DE69010001T2 - Synthetisches pseudomonas aeruginosa pilin-peptid und verwandte impfstoffe und diagnostika. - Google Patents

Description

ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG
• Die Erfindung betrifft Antigene, Immunogene und solche Immunogene enthaltende Vakzine. Genauer genommen betrifft die Erfindung Polypeptidantigene bzw. -immunogene, durch solche Immunogene entstandene Antikörper und ein zur Vorbeugung gegen Infektion oder Besiedlung durch P. aeruginosa geeignetes Vakzin.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• In den letzten beiden Jahrzehnten wurde Pseudomonas aeruginosa als Krankheitserreger erkannt, der 10% bis 20% aller Infektionskrankheiten in den meisten Krankenhäusern hervorruft. Pseudomonas-Infektionen treten besonders häufig bei Patienten mit Brandwunden, Mukoviszidose, akuter Leukämie, Organtransplantationen sowie bei intravenöser Drogenabhängigkeit auf. P. aeruginosa ist ein im Krankenhaus allgemein verbreiteter Krankheitserreger; vielerlei Ursachen haben bereits zu Epidemien im Krankenhausumfeld geführt. Patienten mit einem längeren Krankenhausaufenthalt werden häufig von diesem Organismus befallen, und eine Infektionskrankheit kann bei Ihnen viel leichter ausbrechen. Die schwersten Infektionskrankheiten sind u.a. bösartige Entzündungen des Außenohrs, Endophthalmie, Endokarditis, Meningitis, Pneumonie und Septikämie. Die Prognose bei Pseudomonas-Infektionen hängt von der Schwere der zugrundeliegenden Krankheit des Patienten ab. Die bekannte Sterblichkeitsrate bei P. aeruginosa-Pneumonie ist sehr hoch; sie liegt bei 50% bis 80%. Trotz der Entwicklung neuerer Antibiotika bleibt die Resistenz nach wie vor ein Problem, das eine kombinierte Antibiotikabehandlung bei schweren P. aeruginosa-Infektionen notwendig macht.
• Alternative Behandlungsmethoden zur Bekämpfung schwerer P. aeruginosa-Infektionen werden schon seit Jahren überprüft. Die Immuntherapie ist die am intensivsten erforschte alternative Behandlungsmethode. In diesem Bereich konzentrierte man sich auf Virulenzfaktoren. Wie bei den meisten bakteriellen Krankheitserregern basiert die Virulenz von Pseudomonas aeruginosa auf mehreren Faktoren und ist das Ergebnis vieler in Wechselwirkung stehender Variablen, die sowohl das Bakterium als auch den Wirt betreffen.
• Anzeichen lassen den Schluß zu, daß eine Infektion mit dem Anhaften von Mikroorganismen an die Epithelzellen der Schleimhäute [E.H. Blackey, J. Infect. Dis., 143: 325-345 (1981)] beginnt. Bei Organismen, die sich nicht an Schleimhäute anhaften können, kommt es zu keiner Besiedlung, da sie von den die Schleimhäute umgebenden Sekreten weggespült werden. Der Anheftungsprozeß hängt von der spezifischen Erkennung zwischen Bakterien und Epithelzellen ab. Bei einer großen Anzahl von gramnegativen Bakterien, einschließlich P. aeruginosa, konzentrierte man sich auf Oberflächenstrukturen, die das Anfheften vermitteln. Diese Oberflächenstrukturen heißen "Adhesine". Die Verteilung spezifischer Rezeptoren für Adhesine bestimmt viele bei Bakterien festgestellte Gewebetropismen. Im Falle der P. aeruginosa zeigte sich, daß auf der Oberfläche des Organismus vorhandene polare Pili die Anheftung an bukkale Epithelzellen vermitteln. Dies wurde folgendermaßen nachgewiesen: (1) pililose Arten heften sich nicht an Epithelzellen an; (2) die Proteasebehandlung von P. aeruginosa reduziert die Anheftungsfähigkeit dieser Organismen an Epithelzellen drastisch; (3) eine Vorinkubation von Epithelzellen mit gereinigten Pili vermindert die Anheftung intakter Organismen erheblich, und (4) Antikörper gegen gereinigte Pili verhindern die Anheftung von Organismen an bukkale Epithelzellen.
• Obwohl Pili von P. aeruginosa in verschiedenen klinischen Isolaten antigenisch heterogen sind, gibt es Anzeichen dafür, daß ein Teil des Pilus verbleibt [siehe Paranchych et al., Antibiotics Chemother. 36: 49-57 (1985)]. Nachdem diese gemeinsame Domäne für das Anheften an Epithelzellen wichtig ist [siehe Doig et al., Infection and Immun., 56: 1641-1646 (1988)], ist sie auch zur Herstellung eines Pilivakzins mit Breitbandwirkung gegen P. aeruginosa nützlich.
• Die Oberfläche von vielen gramnegativen Bakterien, z.B. E. coli, P. aeruginosa, M. bovis, N. gonorrhea sind mit filamentösen Strukturen, genannt Pili oder Fimbrien, bedeckt. Pili bestehen in erster Linie aus Protein (Pilin) und fungieren erfahrungsgemäß als antigene Determinanten, wenn sie Versuchstieren eingespritzt werden. Einige Pili, einschließlich PAO, PAK, CD4, wie sie im allgemeinen genannt werden, und andere vermitteln die Besiedlung von P. aeruginosa beim Menschen. Einige bakterielle Zellen, die diese Pili nicht besitzen - entweder aufgrund Mutationen oder weil das Plasmid mit dem Pilusgen verlorenging - können keine Schleimhäute besiedeln. Offensichtlich haften sich die Pili auf der Oberfläche des Bakteriums aufgrund spezifischer Wechselwirkungen mit den Epithelzellenrezeptoren an die Auskleidung des Halses bzw. der Luftröhre an. P. aeruginosa kann als Adhesine sowohl Pili als auch Alginat (der Hauptbestandteil von P. aeruginosa-Kapseln) verwenden, um eine Anheftung an die Epithelzellen der menschlichen Atemwege zu vermitteln [siehe Doig et al., Infection and Immun., 55: 1517-1522 (1987); Doig et al., Infection and Immun., 56: 1641-1646 (1988); Marcus et al., Infection and Immun., 47: 723-729 (1985); Ramphal et al., Infection and Immun. 44: 38- 40 (1984); Ramphal et al., Infection and Immun., 47: 1-4 (1985); Woods et al., Infection and Immun., 29: 1146-1151 (1980)].
• Die Gleichgewichtsanalyse der Anheftung von P. aeruginosa an die Epithelzellen der menschlichen Atemwege zeigt, daß das Pilusadhesin von Pseudomonas eine weitaus höhere Affinität bzw. Bindungskonstante (Ka) besitzt als das Alginatadhesin [McEachran et al., Can. J. Microbiol. 31: 563-569 (1985), McEachran et al., J. Microbiol. Meth., 5: 99-111 (1986); Doig et al., Infection and Immun., 55: 1517-1522 (1987)].
• Diese Beobachtungen lassen den Schluß zu, daß das Pilusadhesin wohl das bestimmende Pseudomonasadhesin beim Auslösen einer Infektion ist. Eine adhesinvermittelte Anheftung ist die Voraussetzung für den Ausbruch einer von P. aeruginosa verursachten Krankheit.
• Alles, was die Anheftung biologisch stört, müßte die Infektion wirksam hemmen. Anhand der monoklonalen Antikörperbehandlung der bakteriellen Anlagerung wurde eine derartige Methode untersucht und in der Patentliteratur, z.B. US-Patentschrift 4 443 549 und US-Patentschrift 4 702 911 sowie in der veröffentlichten US-PCT-Anmeldung S.N. PCT/US85/00565 erläutert. Es ist wichtig zu erwähnen, daß bakterielle Adhesine einzigartig sind. Somit läßt sich diese Methode für eine Reihe anderer Bakterien nicht voraussagen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, das kleiner ist als ein natürlich vorkommendes Pilinprotein von P. aeruginosa und die pharmazeutisch geeigneten Salze davon, die eine konservierte antigene Determinante innerhalb eines semivariablen Bereichs der Carboxylterminushälfte des Pilins von P. aeruginosa immunologisch nachahmen und so als Antigen bzw. als Immunogen fungieren können, das eine Infektion mit P. aeruginosa wirksam hemmen kann. Überdies sieht die vorliegende Erfindung ein Vakzin vor, das ein derartiges Immunogen enthält, sowie eine Methode zur Immunisierung gegen eine P. aeruginosa Infektion. Die Erfindung schlägt weiterhin eine diagnostische Probe vor, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid bzw. einen Rezeptor verwendet wie einen von einem solchen Polypeptid hervorgerufenen Antikörper.
• Gemäß einer weiteren Ausführung der Erfindung besteht das reine homogene Polypeptid aus mindestens einer Aminosäurerestsequenz mit ungefähr 12 bis zu ungefähr 20 Aminosäureresten, die eine Sequenz definiert, die eine antigene Determinante eines Pilins von P. aeruginosa nachahmen kann. Die Aminosäurerestsequenz kann sich als Einheit ein- oder mehrmals in demselben Polypeptidmolekül wiederholen. Mehr als eine Art solcher Wiederholungseinheiten bzw. mehr als eine Wiederholungseinheit derselben Art können in einem einzigen erfindungsgemäßen Polypeptidmolekül vorhanden sein.
• Ein solches Polypeptid kann als ein mit gentechnischen Verfahren synthetisch hergestelltes Protein oder als einzelne Aminosäurereste bzw. Aminosäurerestblöcke davon aufgebaut sein.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführung der Erfindung können reine homogene erfindungsgemäße Polypeptide so definiert werden, daß sie die Aminosäurerestsequenz - von links nach rechts und vom Aminoterminus in Richtung Carboxylterminus - mit folgender Formel umfassen:
• wobei X ein Aminosäurerest oder eine Leerstelle ist. Wenn zwischen Xn und Xn+2 eine Leerstelle auftritt, wobei n=1 bis 18, dann ist Xn mit Xn+2 über eine Amidbindung (-CONH-) verbunden. Diese Amidbindung rührt von der Kondensation eines α-Carboxylterminus des Restes Xn mit dem α-Aminoterminus des Restes Xn+2 her.
• In der oben gennannten Formel ist:
• X&sub1; der Aminosäurerest Cystein (C);
• X&sub2; der Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Lysin (K), Serin (S) oder eine Leerstelle;
• X&sub3; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A) oder Isoleucin (I) oder eine Leerstelle;
• X&sub4; ein Aminosäurerest der Gruppe Serin (S) oder Threonin (T)
• oder eine Leerstelle;
• X&sub5; ein Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Lysin (K), Serin (S) oder eine Leerstelle;
• X&sub6; ein Aminosäurerest der Gruppe Serin (S) oder Threonin (T);
• X&sub7; ein Aminosäurerest der Gruppe Asparaginsäure (D), Leucin (L), Asparagin (N), Prolin (P) oder eine Leerstelle;
• X&sub8; ein Aminosäure der Gruppe Alanin (A), Leucin (L), Valin (V) oder eine Leerstelle;
• X&sub9; die Aminosäure Threonin (T) oder eine Leerstelle;
• X&sub1;&sub0; eine Aminosäure der Gruppe Alanin (A), Asparagin (N), Glutamin (Q) Tryptophan (W) oder eine Leerstelle;
• X&sub1;&sub1; ein Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Tryptophan (W) oder eine Leerstelle;
• X&sub1;&sub2; ein Aminosäurerest der Gruppe Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Lysin (K);
• X&sub1;&sub3; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A), Glutaminsäure (E), Asparagin (N), Prolin (P);
• X&sub1;&sub4; ein Aminosäurerest der Gruppe Lysin (K), Methionin (M), Asparagin (N), Glutamin (Q);
• X&sub1;&sub5; ein Aminosäurerest der Gruppe Phenylalanin (F), Tyrosin (Y);
• X&sub1;&sub6; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A), Isoleucin (I), Leucin (L), Arginin (R), Threonin (T);
• X&sub1;&sub7; der Aminosäurerest Prolin (P);
• X&sub1;&sub8; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A), Lysin (K), Asparagin (N), Serin (S);
• X&sub1;&sub9; ein Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Asparagin (N), Threonin (T);
• X&sub2;&sub0; die Aminosäure Cystein (C).
• Besonders bevorzugte Aminosäurerestsequenzen innerhalb der oben aufgeführten Gruppen von links nach rechts und vom Aminoterminus in Richtung Carboxylterminus sind:
• In diesem Patent stellt die Beschreibung des synthetisch hergestellten Peptids keine schon früher veröffentlichte Sequenz dar, sondern ist eine Zusammensetzung aus den kritischen Resten, die an der Anheftung an bukkale und tracheale Epithelzelloberflächenrezeptoren beteiligt sind. Einige Sequenzen wurden veröffentlicht und sind Untermengen dieser zusammengesetzten Sequenz.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Bevorzugte Ausführungen der Erfindung werden in Bezug auf folgende Beispiele erläutert, wobei:
• Abbildung 1 eine Kurve ist, die die Anheftung des synthetischen Peptids Ac17red und Ac17ox an humane BECs (engl. für bukkale Epithelzellen) darstellt;
• Abbildung 2 ein modifiziertes Lineweaver-Burk-Diagramm der Anheftung synthetischer Peptide an menschliche BECs darstellt;
• Abbildung 3 ein modifiziertes Lineweaver-Burk-Diagramm der Anheftung von PAK-Pili an humane BECs darstellt;
• Abbildung 4 einen Blot der Anheftung von PAK-Pili und einem synthetischem Peptid an geblottete BEC-Proteine auf Nitrozellulose darstellt;
• Abbildung 5 die mikroskopischen Abbildungen A, B, C und D der indirekten immunfluoreszierenden Lokalisation der PAK-Pili- Anheftung an fraktionierte bewimperte TECs (engl. für tracheale Epithelzellen) darstellt;
• Abbildung 6 die mikroskopischen Abbildungen A, B, C, D, E und F der indirekten immunfluoreszierenden Lokalisation der Anheftung von synthetischen Peptiden an humane bewimperte TECs darstellt; und
• Abbildung 7 ein Balkendiagramm mit den Fab-Fragmenten, die auf Bereichen hergestellt werden, die das C-Ende von PAK Pilin ausschließen und zur Vorbeugung der Pilinanheftung an BECs unwirksam sind, darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind kleiner als natürlich vorkommende Pilinproteine von Pseudomonas aeruginosa und umfassen Aminosäurerestsequenzen von ungefähr 12 bis ungefähr 20 Aminosäureresten, vorzugsweise 12 bis 20 Aminosäureresten, die eine konservierte antigene Determinante im Bereich der Carboxylterminushälfte des Pilinproteins von P. aeruginosa immunologisch nachahmen. Als solche sind die vorliegenden Polypeptide schon in dieser Form bzw. als pharmazeutisch geeignete Salze, als Wirkstoff in einem Vakzin, als Inoculum oder in einer diagnostischen Probe nützlich. Wie noch beschrieben wird, werden erfindungsgemäße Polypeptide mit Hilfe einer Vielzahl synthetischer Verfahren hergestellt. Eine solche synthetische Herstellung der vorliegenden Polypeptide führt zu reinen Stoffen, d.h. homogenen Peptidsequenzen, die weitgehend frei zumindest von biologischen Fremdstoffen sind.
• Der Begriff "antigene Determinante" - wie hier verwendet - bezeichnet den strukturellen Bestandteil eines Moleküls, das für die spezifische Wechselwirkung mit den entsprechenden Antikörpermolekülen (Immunglobulin), die durch dasselbe oder ein ähnliches Antigen gebildet wurden, verantwortlich ist.
• Antigene Determinanten sind bei vorliegenden Polypeptiden u.a. chemisch aktive Oberflächengruppen von Aminosäureresten.
• Der Begriff "Antigen" - wie hier verwendet - bedeutet eine von einem Antikörper gebundene Einheit.
• Der Begriff "Immunogen" - wie hier verwendet - beschreibt eine Einheit, die die Antikörperbildung im tierischen Wirt auslöst. In manchen Fällen stellen das Antigen und das Immunogen dieselbe Einheit dar, während in anderen Fällen die beiden Einheiten verschieden sind.
