DE69333110T2

DE69333110T2 - Mit dem cytotoxin von helicobacter pylori assoziiertes, immunodominantes antigen verwendbar in impfstoffen und zur diagnose

Info

Publication number: DE69333110T2
Application number: DE69333110T
Authority: DE
Inventors: Antonello Covacci; Massimo Bugnoli; John Telford; Giovanni Macchia; Rino Rappuoli
Original assignee: CHIRON SpA SIENA; Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1992-03-02
Filing date: 1993-03-02
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2013-03-03
Also published as: EP0967279B1; WO1993018150A1; CA2131729A1; AU3630093A; DE69334197D1; JP2006055168A; JP3368902B2; US7700755B2; US20040048353A1; US20050276819A1; JP3408494B2; JP2000333686A; US6077706A; CA2131729C; CA2383007A1; DE69333110D1; DE69334197T2; EP0967279A1; JP2000350591A; JPH07504565A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Bereich der Offenbarung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Cytotoxin-assoziierte, immunodominante Antigen von Helicobacter pylori, Gene, die das Protein exprimieren, und die Verwendung des Proteins für diagnostische und Impfanwendungen.
2. Kurze Beschreibung des Fachgebietes
Helicobacter pylori ist ein spiralförmiges, mikroaerophiles, Gram-negatives Bakterium, das zum ersten Mal 1982 aus Magenbiopsien von Patienten mit Chronischer Gastritis isoliert wurde, Warren et al., Lancet i (1983), 12730-75. Ursprünglich Campylobacter pylori genannt, wurde es als Teil einer separaten Gattung mit Namen Helicobacter erkannt, Goodwin et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 39 (1989), 397-405. Das Bakterium besiedelt die menschliche Magenschleimhaut, und die Infektion kann über Jahrzehnte andauern. Während der letzten Jahre wurde die Anwesenheit des Bakteriums mit Chronischer Typ-B-Gastritis in Verbindung gebracht, eine Erkrankung, die in den meisten infizierten Personen asymptomatisch bleiben kann, jedoch das Risiko eines Magengeschwürs und eines Magen-Adenokarzinoms beträchtlich erhöht. Die jüngsten Studien deuten stark darauf hin, daß eine Infektion mit H. pylori entweder eine Ursache oder ein Cofactor für Typ B-Gastritis, Magengeschwüre und Magentumore sein könnte, siehe z. B. Blaser, Gastroenterology 93 (1987), 371 -83; Dooley et al., New Engl. J. Med. 321 (1989), 1562-66; Parsonnet et al., New Engl. J. Med. 325 (1991), 1127-31. H. pylori wird wahrscheinlich auf oralem Weg übertragen, Thomas et al., Lancet i 340 (1992), 1194, und das Risiko einer Infektion steigt mit dem Alter, Graham et al.; Gastroenterology 100 (1991), 1495-1501, und wird durch Überbevölkerung vergößert, Drumm et al., New Engl. J. Med. 4322 (1990), 359-63; Blaser, Clin. Infect. Dis. 15 (1992), 386-93. In den Industrieländern steigt die Anwesenheit von Antikörpern gegen H. pylori-Antigene von weniger als 20% auf über 50% in Menschen im Alter von 30 bzw. 60 Jahren an, Jones et al., Med. Microbio. 22 (1986), 57-62; Morris et al., N. Z. Med. J. 99 (1986), 657-59, während in den Entwicklungsländern über 80% der Bevölkerung bereits im Alter von 20 Jahren infiziert sind, Graham et al., Digestive Diseases and Sciences 36 (1991), 1084-88.
Die Beschaffenheit und die Rolle der Virulenzfaktoren von H. pylori werden noch schlecht verstanden. Die Faktoren, die bislang identifiziert wurden, schließen die Flagellen ein, die möglicherweise für die Beweglichkeit in der Mucus-Schicht notwendig sind, siehe z. B. Leying et al., Mol. Microbiol. 6 (1992), 2863-74; die Urease, die für die Neutralisierung der sauren Umgebung des Magens notwendig ist und die anfängliche Besiedelung erlaubt, siehe z. B. Cussac et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 2466-73; Perez – Perez et al., J. Infect. Immun. 60 (1992), 3658-3663; Austin et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 7470-73; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/04030; und ein hochmolekulares cytotoxisches Protein, das von Monomeren mit einem angegebenen Molekulargewicht von 87 kDa gebildet wird, das die Bildung von Vakuolen in eukaryotischen Epithelzellen verursacht und von H. pylori-Stämmen produziert wird, die mit Erkrankungen im Zusammenhang stehen, siehe z.B. Cover et al., J. Bio. Chem. 267 (1992), 10570-75 (Hinweis auf ein "vakuolisierendes Toxin" mit einer aufgeführten N-terminalen Sequenz von 23 Aminosäuren); Cover et al., J. Clin. Invest. 90 (1992), 913-18; Leunk, Rev. Infect. Dis. 13 (1991), 5686-89. Darüberhinaus ist das Folgende ebenfalls bekannt.
Von verschiedenen Autoren wurde gezeigt, daß Kulturüberstände von H. pylori ein Antigen mit einem Molekulargewicht von 120, 128, 130 oder 132 kDa enthalten, Apel et al., Zentralblatt für Bakteriol. Microb. und Hygiene 268 (1988), 271-76; Crabtree et al., J. Clin. Pathol. 45 (1992), 733-34; Cover et al., Infect. Immun. 58 (1990), 603-10; Figura et al. (1990), in: Malfertheiner et al. (Hrsg.), H. pylori, gastritis and peptic ulcer, Berlin: Springer Verlag; Cover and Blaser (1989) Gastroenterology 96: abstracts A 101. Ob der Unterschied in der Größe des Antigens auf Unterschiede bei der Abschätzung des Molekulargewichts des gleichen Proteins in verschiedenen Labors, auf Größenvariabilität des gleichen Antigens, oder wirklich auf verschiedene Proteine zurückzuführen ist, war nicht klar. Es gab keine Information über Nukleotid- oder Aminosäuresequenz für das Protein. Dieses Protein ist in infizierten Menschen sehr immunogen, da spezifische Antikörper in den Seren fast aller Patienten nachgewiesen werden, die mit H. pylori infiziert sind, Gerstenecker et al., Eur. J. Clin. Microbiol. 11 (1992), 595-601.
Hitzeschockproteine (hsp) von H. pylori wurden beschrieben, Evans et al., Infect. Immun. 60 (1992), 2125-27 (44 Aminosäuren N-terminale Sequenz und ein Molekulargewicht von ungefähr 62 kDa); Dunn et al., Infect. Immun. 60 (1992), 1946-51 (33 in der N-terminalen Sequenz gefundene Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ungefähr 54 kDa); Austin et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 7470-73 (37 in der N-terminalen Sequenz gefundene Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ungefähr 60 kDa). Austin et al. schlagen vor, daß diese in Wirklichkeit das gleiche Protein mit identischen Aminosäuresequenzen an ihrem N-Terminus sind.
Für Beispiele diagnostischer Tests auf der Grundlage von H. pylori-Lysaten oder teilweise gereinigten Antigenen siehe Evans et al., Gastroenterology 96 (1989), 1004 – 08; U. S. 4,882,271; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/08843 (alle betreffen Zusammensetzungen und Tests, die die gleichen hochmolekularen Antigene (300–700 kDa) von der Oberfläche der äußeren Membran mit Urease-Aktivität beinhalten); EPO-Veröffentlichung Nr. 329 570 (betrifft ein Mittel aus Antigenen zum Nachweis von H. pylori-Antikörpern mit Fragmenten von mindestens einem Fragment aus der Gruppe mit 63, 57, 45, und 31 kDa).
Der Prozentsatz von Menschen, die mit H. pylori infiziert sind, entweder in einer symptomatischen oder asymptomatischen Form, ist sowohl in den Entwicklungsländern als auch in den Industrieländern sehr hoch, und die Kosten für Krankenhausaufenthalt und Therapie machen die Entwicklung von H. pylori-Impfstoffen und weiteren diagnostischen Tests für diese Erkrankung wünschenswert.
INHALT DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für das "Cytotoxin-assoziierte immunodominante" (CAI) Antigen von H. pylori, dessen Aminosäuresequenz und Gen unbekannt waren. Die Erfindung betrifft nicht nur diese gereinigten Proteine und ihre Gene, sondern auch damit zusammenhängendes rekombinantes Material, wie Vektoren und Wirtszellen. Das Verständnis der Beschaffenheit und der Rolle des Proteins auf molekularer Ebene und die Verfügbarkeit einer rekombinanten Herstellung hat bedeutende Folgen für die Entwicklung neuer Diagnostika für H. pylori und für den Entwurf von Impfstoffen, die die Infektion mit H. pylori verhindern und die Erkrankung behandeln könnten.
Das Protein kann daher sowohl in Impfungen als auch in diagnostischen Anwendungen verwendet werden. Die vorliegende Erfindung schließt Methoden zur Behandlung und zur Diagnose dieser mit H. pylori assoziierten Erkrankungen ein. Da H. pylori mit Typ-B-Gastritis, Magengeschwüren, und dem Magen-Adenokarzinom in Zusammenhang gebracht wurde, ist zu hoffen, daß die vorliegende Erfindung zu einer frühen Erkennung und einer Linderung dieser Erkrankungszustände beitragen wird. Gegenwärtig beruht die Diagnose hauptsächlich auf Endoskopie und histologischer Anfärbung von Biopsien; existierende Immuntests basieren auf H. pylori-Lysaten oder teilweise gereinigten Antigenen. Angesichts der in solchen Ansätzen gefundenen Heterogenität ist die Korrelation mit den Erkrankungszuständen noch nicht gut etabliert. Das Potential für rekombinante Immuntests auf Basis von Antigenen wie auch Nukleinsäure-Tests zur Erkennung der Erkrankung ist daher groß. Gegenwärtig gibt es im Handel keine Impfung gegen eine H. pylori-Infektion oder zur Behandlung. Ein rekombinanter Impfstoff ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Endung ist in den Patentansprüchen genau bezeichnet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nukleotidsequenz für das Cytotoxin (CT) Protein (zur Information).
2 zeigt die Aminosäuresequenz für das Cytotoxin (CT) Protein (zur Information).
3 zeigt eine Karte des cai-Gens für das CAI-Protein und eine Zusammenstellung der Klone, die zur Identifizierung und Sequenzierung dieses Gens dienten. 4 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des CAI-Antigens.
5 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des Hitzeschockproteins (hsp) (zur Information).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Allgemeine Methoden
Die Ausführung der vorliegenden Endung verwendet, wenn nicht anders angegeben, konventionelle Techniken aus Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA, und Immunologie, die Stand der Technik des Fachgebietes sind. Diese Techniken werden ausführlich in der Literatur abgehandelt. Siehe z.B. Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING; A LABORATRY MANUAL (ZWEITE AUFLAGE); Glover, D. N. (Hrsg.) (1985), DNA CLNING, BÄNDE I UND II; Gait, M.J. (Hrsg.) (1984), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS; Hames B. D. & Higgins S. J. (Hrsg.) (1984), NUCLEIC ACID HYBRIDIZATIN; Hames B. D. & Higgins S. J. (Hrsg.) (1984), TRANSCRIPTIN AND TRANSLATIN; Freshney, R. I. (Hrsg.) (1986), ANIMAL CELL CULTURE; IMMBILIZED CELLS AND ENZYMES (1986), IRL Press; Perbal, B. (1984), A PRACTICAL GUIDE TO MLECULAR CLONING; die Serie METHODS IN ENZYMOLGY, Academic Press, Inc.; Miller, J. H. and Calos, M. P. (Hrsg.) (1987), GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, Cold Spring Harbor Laboratory, Wu and Grossman (Hrsg.) bzw. Wu (Hrsg.), Methods in Enzymology, Vol. 154 bzw. Vol. 155, Mayer and Walker (Hrsg.) (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MLECULAR BIOLOGY, London: Academic Press, Scopes (1987), PRTEIN PURIFICATIN: PRINCIPLES AND PRACTICE (Zweite Auflage), N. Y: Springer Verlag, und Weir, D. M. and Blackwell, C. C. (Hrsg.) (1986), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLGY, BÄNDE I–IV.
In dieser Patentbeschreibung werden die Standardabkürzungen für Nukleotide und Aminosäuren verwendet.
B. Definitionen
"Cytotoxin", "cytotoxisches Protein" oder "Toxin" von H. pylori bezeichnet das Protein, und Teile davon, dessen Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz in 1 bzw. 2 gezeigt werden, und ihre Derivate, und dessen Molekulargewicht ungefähr 140 kDa beträgt. Dieses Protein dient als Vorläufer eines Proteins mit einem ungefähren Molekulargewicht von 100 kDa und mit cytotoxischer Aktivität. Das Cytotoxin verursacht Vakuolisierung und Tod einer Anzahl eukaryotischer Zelltypen und wurde aus H. pylori-Kulturüberständen aufgereinigt. Darüberhinaus ist das Cytotoxin proteinös und hat ein scheinbares, durch Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht von ungefähr 950–972 kDa. Denaturierende Gelelektrophorese von gereinigtem Material hatte früher ergeben, daß die Hauptkomponente des 950–972 kDa Moleküls angeblich ein Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 87 kDa war, Cover et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 10570–75. Es wird jedoch hier vorgeschlagen, daß das ursprünglich beschriebene 87 kDa Protein entweder aus einer weiteren Prozessierung des 100 kDa Proteins oder aus dem proteolytischen Abbau eines größeren Proteins während der Aufreinigung hervorgeht.
Das "Cytotoxin-assoziierte immunodominante" (CAI) Antigen bezeichnet das Protein, und Teile davon, dessen Aminosäuresequenz in 4 beschrieben wird und Derivate hiervon. Es ist ein hydrophiles, an der berfläche liegendes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 120–132 kDa, bevorzugt 128–130 kDa, das von klinischen Isolaten produziert wird. Die Größe des Gens und des darauf kodierten Proteins variieren in verschiedenen Stämmen durch einen Mechanismus, der die Duplikation von Bereichen innerhalb des Gens beinhaltet. Die klinischen Isolate, die das CRI-Antigen nicht produzieren, besitzen das cai-Gen nicht, und können auch kein aktives Cytotoxin produzieren. Der Zusammenhang zwischen der Anwesenheit des cai-Gens und der Cytotoxizität legt nahe, daß das Produkt des cai-Gens für die Transkription, die Faltung, den Export oder die Funktion des Cytotoxins erforderlich ist. Alternativ fehlen sowohl das Cytotoxin (CT) als auch das cai-Gen in nicht cytotoxischen Stämmen. Dies deutet auf eine physikalische Verbindung beider Gene hin. Eine besondere Eigenschaft des CRI-Antigens ist die Größenvariabilität, die nahelegt, daß das cai-Gen sich fortlaufend verändert. Das CRI-Antigen scheint mit der Zelloberfläche assoziiert zu sein. Dies legt den Schluß nahe, daß die Freisetzung des Antigens in den Überständen möglicherweise auf die Einwirkung von Proteanen im Serum zurückzuführen ist, die entweder das Antigen selbst oder die Komplexe, die das CRI-Antigen an der Bakterienoberfläche festhalten, spalten. Ähnliche Prozessierungsaktivitäten setzen das Antigen möglicherweise während des Wachstums in vivo frei. Das Fehlen einer typischen Signalpeptidsequenz legt die Anwesenheit eines unabhängigen Exportsystems nahe.
"Hitzeschockprotein" (hsp) bezeichnet das H. pylori-Protein, und Teile davon, dessen Aminosäuresequenz in 5 angegeben wird, und Derivate hiervon, und dessen Molekulargewicht im Bereich von 54–62 kDa, bevorzugt von 58–60 kDa liegt. Dieses hsp gehört zu einer Gruppe von Hitzeschockproteinen Gram-negativer Bakterien, hsp 60. Im Allgemeinen gehören hsp zu den am meisten konservierten Proteinen in allen lebenden rganismen, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, Tieren und Pflanzen, und die Konservierung betrifft die gesamte Sequenz. Diese hohe Konservierung legt eine Beteiligung der gesamten Sequenz an der funktionellen Struktur des Proteins nahe, die kaum verändert werden kann, ohne seine Aktivität zu beeinträchtigen.
Beispiele von Proteinen, die in der vorliegenden Endung verwendet werden können, schließen Polypeptide mit geringfügigen Aminosäurevariationen der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins ein; insbesondere konservative Aminosäureaustausche werden betrachtet. Konservative Austausche sind solche, die innerhalb einer in ihren Seitenketten verwandten Familie ablaufen. Genetisch codierte Aminosäuren sind im allgemeinen in vier Familien unterteilt: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan, und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Zum Beispiel ist es ziemlich vorhersagbar, daß ein isolierter Austausch eines Leucins gegen ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats gegen ein Glutamat, eines Threonins gegen ein Serin, oder ein ähnlicher konservativer Austausch einer Aminosäure mit einer strukturell verwandten Aminosäure keinen wesentlichen Einfluß auf die biologische Aktivität haben wird. Polypeptidmoleküle mit einer im wesentlichen gleichen Aminosäuresequenz wie das Protein, aber mit geringfügigen Aminosäureaustauschen, die die funktionellen Aspekte nicht grundlegend beeinflußen, liegen innerhalb der Definition des Proteins.
Ein wesentlicher Vorteil der Produktion des Proteins durch rekombinante DNA-Techniken gegenüber der Isolierung und Reinigung eines Proteins aus natürlichen Quellen besteht darin, daß gleichwertige Proteinmengen aus weniger Ausgangsmaterial produziert werden können, als für eine Isolierung des Proteins aus einer natürlichen Quelle erforderlich wäre. Die Produktion eines Proteins durch rekombinante Techniken erlaubt auch die Isolierung des Proteins in Abwesenheit einiger Moleküle, die normalerweise in Zellen vorhanden sind. In der Tat können leicht Proteinpräparationen hergestellt werden, die gänzlich frei von jeder Spur humaner Protein-Kontaminanten sind, weil das einzige Humanprotein, das von der rekombinanten nicht-humanen Wirtszelle hergestellt wird, das betreffende rekombinante Protein ist. Mögliche virale Wirkstoffe aus natürlichen Quellen und für den Menschen pathogene virale Bestandteile werden dadurch ebenso vermieden.
