DE69835682T2

DE69835682T2 - Oberflächenantigene und proteine für zusammensetzungen zu diagnose und vorbeugung der lyme-kkrankheit

Info

Publication number: DE69835682T2
Application number: DE69835682T
Authority: DE
Inventors: T. Mario Mandeville PHILIPP
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-06-30
Also published as: WO1999000413A1; DE69835682D1; US20040067517A1; US20030059894A1; PL337667A1; NO996514D0; AU8177298A; CN1261896A; ATE337335T1; EP1012181B1; US6660274B2; ES2270523T3; DK1012181T3; ZA985704B; AR016295A1; NO996514L; KR20010020567A; CA2294701C; CA2294701A1; JP2002511760A

Description

Die Erfindung wurde zum Teil von National Institutes of Health mit Grant Nr. ROI AI35027 und RR/AE00164-32 unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hält bestimmte Rechte an der Erfindung.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet pharmazeutischer und diagnostischer Zusammensetzungen, die sich zur Diagnose, Therapie und Prophylaxe von Lyme-Borreliose eignen. Insbesondere stellt die Erfindung ein isoliertes natürliches Oberflächenantigen von Borellia und Antikörper hierfür zur Verwendung bei der Diagnose, Therapie oder Prophylaxe der Lyme-Krankheit bereit.
Hintergrund der Erfindung
Borrelia burgdorferi sensu lato ist ein Gattungsbegriff, der Borrelia-Spezies umfasst, die mit Lyme-Borreliose (Lyme-Krankheit) in Verbindung stehen und als Erreger dieser Krankheit gelten: B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii und B. afzelii. Diese Krankheit wird durch den Biss verschiedener Spezies von Ixodes-Zecken, die die Spirochäte tragen, übertragen. Die Hauptinfektionsquelle in den Vereinigten Staaten ist die Weißfußmaus Peromyscus leucopus. Die Infektion kann auf zahlreiche Säugetierspezies, einschließlich Hunde, Katzen und Menschen, übertragen werden (J. G. Donahue et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 36 (1987), S. 92-96; R. T. Green et al., J. Clin. Micro., Bd. 26 (1988), S. 648-653). Trotz des Vorliegens einer aktiven Immunantwort hält die Krankheit bei den Patienten über Jahre hinweg an. Es wird angenommen, dass dieses Fortbestehen zumindest teilweise auf eine antigene Variation der bakteriellen Proteine zurückzuführen ist (J. R. Zhang et al., Cell, Bd. 89 (1997), S. 275-285).
Die Diagnose der Lyme-Krankheit bei Menschen und Tieren wird durch das Fehlen einer definitiven Serologie, die zu einem raschen und genauen Test führt, beeinträchtigt. Derzeitige diagnostische Tests leiden an einer geringen Empfindlichkeit und Spezifität, wie durch einen neueren Übersichtsartikel über die Leistungen diagnostischer Laboratorien des Wisconsin State Laboratory of Hygiene dargelegt wird (L. Bakken et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 35 (1997), S. 537). Somit besteht auf dem einschlägigen Gebiet ein Bedarf nach einer einfachen, empfindlichen und spezifischen diagnostischen Zusammensetzung und einem Verfahren zum frühen Nachweis der Lyme-Krankheit.
Publikationen über Proteine und Polypeptide von Borrelia burgdorferi legten deren Verwendung als diagnostische und pharmazeutische Mittel nahe. Zu derartigen Proteinen und Polypeptiden gehören die äußeren Oberflächenproteine A und B (OspA und OspB), Flagellin und andere Proteine mit den Bezeichnungen P21, P39, P66 und P83 entsprechend ihren geschätzten Molekulargewichten (A. G. Barbour et al., Infect. Immun., Bd. 45 (1984), S. 94-100; W. J. Simpson et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 28 (1990), S. 1329-1337; K. Hansen et al., Infect. Immun., Bd. 56 (1988), S. 2047-2053; K. Hansen et al., Infect. J. Clin. Microbiol., Bd. 26 (1988), S. 338-346; B. Wilske et al., Zentral. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1. Orig. Reihe. A., Bd. 263 (1986), S. 92-102; D. W. Dorward et al., J. Clin. Microbiol., Bd.29 (1991), S. 1162-1170; die veröffentlichte NTIS-US-Patentanmeldung 485 551; EP-A-465 204, Veröffentlichungstag B. Januar 1992; PCT/US91/01500, Veröffentlichungstag 19. September 1991; PCT/EP90/02282, Veröffentlichungstag 11. Juli 1991; PCT/DK89/00248, Veröffentlichungstag 3. Mai 1990; WO-92/00055, Veröffentlichungstag 9. Januar 1992).
Ein bevorzugter Proteinkandidat für einen Impfstoff ist OspA (M. Philipp et al, J. Spirochetal and Tick-borne Diseases, Bd. 3 (1996), S. 67-79). Die Expression von OspA wird entweder aufgehoben oder herunterreguliert, wenn sich die Spirochäten auf ihrem Weg vom Mitteldarm der Zecke zu den Speicheldrüsen befinden, während eine Blutaufnahme stattfindet (A. DeSilva et al., J. Exp. Med., Bd. 183 (1996), S. 271-275). Dieses Phänomen erzeugt mögliche Probleme insofern, als die Wirksamkeit des OspA-Impfstoffes abnehmen kann. Ein spirochätaler Abrieb erfolgt möglicherweise nur im Mitteldarm der Zecke (A. DeSilva et al., a.a.O.) und nicht bei Infektion des Wirbeltierwirts. Da der Speichel von Ixodes scapularis einen Dekomplementierungsfaktor enthält (T. Mather et al., "Ixodes saliva: vector competence for Borrelia burgdorferi and potential vaccine strategies", VII International Congress on Lyme Borreliosis, San Francisco, CA (1996)), könnte eine spirochätale Reibung innerhalb des Mitteldarms der Zecke über einen Mechanismus erfolgen, an dem nur der Antikörper und nicht das Komplement beteiligt sind.
Obgleich dieser Wirkungsmodus der antikörperabhängigen Abtötung nicht vollkommen verstanden worden ist, scheint es ein weniger wirksamer Mechanismus der Abtötung zu sein, verglichen mit der durch Antikörper und Komplement (die zusammenwirken) vermittelten Abtötung (M. Sole et al., Infect. Immunol., Bd. 66 (1998), S. 2540-2546). Somit könnte dies ein Entweichen solcher Spirochäten aus dem Mitteldarm ermöglichen, die eine geringe Oberflächendichte an OspA aufweisen. Tatsächlich stellt OspA zwar ein reichliches B. burgdorferi-Protein dar, jedoch liegt nur eine untergeordnete Fraktion von OspA-Molekülen frei an der Oberfläche der Spirochäten (D. Cox et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 93 (1996), S. 7973-7978). Somit können geringe Variationen der absoluten Anzahl von OspA-Oberflächenmolekülen signifikante Unterschiede in der Spirochäten-Reibungsrate verursachen und es einer Fraktion der residenten Spirochäten ermöglichen, in die Speicheldrüsen zu entkommen.
OspA-Fluchtmutanten entgehen insgesamt leicht der Abtötung und tragen dann, wenn sie für den Wirbeltierwirt infektiös sind, sogar noch weiter zur Verringerung des OspA-Impfstoffwirkungsgrads bei. In klonalen Populationen von B. burgdorferi, die man in vitro wachsen lässt, überwiegen Mutanten, die gegen die Abtötung durch anti-OspA-Antikörper resistent sind, in Bereichen von 10^–5 bis 10^–2 (A. Sadziene et al., J. Exp. Med., Bd. 176 (1992), S. 799-809). Wenn derartige Frequenzen in einer bei der Nahrungsaufnahme befindlichen Nymphe reproduziert werden, in der die Spirochätenzahlen innerhalb einer 15-stündigen Anhaftung einen Mittelwert von 7 848 erreichen können (A. DeSilva et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., Bd. 53 (1995), S. 397-404), so können in einer einzigen Zecke mehrere Mutanten vorliegen. Typische mutante Phänotypen umfassen solche, die weder OspA noch OspB exprimieren, und häufig Expressoren eines chimären Moleküls, das aus einem N-terminalen Fragment von OspA in Fusion mit einem C-terminalen Fragment. von OspB besteht, exprimieren. Diese Deletionsmutanten wurden in mehreren Stämmen von B. burgdorferi gefunden (P. Rosa et al., Mol. Microbiol., Bd. 6 (1992), S. 3031-3040) und in mehreren Zeckenisolaten aus Kalifornien (T. Schwan et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 31 (1993), S. 3096-3108). Chimäre (Deletions)-mutanten, die einer Abtötung mit anti-OspA-Antikörper allein widerstehen, können durch die kombinierte Wirkung von Antikörper und Komplement abgetötet werden. Da das Komplement in der Zecke anscheinend nicht-funktionell ist (T. Mather et al., a.a.O.) und OspA sowie auch vermutlich dessen chimäre Form kurz nach der Infektion nicht im Wirbeltierwirt exprimiert werden, könnten chimäre OspA-Fluchtmutanten den Wirbeltierwirt infizieren. Ferne r wird angenommen, dass bis zu 2 % von Ixodes-Zecken nur teilweise gesättigt sind und daher immer noch nach Nahrung trachten (Y. Lobet, persönliche Mitteilung). Wenn derartige Zecken ihre unvollendete Mahlzeit an einem mit B. burgdorferi infizierten Wirt eingenommen haben, weisen sie Spirochäten in ihren Speicheldrüsen auf, die kein OspA exprimieren und die einen OspA-geimpften Wirt leicht infizieren.
Es wurde weder eine Booster-Wirkung beobachtet (M. Philipp et al., a.a.O.) noch sollte eine solche Wirkung bei Spirochäten-Belastung bei einem OspA-geimpften Wirt erwartet werden. Somit sind beim OspA-Impfstoff möglicherweise wiederholte Verabreichungen zur Aufrechterhaltung von wirksamen Antikörpertitern erforderlich.
Somit besteht auf dem einschlägigen Gebiet ein Bedürfnis nach zusätzlichen und verbesserten Verfahren und Zusammensetzungen zur Prophylaxe der Lyme-Krankheit bei Menschen und Tieren sowie zur Therapie dieser Krankheit.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung befriedigt das auf dem einschlägigen Gebiet bestehende Bedürfnis durch Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur Prophylaxe der Lyme-Krankheit auf der Grundlage von Spirochäten-Antigenen, die durch die Spirochäte während ihres Verweilens im Wirbeltierwirt exprimiert werden. Derartige Verfahren und Zusammensetzungen können auch zur Therapie der Lyme-Krankheit eingesetzt werden.
Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Borrelia burgdorfer sensu lato-Oberflächenantigen, das in vivo durch die Spirochäte im Wirbeltierwirt exprimiert wird. Das Antigen, das hier als P39.5 bezeichnet wird, ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass es eine Molekülmasse von 39,5 kDa aufweist. Fragmente dieses Antigens eignen sich ebenfalls in den Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung neuartige Borrelia-Kassetten-String-Polypeptide/Proteine.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die für P39.5 oder ein Fragment davon, wie P7-1, kodieren, sowie Nucleinsäuresequenzen, die für andere Borrelia-Kassetten-String-Proteine oder Fragmente davon kodieren. Diese Nucleinsäuresequenzen umfassen Sequenzen, die mit den vorstehenden Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren, allele Varianten davon und Deletionsmutanten davon. Insbesondere stellt die Erfindung eine Nucleinsäuresequenz bereit, die für ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, die eine Bindung mit Antikörpern gegen den die Lyme-Krankheit bei einem Säuger verursachenden Erreger eingehen, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus:

(a) SEQ ID NO:1 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(b) SEQ ID NO:3 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(c) SEQ ID NO:4 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(d) SEQ ID NO:5 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(e) SEQ ID NO:6 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(f) SEQ ID NO:7 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(g) SEQ ID NO:8 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(h) SEQ ID NO:9 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(i) SEQ ID NO:10 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(j) SEQ ID NO:11 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(k) SEQ ID NO:12 oder eine hierzu komplementäre Sequenz;
(l) SEQ ID NO:13 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; und
(m) eine Sequenz, die für ein Protein kodiert, das ein Fragment von mindestens 8 Aminosäuren von SEQ ID NO:2 umfasst, wobei das Fragment an einen Antikörper bindet, der gegen das Protein von SEQ ID NO:2 erzeugt worden ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung neuartige Proteine, die Fragmente der P39.5-Proteinsequenz oder Kassetten-String-Proteinsequenzen gemäß der vorstehenden Beschreibung gegebenenfalls in Fusion oder im Gemisch mit einem zweiten ausgewählten Polypetpid oder Protein umfassen, wobei es sich dabei um ein Protein handeln kann, das in seiner Aminosäuresequenz eine bis etwa 90%ige Identität mit der Sequenz von P39.5 oder anderen Borrelia-Antigenen, wie OspA, aufweist, oder um Proteine oder Polypeptide, die sich von anderen Mikroorganismen ableiten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Protein oder ein Fragment davon, die eine Bindung mit Antikörpern gegen den die Lyme-Krankheit bei einem Säuger verursachenden Erreger eingehen, wobei das Protein oder Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:

(a) SEQ ID NO:2;
(b) SEQ ID NO:14;
(c) eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:13 kodiert wird;
(d) eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:7 kodiert wird;
(e) eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:11 kodiert wird; und
(f) eine Aminosäuresequenz von (a) bis (e), in der ein konservativer Aminosäureaustausch vorliegt;
(g) eine Aminosäuresequenz, die ein Fragment von mindestens 8 Aminosäuren von (a) oder (b) umfasst, wobei das Fragment an einen Antikörper bindet, der gegen ein Protein von SEQ ID NO:2 erzeugt worden ist.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung neuartige Proteinzusammensetzungen, die die vorstehend beschriebenen Proteinsequenzen des oder der Antigene oder Fragmente davon umfassen, gegebenenfalls im Gemisch mit einem zweiten ausgewählten Polypeptid oder Protein, bei dem es sich um ein Protein, das in seiner Aminosäuresequenz eine bis zu etwa 90%ige Identität mit der Sequenz von P39.5 aufweist, oder um andere Borrelia-Antigene, wie OspA, und Proteine oder Polypeptide, die von anderen Mikroorganismen abgeleitet sind, handeln kann.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur rekombinanten Erzeugung des vorstehend beschriebenen P39.5-Proteins, von Fragmenten davon oder von Fusionsproteinen, die derartige Fragmente enthalten, indem man eine DNA-Sequenz, die für das Protein, das Fragment oder das Fusionsprotein kodiert, in einer ausgewählten Wirtszelle exprimiert und das Protein daraus isoliert. Ferner werden Wirtszellen bereitgestellt, die mit derartigen DNA-Sequenzen transfomiert sind. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum rekombinanten Exprimieren des erfindungsgemäßen Proteins oder Fragments, wobei das Verfahren das Züchten einer rekombinanten Wirtszelle umfasst, die mit einer Nucleinsäuresequenz transfomiert ist, die das Protein oder Fragment unter Bedingungen kodiert, die die Expression des Proteins oder Peptids erlauben.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen isolierten Antikörper, der gegen das vorstehend beschriebene P39.5-Antigen, Fragmente davon, Kassetten-String-Proteine oder Fragmente oder ein Fusionsprotein mit einem Gehalt an derartigen Fragmenten gerichtet ist. Diese Antikörper können polyklonal sein. Derartige Antikörper lassen sich durch ein Verfahren erzeugen, das das Immunisieren eines Menschen oder eines Tiers mit einem isolierten Antigen gemäß der vorstehenden Beschreibung oder mit einem Fragment oder mit einem Gemisch von mehr als einem Fragment davon oder mit einem Fusionsprotein, das ein oder mehr Fragmente der Erfindung enthält, umfasst. Weitere Typen von Antikörpern lassen sich aus auf diese Weise immunisierten Tieren herstellen, z. B. rekombinante, monoklonale, chimäre, humanisierte Antikörper und dergl.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung und Verfahren zur Behandlung von Menschen und/oder Tieren mit Lyme-Krankheit. Die therapeutische Zusammensetzung enthält einen Antikörper oder ein Protein oder ein Fragment gemäß der vorstehenden Beschreibung und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Impfstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Impfen eines humanen oder tierischen Patienten gegen die Lyme-Krankheit durch Verwendung der vorstehend beschriebenen Zusammensetzungen. Die Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge mindestens eines erfindungsgemäßen Borrelia-Antigens, z. B. ein Antigen, das in vitro durch Borrelia-Spirochäten exprimiert wird, wobei das Antigen eine relative Molekülmasse von 39 500 Dalton aufweist, oder ein oder mehr antigene Fragmente davon oder ein Fusionsprotein, das ein derartiges Fragment enthält, oder ein oder mehr Kassetten-String-Proteine und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Impfstoffzusammensetzung kann das P39.5-Protein, Fragmente davon, Fusionsproteine oder Gemische von Proteinen gemäß der vorstehenden Beschreibung enthalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Impfstoffzusammensetzungen und Verfahren zum Impfen eines humanen oder tierischen Patienten gegen die Lyme-Krankheit unter Verwendung von Nucleinsäurezusammensetzungen, z. B. DNA-Impfstoffen. Die Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Menge einer DNA-Sequenz, die für mindestens ein erfindungsgemäßes Borrelia-Antigen oder ein oder mehr antigene Fragmente davon, ein oder mehr Kassetten-String-Antigene oder ein Fusionsprotein, das ein derartiges Fragment enthält, kodiert, und einen optionalen, pharmazeutisch verträglichen Träger.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Lyme-Borreliose in einem Menschen oder einem Tier. Dieses Verfahren umfasst die Stufe des Inkubierens eines erfindungsgemäßen Antigens oder Antikörpers, der vorzugsweise in herkömmlicher Weise für Nachweiszwecke markiert ist, mit einer Probe von biologischen Flüssigkeiten eines Menschen oder eines Tiers, bei denen eine Diagnose zu stellen ist. In Gegenwart einer B. burgdorferi-Infektion des humanen oder tierischen Patienten wird ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet. Anschließend wird das Reaktionsgemisch analysiert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Antigen-Antikörper-Komplexe festzustellen. In einer weiteren Ausführungsform kann der diagnostische Test DNA-Sequenzen, vorzugsweise antisense-Sequenzen, des Antigens oder von Fragmenten davon verwenden und die Infektion durch das Vorliegen von Sequenzen in einer biologischen Flüssigkeit eines Patienten, die damit hybridisieren, diagnostizieren. Weitere herkömmliche Testformate können unter Verwendung von Reagenzien, die in dieser Erfindung identifiziert werden, verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Kit zur Diagnose einer Infektion mit B. burgdorferi in einer humanen oder tierischen Patientenprobe bereit, wobei das Kit mindestens einen Antikörper, der zur Bindung an mindestens ein erfindungsgemäßes Antigen oder ein oder mehr antigene Fragmente davon befähigt ist, oder eine DNA-Sequenz, die für ein oder mehr erfindungsgemäße Antigene oder eine antisense-Sequenz davon kodieren, enthält. Die Antikörper und Sequenzen können gegebenenfalls für Nachweiszwecke markiert sein oder es kann ein Nachweissystem im Kit enthalten sein.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der nachstehenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm der Titration der antikörperabhängigen, komplementvermittelten Abtötung (ADCK) von Spirochäten aus B. burgdorferi-Stämmen JD1 (o), B31 (Δ) und B. garinii-Stamm IP90 (☐) mit Serum eines Rhesus-Affen, der mit einer Zecke mit JD1-Spirochäten inokuliert worden ist.
2 ist eine schematische Darstellung von Teilen der DNA-Sequenz des neuen P39.5, das für einen einzigen offenen Leseraster kodiert, der für ein abgeleitetes Protein mit 37,7 kDa kodiert. Dieses DNA-Fragment wird als 7-1 bezeichnet und das abgeleitete Protein wird als P7-1 bezeichnet. Bei der schwarz dargestellten Region handelt es sich um eine einzigartige Region, die einen Bereich von etwa bp 769 bis etwa bp 854 von SEQ ID NO:1 überspannt. Die mit IA bezeichnete Region überspannt etwa bp 1 bis etwa bp 309 von SEQ ID NO:1; IB überspannt etwa bp 855 bis etwa bp 1189 von SEQ ID NO:1. Die Regionen IA und IB weisen eine 70%ige Identität auf. Die Region IIA, die etwa bp 310 bis etwa bp 494 von SEQ ID NO:1 überspannt, und die Region IIB, die etwa bp 595 bis etwa bp 769 von SEQ ID NO:1 überspannt, weisen eine 91%ige Identität auf. Die Region A, die etwa bp 208 bis etwa bp 309 von SEQ ID NO:1 überspannt, und die Region B, die etwa bp 495 bis etwa bp 595 von SEQ ID NO:1 überspannt, weisen eine 84%ige Identität auf. Die Regionen B und C, die zusammen etwa bp 1090 bis etwa bp 1189 von SEQ ID NO:1 überspannen, weisen eine 90%ige Identität auf.
3 ist ein Balkendiagramm, das die in vitro-Abtötung von IP90-Spirochäten mit folgenden Produkten darstellt: Plasma eines mit JD1-Spirochäten infizierten Affen und Affen-Komplement (Balken 1); Antikörper aus dem gleichen Plasma, das an nativem P39.5 affinitätsgereinigt worden ist, und Affen-Komplement (Balken 2); der gleiche Antikörper wie bei Balken 2 ohne Komplement (Balken 3); Komplement allein (Balken 4); und BSK-H-Medium allein (Balken 5). Die Fehlerbalken geben die Standortabweichung des Mittelwerts von zwei Bestimmungen wieder.
4 ist ein Balkendiagramm zur Darstellung der ADCK von Spirochäten des IP90-Stammes unter Verwendung folgender Produkte: ein Plasmapool von Affen, die mit B. burgdorferi JD1 in einer Verdünnung von 1:10 infiziert worden sind (Balken 1, 5); gepooltes Serum aus Mäusen, die mit einer rekombinanten Form von P7-1 (rP7-1) immunisiert worden sind, und Ribi-Adjuvans in einer Verdünnung von 1:10 (Balken 2,6); und 1:50 (Balken 3); und mit Ribi-Adjuvans allein immunisierte Mäuse (Balken 4,7). Affen-Komplement wurde bei ADCK der Balken 1-4 und Meerschweinchen-Komplement bei ADCK der Balken 5-7 verwendet. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwerts von zwei Bestimmungen wieder.
5 ist eine Darstellung des "Strings" von stummen VLS-Kassetten in einer DNA-Strecke mit einer Länge von etwa 8 kb, dupliziert nach J. R. Zhang et al., Cell, Bd. 89 (1997), S. 275-285).
6 ist ein Western-Blot von Lysaten aus Spirochäten der B. bergdorferi-Stämme JD1 und B31 und von B. garinii Stamm IP90, entwickelt aus Serum von Affen, die mit JD1-Spirochäten mit der Nadel (Bahn 1) und mit Zecken (Bahn 2) inokuliert worden sind, und Antikörpern aus dem letztgenannten Serum, die durch Affinitätsreinigung von vollständigen lebenden JD1-Spirochäten erhalten worden sind (Bahn 3).
Sequenzlistenbezeichnungen

SEQ ID NO:1 ist die Nucleinsäuresequenz von Klon 7-1.
SEQ ID NO:2 ist die abgeleitete Proteinsequenz von Klon 7-1.
SEQ ID NO:3 ist das 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 1-1.
SEQ ID NO:4 ist eine partielle Nucleinsäuresequenz von Klon 1-1, der in der Mitte der Nucleinsäuresequenz auftritt.
SEQ ID NO:5 ist das 3'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 1-1.
SEQ ID NO:6 ist das 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 3-1.
SEQ ID NO:7 ist das 3'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 3-1.
SEQ ID NO:8 ist das 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 6-1.