• Die Wendung "immunologisch nachahmen" dient in diesem Zusammenhang der Beschreibung dessen, daß ein erfindungsgemäßes immunogenes Polypeptid kein natürlich vorkommendes Protein bzw. ein abgespaltenes Fragment eines natürlichen Proteins ist, sondern ein mit Hilfe der Festphasensynthese oder gentechnischer Verfahren synthetisch hergestelltes Polypeptid, das die Bildung von Antikörpern, die sich an das Auslöserpolypeptid sowie an einen entsprechenden Pilin- bzw. Pilinpolypeptidteil anhaften, auslöst.
• Wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, liegen alle hier erwähnten Aminosäurereste in der natürlichen bzw. L-Konfiguration vor.
• In Einklang mit der genormten Peptidnomenklatur sind die Abkürzungen für die hier verwendeten Aminosäurereste wie folgt: Symbol Aminosäure Buchstabe -L-Tyrosin -Glycin -L-Phenylalanin -L-Methionin -L-Alanin -L-Serin -L-Isoleucin -L-Leucin -L-Threonin -L-Valin -L-Prolin -L-Lysin -L-Asparagin -L-Histidin -L-Glutamin -L-Glutaminsäure -L-Tryptophan -L-Arginin -L-Asparaginsäure -L-Cystein
• Der Begriff "pharmazeutisch geeignete Salze" - wie hier verwendet - bezieht sich auf nicht-toxische Salze, wie Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die in der Pharmaindustrie breite Anwendung finden, einschließlich Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, Ammoniumsalze u.ä., die mit Hilfe bekannter Verfahren hergestellt werden. Der Begriff umfaßt auch nicht-toxische saure Zusatzsalze, die im allgemeinen in einer Reaktion zwischen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Solche Salze sind u.a. Hydrochlorid, Bromwasserstoff, Sulfat, Bisulfat, Azetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat u.ä. Die Polypeptide, die die obengenannten Bedingungen erfüllen, lösen in einem Säugetierwirt die Bildung von Antikörpern aus. Es wird allgemein angenommen, daß sie eine gewünschte antigene Determinante innerhalb des Bereichs der Carboxylterminushälfte des Pilinproteins nachahmen.
• Ein oder mehrere Aminosäurerestsequenzen, die die oben genannten Bedingungen erfüllen, können als Wiederholungseinheiten vorliegen. Überdies können Polypeptide mit einer oder mehreren solchen Aminosäurerestsequenzen in relativ größere synthetische Teile übergehen, indem sie die einzelnen Polypeptide in Kopf-an-Schwanz-Weise miteinander verknüpfen.
• Diese Polypeptide können als diejenigen beschrieben werden, die die Aminosäuresequenz - von links nach rechts und vom Aminoterminus in Richtung Carboxylterminus - mit folgender Formel umfassen:
• wobei X einen Aminosäurerest oder eine Leerstelle bezeichnet. Wenn zwischen Xn und Xn+2 eine Leerstelle auftritt, wobei n=1 bis 18, dann ist Xn mit Xn+2 über eine Amidbindung (-CONH-) verbunden. Diese Amidbindung rührt von der Kondensation eines α-Carboxylterminus des Restes Xn mit dem α-Aminoterminus des Restes Xn+2 her.
• In der oben gennannte Formel ist:
• X&sub1; der Aminosäurerest Cystein (C);
• X&sub2; der Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Lysin (K), Serin (S) oder eine Leerstelle;
• X&sub3; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A) oder Isoleucin (I) oder eine Leerstelle;
• X&sub4; ein Aminosäurerest der Gruppe Serin (S) oder Threonin (T) oder eine Leerstelle;
• X&sub5; ein Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Lysin (K), Serin (S) oder eine Leerstelle;
• X&sub6; ein Aminosäurerest der Gruppe Serin (S) oder Threonin (T);
• X&sub7; ein Aminosäurerest der Gruppe Asparaginsäure (D), Leucin (L), Asparagin (N), Prolin (P) oder eine Leerstelle;
• X&sub8; ein Aminosäure der Gruppe Alanin (A), Leucin (L), Valin (V) oder eine Leerstelle;
• X&sub9; die Aminosäure Threonin (T) oder eine Leerstelle;
• X&sub1;&sub0; eine Aminosäure der Gruppe Alanin (A), Asparagin (N), Glutamin (Q) Tryptophan (W) oder eine Leerstelle;
• X&sub1;&sub1; ein Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Tryptophan (W) oder eine Leerstelle;
• X&sub1;&sub2; ein Aminosäurerest der Gruppe Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Lysin (K);
• X&sub1;&sub3; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A), Glutaminsäure (E), Asparagin (N), Prolin (P);
• X&sub1;&sub4; ein Aminosäurerest der Gruppe Lysin (K), Methionin (M), Asparagin (N), Glutamin (Q);
• X&sub1;&sub5; ein Aminosäurerest der Gruppe Phenylalanin (F), Tyrosin (Y);
• X&sub1;&sub6; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A), Isoleucin (I), Leucin (L), Arginin (R), Threonin (T);
• X&sub1;&sub7; der Aminosäurerest Prolin (P);
• X&sub1;&sub8; ein Aminosäurerest der Gruppe Alanin (A), Lysin (K), Asparagin (N), Serin (S);
• X&sub1;&sub9; ein Aminosäurerest der Gruppe Glycin (G), Asparagin (N), Threonin (T);
• X&sub2;&sub0; die Aminosäure Cystein (C).
• Besonders bevorzugte Aminosäurerestsequenzen innerhalb der oben aufgeführten Gruppen von links nach rechts und vom Aminoterminus in Richtung Carboxylterminus sind:
• Es stellte sich heraus, daß sich diese Sequenzen im Bereich der Carboxylterminushälfte von Pilinproteinen bei acht verschiedenen Arten von P. aeruginosa befinden, wie von Pasloske et al., J. of Bacteriology, 170: 3738-3741 (1988) beschrieben.
• Besonders bevorzugte Strukturen für die hier beschriebenen Sequenzen sind diejenigen, bei denen diese Sequenzen intramolekulare Disulfidbindungen enthalten. Diese Disulfidbindungen werden durch die oxidative Anlagerung der Schwefelatome zweier in jeder Sequenz enthaltenen Cysteinreste (C) gebildet.
• Bei der typischen Laborherstellung werden 10 Milligramm Di-CYS-Polypeptid (das Amino- bzw. Carboxylterminuscysteinreste in nicht oxidierter Form enthält) in 250 Milliliter 0,1 molarem Ammoniumbicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von ca. 8 aufgelöst. Das aufgelöste Di-CYS-Polypeptid wird dann in Luft oxidiert, indem die Lösung ungefähr 18 Stunden lang gerührt wird bzw. bis durch das Ellman-Verfahren kein erkennbares freies Marcaptan mehr vorhanden ist. [Siehe Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959)]. Im allgemeinen wird dann das so hergestellte ringförmige Peptid in der Regel mit Hilfe der Gefriertrocknung, Wiederauflösung und chromatographischen Reinigung isoliert.
• Es stellte sich heraus, daß die bevorzugten Sequenzen innerhalb des Bereichs der Carboxylterminushälfte des Pilinproteins bei acht verschiedenen Arten von P. aeruginosa konserviert sind, wie von Pasloske et al., J. Bacteriology 170: 3738-3741 (1988) beschrieben, sowie antigenisch verwandte Varianten davon, wie weiter unten in dieser Erfindung erläutert wird.
• Das Polypeptid kann eines oder mehrere der vorausgehenden Sequenzen enthalten, die in der Regel durch eine Kette anderer Aminosäureresten oder anderer geeigneter Verbindungsgruppen voneinander getrennt sind.
• Aus Immunproben und durch Ableitung aus der konservierten Protein-Protein-Wechselwirkung bei gelösten kristallographischen Röntgenstrahlstrukturen mit unterschiedlichen Sequenzen, wie bei den Dimerkontakten von oligomeren Enzymen, zeigen biochemische Nachweise, daß die Beibehaltung der Protein-Protein-Erkennung keine strenge Einhaltung der Sequenz voraussetzt, um eine Verwandtschaft aufzuweisen. Während Änderungen der einzelnen Aminosäurereste diese Erkennung in hohem Maße beeinträchtigen können - je nach Art der Substitution - kann im allgemeinen die Verwandtschaft von zwei verschiedenen Aminosäuresequenzen bezüglich der Protein-Protein- (sowie antigenen bzw. immunogenen) Erkennung anhand sieben hauptsächlicher Parameter für Aminosäuren ausgedrückt werden:
• (1) Hydrophobie;
• (2) Polarität;
• (3) Länge der Seitenkette;
• (4) Ladung;
• (5) bevorzugte gedrehte Sekundärstruktur;
• (6) bevorzugte Betastrang-Sekundärstruktur;
• und
• (7) bevorzugte Helix-Sekundärstruktur.
• Zur Bestimmung des Ausmaßes der für die antigene bzw. immunogene Erkennung relevanten Sequenzidentität und somit antigenisch verwandter Varianten, kann folgende empirische Ähnlichkeiten zwischen Aminosäureresten verwendende Klassifizierung herangezogen werden. Diese Klassifizierung basiert auf einer Anordnung von Aminosäureresten in Form von Austauschgruppen. Aminosäuren innerhalb einer solchen Gruppe werden bevorzugt gegeneinander ausgetauscht. Deshalb sind sie sich am ähnlichsten, was ihre Auswirkungen auf Proteinstrukturen angeht. Diese empirischen Ähnlichkeiten werden in "Principles of Protein Structures", Charles R. Cauton, Herausgeber Springer-Verlag, New York, Inc. 1979, Seite 14 wie folgt dargestellt: Austauschgruppen Beschreibung Die Aromate Phe (F), Tyr (Y) und Tryptophan (W); Die positiv geladenen Reste Lys (K), Arg (R) und His (H); Die großen aliphatischen unpolaren Reste Val (V), Leu (L), Ile (I), Met (M) und Cys (C); Die kleinen Reste Ser (S), Thr (T), Asp (D), Asn (N), Gly (G), Ala (A), Glu (E), Gln (Q) und Pro (P).
• Im Sinne dieser Erfindung wird ein verwandtes Peptid wie folgt definiert:
• Irgendein Peptid mit einem Cysteinrest (C) in Position X&sub1;, gefolgt von
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 2 oder 4 in Position X&sub2; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 3 oder 4 in Position X&sub3; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub4; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 2 oder 4 in Position X&sub5; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub6; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 3 oder 4 in Position X&sub7; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 3 oder 4 in Position X&sub8; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub9; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub1;&sub0; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 1 oder 4 in Position X&sub1;&sub1; oder einer Leerstelle.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 2 oder 4 in Position X&sub1;&sub2;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub1;&sub3;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 2, 3 oder 4 in Position X&sub1;&sub4;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 1 in Position X&sub1;&sub5;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 2, 3 oder 4 in Position X&sub1;&sub6;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub1;&sub7;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppen 2 oder 4 in Position X&sub1;&sub8;.
• - einem Aminosäurerest der Gruppe 4 in Position X&sub1;&sub9;.
• und einen Cysteinrest (C) in Position X&sub2;&sub0; enthaltend.
• Die hier verwendeten Peptide werden erfindungsgemäß an hochmolekularen Verbindungen bevorzugt angelagert. Zum Beispiel können bei folgendem Verfahren Proteine wie Hämocyanin aus Schlüsselloch-Napfschnecken (KLH = keyhole limpet hemocyanin) bzw. Rinderserumalbumin (BSA) bzw. toxoide Proteine eingesetzt werden.
Peptidkonjugation an Proteinträger
• Die Peptide wurden mit Hämocyanin aus Schlüsselloch- Napfschnecken (KLH) bzw. Rinderserumalbumin BSA über einen Linker konjugiert, bestehend aus einem [¹&sup4;C] Glycin und einer Benzophenon-Vernetzungsgruppe (Benzoylbenzoesäure), der dem Peptid bei der synthetischen Herstellung, als sich das Peptid noch auf einer festen Matrix befand, beigemengt wurde. Zunächst wurde Hapten in 10-20 ul Wasser in einem Reagenzglas aufgelöst. Dann wurden die Proteinträger (10 mg/100ul) beigemengt und gemischt. Die kovalente Anlagerung des Peptids an den Träger erfolgte nach der Aktivierung der Benzoyl- Benzoyl-Gruppe durch eine einstündige UV-Bestrahlung bei 4ºC in einem RPR 208 Herstellungsreaktor mit RPR 3500 Lampen. Anschließend wurde nichtkonjugiertes Hapten durch nachfolgende Dialyse in 8 M Karbamid, 100 mM und 25 mM Ammoniumbikarbonat entfernt. Das Produkt wurde lyophil getrocknet und die Peptidanlagerung durch Messen der pro Mol Träger aufgenommenen Radioaktivität bestimmt. Man erhielt Peptid/Proteinverhältnisse von ungefähr 4:1 bzw. 10:1 für die oxidierten bzw. reduzierten Peptide.
• Ein Gemisch der vorhergehenden Polypeptide, einschließlich derer mit antigenisch verwandten Bereichen, wie oben beschrieben, kann auch für ein Vakzin gegen oder eine diagnostische Probe für eine Infektion von P. aeruginosa bzw. einem Inoculum zur Antikörperbildung verwendet werden. Es ist ebenfalls klar, daß anti-idiotypische Antikörper als auf der erfindungsgemäßen Sequenz basierende Vakzine hergestellt werden können. Ein solches Verfahren wird bei Kennedy et al, Vaccines 86 "New Approaches to Immunization", Cold Spring Harbour, 1986, S. 85, näher erläutert.
• Jegliche Störung der bakteriellen Anlagerung und nachfolgenden Besiedlung wird eine Infektion verhindern. Für einen Teil der Aminosäuresequenz des P. aeruginosa Piliproteins spezifische monoklonale Antikörper können mit den Adhesinen eine Wechselwirkung eingehen und so die Zellenanlagerung stören. Eine andere Möglichkeit ist, ein Peptid bzw. einen Teil der ganzen Pilinaminosäuresequenz als Immunogen zu verwenden, um Wirtsantikörper zu entwickeln, die ihrerseits das Anlagern von Bakterien und die anschließende Besiedlung verhindern. Diese Verfahren stellen deshalb neue und nützliche biologische Mittel zur Verhinderung bzw. Behandlung von P. aeruginosa-Krankheiten beim Mensch dar. Es ist anzumerken, daß dieses synthetisch hergestellte Vakzin nicht auf die bestimmende immunogene oder antigene Stelle von P. aeruginosa, sondern vielmehr auf die für die Anlagerung des Bakteriums an die Oberflächen der menschlichen bukkalen und trachealen Epithelzellen verantwortliche Adhesinbindungsstelle gerichtet ist. Vakzine mit wirksamen Mengen vorliegender Polypeptide lösen die Bildung von Antikörpern in Mengen aus, die ausreichen, um die geimpfte Person vor einer Infektion mit P. aeruginosa zu schützen. Gegebenenfalls können Auffrischungsimpfungen verabreicht werden.
• Also steht der Begriff "Vakzin" sowie die verschiedenen hier verwendeten grammatikalischen Formen in Bezug zum Schutz des Säugetierwirtes. Der Begriff "Inoculum" sowie die hier verwendeten verschiedenen grammatikalischen Formen beschreiben eine Zusammensetzung mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid als Wirkstoff zur Bildung von Antikörpern, die sich immunologisch an die Pili von P. aeruginosa anlagern. Ein Vakzin und ein Inoculum können also identische Bestandteile haben; ihre Anwendungsbereiche unterscheiden sich jedoch erheblich.
• Die als Antigene oder Immunogene oder als beides zu vorliegenden Zwecken geeigneten Polypeptide können synthetisch oder gentechnisch hergestellt werden; sie können sowohl in monomerer als auch in multimerer Form in Vakzinen, Inocula oder als diagnostische Mittel verwendet werden. Bei Verwendung in einem Vakzin oder Inoculum kann das Polypeptid allein, wie im Falle eines Oligomers oder Multimers, oder gebunden an eine andere Trägerkomponente als Konjugat verwendet werden. Wenn es allein als Immunogen verwendet wird, enthält das erfindungsgemäße Polypeptid in der Regel ca. 12 bis ca. 20 Aminosäurereste. Solche Polypeptide sind vorzugsweise an einen Träger gebunden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind deshalb rein und homogen, d.h. ohne Fremdstoffe, was man auch bei einer Isolierung der Polypeptide aus natürlich vorkommenden Polypeptiden feststellen würde.