Der Begriff "rekombinantes Polynukleotid", wie hier verwendet, meint ein Polynukleotid genomischen, cDNA-, teilsynthetischen, oder synthetischen Ursprungs, das aufgrund seines Ursprungs oder Manipulation: (1) nicht mit dem vollständigen oder einem Teil des Polynukleotides verbunden ist, mit dem es in der Natur verbunden ist, (2) mit einem anderen Polynukleotid verbunden ist als demjenigen, mit dem es in der Natur verbunden ist, oder (3) in der Natur nicht vorkommt. Dieser Begriff schließt daher auch den Umstand ein, in dem das H. pylori-Bakteriengenom genetisch verändert wird (z.B. durch Mutagenese), um ein oder mehrere veränderte Polypeptide herzustellen.
Der Begriff "Polynukleotid", wie hier verwendet, bezeichnet die polymere Form eines Nukleotids jeglicher Länge, bevorzugt Desoxyribonukleotide, und wird hier austauschbar mit den Begriffen "ligonukleotid" und "ligomer" verwendet. Der Begriff bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Der Begriff schließt daher doppel- und einzelsträngige DNA, sowie Antisense-Polynukleotide ein. Er schließt auch bekannte Arten der Modifikation ein, zum Beispiel, die Anwesenheit von Markierungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, Methylierung, Kopfgruppen (End-"Caps"), Ersatz von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide durch ein Analogon, Internukleotid-Modifikationen wie, zum Beispiel, Austausch gegen bestimmte Typen ungeladener Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphortriester, Phosphoramidate, Carbamate, usw.) oder geladene Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, usw.), Einführung überhängender Einheiten, wie, zum Beispiel, Proteine (eingeschlossen Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, usw.), Intercalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, usw.), Chelatoren (z. B. Metalle, radioaktive Spezies, Bor, oxidative Einheiten, usw.), alkylierende Verbindungen (z. B. alpha-anomerische Nukleinsäuren, usw.).
Mit "genomisch" ist eine Sammlung oder eine Genbank von DNA-Molekülen gemeint, die sich aus Restriktionsfragmenten ableiten, die in Vektoren kloniert wurden. Dies kann das gesamte oder einen Teil des genetischen Materials eines rganismus einschließen.
Mit "cDNA" ist eine komplementäre mRNA-Sequenz gemeint, die mit einem komplementären mRNA-Strang hybridisiert.
Der Begriff "ligomer", so wie hier verwendet, bezieht sich sowohl auf Primer als auch auf Sonden und wird hier austauschbar mit dem Begriff "Polynukleotid" verwendet. Der Begriff ligomer bedeutet nicht zugleich die Größe des Moleküls. Typischerweise sind ligomere jedoch nicht länger als 1000 Nukleotide, typischer nicht länger als 500 Nukleotide, noch typischer nicht länger als 250 Nukleotide; sie können nicht länger als 100 Nukleotide, und sie können nicht länger als 75 Nukleotide sein, und sie können auch nicht länger als 50 Nukleotide sein.
Der Begriff "Primer", so wie hier verwendet, bezeichnet ein ligomer, das als Startpunkt für die Synthese eines Polynukleotidstrangs bei Anwendung geeigneter Reaktionsbedingungen fungieren kann. Der Primer ist vollständig oder im wesentlichen komplementär zu einem Bereich des Polynukleotidstranges, der kopiert werden soll. Der Primer lagert sich daher unter Bedingungen, die eine Hybridisierung begünstigen, an den komplementären Bereich des Analytstrangs an. Nach Zugabe geeigneter Reaktionspartner (z. B. eine Polymerase, Nukleotidtriphosphate, und ähnliche), wird der Primer durch den polymerisierenden Wirkstoff verlängert, um eine Kopie des Analytstrangs zu bilden. Der Primer kann einzelsträngig oder in einer anderen Ausführungsform auch teilweise oder vollständig doppelsträngig sein.
Die Begriffe "Analytpolynukleotid" und "Analytstrang" beziehen sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, von dem angenommen wird, daß es eine Zielsequenz enthält, und das in einer biologischen Probe vorhanden sein kann.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Sonde" auf eine aus einem Polynukleotid bestehende Struktur, die aufgrund der Komplementarität wenigstens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz im Bereich des Zieles eine Hybridstruktur mit einer Zielsequenz bildet. Die Polynukleotidbereiche der Sonden können sich aus DNA, und/oder RNA, und/oder synthetischen Nukleotidanaloga zusammensetzen. Eingeschlossen in die Sonden sind "Fangsonden" und "Markierungssonden".
Der Begriff "Zielbereich", so wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Bereich der Nukleinsäure, der amplifiziert und/oder detektiert werden soll. Der Begriff "Zielsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer ein stabiles Hybrid unter den erwünschten Bedingungen bildet.
Der Begriff "Fangsonde", so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Polynukleotidsonde, die ein mit einem Bindungspartner gekoppeltes einzelsträngiges Polynukleotid enthält. Das einzelsträngige Polynukleotid enthält eine Ziel-Polynukleotidsequenz, die komplementär zu einer Zielsequenz in einem Zielbereich ist, die in dem Analytpolynukleotid nachgewiesen werden soll. Dieser komplementäre Bereich ist ausreichend lang und komplementär zur Zielsequenz, um einen stabilen Doppelstrang zu ermöglichen, der ausreichend ist, um das Analytpolynukleotid an einer festen berfläche (über die Bindungspartner) zu immobilisieren. Der Bindungspartner ist spezifisch für einen zweiten Bindungspartner; der zweite Bindungspartner kann an die berfläche eines festen Trägers gebunden sein, oder kann indirekt über andere Strukturen oder Bindungspartner mit einem festen Träger verbunden sein.
Der Begriff "zielende Polynukleotidsequenz", so wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Polynukleotidsequenz, die Nukleotide enthält, die komplementär zu einer Ziel-Nukleotidsequenz sind; die Sequenz ist ausreichend lang und komplementär zur Zielsequenz, um einen Doppelstrang zu bilden, der eine ausreichende Stabilität für den vorgesehenen Zweck hat.
Der Begriff "Bindungspartner", so wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das in der Lage ist, ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität zu binden, wie zum Beispiel ein Antigen und ein dafür spezifischer Antikörper. Im allgemeinen müssen die spezifischen Bindungspartner mit ausreichender Affinität binden, um den Doppelstrang aus Analytkopie/Komplementärstrang (im Falle der Fangsonden) unter den Bedingungen der Isolierung zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind auf dem Fachgebiet bekannt, und schließen, zum Beispiel, Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen Rezeptor-Liganden Paare, und komplementäre Polynukleotidstränge ein. Im Falle von komplementären Polynukleotid-Bindungspartnern sind die Partner normalerweise mindestens 15 Basen lang, und können mindestens 40 Basen lang sein; zusätzlich haben sie einen G- und C-Gehalt von mindestens ungefähr 40% bis hin zu ungefähr 60%. Das Polynukleotid kann aus DNA, RNA, oder synthetischen Nukleotidanaloga bestehen.
Dr Begriff "gekoppelt", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Verknüpfung durch kovalente Bindungen oder durch starke nicht-kovalente Wechselwirkungen (z. B. hydrophobische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, usw.). Kovalente Bindungen können zum Beispiel Ester-, Ether-, Phosphorester-, Amid-, Peptid-, Imid-, Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen, Kohlenstoff-Phosphor-Bindungen, und ähnliche sein.
Der Begriff "Träger" bezieht sich auf jede feste oder halbfeste berfläche, an der ein gewünschter Bindungspartner verankert sein kann. Geeignete Träger schließen Glas, Plastik, Metall, Polymer-Gele und ähnliche ein, und können die Form von Kügelchen, Vertiefungen, Dipsticks, Membranen, und ähnliche haben.
Der Begriff "Markierung", wie hier verwendet, bezieht sich auf jedes Atom oder jede Einheit, das oder die zur Erzeugung eines detektierbaren (vorzugsweise quantifizier baren) Signals verwendet und mit einem Polynukleotid oder Polypeptid verknüpft werden kann.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Markierungssonde" auf eine Polynukleotidsonde, die eine zielsuchende Polynukleotidsequenz enthält, die zu einer im Analytpolynukleotid nachzuweisenden Zielsequenz komplementär ist. Dieser komplementäre Bereich ist ausreichend lang und komplementär zur Zielsequenz, um einen Doppelstrang aus der "Markierungsprobe" und der "Zielsequenz" zu ermöglichen. Die Markierungsprobe ist entweder direkt mit einer Markierung, oder indirekt über eine Gruppe von Ligandenmolekülen mit hoher Spezifität für einander, eingeschlossen Multimere, gekoppelt.
Der Begriff "Multimer", wie hier verwendet, bezieht sich auf lineare oder verzweigte Polymere der gleichen, sich wiederholenden Polynukleotideinheit oder verschiedener einzelsträngiger Polynukleotideinheiten. Mindestens eine der Einheiten hat eine Sequenz, eine Länge und eine Zusammensetzung, die es ihr erlaubt, spezifisch an eine erste einzelsträngige Nukleotidsequenz von Interesse zu hybridisieren, typischerweise an einen Analyt oder an eine an einen Analyt gebundene Polynukleotidsonde (z. B. eine Markierungssonde). Um eine solche Spezifität und Stabilität zu ermöglichen, ist diese Einheit mindestens ungefähr 15 Nukleotide lang, typischerweise nicht mehr als 50 Nukleotide lang, und bevorzugt ungefähr 30 Nukleotide lang; darüberhinaus beträgt der G- und C-Gehalt normalerweise mindestens ungefähr 40% und höchstens ungefähr 60%. Zusätzlich zu einer solchen Einheit (solchen Einheiten) schließt das Multimer eine Vielzahl von Einheiten ein, die in der Lage sind, spezifisch und stabil an ein zweites einzelsträngiges Nukleotid von Interesse, typischerweise ein markiertes Polynukleotid oder ein anderes Multimer, zu hybridisieren. Diese Einheiten haben im allgemeinen etwa die gleiche Größe und Zusammensetzung wie die oben angeführten Multimere. Wenn ein Multimer entworfen wird, um mit einem anderen Multimer hybridisiert zu werden, sind die erste und die zweite ligonukleotideinheit heterogen (verschieden), und hybridisieren unter den Bedingungen des ausgewählten Assays nicht miteinander. Daher können Multimere Markierungssonden sein, oder Liganden, die die Markierung an die Sonde koppeln.
Ein "Replikon" ist jedes genetische Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid, usw., das sich wie eine eigenständig replizierende Polynukleotideinheit innerhalb einer Zelle verhält; d. h., befähigt zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle. Dies kann selektierbare Marker einschließen.
"PCR" bezieht sich auf die Technik der Polymerase-Kettenreaktion wie beschrieben in Saiki et al., Nature 324 (1986), 163; und Scharf et al., Science 233 (1986), 1076-1078; und US 4,683,195 ; und US 4,683,202 .
Wie hier verwendet, ist x "heterolog" in Bezug auf y, wenn x nicht natürlicherweise mit y in der identischen Weise verbunden ist; d. h., x ist in der Natur nicht mit y verbunden oder x ist nicht in der gleichen Weise mit y wie in der Natur verbunden.
"Homologie" bezieht sich auf den Grad der Ähnlichkeit zwischen x und y. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz einer Form mit einer anderen kann durch im Fachgebiet bekannte Techniken bestimmt werden. Zum Beispiel kann sie durch direkten Vergleich der Sequenzinformation des Polynukleotids bestimmt werden. Alternativ kann die Homologie durch Hybridisierung der Polynukleotide unter Bedingungen bestimmt werden, bei denen sich stabile Doppelstränge zwischen homologen Bereichen ausbilden (zum Beispiel solche, die vor einem S1-Verdau verwendet würden), gefolgt von einer Spaltung mit einer für Einzelstränge spezifischen Nuklease (mit für Einzelstränge spezifische Nukleasen), gefolgt von einer Größenbestimmung der gespaltenen Fragmente.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, mit dem ein anderes Polynukleotidsegment verbunden ist, so daß die Replikation und/oder Expression des verbundenen Segmentes bewerkstelligt wird.
"Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynukleotidsequenzen, die erforderlich sind, um eine Expression der kodierenden Sequenzen zu bewirken, mit denen sie ligiert sind. Die Beschaffenheit solcher Kontrollsequenzen differiert in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus; in Prokaryoten schließen solche Kontrollsequenzen meistens einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle, und eine Transkriptions-Terminationssequenz ein; in Eukaryoten schließen solche Kontrollsequenzen meistens Promotoren und eine Transkriptions-Terminationssequenz ein. Der Begriff "Kontrollsequenz" soll mindestens alle Komponenten einschließen, deren Anwesenheit für eine Expression erforderlich ist, und kann auch zusätzliche Komponenten einschließen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, zum Beispiel Signalsequenzen und Fusionspartnersequenzen.
"Funktionell verbunden" bezieht sich auf eine räumliche Nähe, in der sich die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, die es ihnen erlaubt, in der geplanten Weise zu funktionieren. Eine mit einer kodierenden Sequenz "funktionell verbundene" Kontrollsequenz ist auf solche Art ligiert, daß die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
Ein "offener Leserahmen" (RF) ist der Bereich einer Polynukleotidsequenz, der ein Polypeptid kodiert; dieser Bereich kann einen Teil der kodierenden Sequenz oder die vollständige kodierende Sequenz repräsentieren.
Eine "kodierende Sequenz" ist eine Polynukleotidsequenz, die in ein Polypeptid übersetzt wird, normalerweise über eine mRNA, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Translations-Startcodon am 5'-Ende und ein Translations-Stopcodon am 3'-Ende bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann cDNA und rekombinante Polynukleotidsequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Polypeptid" auf ein Polymer aus Aminosäuren und bezieht sich nicht auf eine bestimmte Länge des Produkts; daher sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in die Definition von Polypeptid eingeschlossen. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf Modifikationen des Polypeptids nach der Expression oder schließt diese aus, zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen. Eingeschlossen in die Definition sind, zum Beispiel, Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (eingeschlossen, zum Beispiel, nicht natürliche Aminosäuren, usw.), Polypeptide mit substituierten Bindungen, wie auch andere im Fachgebiet bekannte Modifikationen, die sowohl natürlich als auch nicht natürlich vorkommen.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz "abgeleitet von" einer bestimmten Nukleinsäuresequenz bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Sequenz identisch zu der eines in dieser Sequenz kodierten Polypeptids besitzt, oder einen Teil davon, wobei der Teil aus mindestens 3 – 5 Aminosäuren besteht, und stärker bevorzugt mindestens 8 – 10 Aminosäuren, und besonders bevorzugt mindestens 11 – 15 Aminosäuren, oder das mit einem in dieser Sequenz kodierten Polypeptid immunologisch identifizierbar ist. Diese Terminologie schließt auch ein durch eine bestimmte Nukleinsäuresequenz exprimiertes Polypeptid ein.
"Immunogen" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids, eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort hervorzurufen, entweder alleine oder verbunden mit einem Träger, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Adjuvans. "Neutralisierung" bezieht sich auf eine Immunantwort, die die Infektiösität eines infektiösen Wirkstoffes entweder teilweise oder vollständig blockiert.
"Epitop" bezieht sich auf eine antigene Determinante eines Peptids, Polypeptids oder Proteins; ein Epitop kann drei oder mehr Aminosäuren in einer dem Epitop eigenen räumlichen Konformation enthalten. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens 5 solcher Aminosäuren und, eher üblich, aus mindestens 8–10 solcher Aminosäuren. Methoden zur Bestimmung der räumlichen Konformation von Aminosäuren sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen, zum Beispiel, Röntgenkristallographie und zweidimensionale Kernmagnetresonanz ein. Antikörper, die das gleiche Epitop erkennen, können in einem einfachen Immuntest bestimmt werden, der die Fähigkeit eines Antikörpers zeigt, die Bindung eines anderen Antikörpers an ein Zielprotein zu blockieren.
"Behandlung", wie hier verwendet, bezieht sich auf Prophylaxe und/oder Therapie (d. h. die Modulation jeglicher Krankheitssymptome). Ein "Individuum" weist auf ein Tier hin, daß empfänglich für eine Infektion mit H. pylori ist und schließt Primaten, eingeschlossen Menschen, ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Ein "Impfstoff' ist ein immunogenes, oder anderweitig befähigtes, einen Schutz, ob teilweise oder vollständig, gegen H. pylori hervorrufendes, zur Behandlung eines Individuums verwendbare Mittel.
Die H. pylori-Proteine können für die Herstellung von entweder monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden, die spezifisch für die Proteine sind. Die Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper sind auf dem Fachgebiet bekannt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellkulturen" und ähnliche Begriffe bezeichnen, zum Beispiel, Mikroorganismen, Insektenzellen, und Säugerzellen, die als Empfänger für einen rekombinanten Vektor oder andere übertragene DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und schließen die Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle ein. Es versteht sich, daß die Nachkommen einer einzelnen Mutterzelle aufgrund von natürlichen, zufälligen oder absichtlichen Mutationen nicht notwendigerweise in Morphologie oder der genomischen oder gesamten DNA vollständig identisch zur ursprünglichen Mutterzelle sein müssen. Beispiele für Säuger-Wirtszellen schließen Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CH) und Affennierenzellen (CS) ein.
"Zelllinie", wie hier verwendet, bezieht sich spezifisch auf eine Population von Zellen, die zu beständigem oder verlängertem Wachstum und Teilung in vitro befähigt sind. Häufig sind Zelllinien von einer einzelnen Vorläuferzelle abgeleitete klonale Populationen. Auf dem Fachgebiet ist weiterhin bekannt, daß spontane oder induzierte Veränderungen im Karyotyp während der Lagerung oder des Transfers solcher klonaler Populationen auftreten können. Daher müssen Zellen, die sich von der bezeichneten Zelllinie ableiten, nicht exakt identisch mit den Vorläuferzellen oder -kulturen sein, und die bezeichnete Zelllinie enthält solche Varianten. Der Begriff "Zelllinie" schließt auch immortalisierte Zellen ein. Zelllinien schließen bevorzugt nicht-hybride Zelllinien oder Hybridome aus nur zwei Zellarten ein.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff "Mikroorganismen" prokaryotische und eukaryotische mikrobielle Spezies ein, wie Bakterien und Pilze, wobei letztere Hefen und filamentöse Pilze einschließen.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Transformation" auf die Insertion eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für die Insertion verwendeten Verfahrens, zum Beispiel direkte Aufnahme, Transduktion, Übertragung durch F-Plasmide oder Elektroporation. Das exogene Polynukleotid kann als nicht-integrierter Vektor, zum Beispiel als Plasmid erhalten bleiben, oder kann in einer anderen Ausführungsform in das Wirtsgenom integriert werden.
