, für die die Aminosäure, die diesen Rest ausmacht, nicht vorher bestimmt werden kann. Solche Bibliotheken nennt man Zufalls-Peptidbibliotheken.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung von Abtiden umfasst das Screenen einer Bibliothek rekombinanter Vektoren, die eine Vielzahl heterofunktioneller Fusionsproteine exprimieren, wobei die genannten Fusionsproteine aufweisen (a) eine bindende Domäne, die von einem Oligonucleotid codiert wird, das unvorhersagbare Nucleotide umfasst, wobei die unvorhersagbaren Nucleotide in einer zusammenhängenden Sequenz oder in mehreren zusammenhängenden Sequenzen angeordnet sind, wobei die Gesamtzahl der unvorhersagbaren Nucleotide größer oder ungefähr gleich 15 und kleiner oder ungefähr gleich 600 ist, und, gegebenenfalls (b) eine Effektordomäne, die von einer Oligonucleotidsequenz codiert wird, die ein Protein oder Peptid ist, das die Expression oder den Nachweis der bindenden Domäne verbessert. Das Screenen erfolgt, indem die Vielzahl der heterofunktionellen Fusionsproteine mit einem Liganden unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die für die Bindung des Liganden geeignet sind, und dann die Fusionsproteine, die an den Liganden binden, isoliert werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen ferner vorzugsweise die Bestimmung der Nucleotidsequenz, die für die bindende Domäne des heterofunktionellen Fusionsproteins codiert, die identifiziert wurde, um die DNA-Sequenz zu bestimmen, die für die bindende Domäne codiert, und um gleichzeitig die Aminosäuresequenz des Mimetops, das beim zweiten Screening verwendet wird, abzuleiten. Die Analyse der Nucleotidsequenz kann mittels beliebiger Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, durchgeführt werden, wobei zu diesen Verfahren, ohne auf sie beschränkt zu sein, das Verfahren von Maxam und Gilbert gehören (1980, Meth. Enzymol. 65: 499-560), das Didesoxy-Verfahren von Sanger (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463), die Verwendung der T7-DNA-Polymerase (Tabor und Richardson, US-Patent Nr. 4 795 699; SequenaseTM, U.S. Biochemical Corp.) oder der Taq- Polymerase oder die Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenzanalysegerätes (beispielsweise von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien).
Alternativ weisen die Bibliotheken, die zum Screenen auf erfindungsgemäße Mimetope und Abtide eingesetzt werden, unvorhersagbare Nucleotide auf, die in einer zusammenhängenden Sequenz oder in mehreren zusammenhängenden Sequenzen angeordnet sind, die von unveränderlichen Resten flankiert werden, die so ausgewählt sind, dass sie für Aminosäuren codieren, die der bindenden Domäne des exprimierten heterofunktionellen Fusionsproteins eine gewünschte Struktur verleihen.
Nachdem eine geeignete Peptidbibliothek konstruiert (oder auf sonstige Weise erhalten) wurde, wird die Bibliothek zur Identifizierung von Peptiden gescreent, die eine Bindungsaktivität gegenüber einem Liganden der Wahl aufweisen. Das Screenen der Bibliotheken kann mittels eines beliebigen der verschiedenen Verfahren, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, erfolgen. Siehe z. B. die folgenden Literaturstellen, die ein Screening von Peptidbibliotheken offenbaren: Parmley und Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251: 215-218; Scott und Smith, 1990, Science 249: 386-390; Fowlkes et al., 1992; BioTechniques 13: 422-427; Oldenburg et al., 1992, Procl. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397; Yu et al., 1994, Cell 76: 933-945; Staudt et al., 1988, Science 241: 577-580; Bock et al., 1992, Nature 355: 564-566; Tuerk et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988-6992; Ellington et al., 1992, Nature 355: 850-852; US-Patent Nr. 5 096 815, US-Patent Nr. 5 223 409 und US-Patent Nr. 5 198 346, alle an Ladner et al.; und Rebar und Pabo, 1992, Science 263: 671-673. Siehe auch die PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994.
Wenn die Bibliotheken als Fusionsproteine mit einem Zelloberflächenmolekül exprimiert werden, dann erfolgt das Screenen vorteilhafterweise durch das Inkontaktbringen der Vektoren mit einem immobilisierten Target-Liganden und das Ernten derjenigen Vektoren, die an den genannten Liganden binden. Derartige nützlichen Screeningverfahren, die als "Panning"- Techniken bezeichnet werden, werden bei Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427 beschrieben. Bei den Panning-Verfahren, die zum Screenen der Bibliotheken nützlich sind, kann der Target-Ligand auf Platten, Körnchen, beispielsweise magnetischen Körnchen, Sepharose etc. oder auf Körnchen, die in Säulen eingesetzt werden, immobilisiert werden. Bei besonderen Ausführungsformen kann der immobilisierte Target-Ligand "getagged" werden, beispielsweise unter Verwendung von Biotin oder 2-Fluorochrom, und zwar beispielsweise für eine Sortierung mittels FACS.
Bei einer Ausführungsform, die als Beispiel und nicht als Einschränkung gebracht wird, kann das Screenen einer Bibliothek von Phagen, die Zufallspeptide auf Phagen oder Phagemid- Vektoren exprimieren, durch die Verwendung von magnetischen Körnchen erzielt werden, wie es in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben wird.
Alternativ kann, um noch ein weiteres, nicht-einschränkendes Beispiel zu bringen, das Screenen einer Bibliothek von Phagen, die Zufallspeptide exprimieren, durch ein Panning unter Verwendung von Mikrotiterplatten erfolgen. Bei einer bevorzugten Methode zur Wiedergewinnung der Phagen, die an die Wells der Mikrotiterplatten gebunden sind, wird eine pH-Veränderung eingesetzt.
Bei noch einem weiteren Beispiel können die Bibliotheken, die Zufallspeptide als Oberflächeprotein entweder eines Vektors oder einer Wirtszelle exprimieren, beispielsweise eines Phagen oder einer Bakterienzelle, durch das Leiten einer Lösung der Bibliothek durch eine Säule mit einem Liganden, der auf einer festen Matrix immobilisiert ist, beispielsweise auf Sepharose, Kieselgel, etc., und das Wiedergewinnen derjenigen Phagen, die an die Säule binden, nach extensivem Waschen und einer Elution gescreent werden.
Bei noch einem weiteren Beispiel können schwach-bindende Mitglieder der Bibliothek auf der Basis verzögerter chromatographischer Eigenschaften isoliert werden. Gemäß einem Modus dieser Ausführungsform des Screenings werden Fraktionen gesammelt, wie sie von der Säule kommen, wobei die verzögert eluierenden Fraktionen aufgehoben werden (d. h. diejenigen Komponenten, deren Mobilität relativ zu denjenigen der Peak-Fraktion verringert ist, werden aufgehoben). Diese Komponenten werden kann konzentriert und ein zweites Mal durch die Säule geleitet, wobei wiederum die verzögert eluierenden Fraktionen aufgehoben werden. Durch aufeinander folgende Chromatographiedurchgänge ist es möglich, diejenigen zu isolieren, die eine gewisse, wenn auch schwache Affinität für den immobilisierten Liganden besitzen. Bei diesen Komponenten der Bibliothek ist aufgrund der Millionen möglicher Wechselwirkungen der Liganden beim Durchtreten der Komponente durch die Säule die Mobilität vermindert. Außerdem selektiert diese Methodik diejenigen Komponenten, die eine mäßige Affinität für das Target aufweisen und auch schnell dissoziieren.
Wenn es gewünscht wird können die Oligonucleotide, die für die auf diese Weise selektierte Bindungsdomäne codieren, mutiert, exprimiert und erneut chromatographiert werden (oder mittels eines anderen Verfahrens gescreent werden), um eine verbesserte Bindungsaktivität zu entdecken. Insbesondere kann eine Sättigungsmutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide, die mittels "dotierter" Nucleotid-Reservoirs synthetisiert wurden, durchgeführt werden. Die Dotierung wird so durchgeführt, dass die ursprüngliche Peptidsequenz nur einmal in 10&sup6; verschiedenen Klonen des mutierten Oligonucleotids vorhanden ist. Die vereinigten Oligonucleotide werden in einen parentalen TSAR-Vektor kloniert. Vorzugsweise ist der Vektor m663 (Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427). m663 ist imstande blaue Plaques zu erzeugen, wenn man ihn im E.-coli-Stamm JM101 oder DH5αF' wachsen lässt. Es wird eine Bibliothek, die größer ist als 10&sup6;, bevorzugt; es reicht jedoch eine Bibliothek von 10&sup5; aus, um TSAR-Phagen zu isolieren, die Peptid-Domänen mit erhöhter Selektivität bezüglich einer Bindung an den Target-Liganden exprimieren.
Gemäß einem weiteren alternativen Verfahren kann das Screenen einer Bibliothek unter Verwendung einer Methode, die einen Anreicherungsschritt und einen "Filter-Lift"-Schritt umfasst, wie folgt erfolgen:
Zufallspeptide aus einer exprimierten Bibliothek, die imstande sind, an einen gegebenen Liganden zu binden ("Positive"), werden zunächst über einen Zyklus oder zwei Zyklen aus einem Panning oder einer Affinitätschromatographie, wie es oben beschrieben wurde, angereichert. Das Ziel besteht darin, die Positiven auf eine Häufigkeit von ungefähr > 1/10&sup5; anzureichern. Nach der Anreicherung wird ein Filter-Lift-Assay durchgeführt. Beispielsweise werden ungefähr 1-2 · 10&sup5; Phagen, die bezüglich bindenden Phagen angereichert sind, zu 500 ul E.- coli-Zellen in der log-Phase gegeben und auf einer großen LB-Agaroseplatte mit 0,7% Agarose im Nährmedium ausplattiert. Man lässt die Agarose fest werden, und es wird ein Nitrocellulose- Filter (beispielsweise 0,45 u) auf die Oberfläche der Agarose gelegt. Es wird eine Reihe von Registrierungsmarkierungen mit einer sterilen Nadel angebracht, um das erneute Anpassen des Filters an die Platte nach der unten beschriebenen Entwicklung zu ermöglichen. Man lässt die Phagen-Plaques sich über Nacht bei 37ºC entwickeln (die Anwesenheit des Filters hemmt den Prozess nicht). Der Filter wird dann mit Phagen eines jeden einzelnen Plaques, die in situ anhaften, von der Platte entfernt. Der Filter wird dann 1-2 Stunden lang einer Lösung aus BSA oder einem anderen Blockierungsmittel ausgesetzt, um eine unspezifische Bindung des Liganden (oder der "Sonde") zu verhindern.
Die Sonde selbst wird markiert, beispielsweise entweder durch eine Biotinylierung (unter Verwendung von im Handel erhältlichen NHS-Biotin) oder durch direkte Enzymmarkierung, beispielsweise mit Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalischer Phosphatase. Die auf diese Weise markierten Sonden sind unbegrenzt haltbar und können mehrere Male wiederverwendet werden. Der blockierte Filter wird mehrere Stunden lang einer Lösung der Sonde ausgesetzt, um es der Sonde zu ermöglichen, in situ die möglicherweise auf dem Filter vorhandenen Phagen zu binden, die ein Peptid mit einer signifikanten Affinität für die Sonde exprimieren. Der Filter wird dann gewaschen, um nicht-gebundene Sonde zu entfernen, und dann über die Exposition gegen eine Lösung des Enzym-Substrats (im Falle einer direkt markierten Sonde) entwickelt oder weiter einer Lösung eines Enzym-markierten Avidins (im Falle einer biotinylierten Sonde) ausgesetzt. Bei einer bevorzugten Methode wird eine HRP-markierte Sonde durch Western-Blotting-Verfahren mittels ECL nachgewiesen (Amersham, Arlington Heights, Illionois), was die Verwendung von Luminol in Anwesenheit von Phenol zur Erzeugung einer erhöhten Chemilumineszenz, die durch eine kurze Exposition eines Films mittels Autoradiographie nachweisbar ist, beinhaltet, wobei die exponierten Bereiche des Films den positiven Plaques auf der Ausgangsplatte entsprechen. Wenn ein Enzym-Substrat verwendet wird, werden die positiven Phagen-Plaques anhand der lokalisierten Ablagerung gefärbter enzymatischer Spaltprodukte auf dem Filter, die Plaques auf der Ausgangsplatte entsprechen, identifiziert. Der entwickelte Filter oder Film wird dann einfach wieder mit der Platte unter Verwendung der Registrierungsmarkierungen zur Deckung gebracht, und die "positiven" Plaques werden zur Gewinnung des Phagen von der Agarose gekratzt. Wegen der hohen Dichte der Plaques auf der Ausgangsplatte ist es normalerweise unmöglich, beim ersten Durchgang einen einzelnen Plaque von der Platte zu isolieren. Dementsprechend werden Phagen, die von der Ausgangsplatte gekratzt wurden, erneut bei niedriger Dichte ausplattiert, und der Prozess wird wiederholt, um die Isolierung einzelner Plaques und somit einzelner Phagenklone zu ermöglichen.
Erfolgreiche Screening-Experimente werden optimalerweise unter Einsatz von drei aufeinander folgenden Screening-Runden durchgeführt. Die gewonnenen Zellen werden dann in niedriger Dichte ausplattiert, um einzelne Kolonien für eine individuelle Analyse zu erhalten. Die einzelnen Kolonien werden ausgewählt und für das Inokulieren von LB-Kultumedium, das Ampicillin enthält, verwendet. Nach einer Übernachtkultur bei 37ºC werden die Kulturen abzentrifugiert. Einzelne Zellaliquots werden dann erneut im Hinblick auf eine Bindung an den Target-Liganden, der an Kügelchen befestigt ist, getestet. Die Bindung an andere Kügelchen, an denen ein nicht-relevanter Ligand befestigt ist, kann als Negativkontrolle eingesetzt werden.
Ein wichtiger Aspekt des Screenings der Bibliotheken betrifft die Elution. Bezüglich der Klarheit der Erläuterung wird das Folgende hinsichtlich einer TSAR-Expression von Phagen diskutiert; jedoch sollte klar sein, dass diese Diskussion auf jedes beliebige System anwendbar ist, bei dem ein Zufallspeptid auf einem Oberflächen-Fusionsmolekül exprimiert wird. Es ist denkbar, dass die Bedingungen, die die Wechselwirkungen zwischen dem Peptid und dem Target während der Gewinnung des Phagen zerstören, für jede gegebene Peptidsequenz aus einer Vielzahl von Proteinen, die auf einem Phagen exprimiert werden, spezifisch sind. Beispielsweise können bestimmte Wechselwirkungen durch einen sauren pH zerstört werden, aber nicht durch einen basischen pH, oder umgekehrt. Somit kann es wünschenswert sein, verschiedene Elutionsbedingungen zu testen (einschließlich aber nicht beschränkt auf, pH 2-3, pH 12-13, überschüssiges Target als Kompetitor, Detergenzien, milde Denaturierungsmittel für Proteine, Harnstoff, unterschiedliche Temperatur, Licht, Anwesenheit oder Abwesenheit von Metall-Ionen, Chelatoren, etc.) und die Primärstrukturen der TSAR-Proteine zu vergleichen, die auf gewonnenen Phagen exprimiert werden, die unter den jeweils eingesetzten Bedingungen gewonnen wurden, um für jede Kombination aus Ligand/TSAR die geeigneten Elutionsbedingungen zu bestimmen. Einige dieser Elutionsbedingungen können unvereinbar mit der Phageninfektion sein, da sie bakterizid sind und durch eine Dialyse entfernt werden müssen (d. h. mittels eine Dialysetasche, eines Centricon/Amicon-Mikrokonzentrators).
Die Fähigkeit unterschiedlicher exprimierter Proteine, unter verschiedenen Bedingungen eluiert zu werden, kann möglicherweise nicht nur auf der Denaturierung der spezifischen Peptid-Bereiche beruhen, die in die Bindung an das Target verwickelt ist, sondern sie kann auch auf Konformationsveränderungen in den flankierenden Bereichen beruhen. Diese flankierenden Bereiche können auch zusammen mit der tatsächlichen Bindungssequenz denaturiert sein; diese flankierenden Bereiche können auch als Reaktion auf die Exposition gegen die Elutionsbedingungen (d. h. pH 2-3, pH 12-13, überschüssiges Target als Kompetitor, Detergenzien, milde Denaturierungsmittel für Proteine, Harnstoff, unterschiedliche Temperatur, Licht, Anwesenheit oder Abwesenheit von Metall-Ionen, Chelatoren, etc.) ihre Sekundärstruktur oder Tertiärstruktur verändern, was wiederum zur Deformation der Konformation des Peptids, das für die Bindung an das Target verantwortlich ist, führt.
Gemäß einem anderen alternativen Verfahren, bei dem die TSARs einen Linkerbereich zwischen der bindenden Domäne und der Effektordomäne besitzen, können bestimmte TSAR- Bibliotheken präpariert und gescreent werden, und zwar durch: (1) gentechnologisches Konstruieren eines Vektors, vorzugsweise eines Phagenvektors, so dass eine DNA-Sequenz einen Abschnitt des Faktors Xa (oder eines Peptids, das durch die Faktor-Xa-Protease spaltbar ist) codiert und an das Gen angrenzend vorliegt, das für die Effektor-Domäne codiert, beispielsweise das Gen des pIII-Hüllproteins; (2) Konstruieren und Zusammenbauen der doppelsträngigen synthetischen Oligonucleotide, wie es oben beschrieben wurde, und Einfügen in den gentechnologisch konstruierten Vektor; (3) Exprimieren der Vielzahl von Vektoren in einem geeigneten Wirt unter Bildung einer Bibliothek von Vektoren; (4) Screenen bezüglich einer Bindung an einen immobilisierten Liganden; (5) Entfernen von überschüssigen Phagen durch Waschen; und (6) Behandeln des immobilisierten Phagen mit der Faktor-Xa-Protease. Das Teilchen wird vom Peptid-Ligand-Komplex entkoppelt und kann dann für das Infizieren von Bakterien zur Regenerierung des Teilchens mit seinem vollständigem pIII-Molekül für weitere Screening-Runden verwendet werden. Diese alternative Ausführungsform erlaubt vorteilhafterweise die Verwendung universell wirksamer Elutionsbedingungen und ermöglicht somit die Identifizierung von Phagen, die TSARs exprimieren und ansonsten unter Verwendung anderer bekannter Elutionsverfahren u. U. nicht gewonnen werden könnten. Zur Illustration sei erwähnt, dass mittels dieser Ausführungsform extrem fest bindende TSARs gewonnen werden konnten. Wenn es gewünscht wird können die Oligonucleotide, die für die auf diese Weise selektierte Bindungsdomäne codieren, mutiert, exprimiert und erneut chromatographiert werden (oder mittels eines anderen Verfahrens gescreent werden), um eine verbesserte Bindungsaktivität zu entdecken. Insbesondere kann eine Sättigungsmutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide, die mittels "dotierter" Nucleotid-Reservoirs synthetisiert wurden, durchgeführt werden. Die Dotierung wird so durchgeführt, dass die ursprüngliche Peptidsequenz nur einmal in 10&sup6; verschiedenen Klonen des mutierten Oligonucleotids vorhanden ist. Die vereinigten Oligonucleotide werden in einen parentalen TSAR-Vektor kloniert. Vorzugsweise ist der Vektor m663 (Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427). m663 ist imstande blaue Plaques zu erzeugen, wenn man ihn im E.-coli-Stamm JM101 oder DH5αF' wachsen lässt. Es wird eine Bibliothek, die größer ist als 10&sup6;, bevorzugt; es reicht jedoch eine Bibliothek von 10&sup5; aus, um TSAR-Phagen zu isolieren, die Peptid-Domänen mit erhöhter Selektivität bezüglich einer Bindung an den Target-Liganden exprimieren.
Für die hier im Abschnitt 6 gebrachten Beispiele wird eine TSAR-Bibliothek eingesetzt; für Fachleute auf diesem Gebiet wird es jedoch klar sein, dass andere Peptidbibliotheken eingesetzt werden können. Ein Beispiel für eine TSAR-Bibliothek ist die TSAR-9-Bibliothek, die von Kay et al., 1993, Gene 128: 59-65, offenbart wurde. TSAR-9-Konstrukte exprimieren ein Peptid von ungefähr 38 Aminosäuren Länge, das insgesamt 36 Zufallspositionen aufweist.