• Besonders nützliche Konjugatträger sind Hämocyanin aus Schlüsselloch-Napfschnecken (KLH), Tetanustoxoid, Poly-L- (LYS:GLU), Erdnußagglutinin, Poly-D-Lysin, Diphterietoxoid, Eieralbumin, Sojabohnenagglutinin, Rinderserumalbumin (BSA), humanes Serumalbumin u.ä.
• Der hier verwendete Begriff "hergestellt" bedeutet, daß das Polypeptidmolekül oder die Polypeptid-Wiederholungseinheit mit chemischen Mitteln synthetisch aufgebaut wurde, d.h. chemisch synthetisiert oder mit vom Mensch angewandten biologischen Mitteln hergestellt wurde, z.B. gentechnisch, einschließlich rekombinanter DNA und Kuhpockenviren als Vektoren für Vakzinantigene. Letzteres Verfahren wird von Gerald Quinnan, "Proceedings of a Workshop", 13.- 14. November, 1984 Elsevier, S. 27, genauer offengelegt.
• Synthesen durch die Verwendung rekombinanter DNA, Impfungen unter Verwendung eines Vektors für Vakzinantigene sowie andere Formen und Bedingungen für die DNA-Expression des vorliegenden Polypeptids liegen der Verwendung einer DNA- Sequenz und ihrer für das gewünschte Polypeptid kodierten Analogen zugrunde. Wie der Fachmann erkennt, können die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierten DNA-Sequenzen von Fachleuten leicht bestimmt und mit Hilfe eines geeigneten Genexpressionssystems zur Herstellung des gewünschten Polypeptids entweder in vitro oder in vivo exprimiert werden.
• Für die Synthese des gewünschten Polypeptids ist es ratsam, die gewählte DNA-Sequenz in einem geeigneten Mikroorganismuswirt entsprechend zu exprimieren. Der Fachmann, der eine gewünschte erfindungsgemäße Polypeptidsequenz herstellen möchte, kann die notwendige, für die gewünschte Polypeptidsequenz kodierte DNA-Sequenz problemlos bestimmen und auswählen. Zur Herstellung des gewünschten Polypeptids im großtechnischen Maßstab wird zur Expression im passenden Mikroorganismuswirt die gewählte DNA- Sequenz in einen geeigneten Vektor eingebracht.
• Zum besseren Verständnis der Genexpression und ihres Produkts sowie zur Herstellung großer Polypeptidmengen für funktionelle Analysen, Antikörperbildung und die Behandlung von Patienten kann die vorliegende DNA-Sequenz verändert werden. Die Sequenzänderungen können das Expressionsmuster bezüglich der Menge, Gewebespezifizität und funktionellen Eigenschaften ändern oder auch nicht. Die für das vorliegende modifizierte bzw. nichtmodifizierte Protein kodierende DNA- Sequenz voller oder partieller Länge kann an bakterielle Expressionsvektoren wie pRIT (Nilsson et al. EMBO J. 4: 1075- 1080 (1985)), pGEX (Smith und Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)) oder pATH (Spindler et al. J. Virol. 49: 132-141 (1984)) Plasmide angebunden sein. Diese Plasmide können in E. coli zur Bildung entsprechender Polypeptide eingeschleust werden, die wiederum gemäß der üblichen Verfahren zur Proteinisolierung getrennt werden können. Die DNA-Sequenz kann auch von ihrem bestehenden Träger an andere Klonierungsträger weitergegeben werden, z.B. an andere Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide, tierische Viren, künstliche Hefechromosomen (YAG) (Burke et al. Science 236:806-812, (1987)), Körperzellen und andere einfache oder komplexe Organismen, wie Bakteien, Pilze (Timberlake und Marshall, Science 244:1313-1317 (1989), Wirbellose, Pflanzen (Gasser und Fralex, Science 244:1293 (1989) und Schweine (Pursel et al. Science 244: 1281-1288 (1989)).
• Zum Erhalt einer vorübergehenden oder langfristigen Expression kann bei der Expression von Säugetierzellen die DNA-Sequenz an heterologe Beschleuniger, wie dem Simian- Sarkomvirus (SV) 40, Beschleuniger im pSV2-Vektor, gebunden werden [Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 78:2072-2076 (1981)] und in Zellen, wie COS-1-Zellen beim Affen, eingeschleust werden [Gluzman, Cell, 23:175-182 (1981)]. Die stabile Einbringung des chimären Gengebildes kann bei Säugetierzellen durch biochemische Selektion, wie Neomycin [Southern und Berg, J. Mol. Appln. Genet. 1:327-341 (1982)] und Mykophenolsäure [Mulligan und Berg, oben] aufrechterhalten werden.
• Die DNA-Sequenzen können mit Hilfe üblicher Verfahren, wie dem Abbau mit Restriktionsenzymen, dem Einfügen mit DNA- Polymerase, der Entfernung mit Exonuclease, der Verlängerung mit Enddesoxynukleotidyl-Transferase, dem Abtrennen synthetischer oder klonierter DNA-Sequenzen, der auf Bindungsstellen gerichteten Sequenzveränderung durch einsträngige Bakteriophagenvermittler, verändert werden.
• Mit Hilfe herkömmlicher Verfahren wird die DNA-Sequenz in eukaryotische Expressionsvektoren eingebracht. Diese Vektoren sind so aufgebaut, daß sie die Transkription der DNA in eukaryotischen Zellen durch Bildung regulierender Sequenzen ermöglichen, die die Transkription der DNA einleiten und beschleunigen sowie das Spleißen und die Polyadenylierung sicherstellen.
• Vektoren mit Beschleunigerbereichen des Simian-Sarkomvirus (SV) 40 oder LTR-Sequenzen (LTR = long terminal repeat) des Rous-Sarkomvirus sowie dem Polyadenylierungs- und Splicing- Signal von SV 40 sind überall erhältlich [Mulligan et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1078-2076, (1981); Gorman et al Proc Natl. Acad. Sci USA 79: 6777-6781 (1982)]. Das Ausmaß der DNA-Expression kann mit diesem Vektor entweder mit Beschleunigern verschiedener Aktivität (der Baculovirus pAC373 z.B. ermöglicht einen hohen Grad an DNA-Expression in Zellen von S. frungiperda [M. D. Summers und G. E. Smith in, Genetically Altered Viruses and the Environment (B. Fields, et al, eds.) Band 22 Nr. 319-328, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York, 1985] oder mit Vektoren, die der Anpassung unterworfene Beschleuniger enthalten, z.B. der auf Glucocoricoid ansprechende Beschleuniger von Mammatumorviren der Maus [Lee et al, Nature 294:228 (1982)]. Die DNA-Expression kann in den Empfängerzellen 24 bis 72 Stunden nach der Einschleusung (vorübergehende Expression) beobachtet werden.
• Überdies enthalten einige Vektoren selektierbare Marker [wie gpt [Mulligan et Berg oben] oder neo [Southern und Berg J. Mol. Appln. Genet 1:327-341 (1982)], bakterielle, die Isolierung von Zellen mit Hilfe chemischer Selektion ermöglichende Gene, die eine stabile langfristige Vektoren- (und dadurch DNA-)Expression in Empfängerzellen ermöglichen. Die Vektoren können in den Zellen als unabhängig replizierende Episomeneinheiten unter Verwendung von regulierenden Viruselementen wie Papillomviren [Sarver er al Mol. Cell Biol. 1:486 (1981)] oder Epstein-Barr (Sugden et al Mol. Cell Biol. 5:410 (1985)] erhalten werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, Keimbahnen mit in die genomische DNA integriertem Vektor herzustellen. Beide dieser Keimbahnen bilden das Genprodukt ständig. Es können auch Keimbahnen mit einer größeren Anzahl Vektorkopien (und dadurch auch DNA- Kopien) hergestellt werden, um so Keimbahnen zu erhalten, die eine große Menge des Polypeptids bilden können [Alt et al. J. Biol. Chem. 253: 1357 (1978)].
• Die Übertragung von DNA in eukaryotische, insbesondere in menschliche Zellen oder andere Säugetierzellen ist heutzutage allgemein üblich. Die Vektoren werden als reine DNA in die Empfängerzellen eingeschleust (Transfektion) z. B. durch Niederschlag mit Hilfe von Calciumphosphat [Graham und Vander Eb, Virology 52:466 (1973)] oder Strontiumphosphat [Brash et al Mol. Cell Biol. 7:2013 (1987)], Elektroporation [Neumann et al EMBO J 1:841 (1982)], Lipofektion [Felgner et al Proc Natl. Acad. Sci USA 84:7413 (1987)], DEAE Dextran [McCuthan et al J. Natl Cancer Inst. 41:351 (1986)], Microinjektion [Mueller et al Cell 15:579 (1978)], Protoplastenfusion [Schafner, Proc Natl. Aca. Sci USA 72:2163] oder Pellet guns [Klein et al, Nature 327: 70 (1987)]. Es besteht auch die Möglichkeit, DNA durch Infektion mit Virusvektoren einzuschleusen. Es gibt Systeme, die z.B. Retroviren [Bernstein et al. Genetic Engineering 7: 235, (1985)], Adenoviren [Ahmad et al J. Virol 57:267 (1986)] oder Herpesviren [Spaete et al Cell 30:295 (1982)] verwenden.
• Erfindungsgemäß umfaßt der rekombinante Klonierungsvektor dann die ausgewählte DNA der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zur Expression in einem geeigneten Wirt. Zur Expression des Polypeptids ist die DNA im Vektor an eine Expressionskontrollsequenz im rekombinanten DNA-Molekül wirksam gebunden. Die Expressionskontrollsequenz kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Sequenzen, die die Genexpression von prokaryotischen bzw. eukaryotischen Zellen und ihrer Viren bzw. Kombinationen davon steuern, bestehen. Die Expressionskontrollsequenz kann auch speziell aus der Gruppe ausgewählt werden, die das lac-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, die größten Auslöser- und Beschleunigerbereiche von Lambda-Phagen, den Kontrollbereich des fd-Umhüllungsproteins, die SV40-Früh- und Spätbeschleuniger, von Polyomaviren, Adenoviren, Retroviren, Baculoviren und Simian-Sarkomviren abgeleitete Beschleuniger, den Beschleuniger für 3-Phosphoglycerat-Kinase, den Beschleuniger für Hefesäurephosphatase, den Beschleuniger für Yeast Alpha-Mating Faktoren und Kombinationen davon umfassen.
• Die Wirtszelle, die mit dem erfindungsgemäßen Vektor eine Transfektion eingeht, kann aus Gruppe bestehend aus E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus oder andere Bazillen; andere Bakterien; Hefe; Pilze; Insekten; Maus- oder andere Tier- oder Pflanzenwirte; oder menschliche Gewebezellen, ausgewählt werden.
• Obwohl die für die verschiedenen erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden DNA-Sequenzen und die entsprechenden RNA-Sequenzen vom Fachmann problemlos aufgezählt werden können, sind die DNA-Sequenzen für die bevorzugten Polypeptidsequenzen wie folgt. Gemäß der üblichen Nomenklatur wird die Polypeptidsequenz durch zwei Reihen für jede bevorzugte Sequenz bezeichnet, wobei die DNA-Sequenz in der dritten Reihe erscheint:
• Mehrere der Sequenzen wurden in bereits bekannter Literatur über die Erforschung des gesamten Pilinpeptids wie in Brittain, L. et al "Cloning and Sequencing of the Pseudomonas aeruginosa PAK Pilin Gene", FEBS 2489, Band 183, Nr. 2, SS. 408-412 (1985); Parimi, Sastry A. et al, "Comparative Studies of the Amino Acid and Nucleotide Sequences of Pilin Derived from Pseudomonas aeruginosa PAK and PAO, Journal of Bacteriology, 164: 571-577 (1985); Brittain L. et al, "Serial Isolates of Pseudomonas aeruginosa from a Cystic Fibrosis Patient Have Identical Pilin Sequences", Infection and Immunity, 56:665-672 (1988) und Brittain, L. et al, "Notes. Two Unusual Pilin Sequences from Different Isolates of Pseudomonas aeruginosa: Journal of Bacteriology 170:3738-3741 (1988) veröffentlicht.
• In Übereinstimmung mit der vorhergehenden Diskussion über die Möglichkeiten zur Konservierung von Aminosäuresequenzen können - wie oben beschrieben - viele Aminosäurereste ersetzt werden. Demnach werden entsprechende Veränderungen in der DNA-Sequenz vorgenommen, um sie für das gewünschte erfindungsgemäße Polypeptid zu kodieren. Weiterhin können geeignete Multieinheiten der gewünschten Polypeptidsequenzen mit oder ohne verknüpften alternierenden Aminosäuresequenzen durch die entsprechende Multieinheit der für das gewünschte Polypeptid kodierten DNA-Sequenz und der für die alternierende Sequenz kodierten DNA-Sequenz exprimiert werden.
• Anstatt ein dem hergestellten Polypeptid zugrundeliegendes Vakzin zu entwickeln, ist es auch möglich, das Vakzinantigen in dem zu schützenden Mensch oder Tier in vivo zu exprimieren. Gemäß dem zuvor erwähnten Quinmann "Proceedings of a Workshop" supra zur Expression des gewünschten erfindungsgemäßen Vakzins in einem viralen Vektor kann dies beim Patienten erreicht werden. Gemäß dem in der Druckschrift beschriebenen Verfahren wird die ausgewählte, für das gewünschte erfindungsgemäße Vakzinantigen kodierende DNA- Sequenz in den viralen Vektor für den Kuhpockenvirus eingebracht und dem vorher durch wiederholte Injektionen des hergestellten Kuhpockenvirus infizierten Patienten verabreicht.
• Es besteht ebenfalls die Möglichkeit, daß durch DNA- Expression in einem geeigneten bakteriellen Plasmid oder Phage der Kuhpockenvirus im Mensch oder Tier exprimiert wird. Dieses Verfahren zum Einschleusen des Vakzinantigens in Bakterien wird bei S.N. Chatfield et al, "Live Salmonella as Vaccines and Carriers of Foreign Antigenic Determinants" Vaccines 7:495-498 (1989) ausführlich beschrieben. Eine allgemeinere Erläuterung der Verwendung geschwächter Bakterien zur Bildung des gewünschten Vakzinantigens im Patienten selbst wird auf Dougan et al, "Live Bacterial Vaccines and Their Application as Carriers for Foreign Antigens", Advances in Veterinary Science and Comparative Medicine, Band 33, verwiesen.
• Wie bei der Kuhpockenvirusmethode verwendet auch die orale bakterielle Impfung die für das gewünschte erfindungsgemäße Vakzinantigen kodierende DNA-Sequenz. So wird die ausgewählte DNA-Sequenz in einem geeigneten Vektor, z.B. einem zu dem Mikroorganismuswirt passenden Plasmid, gebildet. Zur Replikation der ausgewählten DNA-Sequenz wird der Mikroorganismus in mehrfachen Plasmidkopien gezüchtet. Der Microorganismus wird dann von der Nährlösung getrennt und für die orale Verabreichung an den Patienten vorbereitet. Nach der oralen Verabreichung reproduziert sich der Mikroorganismus und gibt das gewünschte Vakzinantigen, auf das der Patient eine wirksame Immunreaktion zeigt, an den Blutkreislauf des Patienten ab. Dementsprechend schlägt diese Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen u.ä. zur Expression in einem geeigneten Träger, wie einem Virus oder Bakterium, das den Patienten infiziert hat, vor, damit das gewünschte und entsprechende erfindungsgemäße Vakzinantigen dem Patienten verabreicht werden kann.
• So bestehen die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide weder aus natürlich vorkommenden Proteinen noch aus Fragmenten davon. Die bekannte chemische Festphasensynthese, bei der Aminosäureresteblöcke zur Bildung des gewünschten Polypeptids nacheinander angelagert werden, ist das bevorzugte Syntheseverfahren und wird unten ausführlich beschrieben.