"Gereinigt" und "isoliert" mit Bezug auf eine Polypeptid- oder Nukleotidsequenz bedeutet, daß das angegebene Molekül praktisch frei von anderen biologischen Makromolekülen der gleichen Art vorliegt. Der Begriff "gereinigt", wie hier verwendet, bedeutet die Anwesenheit von bevorzugt mindestens 75 Gew.-%, stärker bevorzugt mindestens 85 Gew.-%, noch stärker bevorzugt mindestens 95 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 98 Gew.-% biologischer Makromoleküle der gleichen Art (aber Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000, können anwesend sind).
C. Nukleinsäure Tests
Unter Verwendung des Genoms von H. pylori als Grundlage können Polynukleotid-Sonden von ungefähr 8 Nukleotiden oder mehr hergestellt werden, die mit dem (den) positiven Strang (Strängen) der RNA oder ihrem Komplement, wie auch mit cDNAs hybridisieren. Diese Polynukleotide dienen als Sonden zum Nachweis, zur Isolierung und/oder Markierung von Polynukleotiden, die Nukleotidsequenzen enthalten, und/oder als Primer für die Transkription und/oder Replikation der Zielsequenzen. Jede Sonde enthält eine zielsuchende Polynukleotidsequenz, die Nukleotide enthält, die zur Ziel-Nukleotidsequenz komplementär sind; die Sequenz ist ausreichend lang und komplementär zur Sequenz um einen für die vorgesehene Anwendung genügend stabilen Doppelstrang zu bilden. Wenn zum Beispiel der Zweck in der Isolierung eines Analyten, der eine Zielsequenz enthält, durch Immobilisierung besteht, enthält die Sonde einen Polynukleotidbereich, der ausreichend lang und komplementär zur Zielsequenz ist, um eine ausreichende Doppelstrangstabilität zu erlauben, um den Analyten unter den Bedingungen der Isolierung an einer festen berfläche zu immobilisieren. Auch wenn die Polynukleotidsonden zum Beispiel als Primer für eine Transkription und/oder Replikation von Zielsequenzen dienen sollen, enthalten die Sonden einen Polynukleotidbereich, der ausreichend lang und komplementär zur Zielsequenz ist, um die Replikation zu ermöglichen. Auch wenn die Polynukleotidsonden zum Beispiel als Markierungssonden oder zur Bindung an Multimere verwendet werden sollen, würde die zielsuchende Nukleotidsequenz ausreichend lang und komplementär sein, um stabile Hybrid-Doppelstränge mit den Markierungssonden und/oder Multimeren zu bilden, um den Nachweis des Doppelstrangs zu ermöglichen. Die Sonden können ein Minimum von 4 zusammenhängenden Nukleotiden beinhalten, die komplementär zur Zielsequenz sind; üblicherweise beinhalten die ligomere ein Minimum von 8 zusammenhängenden Nukleotiden, die komplementär zur Zielsequenz sind, und beinhalten bevorzugt ein Minimum von 14 zusammenhängenden Nukleotiden, die komplementär zur Zielsequenz sind.
Die Sonden hingegen müssen nicht nur aus der Sequenz bestehen, die komplementär zur Zielsequenz ist. Sie können zusätzliche Nukleotidsequenzen oder andere Einheiten enthalten. Wenn die Sonden zum Beispiel als Primer für die Amplifizierung von Sequenzen über PCR verwendet werden sollen, können sie Sequenzen enthalten, die im Doppelstrang Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme bilden, die die Klonierung der amplifizierten Sequenzen erleichtern. Auch wenn die Sonden als "Fangsonden" in Hybridisierungsansätzen verwendet werden sollen, sind sie an einen "Bindungspartner", wie oben definiert, gekoppelt. Hergestellt werden die Sonden durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, eingeschlossen, zum Beispiel, durch Verfahren, die Ausschneiden, Transkription oder chemische Synthese einschließen.
D. Expressionssysteme
Sobald die entsprechende kodierende Sequenz von H. pylori isoliert ist, kann sie in einer Vielzahl verschiedener Expressionssysteme exprimiert werden; zum Beispiel in solchen, die Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefen verwenden.
i. Säuger-Systeme
Säuger-Expressionssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein Säuger-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die RNA-Polymerase aus einem Säugetier binden und stromabwärts (3') die Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor hat eine Transkriptions-Initiationsregion, die üblicherweise nahe dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz lokalisiert ist, und eine TATA-Box, die üblicherweise 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Transkriptions-Initiationsstelle liegt. Es wird angenommen, daß die TATA-Box die RNA-Polymerase II plaziert, um die RNA-Synthese an der richtigen Stelle zu beginnen. Ein Säuger-Promotor enthält auch ein stromaufwärts gelegenes Promotorelement, das üblicherweise innerhalb von 100 bis 200 bp stromaufwärts der TATA-Box liegt. Ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird und kann in beiden rientierungen funktionieren, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2. Auflage).
Gene von Säuger-Viren sind oft hoch exprimiert und haben ein breites Wirtsspektrum; daher liefern Sequenzen, die Gene von Säuger-Viren kodieren, besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen den frühen Promotor von SV40, den LTR-Promotor des Maus-Mamma-Tumor-Virus, den späten Haupt-Promotor von Adenovirus (Ad MLP) und den Herpes simplex-Viruspromotor ein. Zusätzlich liefern von nicht-viralen Genen abgeleitete Sequenzen, wie das murine Metallothionein-Gen, nützliche Promotorsequenzen. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, kann in Abhängigkeit vom Promotor in Hormon-responsiven Zellen mit Glucocorticoid induziert werden.
Die Anwesenheit eines Enhancerelements (Enhancer), zusammen mit den oben beschriebenen Promotorelementen, erhöht üblicherweise das Expressionsniveau. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription bis zu 1000fach stimulieren kann, wenn sie mit homologen oder heterologen Promotoren verbunden ist, wobei die Synthese am normalen RNA-Startpunkt beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromaufwärts oder stromabwärts der Transkriptions-Initiationsstelle lokalisiert sind, entweder in normaler oder umgekehrter rientierung, oder in einer Entfernung von mehr als 1000 Nukleotiden vom Promotor entfernt, Maniatis et al., Science 236 (1989), 1237; Alberts et al. (1989), Molecular Biolog, of the Cell (2. Auflage). Von Viren abgeleitete Enhancerelemente können besonders nützlich sein, da sie üblicherweise ein breiteres Wirtsspektrum haben. Beispiele schließen den Enhancer für das frühe Gen von SV40, Dijkema et al., EMB J. 4 (1985), 761, und den vom long terminal repeat (LTR) des Rous-Sarkoma-Virus, Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 6777, und vom humanen Cytomegalievirus, Boshart et al., Cell 41 (1985), 5221, abgeleiteten Enhancer/Promotor ein. Zusätzlich sind manche Enhancer regulierbar und werden erst in der Anwesenheit eines Induktors, wie eines Hormons oder eines Metallions, aktiv, Sassone-Corsi et al., Trends Genet. 2 (1986), 215; Maniatis et al., Science 236 (1987), 1237.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Säugerzellen exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein Methionin ist, das durch das ATG-Startcodon kodiert wird. Falls erforderlich, kann der N-Terminus vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
In einer anderen Alternative können Fremdproteine auch durch Erzeugung chimärer DNA-Moleküle, die ein Fusionsprotein kodieren, das ein Leadersequenz-Fragment enthält, das für die Sekretion des Fremdproteins in Säugerzellen sorgt, aus der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden. Bevorzugt befinden sich kodierte Prozessierungsstellen zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdprotein, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment kodiert üblicherweise ein aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetztes Signalpeptid, das die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuert. Der dreiteilige Adenovirus-Leader ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die für die Sekretion eines Fremdproteins in Säugerzellen sorgt.
Üblicherweise sind von Säugerzellen erkannte Transkriptions-Terminationsund Polyadenylierungssequenzen regulatorische Bereiche, die sich 3' vom Translations-Stopcodon befinden und daher zusammen mit den Promotorelementen die kodierende Sequenz flankieren. Das 3'-Ende der reifen mRNA wird durch Erkennungsstellen-spezifische posttranslationale Spaltung und Polyadenylierung gebildet, Birnstiel et al., Cell 41 (1985), 349; Proudfoot and Whitelaw (1988), Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA, in: B. D. Hames und D.M. Glover (Hrsg.), Transcription and splicing; Proudfoot, Trends Biochem. Sci. 14 (1989), 105. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in ein Protein übersetzt werden kann, das von DNA kodiert wird. Beispiele für Transkriptions-Terminator/Polyadenylierungssignale schließen die von SV40 abgeleiteten ein, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Einige Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns (auch intervenierende Sequenzen genannt) anwesend sind. Manche cDNAs hingegen wurden effizienter durch Vektoren ohne Spleißsignale (auch Spleiß-Donor- und -Akzeptorstelle genannt) exprimiert, siehe z. B. Gething and Sambrook, Nature 293 (1981), 620. Introns sind intervenierende, nicht-kodierende Sequenzen innerhalb einer kodierenden Sequenz, die Spleiß-Donor und -Akzeptorstellen enthalten. Sie werden durch einen "Spleißen" genannten Frozeß entfernt, der auf die Polyadenylierung des primären Transkripts folgt, Nevins, Annu. Rev. Biochem. 52 (1983), 441; Green, Annu. Rev. Genet. 20 (1986), 671; Padgett et al., Annu. Rev. Biochem. 55 (1986), 1119; Krainer and Maniatis (1988), RNA splicing, in: B. D. Hames and D.M. Glover (Hrsg.), Transcription and splicing.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und eine Transkription-Terminationssequenz enthalten, in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Enhancer, Introns mit funktionellen Spleiß-Donorund -Akzeptorstellen und Leadersequenzen können, falls gewünscht, ebenfalls in einem Expressionskonstrukt vorhanden sein. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replikon, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. einem Plasmid), aufrechterhalten, das zur stabilen Aufrechterhaltung in einer Wirtszelle, wie in Säugerzellen oder Bakterien, befähigt ist. Replikationssysteme aus Säugern schließen die von Tier-Viren ein, die in trans arbeitende Faktoren zur Replikation benötigen. Zum Beispiel replizieren sich Plasmide, die die Replikationssysteme von Papovaviren, wie SV40, Gluzman, Cell 23 (1981), 175, oder Polyomavirus enthalten, zu extrem hoher Kopienzahl in Gegenwart des entsprechenden viralen T-Antigens. Weitere Beispiele für Replikons aus Säugern schließen die aus bovinem Papillomavirus und aus Epstein-Barr-Virus abgeleiteten ein. Weiterhin kann das Replikon zwei Replikationssysteme haben, wodurch es, zum Beispiel, in Säugerzellen zur Expression und in einer prokaryotischen Wirtszelle zum Klonieren und zur Amplifikation, aufrechterhalten werden kann. Beispiele für solche Säuger-Bakterien-Shuttlevektoren schließen pMT2, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989), 946 und pHEBO ein, Shimizu et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 1074.
Die Transformations-Methode hängt vom zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zum Einbringen von heterologen Polynukleotiden in Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Fällung, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Einschluß des (der) Polynukleotids (Polynukleotide) in Liposomen, und direkte Mikroinjektion der DNA in die Zellkerne ein.
Säugerzelllinien, die als Wirtszellen zur Expression verfügbar sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen viele immortalisierte Zelllinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CH), HeLa Zellen, Baby-Hamster Nierenzellen (BHK), Affennierenzellen (CS), humane Zellen aus hepatozellulären Karzinomen (z. B. Hep G2) und eine Anzahl anderer Zelllinien.
ii. Baculovirus-Systeme
Das Protein-kodierende Polynukleotid kann auch in einen geeigneten Insekten-Expressionsvektor eingefügt werden, und ist funktionell mit den Kontrollelementen innerhalb des Vektors verbunden. Zur Konstruktion von Vektoren werden auf dem Fachgebiet bekannte Techniken verwendet.
Im allgemeinen schließen die Komponenten des Expressionssystems einen Transfervektor ein, üblicherweise ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment aus dem Baculovirus-Genom als auch eine geeignete Restriktionsstelle zur Insertion des oder der zu exprimierenden heterologen Gens oder Gene enthält; einen Wildtyp-Baculovirus mit einer zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment im Transfervektor homologen Sequenz (dies ermöglicht die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom) und geeignete Insekten-Wirtszellen und Züchtungsmedien.
Nach dem Einfügen der Protein-kodierenden DNA-Sequenz in den Transfervektor werden der Vektor und das Wildtyp-Virusgenom in eine Insekten-Wirtszelle transfiziert, wo der Vektor und das virale Genom rekombinieren können. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert und rekombinante Plaques werden identifiziert und aufgereinigt. Material und Methoden für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind im Handel in Kit-Form erhältlich, unter anderem von Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac" Kit). Diese Techniken sind dem Fachmann im Allgemeinen bekannt und vollständig beschrieben in Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), (nachstehend als "Summers and Stitch" bezeichnet).
Vor der Insertion der Protein-kodierenden DNA-Sequenz in das Baculovirus-Genom werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, einen Leader (falls gewünscht), die kodierende Sequenz von Interesse und die Transkriptions-Terminationssequenz umfassen, üblicherweise in einem übertragenden Zwischenkonstrukt (Transfervektor) zusammengesetzt. Dieses Konstrukt kann ein einzelnes Gen und funktionell verbundene regulatorische Elemente enthalten; mehrere Gene, jedes mit seinem eigenen Satz funktionell verbundener regulatorischer Elemente; oder mehrere Gene, die durch denselben Satz regulatorischer Elemente reguliert werden. Übertragende Zwischenkonstrukte werden häufig in einem Replikon, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), aufrechterhalten, das zur stabilen Aufrechterhaltung in einem Wirt, wie einem Bakterium, befähigt ist. Das Replikon hat ein Replikationssystem und kann dadurch in einem geeigneten Wirt zur Klonierung und Amplifikation aufrechterhalten werden.
Der meistbenutzte Transfervektor zum Einbringen fremder Gene in AcNPV ist gegenwärtig pAc373. Viele andere, dem Fachmann bekannte Vektoren sind ebenfalls entworfen worden. Diese schließen, zum Beispiel, pVL985 ein (der das Polyhedrin-Startcodon von ATG zu ATT ändert, und der eine BamHI-Klonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts des ATT einführt); siehe Luckow and Summers, Virology 17 (1989), 31.
Das Plasmid enthält üblicherweise auch das Polyhedrin-Polyadenylierungssignal (Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. 42 (1988), 177) und ein prokaryotisches Ampicillin-Resistenzgen (amp) und einen Replikationsursprung zur Selektion und Propagierung in E. coli.
Baculovirus-Transfervektoren enthalten üblicherweise einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Baculovirus RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärtige (5' nach 3') Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor hat eine Transkriptions-Initiationsregion, die üblicherweise nahe dem 5'-Ende der kodierenden Sequenz liegt. Diese Transkriptions-Initiationsregion schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiationsstelle ein. Ein Baculovirus-Transfervektor kann auch eine zweite, Enhancer genannte Domäne besitzen, die, wenn vorhanden, üblicherweise distal zum Strukturgen liegt. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturgene, die in den späten Phasen des viralen Infektionszyklus in großer Menge transkribiert werden, liefern besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen von dem Gen für das virale Polyhedrin-Protein abgeleitete Sequenzen, Friesen et al. (1986), The Regulation of Baculovirus Gene Expression, in: Walter Doerfler (Hrsg.), The Molecular Biologe of Baculoviruses; EPO-Veröffentlichungen Nr. 127 839 und 155 476; und das das p10-Protein kodierende Gen, Vlak et al., J. Gen. Virol. 69 (1988), 765, ein.
Geeignete Signalsequenzen kodierende DNA kann aus Genen für sekretierte Insekten- oder Baculovirus-Proteine, wie dem Polyhedrin-Gen von Baculovirus, erhalten werden (Carbonell et al., Gene 73 (1988), 409). Da die Signale für posttranslationale Modifikationen in Säugerzellen (wie die Abspaltung des Signalpeptids, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) von Insektenzellen offenbar erkannt werden, und die zur Sekretion und Kernlokalisierung erforderlichen Signale ebenso zwischen den Zellen von Invertebraten und Vertebraten offenbar konserviert sind, können Leadersequenzen nicht-insektoiden Ursprungs, wie die von Genen abgeleiteten, die das humane α-Interferon, Maeda et al., Nature 315 (1985), 592; das humane Gastrin-freisetzende Peptid, Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 3129; das humane IL-2, Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 8404; das IL-3 der Maus, Miyajima et al., Gene 58 (1987), 273; und die humane Glucocerebrosidase, Martin et al., DNA 7 (1988), 99, kodieren, in einer anderen Ausführungsform auch verwendet werden, um die Sekretion in Insekten zu ermöglichen.
Ein rekombinates Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert oder sekretiert werden, wenn es mit geeigneten regulatorischen Sequenzen exprimiert wird. Gute intrazelluläre Expression von nicht-fusionierten Fremdproteinen erfordert üblicherweise heterologe Gene, die Idealerweise eine kurze Leadersequenz haben, die geeignete Translations-Initiationssignale vor einem ATG-Startsignal enthält. Falls erforderlich, kann das Methionin am N-Terminus durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan vom reifen Protein abgespalten werden.
In einer anderen Alternative können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die natürlicherweise nicht sekretiert werden, durch die Erzeugung chimärer DNA-Moleküle, die für ein Fusionsprotein kodieren, das ein Leadersequenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Insekten ermöglicht, aus der Insektenzelle sekretiert werden. Das Leadersequenz-Fragment kodiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, die die Translokation des Proteins in das Endoplasmatische Retikulum steuern.
Nach der Insertion der DNA-Sequenz und/oder des Gens, das das Vorläufer-Expressionsprodukt des Proteins kodiert, wird eine Insekten-Wirtszelle mit der heterologen DNA des Transfervektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus kotransformiert– üblicherweise durch Kotransfektion. Der Promotor und die Transkriptions-Terminationssequenz des Konstruktes enthält üblicherweise einen 2–5 kb großen Abschnitt des Baculovirus-Genoms. Verfahren zum Einbringen heterologer DNA an die gewünschte Stelle im Baculovirus sind auf dem Fachgebiet bekannt. (Siehe Summers and Smith; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 2156 und Luckow and Summers (1989)). Zum Beispiel kann die Insertion in ein Gen wie das Polyhedrin-Gen durch homologe doppelte Crossover-Rekombination erfolgen; die Insertion kann auch in die Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms erfolgen, die in das gewünschte Baculovirus-Gen eingeführt wurde. Miller et al., Bioessays 4 (1989), 91.