SEQ ID NO:9 ist das 3'-Ende der Nucleinsäuresequenz des Klons 6-1.
SEQ ID NO:10 ist das 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 9-1.
SEQ ID NO:11 ist das 5'-Ende der Nucleinsäuresequenz des Klons 12-1.
SEQ ID NO:12 ist das 3'-Ende der Nucleinsäuresequenz von Klon 12-1.
SEQ ID NO:13 ist eine partielle Nucleinsäuresequenz, die aus Klon 14 erhalten worden ist, der bei Addition an den 5'-Terminus von Klon 7-1 (SEQ ID NO:1) ein größeres Fragment von P39.5, d. h. P7-1, bildet. Die ersten 5'-terminalen sechs Basen stammen aus dem Plasmidvektor.
SEQ ID NO:14 ist die abgeleitete Proteinsequenz von SEQ ID NO:13.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Borrelia-Oberflächenantigen, P39.5, das durch die Spirochäte exprimiert wird, wenn sie sich im Wirbeltierwirt befindet ("in vivo"). Auf dieses Antigen zielt man durch eine antikörperabhängige, komplementvermittelte in vitro-Abtötung (ADCK) ab. Dieses neue Antigen, Fragmente davon, hierzu entwickelte Antikörper, die dafür kodierenden Nucleinsäuresequenzen und die Verwendung von derartigen Antigenen, Antikörpern und Nucleinsäuresequenzen in diagnostischen, therapeutischen und prophylaktischen Zusammensetzungen und Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe der Lyme-Krankheit bieten Vorteile gegenüber der Verwendung anderer Borrelia-Proteine und -Antikörper in bekannten Zusammensetzungen und Verfahren für diesen Zweck.
I. Das erfindungsgemäße P39.5-Antigen
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein neues isoliertes Borrelia-Antigen, das als P39.5 bezeichnet wird. Dieses Antigen wird sowohl in vitro als auch in vivo durch Borrelia-Spirochäten, z. B. Spirochäten von B. garinii Stamm IP90, exprimiert. Dieses Antigen oder ein Homologes davon wird ebenfalls in vivo durch Spirochäten der B. burgdorferi sensu stricto-Stämme JD1, B31 und NT1 exprimiert. Dieses Antigen weist eine scheinbare Molekülmasse von 39,5 kDa in IP90-Spirochäten auf und wird funktionell durch die Fähigkeit zur Anregung der Antikörperbildung in Tieren im Verlauf einer natürlichen Infektion mit Borrelia-Spirochäten charakterisiert. Diese induzierten Antikörper töten IP90-Spirochäten in vitro durch ADCK ab. Der hervorgerufene Antikörper tötet auch Spirochäten des NT₁-Stammes von B. burgdorferi sensu lato ab, einem Stamm, der aus der zerebrospinalen Flüssigkeit eines Patienten in den Vereinigten Staaten isoliert worden ist, der aber innerhalb des sensu lato-Komplexes von Spezies nicht weiter charakterisiert worden ist. Dieser Stamm wurde von Dr. Patricia Coyle, State University of New York at Stony Brook, New York, bereitgestellt.
Das Genfragment mit der Bezeichnung 7-1 aus einem B. burgdorferi sensu lato-Stamm (B. garinii Stamm IP90), das in pBluescript II-Plasmid inseriert worden war, wurde in E. coli transformiert und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland ("ATCC"), am 27. Juni 1997 unter der Hinterlegungsnummer 98478 hinterlegt. Wenn dieses Genfragment in E. coli exprimiert wird, als ein reines Protein isoliert wird und das Protein als Immunogen in Mäusen verwendet wird, reagiert der auf diese Weise erzeugte Antikörper mit P39.5 von IP90. Weitere Genfragmente mit den Bezeichnungen 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 und 12-1 aus dem Borrelia garinii Stamm IP90 wurden gleichermaßen in pBluescript II-Plasmide inseriert, in E. coli transformiert und hinterlegt. Diese letztgenannten Hinterlegungen erfolgten bei der ATCC am oder vor dem 25. Juni 1998 unter den Hinterlegungsnummern 98768 für 1-1, 98769 für 3-1, 98770 für 6-1, 98771 für 9-1 und 98772 für 12-1. Sämtliche Hinterlegungen erfolgten gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und erfüllen vollständig die Bedingungen des United States Patent and Trademark Office für Hinterlegungen für Patentzwecke. Erfindungsgemäß geeignete Sequenzen können aus diesen Hinterlegungen bezogen werden.
A. Nucleinsäuresequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Säugetier-Nucleinsäuresequenzen, die für Fragmente von P39.5 kodieren. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen werden aus zellulären Materialien, mit denen sie natürlicherweise assoziiert sind, isoliert. Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, wurde ein Segment mit 1190 bp, das für einen Teil der Kodierungsregion des Borrelia P39.5-Gens kodiert, kloniert und sequenziert. Es umfasst einen einzigen offenen Leseraster, der für ein Protein mit vermutlich 37,7 kDa kodiert. Diese partielle DNA-Sequenz ist in SEQ ID NOS:13 und 1 wiedergegeben. SEQ ID NO:13 ist eine Sequenz unmittelbar in 5'-Stellung zur ersten Base von SEQ ID NO:1. Zusammen bilden diese Sequenzen ein partielles Protein von 1189 bp und etwa 396 Aminosäuren. Das sequenzierte Fragment ist aus vorwiegend hydrophilen Domänen zusammengesetzt, die mehrere interne Wiederholungsregionen und eine besondere einzige Region, die etwa bp 627 bis etwa bp 712 von SEQ ID NO:1 überspannt, enthalten; vergl. 2, wo die Wiederholungssequenzen und die Homologien sowie die prozentualen Identitäten derartiger Sequenzen angegeben sind.
Sofern im vorliegenden Text Protein- und/oder DNA-Sequenzen durch ihre prozentualen Homologien oder Identitäten mit identifizierten Sequenzen definiert werden, umfassen die Algorithmen, die zur Berechnung der prozentualen Identitäten oder prozentualen Ähnlichkeiten verwendet werden, folgendes: den Smith-Waterman-Algorithmus (J. F. Collins et al., Comput. Appl. Biosci., Bd. 4 (1988), S. 67-72; J. F. Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment (Hrsg. M. J. Bishop et al.) Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press, Oxford, England, UK (1987), S. 417) und die BLAST- und FASTA-Programme (E. G. Shpaer et al., Genomics, Bd. 38 (1996) S. 179-191). Diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Ferner werden hier weitere Borrelia-Nucleinsäurefragmente beschrieben, z. B. Kassetten-String-Fragmente sowie Fragmente von P39.5. Derartige Fragmente werden als 1-1 (das für ein Protein/Peptid P1-1 kodiert), 3-1 (das für ein Protein/Peptid P3-1 kodiert), 6-1 (das für ein Protein/Peptid P6-1 kodiert), 9-1 (das für ein Protein/Peptid P9-1 kodiert) und 12-1 (das für ein Protein/Peptid P12-1 kodiert) bezeichnet. Vorzugsweise sind derartige Fragmente dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen biologisch aktiven Teil von P39.5, z. B. ein Epitop, kodieren. Im allgemeinen weisen diese Oligonucleotidfragmente eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden auf. Jedoch können je nach Wunsch Oligonucleotidfragmente variierender Größe gewählt werden. Derartige Fragmente können beispielsweise zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) z. B. an einer durch Biopsie erhaltenen Gewebeprobe, verwendet werden. Beispielsweise umfassen geeignete Fragmente von P39.5-DNA und entsprechende Sequenzen die Sequenzen, die zwischen bp 793-816 von SEQ ID NO:1 und bp 59-85 von SEQ ID NO:13 auftreten. Weitere geeignete Fragmente sind in 2 identifiziert. Fragmente von 1-1 umfassen Sequenzen von SEQ ID NOS:3, 4 und 5. Fragmente von 3-1 umfassen Sequenzen von SEQ ID NOS:6 und 7; Fragmente von 6-1 umfassen Sequenzen von SEQ ID NOS:8 und 9. Ein Fragment von 9-1 umfasst die Sequenz von SEQ ID NO:10. Fragmente von 12-1 umfassen die Sequenzen von SEQ ID NOS:11 und 12. Die vollständigen Sequenzen von 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 und 12-1 sowie weitere geeignete Fragmente lassen sich vom Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet leicht unter Zuhilfenahme herkömmlicher DNA-Sequenzierungstechniken erhalten, die auf die vorstehend genannte, bei der ATCC hinterlegte DNA angewandt werden.
Die DNA-Sequenzen von SEQ ID NOS:1 und 3-12 sowie die vorstehend identifizierten hinterlegten Materialien ermöglichen es einem Fachmann, leicht die entsprechenden antisense-Stränge dieser DNA-Sequenzen zu erhalten. Ferner kann der Fachmann unter Anwendung bekannter Techniken je nach Wunsch leicht zusätzliche genomische und c-DNA-Sequenzen erhalten, die die dargestellten DNA-Sequenzen oder die entsprechenden RNA-Sequenzen flankieren. Gleichermaßen wird der Fachmann durch die Verfügbarkeit von SEQ ID NOS:1 und 3-12 und durch die hinterlegten erfindungsgemäßen Materialien dazu befähigt, andere Spezies-P39.5-Analoge, B. garinii-Peptide und Fragmente davon unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen als Sonden in einer herkömmlichen Technik, z. B. der Polymerase-Kettenreaktion, zu erhalten. Allele Varianten dieser Sequenzen innerhalb einer Spezies (d. h. Sequenzen, die einige individuelle Nucleotiddifferenzen in Bezug zu einer weiter verbreiteten Sequenz innerhalb einer Spezies enthalten, die aber dennoch für das gleiche Protein oder ein Protein mit der gleichen Funktion kodieren), wie andere Varianten von P39.5 SEQ ID NO:2, lassen sich ebenfalls leicht aufgrund der Kenntnis dieser Sequenz, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, erhalten.
Ferner können Nucleinsäuresequenzen unter stringenten Bedingungen (vergl. J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) zur Hybridisierung mit den Sequenzen von SEQ ID NO:1, mit deren antisense-Strängen oder mit biologisch aktiven Fragmenten davon befähigt sein. Ein Beispiel für eine hochgradig stringente Hybridisierungsbedingung ist eine Hybridisierung bei 2×SSC bei 65 °C, gefolgt von einem Waschvorgang in 0,1×SSC bei 65 °C für 1 Stunde. Alternativ handelt es sich bei einer hochgradig stringenten Hybridisierungsbedingung um 50 % Formamid, 4×SSC bei 42 °C. Moderat hochgradig stringente Bedingungen können sich ebenfalls als geeignet erweisen, z. B. eine Hybridisierung in 4×SSC bei 55 °C, gefolgt von einem 1-stündigen Waschvorgang in 0,1×SSC bei 37 °C. Ein alternatives Beispiel für eine mäßig hochgradig stringente Hybridisierungsbedingung ist in 50 % Formamid, 4×SSC bei 30 °C.
Die Nucleinsäuresequenzen können modifiziert werden. Unter Verwendung der Sequenzdaten von SEQ ID NOS:1 und 3-12 gelingt es dem Fachmann, synthetisch oder rekombinant weitere Polynucleotidsequenzen oder modifizierte Polynucleotidsequenzen zu erhalten oder herzustellen, die für erfindungsgemäße Proteine von voller Länge oder geeignete Fragmente davon kodieren. Derartige Modifikationen auf dem Nucleinsäureniveau umfassen beispielsweise Modifikationen an Nucleotidsequenzen, die stumm sind oder die die Aminosäuren verändern, z. B. zur Verbesserung der Expression oder Sekretion. Ferner gehören dazu allele Variationen, die durch die natürliche Degeneration des genetischen Codes verursacht werden.
Ferner werden Mutanten der P39.5-Fragmente und die darin vorgesehenen Kassetten-String-Sequenzen 1-1, 3-1, 6-1, 7-1, 9-1 und 12-1 beschrieben. Derartige Mutanten umfassen aminoterminale, carboxyterminale oder interne Deletionen, bei denen im wesentlichen die Antigenizität des P39.5 von voller Länge oder anderer Proteine oder Fragmente davon erhalten bleibt. Eine derartige geschnittene oder Deletionsmutante kann mit dem Ziel, die Aktivität des Gens von voller Länge oder des Wildtypgens oder von Genfragmenten zu beeinflussen, exprimiert werden.