• Wie oben erwähnt können geeignete erfindungsgemäße Polypeptide mit Hilfe der bekannten Festphasensynthese hergestellt werden. Zur vollständigen Erläuterung dieser Verfahren siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149- 2154 (1963), Houghten et al., Int. J. Pept. Proc. Res. 16: 311-320 (1980) und Parker und Hodges, J. Prot. Chem. 3: 465- 478 (1985). Das Festphasenverfahren zur Synthese von Polypeptiden kann mit Hilfe eines Beckman Modell 990B Peptidsynthetisierers durchgeführt werden, im Handel bei Beckman Instruments Co., Berkeley, CA., U.S.A. erhältlich.
• Bei der Herstellung eines synthetischen erfindungsgemäßen Polypeptids mit oben beschriebener Festphasenmethode werden die Aminosäurereste über eine Amidverbindung vom Carboxylterminusrest an ein Harz (feste Phase) angelagert.
• Die alpha-Aminogruppe jeder angelagerten Aminosäure wird in der Regel von einer tertiären Butoxycarbonyl-Gruppe (t-Boc) geschützt, bevor sich die Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette anlagert. Vor der Anlagerung der nächsten Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette wird die t-Boc Gruppe entfernt. Während der Synthese des Polypeptids werden reaktive Aminosäureseitenketten ebenfalls geschützt. Übliche Seitenketten schützende Gruppen, die für die übrigen Aminosäureresten verwendet werden, sind: O-(p-Brombenzyloxycarbonyl) für Tyrosin, O-Benzyl für Threonin, Serin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, sowie S- Methoxybenzyl für Cystein, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl für Lysin und Formyltryptophan. Geschützte Aminosäuren werden mit geeigneten Lösungsmitteln rekristallisiert, um einzelne Punkte mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie sichtbar zu machen. In der Regel werden Anlagerungen mit einem 2-fachen molaren Überschuß an geschützter Aminosäure und Dicyclohexylcarbodiimids über die Zahl der Milligrammäquivalente der ersten N-Terminus-Aminosäure durchgeführt. Bei Asparagin und Glutamin wird der geschützten Aminosäure dieselbe Molarmenge N-Hydroxybenzotriazol beigemengt und Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet. Mit Hilfe des Pikrinsäuretests von Gisin, Anal. Chem. Acta, 58: 248-249 (1972) oder des Ninhydrintests, Sarin et al., Anal. Biochem. 117: 147-157 (1981) laufen in der Regel alle Anlagerungsreaktionen zu mehr als 99% vollständig ab.
• Ein Teil des erhaltenen, geschützten, harzgebundenen Polypeptids (1 Gramm) wird mit zwei Milliliter Anisol behandelt. Bei Trockeneistemperatur werden 20 Milliliter nichtwässrigen Fluorwasserstoffs in das Reaktionsgefäß kondensiert. Das resultierende Gemisch wird zur Abspaltung der schützenden Gruppen und zur Lösung des Polypeptids vom Harz bei 4ºC eine Stunde lang gerührt. Nach der Verdampfung des Fluorwasserstoffs mit einem N&sub2;-Strom bei einer Temperatur von 4ºC wird zur Entfernung des Anisols der Rest mit einem nichtwässrigen Diethyläther dreimal ausgeschüttelt und im Vakuum getrocknet.
• Die im Vakuum getrocknete Substanz wird mit unverdünnter Trifluoressigsäure (jeweils dreimal 10 Milliliter) gewonnen. Die Gewinnung löst das freie Polypeptid vom Harz. Nach Verdünnung der erhaltenen Lösung mit Wasser auf eine Konzentration von 10 bis 20% Essigsäure wird diese zur Bildung eines monomeren, unoxidierten Polypeptids lyophilisiert. Das vom Harz gelöste Peptid wird mittels bekannten chromatographischen Verfahrens isoliert und zu einem monomeren, intramolekularen, ringförmigen Gebilde oxidiert.
• Bei der typischen Laborherstellung werden 10 Milligramm Di- CYS Polypeptid (das Amino- und Carboxylterminuscysteinreste in nicht oxidierter Form enthält) in 250 Milliliter 0,1 molarem Ammoniumbicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von ca. 8 aufgelöst. Das aufgelöste Di-CYS-Polypeptid wird dann in Luft oxidiert, indem die Lösung ca. 18 Stunden lang gerührt wird bzw. bis kein durch das Ellman-Verfahren erkennbares freies Marcaptan mehr vorhanden ist. [Siehe Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959)]. Unter Verwendung des folgenden Verfahrens kann das so hergestellte ringförmige Peptid auch vom Kopf- bis zum Schwanzende polymersisiert werden: Das ringförmige Polypeptid wird in Meththylformamid (1 mg/ml) aufgelöst und Benzothiazol-1-yloxytris (Dimethylamino-) Phosphoniumhexafluorophosphat (1,1 molare Äquivalente) sowie Diisopropylethylamin (100 uL) werden beigemengt und bei Raumtemperatur ca. 8 Stunden lang zur Reaktion gebracht. Durch Verdampfung der Lösungsmittel und chromatographische Ausscheidung werden die so hergestellten polymeren Peptide aufgetrennt. Bei -10ºC werden benzylschützende Gruppen durch Behandlung des Polymers mit Anisol und nichtwäßrigem Fluorwasserstoff über einen Zeitraum von 110 Stunden entfernt. Nach der Entfernung des Fluorwasserstoffs bei -10ºC mit einem N&sub2;-Strom wird zur Entfernung des Anisols und des Restes der Rest mit nichtwäßrigem Diethyläther dreimal ausgeschüttelt. Für die Herstellung des Vakzins gegen Pseudomonas aeruginosa können Polypeptidmultimere mit oxidierten, ringförmigen, monomeren Einheiten verwendet werden. Dabei muß die Synthese gemäß der bekannten Festphasenmethode durchgeführt werden, die von Atherton et al., J.C.S. Perkin 1: 538-546 (1981), auf deren Offenlegungen hier Bezug genommen wird, entwickelt wurde. Diese Synthese kann mit einem im Handel von LKB Biochrom, Ltd., Cambridge, England erhältlichen LKB BioLynx Modells 4175 Peptidsynthetisierer durchgeführt werden.
• Bei der Herstellung eines erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptids mit oben erwähnter Festphasenmethode werden die Aminosäurereste über eine Esterbindung vom Carboxylterminusrest an ein Harz (feste Phase) gebunden.
• In der Regel wird vor der Anlagerung der Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette die alpha-Aminogruppe jeder angelagerten Aminosäure von einer 9-Fluoroenyl- Methoxycarbonyl-Gruppe (FMOC) geschützt. Die FMOC-Gruppe wird entfernt, bevor die nächste Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette angelagert wird. Auch während der Synthese des Polypeptids werden reaktionsfreudige Aminosäureseitenketten geschützt. Allgemein übliche, für die restlichen Aminosäurereste verwendete Gruppen, die die Seitenketten schützen, sind:
• o-(p-Brombenzoyloxycarbonyl) für Tyrosin, o-Benzyl für Threonin und Serin, -Phenacyl für Asparaginsäure und Benzyl für Glutaminsäure, S-tert-Butyl für Cystein und 2-Chlorbenzyloxycarbonyl für Lysin. In der Regel werden Anlagerungen durchgeführt, indem ein 2-facher molarer Überschuß an geschützter Aminosäure und einem Äquivalent Dicyclohexycarbodiimd über die Zahl der Milliäquivalente der ersten N-Terminus-Aminosäure verwendet wird. Bei Asparagin (N) und Glutamin (Q) werden 2 molare Äquivalente N-Hydroxy- Benzotriazol und Dicyclohexycarbodiimd verwendet. Alle Anlagerungsreaktionen wurden in der Regel mit dem Ninhydrintest von Sarin, Anal. Biochem. 117: 147-157 (1981) überwacht und liefen zu mehr als 99% vollständig ab.
• Ein Teil dieses Harzes wird gespalten und setzt zur Oxidation und Polymerisation ein Peptid frei. Eine Abspaltung zur Freisetzung teilweiser ungeschützter Peptide wird mit folgendem Verfahren erreicht, bei dem 95%ige Trifluoressigsäure (5mL/50mg Harz) eingesetzt wurde. Das Harz (50 mg) wird in 95%iger Trifluoressigsäure mit Anisol (Vol-3%), Ethandithiol (Vol-1%) und Ethylmethylsulfid (Vol-1%) suspendiert; die Reaktion läuft bei Zimmertemperatur 2-3 Stunden lang ab. Zur Entfernung des Peptids und des Desoxidationsmittels wird das Harz danach gefiltert und mit reiner Trifluoressigsäure (3-5 mL) gewaschen. Die Filtrate werden gemeinsam im Vakuum verdampft und der Rest mit Diethyläther pulverisiert. Schließlich wird der Rest in 0,5%iger Trifluoressigsäure in Wasser gelöst und lyophilisiert.
• Dieses Rohpeptid kann mit bekannten Umkehrphasen-Verfahren (HPLC-Verfahren) isoliert werden und das isolierte Peptid mit Hilfe der Oxidation in Luft in 0,1 molarem Ammonium- Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von ca. 8 über ca. 18 Stunden hinweg - wie bereits beschrieben - zyklisiert werden. Die Isolierung des ringförmigen Produkts aus dem Oxidationsverfahren erfolgt mittels bekannten chromatographischen Verfahren. Unter Verwendung von Benzotriazol-1-yloxytris (Dimethylamino-)- Phosphoniumhexafluorophosphat (1,1 molarem Äquivalent) und Diisopropylethylamin (100 l) erfolgt die Synthese des polymeren Polypeptids durch Kopf/Schwanz-Bindungen zwischen den freien Amino- und Carboxyltermini bei Raumtemperatur ca. 8 Stunden lang. Die Muitimere werden dann aufgrund des bekannten Größenausschluß-Chromatographie-Verfahrens isoliert. Die restlichen Seitenketten-schützenden Benzylgruppen werden dadurch abgespalten, daß die Multimere mit nichtwässrigem, Anisol-enthaltendem (1 mL) Fluorwasserstoff (9 ml) bei ca. -10ºC ca. 1 Stunde lang behandelt werden. Die ungeschützten Multimere werden bei einer konstanten Temperatur von ungefähr -10ºC durch Verdampfung des Fluorwasserstoffs unter einem N&sub2;-Strom getrennt. Zur Entfernung des Desoxidationsmittels wird das Produkt dann mit Diethyläther pulverisiert, in wässriger 0,5%iger Trifluoressigsäure aufgelöst und danach lyophilisiert.
• Sofern die Sequenz benzylgeschütztes Serin und Threonin in Kombination mit tert-Butyl-Cystein enthält, besteht auch die Möglichkeit, die Abspaltung vor der Zyklisierung in flüssigem nichtwäßrigem Anisol (1 mL) und Ethandithiol (25 uL) enthaltendem Fluorwasserstoff (9 mL) durchzuführen. Nach dieser Abspaltung werden Zyklisierung und Polymerisation zum multimeren Polypeptid führen. Die Isolierung findet bei jedem Syntheseschritt mit Hilfe bekannter chromatographischer Verfahren statt.
• Mit oben beschriebenen Verfahren können isolierte ringförmige Polypeptide auch direkt an eine Kernmatrix, einem sogenannten mehrfachem Antigenpeptidsystem (MAP) angelagert werden, das von J.P. Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5409-5413 (1988) beschrieben wird und dem Fachmann bekannt ist. Die Anlagerung des ringförmigen monomeren Polypeptids findet unter Verwendung eines molaren Verhältnisses des Polypeptids zur Kernmatrix von 8:1 in Dimethylformamid mit 8 Äquivalenten Benzotriazol-1-yloxytris(Dimethylamino-)- Phosphoniumhexafluorphosphat und Diisopropylethylamin (100 uL) statt.
• Erfindungsgemäße Vakzine und Inocula können in der Regel intramuskulär bzw. subkutan injiziert oder oral in Form von enterischen Kapseln bzw. Tabletten, als Zäpfchen bzw. Nasenspray oder in anderer Form verabreicht werden. Beim Mensch hängt die geeignete Dosis des Polypeptids von der gewählten Verabreichungsfrom sowie von einer Reihe anderer Faktoren ab. Zu diesen Faktoren gehören u.a. das Körpergewicht des zu immunisierenden Säugetiers, der Träger (falls ein solcher verwendet wird), das Adjuvans (falls ein solches verwendet wird) und die Anzahl der gewünschten Impfungen.
• In der Regel können einzelne Impfungen beim Mensch Einheitsdosen von ca. 10 Mikrogramm bis 100 Milligramm des Polypeptids ohne einen Träger, an das das Polypeptid angelagert sein könnte, enthalten. Wenn erwünscht, können für eine optimale Immunität mehrere Dosen über einen längeren Zeitraum verabreicht werden. Auf Wunsch können auch Einheitsdosen des Vakzins mit den vorher erwähnten Mengen Polypeptid hergestellt werden.
• Auf jeden Fall ist das in einem Vakzin bzw. einem Inoculum enthaltene Immunogen in "wirksamer Menge" vorhanden; diese Menge hängt von einer Reihe von in der Immunologie bekannten Faktoren ab, z.B. dem Körpergewicht des zu immunisierenden Säugetiers, dem verwendeten Trägeranteil, dem verwendeten Adjuvans, der gewünschten Dauer des Impfschutzes und dem gewünschten Immunisierungsprotokoll.
• In einer weiteren Ausführung der Erfindung sind ganze Antikörper sowie weitgehend ganze Antikörper vorgesehen, die in Folge der Bildung der erfindungsgemäßen Polypeptide entstehen, sowie die mit solchen Antikörpern hergestellten Antikörperbindungsstellen. Im allgemeinen Sprachgebrauch heißen solche Moleküle Rezeptoren.
• Rezeptoren werden in Säugetieren wie Hasen, Ziegen, Pferden u.ä. durch Immunisierung mit oben beschriebenen Inocula gebildet. Die Immunisierungsverfahren sind weitgehend dieselben wie bei Impfungen, außer daß wirksame, beim Mensch nicht einsetzbare Adjuvanten, wie das allgemein bekannte komplette Freundsche Adjuvans (CFA) bzw. das inkomplette Freundsche Adjuvans (IFA), in Inocula für Tiere enthalten sein können.
• Übliche Stammlösungen für Impfstoffe werden mit CFA, IFA oder Alumen wie folgt hergestellt: Eine bestimmte, für die gewünschte wirksame Polypeptidmenge pro Impfung ausreichende Menge Polypeptid, synthetischen Polypeptidkonjugats bzw. polymeren Polypeptids wird in PBS mit einem pH-Wert von 7,2 aufgelöst. Danach werden zur Bildung eines polypeptid-, wasser- und adjuvanshaltigen Impfstoffes die gleichen Mengen CFA bzw. IFA mit der Polypeptidlösung gemischt, wobei das Verhältnis von Wasser zu Öl ca. 1:1 beträgt. Anschließend wird zur Bildung der Stammlösung des Impfstoffes das Gemisch homogenisiert. Bei Alumen werden ca. 200 Mikrogramm Konjugat auf ca. 4 Milligramm Alumen für die Bildung der Stammlösung absorbiert.
• Zur Züchtung von Antipolypeptid-Antikörpern können Hasen verwendet werden. In der Regel wird dem Hasenwirt dabei ein Impfstoff subkutan injiziert. Dieser Impfstoff enthält 200 Mikrogramm in CFA emulgiertes Polypeptidkonjugat (Polypeptid plus Träger), 200 Mikrogramm in IFA emulgiertes Polypeptidkonjugat und 200 Mikrogramm Polypeptidkonjugat mit 4 Milligramm Alum, das dem Hasen jeweils am 0, 14. und 21. Tag des Immunisierungsprogramms intraperitoneal injiziert wird. Jede Impfung (Immunisierung) besteht aus vier Injektionen des Impfstoffes. Mit ca. einem Zehntel der oben angegebenen Dosis pro Injektion können Mäuse auf ähnliche Weise immunisiert werden.
• In der Regel werden den Tieren 4 bzw. 14 Wochen nach der ersten Injektion Blutproben genommen. Kurz vor der ersten Immunisierung wird von jedem Tier ein Kontrollserum durch Blutentnahme noch vor der Immunisierung gewonnen.
• Kontrollstammlösungen des Impfstoffes können auch mit Hämocyanin aus Schlüsselloch-Napfschnecke (KLH), mit KLH in CFA bzw. IFA, mit KLH-Alumen absorbiertem, KLH-Alumen absorbiertem Pertussis, Edestin, Thyroglobulin, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid in IFA, Choleratoxoid und Choleratoxoid in IFA u.ä. hergestellt werden.
• In der Regel wird die Wirksamkeit der oben beschriebenen Immunisierungsverfahren mit ELISA bestimmt, wobei das erfindungsgemäße immunogene Polypeptid als Antigen verwendet wird, um die Antikörpermenge in den verdünnten Seren der Blutproben zu bestimmen. Zur Bildung der erfindungsgemäßen Antikörper können Seren mit Antipolypeptid-Antikörpertiter (Lösungen) im Verhältnis von mindestens 1:160 verwendet werden. Der allgemein vewendete ELISA-Test wird in Bittle et al., Nature 298, 30-33 (1982) ausführlich beschrieben.