Die DNA-Sequenz wird sowohl 5' als auch 3' von Polyhedrin-spezifischen Sequenzen flankiert, wenn sie anstelle des Polyhedrin-Gens in den Expressionsvektor kloniert wird und ist stromabwärts des Polyhedrin-Promotors positioniert.
Der neu gebildete Baculovirus-Expressionsvektor wird anschließend in ein infektiöses, rekombinantes Baculovirus verpackt. Die homologe Rekombination erfolgt mit niedriger Häufigkeit (zwischen etwa 1% und etwa 5%); daher ist der überwiegende Teil des nach der Kotransfektion produzierten Virus noch Wildtyp-Virus. Daher ist eine Methode zur Identifizierung rekombinanter Viren erforderlich. Ein Vorteil des Expressionssystems besteht in der visuellen Durchmusterung, die die Unterscheidung rekombinanter Viren gestattet. Das Polyhedrin-Protein, das vom nativen Virus produziert wird, wird in den Zellkernen infizierter Zellen in sehr großen Mengen in den späten Phasen nach der viralen Infektion produziert. Angesammeltes Polyhedrin-Protein bildet Occlusion Bodies, die auch eingebettete Partikel enthalten. Diese bis zu 15 μm großen Occlusion Bodies sind stark lichtbrechend, was ihnen ein hell leuchtendes Aussehen verleiht, das unter dem Lichtmikroskop leicht sichtbar gemacht werden kann. Mit rekombinanten Viren infizierte Zellen besitzen keine cclusion Bodies. Um rekombinante Viren von Wildtyp-Viren zu unterscheiden, wird der Transfektionsüberstand durch dem Fachmann bekannte Techniken zur Plaquebildung auf eine einzellige Schicht aus Insektenzellen ausgebracht. Die Plaques werden dann unter dem Lichtmikroskop auf die Anwesenheit (kennzeichnend für Wildtyp-Virus) oder die Abwesenheit (kennzeichnend für rekombinantes Virus) von cclusion Bodies durchsucht. Ausubel et al. (Hrsg.) (1990), Current Protocols in Microbiology, Band 2, Suppl. 10, Kap. 16.8; Summers and Smith; Miller et al. (1989). Rekombinante Baculovirus-Expressionsvektoren wurden für die Infektion von Zellen mehrerer Insektenarten entwickelt. Zum Beispiel wurden rekombinante Baculoviren unter anderem entwickelt für: Aedes Aegypti, Autogranha californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (PCT-Veröffentlichung Nr. W 89/046699; Carbonell et al., J. Virol. 56 (1986), 153; Wright, Nature 312 (1986), 718; Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 2156; und siehe allgemein, Fraser et al., In vitro Cell. Dev. Biol. 25 (1989), 225).
Zellen und Zellkulturmedien sind sind sowohl für die direkte als auch für die Fusionsexpression heterologer Polypeptide in einem Baculovirus-Expressionssystem im Handel erhältlich; Zellkulturtechnologie ist dem Fachmann im Allgemeinen bekannt. Siehe z. B. Summers and Smith.
Die veränderten Insektenzellen können dann in einem entsprechenden Nährmedium gezüchtet werden, das eine stabile Aufrechterhaltung des (der) in den veränderten Insekten-Wirtszellen anwesenden Plasmids (Plasmide) erlaubt. Steht das Gen für das Expressionsprodukt unter induzierbarer Kontrolle, können die Wirtszellen zu hohen Dichten gezüchtet und die Expression induziert werden. Wenn in einer anderen Ausführungsform die Expression konstitutiv ist, wird das Produkt kontinuierlich in das Medium exprimiert, und das Nährmedium muß ständig zirkulieren, wobei das gewünschte Produkt abgetrennt und verbrauchte Nährstoffe ergänzt werden. Das Produkt kann durch Techniken wie Chromatographie, z. B. HPLC, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, usw.; Elektrophorese; Dichtegradientenzentrifugation; Lösungsmittelextraktion, oder ähnliche gereinigt werden. Falls zweckmäßig, kann das Produkt wie erforderlich weiter gereinigt werden, um im wesentlichen alle Insektenproteine zu entfernen, die ebenfalls in das Medium sekretiert werden oder durch Lyse von Insektenzellen entstehen, um ein Produkt zu liefern, das zumindest überwiegend frei ist von Bruchstücken der Wirtszellen, wie z. B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden.
Um Proteinexpression zu erhalten, werden aus den Transformanten abgeleitete rekombinante Wirtszellen unter Bedingungen inkubiert, die die Expression der Sequenz erlauben, die das rekombinante Protein kodiert. Diese Bedingungen variieren in Abhängigkeit von der ausgewählten Wirtszelle. Die Bedingungen sind jedoch auf Basis des bekannten Fachwissens für den Durchschnittsfachmann leicht zu ermitteln.
iii. Bakterielle Systeme
Bakterielle Expressionstechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt. Ein bakterieller Promotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärtige (3') Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die sich üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der kodierenden Sequenz befindet. Diese Transkriptions-Initiationsregion schließt üblicherweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase und eine Transkriptions-Initiationsstelle ein. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite, perator genannte Domäne haben, die eine benachbarte Transkriptions-Initiationsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der perator gestattet eine negativ regulierte (induzierbare) Transkription, da das Gen-Repressorprotein an den perator binden und dadurch die Transkription eines spezifischen Gens inhibieren kann. Konstitutive Expression kann in der Abwesenheit negativ regulatorischer Elemente, wie des perators, stattfinden. Zusätzlich kann eine positive Regulation durch eine Gen-Aktivatorprotein bindende Sequenz erzielt werden, die sich, falls vorhanden, üblicherweise proximal (5') von der die RNA-Polymerase bindenden Sequenz befindet. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivatorprotein ist das Catabolite Activator-Protein (CAP), das bei der Initiierung der Transkription des lac-Operons in E. coli mitwirkt, Raibaud et al., Annu. Rev. Genet. 18 (1984), 173. Regulierte Expression kann daher entweder positiv oder negativ sein und dadurch die Transkription entweder verstärken oder abschwächen.
Sequenzen, die für Enzyme von Stoffwechselwegen kodieren, liefern besonders nützlich Promotorsequenzen. Beispiele schließen Promotorsequenzen ein, die sich von Enzymen ableiten, die Zucker wie Galaktose, Lactose (lac), Chang et al., Nature 198 (1977), 1056, und Maltose metabolisieren. Weitere Beispiele schließen Promotorsequenzen von biosynthetischen Proteinen ein, wie Tryptophan (trp), Goeddel et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980), 4057; Yelverton et al., Nuc. Acids Res. 9 (1981), 731; U. S. 4,738,921; EP-Veröffentlichungen Nr. 036 776 und 121 775. Das β-Lactamase (bla) Promotor-System, Weissmann (1981), The cloning of Interferon and other mistakes., in: I. Gresser (Hrsg.), Interferon 3, das Bakteriophage lambda p_L-, Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128, und das T5-Promotorsystem, U.S. 4,689,406, liefern ebenfalls nützliche Promotorsequenzen.
Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, als bakterielle Promotoren. Zum Beispiel können Transkriptions-aktivierende Sequenzen eines Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotors mit den peronsequenzen eines anderen Bakterien- oder Bakteriophagen-Promotors verbunden werden, um einen synthetischen Hybridpromotor zu erzeugen, U. S. 4,551,433. Der tac-Promotor zum Beispiel ist ein trp-lac-Hybridpromotor, der sowohl trp-Promotor- als auch lac-peronsequenzen enthält, und durch den lac-Repressor reguliert wird, Amann et al., Gene 25 (1983), 167; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21. Weiterhin kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht-bakteriellen Ursprungs enthalten, die in der Lage sind, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription zu initiieren. Ein natürlich vorkommender Promotor nicht-bakteriellen Ursprungs kann auch mit einer kompatiblen RNA-Polymerase gekoppelt werden, um hohe Expressionsniveaus einiger Gene in Frokaryoten zu erreichen. Das RNA-Polymerase/Promotor-System des Bakteriophagen T7 ist ein Beispiel eines gekoppelten Promotorsystems, Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), 113; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 1074. Darüberhinaus kann ein Hybridpromotor einen Bakteriophagen-Promotor und einen E. coli- peratorbereich enthalten (EP-Veröffentlichung Nr. 267 851).
Zusätzlich zu einer funktionellen Promotorsequenz ist eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle für die Expression von Fremdgenen in Prokaryoten nützlich. In E.coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle als Shine-Dalgarno-Sequenz bezeichnet und schließt ein Initiationscodon (ATG) und eine 3–9 Nukleotide lange Sequenz in einem Abstand von 3–11 Nukleotiden stromaufwärts des Initiationscodons ein, Shine et al., Nature 254 (1975), 34. Von der SD-Region wird angenommen, daß sie die Bindung der mRNA an das Ribosom durch Basenpaarung zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der E.coli 16S rRNA begünstigt, Steitz et al. (1979), Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA., in: R. F. Goldberger (Hrsg.), Biological Regulation and Development: Gene Expression. Um eukaryotische Gene und prokaryotische Gene mit schwachen Ribosom-Bindungsstellen zu exprimieren, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein Methionin ist, das vom ATG-Startcodon kodiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan oder entweder durch in vivo-oder in vitro-Inkubation mit einer bakteriellen Nterminalen Methionin-Peptidase abgespalten werden (EPO-Veröffentlichung Nr. 219 237).
Fusionsproteine bilden eine Alternative zu direkter Expression. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Bakterienproteins, oder ein anderes stabiles Protein kodiert, an das 5'-Ende der heterologen kodierenden Sequenz fusioniert. Nach der Expression liefert dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen. Zum Beispiel kann das cII-Gen des Bakteriophagen lambda mit dem 5'-Ende eines Fremdgens verbunden und in Bakterien exprimiert werden. Das entstandene Fusionsprotein beinhaltet bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagen-Protein vom Fremdprotein abzuspalten, Nagai et al., Nature 309 (1984), 810. Fusionsproteine können auch mit Sequenzen des lacZ-Gens, Jia et al., Gene 60 (1987), 197, des trpE-Gens, Allen et al., J. Biotechnol. 5 (1987), 93; Makoff et al., J. Gen. Microbiol. 135 (1989), 11, und EPO-Veröffentlichung Nr. 324 647, hergestellt werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare oder nicht spaltbare Stelle kodieren. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird unter Verwendung der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym beinhaltet (z. B. eine Ubiquitin-spezifische Protease), um das Ubiquitin von dem Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren können native Fremdproteine isoliert werden. Miller et al., Bio/Technology 7 (1989), 698.
In einer anderen Alternative können Fremdproteine auch von der Zelle durch Erzeugung eines chimären DNA-Moleküls sekretiert werden, das ein Fusionsprotein kodiert, das ein Signalpeptidsequenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Bakterien ermöglicht, U.S. 4,336,336. Das Signalsequenz-Fragment kodiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern. Das Protein wird entweder in das Kulturmedium (Gram-positive Bakterien) oder in das Periplasma, das sich zwischen innerer und äußerer Zellmembran befindet (Gramnegative Bakterien), sekretiert. Bevorzugterweise sind Prozessierungsstellen zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen kodiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können.
DNA, die geeignete Signalsequenzen kodiert, kann aus Genen für sekretierte Bakterienproteine erhalten werden, wie aus dem Gen für das äußere Membranprotein (omp A von E. coli, Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al., EMB J. 3 (1984), 2437, und die Signalsequenz für die Alkalische Phosphatase (phoA) von E. coli, Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7212. Als zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des alpha-Amylase-Gens verschiedener Bacillus-Stämme zur Sekretion heterologer Proteine aus B. subtilis verwendet werden. Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5582; EPO-Veröffentlichung Nr. 244 042.
Üblicherweise sind von Bakterien erkannte Transkriptions-Terminationssequenzen regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stopcodon liegen, und daher mit dem Promotor die kodierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA kodierte Polypeptid translatiert werden kann. Transkriptions-Terminationssequenzen beinhalten häufig etwa 50 Nukleotide lange DNA-Sequenzen, die Stamm-Schleifen-Strukturen ausbilden können, die zur Termination der Transkription beitragen. Beispiele schließen Transkriptions-Terminationssequenzen ein, die aus Genen mit starken Promotoren erhalten wurden, wie den trp-Genen von E. coli und auch anderen biosynthetischen Genen.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, eine Signalsequenz (wenn gewünscht), eine bestimmte kodierende Sequenz, und eine Transkriptions-Terminationssequenz beinhalten, zu einem Expressionskonstrukt vereinigt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replikon, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), aufrechterhalten, das in einem Wirt, wie einem Bakterium, stabil aufrechterhalten wird. Das Replikon besitzt ein replikatives System, das es ihm erlaubt, in einem prokaryotischen Wirt entweder zur Expression oder zur Klonierung und Amplifikation aufrechterhalten zu werden. Weiterhin kann ein Replikon entweder ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl hat im allgemeinen eine hohe Kopienzahl zwischen etwa 5 bis etwa 200, und üblicherweise etwa 10 bis etwa 150.
Eine Wirtszelle, die ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, enthält bevorzugt mindestens etwa 10, und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Es kann entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl ausgewählt werden, in Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf die Wirtszelle.
In einer anderen Alternative kann das Expressionskonstrukt mit einem integrierenden Vektor in das Bakteriengenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zum Bakterienchromosom homologe Sequenz, durch die der Vektor integrieren kann. Integrationen scheinen durch Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Bakterienchromosom zu entstehen. Zum Beispiel integrieren sich mit der DNA verschiedener Bacillus-Stämme konstruierte integrierende Vektoren in das Bacillus-Chromosom (EP-Veröffentlichung Nr. 127 328). Integrierende Vektoren können auch Bakteriophagen- oder Transposonsequenzen enthalten.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion transformierter Bakterienstämme zu ermöglichen. Selektierbare Marker können in der bakteriellen Wirtszelle exprimiert werden und können Gene einschließen, die Bakterien resistent gegenüber Antibiotika machen, wie etwa Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin), und Tetracyclin. Davies et al., Annu. Rev. Microbiol. 31 (1978), 469. Selektierbare Marker können auch biosynthetische Gene einschließen, wie die des Histidin-, Tryptophan-, und Leucin-Biosynthesewegs.
In einer anderen Alternative können einige der oben beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengestellt werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replikon aufrechterhalten oder in einen integrierenden Vektor entwickelt wird.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation zahlreicher Bakterienarten entwickelt. Zum Beispiel wurden Expressionsvektoren, unter anderem, für folgende Bakterien entwickelt: Bacillus subtilis, Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5582; EPO-Veröffentlichungen Nr. 036 259 und 063 953; PCT-Veröffentlichung Nr. W 84/04541; E. coli, Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128; Amann et al., Gene 40 (1985), 183; Studier et al. J. Mol. Biol. 189 (1986), 113; EPO-Veröffentlichungen Nr. 036 776, 136 829 und 136 907; Streptococcus cremoris, Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655; Streptococcus lividans, Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655; und Streptomyces lividans, U. S. 4,745,056.
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in bakterielle Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und schließen üblicherweise die Transformation mit CaCl₂ oder anderen Mitteln, wie divalenten Kationen und DMS, behandelter Bakterien ein. DNA kann auch durch Elektroporation in Bakterienzellen eingebracht werden. Das Transformationsverfahren ändert sich mit der zu transformierenden Bakterienspezies. Siehe z. B. Masson et al., FEMS Microbiol. Lett. 60 (1989), 273; Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5582; EPO-Veröffentlichungen Nr. 036 259 und 063 953; PCT-Veröffentlichungen Nr. W 84/04541, für Bacillus; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 856; Wang et al., J. Bacteriol. 172 (1990), 949, für Campylobacter; Cohen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1973), 2110; Dower et al. Nucleic Acids Res. 16 (1988), 6127; Kushner (1978), An improved method for transformation of E. coli with ColE1-derived plasmids, in: H. W. Boyer and S. Nicosia (Hrsg.), Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering; Mandel et al., J. Mol. Biol. 53 (1970), 159; Taketo, Biochim. Biophys. Acta 949 (1988), 318, für Escherichia; Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett. 44 (1987), 173, für Lactobacillus; Fiedler et al., Anal. Biochem. 170 (1988), 38, für Pseudomonas; Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett. 66 (1990), 203, für Staphylococcus; Barany et al., J. Bacteriol. 144 (1980), 698; Harlander (1987), Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: J. Ferretti and R. Curtiss III (Hrsg.), Streptococcal Genetics; Perry et al., Infec. Immun. 32 (1981), 1295; Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988), 655; Somkuti et al., Proc. 4^th Evr. Cong. Biotechnology 1 (1987), 412, für Streptococcus.
iv. Expression in Hefe
Hefe Expressionssysteme sind dem Durchschnittsfachmann ebenfalls bekannt. Ein Hefepromotor ist jede DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärtige (3') Transkription einer kodierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiationsregion, die sich üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der kodierenden Sequenz befindet. Diese Transkriptions-Initiationregion schließt üblicherweise eine Bindungsstelle für die RNA-Polymerase (die "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiationsstelle ein. Ein Hefepromotor kann auch eine zweite, Upstream Activator Sequence (UAS) genannte Domäne haben, die sich, wenn vorhanden, üblicherweise distal zum Strukturgen befindet. Die UAS gestattet eine regulierte (induzierbare) Transkription. Konstitutive Expression findet in der Abwesenheit einer UAS statt. Regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein und dadurch die Transkription entweder verstärken oder abschwächen.
Hefe ist ein fermentierender rganismus mit einem aktiven Stoffwechselgeschehen, daher liefern Sequenzen, die Enzyme der Stoffwechselwege kodieren, besonders nützliche Promotorsequenzen. Beispiele schließen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) (EP-Veröffentlichung Nr. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, Glycerinaldehyd -3- phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-phosphoglycerat-Mutase, und Pyruvatkinase (PyK) (EPO-Veröffentlichung Nr. 329 203) ein. Das PHO5-Gen der Hefe, das eine saure Phosphatase kodiert, liefert ebenfalls nützliche Promotorsequenzen, Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983),1.