5.3.1. ANTIKÖRPER UND DERIVATE VON DIESEN ZUR VERWENDUNG BEIM SCREENING

Es können Antikörper erzeugt werden, die ein Antigen von Interesse erkennen. Diese Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Diese Antikörper können als Liganden im ersten Screening-Schritt der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Es sind auf diesem Gebiet verschiedene Verfahren bekannt, die zur Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen ein Antigen von Interesse verwendet werden können. Für die Erzeugung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch die Injektion eines Antigens von Interesse oder eines Derivat von diesem immunisiert werden, wobei zu diesen Tieren, ohne auf diese begrenzt zu sein, Kaninchen, Mäuse, Ratten etc. gehören. Es können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Antwort in Abhängigkeit von der Wirtsspezies zu verstärken, wobei zu diesen. ohne auf sie beschränkt zu sein, Freunds Adjuvans (komplett und nicht komplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen, die Hämocyanine der Schlüsselloch-Napfschnecke, Dinitrophenol und potenziell nützliche humane Adjuvanzien wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum gehören.
Ein monoklonaler Antikörper gegen ein Antigen von Interesse kann unter Verwendung einer beliebigen Technik erzeugt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur ermöglicht. Zu diesen Techniken gehören, ohne auf sie beschränkt zu sein, die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Köhler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) beschrieben wurde, und die neuere Technik unter Einsatz von menschlichen B-Zell-Hybridomen (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) sowie die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., S. 77-96).
Die molekularen Antikörper können humane molekulare Antikörper oder schimärische monoklonale Human-Maus-Antikörper (oder anderer Spezies) sein. Humane monoklonale Antikörper können mittels einer beliebigen der zahlreichen Techniken, die in diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden (z. B. Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92: 3-16). Es können schimärische Antikörpermoleküle hergestellt werden, die eine Antigen-bindende Domäne der Maus und konstante Bereiche des Menschen enthalten (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851, Takeda et al., 1985, Nature 314: 452).
Ein molekularer Klon eines Antikörpers gegen ein Antigen von Interesse kann mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Gentechnologische Verfahren (siehe z. B. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) können zur Konstruktion von Nucleinsäuresequenzen verwendet werden, die für ein Molekül eines monoklonalen Antikörpers oder dessen Antigen-bindenden Bereich codieren.
Antikörpermoleküle können mittels bekannter Techniken gereinigt werden, beispielsweise durch Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (high performance liquid chromatography) oder eine Kombination von diesen etc.
Antikörper-Fragmente, die den Idiotyp oder den Antigen-bindenden Bereich des Moleküls enthalten, können mittels bekannter Techniken erzeugt werden. Zu solchen Fragmenten gehören, ohne auf sie beschränkt zu sein: das F(ab')2-Fragment, das durch einen Pepsin- Verdau des Antikörpermoleküls erzeugt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch eine Reduktion der Disulfid-Brücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden können, und die 2 Fab oder Fab-Fragmente, die durch die Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.

5.4. IDENTIFIZIERUNG SYNTHETISCHER SEQUENZEN, DIE DIE BINDUNG VERMITTELN

Wenn ein Peptid aus einer Peptidbibliothek als Abtid oder Mimetop für einen speziellen Target-Liganden von Interesse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde (entweder im ersten oder dem zweiten Screening-Schritt), dann kann es nützlich sein zu bestimmen, welcher Bereich bzw. welche Bereiche der exprimierten Peptidsequenz für die Bindung an den Target-Liganden verantwortlich ist bzw. sind. Eine derartige Analyse kann auf zwei unterschiedlichen Niveaus durchgeführt werden, d. h. auf dem Niveau der Nucleotidsequenz und auf dem der Aminosäuresequenz.
Mittels molekularbiologischer Techniken ist es möglich, ein Liganden-bindendes Peptid auf dem Niveau von Oligonucleotiden zu verifizieren und genauer zu analysieren. Erstens können die insertierten Oligonucleotide unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme gespalten und in den ursprünglichen Expressionsvektor ligiert werden, und das Expressionsprodukt dieses Vektors kann bezüglich einer Ligandenbindung gescreent werden, um die Oligonucleotide zu identifizieren, die für den bindenden Bereich des Abtids oder Mimetops codieren. Zweitens können die Oligonucleotide in einen anderen Vektor transferiert werden, beispielsweise vom Phagen zum Phagemid. Die neu exprimierten Fusionsproteine sollten die gleiche Bindungsaktivität besitzen, wenn die Domäne notwendig und ausreichend für die Bindung an den Liganden ist. Dieser letztere Ansatz untersucht auch, ob die flankierenden Aminosäurereste, die durch den ursprünglichen Vektor codiert werden, die Bindung des Peptids auf irgendeine Weise beeinflusst oder nicht. Drittens können die Oligonucleotide basierend auf der Nucleotidsequenz, die für den Phagen in der Bibliothek bestimmt wurde, der für das bindende Peptid codiert, synthetisiert werden, durch Klonierung oder PCR-Amplifizierung unter Verwendung interner und flankierender Primer amplifiziert werden, in zwei Stücke gespalten und als zwei halbe Fragmente der bindenden Domäne kloniert werden. Auf die beschriebene Weise werden die insertierten Oligonucleotide in zwei gleiche Hälfte gespalten. Wenn die für die Bindung wichtige Peptid-Domäne klein ist, dann würde einer der rekombinanten Klone eine Bindung zeigen und der andere nicht. Wenn beide keine Bindung zeigen, dann sind entweder beide wichtig oder der essentielle Abschnitt der Domäne umfasst die Mitte (was durch das Exprimieren lediglich des zentralen Bereichs getestet werden kann).
Alternativ können die bindenden Domänen durch das Synthetisieren von Peptiden, die der abgeleiteten Sequenz des Abtids oder Mimetops entsprechen, analysiert werden. Zuerst sollte das gesamte Peptid synthetisiert und bezüglich seiner Bindung an den Target-Liganden untersucht werden um zu verifizieren, dass das Peptid für die Bindung notwendig und ausreichend ist. Zweitens können kurze Peptid-Fragmente, beispielsweise überlappende 10-mers, basierend auf der Aminosäuresequenz der bindenden Domäne des Zufallspeptids, synthetisiert werden und zur Identifizierung derjenigen, die den Liganden binden, getestet werden.
Darüber hinaus kann es in bestimmten Fällen sein, dass lineare Motive (Konsensusmotive) nach dem Vergleich der Primärstrukturen unterschiedlicher bindender Peptide aus der Bibliothek, die eine Bindungsaffinität für einen Target-Liganden aufweisen, deutlich werden. Der Beitrag dieser Motive zur Bindung kann mittels synthetisierter Peptide in Kompetitionsexperimenten verifiziert werden (d. h. durch die Bestimmung der Konzentration des Peptids, die imstande ist, die Bindung des Phagen an sein Target um 50% zu hemmen; IC&sub5;&sub0;). Umgekehrt kann das Motiv oder ein beliebiger Bereich, von dem angenommen wird, dass er wichtig für die Bindung ist, aus der DNA, die für das Zufalls-Peptidinsert codiert, entfernt oder in dieser mutiert werden, und das veränderte exprimierte Peptid kann bezüglich einer Bindung erneut getestet werden.
Weiterhin kann, wenn die bindende Domäne eines Peptids identifiziert worden ist, die Bindungscharakteristik dieses Peptids durch das Variieren der Sequenz der bindenden Domäne modifiziert werden, um eine verwandte Familie von Peptiden mit unterschiedlichen Eigenschaften bezüglich eines spezifischen Liganden zu erzeugen.
Weiterhin können in einem Verfahren einer gerichteten Evolution die identifizierten Peptide durch weitere Runden einer Zufallsmutagenese, Selektion und Amplifikation der Nucleotidsequenzen, die für die bindenden Domänen codieren, verbessert werden. Die Mutagenese kann durch das Erzeugen und Klonieren einer neuen Gruppe von Oligonucleotiden erreicht werden, die sich leicht von der Ausgangssequenz unterscheiden, beispielsweise um 1 bis 10%. Die Selektion und die Amplifikation werden wie oben beschrieben erreicht. Beispielsweise kann man um zu verifizieren, dass die isolierten Peptide eine verbesserte Bindungscharakteristik aufweisen, Mutanten und den Ausgangsphagen, die sich in ihrer lacZ-Expression unterscheiden, während der Screening-Experimente gemeinsam verarbeiten. Eine Veränderung des ursprünglichen Verhältnisses der blauen zur weißen Farbe im Laufe des Screening- Experimentes dient als optisches Verfahren für die Überprüfung der erfolgreichen Selektion verbesserter bindender Petide. Dieser Prozess kann mehrere Zyklen durchlaufen.