• Geeignete monoklonale Rezeptoren, in der Regel ganze Antikörper, können ebenfalls mit der bei Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4949-4953 (1983) beschriebenen Hybridomtechnik hergestellt werden. Monoklonale Rezeptoren können nicht nur aus überstehenden Hybridomflüssigkeiten gewonnen werden, sondern auch in im allgemeinen großen Mengen aus Aszitesflüssigkeit bei Säugetieren, denen die gewünschten Hybridome injiziert wurden. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit Aszitesflüssigkeit ist bekannt und wird hier nicht ausführlicher erläutert. Ein erfindungsgemäßer Rezeptor lagert sich sowohl an das Polypeptid an, für das es gebildet wurde, als auch an das entsprechende Pilinprotein, dessen antigene Determinante das erfindungsgemäße Polypeptid immunologisch nachahmt. Demnach kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowohl als Immunogen wie auch als Antigen fungieren.
• Die erfindungsgemäßen Rezeptoren sind eine Untermenge der natürlich vorkommenden polyklonalen Antikörper, da sie für ein Immunogen gebildet wurden, das einen kleinen Teil des intakten Pilinmoleküls nachahmt. Folglich lagern sich die erfindungsgemäßen Rezeptoren an Epitope des Polypeptids an (das Teil des Pilinmoleküls ist), während sich natürlich vorkommende, für ein Pilin von Pseudomonas gebildetete Antikörper an Epitope über das ganze Pilinmolekül hinweg anlagern. Die Polypeptide, Antikörper und die von diesen Polypeptiden gebildeten Antikörperbindungsstellen sowie die erfindungsgemäßen Verfahren können ebenfalls für Diagnosetests wie Immuno-Assays verwendet werden. Solche Diagnoseverfahren umfassen z.B. die Enzym-Immuno-Assay, die EMIT-Assay (engl. für enzyme multiplied immunoassay), die ELISA-Assay (engl. für enzyme-linked immunosorbent assay), die Radioimmunoassay (RIA), die Fluoreszenz-Immuno-Assay, Verfahren mit entweder einem oder zwei Antikörpern sowie andere Verfahren, bei denen entweder eine Antikörperbindungsstelle oder das Antigen mit einem nachweisbaren Tag markiert ist. Siehe im allgemeinen Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, Ohio (1981) und Goldman, M., Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, N.Y. (1980).
• Ein anschauliches erfindungsgemäßes Diagnosesystem zum Nachweis von P. aeruginosa enthält Rezeptormoleküle, wie Antikörper (weitgehend ganze Antikörper) bzw. vom erfindungsgemäßen Polypeptid gebildete Antikörperbindungsstellen. Zu einem derartigen System gehört auch ein Gerät zur Anzeige einer Immunitätsreaktion zwischen Rezeptor und Antigen. Das Anzeigegerät ermöglicht auch den Nachweis einer Immunreaktion. Wenn das Rezeptormolekül mit einer Körperprobe, wie Sputum, gemischt wird, geht es mit dem Pilinantigen eine Immunreaktion ein und bildet einen Reaktanten, wobei das verwendete Anzeigegerät die Immunreaktion anzeigt.
• Ein Beispiel für eine derartige Ausführung ist eine Immunofluoreszenz-Assay, bei der ein Sputumabstrich auf einen ebenen Objektträger mit Azeton fixiert wird. Ein aliquoter Teil der erfindungsgemäßen, z.B. in Hasen gebildeten Antikörper, im allgemeinen ca. 10 Mikrogramm bis ca. 500 Mikrogramm, wird mit bekannten Verfahren auf dem Objektträger inkubiert.
• Nachdem nicht zur Immunreaktion gebrachte Antikörper weggespült und nicht-spezifische Bindungsstellen auf dem Objektträger mit einem Protein wie BSA blockiert sind, kann - wenn erwünscht - ein zweiter Antikörper, z.B. ein Anti-Hasen Ziegenantikörper, auf dem Versuchsobjektträger inkubiert werden. Der zweite Antikörper wird durch Bindung an eine Fluorchromfarbe, wie Fluorsceinisothiocyanat (FITC), markiert.
• Nach dieser zweiten Inkubation werden alle überschüssigen zweiten Antikörper abgespült, wobei alle an die ersten Antikörper auf dem Versuchsobjektträger angelagerten FITC- markierten Anti-Hasen Ziegenantikörper übrig bleiben. Das Vorhandensein FITC-markierter Antikörper und somit auch einer Infektion mit Pseudomonas kann mit der Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden.
• Bei vielen Diagnosesystemen, wie bei den oben beschriebenen Immunofluoreszenz-Assays, braucht man für die Rezeptormoleküle keine ganzen, intakten, biologisch aktiven Antikörper, sondern vielmehr nur die immunologisch aktive Bindungs- und Erkennungsrezeptorstelle des Antikörpermoleküls, die das Idiotyp enhält und das Antigen bindet, d.h. die Antikörperbindungsstelle. Beispiele solcher Antikörperbindungsstellen sind die mit bekannten Verfahren hergestellten Fab- und F(ab')&sub2;-Antikörperteile.
• Ein anderes erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren ist die ELISA-Assay. Hier wird ein erfindungsgemäßes Polypeptidantigen auf einen festen Träger, wie die Wände einer Mikrotiterscheibe, aufgebracht. Anschließend werden nichtspezifische Bindungsstellen an den Wänden der Mikrotitermulde mit einem Protein wie BSA blockiert. Ungebundenes Polypeptid und BSA werden von der Mikrotitermulde weggespült.
• Eine Körperprobe, wie die oben erwähnte, wird mit den überschüssigen erfindungsgemäßen Antikörpern in einer wässrigen Lösung gemischt und das Gemisch so lange aufbewahrt, bis eine Immunreaktion zwischen dem Antikörper und dem Piliantigen von Pseudomonas stattfindet. Anschließend wird dieses flüssige Gemisch mit dem oben beschriebenen polypeptidgebundenen festen Träger gemischt. Dadurch entsteht ein zweites Gemisch mit festen und flüssigen Phasen. Das Gemisch mit fester/flüssiger Phase wird so lange aufbewahrt, bis vorher nicht reagierende Antikörper mit dem Polypeptidantigen eine Immunreaktion eingehen. Im Anschluß wird die flüssige Phase von der festen Phase getrennt. Eine Lösung eines zweiten markierten Antikörpers, der mit dem erstgenannten Antikörper reagiert, wird dann mit der festen Phase gemischt. Ein Beispiel für einen zweiten Antikörper ist ein an alkalische Phosphatase gebundenes Anti-Hasen-Ziegen- IgG, wobei die erstgenannten Antikörper in Hasen gebildet werden. Das Gemisch aus der festen Phase und der zweiten markierten Antikörperlösung wird so lange aufbewahrt, bis eine Immunreaktion zwischen den beiden Antikörpern stattfindet. Anschließend werden die feste und die flüssige Phase voneinander getrennt.
• Anschließend wird eine Lösung mit einem Substrat für das Enzym, wie p-Nitrophenylphosphat, der festen Phase beigemengt. Bei einer vorher bestimmten Wellenlänge (z.B. 405 Nanometer) kann dann die optische Dichte nach einem vorher festgelegten Zeitraum bestimmt und mit der optischen Dichte der Kontrollprobe verglichen werden, um so den Nachweis des Antigens von Pseudomonas in der Körperprobe zu erbringen.
• Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
BEISPIEL 1: POLYPEPTIDSYNTHESE
• Eine Reihe kurzer, synthetisch hergestellter Polypeptide, deren Aminosäurerestsequenzen den kleinen Segmenten des Pilinproteins von Pseudomonas entsprechen, wurden gemäß dem Verfahren von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963), das von Houghten et al., Int. J. Pept. Proc. Res. 16: 311-120 (1980) modifiziert wurde, unter Verwendung eines Beckman Peptidsynthetisierers Modell 990B (Beckman Instruments Co., Berkeley, CA, U.S.A.) synthetisch hergestellt. In Tabelle 1 unten werden die Polypeptidbezeichungen und -stellen im Pilinprotein der entsprechenden Aminosäuresequenz von Pseudomonas dargestellt. TABELLE 1 Synthetisch hergestelltes, dem Pilinsegment von Pseudomonas entsprechendes Polypeptid Bezeichung¹ Stelle² Aminosäurerestsequenz 1 An KLH bzw. BSA unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Benzophenon-Vernetzungsgruppe angelagertes Polypeptid. 2 Die Stelle entspricht der Position des Aminosäurerestes der von Sastry et al., FEBS Lett. (1983) 151: 253-256 beschriebenen Pilinproteinseqenz.
BEISPIEL 2: ANLAGERUNGEN AN DEN POLYPEPTlDTRÄGER
• Die Peptide wurden über einen Linker, bestehend aus einem Norleucinzwischenstück und einer Benzophenon- Vernetzungsgruppe (Benzoylbenzoesäure), bei Rinderserumalbumin an Hämocyanin aus Schlüsselloch- Napfschnecke konjugiert. Bei der Synthese wurde dieser Linker dem Peptid beigemengt, als sich das Peptid noch auf der festen Matrix befand. Zunächst wurde das Protein ( 3mg) in einem Reagenzglas in 10 bis 20 uL Wasser aufgelöst. Anschließend wurden die Proteinträger (10 mg/100 uL) beigemengt. Die kovalente Anlagerung des Peptids an den Träger erfolgte nach der Aktivierung der Benzoyl-Benzoyl- Gruppe durch eine einstündige UV-Bestrahlung bei 4ºC in einem RPR 208 Herstellungsreaktor (Rayonet, Southern New England Ultraviolet Co., Middletown, Conn.) mit RPR 3500 Lampen. Anschließend wurde nichtkonjugiertes Hapten durch nachfolgende Dialyse in 8 M Karbamid, 100 mM und 25 mM Ammoniumbikarbonat entfernt. Das Produkt wurde lyophil getrocknet. Die Peptideinbringung wurde durch Hydrolyse einer kleinen Konjugatprobe und Berechnung des Verhältnisses des Restnorleucins zu jeder nicht in der Peptidsequenz, sondern in der Sequenz des Trägermoleküls nachgewiesenen Aminosäure bestimmt. Dieses Verhältnis stellt das molare Verhältnis des Peptids zum Träger dar. Für oxidierte sowie reduzierte Peptide erhielt man Peptid/Träger-Verhältnisse von jeweils ca. 4:1 und 10:1.
BEISPIEL 3: SCREENING VON HASENSEREN AUF ANTI-POLYPEPTID- ANTIKÖRPER
• Hasenantiseren wurden mit einer enzymgebundenen ELISA-Assay auf Anti-Polypeptid-Antikörper gescreent. Das wie in Beispiel 1 hergestellte Polypeptidantigen wurde auf die Wände von Mikrotitermulden adsorbiert, um ein an die feste Phase gebundenes Zielantigen zu erhalten.
• Eine Konjugatlösung (5 ug/mL), aufgelöst in einem Umhüllungspuffer aus Natriumkarbonat mit einem pH-Wert von 9,6, wurde zum Beschichten der Mulden einer Mikrotiterscheibe verwendet. Die einzelnen Mulden wurden mit 120 uL dieser Lösung bei 4ºC in einer feuchten Kammer 16 Stunden lang beschichtet. Die Scheiben wurden dann dreimal mit einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung/Tween gewaschen.
• Anschließend wurden nichtspezifische Bindungsstellen an den Wänden der Mikrotitermulde durch Inkubation von 50 uL 3%igem (Vol.-Gew.) BSA/PBS in jeder Mulde bei 37ºC 4 Stunden lang in einer feuchten Kammer blockiert. Nach der Inkubation wurde überschüssiges BSA durch Umdrehen und Schütteln der Scheiben entfernt. Somit erhielt man das an einen festen Träger gebundene Polypeptid, dessen nichtspezifische Bindungsstellen blockiert worden waren. Somit konnte es als Zielantigen verwendet werden.
• Zur Prüfung der Hasenseren auf das Vorhandensein von Anti- Polypeptid-Antikörpern wurde ein aliquoter Teil jedes Serums der Reihe nach zehnfach in 1%igem (Vol.-Gew.) BSA/PBS verdünnt. 100 Mikroliter jedes verdünnten Serums wurden mit einem an eine feste Phase gebundenen Polypeptid über ein Gemisch in den wie oben vorbereiteten geeigneten Mikrotitermulden in Kontakt gebracht. Der Kontakt wurde durch Inkubation der Mulden bei 37ºC zwei Stunden lang in einer feuchten Kammer aufrechterhalten, wodurch alle in dem verdünnten Serum enthaltenen Anti-Polypeptid-Antikörper mit dem an die feste Phase gebundenen Polypeptid-Zielantigen eine Immunreaktion eingingen. Nach der Inkubation wurden die feste und die flüssige Phase durch Füllen der Schächte mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung/Tween sowie durch dreimaliges Umdrehen und Schütteln in Seriatim voneinander getrennt.
• Zum Nachweis einer Immunreaktion zwischen Anti-Polypeptid- Antikörpern und dem Festphasenantigen wurden 100 uL einer 1:1000 Anti-Hasen-Ziegen-IgG-Lösung, markiert mit einer alkalischen Phosphatase (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung/Tween, jeder Mulde beigemengt und bei Raumtemperatur ca. 2 Stunden lang in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Mulden wurden dann dreimal mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung/Tween in Seriatim gewaschen. In jede Mulde wurde eine Substratlösung (50 uL) mit 1 mg p-Nitrophenylphosphat in 1 mL 10%igem Diethanolamin mit einem pH-Wert von 9,8 gegeben. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur 45 bis 60 Minuten lang weiter ablaufen. Der Grad der nachweisbaren Reaktion (Farbbildung) wurde durch Messen der Extinktion jeder Mulde bei 405 nm bestimmt. Es wurden Hasenantiseren mit einer Extinktion von ca. 0,05 Einheiten im Vergleich zum Hintergrund bestimmt und die Ergebnisse in Tabelle 2 aufgeführt. TABELLE 2 Endpunkttiter - Direkte ELISA-Assay mit Hasenantiseren gegen Peptidkonjugat Bezeichung¹ Peptid/Konjugat Titer 1 Von 4 verschiedenen Hasen abgeleitete Antiseren. 2 Wie oben verwendet bezieht sich R auf Antiseren, die auf reduzierten Peptiden hergestellt wurden. 3 Wie oben verwendet bezieht sich O auf Antiseren, die auf oxidierten Peptiden hergestellt wurden.
BEISPIEL 4: SCREENING VON HASENSEREN AUF ANTI-PILIN- ANTIKÖRPER
• Unter Verwendung der direkten enzymgebundenen ELISA-Assay wurden Hasenantiseren auf Bindung an Pili von Pseudomonas, die von dem beiden Pili-Sorten, PAK und PAO, getrennt wurden, gescreent. Die Pili wurden, wie von Paranchych et al., Can. J. Microbiol. (1979) 25: 1175-1181 und in Beispiel 5 beschrieben, getrennt und isoliert. Zum Beschichten der Mulde einer Mikrotiterscheibe wurde eine 5 ug/mL in einem Umhüllungspuffer aus Natriumkarbonat mit einem pH-Wert von 9,6 aufgelösten Pililösung verwendet. Die einzelnen Mulden ??? wurden mit 120 uL dieser Lösung bei 4ºC in einer feuchten Kammer 16 Stunden lang beschichtet. Die Scheiben wurden dann dreimal mit einer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung/Tween gewaschen.
• Anschließend wurden nichtspezifische Bindungsstellen an den Wänden der Mikrotitermulde durch Inkubation von 50 uL 3%igem (Vol.-Gew.) BSA/PBS in jeder Mulde bei 37ºC vier Stunden lang in einer feuchten Kammer blockiert. Nach der Inkubation wurde überschüssiges BSA durch Umdrehen und Schütteln der Scheiben entfernt. Somit erhielt man das an einen festen Träger gebundene Polypeptid, dessen nichtspezifische Bindungsstellen blockiert worden waren. Somit konnte es als Zielantigen verwendet werden.
• Zur Prüfung der Hasenseren auf das Vorhandensein von Anti- Polypeptid-Antikörpern wurde ein aliquoter Teil jedes Serums der Reihe nach zehnfach in 1%igem (Vol.-Gew.) BSA/PBS verdünnt. 100 Mikroliter jedes verdünnten Serums wurden mit einem an eine feste Phase gebundenen Polypeptid über ein Gemisch in den wie oben vorbereiteten geeigneten Mikrotitermulden in Kontakt gebracht. Der Kontakt wurde durch Inkubation der Mulden bei 37ºC zwei Stunden lang in einer feuchten Kammer aufrechterhalten, wodurch alle in dem verdünnten Serum enthaltenen Anti-Polypeptid-Antikörper mit dem an die feste Phase gebundenen Polypeptidzielantigen eine Immunreaktion eingingen. Nach der Inkubation wurden die feste und die flüssige Phase durch Füllen der Mulden mit Phosphat- gepufferter Kochsalzlösung/Tween sowie durch dreimaliges Umdrehen und Schütteln in Seriatim voneinander getrennt.