Darüberhinaus funktionieren synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, ebenfalls als Hefepromotoren. Zum Beispiel können UAS-Sequenzen eines Hefepromotors mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines anderen Hefepromotors verbunden werden, um einen synthetischen Hybridpromotor zu erzeugen. Beispiele für solche Hybridpromotoren schließen die mit der Transkriptions-aktivierenden Region von GAP verbundene regulatorische Sequenz von ADH ein (U.S. 4,876,197 und U.S. 4,880,734). Andere Beispiele für Hybridpromotoren schließen Promotoren ein, die aus regulatorischen Sequenzen des ADH2-, des GAL4-, des GAL10- oder des PHO5-Gens bestehen, die mit der Transkriptions-aktivierenden Region eines Gens für ein glykolytisches Enzym, wie etwa GAP oder PyK, kombiniert sind (EP-Veröffentlichung Nr. 164 556). Darüberhinaus kann ein Hefepromotor natürlich vorkommende Promotoren, die nicht aus Hefe stammen, beinhalten, die die Fähigkeit besitzen, die RNA-Polymerase der Hefe zu binden und die Transkription zu initiieren. Beispiele für solche Promotoren schließen, unter anderem, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1078; Henikoff et al., Nature 283 (1981), 835; Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96 (1981), 119; Hollenberg et al. (1979), The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae, in: K. N. Timmis and A. Puhler (Hrsg.), Plasmids of Medical. Environmental and Commercial Importance; Mercerau-Puigalon et al., Gene 11 (1980), 163; Panthier et al., Curr. Genet. 2 (1980), 109, ein.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül verbunden sein, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus immer ein Methionin ist, das vom ATG-Startcodon kodiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-Terminus vom Protein durch in vitro-Inkubation mit Bromcyan abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine weitere Möglichkeit für Hefe-Expressionssysteme dar, wie auch in Säuger-, Baculovirus-, und bakteriellen Expressionssystemen. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Teil eines endogenen Hefeproteins, oder ein anderes stabiles Protein kodiert, an das 5'-Ende der heterologen kodierenden Sequenz fusioniert. Nach der Expression liefert dieses Konstrukt eine Fusion von zwei Aminosäuresequenzen. Zum Beispiel kann das Gen der Superoxid-Dismutase (SD) aus Hefe oder Mensch mit dem 5'-Ende eines Fremd-Gens verbunden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare oder nicht spaltbare Stelle kodieren. Siehe z. B. EP-Veröffentlichung Nr. 196 056. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird unter Verwendung der Ubiquitin-Region hergestellt, die bevorzugt eine Erkennungsstelle für ein prozessierendes Enzym beinhaltet (z. B. eine Ubiquitin-spezifische Protease), um das Ubiquitin von dem Fremdprotein abzuspalten. Durch dieses Verfahren können daher native Fremdproteine isoliert werden (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. W 88/024066).
In einer anderen Alternative können Fremdproteine auch durch Erzeugung eines chimären DNA-Moleküls, das ein Fusionsprotein kodiert, das ein Signalpeptidsequenz-Fragment enthält, das die Sekretion des Fremdproteins in Hefe ermöglicht, von der Zelle sekretiert werden. Bevorzugterweise sind Prozessierungsstellen zwischen dem Signalpeptidfragment und dem Fremdgen kodiert, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Signalsequenzfragment kodiert üblicherweise ein Signalpeptid, das hydrophobe Aminosäuren enthält, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern.
DNA, die geeignete Signalsequenzen kodiert, kann aus Genen für sekretierte Hefeproteine erhalten werden, wie aus dem Gen der Hefe-Invertase (EP-Veröffentlichung Nr. 012 873; JP-Veröffentlichung Nr. 62,096,086) und dem Gen des α-Faktors (U. S. 4,588,684). In einer anderen Ausführungsform gibt es Leader, die nicht aus Hefe stammen, wie etwa ein Interferon-Leader, und ebenfalls die Sekretion in Hefe ermöglichen (EP-Veröffentlichung Nr. 060 057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern sind solche, die ein Fragment des alpha-Faktor-Gens aus Hefe verwenden, das sowohl eine "prä"-Signalsequenz als auch eine "pro"-Region enthält. Die Arten von alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, schließen sowohl den Voll-Längen Präpro-alpha-Faktor-Leader (etwa 83 Aminosäurereste) als auch verkürzte alpha-Faktor-Leader (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) ein (U. S. 4,546,083 und U.S. 4,870,008; EP-Veröffentlichung Nr. 324 274). Zusätzliche Leader, die ein alpha-Faktor-Leaderfragment verwenden, das Sekretion ermöglicht, schließen hybride alpha-Faktor-Leader ein, die aus der Präsequenz des alpha-Faktors einer ersten Hefe, aber mit der pro-Region des alpha-Faktors aus einer zweiten Hefe hergestellt wurden. (Siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. W 89/02463).
Üblicherweise sind von Hefen erkannte Transkriptions-Terminationssequenzen regulatorische Regionen, die 3' vom Translations-Stopcodon liegen, und daher mit dem Promotor die kodierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das durch die DNA kodierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele für Transkriptions-Ternünationssequenzen und andere von Hefe erkannten Terminationssequenzen, wie solche, die für glykolytische Enzyme kodieren.
Üblicherweise werden die oben beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, eine Signalsequenz (wenn gewünscht), eine bestimmte kodierende Sequenz, und eine Transkriptions-Terminationssequenz beinhalten, zu einem Expressionskonstrukt vereinigt. Expressionskonstrukte werden oft in einem Replikon, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), aufrechterhalten, die in einem Wirt, wie einer Hefe oder einem Bakterium, stabil aufrechterhalten werden. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme haben, wodurch es, zum Beispiel, in Hefe zur Expression und in einer prokaryotischen Wirtszelle zum Klonieren und zur Amplifikation, aufrechterhalten werden kann. Beispiele für solche Hefe-Bakterien-Shuttlevektoren schließen YEp24, Botstein et al., Gene 8 (1979), 17 – 24; pCl/1, Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 4642-4646; und YRp17, Stinchcomb et al., J. Mol. Biol. 158 (1982), 157, ein. Weiterhin kann ein Replikon entweder ein Plasmid mit hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl hat im allgemeinen eine hohe Kopienzahl von etwa 5 bis etwa 200, und üblicherweise von etwa 10 bis etwa 150. Eine Wirtszelle, die ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, enthält bevorzugt mindestens etwa 10, und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Es kann entweder ein Vektor mit hoher oder niedriger Kopienzahl ausgewählt werden, in Abhängigkeit der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf die Wirtszelle.
In einer anderen Alternative kann das Expressionskonstrukt mit einem integrierenden Vektor in das Hefegenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zum Hefechromosom homologe Sequenz, durch die der Vektor integrieren kann, und enthalten bevorzugt zwei homologe Sequenzen, die das Expressionskonstrukt flankieren. Integrationen scheinen durch Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefechromosom zu entstehen, Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol. 101 (1983), 228-245. Ein integrierender Vektor kann durch Auswahl der geeigneten homologen Sequenz als Teil des Vektors zu einem spezifischen Genort in der Hefe gesteuert werden. Eines oder mehrere der Expressionskonstrukte können integrieren, und dadurch die Menge des produzierten rekombinanten Proteins beeinflußen, Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 6750. Die im Vektor enthaltene chromosomale Sequenz kann entweder als singuläres Element im Vektor vorliegen, was zur Integration des gesamten Vektors führt, oder zwei Segmente, die homolog zu aneinander angrenzenden Segmenten im Chromosom sind, flankieren das Expressionskonstrukt im Vektor, was zu einer stabilen Integration des Expressionskonstrukts alleine führen kann.
Üblicherweise können extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion transformierter Hefestämme zu ermöglichen. Selektierbare Marker können biosynthetische Gene einschließen, die in der Hefe-Wirtszelle exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, und das G418-Resistenzgen, das den Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 verleiht. Darüberhinaus kann ein geeigneter selektierbarer Marker der Hefe die Fähigkeit zum Wachstum in Anwesenheit toxischer Verbindungen, wie Metallen, verleihen. Zum Beispiel ermöglicht die Anwesenheit von CUP1 der Hefe das Wachstum in Gegenwart von Kupferionen. Butt et al., Microbiol. Rev. 51 (1987), 351.
In einer anderen Alternative können einige der oben beschriebenen Komponenten in Transformationsvektoren zusammengestellt werden. Transformationsvektoren enthalten üblicherweise einen selektierbaren Marker, der entweder in einem Replikon aufrechterhalten oder in einen integrierenden Vektor entwickelt wird.
Expressions- und Transformationsvektoren, entweder als extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, wurden zur Transformation zahlreicher Hefen entwickelt. Zum Beispiel wurden Expressionsvektoren, unter anderem, für folgende Hefen entwickelt: Candida albicans, Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 142; Candida maltosa, Kunze et al., J. Basic. Microbiol. 25 (1985), 141; Hansenula polymorpha, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 302; Kluyveromyces fragilis, Das et al., J. Bacteriol. 158 (1984), 1156; Kluyveromyces lactis, De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 737; Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990), 135; Pichia guillermondii, Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141; Pichia pastoris, Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3376; U. S. 4,837,148 und U.S. 4,929,555; Saccharomyces cerevisiae, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929; Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163; Schizosaccharomyces pombe, Beach et al., Nature 300 (1981), 706; und Yarrowia lipolytica, Davidow et al., Curr. Genet. 10 (1985), 39; Gaillardin et al., Curr. Genet. 10 (1985), 49.
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in Hefe-Wirtszellen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und schließen üblicherweise entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von mit Alkali-Kationen behandelten Hefezellen ein. Die Transformationsverfahren ändern sich üblicherweise mit der zu transformierenden Hefespezies. Siehe z. B. Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 142; Kunze et al., J. Basic. Microbiol. 25 (1985), 141, für Candida;, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 302, für Hansenula; Das et al., J. Bacteriol. 158 (1984), 1156; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 737; Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990), 135, für Kluyveromyces; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 3376; Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141; U. S. 4,837,148 und U. S. 4,929,555, für Pichia; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929; Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163 für Saccharomyces; Beach et al., Nature 300 (1981), 706, für Schizosaccharomyces; Davidow et al., Curr. Genet. 10 (1985), 39; Gaillardin et al., Curr. Genet. 10 (1985), 49, für Yarrowia.
E. Impfstoffe
Das H. pylori-CAI kann als alleiniger Kandidat für einen Impfstoff, optional in Kombination mit einem oder mehrereren Antigenen, letztere entweder von H. pylori, z. B. das Cytotoxin oder das Hitzeschock-Protein, oder von anderen pathogenen Quellen, verwendet werden. Bevorzugt sind "Cocktail"-Impfstoffe, die zum Beispiel das Cytotoxin- (CT) Antigen, das CAI-Protein, und die Urease enthalten. Zusätzlich kann das hsp zu einer oder mehreren dieser Komponenten hinzugefügt werden. Diese Impfstoffe können entweder prophylaktisch (zur Vorbeugung einer Krankheit) oder therapeutisch (zur Krankheits-Behandlung nach Infektion) sein.
Diese Impfstoffe enthalten ein H. pylori-Antigen oder -Antigene, üblicherweise in Kombination mit "pharmazeutisch verträglichen Trägern", die jeden Träger einschließen, der nicht selbst die Produktion von für das Individuum, das das Mittel erhält, schädlichen Antikörpern verursacht. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierte Makromoleküle wie Proteine, Polysaccharide, Polylactate, Polyglycol-Säuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Kopolymere, Lipid-Aggregate (wie etwa Öltröpfchen oder Liposomen), und inaktive Viruspartikel. Diese Träger sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt. Zusätzlich können diese Träger als immunstimulierende Mittel wirken ("Adjuvantien"). Darüberhinaus kann das Antigen mit einem bakteriellen Toxoid, wie etwa dem Toxoid des Diphterie-, Tetanus-, Cholera-, H. pylori-, und ähnlicher Krankheitserreger versetzt sein.
Bevorzugte Adjuvantien zur Verbesserung der Wirksamkeit eines Mittels schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: (1) Aluminium-Salze (Alaun), wie etwa Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, usw.; (2) Öl-in-Wasser Emulsions-Formulierungen (mit oder ohne anderen spezifisch immunstimulierenden Mitteln wie etwa Muramin-Peptidasen (siehe unten) oder bakteriellen Zellwand-Komponenten), wie zum Beispiel (a) MF59 (PCT-Veröffentlichung Nr. W 90/14837) mit 5% Squalen, 0.5% Tween 80, und 0.5% Span 85 (das optional verschiedene Mengen MTP-PE (siehe unten) enthält, obgleich nicht erforderlich) in einer Submikron-Partikel Formulierung, hergestellt unter Verwendung eines Geräts zur Tropfenzerkleinerung, wie etwa Modell 110Y Microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF mit 10% Squalen, 0.4% Tween 80, 5% Pluronicgeblocktem Polymer L121, und thr-MDP (siehe unten), entweder in eine Submicron-Emulsion mikrofluidisiert oder gevortext zur Erzeugung einer Emulsion mit größerer Partikelgröße, und (c) Ribi^TM Adjuvant System (RAS), (Bibi Immunochem, Hamilton, MT) mit 2% Squalen, 0.2% Tween 80, und einer oder mehreren bakteriellen Zellwand-Komponenten aus der Gruppe, die Monophospholipid A (MPL), Trehalose-dimycolat (TDM), und das Zellwand-Skelett (CWS), bevorzugt MPL + CWS (Detox^TM), enthält; (3) Saponin-Adjuvantien, wie etwa Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) oder daraus erzeugte Partikel wie etwa ISCMs (immunstimulierende Komplexe) können verwendet werden; (4) Vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA) und Unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA); (5) Cytokine, wie etwa Interleukine (IL-1, IL-2, usw.); Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), usw.; und (6) andere Substanzen, die als immunstimulierende Mittel zur Verstärkung der Wirksamkeit des Mittels wirken. Alaun und MF59 werden bevorzugt.
Wie oben erwähnt, schließen Muramin-Peptide N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamaniyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), usw. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Das immunogene Mittel (z. B. das Antigen, ein pharmazeutisch verträglicher Träger, und ein Adjuvans) enthält typischerweise Verdünnungsmittel, wie etwa Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, usw. Zusätzlich können Hilfssubstanzen, wie etwa befeuchtende oder emulgierende Mittel, pH-puffernde Substanzen, und ähnliche in diesen Mitteln vorhanden sein.
Typischerweise werden die immunogenen Mittel injizierbar hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die sich zur Lösung oder Suspension in flüssigen Mitteln vor der Injektion eignen, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann auch als Emulsion oder eingeschlossen in Liposomen für eine verstärkte Adjuvantien-Wirkung erfolgen, wie oben unter "pharmazeutisch verträgliche Träger" erörtert.
Immunogene Mittel, die als Impfstoff verwendet werden, beinhalten, wie erforderlich, eine immunologische wirksame Menge des antigenen Polypeptids, sowie jede der oben erwähnten Komponenten. Mit " immunologisch wirksame Menge" ist gemeint, daß die Verabreichung dieser Menge an ein Individuum, entweder als Einzeldosis oder als Teil einer Serie, wirksam zur Behandlung oder Prävention ist. Diese Menge variiert in Abhängigkeit von Gesundheitszustand und physischer Verfassung des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums (z. B. nicht-Mensch Primat, Primat, usw.), der Kapazität des Immunsystems des Individuums zur Antikörpersynthese, dem gewünschten Grad des Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Einschätzung der medizinischen Situation durch den behandelnden Arzt, und anderen relevanten Faktoren. Es ist zu erwarten, daß die Menge in einen relativ breiten Rahmen fällt, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Die immunogenen Mittel werden herkömlich parenteral, z. B. durch entweder subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht. Weitere Formulierungen, die sich für andere Arten der Verabreichung eignen, schließen orale und pulmonale Formulierungen, Suppositorien und transdermale Applikationen ein. rale Formulierungen werden für H. pylori-Proteine besonders bevorzugt. Die Dosierung der Behandlung kann nach einem Einzeldosisplan oder einem Mehrfachdosisplan erfolgen. Der Impfstoff kann zusammen mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
F. Immundiagnostische Tests
H. pylori-Antigene können in Immuntests zum Nachweis von Antikörper-Spiegeln verwendet werden (oder umgekehrt können H. pylori-Antikörper zum Nachweis von Antigen-Spiegeln verwendet werden) und es kann ein Zusammenhang zwischen gastroduodenalen Erkrankungen und besonders duodenalen Geschwüren hergestellt werden. Immuntests auf Basis gut definierter rekombinanter Antigene können entwickelt werden, um die invasiven diagnostischen Verfahren zu ersetzen, die heute angewendet werden. Antikörper gegen H. pylori-Proteine in biologischen Proben, eingeschlossen, zum Beispiel, Blut- oder Serum-Proben, können nachgewiesen werden. Immuntests können auf sehr unterschiedliche Weise aufgebaut werden, und verschiedene Möglichkeiten dazu sind auf dem Fachgebiet bekannt. Protokolle für Immuntests können zum Beispiel auf Kompetition, oder direkter Reaktion, oder Tests vom Sandwich-Typ beruhen. Die Protokolle können zum Beispiel auch feste Träger verwenden, oder können mit Immunopräzipitation arbeiten. Die meisten Tests umfassen die Verwendung markierter Antikörper oder Polypeptide; die Markierungen können zum Beispiel fluoreszierende, chemiluminiszente, radioaktive oder Farbstoff-Moleküle sein. Tests, die die Signale der Sonde verstärken, sind ebenfalls bekannt; Beispiele dafür sind Tests, die Biotin und Avidin verwenden, und Enzym-markierte und indirekte Immuntests, wie etwa ELISA-Tests.
Kits, die sich zur Immundiagnostik eignen und die entsprechenden markierten Reagentien enthalten, werden durch Verpacken der entsprechenden Substanzen, einschließlich der erfindungsgemäßen Mittel, in geeignete Behälter zusammengestellt„ zusammen mit den anderen Reagentien und Substanzen (zum Beispiel geeigneten Puffern, Salzlösungen, usw.), die zur Testdurchführung erforderlich sind, wie auch einer geeigneten Zusammenstellung von Testvorschriften.
G. Beispiele
Die im Folgenden dargestellten Beispiele sind als weitere Anleitung für den Durchschnittsfachmann bestimmt, und sollen in keinster Weise als Beschränkung der Erfindung ausgelegt werden.
i. H. pylori Cytotoxin (CT)-Antigen (zur Information; nicht Teil der Erfindung)
1. Material und Methoden
Für allgemeine Materialien und Methoden bezüglich H. pylori-Anzucht und DNA-Isolierung siehe unten, Abschnitte ii bzw. iii, die das CAI-Antigen bzw das hsp betreffen.
a. Klonierung
Zwei Mischungen degenerierter ligonukleotide wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 380B DNA-Synthesizers synthetisiert. Diese Mischungen wurden in einer 4-mikromolaren Konzentration in einer 100-Mikroliter Polymerase-Kettenreaktion mit 200 Nanogramm gereinigter DNA unter Verwendung des Genamp PCR Kits nach Vorschrift des Herstellers verwendet. Die Reaktion wurde für 1 Minute bei 94°C, 2 Minuten bei 48°C und 2 Minuten bei 56°C inkubiert. Die Reaktionsmischung durchlief 30 Zyklen unter diesen Bedingungen.