5.5. VERWENDUNGEN VON ABTIDEN

5.5.1. TESTS UNTER VERWENDUNG VON ABTIDEN

Die Abtide der vorliegenden Erfindung und diejenigen, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, besitzen Bindungsspezifitäten, die denjenigen der Liganden (beispielsweise Antikörper, Rezeptoren) ähnlich sind, die im ersten Screening-Schritt des Prozesses, durch den die Abtide identifiziert werden, verwendet wurden. Demgemäß können die Abtide in vielen der Fälle verwendet werden, in denen der Ligand des ersten Screening- Schritts verwendet werden könnte. Beispielsweise bindet, wenn der Ligand, der im ersten Screening-Schritt verwendet wird, ein Antikörper ist, das Abtid, das nach dem zweiten Screening-Schritt identifiziert wird, spezifisch an das gleiche Antigen, an das der Antikörper spezifisch bindet. Deshalb könnte das Abtid in vielen der Reaktionen oder Tests, in denen der Antikörper verwendet werden könnte, als Ersatz für den Antikörper eingesetzt werden. Beispielsweise könnte das Abtid in Immunoassays, die auf diese Gebiet bekannt sind, eingesetzt werden, beispielsweise denjenigen, die für den Nachweis oder die Bestimmung der Menge des Antigens konstruiert sind. Natürlich kann es sein, dass derartige Immunoassays auf geeignete Weise modifiziert werden müssen. Beispielsweise nützen viele Immunoassays einen Schritt aus, bei dem ein zweiter Antikörper, der mit einer radioaktiven Gruppe oder einem Enzym, wie der alkalischen Phosphatase, markiert ist, spezifisch den ersten Antikörper bindet. Von einem derartigen zweiten Antikörper würde man nicht erwarten, dass er spezifisch das Abtid bindet. Jedoch wäre es ohne weiteres für einen durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiete möglich, eine andere markierte Gruppe zu erzeugen, vielleicht einen dritten Antikörper, der imstande wäre, spezifisch das Abtid zu binden, oder das Abtid vor der Verwendung mit einem nachweisbaren Marker zu markieren.
Zu den Immunoassays, die eingesetzt werden können, gehören, ohne auf sie beschränkt zu sein, kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme, die Techniken wie Western- Blots, Radioimmunoassays, ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), "Sandwich"-Immunoassays, Dot-Immunoblot-Assays, Immunpräzipitatonsassays, Präzipitinreaktionen, Geldiffusions-Präzipitinreaktionen, Immundiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplement- Fixierungsassays, immunradiometrische Assays, Fluoreszenz-Immunoassays, Protein-A-Immunoassays, Immunaffinitätschromatographie und Flow-Dipstick-Assays, um nur ein paar aufzuzählen. Bezüglich beispielhafter Verfahren, die in Immunoassays eingesetzt werden können, siehe ganz allgemein Kricka, 1985, Clinical and Bichemical Analysis 17: 1-15; Armbruster, 1993, Clin. Chem. 39/2: 181-195; Birnbaum et al., 1992, Anal. Biochem. 206: 168-171; Miyai, 1985, Adv. Clin. Chem. 24: 61-110 sowie die darin zitierten Literaturstellen.
Die Proben, die mittels der Immunoassays untersucht werden sollen, können jede beliebige Probe sein, die das Antigen oder den Liganden enthalten könnte, der getestet werden soll. Beispielsweise können diese Proben Körperflüssigkeiten sein, wie Plasma, Blut, Serum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit etc.
Die nachweisbare Markierung, die in den Immunoassays verwendet werden soll, kann jede beliebige nachweisbare Markierung sein, die man in diesem Gebiet kennt. Zu derartigen Markierungen gehören Radioisotope, fluoreszierende Farbstoffe, Enzyme (beispielsweise Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase), chemilumineszierende Moleküle, Metallatome oder phosphoreszierende Farbstoffe, gefärbte Teilchen, Metall- und Farbstoffkolloide.

5.5.1.1. SANDWICH-ELISA

Bei einer besonderen Ausführungsform können die Abtide in einem Sandwich-Enzyme- Immunoassay eingesetzt werden. Es folgt eine Beschreibung einer solchen Ausführungsform, die als Beispiel, und nicht als Einschränkung, gebracht wird: Ein Molekül, das ein Abtid umfasst, wird an einem festen Träger befestigt. Das Molekül, das das Abtid umfasst, kann mit einer Substanz verknüpft sein, die die Befestigung des Moleküls am Träger erleichtert. Die Probe, die getestet werden soll, wird mit dem Molekül, das das an den Träger gebundene Abtid umfasst, in Kontakt gebracht. Die Substanzen in der Probe, die spezifische Bindungspartner des Abtids (Analyten) sind, binden an das Abtid, und nicht-bindende Bestandteile der Probe werden durch Waschen entfernt. Es wird ein Enzym-konjugierter monoklonaler Antikörper, der gegen den Analyten gerichtet ist, zugegeben. Dieser Enzym-konjugierte monoklonale Antikörper bindet an den Teil des Analyten, für den er spezifisch ist, und vervollständigt den Sandwich. Nach der Entfernung von ungebundenem Enzym-konjugiertem monoklonalen Antikörper durch Waschen wird eine Substratlösung zu den Wells gegeben. Es bildet sich ein gefärbtes Produkt im Verhältnis zur Menge des Analyten, der in der Probe vorhanden ist. Die Reaktion kann durch den Zusatz einer Stopp-Lösung beendet werden, und die Absorption wird spektralphotometrisch gemessen. Das Folgende veranschaulicht diese Schritte detaillierter.
(a) Die Wells von Mikrotiterplatten aus Polystyrol (Flow Laboratory) werden über Nacht bei Raumtemperatur mit 100 ul einer Lösung eines Moleküls beschichtet, die ein Abtid in einer Konzentration von 1 mg/ml in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) enthält.
(b) Die Beschichtungslösung wird abgegossen, und die Wells werden 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 300 ul 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphatgepufferter Saline (PBS) mit 0,05% Tween 20 (PBS-Tween-Puffer) geblockt.
(c) 150 ul einer Probe (von der vermutet wird, dass sie einen Analyten enthält, dessen Anwesenheit oder Menge bestimmt werden soll), die mit 1% BSA-PBS verdünnt ist, werden zu jedem Well gegeben. Die Wells werden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
(d) Die Wells werden 4-mal mit PBS-Tween-Puffer gewaschen.
(e) 100 ul eines mit Meerrettichperoxidase konjugierten monoklonalen Antikörpers in 1% BSA-PBS, der spezifisch für den Analyten ist, werden zu jedem Well gegeben. Die Konzentration des monoklonalen Antikörpers kann von ungefähr 10 ng/ml bis 10 mg/ml reichen. Die Wells werden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
(f) Die Wells werden 6-mal mit PBS-Tween-Puffer gewaschen.
(g) 100 ul einer Arbeitslösung von ABTS® (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazidinsulfonat (6)] von Boehringer Mannheim, Lösung des kristallisierten Diammoniumsalzes, werden pro Well zugegeben. Die ABTS®-Stammlösung wird in einer Konzentration von 15 mg/ml in dH&sub2;O hergestellt. Zur Herstellung der Arbeitslösung werden 200 ul dieser ABTS®-Stammlösung mit 10 ml Citrat-Phosphat-Puffer (17 mM Zitronensäure, 65 mM dibasisches Natriumphosphat) und 10 ul 30% H&sub2;O&sub2; verdünnt.
(h) Die Absorption jedes Wells wird bei 405 nm in einem Mikroplatten-Reader (Dynatech MR600, Dynatech Corp. Alexandria, Virginia) gemessen.

5.5.2. PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN

Die Erfindung betrifft Verfahren für eine Behandlung durch die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen (therapeutischen oder diagnostischen) Zusammensetzung, die ein Abtid aufweist; an ein Subjekt. Ein derartiges Abtid, das für eine therapeutische oder diagnostische Verwendung vorgesehen ist, wird hier im folgenden als "Therapeutikum" oder "erfindungsgemäßes Therapeutikum" bezeichnet. Derartige Therapeutika sind Abtide, die spezifische an ein Molekül in vivo binden, um eine therapeutische oder diagnostische Wirkung auszuüben. Bei einem bevorzugten Aspekt ist das Therapeutikum im wesentlichen gereinigt. Das Subjekt ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich von, ohne auf diese beschränkt zu sein, Tieren wie Kühen, Schweinen, Pferden, Hühnern, Katzen, Hunden etc., und es ist vorzugsweise ein Säugetier und am bevorzugtesten ein Mensch.
Formulierungen und Verabreichungsverfahren, die eingesetzt werden können, sind in diesem Gebiet bekannt, und sie können aus denjenigen ausgewählt werden, die hier im Folgenden beschrieben werden.
Verschiedene Verabreichungssysteme sind bekannt und können zur Verabreichung eines erfindungsgemäßen Therapeutikums eingesetzt werden, beispielsweise eine Verkapselung in Liposomen, Mikroteilchen, Mikrokapseln, rekombinante Zellen, die das Therapeutikum enthalten, eine Rezeptor-vermittelte Endocytose (vgl. beispielsweise Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), etc. Zu Verabreichungsverfahren gehören, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein, der intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und orale Weg sowie transdermale und subkutane Implantate für eine verzögerte Freisetzung. Die Therapeutika können auf jedem beliebigen geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise über eine Infusion oder Bolus-Injektion, über eine Absorption durch epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (beispielsweise die orale Mukosa, die rektale und intestinale Mukosa etc.), und sie können zusammen mit anderen biologisch wirksamen Stoffen verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung über einen beliebigen geeigneten Weg in das Zentralnervensystem einzuführen, einschließlich einer intraventrikulären und intrathekalen Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter erleichtert werden, der beispielsweise an einem Reservoir wie einem Ommaya-Reservoir befestigt ist. Bei einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, Liposomen einzusetzen, die über Abtide auf spezifische identifizierbare Zelloberflächen-Antigene ausgerichtet sind.
Bei einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die Therapeutika der Erfindung dem Gebiet, das eine Behandlung benötigt, lokal zuzuführen. Das kann beispielsweise, aber nicht als Einschränkung, über eine lokale Infusion während einer Operation, über eine topische Applikation, z. B. zusammen mit einem Wundverband nach einem chirurgischen Eingriff, über eine Injektion, mittels eines Katheters, mittels eines Zäpfchens oder mittels eines Implantats erzielt werden, wobei das genannte Implantat aus einem porösen, nicht-porösen oder gelatineartigen Material, einschließlich von Membranen, wie silastischen Membranen, oder Fasern bestehen kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen. Derartige Zusammensetzungen weisen eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff auf. Ein derartiger Träger enthält, ohne darauf beschränkt zu sein, Saline, gepufferte Saline, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Der Träger und die Zusammensetzung können steril sein. Die Zusammensetzung sollte der Verabreichungsform angepasst sein.
Die Zusammensetzung kann, wenn es gewünscht wird, auch kleinere Mengen an Benetzungsmitteln oder Emulgatoren oder pH-puffernden Mitteln enthalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, eine Suspension, eine Emulsion, eine Tablette, eine Pille, eine Kapsel, eine Formulierung für eine verzögerte Freisetzung oder ein Pulver sein. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen formuliert sein, mit herkömmlichen Bindemitteln und Trägern, beispielsweise Triglyceriden. Orale Formulierungen können Standardträger enthalten, wie Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat etc. in pharmazeutischer Reinheit.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung gemäß Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die für eine intravenöse Verabreichung an den Menschen adaptiert ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen für eine intravenöse Verabreichung Lösungen in sterilem, isotonischem, wässrigem Puffer. Wenn es erforderlich ist kann die Zusammensetzung auch einen Lösungsvermittler und ein Lokalanästhetikum, wie Lignocain enthalten, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern. Im allgemeinen werden die Bestandteile entweder getrennt oder in einer Einheitadosierung gemischt zugeführt, beispielsweise als trockenes lyophilisiertes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch versiegelten Behälter, wie einer Ampulle oder einem Päckchen, auf der bzw. dem die Menge des Wirkstoffs angegeben ist. Wenn die Zusammensetzung über eine Infusion verabreicht werden soll, kann sie in eine Infusionsflasche gegeben werden, die steriles Wasser oder sterile Saline von pharmazeutischer Reinheit enthält. Wenn die Zusammensetzung über eine Injektion verabreicht werden soll, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für die Injektion oder Saline bereit gestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung vermischt werden können.
Die erfindungsgemäßen Therapeutika können in neutraler Form oder in Form von Salzen formuliert werden. Zu pharmazeutisch annehmbaren Salzen gehören diejenigen, die sich mit freien Aminogruppen bilden, wie diejenigen, die sich von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäuren etc. ableiten, und diejenigen, die sich mit freien Carboxy- Gruppen bilden, wie denjenigen, die sich von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- und Eisenhydroxiden ableiten, von Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc.
Die Menge des erfindungsgemäßen Therapeutikums, das bei der Behandlung einer bestimmten Erkrankung oder Krankheit wirksam ist, hängt von der Art der Krankheit oder Erkrankung ab und kann mittels klinischer Standardtechniken ermittelt werden. Außerdem können In-vitro-Tests gegebenenfalls als Unterstützung bei der Identifizierung optimaler Dosisbereiche eingesetzt werden. Die genaue Dosis, die in der Formulierung eingesetzt werden soll, hängt auch vom Verabreichungsweg ab und von der Schwere der Krankheit oder Erkrankung, und sie sollte in Abhängigkeit vom Urteil des Arztes und dem Zustand jedes einzelnen Patienten getroffen werden.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit, die bzw. der einen oder mehrere Behälter umfasst, der bzw. die mit einem oder mehreren der Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt ist bzw. sind. Gegebenenfalls kann ein derartiger Behälter oder können derartige Behälter mit einer Notiz versehen sein, und zwar in der Form, die von Behörden vorgegeben ist, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten regulieren, wobei die Notiz die Zustimmung der Behörde zur Herstellung, zur Verwendung und zum Verkauf für eine Anwendung beim Menschen bescheinigt.