• Zum Nachweis einer Immunreaktion zwischen Anti-Polypeptid- Antikörpern und dem Festphasenantigen wurden 100 uL einer 1:1000 Anti-Hasen Ziegen-IgG-Lösung, markiert mit einer alkalischen Phosphatase (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung/Tween, jeder Mulde beigemengt und bei Raumtemperatur ca. 2 Stunden lang in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Mulden wurden dann dreimal mit Phasphatpufferkochsalzlösung/Tween in Seriatim gewaschen. In jede Mulde wurde eine Substratlösung (50 uL) mit 1 mg p- Nitrophenylphosphat in 1 mL 10%igem Diethanolamin mit einem pH-Wert von 9,8 gegeben. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur 45 bis 60 Minuten lang weiter ablaufen. Der Grad der nachweisbaren Reaktion (Farbbildung) wurde durch Messen der Extinktion jeder Mulde bei 405 nm bestimmt. Es wurden Hasenantiseren mit einer Extinktion von ca. 0,05 Einheiten im Vergleich zum Hintergrund bestimmt und die Ergebnisse in Tabelle 3 aufgeführt. TABELLE 3 Endpunkttiter (SD) (n = 3) - Direkte ELISA-Assay mit Hasenantiseren¹ gegen PAK- und PAO-Pili Pilititer Bezeichung¹ 1 Von 4 verschiedenen Hasen abgeleitete Antiseren. 2 Der Endpunkt (n = 3) wurde als Endpunkt bei einem A405 von 0,05 AU bestimmt. 2 Wie oben verwendet bezieht sich R auf Antiseren, die auf reduzierten Peptiden hergestellt wurden. 3 Wie oben verwendet bezieht sich O auf Antiseren, die auf oxidierten Peptiden hergestellt wurden.
BEISPIEL 5: PILINISOLIERUNG
• Das verwendete Isolierungsverfahren wurde schon von Paranchych et al., Can. J. Microbiol. (1979) 25: 1175-1181 beschrieben. Wie oben bereits dargelegt, wurden Bakterien in großen Pfannen gezüchtet und anschließend durch Abkratzen der Agaroberfläche und Suspendieren der Zellen von 36 Schalen (ca. 100 g Feuchtgutmasse) in 1000 mL SSC-Puffer gewonnen. Anschließend wurden die Zellen bei 5ºC mit einem Magnetrührer 2 Stunden lang gerührt. Durch Sieben der Suspension wurden große Agarteile entfernt. Die Pili wurden von den Zellen entfernt, indem sie in 200 mL-Mengen bei 2000 UdM 2 Minuten lang mit einem Sorvall Omnimixer beigemengt wurden. Nach der Entfernung von Bakterien durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 10,000 x g wurde die NaCl-Konzentration der überstehenden Lösung auf 0,5 M eingestellt. Polyethylenglykol 6000 (PEG 6000) wurde solange beigemengt, bis die Endkonzentration 1% Gew./Vol. betrug. Die Lösung ruhte dann bei 4ºC 18 Stunden lang. Sowohl Pili als auch Flagellen scheideten sich unter diesen Bedingungen ab und wurden mittels 20-minütiger Zentrifugation bei 7000 x g entfernt. Zur Entfernung der Flagellen wurde das Pellet noch einmal in einer 10% Gew./Vol. (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung (pH-Wert 4,0) suspendiert und ruhte dann bei 4ºC 2 Stunden lang. Unter diesen Bedingungen wurden die Pili abgeschieden und die Flagellen blieben in der Suspension. Die restlichen Flagellen wurden durch wiederholte Ammoniumsulfatausscheidung entfernt. Das resultierende Pellet wurde noch einmal in Wasser aufgelöst, zur Entfernung von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; dialysiert und dann einer CsCl- Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Bei letzterem Verfahren wurden 20 mL Pililösung auf 16 mL eines bevorzugten Stufengradienten mit einer CsCl-Dichte zwischen 1,1 und 1,5 aufgetragen. Nach einer 20-stündigen Zentrifugation bei 20.000 UdM in einem SW27-Rotor unter Verwendung einer Beckman L2-65B Ultrazentrifuge wurde die Pilusschicht (mit einer schwimmenden Dichte von ca. 1,3 g/cm³) entfernt und danach einer zweiten CsCl-Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Nach dem Entfernen der Pilusschicht vom zweiten CsCl- Gradienten und der Dialyse zur Entfernung des CsCl, wurden die Pili in destilliertem Wasser noch einmal suspendiert und durch wiederholte Zentrifugation bei 50.000 UdM in einem 60- Ti Rotor mit festem Winkel 2 Stunden lang gewaschen. Die Pili wurden für aufgetrennt gehalten, als die SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophoreseüberprüfung der Probe eine einzige Proteinschicht mit hohem Pilinanteil in den Proben (100 ug Pilin pro Probe) aufzeigten.
BEISPIEL 6: WESTERN-BLOT ASSAY
• Die Hasenantiseren wurden weiterhin gescreent, um festzustellen, ob sie in einer Western-Blot-Assay mit Pilinprotein von Pseudomonas eine Immunreaktion aufwiesen. Das Pilinprotein von Pseudomonas wurde - wie in Beispiel 5 beschrieben - von den PAK- und PAO-Sorten getrennt. Entsprechend der Laemmli-Methode wurde unter Verwendung von flüssigen 15%igen Polyacrylamid-Gels eine Natriumdodezylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Dabei wurden isolierte Pili (5 ug) und ein Ganzzellen-Lysat (3 x 10&sup7; Bakterien) verwendet. Das Ganzzellen-Lysat wurde durch 2 bis 3-minütiges Abkochen der PAK-Zellen in 100 uL Probenpuffer (2,5%igem Natriumdodezylsulphat in 0,25 M Tris, pH-Wert 6,8) hergestellt, das zur Auflösung von auf Natriumdodezylsulfat- Polyacrylamidgele aufzubringende Proteine verwendet wird. Anschließend wurde das Gemisch auf einer Tischmikrofuge zentrifugiert; 10 uL der überstehenden Flüssigkeit wurden entfernt und mit 15 uL Probenpuffer vor dem Auftragen auf das Gel verdünnt. Nach der Trennung wurden die Proteine bei 0,2 A nach Towbin et al., P.N.A.S. (USA) (1979) 76:4350-4354, zwei bis sechs Stunden lang auf Nitrozellulosepapier transblottet. Die zu hohe Proteinbindungsfähigkeit des Nitrozelluloseblattes wurde mit einer 5%igen Gelatinelösung (59 Gelatin in 100 mL Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH- Wert 7,5) bei Raumtemperatur eine Stunde lang blockiert. Anschließend wurde das Nitrozelluloseblatt zweimal mit 0,05%igem Tween-20 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Unterlage wurde dann mit Antipeptid-Antiseren (1:250), die mit 1%igem Gelatin in Tris-gepufferter Tween-20 enthaltender Kochsalzlösung verdünnt waren, bei Raumtemperatur 16 Stunden lang behandelt. Überschüssiges Serum wurde mit Tris-gepufferter Tween-20 enthaltender Kochsalzlösung abgewaschen. Die Pilinschichten wurden mit einem Immuno-Assay-Baukasten (BioRad Laboratories, Richmond, California) nachgewiesen, wobei ein 3000-fach mit 1% Gelatin in Tris-gepufferter Tween-20 enthaltender Kochsalzlösung verdünntes alkalisches Phosphatasekonjugat von Anti-Hasen- Ziegen-IgG verwendet wurde. Die Inkubation mit diesem Konjugat wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang durchgeführt. Das überschüssige Konjugat wurde in zwei Waschgängen mit Tris-gepufferter Tween-20 enthaltender Kochsalzlösung von der Unterlage entfernt, gefolgt von einem Waschgang mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung allein. Die Immunreaktanten wurden mit p-nitroblauem Tetrazolchlorid in Gegenwart von 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphattoluidinsalz nachgewiesen. Die Immunreaktanten waren als purpurrote Schichten erkennbar. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 zusammengefaßt. TABELLE 4 Die Ergebnisse der Immunblot-Analyse von PAK- und PAO- Pilinproteinen mit Peptidkonjugat-Hasenantiseren¹ Pilin Bezeichnung¹ 1 Von vier verschiedenen Hasen abgeleitete Antiseren. 2 +++, intensive Schicht; ++, mäßig intensive Schicht; +, schwache Schicht. 3 Wie oben verwendet bezieht sich R auf Antiseren, die auf reduzierten Peptiden hergestellt wurden. 4 Wie oben verwendet bezieht sich O auf Antiseren, die auf oxidierten Peptiden hergestellt wurden.
BEISPIEL 7: GEWINNUNG BUKKALER EPITHELZELLEN
• Mit Holzspateln, die leicht gegen die Wangeninnenseite gerieben wurden - insgesamt drei Holzspatel pro Wange - wurden BECs von zehn gesunden, nichtrauchenden, freiwilligen männlichen Versuchspersonen entnommen. Um die BECs in Suspension zu bringen wurden diese Spatel in 30 mL Phosphat- gepufferter Kochsalzlösung leicht aneinander gerieben. Mit nachfolgender Zentrifugation (650 x g Spins) wurden diese Zellen dreimal mit 30 mL Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und wiederholt suspendiert. Das resultierende Pellet wurde in 5 mL Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,2 suspendiert. Die Suspension wurde gefiltert (durch ein vorher angefeuchtetes 70 um Nylonnetz) und die Zellen so verdünnt, daß die Endkonzentration 2 x 10&sup5; Zellen/mL in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 7,2 betrug. Diese Suspension wurde bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
BEISPIEL 8: GEWINNUNG TRACHEALER EPITHELZELLEN
• Humane, bewimperte, tracheale Epithelzellen (TECs) wurden von Patienten auf der Intensivstation im Toronto General Hospital durch bronchoskopisches Bürsten der bronchialen Schleimhäute - wie von Franklin et al., Infection and Immunity (1987) 55, 1523-1525 beschrieben - entnommen.
• Die TECs wurden Chirurgie-Patienten (bei Vollnarkose), intubierten Patienten auf der Intensivstation und freiwilligen Versuchspersonen mit Hilfe der Bronchoskopie entnommen. Bei den Chirurgie-Patienten und den Patienten auf der Intensivstation wurde die Bronchoskopie mit einem flexiblen Olympus-Bronchoskop vom Typ 2 BF durchgeführt, das durch ein Endotrachealrohr eingeführt wurde. Zum Abschaben der tracheal-bronchialen Schleimhäute wurde eine zytologische Bürste verwendet. Die TECs wurden in einem 1%igem Natriumcitrat enthaltendem von Dulbecco modifiziertem Eagle- Medium hoher Glukosekonzentration gesammelt.
• Die mit Hilfe der Bronchoskopie gewonnene Zellsuspension enthielt außer bewimperten und nichtbewimperten kubischen Epithel und Säulenepithel verschiedene Mengen Schleim, Erythrozyten, Granulozyten und Zelltrümmer und konnte deshalb nicht direkt für Adhäsionsassays verwendet werden. Die Zellsuspension wurde kurz verwirbelt, danach durch Nylonscreens mit einer Netzporengröße von 70 und 30 u gesiebt, mit 10 l 0,01 Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,2) zweimal gewaschen (500 x g bei 4ºC 15 Min. lang) (PBS) und wiederholt in 11 ml PBS suspendiert. Anschließend wurde die Zellsuspension mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation (500 x g bei 4ºC 15 Min. lang in einem Rotor mit schwingendem Eimer) auf einem PBS- vorgeformten (48,000 x g bei 4ºC 40 Min. lang) 65%igem (Vol/Vol) Perkollgradienten fraktioniert. Die TEC-Schicht wurde gewonnen und auf einen zweiten Perkollgradienten aufgetragen. Die Schicht bewimperter TECs wurde aus dem zweiten Gradienten gewonnen, die Zellen einmal in PBS gewaschen und dann in 1,5 ml PBS wiederholt suspendiert. Die Zellen wurden direkt mit einem Hämozytometer gezählt und die Lebensfähigkeit der Zellen mit Hilfe der Trypanblau- Farbausschlußmethode bestimmt. Die Zellfraktionierung brachte die übliche Menge Zellen (2,08 ± 0,34) x 10&sup5; (Mittelwert ± Standardfehler), von denen 32,8 ± 6,5% bewimperte TECs waren. Die Mehrzahl dieser Zellen war lebensfähig und in vielen Fällen bewegten sich die Cilien noch. Die fraktionierten TECs enthielten nur Epithelzellen und waren fast völlig frei von Schleimverunreinigungen. Sie konnten deshalb direkt für Adhäsionsassays verwendet werden.
BEISPIEL 9: AN BECS ANGELAGERTE PAK 128-144
• Zur Bewertung der Bindung von PAK 128-144 red und PAK 128-144 ox an BECs wurde eine Immunassay durchgeführt. Dem synthetisch hergestellten Peptid (0 nMol/ml bis 120 nMol/ml) wurde dieselbe Menge BECs (0,2 ml bei 2,0 x 10&sup5; BECs/ml) in PBS beigemengt und bei 37ºC inkubiert sowie bei 300 UdM gerührt. Nach einer Stunde wurden die BECs mit Hilfe der Zentrifugation (13.000 x g bei Raumtemperatur 2 Min. lang) gesammelt und fünfmal mit PBS gewaschen. Der monoklonale Antikörper PK99H (0,2 ml einer 10&supmin;³-Verdünnung in PBS isolierter IgG mit einem Titer von 10&sup6;) wurde dem Pellet beigemengt und wie oben beschrieben eine Stunde lang inkubiert. Die BECs wurden dann mit Hilfe der Zentrifugation (13.000 x g bei Raumtemperatur 2 Min. lang) gesammelt und fünfmal mit PBS gewaschen. Immunoglobulin-G- Peroxidasekonjugat (Jackson Laboratories) von Anti-Maus- Ziegen-IgG (H+L) wurde dem BEC-Pellet (0,2 ml einer 1:10000 Verdünnung in PBS) beigemengt und das Gemisch - wie oben beschrieben - eine Stunde lang inkubiert. Die BECs wurden dann mit Hilfe der Zentrifugation (13.000 x g bei Raumtemperatur 2 Min. lang) gesammelt und fünfmal mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde noch einmal in 0,2 ml einer 1 mM ABTS (2,2'-Azin-Di-(3-Ethylbenzthiazol-Sulfonsäure)) in einem Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,2 + 0,03% Peroxid suspendiert und anschließend in ein sauberes Röhrchen gegeben. Die Enzymreaktion von Meerettichperoxydase wurde durch die Zugabe von 0,2 ml 4 mM NaN&sub3; zum Stillstand gebracht und die optische Dichte bei 405 nm wurde nach der Entfernung der BECs mittels Zentrifugation bestimmt. Am Ende der Assay und vor der Entfernung der BECs durch Zentrifugation wurde die BEC-Konzentration in jedem Röhrchen mit Hilfe eines Hämozytometers gemessen. Die Ergebnisse werden in Abbildung 1, die die Anlagerung synthetisch hergestellten AC17red ( )-und AC17ox (+)-Peptids an humane BECs zeigt, dargestellt. Ac17red und AC17ox beziehen sich jeweils auf die reduzierten bzw. oxidierten synthetisch hergestellten 17-mer- Peptide, die die Sequenz des authentischen Pilinproteins von Pseudomonas, einschließlich Rest 128 bis 144, umfassen. Die Anlagerung synthetisch hergestellter BECs wurde mittels einer Ganzzellen-ELISA-Assay bestimmt unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers PK99H (das sich sowohl an AC17ox und Ac17red anlagert) zur Bestimmung der Menge synthetisch hergestellten, an die Oberfläche von BECs angelagerten Peptids.
BEISPIEL 10: PAK 128-144 HEMMUNG DER PILUSANLAGERUNG AN BECS
• Es wurde eine Immunassay durchgeführt, um die Auswirkungen von PAK 128-144 red auf die Pilusanlagerung an BECs zu beurteilen. Die BECs (0,2 ml bei 2,0 x 10&sup5; BEC/ml) und das synthetische Peptid PAK 128-144 red (0,1 ml, bis die Endkonzentration 0, 40, 80 bzw. 120 nMol/ml synthetisch hergestellten Peptids betrug) wurden bei Raumtemperatur 30 Min. lang vorinkubiert. Anschließend wurden den BECs mit unterschiedlichen synthetisch hergestellten Peptidkonzentrationen (0, 40, 80 für 120 nMol/ml) die Pili (0,1 ml von 0 ug/ml bis 100 ug/ml) beigemengt. Die Gemische wurden dann bei 27ºC zwei Stunden lang inkubiert und gleichzeitig bei 300 UdM gerührt. Die BECs und die gebundenen Pili wurden dann mit Hilfe der Zentrifugation (13.000 x g zwei Min. lang) gewonnen und fünfmal mit PBS zur Entfernung ungebundener Pili gewaschen. Der monoklonale Antikörper PK3B (0,1 ml einer 10&supmin;&sup4;-Lösung in PBS) (dieser Antikörper erkennt PAK-Pili, reagiert aber nicht mit dem synthetisch hergestellten Peptid PAK 128-144) wurde dann den BECs mit gebundenen Pili beigemengt und, wie oben beschrieben, eine Stunde lang inkubiert. Der Rest der Immunassay war derselbe wie der für die Pilusanlagerung an BECs beschriebene. Die Ergebnisse werden in Abbildung 2, die eine modifizierte Lineweaver-Burk-Kurve der Anlagerung der synthetisch hergestellten Ac17red ( )- und Ac17ox (+)-Peptide an humane BECs zeigt, und in Abbildung 3, die eine modifizierte Lineweaver-Burk-Kurve der Anlagerung von PAK-Pili an humane BECs in Gegenwart von 0 (X), 40 (X), 80 (D) und 120 ( ) nMol/ml synthetisch hergestellten Ac17red-Peptids zeigt, dargestellt.