Die Analyse der Reaktionsprodukte durch Agarose-Gelelektrophorese ergab ein markantes Fragment von ungefähr 87 bp. Nach Spaltung mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRI wurde das Fragment in das zuvor ebenfalls mit XbaI und EcoRI gespaltene Plasmid Bluescript SK+ (Stratagene) ligiert. Der Ligierungs-Ansatz wurde zur Transformation kompetenter E. coli durch Elektroporation bei 2000 V und 25 Mikrofarad (200 Ω) mit einem BioRad Gene Pulser (Kalifornien) verwendet. Transformierte E. coli wurden durch Anzucht auf L-Agarplatten selektiert, die 100 Mikrogramm Ampicillin pro Milliliter enthielten. Plasmid-DNA wurde aus positiven E. coli-Isolaten extrahiert und einer Sequenzanalyse unter Verwendung des Sequenase 2 DNA-Sequenzierungskits (United States Biochencal Corporation) nach Vorschrift des Herstellers unterzogen.
b. Anlegen von Genbanken
1) Genbank aus HindIII-Fragmenten
Sieben Mikrogramm gereinigter DNA wurden vollständig mit dem Restriktionsenzym HindIII gespalten. Drei Mikrogramm Bluescript SK+ Plasmid wurden vollständig. mit HindIII gespalten, dann mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Beide DNA-Gemische wurden durch Ausschütteln mit Wasser-gesättigtem Phenol gereinigt, dann durch Zugabe von Ethylalkohol auf 67° (v/v) gefällt. Beide DNAs wurden in 50 Mikroliter Wasser resuspendiert. 0.7 Mikrogramm der DNA-Fragmente wurden mit 0.3 Mikrogramm der Bluescript-DNA in 50 Mikroliter einer Lösung gemischt, die 25mM Tris pH 7.5, 10mM MgCl₂ und 5 Units T4 DNA-Ligase enthielt. Diese Mischung wurde bei 15°C für 20 Stunden inkubiert, wonach die DNA mit Wasser-gesättigtem Phenol extrahiert und mit Ethylalkohol gefällt wurde. Daraufhin wurde die DNA in 50 Mikrol. Wasser resuspendiert. Die Einführung von 1 Mikrol. dieser DNA in E. coli durch Elektroporation erbrachte ungefähr 3000– 10,000 Ampicillin-resistente Bakterienkolonien.
2) Genbank aus EcoRI-Fragmenten
Etwa 0.7 Mikrog EcoRI-gespaltener DNA wurde gereinigt und mit 0.45 Mikrogramm Bluescript SK+ Plasmid gemischt, das zuvor mit EcoRI gespalten und mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt worden war. Die Fragmente wurden in 50 Mikrol. Lösung ligiert. Nach Reinigung und Fällung wurde die DNA in 50 Mikrol. Wasser resuspendiert. Elektroporation von E. coli mit 1 Mikrol. dieser Lösung erbrachte ungefähr 200 Ampicillinresistente Bakterienkolonien.
Um geeignete Restriktionsfragmente aus dem Genom für die weitere Klovierung zu identifizieren, wurde das Plasmid einheitlich mit ³²P markiert und als Sonde verwendet, um DNA des Stammes CCUG zu analysieren, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten, über Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Filter übertragen wurde. Die Sonde zeigte ein einzelnes HindIII-Restriktionsfragment von ungefähr 3.5 kb. Eine Genbank aus HindIII-gespaltenen DNA-Fragmenten wurde hergestellt und in den Bluescript Plasmidvektor kloniert. Diese Genbank wurde mit der ³²P-markierten DNA abgesucht, die dem zuvor klonierten 87 bp Fragment entsprach. Zwei Klone, die identische HindIII-Fragmente von ungefähr 3.3 kbp enthielten, wurden identifiziert. Die DNA-Sequenzierung dieser HindIII-Fragmente ergab Sequenzen, die die 23 Aminosäuren kodieren können, die mit dem Aminoterminus des zuvor beschriebenen 87 kDa Cytotoxins übereinstimmen. Diese Sequenzen enthalten den Teil eines offenen Leserahmens mit ungefähr 300 Nukleotiden, der am Rand des Fragments endet, das durch die HindIII-Restriktionsstelle begrenzt wird. Die Sequenz zeigte ebenso das Vorhandensein einer EcoRI-Restriktionsstelle innerhalb des vermuteten offenen Leserahmens in 120 bp Entfernung von der HindIII-Stelle.
Eine ³²P-markierte Sonde, die mit der Sequenz zwischen der EcoRI-Stelle und der HindIII-Stelle übereinstimmte, wurde zum Absuchen einer Genbank aus EcoRI-DNA-Fragmenten, kloniert in den Bluescript SK+ Vektor, verwendet. Diese Sonde ergab zwei Klone, die Fragmente von ungefähr 7.3 kbp enthielten. Die DNA-Sequenzierung dieser Fragmente ergab einen durchgehenden offenen Leserahmen, der sich mit den aus den 3.2 kbp HindIII-Fragmenten bestimmten Sequenzen überschnitt. Die DNA-Sequenz dieser überlappenden Fragmente und die konzeptionelle Translation des darin enthaltenen einzelnen offenen Leserahmens sind in 1 bzw. 2 gezeigt.
Es soll angemerkt werden, daß sich diese Klone als extrem instabil erwiesen. Die beim Absuchen identifizierten ursprünglichen Kolonien waren so klein, daß sie schwierig zu finden waren. Die Vermehrung dieser Klone durch herkömmliche Verfahren der nachfolgenden Züchtung für 16–18 Stunden ergab sehr heterogene Plasmidpopulationen aufgrund von DNA-Umlagerungen und Deletionen. Ausreichende Mengen dieser Klone wurden durch nachfolgende Züchtung für 8–10 Stunden ohne Antibiotika-Selektion angezogen. bwohl die Plasmidausbeuten relativ gering waren, wurden auf diese Weise Selektion und Wachstum von Bakterien verhindert, die ein vermehrungsähiges umgelagertes Plasmid enthielten.
c. Absuchen von DNA-Genbanken
Das Produkt der PCR-Reaktion, das das markante 87 bp Fragment enthielt, wurde mit ³²P durch Random Priming unter Verwendung des Prime-a-gene Kits (Promega) markiert. Diese markierte Sonde wurde in einer Hybridisierungsreaktion mit an Nitrocellulose immobilisierter DNA von ungefähr 3000 Bakterienklonen verwendet. Die Hybridisierungsreaktion wurde bei 60°C in einer 0.3M NaCl-Lösung durchgeführt. Ein positiver Bakterienklon wurde vermehrt und die Plasmid-DNA wurde präpariert. Das Plasmid enthielt ein Insert von ungefähr 3.3 kb DNA und wurde TOXHH1 genannt.
Ein 120 bp Fragment, das die in l gezeigte Sequenz zwischen Position 292 und 410 enthielt, wurde aus dem Plasmid TOXHH1 gewonnen und zum Absuchen von ungefähr 400 Kolonien der Genbank aus EcoRI-Fragmenten verwendet. Ein positiver Klon, der ungefähr 7.3 kb DNA-Sequenzen enthielt, wurde isoliert und TOXEE1 genannt.
Die in 1 gezeigte Nukleotidsequenz wurde aus den Klonen TOXHH1 und TOXEE1 unter Verwendung des Sequenzee 2 Sequenzierungskits erhalten. Die Nukleotide zwischen Position 1 und 410 in 1 wurden aus TOXHH1 und die zwischen 291 und 3507 aus TOXEE1 erhalten. E. coli, die die Plasmide TOXHH1 und TOXEE1 enthielten, wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt, siehe unten.
d. Herstellung von Antiseren gegen das Cytotoxin
Ein den Nukleotiden 116–413 der in 1 gezeigten Sequenz entsprechendes DNA-Fragment wurde so in den bakteriellen Expressionsvektor pex 34 A kloniert, daß durch Induktion des Bakterienpromotors ein Fusionsprotein produziert wurde, das einen Teil des MS2-Polymerase-Polypeptids enthielt, das mit den Aminosäuren des Cytotoxin-Polypeptids fusioniert war und die zuvor identifizierten 23 Aminosäuren einschloss. Ungefähr 200 Mikrogramm dieses Fusionsproteins wurden durch Acrylamid-Gelelektrophorese teilweise gereinigt und zur Immunisierung von Kaninchen durch Standardverfahren verwendet.
Antiseren dieser Kaninchen, die nach 3 Immunisierungen im Abstand von je 1 Monat entnommen wurden, wurden zur Untersuchung von Proteinextrakten eines Cytotoxinpositiven und eines Cytotoxin-negativen H. pylori-Stammes in üblichen Immunoblot-Experimenten verwendet.
Die Antiseren reagierten mit einem Polypeptid, das in der denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 100 kDa wanderte. Dieses Polypeptid wurde in Proteinextrakten des Cytotoxin-positiven, aber nicht des Cytotoxin-negativen Stammes gefunden. Vor der Immunisierung gewonnenes Serum reagierte nicht mit diesem Polypeptid.
e. Teilweise Aufreinigung der vakuolisierenden Aktivität
Vollständige H. pylori-Membranen wurden in einer Konzentration von 6 mg/ml in einer Lösung mit 1% CHAPS, 0.5M NaCl, 10mM Hepes pH 7.4, 2.5mM EDTA, 20% Saccharose für 1 Stunde bei 4°C solubilisiert. Dieses Gemisch wurde auf einen diskontinuierlichen Saccharose-Gradienten mit Stufen von 30%, 35%, 40% und 55% Saccharose aufgetragen und einer Ultrazentrifugation für 17 Stunden bei 20000 × g unterzogen. Der Gradient wurde fraktioniert und jede Fraktion wurde auf vakuolisierende Aktivität und auf Urease-Aktivität getestet. Mit der Urease-Aktivität assoziierte vakuolisierende Aktivität wurde in mehreren Fraktionen des Gradienten gefunden. Ein Signal der vakuolisierenden Aktivität wurde ebenfalls in den obersten Fraktionen des Gradienten gefunden und diese Fraktionen waren praktisch frei von Urease-Aktivität.
Diese Urease-unabhängige vakuolisierende Aktivität wurde durch stufenweise Fällung mit Ammoniumsulfat-Konzentrationen von 20% bis 34% weiter fraktioniert. Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese der bei verschiedenen Ammoniumsulfat-Konzentrationen gefällten Proteine ergab ein markantes Polypeptid von etwa 100 kDa, das zusammen mit der vakuolisierenden Aktivität gereinigt wurde. Dieses Polypeptid wurde von den gegen die oben beschriebenen rekombinanten Fusionsproteine gewonnenen Kaninchen-Antiseren erkannt.
2. Ergebnisse
Zwei überlappende Fragmente, die etwa 10 kbp des H. pylori-Genoms entsprechen, wurden kloniert. Diese Klone enthalten ein Gen mit 3960 bp (gezeigt in 1), das für ein Polypeptid mit 1296 Aminosäuren kodieren kann (gezeigt in 2). Das Molekulargewicht dieses mutmaßlichen Polypeptids beträgt 139.8 kDa. Die Nukleotidsequenz AGGAAG 9 bp stromaufwärts des Methionin-Codons an Position 18 in l ähnelt stark der Shine-Dalgarno- Consensussequenz und unterstützt die Hypothese, daß dieses Methionin das Initiator-Methionin für die Synthese des Polypeptids repräsentiert. Eine 30 bp Nukleotidsequenz, die 10 bp stromabwärts des vermuteten Stopcodons an Position 3906 in l beginnt, ähnelt stark der Struktur eines prokaryotischen Transkriptions-Terminators und repräsentiert wahrscheinlich das Ende der kodierenden Sequenzen der Boten-RNA.
Das Cytotoxin-Gen wird durch folgende Kriterien definiert, den Polypeptid-Vorläufer der vakuolisierenden Aktivität von H. pylori zu kodieren:

(i) Das mutmaßliche Polypeptid enthält die 23 Aminosäuren lange Sequenz (2, Positionen 34–56), die als Aminoterminus des zuvor beschriebenen 87 kDa vakuolisierenden Proteins identifiziert wurden, Clover et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 10570–75. Dieser Sequenz gehen 33 Aminosäuren voraus, die einer prokaryotischen Leadersequenz ähneln; daher repräsentiert diese Sequenz wahrscheinlich den Aminoterminus eines reifen Froteins;
(ii) Kaninchen-Antiseren, die für ein 100 Aminosäuren langes Fragment des mutmaßlichen Polypeptids spezifisch sind, das den vorgeschlagenen Aminoterminus enthält, erkannten ein 100 kDa Polypeptid in einem Cytotoxin-positiven, nicht hingegen in einem Cytotoxin-negativen H. pylori-Stamm. Dieses 100 kDa Polypeptid wird zusammen mit der vakuolisierenden Aktivität aus H. pylori-Membranen aufgereinigt.

Zusammengenommen kodiert das hier beschriebene Gen ein ungefähr 140 kDa Polypeptid, das zu einem 100 kDa Polypeptid prozessiert wird, das mit der cytotoxischen Aktivität von H. pylori in Zusammenhang steht. Das zuvor beschriebene 87 kDa Polypeptid muß entweder durch weitere Prozessierung des 100 kDa Polypeptids oder durch proteolytischen Abbau während der Aufreinigung entstehen.
ii. H. pylori-CAI-Antigen
1. Material und Methoden
a. Herkunft des Materials
Die Klone A1, 64/4, G5, A17, 24 und 57/D wurden aus einer lambda gt11-Genbank erhalten. Klon B1 wurde aus einer genomischen Plasmid-Genbank aus HindIII-Fragmenten erhalten. 007 wurde durch PCR erhalten. Die Cytotoxin-produzierenden H. pylori-Stämme waren: G10, G27, G29, G32, G33, G39, G56, G65, G105, G113A. Die nichtcytotoxischen Stämme waren: G12, G21, G25, G47, G50, G204. Sie wurden aus Endoskopie-Biopsieproben am Grosseto Hospital (Toskana, Italien) isoliert. Der Stamm CCUG 17874 (Cytotoxin-positiv) wurde aus der Stammsammlung der Universität Göteborg erhalten. Die nicht-cytotoxischen Stämme Pylo 2U+ (Urease-positiv) und Pylo 2U- (Urease-negativ) wurden von F. Megraud, Centre Hospitalier, Bordeaux (Frankreich), erhalten. Die E. coli-Stämme DH10B (Bethesda Research Laboratories), TG1, K12 delta H1 delta trp, Y1088, Y1089, Y1090 sind auf dem Fachgebiet bekannt. Das Plasmid Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) wurde als Klonierungsvektor verwendet. Die Plasmide pEx34 a, b, c für die Expression von MS2-Fusionsproteinen sind zuvor beschrieben worden. Der für die Expressions-Genbank verwendete lambda gt11-Phagenvektor stammt aus dem lambda gt11-Klonierungssystem Kit (Bethesda Research Laboratories). Die E. coli-Stämme wurden in LB Medium gezüchtet (24). Die H. pylori-Stämme wurden auf Selektionsmedien ausplattiert (5% Pferdeblut, Columbia Agar Basis mit Dent oder Skirrows Antibiotika-Supplement, 0.2% Cyclodextrin) oder in Brucella-Broth Flüssigmedium mit 5% fötalem Kälberserum (6) oder 0.2% Cyclodextrin (25).
b. Anzucht von H. pylori und DNA-Isolierung
H. pylori-Stämme wurden in festen oder flüssigen Medien für 3 Tage bei 37°C gezüchtet, in beiden Fällen in mikroaerophiler Atmosphäre unter Verwendung von XID (Basingstoke, England) oder Becton und Dickinson (Cockeysville, MD) Gas-Pack-Generatoren oder in einem Inkubator, der Luft mit 5% CO₂ enthielt (26). Die Bakterien wurden geerntet und in STE resuspendiert (0.1M NaCl, 10mM Tris-HCl pH 8, 1mM EDTA pH 8), das Lysozym in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm/ml enthielt, und bei Raumtemperatur 5 min. inkubiert. Um die Bakterien zu lysieren, wurde SDS zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben und auf 65°C erwärmt. Nach Zugabe von Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 25 Mikrogramm/ml wurde die Lösung bei 50°C für 2 Stunden inkubiert. Die DNA wurde über einen CsCl-Gradienten in der Anwesenheit von Ethidiumbromid gereinigt, mit 77% Ethanol gefällt, und mit einer versiegelten Glaskapillare isoliert.
c. Konstruktion und Absuchen einer lambda gt11-Expressions-Genbank
Zum Anlegen der lambda gtl1-Expressions-Genbank wurde mit den Restriktionsenzymen HaeIII und AluI partiell gespaltene genomische DNA des Stammes CCUG 17874 verwendet. Nach Fraktionierung auf einem 0.8% Agarosegel wurde die DNA mit einer Größe zwischen 0.6 und 8 kb unter Verwendung eines Costar Spin-X (0.22 Mikron) Mikrozentrifugen-Filters eluiert. Die Produkte von jeder Spaltung wurden vereinigt, und zur Konstruktion der Expressions-Genbank unter Verwendung des lambda gt11-Klonierungssystem Kits (Bethesda Research Laboratories) und des Gigapack II Gold Verpackungskits (Stratagene, La Jolla, CA) verwendet. Die Genbank, die 0.8 – 1 × 10⁶ rekombinante Phagen enthielt, wurde in E. coli Y1088 amplifiziert, was 150 ml Lysat mit einem Titer von 10⁹ Phagen/ml ergab, von denen 85% rekombinant waren und eine durchschnittliche Insertgröße von 900 Basenpaaren hatten. Das immunologische Absuchen wurde mit Standardverfahren unter Verwendung des Protoblot-Systems (Promega, Madison, WI) durchgeführt.
d. Konstruktion von Plasmid-Genbanken
Versuche zur Herstellung vollständiger genomischer Genbanken aus partiell gespaltener chromosomaler DNA unter Verwendung von Standardvektoren wie EMBL4 oder lambda DASH stießen auf die ebenfalls von vielen Autoren beschriebenen Schwierigkeiten bei der Klovierung von H. pylori-DNA und ergaben keine zufriedenstellenden Genbanken. Daher wurden partielle Genbanken unter Verwendung der mit dem Restriktionsenzym HindIII gespaltenen genomischen DNA der Stämme CCUG 17874, G39 und G50, kloniert in Bluescript SK+, hergestellt. DNA-Ligierung, Elektroporation von E. coli DH 10B, Absuchen, und Amplifikation der Genbank wurden durchgeführt. Es wurden Genbanken in der Größenordnung von 70000 bis 85000 Kolonien mit einem Hintergrund von nicht mehr als 10% erhalten.
e. DNA-Manipulation und Nukleotidsequenzierung
DNA-Manipulationen wurde unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung von Sequenase 2.0 (USB) durchgeführt, und die in 3 gezeigten DNA-Fragmente in Bluescript KS+ subkloniert. Jeder Strang wurde mindestens dreimal sequenziert. Der Bereich zwischen den Nukleotiden 1533 und 2289, für den kein DNA-Klon verfügbar war, wurde durch PCR amplifiziert und unter Verwendung asymmetrischer PCR und direkter Sequenzierung amplifizierter Produkte sequenziert. Die Überschneidung dieses Bereichs wurde durch einfach und doppelt verankerte PCR bestätigt: ein externer Universal-Anker
der eine vorstehende HindIΠ-Sequenz und Erkennungsstellen für ClaI, SalI, XhoI enthielt, wurde an eine Primer-verlängerte DNA ligiert und amplifiziert. Ein zweiter PCR-Durchgang unter Verwendung eingebetteter Frimer wurde dann verwendet, um für Klovierung und Sequenzierung geeignete DNA-Fragmente zu erhalten. DNA-Sequenzdaten wurden mit dem GCG-Paket (Genetics Computer Group, Inc., Madison, WT), das auf einer VAX 3900 unter VMS läuft, zusammengestellt und analysiert. Die GenBank- und EMBL-Datenbanken wurden unter Verwendung des EMBL VAX-Clusters abgesucht.
f. Protein-Reinigung und ELISA
Proteinextrakte wurden durch Behandlung von H. pylori-Niederschlägen mit 6 M Guanidin erhalten. Western-Blots, SDS-PAGE, Elektroelution wurden mit Standardverfahren durchgeführt. Fusionsproteine wurden induziert und durch Elektroelution oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Gereinigte Proteine wurden zur Immunisierung von Kaninchen und zur Beschichtung von Mikrotiterplatten für ELISA-Tests verwendet. Seren von Menschen mit normaler Schleimhaut, Blutspendern und Patienten wurden von A. Ponzetto (Turin, Italien) erhalten. Die klinische Diagnose beruhte auf der Histologie von Magen-Biopsien. Die vakuolisierende Aktivität der Proben wurde an HeLa-Zellen getestet, wie von Cover et al., Infect. Immun. 59 (1991), 1264-70, beschrieben.