5.5.3. DIAGNOSTISCHE UND THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN VON ABTIDEN IN VIVO

Ein weiteres Gebiet, auf dem Abtide anstelle von Antikörpern eingesetzt werden können, ist das Imaging, der Nachweis oder die Behandlung von Krankheiten. Die derzeitigen diagnostischen und therapeutischen Verfahren setzen Antikörper ein, um Agenzien für ein Imaging oder therapeutische Substanzen auf ein bestimmtes Ziel, z. B. auf Tumoren, auszurichten. Da Abtide die gleiche Bindungsspezifität wie Antikörper besitzen, können Abtide anstelle von Antikörpern in derartigen diagnostischen und therapeutischen Verfahren eingesetzt werden.
Abtide können mit Chelatoren verknüpft werden, beispielsweise denjenigen, die im US- Patent Nr. 4 741 900 oder im US-Patent Nr. 5 326 856 beschrieben werden. Der Abtid-Chelator- Komplex kann dann radioaktiv markiert werden, um ein Agens zum Imaging für die Diagnose oder die Behandlung von Krankheiten zu liefern. Das Abtid kann auch in den Verfahren, die in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/127 351 (WO-A-9509013) offenbart werden, zur Erzeugung eines radioaktiv markierten Peptids für eine Verwendung im Imaging oder in der Radiotherapie eingesetzt werden. Diese Anmeldung enthält einen Review von Verfahren, bei denen Peptide als Agenzien für ein Imaging eingesetzt werden.
Bei diagnostischen In-vivo-Anwendungen können spezifische Gewebe, oder sogar spezifische zelluläre Erkrankungen, durch die Verabreichung einer ausreichenden Menge eines markierten Abtids der vorliegenden Erfindung bildlich dargestellt oder gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert werden.
Eine große Vielzahl von Metall-Ionen, die für ein Gewebs-Imaging in vivo geeignet sind, wurde klinisch getestet und eingesetzt. Für das Imaging mit Radioisotopen sind die folgenden Charakteristika allgemein erwünscht: (a) eine niedrige Strahlendosis für den Patienten; (b) eine hohe Photonen-Ausbeute, die es ermöglicht, eine nuklearmedizinische Prozedur in kurzer Zeit durchzuführen; (c) die Fähigkeit, in ausreichenden Mengen erzeugt werden zu können; (d) akzeptable Kosten; (e) einfache Präparierung für eine Verabreichung; und (f) keine Notwendigkeit, den Patienten anschließend zu isolieren. Diese Charakteristika bewirken im allgemeinen das Folgende: (a) die Strahlenexposition der kritischsten Organe liegt unter 5 rad; (b) ein einzelnes Bild kann innerhalb weniger Stunden nach der Infusion erhalten werden; (c) das Radioisotop zerfällt nicht unter Aussendung eines Partikels; (d) das Isotop kann leicht nachgewiesen werden; und (e) die Halbwertszeit liegt unter vier Tagen (Lamb und Kramer, "Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine", In Radiotracers For Medical Applications, Band 1, Rayudu (Hrsg.), CRC-Press Inc., Boca Raton, S. 17-62). Vorzugsweise ist das Metall Technetium-99 m.
Zur Veranschaulichung sei angemerkt, dass zu den Targets, die bildlich dargestellt werden können, beliebige feste Neoplasien bestimmter Organe wie Lymphknoten, Nebenschilddrüsen, Milz und Niere, Orte einer Entzündung oder Infektion (beispielsweise Macrophagen an diesen Orten), Herzinfarkte oder Thrombosen (neoantigene Determinanten auf Fibrin oder Blutplättchen) und dergleichen gehören, die für einen durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sind. Weiterhin kann das neoplastische Gewebe im Knochen, in inneren Organen, im Bindegewebe oder in der Haut vorhanden sein.
Wie es ebenso für einen durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet klar ist, kann man die vorliegende Erfindung in der In-vivo-Therapeutik einsetzen (beispielsweise bei der Verwendung radiotherapeutischer Metallkomplexe), insbesondere dann, wenn ein Krankheitszustand über die oben beschriebenen diagnostischen In-vivo-Verfahren diagnostiziert wurde, oder in diagnostischen Anwendungen in vitro (beispielsweise durch die Verwendung eines radioaktiven Metalls oder eines fluoreszierenden Metallkomplexes).
Dementsprechend stellt man sich bei der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Bildes eines inneren Bereiches eines Subjekts vor, wobei das szintigraphische Bild aufgezeichnet wird, das aus dem Zerfall eines radioaktiven Metalls erhalten wird, wobei das radioaktive Metall eine Markierung auf einem erfindungsgemäßen oder gemäß der vorliegenden Erfindung identifizierten Abtid ist, von dem zuvor eine wirksame Menge dem Subjekt verabreicht wurde. Ähnlich stellt man sich ein Verfahren vor, bei dem ein Magnetresonanz-Bild eines inneren Bereiches eines Subjekts verstärkt wird, wobei man einem Subjekt eine wirksame Menge einer Abtid-Zusammensetzung verabreicht, die ein Metall enthält, wobei das Metall paramagnetisch ist und das Magnetresonanz-Bild eines inneren Bereichs des Subjekts aufgezeichnet wird.
Zu weiteren Verfahren gehört ein Verfahren der Verstärkung eines sonographischen Bildes eines inneren Bereiches eines Subjekts, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Abtid-Zusammensetzung, die ein Metall enthält, an ein Subjekt sowie das Aufzeichnen des sonographischen Bildes eines inneren Bereiches des Subjekts umfasst. Bei dieser letzteren Anwendung ist das Metall vorzugsweise ein beliebiges, nicht-toxisches Schwermetall-Ion. Es wird auch ein Verfahren zur Verstärkung eines Röntgenbildes eines inneren Bereiches eines Subjekts bereit gestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Abtid- Zusammensetzung, die ein Metall enthält, an das Subjekt sowie das Aufzeichnen des Röntgenbildes eines inneren Bereiches des Subjekts umfasst. Es wird ein radioaktives, nicht-toxisches Schwermetall-Ion bevorzugt.
Die Verwendung von Abtiden anstelle von Antikörpern in derartigen Verfahren hat gewisse Vorteile. Da Abtide Peptide sind, und keine großen Proteine wie Antikörper, unterscheidet sich die Kinetik ihrer Verteilung im Körper und ihrer Ausscheidung aus dem Blutstrom von derjenigen großer Proteine wie Antikörper. Beispielsweise können Abtide, wie im Abschnitt 6.1.4 demonstriert wird, für eine Darstellung von Krankheitszuständen in vivo innerhalb von ungefähr 2 bis 5 Stunden verwendet werden. Die derzeit eingesetzten Verfahren zum Imaging von Tumoren unter Verwendung von Antikörpern erfordern ungefähr 24 bis 48 Stunden.
Da Abtide Peptide sind, werden sie schneller als Antikörper aus dem Blut entfernt. Das bedeutet, dass ein geringeres Hintergrund-Signal im Blutstrom vorliegt, wenn Abtide zum Imaging von Krankheitszuständen verwendet werden, als wenn Antikörper verwendet werden.
Peptide rufen höchstwahrscheinlich eine weniger ausgeprägte Immunantwort bei Patienten hervor als große Proteine wie Antikörper. Diese Überlegung ist besonders dann wichtig, wenn eine Diagnose oder eine Behandlung wiederholt oder über einen längeren Zeitraum erfolgen muss.
Abtide können, da sie im allgemeinen kleine Proteine sind, in physiologischen Flüssigkeiten unter Bedingungen löslich bleiben, unter denen Antikörper es nicht können.
Abtide können, wiederum, weil sie im allgemeinen Peptide sind, mittels synthetischer Verfahren oder mittels gentechnologischer Verfahren erzeugt werden, und deshalb kann es sein, dass ihre Herstellung weniger Kosten verursacht als die Erzeugung von Antikörpern.
Abtide können einzeln eingesetzt werden. Alternativ können Abtide als Zusammensetzungen von Abtiden, bei denen sich die Peptidsequenzen der Abtide unterscheiden, eingesetzt werden.

5.6. SYNTHESE VON PEPTIDEN

5.6.1. VERFAHREN FÜR DIE FESTPHASEN-SYNTHESE

Abtide oder Mimetop-Peptide können mittels Verfahren hergestellt werden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise besteht, um das Verfahren kurz zusammenzufassen, die Festphasen-Peptidsynthese aus dem Koppeln der Carboxy-Gruppe der C-terminalen Aminosäure an ein Harz und dem sukzessiven Anknüpfen N-alpha-geschützter Aminosäuren. Die Schutzgruppen können beliebige, die man auf diesem Gebiet kennt, sein. Vor der Zugabe jeder Aminosäure zur wachsenden Kette wird die Schutzgruppe der vorhergehenden Aminosäure, die der Kette angefügt wurde, entfernt. Das Koppeln von Aminosäuren an geeignete Harze wird bei Rivier et al., US-Patent Nr. 4 244 946, beschrieben. Derartige Festphase- Synthesen wurde beispielsweise beschrieben von Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Vale et al., 1981, Science 213: 1394-1397; Marki et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3178 und in den US-Patenten Nr. 4 305 872 und Nr. 4 316 891. Bei einem bevorzugten Aspekt wird ein automatischer Peptid-Syntheseapparat eingesetzt.
Peptide können beispielsweise, ohne dass das als Einschränkung verstanden werden soll, auf einem automatischen Peptid-Syntheseapparat Modell 431A von Applied Biosystems Inc. ("ABI") unter Verwendung des "Fastmoc"-Syntheseprotokolls, das von ABI bereit gestellt wird, synthetisiert werden, wobei das Verfahren 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat ("HBTU"") als Kopplungsmittel einsetzt (R. Knorr et al., 1989, Tet. Lett., 30: 927). Die Synthesen können auf 0,25 mmol kommerziell erhältlichem 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-(9-fluorenyl-methoxycarbonyl)-aminomethyl)-phenoxy-Polystyrolharz ("Rink resin" von Advanced ChemTech) (H. Rink, 1987, Tet. Lett. 28: 3787) durchgeführt werden. Die Fmoc-Aminosäuren (1 mmol) werden entsprechend dem Fastmoc-Protokoll gekoppelt. Es werden die folgenden Seitenketten-geschützten Fmoc-Aminosäure-Derivate verwendet: FmocArg(Pmc)OH; FmocAsn(Mbh)OH; FmocAsp(tBu)OH; FmocCys(Acm)OH; FmocGlu(tBu)OH; FmocGln(Mbh)OH; FmocHis(Tr)OH; FmocLys(Boc)OH; FmocSer(tBu)OH; FmocThr(tBu)OH; FmocTyr(tBu)OH. [Abkürzungen: Acm, Acetamidomethyl; Boc, tert-Butoxycarbonyl; tBu, tert-Butyl; Fmoc, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; Mbh, 4,4'-Dimethoxybenzylhydryl; Pmc; 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl; Tr, Trityl].
Die Synthese wird unter Verwendung von N-Methylpyrrolidon (NMP) als Lösemittel durchgeführt, wobei HBTU in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst ist. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wird unter Verwendung von ca. 20% Piperidin in NMP durchgeführt. Am Ende jeder Synthese wird die vorliegende Peptidmenge mittels Ultraviolettspektroskopie bestimmt. Eine Probe des trockenen Peptidharzes (ca. 3-10 mg) wird abgewogen, und dann wird 20% Piperidin in DMA (10 ml) zugegeben. Nach einer 30-minütigen Ultraschallbehandlung wird die UV-Absorption des Dibenzofulven-Piperidin-Addukts (gebildet durch die Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Gruppe) bei 301 nm aufgezeichnet. Die Peptid-Substitution (in mmol g&supmin;¹) kann nach der folgenden Gleichung berechnet werden:
wobei A die Absorption bei 301 nm ist, v das Volumen des 20%-igen Piperidin in DMA (in ml), 7800 der Extinktionskoeffizient (in mol&supmin;¹ dm³ cm&supmin;¹) des Dibenzofulven-Piperidin-Addukts und w das Gewicht der Peptidharz-Pobe (in mg) ist.
Schließlich wird die N-terminale Fmoc-Gruppe unter Verwendung von 20% Piperidin in DMA abgespalten und dann unter Verwendung von Essigsäureanhydrid und Pyridin in DMA acetyliert. Das Peptidharz wird gründlich mit DMA, CH&sub2;Cl&sub2; und schließlich Diethylether gewaschen.

5.6.2. SPALTUNG UND ABSPALTUNG DER SCHUTZGRUPPE

Die Spaltung und die Entfernung der Schutzgruppe kann beispielsweise, und nicht als Einschränkung, wie folgt durchgeführt werden. Das luftgetrocknete Peptidharz wird mit Ethylmethylsulfid (EtSMe), Ethandithiol (EDT) und Thioanisol (PhSMe) ungefähr 20 min vor der Zugabe von 95% wässriger Trifluoressigsäure (TFA) behandelt. Es wird ein Gesamtvolumen von ca. 50 ml dieser Reagenzien pro Gramm des Peptidharzes eingesetzt. Es wird das folgende Verhältnis verwendet: TFA : EtSMe : EDT : PhSme = 10 : 0,5 : 0,5 : 0,5). Die Mischung wird 3 h lang bei Raumtemperatur unter einer N&sub2;-Atmosphäre gerührt. Die Mischung wird filtriert, und das Harz wird mit TFA (2 · 3 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum eingedampft, und wasserfreier Diethylether wird zu dem gelborangen Rückstand gegeben. Das resultierende weiße Präzipitat wird durch Filtration isoliert. Bezüglich unterschiedlicher Spaltungsverfahren siehe King et al., 1990, Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255-266.

5.6.3. REINIGUNG DER PEPTIDE

Die Reinigung der Peptide kann mittels Standardverfahren durchgeführt werden, zu denen Chromatographie (beispielsweise Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie und nach Größe auftrennende Säulenchromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)), Zentrifugation und differenzielle Löslichkeit gehören, oder durch jede beliebige andere Standardtechnik.