Diese Nucleinsäuresequenzen eignen sich für eine Vielzahl von diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verwendungen. Vorteilhafterweise eignen sich die Nucleinsäuresequenzen zur Entwicklung von diagnostischen Sonden und antisense-Sonden zur Verwendung beim Nachweis und der Diagnose der Lyme-Krankheit unter Verwendung einer Vielzahl bekannter Nucleinsäuretests, z. B. Northern- und Southern-Blots, der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anderer Testtechniken, die dem Fachmann geläufig sind. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen eignen sich auch zur Herstellung von P39.5-Proteinen und Homologen sowie anderer Proteine von B. garinii.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen können durch herkömmliche Anwendungsmöglichkeiten der Polymerase-Kettenreaktion oder von Klonierungstechniken, wie sie in Standardwerken, z. B. Sambrook et al., a.a.O., beschrieben sind, isoliert werden. Beispielsweise lassen sich die Nucleinsäuresequenzen des erfindungsgemäßen Antigens aus B. garinii-DNA unter Verwendung von DNA-Primern und -Sonden und PCR-Techniken herstellen oder isolieren. Alternativ lässt sich das Antigen aus Genbanken, die von der vollständigen Genom-DNA von B. garinii abgeleitet sind, erhalten. Diese Sequenzen, Fragmente davon, Modifikationen davon und die Sequenzen von voller Länge lassen sich auf rekombinante Weise unter Anwendung herkömmlicher gentechnischer Maßnahmen oder chemischer Synthesetechniken oder durch PCR und dergl. konstruieren, wobei man sich der hier bereitgestellten Informationen bedient.
B. Proteinsequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner B. burgdorferi-sensu lato-Proteine, wie B. garinii-Proteine und -Peptide, einschließlich P39.5-Polypeptide oder Proteine sowie die erfindungsgemäßen Peptide/Proteine mit den Bezeichnungen P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 und P12-1. Diese Proteine sind frei von einer Assoziation mit anderen kontaminierenden Proteinen oder Materialien, mit denen sie in der Natur auftreten. Da das native P39.5 bei einer Triton X114-Extraktion vollständig in die Detergensphase extrahiert wurde, handelt es sich vermutlich um ein Lipoprotein. Das P39.5-Antigen weist eine relative Molekülmasse von 39 500 Dalton auf, bestimmt durch Western-Immunoblot (vergl. Beispiel 2 und 6). In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein partielles P39.5 (SEQ ID NO:2)-Polypeptid mit etwa 354 Aminosäuren, vermutlich ein Lipoprotein, bereit, das eine vorhergesagte relative Molekülmasse von etwa 37,7 kD aufweist (d. h. das "P7-1-Fragment"). Diese abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) ist bis zu 22 % identisch mit Mitgliedern der variablen Major-Protein (Vmp)-Familie von äußeren Oberflächen-Lipoproteinen von Borrelia hermsii (vergl. Beispiel 6). Es ist zu etwa 50 % identisch mit der Vmp-artigen Sequenz (vls) VlsE des B31-Stammes von B. burgdorferi (J.-R. Zhang et al., a.a.O.) und zu anderen vls-Sequenzen von B. burgdorferi (d. h. Vls-6 Genbank Nr. U76406 (53 % Identität über 190 aa) (aa = Aminosäuren); (VlsE-Genbank Nr. U84553 (57 % über 210 aa) und U84566 (58 % über 209 aa) und U84555 (58 % über 210 aa)).
VlsE ist ein Teil eines Antigens von B. burgdorferi, das durch einen Rekombinationsmechanismus einer antigenen Variation unterliegt, wobei ein zentrales Fragment der exprimierten Kopie (VlsE) mit Fragmenten eines Strings von 15 "Kassetten", die sich strangaufwärts von der exprimierten Kopie befinden, rekombiniert wird (J. Zhang, a.a.O.). Jede Kassette weist eine durchschnittliche Länge von 500 bp auf und der gesamte String nimmt eine DNA-Kette von etwa 8 kb ein. Eines der bemerkenswerten Merkmale dieses Strings von Kassetten besteht darin, dass bei B. burgdorferi B31 die Kassetten in einem nahezu angrenzenden offenen Leseraster angeordnet sind, der nur durch ein Stoppcodon in der Kassette vls11 und zwei Rasterverschiebungen in den Kassetten vls 14 und vls 16 unterbrochen ist; vergl. z. B. 6, die eine Kopie einer ähnlichen Struktur darstellt, die von Zhang et al. definiert ist (a.a.O.).
Eine längere partielle Proteinsequenz von P39.5 wird durch direkte Fusion der partiellen Sequenz aus Klon 14 (SEQ ID NO:14) mit dem 5'-Ende der Sequenz von SEQ ID NO:2 gebildet. Die Sequenz aus Klon 14 wurde als eine Sequenz in 5'-Stellung zur Sequenz von P7-1 identifiziert, was sich aus überlappenden Sequenzen zwischen den beiden Klonen, aus denen diese Sequenzen erhalten worden waren, ergab, wobei die überlappenden Sequenzen bewiesen, dass sie Bestandteil des gleichen offenen Leserasters waren. So schließt sich an Leu (Aminosäure 47 von SEQ ID NO:14) unmittelbar Lys (Aminosäure 1 von SEQ ID NO:2) in der größeren, von P39.5 abgeleiteten Aminosäuresequenz an.
Die vorliegende Erfindung stellt partielle DNA- und abgeleite Aminosäuresequenzen von mehreren Fragmenten bereit, die anscheinend Bestandteil des Kassetten-Strings von B. garinii IP90 sind. Diese Fragmente, die 7-1 umfassen können, werden als 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 und 12-1 bezeichnet und weisen eine Länge zwischen 1 und 2 kb auf. Jedes dieser Fragmente exprimiert ein Peptid (aus dem lacZ-Promotor von pBluescript), das im richtigen Verhältnis zur Größe des Inserts steht und das mit Antikörpern von infizierten Affen reagiert. Keines der 5'-Enden dieser Fragmente (SEQ ID NOS:1, 3, 6, 8, 10 und 11) enthält eine hydrophobe Leadersequenz oder eine Signal-Peptidase II-Konsensussequenz des Typs, der für bakterielle Lipoproteine charakteristisch ist. Diese Fragmente müssen daher Bestandteil des Kassetten-Strings von IP90 sein und sich wie der Kassetten-String von B31 im Raster befinden. Diese vls-artigen Proteine werden durch partielle 5'- und 3'-Sequenzen identifiziert (vergl. z. B. SEQ ID NOS:1, 3 und 5 bis 12). Der Fachmann kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken, wie PCR, sich in einfacher Weise der partiellen 5'- und 3'-Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, und der DNA-Sequenzen von B. garinii (oder der DNA-Bank davon) oder der bei der ATCC für jedes vorstehend identifizierte Kassetten-String-Protein hinterlegten Materialien bedienen, um die vollständigen Sequenzen davon zu identifizieren. Derartige Verfahren entsprechen der Routine und erfordern angesichts der hier bereitgestellten Informationen keinen unzumutbaren experimentellen Aufwand.
Erfindungsgemäße Antigene können durch immunologische Messungen charakterisiert werden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Western-Blot, makromolekulare Massebestimmungen durch biophysikalische Bestimmungen, wie SDS-PAGE/Färbung, HPLC und dergl., Antikörper-Erkennungstests, T-Zellen-Erkennungstests, MHC-Bindungstests und Tests zur Feststellung von immunologischem Schutz oder immunologischer Pathologie durch adoptiven Transfer von Zellen, Proteinen oder Antikörpern.
Das hier beschriebene, proteinhaltige P39.5-Oberflächenantigen (sowie seine natürlich vorkommenden Varianten oder Analoge in anderen Spezies von Borrelia oder die hier identifizierten anderen vls-artigen Proteine) können in Form eines vollständigen, intakten Proteins oder eines Polypeptids oder Fragments davon isoliert werden. Gemäß einer Ausführungsform wird P39.5 durch Immunoblot-Verfahren entsprechend seiner jeweiligen Molekülmasse isoliert, wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben wird. Eine derartige Isolation stellt das Antigen in einer Form bereit, die im wesentlichen frei von anderen proteinhaltigen oder nicht-proteinhaltigen Materialien des Mikroorganismus und dem Zecken-Vektor ist. Die Moleküle, die die erfindungsgemäßen Borrelia-Polypeptide und -Antigene umfassen, können durch eine Vielzahl von herkömmlichen Verfahren aus der Spirochäte isoliert und weiter gereinigt werden, wozu folgende Verfahren gehören: Flüssigchromatographie, z. B. mit normaler oder reverser Phase, unter Anwendung von HPLC, FPLC und dergl.; Affinitätschromatographie (z. B. mit anorganischen Liganden oder monoklonalen Antikörpern), Größenausschlusschromatographie; immobilisierte Metallchelat-Chromatographie; Gelelektrophorese; und dergl. Der Fachmann kann die zweckmäßigsten Isolierungs- und Reinigungstechniken auswählen, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen.
Alternativ können die Aminosäuresequenzen von P39.5 oder der anderen erfindungsgemäßen Borrelia-Proteine auf rekombinantem Wege gemäß herkömmlichen gentechnischen Verfahren erzeugt werden (vergl. z. B. Sambrook et al., a.a.O. und die nachstehende ausführliche Beschreibung zur Herstellung der Proteine).
i. Analoge/modifizierte Antigene
Ferner werden hier Analoge oder modifizierte Versionen des P39.5-Proteins oder vls-artige Proteine P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 and P12-1, bereitgestellt. Typischerweise unterscheiden sich derartige Analoge von den spezifisch identifizierten Proteinen durch nur 1 bis 4 Codonänderungen. Zu Beispielen gehörten Polypeptide mmit geringfügigen Aminosäurevartiationen, verglichen mit der dargestellten partiellen Aminosäuresequenz von beispielsweise P7-1 (SEQ ID NO:2), wobei es sich insbesondere konservative Aminosäure-Austauschvorgänge handelt. Konservative Austauschvorgänge sind solche, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden und die in ihren Seitenketten und chemischen Eigenschaften miteinander verwandt sind. Ferner werden hier Homologe der erfindungsgemäßen Proteine beschrieben, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine mindestens 85%ige Identität mit SEQ ID NO:2 oder mit den Sequenzen der vls-artigen Proteine aufweisen. Aufgrund der hier bereitgestellten Sequenzinformationen kann der Fachmann leicht P7-1 von voller Länge oder P7-1-Homologe und -Analoge sowie vls-artige 1-1-, 3-1-, 6-1-, 9-1- und 12-1-Proteinhomologe und -analoge von voller Länge von anderen bakteriellen Spezies erhalten.
Ein erfindungsgemäßes Antigen kann auch modifiziert werden, um seine Immunogenizität zu erhöhen. Beispielsweise kann das Antigen mit chemischen Verbindungen oder immunogenen Trägern gekuppelt werden, vorausgesetzt, dass die Kupplung nicht die angestrebte biologische Aktivität entweder des Antigens oder des Trägers stört. Bezüglich eines Übersichtsartikels über allgemeine Erwägungen bei Kupplungsstrategien wird verwiesen auf Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. E. Harlow und D. Lane (1988). Geeignete immunogene Träger sind aus dem Stand der Technik bekannt. Hierzu gehören (ohne Beschränkung) Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH); Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin, PPD (gereinigtes Proteinderivat von Tuberculin); rote Blutkörperchen; Tetanus-Toxoid; Cholera-Toxoid; Agarose-Perlen; Aktivkohle; oder Bentonit. Zu geeigneten chemischen Verbindungen für die Kupplung gehören (ohne Beschränkung hierauf) Dinitrophenolgruppen und Arsonilsäure.