2. Ergebnisse
a. Immunodominanz und Cytotoxizität
Die Untersuchung von Western-Blots von H. pylori-Guanidinextrakten mit Seren von Patienten mit einer gastroduodenalen Erkrankung zeigte, daß ein 130 kDa Protein, das eine schwache Komponente im Coomassie-gefärbten Gel ist, von allen untersuchten Seren stark erkannt wird. Das CAI-Protein wurde elektroeluiert und zur Herstellung eines Maus-Serums verwendet, das im Western-Blot nur dieses Protein erkannte. Dieses Serum wurde dann zum Nachweis des CAI-Proteins durch Western-Blot in Extrakten von H. pylori-Stämmen verwendet. Das Antigen war in allen 10 Stämmen vorhanden, die vakuolisierende Aktivität auf HeLa-Zellen hatten, während es in den acht Stämmen ohne diese Aktivität nicht vorhanden war; darüberhinaus variierte die Größe des Proteins in geringem Maße zwischen den Stämmen. Das CAI-Antigen wurde durch Western-Blot nicht in anderen untersuchten Spezies, wie Campylobacter Liuni, Helicobacter mustelae, E. coli. und Bordetella pertussis gefunden.
b. Struktur des cai-Gens
10⁶ Klone der lambda gtl1-Expressions-Genbank wurden mit dem für CAI spezifischen Maus-Serum und mit einem Pool aus Seren von Patienten mit einer gastroduodenalen Erkrankung abgesucht. Das Maus-Serum erbrachte positive Klone mit einer Häufigkeit von 3 × 10^–3. Die Sequenzanalyse von 8 Klonen ergab, daß sie sich alle mit dem in 3 gezeigten Klon A1 teilweise überschnitten. Der Pool aus Human-Seren identifizierte viele Klone, die unterschiedliche Bereiche des cai-Gens enthielten, einschließlich der Klone 57/D, 64/4 und 24 und mehrerer Klone, die mit Klon A1 überlappen.
Die Klone A1, 64/4, G5, A17, 24 und 57/D in 3 wurden aus der lambda gt11-Genbank erhalten. Der Klon B1 wurde aus einer Plasmid-Genbank aus HindIII-Fragmenten erhalten. E. coli, die die Plasmide 57/D, 64/4, B1 (B/1) und P1-24 (das hinterste Plasmid von Nukleotid 2150 bis 2650) enthielten, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt, siehe unten. 007 wurde durch PCR erhalten. Der offene Leserahmen ist am unteren Rand von 3 gezeigt. Pfeile bezeichnen Position und Richtung der als Sequenzierungs-Primer verwendeten ligonukleotide, und die Position der Insertion der repetitiven Sequenz von G39 ist gezeigt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz eine dieser repetitiven in Stamm 39 gefundenen Sequenzen ist ebenfalls gezeigt. Die Großbuchstaben bezeichnen die aus dem cai-Gen duplizierten Sequenzen D1, D2 und D3, die Kleinbuchstaben bezeichnen die verbindenden Nukleotid- und Aminosäuresequenzen; P = Promotor und T = Terminator.
Die Nukleotidsequenz des gesamten Bereiches wurde unter Verwendung der aus der lambda gt11-Genbank erhaltenen Klone bestimmt, der Klon B1 aus der HindIII-Plasmidbank isoliert, und das Fragment 007 durch PCR mit chromosomaler DNA erhalten. Die Computeranalyse der 5925 Nukleotide langen Sequenz ergab einen langen offenen Leserahmen von Nukleotid 535 bis 3977, der im Leseraster mit den Fusionsproteinen war, die sich von den lambda gt11-Klonen 64/4, 24 und A1 und A17 ableiten. Klon 57/D enthielt nur im 3'-Bereich des klonierten Fragments einen offenen Leserahmen, und konnte daher kein Fusionsgen mit dem Beta-Galactosidase-Gen von lambda gt11 bilden. Die Anwesenheit eines immunreaktiven Proteins im lambda gt11-Klon 57/D konnte nur durch die Anwesenheit eines endogenen Promotors erklärt werden, der die Expression eines nicht-fusionierten Proteins steuerte. Diese Hypothese wurde durch Subklonierung des Inserts 57/4 in beiden Richtungen in den Bluescript-Plasmidvektor und Nachweis eines immunreaktiven Proteins in beiden Fällen als richtig bestätigt. Ein abschließender Beweis, daß das identifizierte Gen tatsächlich das CAI-Antigen kodiert, wurde durch Subklonierung der Inserts A17 und 64/4 in den pEx 34B-Plasmidvektor erbracht, um so Fusionsproteine zu erhalten, die gereinigt und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet wurden. Die erhaltenen Seren erkannten spezifisch die CPI-Antigenbande in cytotoxischen H. pylori-Stämmen.
Das cai-Gen kodiert ein mutmaßliches Protein mit 1147 Aminosäuren, mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 128012.73 Dalton und einem isoelektrischen Punkt von 9.72. Die basischen Eigenschaften des gereinigten Froteins wurden durch zweidimensionale Gelelektrophorese bestätigt. Die Codonverwendung und der GC-Gehalt (37%) des Gens waren denen anderer beschriebener H. pylori-Gene ähnlich (13,26). Eine mutmaßliche Ribosomen-Bindungsstelle: AGGAG, wurde 5 Basenpaare stromaufwärts des vorgeschlagenen ATG-Startcodons identifiziert. Eine Computersuche nach Promotorsequenzen der Region stromaufwärts des ATG-Startcodons identifizierte Sequenzen, die entweder der m10 oder der –35 Region ähneln, es wurde aber keine Region mit einer guten Übereinstimmung zu einem E. coli-Promotor oder einer Ähnlichkeit mit publizierten H. pylori- Promotorsequenzen gefunden. Die Primer-Extensions-Analyse gereinigter H. pylori-RNA zeigte zwei Transkriptions-Startstellen 104 und 214 Basenpaare stromaufwärts des ATG-Startcodons. Es konnten jeweils keine kanonischen Promotoren stromaufwärts der beiden Transkriptions-Initiationsstellen identifiziert werden. Die Expression eines Teils des CAI-Antigens durch Klon 57/D legt nahe, daß E. coli ebenfalls einen Promotor in diesem Bereich erkennt, es ist jedoch nicht klar, ob E. coli die gleichen Promotoren von H. pylori erkennt, oder ob die AT-reiche DNA von H. pylori E. coli Bereiche liefert, die als Promotoren wirken können. Ein rho-unabhängiger Terminator wurde stromabwärts des Stopcodons Identifiziert. In 4 sind die AGGAG-Ribosomen-Bindungsstelle und der Terminator unterstrichen, und die repetitive Sequenz und das 6 Asparagine enthaltende Motiv sind eingerahmt. Das CAI-Antigen ist sehr hydrophil, und zeigt keine offensichtlichen Leaderpeptide oder Transmembransequenzen. Der am stärksten hydrophile Bereich erstreckt sich von Aminosäure 600 bis 900, wo auch eine Reihe ungewöhnlicher Merkmale beobachtet werden können: Die Wiederholung der Sequenzen EFKNGKNKDFSK und EPIYA, und die Anwesenheit einer Reihe von sechs aufeinanderfolgenden Asparaginen (eingerahmt in 4).
c. Diversität des cai-Gens
Die Diversität des Gens scheint durch interne Duplikationen hervorgerufen zu werden. Um den Mechanismus der Größenheterogenität des CAI-Proteins in verschiedenen Stämmen aufzuklären, wurde die Struktur eines der Stämme mit einem größeren CAI-Protein (G39) durch Southern-Blot, PCR und DNA-Sequenzierung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß die cai-Gene von G39 und CCUG 17874 in der Größe bis Position 3406 identisch waren, an der der Stamm G39 eine aus zwei identischen Wiederholungen von 102 Basenpaaren bestehende Insertion von 204 Basenpaaren beinhaltet. Jede Wiederholung enthält Sequenzen, die sich aus der Duplizierung von 3 DNA-Segmenten (Sequenzen D1, D2 und D3 in 3) herleiten, die aus dem gleichen Bereich des cai-Gens stammen und durch kurze verbindende Sequenzen verbunden sind. Eine schematische Darstellung des Bereiches, in dem die Insertion stattfand, und der Insertion selbst ist in 3 gezeigt.
d. Das cai-Gen fehlt in nicht-cytotoxischen Stämmen
Um zu untersuchen, warum nicht-cytotoxischen Stämmen das CAI-Antigen fehlt, wurde DNA von zwei dieser Stämme (G50 und G21) mit den Restriktionsenzymen EcoRI, HindIII und HaeIII gespalten, und im Southern-Blot mit zwei Sonden innerhalb des cai-Gens im Bereich der Nukleotide 520–1840 bzw. 2850–4331 untersucht. Beide Sonden erkannten stark hybridisierende Banden in den Stämmen CCUG 17874 und G39. Die Größen der Banden unterschieden sich in den zwei Stämmen, in Übereinstimmung mit der Diversität des Gens. Keine der Sonden hybridisierte hingegen mit der DNA aus G50 und G21. Dies zeigte, daß die untersuchten nicht-cytotoxischen Stämme das cai-Gen nicht enthalten.
e. Serum-Antikörper
Die Anwesenheit von Serum-Antikörpern gegen das CAI-Antigen korrelierte mit gastroduodenalen Erkrankungen. Um die quantitative Antikörperantwort gegen das CAI-Antigen zu untersuchen, wurde das von dem in pEx34 subklonierte Fragment A17 produzierte Fusionsprotein bis zur Homogenität aufgereinigt und zum Beschichten von Mikrotiterplatten für einen ELISA-Test verwendet. In diesem Test hatten die Patienten mit gastroduodenalen Krankheitsbildern im Durchschnitt einen ELISA-Titer, der signifikant höher war als der in zufällig ausgewählten Blutspendern und Menschen mit normaler Magenschleimhaut gefundene. Um zu überprüfen, ob der Antikörpertiter mit einer bestimmten gastroduodenalen Erkrankung korrelierte, wurden die Seren von Patienten mit bekannter histologischer Diagnose in dem ELISA-Test untersucht. Patienten mit Zwölffingerdarm-Geschwüren hatten im Durchschnitt einen signifikant höheren Antikörperiiter als alle Patienten mit anderen Erkrankungen. Zusammenfassend wurde gefunden, daß der ELISA 75.3% der Patienten mit einer beliebigen gastroduodenalen Erkrankung und 100% der Patienten mit Zwölffingerdarm-Geschwür erkennen konnte.
In einem bestimmten ELISA wurde ein rekombinantes Protein, das 230 aus dem CAI-Antigen stammende Aminosäuren enthielt, durch Absuchen einer Expressions-Genbank aus H. pylori-DNA unter Verwendung eines für das Protein spezifischen Antiserums identifiziert. Das rekombinante Protein wurde als Fusionsprotein in E. coli exprimiert, bis zur Homogenität aufgereinigt, und zum Beschichten von Mikrotiterplatten verwendet. Die Platten wurden dann für 90 Minuten mit einer 1 : 2000-Verdünnung eines anti-human IgG aus Ziege, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, inkubiert. Nach dem Waschen wurde das Enzymsubstrat zu den Platten gegeben und die optische Dichte bei 405 nm 30 Minuten später bestimmt. Der Ausschlußwert wurde unter Verwendung von Seren von 20 Individuen, die weder gastritsche Erkrankungen noch im Western-Blot nachweisbare anti-H. pylori-Antikörper hatten, durch die gemittelte Absorption plus zwei Standardabweichungen ermittelt. Der ELISA-Test wurde mit peripheren Blutproben von zweiundachtzig magenkranken Patienten (durchschnittliches Alter 50.6 ± 13.4 Jahre, im Bereich von 28 bis 80) geprüft, die sich endoskopischen Routineuntersuchungen des oberen Gastrointestinaltraktes unterzogen. Die Schleimhaut des Antrums der Patienten wurde zur histologischen und Giemsa-Anfärbung erhalten. Zwanzig der Patienten hatten Zwölffingerdarm-Geschwüre, 5 hatten Magengeschwüre, 43 hatten eine aktive Chronische Typ-B-Gastritis, 8 hatten eine Zwölffingerdarm-Entzündung und 6 hatten eine normale Histologie der Magenschleimhaut. Alle Patienten mit Zwölffingerdarm-Geschwür hatten einen Wert der optischen Dichte über dem Ausschluß-Wert. Die Patienten mit Zwölffingerdarm-Entzündung, Zwölffingerdarm-Geschwür und Chronischer Gastritis hatten einen positiven ELISA-Wert in 75% bzw. 80% bzw. 53.9% der Fälle. Die Übereinstimmung zwischen ELISA und histologischer Giemsa-Färbung betrug 95% bei Zwölffingerdarm-Geschwüren, 98% bei Zwölffingerdarm-Entzündung und 55.8% bei Chronischer Gastritis. Dieser Test ergibt eine hervorragende Korrelation mit Zwölffingerdarm-Geschwür-Erkrankungen (p < 0.0005).
iii. Hitzeschock-Protein (hsp) (zur Information; nicht Teil der Erfindung)
1. Material und Methoden
a. H. pylori-Stämme und Anzucht-Bedingungen
Die verwendeten H. pylori-Stämme waren: CCUG 17874, G39 und G33 (isoliert aus Magen-Biopsien im Hospital von Grosseto, Italien), Pylo 2U+ und Pylo 2U- (zur Verfügung gestellt von F. Megraud, Hospital Pellegrin, Bordeaux, Frankreich), BA96 (isoliert aus Magen-Biopsien an der Universität von Siena, Italien). Stanzen Pylo2U+ ist nicht-cytotoxisch; Stamm Pylo2U- ist nicht-cytotoxisch und Urease-negativ. Alle Stämme wurden standardmäßig auf Columbia-Agar mit 0.2% Cyclodextrin, 5μg/ml Cefsulodin und 5μg/ml Amphotericin B unter mikroaerophilen Bedingungen für 5–6 Tage bei 37°C gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und mit PSB gewaschen. Die Niederschläge wurden in Laemmli-Probenpuffer resuspendiert und durch Kochen lysiert.