5.6.4. KONJUGATION DER PEPTIDE AN ANDERE MOLEKÜLE

Die erfindungsgemäßen Abtide können mittels Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, mit anderen Molekülen verknüpft werden (beispielsweise einer nachweisbaren Markierung, einem Molekül, das die Adsorption an einen festen Träger erleichtert, oder ein Toxin, entsprechend den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung). Zu derartigen Verfahren gehören die Verwendung homobifunktioneller und heterobifunktioneller vernetzender Moleküle.
Die homobifunktionellen Moleküle haben wenigstens zwei reaktive funktionelle Gruppen, die gleich sind. Zu den reaktiven funktionellen Gruppen eines homobifunktionellen Moleküls gehören beispielsweise Aldehyd-Gruppen und aktive Ester-Gruppen. Zu homobifunktionellen Molekülen mit Aldehyd-Gruppen gehören beispielsweise Glutaraldehyd und Subaraldehyd. Die Verwendung von Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel wurde von Poznansky et al., 1984, Science 223: 1304-1306 offenbart.
Zu homobifunktionellen Molekülen mit wenigstens zwei aktiven Ester-Einheiten gehören Ester von Dicarbonsäuren und N-Hydroxysuccinimid. Zu Beispielen derartiger N-Succinimidylester gehören Disuccinimidylsuberat und Dithio-bis-(succinimidylpropionat) und ihre löslichen Bis-Sulfonsäure- und Bis-Sulfonatsalze, beispielsweise ihre Natrium- und Kaliumsalze. Diese homobifunktionellen Reagenzien können von Pierce, Rockford, Illinois, bezogen werden.
Die heterobifunktionellen Moleküle besitzen wenigstens zwei unterschiedliche reaktive Gruppen. Zu Beispielen für heterobifunktionelle Reagenzien, die reaktive Disulfid-Bindungen enthalten, gehören N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (Carlsson et al., 1978, Biochem. J. 173: 723-737), Natrium-S-4-succinimidyloxycarbonyl-alpha-methylbenzylthiosulfat und 4-Succinimidyloxycarbonyl-alpha-methyl-(2-pyridyldithio)toluol. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat wird bevorzugt. Zu Beispielen für heterobifunktionelle Reagenzien, die reaktive Gruppen mit einer Doppelbindung enthalten, die mit einer Thiol-Gruppe reagiert, gehören Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat und Succinimidyl-m-maleimidobenzoat.
Zu anderen heterobifunktionellen Molekülen gehören Succinimidyl-3-(maleimido)propionat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimido-phenyl)butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethylcyclohexan)-1-carboxylat und Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester. Das Natriumsulfonatsalz von Succinimidyl-m-maleimidobenzoat wird bevorzugt. Viele der oben erwähnten heterobifunktionellen Reagenzien und ihre Sulfonatsalze können von Pierce bezogen werden.
Weitere Informationen bezüglich der Herstellung und Verwendung dieser sowie anderer polyfunktioneller Reagenzien können den folgenden Literaturstellen entnommen werden, die auf diesem Gebiet zur Verfügung stehen:
Carlsson et al., 1978, Biochem. J. 173: 723-737.
Cumber et al., 1985, Methods in Enzymology 112: 207-224.
Jue et al., 1978, Biochem. 17: 5399-5405.
Sun et al., 1974, Biochem. 13: 2334-2340.
Blattler et al., 1985, Biochem. 24: 1517-152.
Liu et al., 1979, Biochem. 18: 690-697.
Youle und Neville, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5483-5486.
Lerner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3403-3407.
Jung und Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761: 162.
Caulfield et al., 1984, Biochem. 81: 7772-7776.
Staros, 1982, Biochem. 21: 3950-3955.
Yoshitake et al., 1979, Eur. J. Biochem. 101: 395-399.
Yoshitake et al., 1982, J. Biochem. 92: 1413-1424.
Pilch und Czech, 1979, J. Biol. Chem. 254: 3375-3381.
Novick et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 8483-8487.
Lomant und Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104: 243-261.
Hamada und Tsuruo, 1987, Anal. Biochem. 160: 483-488.
Hashida et al., 1984, J. Applied Biochem. 6: 56-63.
Darüber hinaus werden Verfahren für das Vernetzen bei Means und Feeny, 1990, Biconjugate Chem. 1: 2-12 zusammenfassend dargestellt.

5.6.4.1. BIOTINYLIERUNG VON PEPTIDEN

Verfahren zur Biotinylierung von Peptiden sind in diesem Gebiet gut bekannt. Jedes beliebige Verfahren kann bei der Durchführung der Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise wurde die folgende Prozedur verwendet:
(1) Auflösen von 10 mg Peptid in 100 ul 0,1% Essigsäure;
(2) Zugabe von 900 ul PBS;
(3) Zugabe von 3,3 mg Biotin-LC-NHS (Pierce, Rockford, Illinois);
(4) 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur;
(5) Reinigung über eine Superose-12-Säule (Pharmacia, Piscataway, New Jersey).

6. BEISPIELE

6.1. ABTIDE, DIE DIE BINDUNGSSPEZIFITÄT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS 7E11-C5 NACHAHMEN

6.1.1. IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG VON ABTIDEN, DIE DIE BINDUNGSSPEZIFITÄT DES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS 7E11-C5 NACHAHMEN

7E11-C5 ist ein monoklonaler IgG1-Maus-Antikörper, der für ein Antigen eines humanen Prostatakarzinoms, LNCaP, spezifisch ist. 7E11-C5 bindet fest an malignes Prostata-Epithel, aber nur schwach an normales Prostata-Epithel. Er bindet nicht an andere Tumoren als Prostatatumoren oder die meisten normalen Organe; siehe Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7: 927-936. 7E11-C5 wird auch im US-Patent Nr. 5 162 504 beschrieben, das am 10. November 1993 erteilt wurde, wobei dieses Patent offenbart, dass 7E11-C5 vom Hybridom 7E11-C5 erzeugt wird, das in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der ATCC-Bezeichnung HB10494 hinterlegt wurde. Hybridome, die den monoklonalen Antikörper 7E11-C5 produzierten, ließ man als Ascites in Mäusen wachsen, und 7E11-C5 wurde durch Affinitätschromatographie mit Protein A bis zu einer Reinheit von über 90% aus der Ascites-Flüssigkeit gereinigt, wie mit einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermittelt wurde.
Zur Identifizierung von Abtiden, die die Bindungsspezifität des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 nachahmen, wurde der monoklonale Antikörper 7E11-C5 als der Target-Ligand in einem ersten Screening der TSAR-9-Bibliothek eingesetzt (siehe Kay et al., 1993, Gene 128: 59-65 und die PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994). Es wurde das folgende Screening-Verfahren eingesetzt. Zuerst wurde 7E11-C5 an einen Well einer Mikrotiterplatte gebunden. 7E11-C5, der in einer Konzentration von 11,2 mg/ml in Phosphat-gepufferter Saline (PBS), pH 6,0, vorlag, wurde mit 0,1 · PBS, pH 7,2, auf 100 ug pro ml verdünnt. 100 Mikroliter (100 ul) dieser Verdünnung wurden zu einem Well einer Mikrotiterplatte gegeben, und dann wurde 1-6 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Well wenigstens 4-mal mit einem Blockierungspuffer gewaschen, der entweder aus 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS bestand, aus 1% entfetteter Trockenmilch ("non-fat dry milk", NFDM) in PBS oder aus 0,1% Tween® in entweder 1 % BSA in PBS oder 1% NFDM in PBS. Es wurden 200 ul des Blockierungspuffers dem Well zugesetzt, und dann wurde wenigstens eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Als nächstes wurde ein Aliquot der TSAR-9-Bibliothek zu dem Well, der den gebundenen 7E11-C5 enthielt, gegeben. Ein Aliquot der Bibliothek, das 1010 Phagenpartikel enthielt, wurde dem Well zugesetzt, und dann wurde wenigstens eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das führte zur Bindung derjenigen Phagen an die Platte, die bindende Domänen, die an 7E11-C5 binden, enthielten. Nach einer Stunde wurde der Well entweder mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, 1% entfetteter Trockenmilch (NFDM) in PBS oder 0,1 Tween® in entweder 1% BSA in PBS oder 1% NFDM in PBS extensiv gewaschen.
Nach dem Waschen wurden Phagen, die an den 7E11-C5-Antikörper im Well gebunden hatten, durch die Zugabe von 100 ul einer sauren Lösung von 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,0, eluiert. Nach einer 15-minütigen bis einstündigen Inkubation wurde die saure Lösung, die den eluierten Phagen enthielt, in ein Röhrchen von 1,5 ml übertragen, und es wurde das gleiche Volumen 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5, zugegeben, um die saure Lösung zu neutralisieren. In einigen Fällen wurde die neutralisierte Phagen-Lösung sofort zu einem zweiten Well gegeben, der gebundenen 7E11-C5 Antikörper enthielt, und die Bindungsprozedur und die Elutionsprozedur wurden wiederholt.
Wenn es gewünscht war, das Ausmaß der Anreicherung während der oben genannten Schritte zu verfolgen, wurde ein irrelevanter Phage, der 7E11-C5 nicht bindet, aber das β-Galactosidase-Gen exprimiert, dem Aliquot aus der TSAR-9-Bibliothek zugesetzt. Dieser Phage führt, wenn er in Gegenwart von X-Gal und IPTG ausplattiert wird, zu blauen Plaques. Nach einem Screening-Schritt wurden die eluierten Phagen in X-Gal und IPTG ausplattiert. Ein Aliquot des nicht-gescreenten Phagen wurde ebenfalls ausplattiert. Es wurde für beide Phagen- Proben das Verhältnis der weißen zu den blauen Plaques bestimmt. Der Anstieg im Verhältnis der weißen Plaques (der TSAR-9-Phagen, die an 7E11-C5 binden) zu den blauen Plaques (der irrelevanten Phagen) ergab das Ausmaß, in dem der Screening-Prozess die Population der Phagen bezüglich derjenigen Phagen, die 7E11-C5 binden, anreicherte.
Wenn es gewünscht war, die Spezifität der Bindung während der oben aufgeführten Screening-Schritte zu verfolgen, wurde das Screening neben demjenigen für 7E11-C5 zusätzlich für ein irrelevantes Target (entweder BSA, Maus-IgG oder Kunststoff) durchgeführt. Die Anreicherung der weißen Plaques gegenüber den blauen Plaques, wenn das Panning für 7E11-C5 und nicht für ein irrelevantes Target erfolgte, zeigte das Ausmaß der Spezifität der Bindung an.
Nach dem Screening wurden die Phagen amplifiziert, indem ein Aliquot der eluierten Phagen zu einer Lösung gegeben wurde, die LB-Nährmedium und kompetente DH5αF'-E.-coli- Zellen (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland) enthielt Typischerweise wurde ein Aliquot von 2-5 ul der Phagen-Lösung zu 125 ul LB-Nährmedium gegeben, das eine 1 : 50-Verdünnung von DHSαF'-E.-coli-Zellen (ungefähr 1 · 10&sup9; Zellen/ml) enthielt. Es wurden 3,3 ml Top-Agar dieser Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde in einer Petrischale, die Agar enthielt, ausplattiert. Der Phage wurde oft titriert, indem mehrere serielle 1 : 10-Verdünnungen hergestellt wurden und die Verdünnung wie oben beschrieben ausplattiert wurde. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten bezüglich des Wachstums von Plaques untersucht und, wenn es gewünscht wurde, ausgezählt. Die Platten wurden eluiert, indem jeder Platte 3-5 ml 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (SM-Puffer) zugegeben wurden und dann 1-5 Stunden lang unter sanftem Bewegen inkubiert wurde. Die Lösung wurde dann von der Platte entfernt, zentrifugiert und entweder aufbewahrt, weiter amplifiziert oder analysiert.
In einigen Fällen wurden die Phagen in Lösung amplifiziert, indem 1-5 ul der Phagen- Lösung zu 1-5 ml LB-Nährmedium, das eine 1 : 50- oder 1 : 100-Verdünnung kompetenter DH5αF'-E.-coli-Zellen (ungefähr 1 · 10&sup9; Zellen/ml) enthielt, zugegeben wurden. Nach einer Inkubation für entweder 6 Stunden oder über Nacht wurde die Lösung zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. In einigen Fällen wurden die Phagen-Teilchen mit Polyethylenglycol (PEG) ausgefällt, indem 1/5 Volumen PEG zur geklärten Phagen-Lösung gegeben und eine Stunde auf Eis inkubiert wurde. Nach der Zentrifugation wurde der Phage üblicherweise mit 100 ul SM-Puffer rekonstituiert.
Mittels der oben genannten Verfahren wurden neun verschiedene Phagen isoliert, die Peptide exprimierten, die bindende Domänen enthielten, die imstande waren, den monoklonalen Antikörper 7E11-C5 zu binden. Moleküle, die diese bindenden Domänen aufweisen, sind somit Mimetope des Antigens, das vom monoklonalen Antikörper 7E11-C5 erkannt wird. Die bindenden Domänen der Peptide, die von den neun Phagen exprimiert werden, wurden gemäß Standardverfahren der DNA-Sequenzierung sequenziert (SequenaseTM, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Die Bestimmung dieser DNA-Sequenzen ermöglichte die Bestimmung der Aminosäuresequenzen dieser Mimetope. Diese Sequenzen sind in der Tabelle 1 gezeigt. Eine Analyse dieser Aminosäuresequenzen zeigte, dass sie ein gemeinsames Motiv MYxxLH teilten (SEQ ID NO: 10). TABELLE 1
Um die Mimetope zur Identifizierung von Abtiden zu verwenden wurden Peptide, die den Mimetop-Sequenzen entsprachen, synthetisiert und dann in einer Endkonzentration von 5 ug/ml entweder in Wasser oder in PBS gelöst. Im einzelnen wurden ein Peptid, das als 7E11-9.5 bezeichnet wurde, mit der Sequenz LYANPGMYSRLHSPA (SEQ ID NO: 20) und ein Peptid mit der Sequenz GMYSRLHSPA (SEQ ID NO: 21) synthetisiert.
Zuerst wurde das Mimetop-Peptid 7E11-9.5 bezüglich seiner Fähigkeit zur Bindung des molekularen Antikörpers 7E11-C5 getestet. Platten mit 69 Wells (Immunlon 4, Dynatech, Alexandria, Virginia) wurden mit 50 ul einer Lösung von 5 ug/ml des Mimetop-Peptids 7E11-9.5 beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells 4-mal mit 1% BSA in PBS gewaschen. Der biotinylierte monoklonale Antikörper 7E11-C5 wurde schrittweise mit PBS verdünnt, wobei bei einer Konzentration von 29 ug/ml begonnen wurde, und unterschiedliche Mengen des monoklonalen Antikörpers wurden zu den Wells gegeben, die mit dem Mimetop-Peptid beschichtet worden waren. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Wells 4-mal mit 1% BSA in PBS und 2-mal mit PBS gewaschen. Dann wurden 100 ul einer 1 : 2000-Verdünnung von Extravidin-alkalischer Phosphatase (4 250 Units/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri) in PBS zu jedem Well gegeben. Nach einer Stunde wurde die Platte erneut 4-mal mit PBS gewaschen, und es wurden 100 ul I einer Lösung von 1 mg/ml des Enzym-Substrats p-Nitrophenylphosphat zu jedem Well gegeben. Man ließ die Farbe sich 15 Minuten bis 1 Stunde entwickeln, und dann wurde die Absorption bei 405 nm bestimmt. Die Fig. 2 zeigt die Ergebnisse. Aus der Fig. 2 geht hervor, dass der monoklonale Antikörper 7E11-C5 auf konzentrationsabhängie Weise an das synthetisierte Mimetop 7E11-9.5 bindet.
Als nächstes wurde das Mimetop-Peptid zur Isolierung von Abtiden aus einer Peptidbibliothek verwendet. 50 bis 100 ul der Lösung dieses Peptides wurden verwendet, um die Wells einer 96-Well-Platte zu beschichten, die Wells wurden mit 0,5% BSA in PBS geblockt, und die Wells wurden für das Screenen verwendet. Es wurde ein Aliquot der TSAR-9-Zufalls- Phagenbibliothek (das ungefähr 3 · 10¹&sup0; Phagenpartikel enthielt) wie beim anfänglichen Screening eingesetzt, und es wurden vier Screening-Runden durchgeführt. Nach den ersten zwei Runden waren die Phagen amplifiziert. Dann wurden zwei weitere Screening-Runden durchgeführt. Mittels dieser Prozedur wurden Phagen aus der TSAR-9-Bibliothek, die Peptide exprimierten, die zur Bindung des Mimetop-Peptids 7E11-9.5 fähig waren, identifiziert und isoliert. Die Peptide, die die bindenden Domänen dieser Phagen enthalten, sind Abtide, und es wurde festgestellt, dass sie die Bindungsspezifitäten des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 nachahmen. Diese Abtide werden "7E11-C5-Abtide" genannt.
Phagen, die für die 7E11-C5-Abtide codierten, wurden einer DNA-Sequenzierung der Nucleotidsequenzen, die für ihre bindenden Peptide codieren, unterzogen, um die DNA- und Aminosäuresequenzen der 7E11-C5-Abtide zu erhalten. Die Tabelle 2 zeigt die Aminosäuresequenz von fünf der 7E11-C5-Abtide, die eine relativ hohe Affinität für das Mimetop aufwiesen. TABELLE 2 Klon Sequenz
Die in der Tabelle 2 für den Klon 14 gezeigte Aminosäuresequenz ist die SEQ ID NO: 1. Die in der Tabelle 2 für den Klon 17 gezeigte Aminosäuresequenz ist die SEQ ID NO: 2. Die in der Tabelle 2 für den Klon 15 gezeigte Aminosäuresequenz ist die SEQ ID NO: 3. Die in der Tabelle 2 für den Klon 13 gezeigte Aminosäuresequenz ist die SEQ ID NO: 4. Die in der Tabelle 2 für den Klon 16 gezeigte Aminosäuresequenz ist die SEQ ID NO: 5.
Es war interessant zu bestimmen, ob es eine strukturelle Basis für die Ähnlichkeit der Bindungscharakteristika des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 und der 7E11-C5 Abtide geben könnte. Die Aminosäuresequenzen der complementarity determining regions (CDRs) des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 wurden durch das Sequenzieren der cDNA-Klone der Gene, die die variablen Abschnitte des Antikörpers codieren, bestimmt. Diese CDRs sind für die spezifische Bindung des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 an sein Antigen verantwortlich. Die Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen der Abtide aus der Tabelle 2 und von Abschnitten der Aminosäuresequenzen von einigen der CDRs des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5. Überraschenderweise kann man sehen, dass es Ähnlichkeiten zwischen den Sequenzen dieser Abtide und den Sequenzen der CDRs des monoklonalen Antikörpers gibt.