Das Antigen kann auch durch andere Techniken, wie eine Denaturierung mit Wärme und/oder SDS, modifiziert werden.
ii. Fragmente/Deletionsmutanten
Unter die Erfindung fallen ferner weitere Fragmente des P39.5-Polypeptids, des P7-1-Peptids oder der anderen hier angegebenen vls-artigen Proteine. Derartige Fragmente sind vorzugsweise dadurch charakterisiert, dass sie eine ähnliche biologische Aktivität wie das vollständige Protein aufweisen, einschließlich z. B. die Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern gegen den Erreger der Lyme-Krankheit. Diese Fragmente können in jeder beliebigen Länge konstruiert oder erhalten werden, einschließlich einer geringen Menge mit etwa 5-8 Aminosäuren. Ein derartiges Fragment kann ein Epitop des Proteins darstellen.
Die internen Wiederholungen von P39.5 (vergl. 2) zeigen, dass dieses Protein, wie OspA, homologen Rekombinationen in Borrelia unterliegen kann, die zu Mutanten führen können, die verkürzte, partiell deletierte Versionen des Gens exprimieren. Somit kann das erfindungsgemäße P7-1-Protein (SEQ ID NO:2) unter Schaffung von Deletionsmutanten modifiziert werden, beispielsweise durch Schneiden an den Amino- oder Carboxytermini oder durch Elimination von einer oder mehreren Aminosäuren. Durch homologe Rekombination ihrer Wiederholungssequenzen erzeugte Deletionsmutanten von P7-1 (2) werden ebenfalls von der Erfindung umfasst, sowie die dafür kodierenden DNA-Sequenzen. In bestimmten Deletionsmutanten sind Teile der P39.5-Kodierungsregion, die vorstehend beschrieben ist, z. B. die Regionen IIA, IIB und B, deletiert.
Deletionsmutanten der P39.5-Antigene, die wie P39.5, und im Gegensatz zu OspA, in vivo exprimiert werden, werden vermutlich bei Infektion des Wirbeltierwirts abgetötet. Die meisten OspA-Deletionsmutanten entkommen in Abwesenheit von Komplement der Abtötung mit anti-OspA-Antikörper, werden aber abgetötet, wenn dieser Antikörper und Komplement zusammenwirken. Da anti-OspA-Antikörper Spirochäten im Zecken-Mitteldarm (wo OspA exprimiert wird, aber Komplement wahrscheinlich nicht aktiv ist), abtötet, können OspA-Deletionsmutanten dem anti-OspA-Antikörper, der durch den OspA-Impfstoff hervorgerufen worden ist, entkommen. Da im Gegensatz dazu P39.5 in vivo exprimiert wird, wo Komplement und anti-P39.5-Antikörper beide vorhanden sind, können P39.5-Deletionsmutanten einem Impfstoff auf der Basis von P39.5 nicht entkommen.
Weitere modifizierte Fragmente von P39.5, P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 oder P12-1 lassen sich durch eine Anzahl von nunmehr herkömmlichen Techniken herstellen, um deren Herstellung zu verbessern, um die Proteinstabilität oder andere Eigenschaften zu verstärken, z. B. die Bindungsaktivität oder biologische Verfügbarkeit, oder dem Protein irgendwelche andere erwünschte Eigenschaften zu verleihen. Weitere geeignete Fragmente dieser Polypeptide lassen sich vom Fachmann unter Anwendung bekannter Techniken, z. B. durch Deletionsmutagenese und Expression, leicht herstellen.
iii. Fusion multimerer Proteine und Zusammensetzungen
Das P39.5-Protein oder Fragmente davon sowie die vls-artigen Kassetten-String-Proteine oder Fragmente davon lassen sich ferner unter Anwendung herkömmlicher gentechnischer Verfahren als Bestandteil eines größeren und/oder multimeren Proteins oder von Proteinzusammensetzungen konstruieren. Erfindungsgemäße Antigene können in Kombination mit B. burgdorferi-äußeren Oberflächenproteinen, wie OspA, OspB, OspC sowie BmpA, B, C, vorliegen oder verschiedene Fragmente der hier beschriebenen Antigene können in Kombination miteinander vorliegen. In einer derartigen Kombination kann das Antigen in Form eines Fusionsproteins vorliegen. Das erfindungsgemäße Antigen kann gegebenenfalls mit einem ausgewählten Polypeptid oder Protein, z. B. mit Borrelia-Antigenen OspA, OspB, OspC, BmpA, BmpB, BmpC, anderen Borrelia-Antigenen und Proteinen oder Polypeptiden, die sich von anderen Mikroorganismen ableiten, fusioniert werden. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Antigen oder Polypeptid an seinem N-Terminus oder C-Terminus mit OspA-Polypeptid oder OspB-Polypeptid oder OspC-Polypeptid oder mit einem Nicht-OspA-nicht-OspB-Polypeptid oder Kombinationen davon fusioniert werden. OspA- und OspB-Polypeptide, die sich für diesen Zweck eignen, umfassen Polypeptide, die im Stand der Technik identifiziert wurden (vergl. z. B. PCT/US91/04056), und Varianten davon. Nicht-OspA-nicht-OspB-Polypeptide, die sich für diesen Zweck eignen umfassen erfindungsgemäße Polypeptide und solche die im Stand der Technik identifiziert worden sind, einschließlich B. burgdorferi-OspC-Protein, das Flagella-assoziierte Protein und Fragmente davon, weitere B. burgdorferi-Proteine und Fragmente davon und Nicht-B. burgdorferi-Proteine und Fragmente davon.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Fusionsprotein wird bereitgestellt, indem man das DNA-Molekül exprimiert, das durch die P39.5-DNA-Sequenz oder ein Fragment davon in Fusion mit DNA-Fragmenten, die mit P39.5 homolog sind (25- bis 95%ige Identität), gebildet worden ist. Ein Beispiel für ein derartiges Protein umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, mit der Aminosäurefragmente fusioniert sind, die bis zu 95 % identisch mit dieser Sequenz sind. Diese Fragmente können in einer beliebigen Reihenfolge inseriert werden und sie können Wiederholungssequenzen enthalten, z. B. die in 2 dargestellten Sequenzen. Diese langen Strings von DNA, die einen einzigen offenen Leseraster bilden, können aus P39.5-Homologen, einschließlich P39.5, konstruiert werden oder sie können sich von den natürlich vorkommenden, langen offenen Leserastern ableiten, z. B. von einem oder mehreren der vls-Kassettenproteine. Die vls-Kassettenproteine von B. garinii (z. B. die Proteine mit den Bezeichnungen P1-1, P3-1, P6-1, P9-1 und/oder P12-1) können miteinander fusioniert werden und/oder in die P39.5- oder P7-1-DNA-Sequenz inseriert werden, wodurch man ein großes DNA-Molekül erzeugt, das ein Protein exprimiert, das eine Vielzahl von Antikörper-Spezifitäten stimulieren kann.
Diese Fusionsproteine, die mehrfache erfindungsgemäße Polypeptide umfassen, werden zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen konstruiert. Diese Fusionsproteine oder multimeren Proteine können auf rekombinantem Wege hergestellt oder chemisch synthetisiert werden. Sie können ferner die erfindungsgemäßen Polypeptide in Fusion oder Kupplung mit Resten, bei denen es sich nicht um Aminosäuren handelt, wie Lipiden und Kohlenhydraten, umfassen. Ferner können die erfindungsgemäßen Antigene in Kombination mit anderen Borrelia-Impfstoffmitteln, die im Stand der Technik beschrieben worden sind, sowie mit anderen Spezies von Impfstoffmitteln, die sich von anderen Viren ableiten, verwendet werden. Derartige Proteine sind bei der Prophylaxe, Therapie und Diagnose der Lyme-Krankheit, die durch ein breites Spektrum von B. burgdorferi-Isolaten verursacht wird, wirksam.
Eine Proteinzusammensetzung, die eine bevorzugte Alternative zu den vorstehend beschriebenen Fusionsproteinen darstellen kann, ist ein Cocktail (d. h. ein einfaches Gemisch) mit einem Gehalt an unterschiedlichen P39.5-Proteinen oder Fragmenten oder verschiedenen Gemischen der erfindungsgemäßen Kassetten-String-Proteine. Derartige Gemische dieser Proteine oder antigener Fragmente davon eignen sich vermutlich zur Erzeugung der angestrebten Antikörper gegen B. garinii.
iv. Salze
Ein erfindungsgemäßes Antigen kann auch in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes verwendet werden. Geeignete Säuren und Basen, die zur Bildung von Salzen mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden befähigt sind, sind dem Fachmann geläufig. Hierzu gehören anorganische und organische Säuren und Basen.
II. Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Antigenen und Nucleinsäuresequenzen
A. In vitro-Expression
Zur Herstellung von rekombinantem P7-1 und/oder anderen Kassetten-String-Proteinen oder anderen Fragmenten von P39.5 der Erfindung werden die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in ein geeignetes Expressionssystem inseriert. Vorzugsweise werden ein rekombinantes Molekül oder Vektor konstruiert, worin die Polynucleotidsequenz, die für das gewählte Protein, z. B. P7-1, kodiert, funktionell mit einer heterologen Expressionssteuersequenz, die die Expression des Proteins erlaubt, verknüpft ist. Es sind zahlreiche Typen von entsprechenden Expressionsvektoren auf dem Gebiet der Proteinexpression bekannt, wobei man sich üblicher molekularbiologischer Techniken bedient. Derartige Vektoren werden unter herkömmlichen Vektortypen, unter Einschluss von Insekten-Expressionssystemen, z. B. Baculovirus-, Hefe-, Pilz-, Bakterien- oder Virus-Expressionssystemen, ausgewählt. Weitere geeignete Expressionsvektoren, von denen zahlreiche Typen auf dem einschlägigen Gebiet bekannt sind, können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden. Verfahren zur Gewinnung derartiger Expressionsvektoren sind bekannt; vergl. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2.Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Miller et al., Genetic Engineering, Bd. 8 (1986), S. 277-298 (Plenum Press), und die dort genannten Druckschriften.
Geeignete Wirtszellen oder Zelllinien für die Transfektion durch dieses Verfahren umfassen bakterielle Zellen. Vorzugsweise wird zumindest für die Verwendung des P39.5-Proteins, bei dem angenommen wird, dass es sich um ein Lipoprotein handelt (vergl. beispielsweise Beispiel 5), das ausgewählte Protein in Bakterien exprimiert, die über die zelluläre Maschinerie zum Anheften von Lipiden verfügen. Dieses Expressionssystem wird besonders dann bevorzugt, wenn das exprimierte Protein zur Verwendung als Impfstoff oder als Therapeutikum dient. Beispielsweise sind verschiedene Stämme von E. coli (z. B. HB101, MC1061 und die in den folgenden Beispielen verwendeten Stämme) bekannte Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces und andere Bazillen und dergl. werden ebenfalls bei diesem Verfahren verwendet.
Ferner sind zahlreiche Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann geläufig sind, ebenfalls als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verfügbar. Weitere Pilzzellen können ebenfalls als Expressionssysteme verwendet werden. Obgleich Hefe ebenfalls Proteine lipidieren kann, kann sich das Lipidierungsmuster von dem von Bakterien unterscheiden, d. h. einen Unterschied zum nativen Protein zeigen.
Säugetierzellen, wie humane 293-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die Affen-COS-1-Zelllinie oder murine 3T3-Zellen, die sich von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen ableiten, werden verwendet. Eine weitere geeignete Säugetier-Zelllinie ist die CV1-Zelllinie. Weitere geeignete Säugetier-Wirtszellen sowie Verfahren zur Transfektion, Züchtung, Amplifikation, Screening, Herstellung und Reinigung sind aus dem Stand der Technik bekannt (vergl. z. B. Gething und Sambrook, Nature, Bd. 293 (1981), S. 620-625; oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5(7) (1985), S. 1750-1759; oder Howley et al., US-Patent 4 419 446).
Alternativ können Insektenzellen, wie Zellen von Spodoptera frugipedera (Sf9), verwendet werden.