BEISPIEL 11: ANLAGERUNG VON PILI UND PAK 128-144 AN TECS
• Es wurden TECs (0,1 ml von 1 x 10&sup5; Zellen/ml) mit derselben Menge PAK-Pili (345 g/ml), PAK 128-144 red (10 nMol/ml), PAK 128-144 ox (50 nMol/ml) bzw. PBS gemischt. Das Gemisch wurde bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert und bei 300 UdM gerührt. Die TECs wurden mittels Zentrifugation (6.000 x g bei Raumtemperatur eine Minute lang) gewonnen und dreimal mit PBS gewaschen. Den TECs wurden monoklonale Anti-Pilus-Antikörper PK3B ((0,1 ml einer 10&supmin;&sup4;-Verdünnung isolierter IgG mit einem Titer von 10&sup8; in PBS) bzw. monoklonale Antikörper PK99H (0,1 ml einer 10&supmin;³-Verdünnung isolierter IgG mit einem Titer von 10&sup6; in PBS) beigemengt, die mit Pili bzw. den synthetisch hergestellten Peptiden PAK 128-144 red und PAK 128-144 ox inkubiert wurden (PK3B reagiert zwar mit PAK-Pili, ohne die Pilusanlagerung zu beeinträchtigen, jedoch weder mit PAK 128- 144 red noch mit PAK 128-144 ox). Die Kontrollproben enthielten mit den monoklonalen Antikörpern PK3B und PK99H inkubierte TECs in PBS, jedoch weder Pili noch synthetisch hergestellte Peptide. Die TECs wurden dann mittels Zentrifugation gewonnen und dreimal mit PBS gewaschen. Anti- Maus-Hasen-IgG und IgM(H+L)-Affinitäts-isoliertes IgG, das an Fluoresceinisothiocyanat (Cedarlane Laboratories) in PBS (0,2 ml einer 1/100-Verdünnung) konjugiert ist, wurden den gewaschenen TEC-Proben beigemengt, bei 37ºC 30 Min. lang inkubiert und bei 300 UdM gerührt. Die TECs wurden, wie oben beschrieben, dreimal gewaschen und wiederholt in 0,1 ml PBS suspendiert. Es wurden naße Proben vorbereitet und mittels Epifluoreszenz und Phasenkontrastmikroskopie unter Verwendung eines Lietz Laborlux mit einem MPS4 Kamerasystem untersucht. Die Fotographien wurden mit einem Kodak T-Max-Film aufgenommen. Die Ergebnisse werden in Abbildung 4 dargestellt, die die indirekte Immunfluoreszenzlokalisierung von an fraktionierte bewimperte TECs angelagerte PAK-Pili zeigt. Dabei ist A eine mikroskopische Phasenkontrastaufnahme von TECs mit angelagerten PAK-Pili; B eine mikroskopische Immunfluoreszenz-Aufnahme von PAK-Pili, die in erster Linie an die Cilien und den Luminalteil der Cytoplasmamembran derselben bewimperten TECs angelagert sind, die in der mikroskopischen Phasenkontrastaufnahme A bildlich dargestellt werden; C und D ein Phasenkontrast- bzw. ein Immunfluoreszenzbild einer Kontroll-TEC, die den monoklonalen Antikörpern PK3B und den FITC-konjugierten Anti-Maus-Pili, nicht aber den PAK-Pili, ausgesetzt ist. Weitere Ergebnisse werden in Abbildung 5 dargestellt, die die indirekte Immunfluoreszenzlokalisierung der Anlagerung synthetisch hergestellter Ac17ox (A und B)- und Ac17red (C und D)-Peptide an humane bewimperte TECs zeigt. Die mikroskopischen Aufnahmen E und F zeigen Kontrollproben, die nicht den synthetisch hergestellten Peptiden, sondern den monoklonalen Antikörpern PK99H und den FITG-konjugierter Anti-Maus-IgG ausgesetzt sind. Abbildungen A, C und E sind mikroskopische Phasenkontrastaufnahmen derselben Zellen, die in Abbildungen B, D und F durch Immunfluoreszenzmikroskopie dargestellt werden. Es ist zu betonen, daß sich die synthetisch hergestellten Ac17ox- und Ac17red-Peptide beide in erster Linie an die Cilien und den Luminalteil der Cytoplasmamembran der TECs anlagern. Die offensichtlich begrenzte Anlagerung von Ac17ox an die TECs ist auf die geringere Affinität des monoklonalen Antikörpers PK99H bezüglich der oxidierten Form des Peptids gegenüber der reduzierten Form des Peptids zurückzuführen.
BEISPIEL 12: DIE ANLAGERUNG VON PAK 128-144 AN BEC-BLOTS
• Es wurde die von Laemmli und Favre, J. Mol. Biol. (1973) 80: 575-599 beschriebene diskontinuierliche Natriumdodezylsulphat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) angewendet. Die SDS-PAGE von BECs wurde, wie oben beschrieben, unter Verwendung von 8%igen Acrylamidgels durchgeführt. Die BECs (2 x 10&sup5; Zellen/ml) wurden bei 100ºC in 2% (Gew./Vol.) SDS, 5% (Vol/Vol) β-Mercaptoethanol, 10% (Vol/Vol) Glycerol in 0,625 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 6,8 löslich gemacht. Die löslich gemachten BECs (25 ul) wurden auf das Gel aufgetragen und bei 20 mA/Gel (Dauerstrom) elektrophoretisiert. Die elektrophoretisch getrennte Substanz wurde auf Nitrozellulose (Schleicher & Schuell) mittels elektrophoretischem Tranfer aufgebracht, wie von Towbin et al., P.N.A.S. (U.S.A.) (1979) 76: 4350-4354 beschrieben. Nach dem Transfer wurden Nitrozelluloseblots mit 3% (Gew./Vol.) BSA, 0,25% (Gew./Vol.) Gelatin, 0,1% (Vol/Vol) normalen Hasenserum, 0,05% (Vol/Vol) Nonidet P-40, 5 mM EDTA und 150 mM Natriumchlorid in 50 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37ºC mindestens 3 Stunden lang blockiert.
• Vor der Verwendung wurden die Blots mit PBS abgespült. Die Blots wurden dann bei 37ºC mit PAK 128-144red (0 bis 20 nMol/ml) bei 100 UdM inkubiert. Nach zwei Stunden wurden die Blots dreimal mit BBBB (TTBS) gewaschen (10 Min. pro Waschgang). Der monoklonale Maus-Antikörper PK99H (10&supmin;&sup4; Verdünnung in TTBS) (dieser monoklonale Antikörper erkennt das synthetisch hergestellte PAK 128-144-Peptid) wurde bei 37ºC mit dem Blot eine Stunde lang bei 100 UdM inkubiert. Anschließend wurde der Blot dreimal mit TTBS gewaschen. Alkalisches Immunoglobulin-G-Peroxidasekonjugat (Jackson Laboratories) von Anti-Maus-Ziegen-IgG (H+L) wurde TTBS beigemengt und eine Stunde lang, wie oben, inkubiert. Der Blot wurde dann dreimal mit TTBS und einmal mit Tris- gepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Eine Substratlösung (NBT/BCIP) aus 0,33 mg/ml nitroblauem Tetrazolchlorid, 0,165 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat, 100 mM Natriumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid in 100 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 9,5 wurde beigemengt und die Farbbildung durch Abspülen des Blots in destilliertem Wasser unterbunden. Die Ergebnisse werden in Abbildung 4 dargestellt, die die Anlagerung von PAK-Pili und synthetisch hergestelltem Ac17red-Peptid an geblottete BEC-Proteine auf Nitrozellulose zeigt. Die Anlagerung des synthetisch hergestellten Peptids an die immobilisierten Proteine wurde (nach der Blockierung der Nitrozellulose mit BSA) unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers PK99H (bzw. des monoklonalen Antikörpers PK3B für PAK-Pili) gemäß üblicher Immunoblottingverfahren ausgewertet. Mit dem geblotteten BEC- Protein wurden PAK-Pili bei 150 ug/ml (Band 1), Ac17red bei 20 (Band 2), 10 (Band 3), 5 (Band 4) bzw. 0 (Band 5) nMol/ml inkubiert. Die BEC-Proteine wurden oxidiert, indem sie 30 mM Periodat ausgesetzt wurden, und danach mit Boranat vor der Inkubation mit 20 nMol/ml Ac17red (Band 6) bzw. Puffer (Band 7) reduziert. Anfangs wurde Ac17red bei 20 nMol/ml mit 100 ug/ml Fab-Fragmenten des monoklonalen Antikörpers PK99H (der sich an das synthetisch hergestellte Ac17red-Peptid anlagert) (Band 8) bzw. mit 100 ug/ml der Fab-Fragmente des monoklonalen Antikörpers PK41C (Band 9), der sich nicht an das synthetisch hergestellte Ac17red-Polypeptid anlagert, zur Reaktion gebracht. Amid-black färbte die BEC-Proteine (Band 10). Übliche Molekulargewichtmarker färbten sich mit Amid- black (Band S).
BEISPIEL 13: PERIODATOXIDATION VON BEC-BLOTS
• Wie von Woodward et al., J. Immunol. Meth., 78: 143-153 (1985 beschrieben, wurden die BEC-Blots mit Periodat oxidiert (30 mM Periodat) und anschließend mit Kaliumboranat reduziert. Ein bzw. zwei Oxidations-Reduktionszyklen wurden mit vorgeblockten Blots durchgeführt. Wie in Beispiel 12 erläutert, wurden die Blots auf ihre synthetisch hergestellten Peptidbindungen hin ausgewertet. Die Ergebnisse werden auch in Abbildung 4 aufgeführt.
BEISPIEL 14: BLOCKIERUNG DER PILUSANLAGERUNG AN BECS
• Den isolierten PAK-Pili (0,1 ml bei 100 ug/ml) wurde dieselbe Menge FAB-Fragmente von Affinitäts-isolierten IgG, das für die verschiedenen synthetisch hergestellten Peptid-BSA- Konjugate in PBS (0,1 ml bei 0,3 - 0,61 mg/ml) spezifisch ist, beigemengt und bei Raumtemperatur 30 Min. lang inkubiert. Es wurden BECs (0,2 ml bei 2,0 x 105 BECs/ml) beigemengt, das Gemisch bei 37ºC inkubiert und bei 300 UdM in einem Mischer der Fa. New Brunswick gemischt. Nach zwei Stunden wurden die BECs mittels Zentrifugation (13.000 Xg 2 Min. lang) gewonnen und fünfmal mit PBS gewaschen. Der monoklonale Antikörper PK3B (0,2 ml einer 10&supmin;³-Verdünnung in PBS) wurde dem BEC-Pellet beigemengt und wie oben beschrieben eine Stunde lang inkubiert. Die BECs wurden dann mit Hilfe der Zentrifugation gewonnen und fünfmal mit PBS gewaschen. Immunoglobulin-G-Peroxidasekonjugat (Jackson Laboratories) von Anti-Maus-Ziegen-IgG (H+L) wurde dem Gemisch beigemengt und - wie oben beschrieben - 30 Min. lang inkubiert. Die BECs wurden dann mittels Zentrifugation gesammelt und fünfmal mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde noch einmal in 0,2 ml ABTS (2,2'-Azin-Di-(3-Ethylbenzthiazol-Sulfonsäure)) in einem Citratpuffer mit dem pH-Wert 4,2 + 0,03% Peroxid suspendiert und anschließend in ein sauberes Röhrchen gegeben. Die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von 0,2 ml 4 mM NaN&sub3; unterbunden und nach der Entfernung der BECs die optische Dichte bei 405 nm mittels Zentrifugation bestimmt. Am Ende der Assay und vor der Entfernung der BECs durch Zentrifugation wurde die BEC-Konzentration in jedem Röhrchen mittels eines Hämozytometers gemessen. TABELLE 5 Ergebnisse der Blockierungsstudien: Von polyklonalen Antiseren hergestellte FAB-Fragmente, wobei die Antiseren auf das synthetisch hergestellte Peptid 128-144 der PAK-Pilinsequenz in Hasen gebildet wurden Protein (mg/ml)² % der Kontrolle Vor Immunisierung Kontrolle Die Endpunkttitration aller Fabs bei jeder Konzentration mittels ELISA beträgt ca. 10³ 1. Gegenüber den Hintergrund eingestellt. 2. Von Folin-Lowry gemessenes Protein mit BSA als Standard. 3. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt sowie dreimal wiederholt.
BEISPIEL 15: GEWINNUNG DER FAB-FRAGMENTE
• Die FAB-Fragmente wurden unter Verwendung immobilisierten Papains (Pierce) gewonnen. Affinitätsisolierte Antikörper wurden gegen 20mM Cystein-HCl, 10mM Tetranatrium- Ethylendiamintetra-Essigsäure (EDTA) in 20 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2 dialysiert. Dem 0,5 ml imobilisierten Papain wurden Antikörper (wobei 1 ml ca. 2 mg Antikörper enthält) beigemengt, bei 37ºC 20 Stunden lang inkubiert und bei 150 UdM gemischt. Das immobilisierte Papain wurde mittels Zentrifugation entfernt und die überstehende Flüssigkeit, die die Fab-Fragmente enthielt, mit 1 ml PBS verdünnt. Die Fab-Fragmente wurden mittels HPLC unter Verwendung einer mit PBS eluierten Protein-G-Säule isoliert. Die Fab-Fragmente wurden beim Durchfluß gewonnen und die Fc-Fragmente mit 10 mM Glycin mit einem pH-Wert von 2,75 aus der Säule herausgespült. Die Fab- Fragmente wurden konzentriert, indem der Fab-Abfluß in eine Dialysierhülse (mit einem Molekulargewicht des Endpunktes von < 8000) gegeben und die Flüssigkeit unter Verwendung von Polyethylenglykol (mit einem Molekulargewicht von 15.000 - 20.000) aus dem Dialysiersack ausgespült wurde. Die Fragmente wurden dann in PBS dialysiert. Die Aktivität der Fab- Fragmente wurde mittels ELISA geprüft und die Herstellung von FAB-Fragmenten mit SDS-PAGE bestätigt.
BEISPIEL 16: AUSWIRKUNG VON FAB-FRAGMENTEN SYNTHETISCH HERGESTELLTER PEPTIDKONJUGATE ENTSPRECHEND DEN AMINOSÄURESEQUENZEN VON PAK-PILIN AUF AN HUMANE BUKKALE ZELLEN (BECS) ANGELAGERTE PAK- PILI
• Vor der Zugabe von BECs (1 x 105 Zellen/mL Endkonzentration) wurden die Fab-Fragmente mit Pili vorinkubiert. Unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers PK3B wurde eine Pilianlagerung nachgewiesen. Alle Fabs wurden verdünnt, bis ihre Titer an PAK-Pili schließlich 103 betrugen, wie mittels ELISA gemessen wurde. Die Ergebnisse werden im Balkendiagramm von Abbildung 7 dargestellt. Das Balkendiagramm zeigt, daß die in anderen Bereichen als dem C-Terminus von PAK-Pilin gebildeten Fab-Fragmente zur Vermeidung der Pilinanlagerung an BECs unwirksam sind. Die wirksamsten Fragmente sind r1, r2, O1 und O2, die auf die Reste 128-144 gerichtet sind und die die Pilinanlagerung auf 40% bis 70% des Kontrollserums sowie des Serums vor der Immunisierung reduzieren. Dies ist der von Fab 99H aufgezeigten Wirkung ähnlich, das vom monoklonalen Antikörper PK99H von Anti-PAK-Pilin hergestellt wird. Dieser Antikörper ist ebenfalls direkt auf diesen C-Terminus-Bereich gerichtet. Das Balkendiagramm zeigt, daß die C-Terminus-Schlaufenregion, Reste 128-144, an der Pilinanlagerung an BECs in besonderer Weise beteiligt ist. Die Legende zu Abbildung 7 lautet wie folgt: 22 = gegen Reste 22-33 gebildete Fab-Fragmente, 41 = gegen Reste 41-49 gebildete Fab-Fragmente, 58 = gegen Reste 58-70 gebildete Fab-Fragmente, 75 = gegen Reste 75-84 gebildete Fab- Fragmente, 89 = gegen Reste 89-99 gebildete Fab-Fragmente, 107 = gegen 107-116 gebildete Fab-Fragmente, 117 = gegen Reste 117-125 gebildete Fab-Fragmente, r1 = gegen Reste 128- 144 gebildete Fab-Fragmente mit reduzierten Cystein-Resten, r2 = gegen Reste 128-144 gebildete Fab-Fragmente mit reduzierten Cystein-Resten, o1 = gegen Reste 128-144 gebildete Fab-Fragmente mit reduzierten Cystein-Resten, o2 = gegen Reste 128-144 gebildete Fab-Fragmente mit oxidierten Cysteinresten, Pre = von den Seren vor der Immunisierung gebildete Fab-Fragmente, 99H = vom monoklonalen Antikörper PK99H von Anti-PAK-Pilin gebildete Fab-Fragmente, Cont = Anzahl der beigemengten Fab-Fragmente.
• Trotz der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird der Fachmann verstehen, daß es hierzu Varianten gibt, die keine Abweichung vom Geist der Erfindung oder den im Anhang beigefügten Ansprüchen darzustellen.