6.1.2. CHARAKTERISIERUNG DER 7E11-C5-ABTIDE

Die 7E11-C5-Abtide wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bindung der 7E11-C5-Mimetope, die als Target-Liganden im zweiten Screening-Schritt oben eingesetzt wurden, getestet. Es wurden die DNA-Sequenzen der Abschnitte der Phagen-DNA, die für die Abtide codierten, bestimmt. Das ermöglichte die Bestimmung der Aminosäuresequenzen der Abtide. Basierend auf diesen bestimmten Aminosäuresequenzen wurden synthetische Peptide, die diesen Sequenzen entsprachen, hergestellt. Diese synthetischen Peptide (7E11-C5-Abtide) hatten eine Länge von 38 Aminosäuren.

6.1.2.1. DOT-BLOTS UNTER VERWENDUNG DER 7E11-C5-ABTIDE

In einigen Fällen wurden diese Abtide in einem Dot-Blot-Experiment eingesetzt. In diesen Fällen wurde 1 ul einer Lösung von 1 mg/ml der Abtide mit einer Länge von 38 Resten auf Streifen oder runde Filter aus Nitrocellulose (0,2 um oder 0,45 um, Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire) gespottet. Nach dem Trocknen (ungefähr 1/2 Stunde) wurde die Nitrocellulose eine Stunde lang in einer Lösung von 1% BSA in PBS geblockt. Dann wurde die Nitrocellulose in ungefähr 5 ml einer Lösung aus 0,1 mg/ml eines biotinylierten 7E11-9.5- Mimetop-Peptids (Biotin-LYANPGMYSRLHSPA) inkubiert. Dieses Mimetop-Peptid war eines von denjenigen, die oben im Abschnitt 6.1.1 beschrieben wurden, und die basierend auf den neun Peptiden synthetisiert worden waren, die im Screening-Schritt des Abschnitts 6.1.1. oben. identifiziert worden waren. Nach einer Stunde wurde die Nitrocellulose ungefähr 5-mal mit einer Lösung von BSA in PBS gewaschen. Dann wurde eine 1 : 2000-Verdünnung von Extravidinalkalischer Phosphatase (4 250 Units/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri) in PBS zugegeben, man ließ sie eine Stunde inkubieren, und danach wurde die Nitrocellulose wieder extensiv gewaschen. Schließlich wurde eine Lösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (0,15 mg/ml) und Nitroblau-Tetrazolium (0,3 mg/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri) (BCIP/NBT) als Enzymsubstrat zugegeben. Nach der Entwicklung der Farbe wurde die Absorption bei 405 nm bestimmt.
Ein Beispiel für einen derartigen Dot-Blot-Test ist in der Fig. 4 gezeigt. In der Fig. 4 wurden die 7E11-C5-Abtide, die als Klon 14, Klon 17, Klon 15, Klon 16 und Klon 13 bezeichnet werden, bezüglich ihrer Fähigkeit zur Bindung des biotinylierten 7E11-9.5 Mimetop-Peptids getestet. Ebenfalls getestet wurde als Positivkontrolle der monoklonale Antikörper 7E11-C5. 7E11-C5 wurde auf den Bereich, der in der Fig. 4 als 351 bezeichnet ist, gespottet. Eine Analyse der Fig. 4 zeigt, dass wenigstens drei der Abtide (Klon 14, Klon 17 und Klon 15) das Mimetop banden. Das zeigt, dass diese Abtide fähig sind, die spezifische Bindung nachzuahmen, die vom monoklonalen Antikörper 7E11-C5 gezeigt wird.

6.1.2.2. 7E11-C5-ABTIDE ANSTELLE VON ANTIKÖRPERN IN IMMUNOASSAYS

Die Einsetzbarkeit synthetisierter Abtide mit den Aminosäuresequenzen, die durch die Zufallsinserts der Phagen codiert wurden, die das 7E11-9.5-Mimetop banden, wurde weiter mittels ELISA-Assay-Verfahren untersucht.
Die Klone 14 und 17 (siehe Tabelle 2) der 7E11-C5-Abtide wurden jeweils in einer Konzentration von 5 ug/ml in 0,1 · PBS gelöst. 50 ul dieser Lösungen wurden jeweils verwendet, um die Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte (Immulon 4, Dynatech, Alexandria, Virginia) durch eine Inkubation über Nacht bei 4ºC zu beschichten. Nach dieser Inkubation wurden die Abtid- Lösungen entfernt, und die Wells wurden mit 200 ul einer Lösung von 1% BSA in PBS geblockt. Die Mimetop-Peptide 7E11-9.5 (LYANPGMYSRLHSPA [SEQ ID NO: 20]) und GMYSRLHSPA (SEQ ID NO: 21) wurden wie im Abschnitt 5.6.4.1. beschrieben biotinyliert und in H&sub2;O in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Es wurden schrittweise 1 : 2-Verdünnungen dieser Lösungen hergestellt, und diese Verdünnungen wurden zu den Wells der Mikrotiterplatte, die die gebundenen Abtide enthielten, gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Wells 4-mal mit 1% BSA in PBS gewaschen. Dann wurde eine 1 : 2000-Verdünnung von Extravidin-alkalischer Phosphatase (4 250 Units/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri) in PBS zu jedem Well gegeben, und es wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells 4-mal mit 1% BSA in PBS und dann zweimal mit PBS gewaschen. 100 ul einer Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin- Puffer (DEA-Puffer) (beide von Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland) wurden dann zugegeben, und nach einer Inkubation für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Absorption der Lösungen in den Wells bei 405 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 5 gezeigt.
Die Fig. 5 zeigt, dass, abgesehen vom nicht-linearen Effekt bei hohen Konzentrationen des Mimetops, eine gute Korrelation zwischen der den Wells zugesetzten Mimetop-Menge und der Absorption bei 405 nm besteht. Die Verwendung von Antikörpern in Tests wie enzymelinked immunosorbent assays (ELISAs) zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz ist auf diesem Gebiet gut bekannt. Die Fähigkeit von Antikörpern zur spezifischen Bindung ihrer Antigene ist von fundamentaler Bedeutung für den Erfolg derartiger Tests. Da Abtide ebenfalls spezifisch an Antigene binden, war es interessant zu bestimmen, ob Abtide anstelle von Antikörpern in Immunoassays, beispielsweise ELISA-ähnlichen Tests, zum Messen der Konzentration einer Substanz eingesetzt werden können. Die Ergebnisse in der Fig. 5 zeigen, dass die erfindungsgemäßen Abtide in Tests auf ganz ähnliche Weise eingesetzt werden können wie Antikörper, die in Immunoassays wie ELISAs verwendet werden können.

6.1.2.3. BIOTINYLIERUNG VON ANTIKÖRPERN

Verfahren zur Biotinylierung von Antikörpern sind in diesem Gebiet gut bekannt. Jedes beliebige Verfahren kann bei der Durchführung der Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise wurde die folgende Prozedur verwendet:
(1) Auflösen von 10 mg Antikörper in 1 ml PBS;
(2) Zugabe von 0,44 mg Biotin-LC-NHS (Pierce, Rockford, Illinois);
(3) 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur;
(4) Reinigung über eine Superose-12-Säule (Pharmacia, Piscataway, New Jersey).

6.1.3. 7E11-C5-ABTIDE UND DER MONOKLONALE ANTIKÖRPER 7E11-C5 ERKENNEN EIN LNCaP-ANTIGEN

Der monoklonale Antikörper 7E11-C5 erkennt ein Prostata-spezifisches Mucin-Antigen auf der menschlichen Prostata-Krebszelllinie LNCaP (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7: 927-936). Um zu bestimmen, ob die 7E11-C5-Abtide das native Antigen erkennen und binden, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
Es wurde ein Sandwich-Assay unter Verwendung des LNCaP-Antigens durchgeführt. Die Wells einer Mikrotiterplatte wurden entweder mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5, dem Klon 14 des 7E11-C5-Abtids oder, als negative Kontrolle, mit BSA beschichtet. Die Beschichtung und die Waschung erfolgten wie bei dem im Abschnitt 6.1.2.2 beschriebenen Test.
Es wurden 100 ul eines Lysates der LNCaP-Zellen zu den Wells gegeben. Das LNCaP- Lysat wurde hergestellt, wie es in der PCT-Veröffentlichung WO 94/18318 vom 18. August 1994 beschrieben ist. Nach der Bindung des Lysates an die Platte wurden 100 ul einer Lösung von 5 ug/ml des biotinylierten monoklonalen 7E11-C5-Antikörpers zu jedem Well gegeben. Nach der Inkubation und Waschung, wie sie im Abschnitt 6.1.2.2 beschrieben wurden, wurde eine 1 : 2000-Verdünnung von Extravidin-alkalischer Phosphatase (4 250 Units/ml) (Sigma, St. Louis, Missouri) in PBS zu jedem Well gegeben, und es wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Wells 4-mal mit 1% BSA in PBS und dann zweimal mit PBS gewaschen. 100 ul einer Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin- Puffer (DEA-Puffer) (beide von Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland) wurden dann zugegeben, und nach einer Inkubation für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Absorption der Lösungen in den Wells bei 405 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 6 gezeigt. Die Fig. 6 zeigt, dass das 7E11-C5-Abtid zur Erkennung des nativen 7E11-C5-Antigens in LNCaP-Lysaten fähig ist. Das war eine überraschende Entdeckung und wäre von Fachleuten auf diesem Gebiet nicht vorher gesagt worden. Es war allgemein vermutet worden, dass das Screening einer Bibliothek mit einem Mimetop ein an das Mimetop bindendes Agens liefern könnte. Ob ein derartiges bindendes Agens auch das native Epitop, das vom Mimetop nachgeahmt wird, binden könnte, war unbekannt. Das Mimetop hätte das Epitop auf lockere Weise darstellen können, beispielsweise hätte seine Primärsequenz leicht modifiziert sein können; seine Sekundärstruktur oder Faktoren, die die Präsentation des Mimetops beeinflussen, könnten sich von denjenigen des nativen Epitops unterscheiden. In einem derartigen Fall wäre das an das Mimetop bindende Agens nicht spezifisch für das native Epitop. Das eben Festgestellte wird als mögliche Erklärung verstanden und nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung.