Es wurden Seren von Patienten, die unter Gastritis und Magengeschwüren litten (zur Verfügung gestellt von A. Ponzetto, Hospital "Le Molinette", Turin, Italien), und Seren von Patienten mit Magenkarzinom (zur Verfügung gestellt von F. Roviello, Universität von Siena, Italien) verwendet.
b. Absuchen der Genbank durch Immunreaktion
Fünfhunderttausend Plaques einer λgt11-Expressions-Genbank aus H. pylori-DNA wurden mit 5 ml einer Suspension des E. coli-Stammes Y1090 gemischt, der üN. in LB mit 0.2% Maltose und 10 mM MgSO₄ gezüchtet wurde, und in 10 mM MgSO₄ zu 0.5 OD resuspendiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37°C wurden 75 ml geschmolzener TopAgarose in das Bakterien/Phagen-Gemisch gegossen und der gesamte Ansatz wurde auf BBL-Platten ausgestrichen (50,000 Plaques/Platte). Nach einer 3.5-ständigen Inkubation der ausgestrichenen Genbank bei 42°C wurden zuvor mit 10 mM IPTG angefeuchtete Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) auf die Platten gelegt, und die Inkubation wurde um 3.5 Stunden bei 37°C und dann üN bei 4°C verlängert. Die abgezogenen Filter mit den lambda-Proteinen wurden in PBS gespült, und mit 5%o fettfreiem Milchpulver, gelöst in TBST (10 mM Tris pH8, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂), für 20' abgesättigt. Der erste Hybridisierungsschritt wurde mit Patienten-Seren durchgeführt; zum Entwickeln und Sichtbarmachen positiver Plaques verwendeten wir einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten anti-human Ig Antikörper (Cappel, West Chester, PA) und den NBT/BCIP Kit (Promega, Madison, WI) in AP-Puffer (100mM Tris pH 9.5, 10 mM NaCl, 5mM MgCl₂) nach Vorschrift des Herstellers.
c. Rekombinante DNA-Verfahren
Die verwendeten Reagentien und Restriktionsenzyme stammten von Sigma (St. Louis, MO) und Boehringer (Mannheim, Deutschland). Standard-Verfahren wurden für molekulare Klonierung, Aufreinigung einzelsträngiger DNA, Transformation in E. coli, radioaktive Markierung von Sonden, Absuchen von Kolonien der genomischen Genbank aus H. pylori-DNA, Southern-Blot Analyse, PAGE und Western-Blot Analyse verwendet.
d. DNA-Sequenzanalyse
Die DNA-Fragmente wurden in Bluescript SK+ (Stratagene, San Diego, CA) subkloniert. Sequenzierung einzelsträngiger DNA wurde unter Verwendung von [³³P]α-dATP (New England Nuclear, Boston, MA) und des Sequenase Kits (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. Die Sequenz wurde auf beiden Strängen bestimmt und jeder Strang wurde im Durchschnitt zweimal sequenziert. Die Computer Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des GCG-Pakets durchgeführt.
e. Rekombinante Proteine
MS2-Polymerase-Fusionsproteine wurden unter Verwendung des Vektors pEX34A, eines Derivats von pEX31, produziert. Insert Hp67 (von Nukleotid 445 bis Nukleotid 1402 in 5), und die EcoRI-Linker wurden im Leserahmen in die EcoRI-Stelle des Vektors kloniert. Um den rt des Stopcodons zu bestätigen, wurde das HpG3' HindIII- Fragment im Leserahmen in die HindIII-Stelle von pEX34A kloniert. Rekombinante Plasmide wurden in E. coli K12 ΔH1 Δtrp kloniert. In beiden Fällen wurde nach Induktion ein Fusionsprotein mit dem erwarteten Molekulargewicht produziert. Im Fall des EcoRI/EcoRI-Fragments wurde das nach Induktion erhaltene Fusionsprotein elektroeluiert, um Kaninchen unter Verwendung von Standardprotokollen zu immunisieren.
2. Ergebnisse
a. Absuchen einer Expressions-Genbank und Klonierung des H. pylori-hsp
Um ein zum Absuchen einer H. pylori-Expressions-Genbank geeignetes Serum zu finden, wurden durch Behandlung mit Ultraschall erzeugte Extrakte des H. pylori-Stamms CCUG 17874 in Western-Blot-Analysen gegen Seren von Patienten getestet, die unter verschiedenen Formen von Gastritis litten. Das Muster der Antigenerkennung durch verschiedene Seren war unterschiedlich, wahrscheinlich entweder aufgrund von Unterschieden in den individuellen Immunantworten oder von Unterschieden in den Antigenen, die von den mit der Infektion zusammenhängenden Stämmen exprimiert wurden.
Serum Nr. 19 wurde zum Absuchen einer λgt11-Expressions-Genbank von H. pylori ausgewählt, um spezifische Antigene von H. pylori zu identifizieren, die während des Bakterienwachstums in vivo exprimiert werden. Nach dem Absuchen der Genbank mit diesem Serum wurden viele positive Klone isoliert und charakterisiert. Die Nukleotidsequenz eines dieser Klone, genannt Hp67, ergab einen offenen Leserahmen von 958 Basenpaaren, der ein Protein mit hoher Homologie zu der hsp60-Familie von Hitzeschock-Proteinen kodiert, Ellis, Nature 358 (1992), 191-92. Um die vollständige kodierende Region zu erhalten, verwendeten wir Fragment Hp67 als Sonde für die Southern-Blot-Analyse von H. pylori-DNA, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten war. Sonde Hp67 erkannte zwei HindIII-Banden mit ungefähr 800 bzw. 1000 Basenpaaren. Eine genomische H. pylori-Genbank aus HindIII-gespaltener DNA wurde mit der Sonde Hp67 abgesucht, und zwei positive Klone (HAGS' und HpG3') mit dem erwarteten Molekulargewicht wurden erhalten. E. coli, die die Plasmide pHp60G2 (ungefähr Nukleotide 1 bis 829) und pHp60G5 (ungefähr Nukleotide 824 bis 1838) wurden in der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt.
b. Sequenz-Analyse
Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab einen offenen Leserahmen mit 1638 Basenpaaren, mit einer mutmaßlichen Ribosomen-Bindungsstelle 6 Basenpaare stromaufwärts des Start-ATG. 5 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des H. pylori-hsp. Die mutmaßliche Ribosomen-Bindungsstelle und die interne HindIII-Stelle sind unterstrichen. Das Cytosin an Position 445 und das Guanin an Position 1402 sind das erste bzw. letzte Nukleotid in Fragment Hp67. Thymin 1772 wurde als das mutmaßlich letzte transkribierte Nukleotid unter Verwendung eines Algorithmus für die Lokalisierung von Faktor-unabhängigen Terminatorregionen identifiziert. Der offene Leserahmen kodiert ein Protein mit 546 Aminosäuren, mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 58.3 kDa und einem vorhergesagten pI von 5.37. Die Codonpräferenz dieses Gens stimmt mit der Codonverwendung von H. pylori überein.
Die Analyse der Hydrophilizitätsprofile ergab ein überwiegend hydrophiles Protein ohne vorhergesagtes Leaderpeptid oder andere Transmembrandomänen. Die aminoterminale Sequenz zeigte eine 100%-ige Homologie zu der 30 Aminosäuren großen, von Dunn et al., Infect. Immun. 60 (1992), 1946-51, ermittelten Sequenz des gereinigten Proteins und unterschied sich nur in einem Rest (Ser42 anstelle von Lys) von der 44 Aminosäuren großen, von Evans et al., Infect. Immun. 60 (1992), 2125-27, veröffentlichten Sequenz. (Evans et al., 1992). Die N-terminale Sequenz des reifen Hitzeschockproteins enthielt das Start-Methionin nicht, was darauf hinweist, daß dieses nach der Translation entfernt worden ist.
c. Homologie mit der hsp60-Familie
Die Analyse der Aminosäuresequenz zeigte eine ausgeprägte Homologie zu der hsp60-Familie von Hitzeschockproteinen, deren Mitglieder in jedem lebenden rganismus vorkommen. Basierend auf dem Grad der Homologie zwischen den hsp60-Proteinen verschiedener Spezies, gehört das H. pylori-hsp zur Untergruppe der hsp60-Proteine Gram-negativer Bakterien; der Grad der Homologie zu anderen Proteinen der hsp60-Familie ist jedoch sehr hoch (mindestens 54% Identität).
d. Expression rekombinanter Proteine und Herstellung eines polyklonalen Antiserums
Die Inserts der Klone Hp67 und HpG3' wurden in den Expressionsvektor pEX34A subkloniert, um diese offenen Leserahmen, fusioniert mit dem Aminoterminus der MS2-Polymerase, zu exprimieren. Die Klone produzierten rekombinante Proteine der erwarteten Größe und wurden von dem für das ursprüngliche Absuchen verwendeten Human-Serum erkannt. Das aus Klon Hp67 erhaltene Fusionsprotein wurde elektroeluiert und zur Immunisierung von Kaninchen verwendet, um anti-hsp-spezifische polyklonale Antiseren zu erhalten. Das erhaltene Antiserum erkannte beide Fusionsproteine und ein Protein von 58 kDa in Extrakten aus ganzen Zellen verschiedener getesteter H. pylori-Stämme, einschließlich eines Urease-negativen Stammes und nicht-cytotoxischer Stämme.
Es wurde gezeigt, daß hsp in allen untersuchten H. pylori-Stämmen exprmiert wurde, und seine Expression nicht mit der Anwesenheit der Urease oder mit der Cytotoxizität zusammenhängt. Das von dem anti-hsp-Antiserum erkannte Protein wurde in den wasserlöslichen Extrakten von H. pylori gefunden und wurde zusammen mit den Urease-Untereinheiten aufgereinigt. Dies legt eine schwache Assoziation dieses Proteins mit der äußeren Bakterienmembran nahe. Daher kann hsp als mit Urease assoziiert und an der berfläche liegend beschrieben werden. Die Lokalisierung auf der Zelloberfläche ist überraschend, da die meisten der hsp-homologen Proteine im Cytoplasma oder in Mitochondrien und Plastiden lokalisiert sind. Die Abwesenheit eines Leaderpeptids in hsp legt den Schluß nahe, daß dieses entweder durch ein besonderes Exportsystem zur Membran exportiert wird, oder daß das Protein aus dem Cytoplasma abgegeben und nach dem Tod des Bakteriums passiv durch die Bakterienmembran adsorbiert wird.
Es wurde gezeigt, daß hsp60-Proteine als molekulare Chaperone wirken, indem sie die korrekte Faltung, den Zusammenbau und die Translokation von oligomeren oder multimeren Proteinen unterstützen. Die zelluläre Lokalisierung des H. pylori-hsp und seine schwache Assoziation mit der Urease legen nahe, daß hsp eine Rolle bei der Unterstützung der Faltung und/oder des Zusammenbaus von Proteinen spielen könnte, die sich an der Membranoberfläche befinden und aus mehreren Untereinheiten aufgebaut sind, so wie die Urease, deren endgültige Quartär-Struktur A₆B₆ ist. Austin et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 7470-73, zeigten, daß die Überstruktur des H. pylori-hsp aus sieben Untereinheiten besteht, die zu einem Scheiben-förmigen Teilchen zusammengebaut sind, das sich weiter Seite an Seite in Vierergruppen aufschichtet. Diese Struktur ähnelt der Form und der Größe des Urease-Makromoleküls, und dies könnte die gemeinsamen Eigenschaften dieser zwei Makromoleküle erklären, die zu ihrer geminsamen Aufreinigung führen. Das hsp-Gen von H. pylori ist jedoch kein Teil des Urease-perons. In Übereinstimmung mit der Genstruktur anderer bakterieller hsp60-Proteine sollte es Teil eines dicistronischen perons sein.
e. Anwesenheit von anti-hsp-Antikörpern in Patienten mit gastroduodenalen Erkrankungen
Das gereinigte Fusionsprotein wurde im Western-Blot unter Verwendung von Seren von Patienten, die mit H. pylori infiziert waren und unter atrophischer und oberflächlicher Gastritis litten, und von Patienten mit Zwölffingerdarm- und Magengeschwüren getestet: Die meisten Seren erkannten das rekombinante Protein. Der Grad der Erkennung variierte jedoch beträchtlich zwischen verschiedenen Individuen und die Antikörperspiegel zeigten keine offensichtliche Korrelation mit der Art der Erkrankung. Darüberhinaus wurden Antikörper gegen H. pylori-Antigene und gegen das hsp-Protein im Besonderen in den meisten der 12 getesteten Seren der Patienten gefunden, die unter Magenkarzinomen litten. bwohl die Erkennung des hsp von H. pylori nicht mit einem bestimmten klinischen Erkrankungszustand in Verbindung gebracht werden konnte, ist es in Anbetracht der hohen Konservierung zwischen dem hsp von H. pylori und seinem Homolog im Menschen möglich, daß dieses Protein autoimmune Antikörper induzieren könnte, die mit dem menschlichen Gegenstück kreuzreagieren. Diese Klasse homologer Proteine ist mit der Induktion von Autoimmun-Erkrankungen in verschiedenen Systemen in Verbindung gebracht worden. Die Anwesenheit hoher Titer von anti-H. pylori-hsp-Antikörpern, die möglicherweise mit dem menschlichen Homolog in magenkranken Patienten kreuzreagieren, legt nahe, daß dieses Protein eine Rolle bei gastroduodenalen Erkrankungen spielt. Die Autoreaktivität könnte eine Rolle bei der Gewebeschädigung spielen, die bei H. pylori-induzierter Gastritis auftritt und so die pathogenen Mechanismen im Zusammenhang mit der Infektion durch dieses Bakterium verstärken.
Die hohen Antikörperspiegel gegen ein so konserviertes Protein sind etwas ungewöhnlich; aufgrund der hohen Homologie zwischen Mitgliedern der hsp60-Familie, einschließlich der menschlichen, sollte dieses Protein vom Immunsystem des Wirts sehr gut toleert werden. Die in vielen Patienten beobachtete starke Immunantwort kann auf zwei unterschiedliche Arten erklärt werden: (1) die Immunantwort ist nur gegen Epitope gerichtet, die für das hsp von H. pylori spezifisch sind; (2) die Immunantwort ist gegen Epitope gerichtet, die das hsp von H. pylori und sein menschliches Homolog gemeinsam haben.
H. Hinterlegung von biologischem Material

Das folgende Material wurde am 15. Dezember 1992 und am 22. Januar 1993 durch Biocine Sclavo, S.p.A., bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Telefon (301) 231-5519, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck des Patentverfahrens hinterlegt. Für das cytotoxische Protein (CT):

ATCC Nr. 69157	E. coli TG1, enthaltend Plasmid TOXHH1
ATCC Nr. n/a	E. coli TG1, enthaltend Plasmid TXEE1

Für das CAI-Protein:

ATCC Nr. 69158	E. coli TG1, enthaltend Plasmid 57/D
ATCC Nr. 69159	E. coli TG1, enthaltend Plasmid 64/4
ATCC Nr. 69160	E. coli TG1, enthaltend Plasmid P1-24
ATCC Nr. 69161	E. coli TG1, enthaltend Plasmid B/1

Für das Hitzeschock-Protein (hsp):

ATCC Nr. 69155 E. coli TG1,	enthaltend Plasmid pHp60G2
ATCC Nr. 69156 E. coli TG1,	enthaltend Plasmid pHp605

Diese Hinterlegungen sind zum Vorteil des Fachmanns bereitgestellt. Die Nukleinsäuresequenzen dieser Hinterlegungen, wie auch die Aminosäuresequenzen der dadurch kodierten Polypeptide, sind hier als Referenz aufgenommen und sollten im Falle eines jeglichen Fehlers in den hier beschriebenen Sequenzen im Vergleich zu den Sequenzen der Hinterlegungen als Bezug genannt werden. Eine Lizenz zur Herstellung, Gebrauch, oder Verkauf des hinterlegten Materials kann erforderlich sein, und keine solche Lizenz wird hiermit bewilligt.

Claims

Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Helicobacter pylori-Cytotoxin-assoziierten immunodominanten Antigen mit der Aminosäuresequenz aus 4; (b) einem Helicobacter pylori-Cytotoxin-assoziierten immunodominanten Antigen mit der Aminosäuresequenz aus 4, modifiziert durch eine oder mehrere konservative Aminosäureaustausche; (c) einem Protein, welches immunologisch identifizierbar ist durch einen Antikörper, welcher spezifisch mit dem Helicobacter pylori-Cytotoxinassoziierten immunodominanten Antigen aus (a) reagiert; (d) einem Helicobacter pylori-Cytotoxin-assoziierten immunodominanten Antigen, umfassend zwei Aminosäurewiederholungen der Aminosäuresequenz GRSVSPEPIYATIDDLGGPFPLKRHDKVDDLSKV; (e) einem Protein, umfassend ein Fragment der Aminosäuresequenz aus 4, wobei das Fragment einen Teil von mindestens elf Aminosäuren der Sequenz darstellt; (f) dem Protein aus (b), (c), (d) oder (e), umfassend die Aminosäuresequenz EFKNGKNKDFSK; (g) dem Protein aus (b), (c), (d) oder (e), umfassend die Aminosäuresequenz EPIYA; und (h) dem Protein aus (b), (c), (d) oder (e), umfassend die Aminosäuresequenz NNNNNN.
Protein nach Anspruch 1, welches markiert oder an einen festen Träger gekoppelt ist.
Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, zur Verwendung in der Behandlung einer Helicobacter pylori-I nfektion.
Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Verwendung als Impfstoff.
Impfstoff oder therapeutische Zusammensetzung, umfassend das Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Impfstoff oder therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, weiterhin umfassend ein oder mehrere: i) Helicobacter pylori-cytotoxische Proteine oder Vorläufer davon; ii) rekombinante Helicobacter pylori-Hitzeschockproteine; iii) Helicobacter pylori-Urease.
Impfstoff oder therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, weiterhin umfassend ein Adjuvans.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs oder einer therapeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, umfassend das Zusammenbringen eines oder mehrerer Proteine nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und, gegebenenfalls, einem Adjuvans.
In-vitro-immundiagnostischer Test, umfassend mindestens einen Schritt, der als mindestens einen Bindepartner ein Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 beinhaltet, welches gegebenenfalls markiert oder an einen festen Träger gekoppelt ist.
Kit zur Immundiagnose zur Durchführung eines Tests nach Anspruch 9, umfassend mindestens ein Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2.
Verwendung eines oder mehrerer Proteine nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung einer Helicobacter pylori-Infektion.
Polynucleotid, welches ein Protein nach Anspruch 1 codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 12, umfassend die gesamte oder einen Teil der Nucleotidsequenz aus 4.
Polynucleotid-Sonde, umfassend mindestens acht zusammenhängende Nucleotide aus (a) dem Polynucleotid aus Anspruch 12 oder Anspruch 13 oder (b) dem Komplement von (a).
Sonde nach Anspruch 14, umfassend mindestens 14 zusammenhängende Nucleotide von (a) oder (b).
Nucleinsäure-Test, wobei in mindestens einem Schritt die Sonde nach Anspruch 14 oder 15 verwendet wird.
Kit zur Durchführung eines Nucleinsäuretests, umfassend mindestens eine Polynucleotid-Sonde nach Anspruch 14 oder Anspruch 15.
Polynucleotid-Amplifikationsverfahren, wobei ein Polynucleotidprimer verwendet wird, wobei mindestens ein Primer ein Polynucleotid ist, welches mindestens 14 zusammenhängende Nucleotide aus (a) dem Polynucleotid aus Anspruch 12 oder Anspruch 13 oder (b) dem Komplement von (a) umfasst.
Kit zur Durchführung eines Polynucleotid-Amplifikationsverfahrens, wobei ein Polynucleotidprimer verwendet wird, wobei mindestens ein Primer ein Polynucleotid ist, welches mindestens 14 zusammenhängende Nucleotide des (a) Polynucleotids aus Anspruch 12 oder Anspruch 13 oder (b) des Komplements von (a) umfasst.
Vektor, umfassend ein rekombinantes Polynucleotid nach Anspruch 12 oder Anspruch 13.
Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 20.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend das Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 21 und Isolieren des rekombinanten Polypeptids.