Claims (15)

1. Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

einschließlich Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (i)-(iii) und innerhalb der Sequenzen (iv)-(vi), und gekennzeichnet sind durch:

(a) eine Disulfidbindung zwischen den beiden Cys-(C)-Resten;

(b) spezifisches Binden an humane bukkale oder humane tracheale Epithelzellen; und

(c) die Fähigkeit zur Stimulation der Erzeugung von Antikörpern, die zur Hemmung der P. aeruginosa-Pilinbindung an humane bukkale Zellen in der Lage sind.

2. Peptid nach Anspruch 1, das eine der folgenden Sequenzen enthält:

einschließlich Aminosäuresequenzen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der (i)-(v) Sequenzen.

3. Peptid nach Anspruch 1, das eine der (i)-(iii) Sequenzen enthält.

4. Peptid nach Anspruch 1, das eine der folgenden Sequenzen enthält:

einschließlich Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (iv)-(vi).

5. Peptid nach Anspruch 4, das eine der (iv)-(vi) Sequenzen enthält.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Impfstoff gegen eine Pseudomonas-Infektion, umfassend

(A) ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

einschließlich Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (i)-(v) und innerhalb der Sequenzen (vi)-(viii), und gekennzeichnet sind durch:

(a) eine Disulfidbindung zwischen den Cys-(C)-Resten;

(b) spezifisches Binden an humane bukkale oder humane tracheale Epithelzellen; und

(c) die Fähigkeit zur Stimulierung der Erzeugung von Antikörpern, die zur Hemmung der P. aeruginosa-Pilinbindung an humane bukkale Zellen in der Lage sind; und

(B) ein steriles, biokompatibles Medium als Träger des Peptids.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin das Peptid eine der folgenden Sequenzen enthält:

einschließlich Aminosäuresequenzen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (i)-(v).

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin das Peptid eine der folgenden Sequenzen enthält:

einschließlich Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (vi)-(viii).

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die darüberhinaus einen immunogenen Träger enthält, an den das Peptid angeheftet ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Verwendung als Impfstoff gegen eine Pseudomonas-Infektion, worin das Peptid zur Stimulierung der Erzeugung von Antikörpern fähig ist, die zur Hemmung der P. aeruginosa- Pilinbindung an humane bukkale Zellen in der Lage sind.

11. Diagnostisches System, das zum Analysieren auf Pseudomona aeruginosa-Pilusprotein geeignet ist, welches umfaßt

(a) Rezeptormoleküle, stimuliert in einem tierischen Wirt durch ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

einschließlich Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (i)-(v) und innerhalb der Sequenzen (vi)-(viii), und

(b) Abzeigemethoden, die zum Signalisieren einer Immunreaktion der Rezeptormoleküle mit dem Pilusprotein in der Lage sind.

12. Diagnostisches Verfahren zum Analysieren auf Pseudomonas aeruginosa-Pilusprotein in einer Probe, welches umfaßt

(a) Bereitstellen eines Peptids mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

einschließlich vn Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (i)-(v) und innerhalb der Sequenzen (vi)-(viii);

(b) Inkubieren des Peptids mit der Probe unter Bedingungen, die zum Bewirken einer Immunreaktion zwischen dem Peptid und den Antikörpern geeignet sind; und

(c) Nachweisen der Immunreaktion.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Peptid eine der Sequenzen (iii)-(v) enthält.

14. Diagnostisches Verfahren zum Analysieren auf Pseudomonas aeruginosa-Pilusprotein in einer Probe, welches umfaßt

(a) Bereitstellen eines Rezeptormoleküls, das in einem tierischen Wirt stimuliert wurde durch ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

einschließlich Aminosäure-Variationen, die innerlich übereinstimmen innerhalb der Sequenzen (i)-(v) und innerhalb der Sequenzen (vi)-(viii);

(b) Inkubieren des Rezeptormoleküls mit der Probe unter Bedingungen, die zum Bewirken einer Immunreaktion zwischen dem Rezeptormolekül und dem Pilusprotein geeignet sind; und

(c) Nachweisen der Immunreaktion.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Rezeptormolekül durch ein Peptid mit einer der Sequenzen (iii)-(v) stimuliert wurde.