6.1.4. VERWENDUNG VON 7E11-C5-ABTIDEN IN UNTERSUCHUNGEN ZUR BIOLOGISCHEN VERTEILUNG

Die im Abschnitt 6.1. und dessen Unterabschnitten oben beschriebenen 7E11-Abtide wurden in Untersuchungen zur biologischen Verteilung eingesetzt, um ihre Fähigkeit zur gezielten Ansteuerung von humanen LNCaP-Prostatakarzinom-Xenotransplantat-Tumoren zu testen, die Mäusen transplantiert worden waren.
Männliche SCID-Mäuse (C. B.-17/lcr Tac - SCID-Mäuse) wurden von Fox Chase (Philadelphia, Pennsylvania) oder Taconic Farms (Germantown, New York) gekauft, in sterilisierten Käfigen mit Filterhauben gehalten, und sie erhielten eine autoklavierte Labornager-Diät (Purina, St. Louis, Missouri) und gefiltertes Leitungswasser ad libitum.
1 · 10&sup7;-Zellen der humanen Prostatatumorlinie LNCaP (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7: 927-936) wurden subkutan (s.c.) in die linke hintere Flanke der Mäuse injiziert. Die Zellen wuchsen vor dem Ernten exponentiell und waren in 0,2 ml steriler Saline resuspendiert worden. Man ließ die Tumoren in den Mäusen 2-3 Monate wachsen, ehe den Mäusen Abtide injiziert wurden.
Für die Studien zur biologischen Verteilung wurden die Abtide an ihren Amino-Termini mit dem Chelator Diethylen-Triamin-Pentaessigsäureanhydrid (DTPA-A) (Sigma, St. Louis, Missouri) modifiziert. Ungefähr 2 mg eines jeden Abtids wurden zunächst in einem geeigneten Volumen von 0,1% Essigsäure gelöst, und dann wurde 1 ml 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,0, zugegeben. Zwei mg DTPA-A wurden in 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO) suspendiert, und 10 ul der Abtid-Lösung wurden zu dieser DTPA-A-Suspension gegeben. Nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Suspension durch ein Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Probenfilter von 0,2 um (Acrodisc, Gelman Sciences Inc., Ann Arbor, Michigan) filtriert und über eine Superose-12-FPLC-Säule (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) mit PBS als Laufpuffer gereinigt. Die modifizierten Peptide wurden eingefroren bei -20ºC oder -70ºC gelagert.
Die mit DTPA modifizierten Abtide wurden mit ¹¹¹InCl&sub2; wie folgt markiert. 0,1 bis 0,5 mCi ¹¹¹InCl&sub2; (Amersham, Chicago, Illinois) wurden zuerst durch die Zugabe des gleichen Volumens an 0,1 M NaOAc neutralisiert und dann zu 100 bis 200 ug des DTPA-A-modifizierten Abtids gegeben. Nach einer halbstündigen Inkubation wurde das markierte Peptid über eine Superose-12-FPLC-Säule (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) mit PBS als Laufpuffer gereinigt. Markierte Fraktionen wurden in einem Fraktionssammler gesammelt. Die Röhrchen, die das markierte Peptid enthielten, wurden vereinigt und zur Präparation von Spritzen für eine Injektion in Mäuse verwendet.
In einem Experiment wurde der DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klon 14 (siehe Tabelle 2) intravenös (i.v.) zwei Gruppen von Mäusen injiziert, die messbare LNCaP-Xenotransplantat-Tumore trugen. Es wurden ungefähr 0,2 ml einer Lösung von 10 ug/ml des radioaktiv markierten Abtids in steriler Saline verwendet. Die spezifische Aktivität des Abtids betrug 32 uCi/ug. Somit lag die injizierte Gesamtdosis der Radioaktivität bei ungefähr 120-140 · 10&sup6; cpm.
Die erste Gruppe der Mäuse wurde 2 Stunden nach der Injektion des Abtids getötet, und die Gewebe wurden für die Analyse präpariert. Die zweite Gruppe wurde 4 Stunden nach der Injektion getötet. Die präparierten Gewebe wurden gewogen, und die Menge des in ihnen vorhandenen ¹¹¹In wurde durch gamma-Zählung bestimmt. Die cpm pro Gramm eines jeden Gewebes wurden durch das Teilen der cpm des im Gewebe gefundenen ¹¹¹In durch das Gewicht des Gewebes in Gramm berechnet. Die Daten werden als das Verhältnis des cpm/g- Wertes eines jeden Organs zum cpm/g-Wert des Blutes (Organ/Blut-Verhältnis) dargestellt. Das führte zu den Verhältnissen, die in der Tabelle 3 und in der Fig. 7 gezeigt sind. TABELLE 3 Biologische Verteilung des DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klons 14 in Mäusen mit dem LNCaP- Xenotransplantat
a Gruppe 1: getötet nach 2 Stunden; n = 2
b Gruppe 2: getötet nach 4 Stunden; n = 2
c Der gezeigte Wert gibt das Organ/Blut-Verhältnis an.
Die Tabelle 3 und die Fig. 7 zeigen, dass, mit Ausnahme der Nieren, sich das höchste Organ/Blut-Verhältnis im Tumor findet, sowohl 2 als auch 4 Stunden nach der Injektion des Abtids. Dieses Ergebnis zeigt, dass Abtide mit der Bindungsspezifität von Antikörpern, beispielsweise solchen, die für Tumor-Antigene spezifisch sind, zur Lokalisierung dieser Tumoren verwendet werden können.
Es wurde, abgesehen von den Nieren, keine ungewöhnliche Lokalisation in einem Gewebe, das keinen Tumor enthielt, gefunden. Das Verhältnis für die Nieren ist aufgrund der gut bekannten Tendenz injizierter Peptide, sich vor ihrer Ausscheidung aus dem Körper in der Niere anzureichern, extrem hoch.
In einem weiteren Experiment wurde der DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klon 17 (siehe Tabelle 2) intravenös vier SCID- Mäusen injiziert, die messbare LNCaP-Xenotransplantat-Tumore trugen. Die Verabreichung der Xenotransplantate erfolgte wie oben beschrieben. Es wurden ungefähr 0,2 ml einer Lösung von 0,1 ug/ml des radioaktiv markierten Abtid-Klons 17 in steriler Saline injiziert. Die spezifische Aktivität des Abtids betrug ungefähr 2,4 uCi/ng. Somit lag die injizierte Gesamtdosis der Radioaktivität bei ungefähr 100-110 · 10&sup6; cpm.
In diesem Experiment wurden die Mäuse entweder 2 Stunden oder 5 Stunden nach der Injektion des markierten Abtids getötet. Wieder sind, wie oben, die Daten als das Organ/Blut- Verhältnis dargestellt. Wie in der Tabelle 4 und in der Fig. 8 gezeigt ist, lokalisierte der DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klon 17 die LNCaP-Xenotransplantat-Tumoren in Mäusen. TABELLE 4 Biologische Verteilung des DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klons 17 in Mäusen mit dem LNCαP- Xenotransplantat
a Der gezeigte Wert gibt das Organ/Blut-Verhältnis an.
Die Tabelle 4 und die Fig. 8 zeigen wie die Tabelle 3 und die Fig. 7, dass das injizierte Abtid den Tumor lokalisierte. Das zeigt, dass Abtide nützlich für die Lokalisierung von Tumoren sein können.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der beiden oben beschriebenen Experimente, bei denen gezeigt wurde, dass radioaktiv markierte Abtide in Tumoren gefunden werden, wurde keine spezifische Lokalisierung in Tumoren beobachtet, wenn die gleichen Experimente mit einem radioaktiv markierten Kontrollpeptid (nicht einem Abtid) (dem Tripeptid GYK-DPTA) durchgeführt wurden. Das geht aus der Fig. 9 hervor, die die Ergebnisse der biologischen Verteilung für Experimente unter Verwendung des ¹¹¹In-markierten Kontrollpeptids zeigt.
Das radioaktiv markierte Peptid-Konjugat DPTA-¹¹¹In-GYK wurde 5 SCID-Mäusen, die messbare LNCaP-Xenotransplantate trugen, intravenös injiziert. Die Mäuse wurden 2 Stunden (n = 2) und 5 Stunden (n = 3) nach der Injektion von 1,5 ug des Kontrollpeptids mit einer spezifischen Aktivität von 30 uCi/ug seziert. Die Organ/Blut-Verhältnisse sind in der Tabelle 5 und der Fig. 9 dargestellt. Wie gezeigt ist, war das Kontrollpeptid nicht selektiv im Tumor lokalisiert. Während das Tumor/Blut-Verhältnis bei einer Maus bei 3,26 lag, verteilte sich das Kontrollpeptid gleich gut in die anderen Organen (beispielsweise Lunge 3,52, Milz 3,27, Leber 21,70 etc.). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Kontrollpeptid nicht spezifisch in diese Organe aufgenommen wurde. Während der DPTA-¹¹¹In-Abtid-Klon 14 nach 2 Stunden ein Tumor/Blut-Verhältnis von lediglich 1,85 aufwies (was offenbar niedriger als dasjenige ist, das mit dem Kontrollpeptid erhalten wurde), zeigte der DPTA-¹¹¹In-Klon 14 eine spezifische Lokalisation im Tumor, da die Organ/Blut-Verhältnisse in den anderen Organen viel niedriger waren (beispielsweise Lunge 0,81, Milz, 0,83, Leber 0,95 etc.). TABELLE 5 Biologische Verteilung des DPTA-¹¹¹In GYK in Mäusen mit dem LNCαP-Xenotransplantat

6.2. ABTIDE, DIE AN EIN BRUSTKREBS-ANTIGEN BINDEN

6.2.1. IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG VON ABTIDEN, DIE AN EIN POLYMORPHES EPITHELIALES MUCIN (PEM) BINDEN

Vom monoklonalen Antikörper SM-3, der spezifisch das Tumor-Antigen des polymorphen epithelialen Mucins (PEM) bindet, das auf menschlichen Brustkrebszellen vorkommt, wurde gezeigt, dass er spezifisch für das Epitop ist, das durch die Aminosäuresequenz VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 9) (Bruchell et al., 1989, Int. J. Cancer 44: 691-696) definiert ist. Ein Peptid, das diese Sequenz aufweist, wurde synthetisiert und zur Isolierung von Abtiden aus TSAR-Peptidbibliotheken mittels Verfahren, die den oben beschrieben analog sind, verwendet. Bei diesen Experimenten waren die spezifischen TSAR-Bibliotheken, die verwendet wurden, R26, D38 und DC43. Siehe die Fig. 10-12 für eine Beschreibung dieser Bibliotheken. An PEM gebundene Phagen wurden entweder mittels Standardverfahren einer Säureelution oder stringenten Verfahren einer Säureelution, bei denen die Phagen mit dem PEM-Peptid nur 10 Minuten vor der Waschung und Elution inkubiert wurden, eluiert, oder sie wurden unter Verwendung von überschüssigem PEM-Peptid eluiert. Es wurden aus jeder Bibliothek Phagen isoliert, die Peptide exprimieren, die zur Bindung an PEM fähig sind. Die Aminosäuresequenzen der PEM-bindenden Phagen sind in der Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6 Sequenzen PEM-bindender Phagen TABELLE 6 (Fortsetzung) Sequenzen PEM-bindender Phagen TABELLE 6 (Fortsetzung) Sequenzen PEM-bindender Phagen

6.2.2. SÄTTIGUNGSMUTAGENESE VON MP-1 UND IDENTIFIZIERUNG WEITERER PEM-BINDENDER ABTIDE

Es wurde eine Sättigungsmutagenese-Bibliothek, die auf einem der PEM-Abtide, MP-1, basierte, konstruiert. Nucleotidsequenzen, die für das MP-1-Abtid codierten, wurden mittels eines Dotierungsschemas synthetisiert, das dem im Abschnitt 5.3 beschriebenen ähnlich war, wobei jedes Nucleotid mit 9% eines jeden der drei anderen Nucleotide kontaminiert war (beispielsweise G = 73% G, 9% A, 9% T, 9% C). Die resultierenden mutagenen Oligonucleotide wurden zur Konstruktion einer Bibliothek mittels TSAR-Bibliothek-Verfahren, wie sie oben beschrieben wurden (siehe Fig. 13), verwendet.
Die resultierende Bibliothek wurde gescreent um Phagen zu identifizieren, die Abtide exprimieren, die zur Bindung an PEM fähig sind. Die Bindung des isolierten Phagen an PEM wurde mittels eines ELISA-Assays bestätigt. Phagen, von denen gezeigt wurde, dass sie an PEM binden, sowie Phagen, die nicht an PEM banden, wurden sequenziert, um die Aminosäuresequenzen der exprimierten Abtide zu bestimmen. Die Tabelle 7 zeigt die Aminosäuresequenzen dieser positiven und negativen Phagen. TABELLE / Sequenzvergleich: MP-1-bindendes Motiv Positive bindende Sequenzen Negative bindende Sequenzen
Wenn die Sequenzen, die in der Tabelle 7 gezeigt sind, verglichen werden (siehe insbesondere die Aminosäurereste, die fett gedruckt sind), ist es möglich, den Einfluss bestimmter Aminosäurereste an bestimmten Positionen in der Sequenz auf die Fähigkeit des Peptids zur Bindung an PEM zu bestimmen. Abtide, die an PEM binden, können durch folgende Formel charakterisiert werden:
R&sub1;R&sub2;R&sub3;R&sub4;R&sub5;R&sub6;R&sub7;R&sub8;R&sub9;R&sub9;R&sub1;&sub0;R&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2;R&sub1;&sub3;R&sub1;&sub4;R&sub1;&sub5;R&sub1;&sub6;R&sub1;&sub7;R&sub1;&sub8;R&sub1;&sub9;R&sub2;&sub0;R&sub2;&sub1;R&sub2;&sub2;R&sub2;&sub3;R&sub2;&sub4;R&sub2;&sub5;R&sub2;&sub6;R&sub2;&sub7;R&sub2;&sub8;R&sub2;&sub9; R&sub3;&sub0;R&sub3;&sub1;R&sub3;&sub2;R&sub3;&sub3;R&sub3;&sub4;R&sub3;&sub5;R&sub3;&sub6;R&sub3;&sub7;R&sub3;&sub8;R&sub3;&sub9;R&sub4;&sub0;R&sub4;&sub1;R&sub4;&sub2;R&sub4;&sub3; (SEQ ID NO: 88)
wobei:
R&sub1; = G, C, E oder V, vorzugsweise G;
R&sub2; = A, S, P oder L, vorzugsweise A;
R&sub3; = P, T, H oder L, vorzugsweise P;
R&sub4; = L, M, Q, G, A oder S;
R&sub5; = W o. Y, vorzugsweise W;
R&sub6; = S, C, K o. T, vorzugsweise S;
R&sub7; = E, S, C, D, V oder R;
R&sub8; = N, H, K, S oder E;
R&sub9; = L, H, R, N, Q, T oder G;
R&sub1;&sub0; = W, P, R, T oder D, vorzugsweise W;
R&sub1;&sub1; = W, C, V, L oder G, vorzugsweise W;
R&sub1;&sub2; = S, T, M oder H, vorzugsweise S o. T;
R&sub1;&sub3; = G;
R&sub1;&sub4; = S, A, G, N, Q oder K, vorzugsweise S;
R&sub1;&sub5; = W, H, G, A oder R;
R&sub1;&sub6; = G, T, E, P, V oder W, vorzugsweise G;
R&sub1;&sub7; = V, F, W, K oder A;
R&sub1;&sub8; = K, Q, D, E, R oder L, vorzugsweise K;
R&sub1;&sub9; = R, F oder S, vorzugsweise R;
R&sub2;&sub0; = P, S, I o. H vorzugsweise P;
R&sub2;&sub1; = G;
R&sub2;&sub2; = C;
R&sub2;&sub3; = G;
R&sub2;&sub4; = D, S, T, N oder H;
R&sub2;&sub5; = G, D, L oder R;
R&sub2;&sub6; = P o. S, vorzugsweise P;
R&sub2;&sub7; = M, S, D, I, L oder R;
R&sub2;&sub8; = G, W, C, L, F, Y oder T, vorzugsweise G o. W;
R&sub2;&sub9; = S, N, V, F, H oder R;
R&sub3;&sub0; = N, A, S, M oder R, vorzugsweise N;
R&sub3;&sub1; = F, Q P oder V, vorzugsweise F;
R&sub3;&sub2; = S, V, I, K, A oder S;
R&sub3;&sub3; = P, A, N oder Y, vorzugsweise P;
R&sub3;&sub4; = G, N oder L;
R&sub3;&sub5; = K, R, C, Q o. L, vorzugsweise K o. R;
R&sub3;&sub6; = V, K, R oder A;
R&sub3;&sub7; = G, D, A oder E, vorzugsweise G;
R&sub3;&sub8; = S, T, P, Y o. W; vorzugsweise S;
R&sub3;&sub9; = R, I, L, P, A o. S;
R&sub4;&sub0; = N, K oder M, vorzugsweise N, o. K;
R&sub4;&sub1; = S, R, T, E, Q, P, Y o. H;
R&sub4;&sub2; = G, A, S, D, N, P, Y oder K, vorzugsweise G;
R&sub4;&sub3; = P, H o. A.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung eines Peptids, das an eine Substanz von Interesse bindet, das umfaßt:

(a) Screenen einer ersten Zufalls-Peptidbibliothek mit einem Liganden, wobei der genannte Ligand ein spezifischer Bindungspartner für die genannte Substanz von Interesse ist, um ein erstes Peptid zu identifizieren, das spezifisch an den genannten Liganden bindet; und

(b) Screenen einer zweiten Zufalls-Peptidbibliothek mit einer Verbindung, die das genannte erste, in Stufe (a) identifizierte Peptid umfaßt, um ein zweites Peptid zu identifizieren, das an die genannte Verbindung bindet und an die genannte Substanz von Interesse bindet.