Somit lassen sich ein rekombinantes Borrelia-Protein, z. B. P7-1 oder andere Kassetten-String-Proteine, nach einem Verfahren herstellen, das die Transfektion, z. B. durch herkömmliche Maßnahmen, wie Elektroporation, einer Wirtszelle mit mindestens einem Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes Polynucleotid enthält, unter der Kontrolle einer transkriptionalen regulatorischen Sequenz beinhaltet. Die transfizierte oder transformierte Wirtszelle wird sodann unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression des Proteins erlauben. Das exprimierte Protein wird gewonnen, isoliert und gegebenenfalls aus der Zelle (oder aus dem Kulturmedium, wenn es extrazellulär exprimiert wird) gereinigt, wobei man dem Fachmann geläufige Verfahren anwendet.
Beispielsweise werden die Proteine in löslicher Form im Anschluss an eine Zelllysis isoliert oder unter Anwendung bekannter Techniken extrahiert, z. B. in Guanidinchlorid. Gegebenenfalls werden die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente als ein Fusionsprotein erzeugt.
Derartige Fusionsproteine wurden vorstehend beschrieben. Alternativ kann es beispielsweise erstrebenswert sein, Fusionsproteine zu erzeugen, um die Expression des Proteins in einer gewählten Wirtszelle zu verstärken, die Reinigung zu verbessern oder eine Anwendung bei der Überwachung des Vorliegens des angestrebten Proteins, z. B. P7-1, in Geweben, Zellen oder Zellextrakten vorzunehmen. Geeignete Fusionspartner für die erfindungsgemäßen Proteine sind dem Fachmann geläufig. Hierzu gehören unter anderem β-Galactosidase, Glutathion-S-transferase und Polyhistidin.
B. In vivo-Expression
Alternativ wird dann, wenn es angestrebt wird, dass das P7-1 oder ein anderes Kassetten-String-Protein der Erfindung (entweder von voller Länge oder ein angestrebtes Fragment) in vivo exprimiert wird, um Antikörper zu induzieren, oder zur Bereitstellung eines DNA-Impfstoffes ein geeigneter Vektor für die Abgabe in einfacher Weise vom Fachmann ausgewählt. Beispielhafte Vektoren für die in vivo-Genabgabe sind aus verschiedenen akademischen und gewerblichen Quellen verfügbar. Hierzu gehören z. B. adenoassoziiertes Virus (PCT/US91/03440), Adenovirusvektoren (M. Kay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91 (1994), S. 2353; S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest., Bd. 92 (1993), S. 883) oder andere virale Vektoren, z. B. verschiedene Poxyviren, Vaccinia und dergl. Verfahren zur Insertion eines erwünschten Gens, z. B. P7-1, und zur Erzielung einer in vivo-Expression des kodierten Proteins sind dem Fachmann geläufig.
III. Erfindungsgemäße Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Antikörper bereit, die dazu befähigt sind, die isolierten oder modifizierten oder multimeren Antigene der Erfindung zu erkennen und zu binden, einschließlich Antikörper, die sich aus Gemischen von derartigen Antigenen oder Fragmenten davon ableiten. Diese Antikörper eignen sich zur Diagnose der Lyme-Krankheit und in therapeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Menschen und/oder Tieren, die einen positiven Test auf die Lyme-Krankheit ergeben oder die vor dem Testen Symptome dieser Krankheit aufweisen. Die Antikörper eignen sich für die Diagnose allein oder in Kombination mit Antikörpern gegen andere erfindungsgemäße Antigene sowie mit Antikörpern gegen andere bekannte B. burgdorferi-Antigene. Diese Antikörper eignen sich auch in passiven Impfstoffzusammensetzungen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper werden durch herkömmliche Maßnahmen erzeugt, bei denen die erfindungsgemäßen isolierten, rekombinanten oder modifizierten Antigene oder Gemische derartiger Antigene oder antigener Fragmente verwendet werden. Beispielsweise werden polyklonale Antikörper durch herkömmliche Stimulation des Immunsystems eines gewählten Tiers oder Menschen mit dem isolierten Antigen oder einem Gemisch von antigenen Proteinen oder Peptiden der Erfindung erzeugt, was es dem Immunsystem erlaubt, dagegen natürliche Antikörper zu erzeugen. Diese Antikörper werden aus dem Blut des Tiers oder des Menschen oder einer anderen biologischen Flüssigkeit gewonnen.
Beispielsweise wird ein erfindungsgemäßer Antikörper erzeugt, indem man einem Wirbeltierwirt das Antigen oder die antigene Zusammensetzung der Erfindung, z. B. P7-1, verabreicht. Vorzugsweise wird eine rekombinante Version von P7-1 (rP7-1) als ein Immunogen verwendet. Ein geeigneter polyklonaler Antikörper gegen das P7-1-Antigen tötet in vitroo IP90-Spirochäten durch einen antikörperabhängigen, komplementvermittelten Abtötungsvorgang (ADCK) ab, unabhängig davon, ob der Antikörper erhalten worden ist durch (1) Affinitätsreinigung, wobei man als Immunoabsorbens natives P39.5-Antigen von IP90-Spirochäten verwendet (abgetrennt an einem Western-Blot; vergl. 6) und als Antikörperquelle das Antiserum verwendet, das bei einer Infektion von Rhesus-Affen mit JD1-Spirochäten erzeugt worden ist, oder (2) durch Immunisierung von Mäusen mit rekombinantem P7-1 aus IP90 (rP7-1).
Somit wird ein erfindungsgemäßer Antikörper durch Affinitätsreinigung des bei einer Infektion eines Wirbeltiers, z. B. eines Rhesus-Affen, mit JD1-Spirochäten erzeugten Antiserums isoliert, wobei man als Immunoabsorbens das native P39.5-Antigen von IP90 oder ein oder mehr der hier identifizierten Kassetten-String-Proteine verwendet. Gleichermaßen wird ein erfindungsgemäßer Antikörper durch Immunisieren von Mäusen mit einem gereinigten, rekombinanten Antigen der Erfindung oder einem gereinigten, isolierten P39.5 nativen Ursprungs isoliert. Monoklonale Antikörper (MAbs), die gegen P39.5 gerichtet sind, werden ebenfalls erzeugt. Hybridoma-Zelllinien, die die angestrebten MAbs exprimieren, werden durch bekannte herkömmliche Techniken erzeugt, z. B. gemäß Köhler und Milstein und den zahlreichen bekannten Modifikationen dieses Verfahrens. Gleichermaßen werden angestrebte Hochtiter-Antikörper durch Anwendung bekannter rekombinanter Techniken auf die monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, die sich gegen diese Antigene entwickelt haben, erzeugt (vergl. z. B. PCT/GB85/00392, GB-A-2188638; Amit et al., Science, Bd. 233 (1986), S. 747-753; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 10029-10033; PCT-WO-90/07861; und Riechmann et al., Nature, Bd. 332 (1988), S. 323-327; Huse et al., Science, Bd. 246 (1988a), S. 1275-1281).
Auf der Grundlage der hier enthaltenen Offenbarung ist ein Fachmann dazu in der Lage, chimäre, humanisierte oder vollständig humane Antikörper gegen P39.5 oder die Kassetten-Proteine oder antigene Fragmente davon unter Zuhilfenahme bekannter Techniken zu erzeugen, indem die komplementaritätsbestimmenden Regionen von tierischen oder humanen Antikörpern gegen das erfindungsgemäße Antigen manipuliert werden; vergl. z. B. E. Mark und Padlin, "Humanization of Monoclonal Antibodies", Kapitel 4, The Handbook of Experimental Pharmacology, Bd. 113, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Springer-Verlag (Juni 1994). Alternativ werden die Antigene als multiantigene Komplexe (vergl. z. B. EP-A-0339695, veröffentlicht am 2. November 1989) oder als einfache Gemische von antigenen Proteinen/Peptiden zusammengebaut und zur Erregung von Antikörpern hoher Titer verwendet, die zur Bindung der gewählten Antigene befähigt sind, wie sie in biologischen Flüssigkeiten eines infizierten Tiers oder Menschen auftreten.
Ferner werden erfindungsgemäß anti-Idiotyp-Antikörper (Ab2) und anti-anti-Idiotyp-Antikörper (Ab3) bereitgestellt. Ab2 sind spezifisch für das Ziel, an das anti-P39.5-Antikörper der Erfindung binden, und Ab3 sind ähnlich mit P39.5-Antikörpern (Ab1) bezüglich ihrer Bindungsspezifitäten und biologischen Aktivitäten (vergl. z. B. M. Wettendorff et al., "Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies", Idiotypic Network and Diseases, Hrsg. J. Cerny und J. Hiernaux, J. Am. Soc. Microbiol., Washington DC, (1990), S. 203-229).
Diese anti-Idiotyp- und anti-anti-Idiotyp-Antikörper werden unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Techniken erzeugt. Derartige anti-Idiotyp-Antikörper (Ab2) können das interne Bild von P39.5, die Kassetten-Proteine oder Fragmente davon tragen und eignen sich somit für die gleichen Zwecke wie P39.5, die Kassetten-Proteine oder die Fragmente.
Im allgemeinen eignen sich polyklonale Antiseren, monoklonale Antikörper und andere Antikörper, die an das gewählte Antigen (Ab1) binden, zum Identifizieren von Epitopen von P39.5 oder von Kassetten-Proteinen zur Abtrennung von P39.5 oder von Kassetten-Proteinen und Analogen davon von Verunreinigungen in lebendem Gewebe (z. B. in chromatographischen Säulen und dergl.) und stellen im allgemeinen Forschungswerkzeuge und Ausgangsmaterialien dar, die für die Entwicklung anderer Typen von Antikörpern gemäß den vorstehenden Ausführungen wesentlich sind. Anti-Idiotyp-Antikörper (Ab2) eignen sich zur Bindung des gleichen Ziels und können somit anstelle des ursprünglichen Antigens, z. B. P39.5 verwendet werden, um eine Immunantwort zu induzieren. Die Ab3-Antikörper eignen sich aus den gleichen Gründen wie Ab1. Weitere Anwendungsmöglichkeiten als Forschungswerkzeuge und als Komponenten zur Abtrennung von P39.5 oder von Kassetten-Proteinen von anderen Verunreinigungen kommen beispielsweise ebenfalls für die vorstehend beschriebenen Antikörper in Frage.
Zur Verwendung in diagnostischen Tests werden die Antikörper mit herkömmlichen Markierungen assoziiert, die dazu befähigt sind, allein oder zusammen mit anderen Zusammensetzungen oder Verbindungen ein nachweisbares Signal zu liefern. Wenn bei einem diagnostischen Verfahren mehr als ein Antikörper verwendet wird, sind die Markierungen vorzugsweise interaktiv, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Insbesondere ist die Markierung visuell nachweisbar, z. B. kolorimetrisch. Eine Vielzahl von Enzymsystemen wurde im Stand der Technik beschrieben, die so funktionieren, dass sich in einem Test ein kolorimetrisches Signal ergibt. Beispielsweise setzt Glucose-oxidase (die Glucose als Substrat verwendet) Peroxid als ein Produkt frei. Peroxidase, die mit Peroxid und einem Wasserstoff-Donator, wie Tetramethylbenzidin (TMB) reagiert, erzeugt oxidiertes TMB, das als blaue Farbe erkennbar ist. Zu weiteren Beispielen gehören Meerrettich-peroxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) sowie Hexokinase in Verbindung mit Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, die mit ATP, Glucose und NAD⁺ reagieren, wobei neben anderen Produkten NADH entsteht, das in Form der erhöhten Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm nachgewiesen wird. Weitere Markierungssysteme, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind durch andere Mittel nachweisbar, z. B. können gefärbte Latex-Mikroteilchen (Bangs Laboratories, Indiana,) in die ein Farbstoff eingebettet ist, können anstelle von Enzymen unter Bildung von Konjugaten mit den Antikörpern und unter Bildung eines visuellen Signals, das ein Hinweis auf die Gegenwart des erhaltenen Komplexes in anwendbaren Tests liefert, verwendet werden. Zu weiteren Markierungen gehören fluoreszierende Verbindungen, radioaktive Verbindungen oder Elemente. Nachweisbare Markierungen für die Anhaftung von Antikörpern, die sich in diagnostischen Tests der Erfindung eignen, können leicht unter zahlreichen Zusammensetzungen ausgewählt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der diagnostischen Tests bekannt sind und leicht verfügbar sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Antikörper sind nicht auf die spezielle nachweisbare Markierung oder das Markierungssystem, die verwendet werden, beschränkt.