2. Verfahren zur Identifizierung eines Peptids, das an ein Antigen von Interesse bindet, das umfaßt:

(a) Screenen einer ersten Zufalls-Peptidbibliothek mit einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Derivat davon, die spezifisch an ein Antigen von Interesse binden, um ein erstes Peptid zu identifizieren, das spezifisch an den genannten Antikörper oder das Antigen-bindende Derivat davon bindet; und

(b) Screenen einer zweiten Zufalls-Peptidbibliothek mit einem Molekül, das das in Stufe (a) identifizierte erste Peptid umfaßt, um eine zweite Peptidsequenz zu identifizieren, die an das Molekül bindet und die an das genannte Antigen von Interesse bindet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Zufalls- Peptidbibliothek eine andere Bibliothek ist als die zweite Zufalls-Peptidbibliothek.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Zufalls- Peptidbibliothek die gleiche Bibliothek ist wie die zweite Zufalls-Peptidbibliothek.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Ligand ein Rezeptor ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Antikörper der monoklonale Antikörper 7E11-C5 ist, der von dem Hybridom ATCC HB-10494 produziert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bibliothek von Stufe (a) oder Stufe (b) eine Bibliothek von rekombinanten Vektoren ist, die eine Vielzahl von heterofunktionellen Fusionsproteinen exprimieren, wobei die genannten Fusionsproteine eine bindende Domäne aufweisen, für die ein Oligonucleotid codiert, das nicht vorhersagbare Nucleotide aufweist, wobei die nicht vorhersagbaren Nucleotide in einer oder mehreren aneinander anschließenden Sequenzen angeordnet sind, wobei die Gesamtzahl der nicht vorhersagbaren Nucleotide größer ist als oder gleich etwa 15 ist und kleiner ist als oder gleich etwa 600 ist.

8. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Bibliothek von Stufe (a) oder Stufe (b) eine Bibliothek von rekombinanten Vektoren ist, die eine Vielzahl von heterofunktionalen Fusionsproteinen exprimieren, wobei die genannten Fusionsproteine eine Bindungsdomäne aufweisen, für die ein Oligonucleotid codiert, das unvorhersagbare Nucleotide umfaßt, wobei die unvorhersagbaren Nucleotide in einer oder mehreren aneinander anschließenden Sequenzen angeordnet sind, wobei die Gesamtzahl der unvorhersagbaren Nucleotide größer ist oder gleich etwa 15 und kleiner ist oder gleich etwa 600.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bibliothek von Stufe (a) oder Stufe (b) eine chemisch synthetisierte Bibliothek ist.

10. Verfahren zum Nachweisen oder Messen eines Analyten von Interesse in einer Probe, das umfaßt:

(a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Molekül, das ein Peptid aufweist, das in der Lage ist, den genannten Analyten von Interesse unter Bedingungen, bei denen ein spezifisches Binden zwischen dem Molekül und dem Analyten erfolgen kann, spezifisch zu binden; und

(b) Nachweisen oder Messen der Menge der genannten Bindung, wobei die Gegenwart und Menge der genannten Bindung die Anwesenheit bzw. Menge des genannten Analyten in der Probe anzeigt, wobei das genannte Peptid nach dem Verfahren von Anspruch 14 identifiziert wurde.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das genannte Molekül an einem festen Träger immobilisiert ist.

12. Verfahren zur Gewinnung eines Bildes, das im Rahmen der Bestimmung des Orts eines Tumors in einem Patienten nützlich ist, das umfaßt: Gewinnen eines Bilds des Orts eines Moleküls, das ein Peptid aufweist, das spezifisch an ein Tumorantigen in dem Patienten bindet, in einem Patienten, wobei das genannte Molekül oder das genannte Peptid eines ist, wie es in irgendeinem der Ansprüche 14 bis 18 beansprucht wird, und ein detektierbares Label aufweist.

13. Verfahren zur Gewinnung eines Bilds eines inneren Bereichs eines Patienten, das die Aufzeichnung des szintigraphischen Bild umfaßt, das bei dem Zerfall eines radioaktiven Metalls erhalten wird, wobei das radioaktive Metall ein Label an einem Molekül ist, wobei eine wirksame Menge des genannten markierten Moleküls vorher an den Patienten verabreicht wurde, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Molekül ein Molekül oder Peptid ist, wie es in irgendeinem der Ansprüche 14 bis 28 beansprucht wird.

14. Molekül, das ein Peptid umfaßt, das an ein Prostatakarzinomantigen bindet, wobei das Peptid durch ein Verfahren identifiziert wurde, das umfaßt:

(a) Screenen einer ersten Zufalls-Peptidbibliothek mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5, wie er von dem Hybridom 7E11-C5 (ATCC HB 10494) produziert wird, oder einem Antigen-bindenden Derivat davon, um ein erstes Peptid zu identifizieren, das spezifisch an den genannten Antikörper oder das Antigen-bindende Derivat davon bindet, und

(b) Screenen einer zweiten Zufalls-Peptidbibliothek mit einer Verbindung, die das in Stufe (a) identifizierte erste Peptid umfaßt, um ein zweites Peptid zu identifizieren, das an die genannte Verbindung bindet und die an das genannten Antigen von Interesse bindet.

15. Molekül, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

oder einen bindenden Abschnitt davon.

16. Peptid bei dem die Aminosäuresequenz des genannten Peptids aus der Sequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

oder einem bindenden Abschnitt davon.

17. Peptid, das die Aminosäuresequenz WQGTHF (SEQ ID NO: 23) und die Aminosäuresequenz LVSKNDSG (SEQ ID NO: 24) enthält, das spezifisch an ein Antigen von humanen Prostatakarzinomzellen bindet.

18. Molekül, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

19. Ein Molekül, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

20. Molekül, das ein Peptid oder einen bindenden Abschnitt davon aufweist, das an einen Liganden von Interesse bindet, wobei das Peptid durch ein Verfahren identifiziert wird, das umfaßt: Screenen einer Zufalls-Peptidbibliothek mit dem genannten Liganden von Interesse, wobei der genannte Ligand von Interesse ein Peptid ist, das eine Länge von zwischen 5 und 40 Aminosäuren aufweist, um ein Peptid zu identifizieren, das spezifisch an den Liganden von Interesse bindet, wobei der Ligand von Interesse auch spezifisch von einem Antikörper oder einem Rezeptor gebunden wird, und wobei der Ligand von Interesse VTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO: 9) oder einen Abschnitt davon umfaßt.

21. Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die ein Molekül umfaßt, das aus der Gruppe von Molekülen von Anspruch 18 ausgewählt ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

22. Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die ein Molekül umfaßt, das aus der Gruppe von Molekülen von Anspruch 19 ausgewählt ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

23. Molekül, das an das polymorphe Epithel-Mucin bindet, das eine Aminosäuresequenz aufweist, das durch die Formel wiedergegeben wird:

R&sub1;R&sub2;R&sub3;R&sub4;R&sub5;R&sub6;R&sub7;R&sub8;R&sub9;R&sub9;R&sub1;&sub0;R&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2;R&sub1;&sub3;R&sub1;&sub4;R&sub1;&sub5;R&sub1;&sub6;R&sub1;&sub7;R&sub1;&sub8;R&sub1;&sub9;R&sub2;&sub0;R&sub2;&sub1;R&sub2;&sub2;R&sub2;&sub3;R&sub2;&sub4;R&sub2;&sub5;R&sub2;&sub6; R&sub2;&sub7;R&sub2;&sub8;R&sub2;&sub9;R&sub3;&sub0;R&sub3;&sub1;R&sub3;&sub2;R&sub3;&sub3;R&sub3;&sub4;R&sub3;&sub5;R&sub3;&sub6;R&sub3;&sub7;R&sub3;&sub8;R&sub3;&sub9;R&sub4;&sub0;R&sub4;&sub1;R&sub4;&sub2;R&sub4;&sub3; (SEQ ID NO: 88)

wobei:

R&sub1; = G, C, E, oder V;

R&sub2; = A, S, P, oder L;

R&sub3; = P, T, H, oder L;

R&sub4; = L, M, Q, G, A, oder S;

R&sub5; = W oder Y;

R&sub6; = S, C, K oder T;

R&sub7; = E, S, C, D, V, oder R;

R&sub8; = N, H, K, S, oder E;

R&sub9; = L, H, R, N, Q, T, oder G;

R&sub1;&sub0; = W, P, R, T, oder D;

R&sub1;&sub1; = W, C, V, L, oder G;

R&sub1;&sub2; = S, T, M, oder H;

R&sub1;&sub3; = G;

R&sub1;&sub4; = S, A, G, N, Q, oder H;

R&sub1;&sub5; = W, H, G, A, oder R;

R&sub1;&sub6; = G, T, E, P, V, oder W;

R&sub1;&sub7; = V, F, W, K, oder A;

R&sub1;&sub8; = K, Q, D, E, R, oder L;

R&sub1;&sub9; = R, F, oder S;

R&sub2;&sub0; = P, S, I oder H;

R&sub2;&sub1; = G;

R&sub2;&sub2; = C;

R&sub2;&sub3; = G;

R&sub2;&sub4; = D, S, T, N;

R&sub2;&sub5; = G, D, L;

R&sub2;&sub6; = P oder S;

R&sub2;&sub7; = M, S, D, I, L, oder R;

R&sub2;&sub8; = G, W, C, L, F, Y, oder T;

R&sub2;&sub9; = S, N, V, F, H, oder R;

R&sub3;&sub0; = N, A, S, M, oder R;

R&sub3;&sub1; = F, Q, P, oder V;

R&sub3;&sub2; = S, V, I, K, A, oder S;

R&sub3;&sub3; = P, A, N, oder Y;

R&sub3;&sub4; = G, N, oder L;

R&sub3;&sub5; = K, R, C, Q oder L;

R&sub3;&sub6; = V, K, R, oder A;

R&sub3;&sub7; = G, D, A, oder E;

R&sub3;&sub8; = S, T, P, Y oder W;

R&sub3;&sub9; = R, I, L, P, A oder S;

R&sub4;&sub0; = N, K, oder M;

R&sub4;&sub1; = S, R, T, E, Q, P, Y oder H;

R&sub4;&sub2; = G, A, S, D, N, P, Y, oder K;

R&sub4;&sub3; = P, H oder A;

24. Molekül nach Anspruch 23, worin:

R&sub1; = G;

R&sub2; = A;

R&sub3; = P;

R&sub5; = W;

R&sub6; = S;

R&sub1;&sub0; = W;

R&sub1;&sub1; = W;

R&sub1;&sub2; = S oder T;

R&sub1;&sub4; = S;

R&sub1;&sub6; = G;

R&sub1;&sub8; = K:

R&sub1;&sub9; = R;

R&sub2;&sub0; = P;

R&sub2;&sub6; = P;

R&sub2;&sub8; = G oder W;

R&sub3;&sub0; = N;

R&sub3;&sub1; = F;

R&sub3;&sub3; = P;

R&sub3;&sub5; = K oder R;

R&sub3;&sub7; = G;

R&sub3;&sub8; = S;

R&sub4;&sub0; = N oder K;

R&sub4;&sub2; = G;

25. Molekül, das ein Peptid mit einer Länge von 17 bis 50 Aminosäuren aufweist, das an Prostatakarzinomzellen bindet, wobei das Peptid die Sequenz WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6) und die Sequenz LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7) aufweist.

26. Molekül, das ein Peptid mit einer Länge von 19 bis 50 Aminosäuren aufweist, das an Prostatakarzinomzellen bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Formel wiedergegeben wird:

R&sub1;XR&sub2;

worin:

R&sub1; = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);

R&sub2; = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7); und

X = eine Sequenz von irgendwelchen 2 bis 23 Aminosäuren.

27. Molekül, das ein Peptid mit einer Länge von 19 bis 50 Aminosäuren aufweist, das an Prostatakarzinomzellen bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Formel wiedergegeben wird:

R&sub1;XR&sub2;

worin:

R&sub1; = WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6), YNAYVPGFT (SEQ ID NO: 89), WFMSPYT SEQ ID NO: 90), FPGVSTPY (SEQ ID NO: 91), WGISYPF (SEQ ID NO: 92), oder FPS;

R&sub2; = LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7), LVSNESG (SEQ ID NO: 93), LSRNLDFG (SEQ ID NO: 94), LSGNYNIFG (SEQ ID NO: 95), TNIRNDIL (SEQ ID NO: 96), oder GSDPRL; und

X = eine Sequenz von wenigstens 2 von irgendwelchen Aminosäuren.

28. Molekül, das ein Peptid einer Länge von 19 bis 50 Aminosäuren aufweist, das an Prostatakarzinomzellen bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Formel wiedergegeben wird:

R&sub1;XR&sub2;

worin:

R&sub1; = eine Sequenz von 9 Aminosäuren mit einer wenigstens 50%igen Homologie zu WQGTHFPYT (SEQ ID NO: 6);

R&sub2; = eine Sequenz von 8 Aminosäuren mit einer wenigstens 50%igen Homologie zu LVSKNDSG (SEQ ID NO: 7); und

X = eine Sequenz von irgendwelchen 2 bis 33 Aminosäuren.