IV. Diagnostische Verfahren und Tests
Erfindungsgemäß werden ferner Verfahren zur Diagnose der Lyme-Krankheit bereitgestellt. Diese diagnostischen Verfahren eignen sich zur Diagnose bei Menschen oder Tieren, die klinische Symptome der Lyme- Krankheit aufweisen oder bei denen ein Verdacht auf diese Krankheit besteht.
In einer Ausführungsform umfasst dieses diagnostische Verfahren den Nachweis der Anwesenheit von natürlich auftretenden anti-P39.5-Antikörpern, die durch das infizierte Immunsystem des humanen oder tierischen Patienten in den biologischen Flüssigkeiten erzeugt werden und die dazu befähigt sind, an die erfindungsgemäßen Antigene oder Kombinationen davon zu binden. Dieses Verfahren umfasst die Stufen der Inkubation eines P39.5-Antigens oder eines Kassetten-String-Antigens der Erfindung mit einer Probe von biologischen Flüssigkeiten des Patienten. Antikörper, die in den Flüssigkeiten als Folge einer B. burgdorferi-Infektion vorhanden sind, bilden mit dem Antigen einen Antikörper-Antigen-Komplex. Anschließend wird das Reaktionsgemisch analysiert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Antigen-Antikörper-Komplexe festzustellen. Die Stufe der Analyse des Reaktionsgemisches umfasst das Kontaktieren des Reaktionsgemisches mit einem markierten, spezifischen Bindungspartner für den Antikörper.
In einer ähnlichen Ausführungsform umfasst das diagnostische Verfahren den Nachweis der Anwesenheit von natürlich vorkommenden anti-P1-1-, anti-P3-1-, anti-P6-1-, anti-P7-1, anti-P9-1- und/oder anti-P12-1-Antikörpern, die durch das infizierte Immunsystem des humanen oder tierischen Patienten in den biologischen Flüssigkeiten erzeugt werden und die dazu befähigt sind, an die erfindungsgemäßen Antigene oder Kombinationen davon zu binden. Dieses Verfahren umfasst die Stufe der Inkubation eines dieser erfindungsgemäßen Antigene oder vorzugsweise eines Gemisches dieser Antigene mit einer Probe von biologischen Flüssigkeiten des Patienten. Antikörper, die in den Flüssigkeiten als Folge einer B. burgdorferi-Infektion vorhanden sind, bilden Antikörper-Antigen-Komplexe mit dem oder den Antigenen. Anschließend wird das Reaktionsgemisch analysiert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Antigen-Antikörper-Komplexe festzustellen. Die Stufe der Analyse des Reaktionsgemisches umfasst das Kontaktieren des Reaktionsgemisches mit einem markierten spezifischen Bindungspartner für den Antikörper.
In einer Ausführungsform des Verfahrens werden gereinigtes Antigen, ein Fragment davon oder ein Gemisch von Antigenen durch Elektro- oder Dot-Blotting auf Nitrocellulosepapier aufgebracht. Anschließend wird die biologische Flüssigkeit (z. B. Serum oder Plasma) mit dem aufgesetzten Antigen inkubiert und man lässt den Antikörper in der biologischen Flüssigkeit an das oder die Antigene binden. Der gebundene Antikörper wird sodann durch übliche immunoenzymatische Verfahren nachgewiesen.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden Latex-Perlen mit dem oder den erfindungsgemäßen Antigenen konjugiert. Anschließend wird die biologische Flüssigkeit mit der Perle/Proteinkonjugat inkubiert, wodurch ein Reaktionsgemisch entsteht. Das Reaktionsgemisch wird sodann analysiert, um die Anwesenheit von Antikörpern festzustellen.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das diagnostische Verfahren den Nachweis der Anwesenheit des natürlich auftretenden P39.5 oder von Kassetten-String-Antigenen selbst in Assoziation mit dem Borrelia-Pathogen in den biologischen Flüssigkeiten eines durch das Pathogen infizierten Tiers oder Menschen. Dieses Verfahren umfasst die Stufe der Inkubation eines erfindungsgemäßen Antikörpers (z. B. hergestellt durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Antigens, das vorzugsweise in herkömmlicher Weise für Nachweiszwecke markiert ist, an einen geeigneten Menschen und/oder Tier) mit einer Probe von biologischen Flüssigkeiten eines der Diagnose zu unterziehenden Menschen oder Tiers. In Gegenwart einer Borrelia-Infektion beim humanen oder tierischen Patienten entsteht ein Antigen-Antikörper-Komplex (es tritt eine spezifische Bindung auf). Anschließend wird überschüssiger markierter Antikörper gegebenenfalls entfernt und das Reaktionsgemisch wird analysiert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des Antigen-Antikörper-Komplexes und die Menge der damit assoziierten Markierung festzustellen.
Tests unter Verwendung des erfindungsgemäßen Protein-Antigens können heterogen (d. h. Erfordernis einer Trennstufe) oder homogen sein. Wenn der Test heterogen ist, können eine Vielzahl von Trennmaßnahmen herangezogen werden, einschließlich Zentrifugation, Filtration, Chromatographie oder Magnetismus.
Ein bevorzugter Test zum Screening der Blutprodukte oder anderer physiologischer oder biologischer Flüssigkeiten besteht in einem enzymgebundenen Immunosorbenstest, d. h. ein ELISA-Test. Typischerweise werden bei einem ELISA-Test das oder die isolierten erfindungsgemäßen Antigene an der Oberfläche einer Mikrotiter-Vertiefung direkt oder über eine Abfangmatrix (d. h. ein Antikörper) adsorbiert. Restliche Protein-Bindungsstellen an der Oberfläche werden sodann mit einem geeigneten Mittel, wie Rinderserumalbumin (BSA), hitzeinaktiviertes, normales Ziegenserum (NGS) oder BLOTTO (eine gepufferte Lösung von Magertrockenmilch, die auch Konservierungsmittel, Salze und ein Schaumverhinderungsmittel enthält) blockiert. Die Vertiefung wird sodann mit einer biologischen Probe, bei der ein Verdacht auf einen Gehalt an spezifischem anti-B. burgdorferi-Antikörper besteht, inkubiert. Die Probe kann unverdünnt oder häufiger in verdünnter Form, üblicherweise in einer gepufferten Lösung, die eine geringe Menge (0,1-5,0 Gew.-%) Protein, wie BSA, NGS oder BLOTTO, enthält, aufgebracht werden. Nach Inkubation für eine ausreichende Zeitspanne, um eine spezifische Bindung zu ermöglichen, wird die Vertiefung zur Entfernung von ungebundenem Protein gewaschen und anschließend mit markiertem antihumanem Immunoglobulin (α-HuIg) oder markierten Antikörpern gegen andere Spezies, z. B. Hunde, inkubiert. Die Markierung kann aus einer Vielzahl von Enzymen gewählt werden, einschließlich Meerrettich-peroxidase (HRP), β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Glucose-oxidase, wie vorstehend ausgeführt. Nach Ablauf einer ausreichenden Zeitspanne für die spezifische Bindung wird die Vertiefung erneut gewaschen, um ungebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat für das Enzym wird zugesetzt. Man lässt eine Farbentwicklung zu und bestimmt die optische Dichte des Inhalts der Vertiefung visuell oder mittels eines Instruments.
Ferner können MAbs oder andere erfindungsgemäße Antikörper, die zur Bindung an das oder die Antigene befähigt sind, an die ELISA-Platten gebunden werden. Bei einem weiteren diagnostischen Verfahren wird die biologische Flüssigkeit an der Platte mit dem gebundenen Antikörper inkubiert, wonach sich ein Waschvorgang anschließt. Der Nachweis von etwaigem Antigen-Antikörper-Komplex und die qualitative Messung des markierten MAb wird auf herkömmliche Weise, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt.
Weitere geeignete Testformate umfassen Filterbecher und Tauchstäbchen. Beim erstgenannten Test wird ein erfindungsgemäßer Antikörper an einem gesinterten Glasfilter an der Öffnung einer kleinen Kappe fixiert. Die biologische Flüssigkeit oder Probe (5 ml) wird durch den Filter gegeben. Wenn das Antigen vorhanden ist (d. h. eine B. burgdorferi-Infektion), bindet es an den Filter und wird dann durch einen zweiten Antikörper-Detektor sichtbar gemacht. Der Tauchstäbchentest umfasst die Fixierung eines Antigens oder Antikörpers an einen Filter, der dann in die biologische Flüssigkeit getaucht, getrocknet und mit einem Detektormolekül festgestellt wird.
Weitere diagnostische Tests können sich des oder der erfindungsgemäßen Antigene oder Fragmente als Nucleinsäuresonden oder antisense-Sequenzen bedienen, die das Vorliegen einer Infektion in der biologischen Flüssigkeit durch Hybridisierung mit komplementären Sequenzen, die durch das Pathogen in den biologischen Flüssigkeiten erzeugt worden sind, identifizieren können. Derartige Techniken, wie PCR, Northern oder Southern-Hybridisierungen und dergl., sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass beliebige herkömmliche Protein-Testformate, insbesondere Immunoassay-Formate, oder Nucleinsäure-Testformate entwickelt werden können, um die isolierten Antigene und Antikörper oder deren Nucleinsäuresequenzen und antisense-Sequenzen der Erfindung zum Nachweis einer Borrelia-Infektion bei Tieren und Menschen zu verwenden. Die Erfindung ist somit nicht durch die Auswahl des speziellen Testformats beschränkt. Es wird angenommen, dass sie Testformate umfasst, die dem Fachmann geläufig sind.
V. Diagnostische Kits
Zweckmäßigerweise können Reagenzien für ELISA-Tests oder andere hier beschriebene Tests in Form von Kits bereitgestellt werden. Derartige Kits eignen sich zur Diagnose einer Infektion mit Borrelia in einer humanen oder tierischen Probe. Ein derartiges diagnostisches Kit enthält ein erfindungsgemäßes Antigen und/oder mindestens einen Antikörper, der zur Bindung an das erfindungsgemäße Antigen befähigt ist, oder die dafür kodierenden Nucleinsäuresequenzen oder deren antisense-Sequenzen. Alternativ können derartige Kits ein einfaches Gemisch von derartigen Antigenen oder Sequenzen oder Mittel zur Herstellung eines einfachen Gemisches enthalten.
Diese Kits können Mikrotiterplatten umfassen, an denen die Borrelia-Antigenproteine oder -Antikörper oder -Nucleinsäuresequenzen der Erfindung vorher adsorbiert worden sind, sowie verschiedene Verdünnungsmittel und Puffer, markierte Konjugate zum Nachweis von spezifisch gebundenen Antigenen oder Antikörpern oder Nucleinsäuren und andere signalerzeugende Reagenzien, wie Enzymsubstrate, Cofaktoren und Chromogene. Weitere Komponenten dieser Kits lassen sich vom Fachmann leicht festlegen. Derartige Komponenten können polyklonale oder monoklonale Abfangantikörper, erfindungsgemäßes Antigen oder einen Cocktail von zwei oder mehr Antikörpern, gereinigte oder halb gereinigte Extrakte dieser Antigene als Standards, MAb-Nachweisantikörper, einen antimurinen oder antihumanen Antikörper mit einem daran konjugierten Indikatormolekül, eine ELISA-Platte, die für die Absorption vorbereitet ist, Indikatorkarten für kolorimetrische Vergleiche, Einweghandschuhe, Anweisungen zur Dekontaminierung, Auftragestäbchen oder Behälter und einen Probenvorbereitungsbecher umfassen. Derartige Kits bieten einem klinischen Laboratorium einen zweckmäßigen, wirksamen Weg zur Diagnose einer Borrelia-Infektion.
VI. Therapeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Antigene, Antikörper, Nucleinsäuresequenzen oder antisense-Sequenzen können allein oder in Kombination mit anderen Antigenen, Antikörpern, Nucleinsäuresequenzen oder antisense-Sequenz, ferner in therapeutischen Zusammensetzungen und in Verfahren zur Behandlung von Menschen und/oder Tieren mit der Lyme-Krankheit verwendet werden. Beispielsweise kann eine derartige therapeutische Zusammensetzung so zubereitet werden, dass sie einen Träger oder Verdünnungsmittel und einen oder mehrere anti-P7-1- oder andere anti-Kassetten-String-Protein-Antikörper der Erfindung enthält. Geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger erleichtern die Verabreichung der Proteine, sind aber physiologisch inert und/oder unschädlich.
Träger können vom Fachmann ausgewählt werden. Zu Beispielen für Träger gehören sterile Kochsalzlösung, Lactose, Saccharose, Calciumphosphat, Gelatine, Dextran, Agar, Pektin, Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl und Wasser. Ferner können der Träger oder das Verdünnungsmittel ein Verzögerungsmaterial, wie Glycerolmonostearat oder Glyceroldistearat allein oder zusammen mit einem Wachs, umfassen. Ferner können Polymerzubereitungen mit langsamer Wirkstofffreisetzung verwendet werden.
Gegebenenfalls kann diese Zusammensetzung auch herkömmliche pharmazeutische Bestandteile, wie Konservierungsmittel oder chemische Stabilisatoren, enthalten. Zu geeigneten Bestandteilen, die in einer therapeutischen Zusammensetzung in Verbindung mit den Antikörpern verwendet werden können, gehören beispielsweise Casaminsäuren, Saccharose, Gelatine, Phenolrot, N-Z-Amin, Monokaliumdiphosphat, Lactose, Lactalbumin-hydrolysat und Trockenmilch.
Alternativ oder zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Antikörpern lässt es sich erwarten, dass weitere Mittel, die bei der Behandlung der Lyme-Krankheit geeignet sind, z. B. Antibiotika oder immunostimulatorische Mittel und Elemente zur Cytokin-Regulation, in Bezug auf eine Verringerung oder Beseitigung von Krankheitssymptomen wertvoll sind. Mittel, die zur Unterdrückung oder zur Bekämpfung der Immunosuppressiva, die vom Zecken-Vektor oder den Spirochäten freigesetzt worden sind, verwendet werden können, sollten zur Unterstützung der natürlichen Immunität des infizierten Menschen oder Tiers dienen. Somit können derartige Mittel mit den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen zusammenwirken. Die Entwicklung von therapeutischen Zusammensetzungen, die diese Mittel enthalten, liegt im Hinblick auf die Lehre dieser Erfindung im Können des Fachmanns.
Ein Mensch oder Tier kann einer Behandlung der Lyme-Krankheit unterzogen werden, indem man eine wirksame Menge einer derartigen therapeutischen Zusammensetzung verabreicht. Eine "wirksame Menge" kann etwa 0,05 bis etwa 1 000 μg/ml eines erfindungsgemäßen Antikörpers betragen. Eine geeignete Dosierung kann etwa 1,0 ml mit einer derartigen wirksamen Menge betragen. Eine derartige Zusammensetzung kann 1- bis 3-mal täglich über einen Zeitraum von 1 Tag bis 12 Wochen verabreicht werden. Jedoch können geeignete Dosierungsanpassungen vom behandelnden Arzt oder Tierarzt je nach Alter, Geschlecht, Gewicht und allgemeinem Gesundheitszustand des humanen oder tierischen Patienten vorgenommen werden. Vorzugsweise wird eine derartige Zusammensetzung parenteral, insbesondere intramuskulär oder subkutan, verabreicht. Jedoch kann die Zusammensetzung auch so zubereitet werden, dass sie auf beliebigen anderen geeigneten Wegen, einschließlich oral oder topisch, zu verabreichen ist.
VII. Impfstoffzusammensetzungen
Keines der potentiellen Probleme des Stands der Technik entsteht mit einem Impfstoff auf der Basis eines Antigens, das im Wirbeltierwirt exprimiert wird. Ein verbesserter Impfstoff auf der Basis von Oberflächenantigen zur Prophylaxe der Lyme-Krankheit bei Menschen und Tieren kann durch Kombination des erfindungsgemäßen P39.5-Antigens und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels bereitgestellt werden. Diese Impfstoffzusammensetzung kann eine oder mehrere der isolierten, rekombinanten, modifizierten oder multimeren Formen des erfindungsgemäßen P39.5-Antigens oder Gemische davon enthalten. Gleichermaßen können in derartigen Zusammensetzungen Salze der antigenen Proteine verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform für eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung beruht auf den übrigen Kassetten-String-Antigenen, d. h. P1-1, P3-1, P6-1, P7-1, P9-1 und P12-1. Der Erfinder ist der Auffassung, dass der Mechanismus einer antigenen Variation, der das vlsE-Antigen unterworfen wird, anzeigt, dass dieses Antigen von entscheidender Bedeutung für das Überleben der Spirochäten im Wirbeltierwirt ist. Ein neuartiges Impfverfahren beinhaltet das Umgehen des Spirochäten-Abwehrmechanismus durch Immunisieren eines Wirts mit einer großen Fraktion der Epitope, die am Kassetten-String, der die eigentliche Quelle der Variation darstellt, exprimiert werden. Dies wird durch die besondere Tatsache ermöglicht, dass der Großteil dieses Kassetten-Strings sich im Raster befindet. Die Erfinder haben dieses Konzept (wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben) durch Immunisieren eines Wirts mit dem Kassetten-String-Antigen P7-1 und durch Induzieren von Antikörper, der die Spirochäten abtötet, bewiesen. Somit beinhaltet ein Impfverfahren die Verabreichung von mehreren oder sämtlichen der klonierten und gereinigten Proteine gemäß der vorstehenden Beschreibung an den Wirt, wobei diese Proteine sich vom antigenen Standpunkt aus von unterschiedlichen Abschnitten des IP90-Kassetten-Strings ableiten. Während eine Vielzahl von immunogenen Zusammensetzungen aus derartigen Proteinen hergestellt werden kann, wird es derzeit bevorzugt, dass ein einfaches Gemisch von zwei oder mehr der Kassetten-String-Proteine oder von Peptidfragmenten davon für diesen Zweck verwendet wird.
Kombinationen des oder der erfindungsgemäßen Antigene mit anderen Antigenen von B. burgdorferi, wie OspA-, OspB- und OspC-Proteine, BmpA-, B-, C- oder D-Proteine oder Fragmente davon kommen ebenfalls in Betracht.
Beispiele für Träger sind die vorstehend für therapeutische Zusammensetzungen beschriebenen Produkte. Gegebenenfalls kann die Impfstoffzusammensetzung ferner Adjuvanzien, Konservierungsmittel, chemische Stabilisatoren oder andere antigene Proteine enthalten. Typischerweise werden Stabilisatoren, Adjuvanzien und Konservierungsmittel optimiert, um die günstigste Zubereitung in Bezug auf die Wirksamkeit bei dem als Ziel dienenden Menschen oder Tier zu bestimmen. Geeignete beispielhafte Konservierungsmittel umfassen Chlorbutanol, Kaliumsorbat, Sorbinsäure, Schwefeldioxid, Propylgallat, Parabene, Ethylvanillin, Glycerin, Phenol und p-Chlorphenol.
Eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen Impfstoffkomponenten können mit einem herkömmlichen Adjuvans vermischt oder daran adsorbiert werden. Das Adjuvans wird verwendet, um Leukozyten anzuziehen oder um eine Immunantwort zu verstärken. Zu derartigen Adjuvanzien gehören unter anderem Ribi, Mineralöl und Wasser, Aluminumhydroxid, Amphigen, Avridine, L121/Squalen, D-Lactid-polylactid/glycosid, Pluronic-"plyois", Muramyldipeptid, abgetötete Bordetella und Saponine, wie Quil A. Ferner kann eine erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung weitere Nicht-B. burgdorferi-Antigene enthalten, einschließlich Bordetella bronchiseptica, Hunde-Parvovirus, Hundestaupe, Tollwut, Leptosporidia, Hunde-Coronavirus und Hunde-Adenovirus. Weitere Impfstoffantigene, die aus anderen Spezies stammen, können ebenfalls in diesen Zusammensetzungen enthalten sein, z. B. Katzen-Coronavirus und dergl.
Ein prophylaktisches Verfahren kann die Verabreichung einer wirksamen Menge einer derartigen Zusammensetzung an ein Tier oder einen Menschen mit sich bringen. Die antigenen P39.5- und/oder Kassetten-String-Protein-Zusammensetzungen werden in einer "wirksamen Menge" verabreicht, d. h. eine Antigenmenge, die bei einem Verabreichungsweg zu einem impftechnischen Nutzen, d. h. einer schützenden Immunität, führt. Geeignete Antigenmengen lassen sich vom Fachmann auf der Grundlage des angestrebten Grads der Immunantwort festlegen. Im allgemeinen enthält die Impfstoffzusammensetzung jedoch 1 ng bis 1 000 mg Antigen und insbesondere 0,05 μg bis 1 mg pro ml Antigen. Geeignete Dosen der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung lassen sich vom Fachmann leicht bestimmen. Im allgemeinen beträgt eine geeignete Dosis 0,1 bis 5 ml Impfstoffzusammensetzung. Ferner kann je nach dem humanen Patienten oder der Tierspezies, die zu behandeln sind, d. h. je nach deren Gewicht, Alter und Gesundheitszustand, die Dosierung ebenfalls vom Fachmann leicht festgelegt werden.
Im allgemeinen wird der Impfstoff 1-mal auf saisonaler Basis verabreicht. In jeder Zeckensaison, üblicherweise im Frühjahr, sollte eine Auffrischung verabreicht werden. Der Impfstoff kann auf beliebigen geeigneten Wegen verabreicht werden. Jedoch stellt eine parenterale Verabreichung, insbesondere intramuskulär, und eine subkutane Verabreichung den bevorzugten Weg dar. Ferner wird der orale Verabreichungsweg bevorzugt. Gegebenenfalls können die Verabreichungswege kombiniert oder angepasst werden.
Ferner kann es sich beim Impfstoff um einen DNA-Impfstoff handeln, der die P7-1-DNA-Sequenz oder ein Fragment davon, ein weiteres Kassetten-String-Protein oder ein Fragment davon, gegebenenfalls unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen, umfasst. Somit kann die für das Antigen kodierende DNA in einem Vektor, z. B. einem viralen Vektor, transportiert werden. Im allgemeinen umfasst eine geeignete Behandlung auf Vektorbasis 1 × 10^–3 pfu bis 1 × 10¹² pfu pro Dosis. Jedoch können die Dosis, die Zeitgebung und die Verabreichungsart dieser Zusammensetzungen vom Fachmann festgelegt werden. Faktoren, wie Alter und physikalischer Zustand des Impfstoffs, können bei der Festlegung der Dosis, der Zeitgebung und der Verabreichungsart der immunogenen Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung der Erfindung berücksichtigt werden.
VIII. Arzneistoff-Screening und -Entwicklung
Die erfindungsgemäßen Proteine, Antikörper und Polynucleotidsequenzen können auch beim Screening und der Entwicklung von chemischen Verbindungen oder Proteinen verwendet werden, die sich als therapeutische Arzneistoffe oder Impfstoffe zur Behandlung oder zur Diagnose oder zur Prophylaxe der Lyme-Krankheit eignen. Beispielsweise kann sich eine Verbindung, die zur Bindung an P39.5 und zur Verhinderung von dessen biologischer Aktivität befähigt ist, als Arzneistoffkomponente zur Therapie oder Prophylaxe der Lyme-Krankheit eignen. Die hier beschriebenen Verfahren können auch auf Fragmente von P39.5 angewandt werden. Gleichermaßen kann sich eine Verbindung, die zur Bindung an ein Kassetten-String-Protein oder ein Fragment davon und zur Verhinderung von deren biologischer Aktivität befähigt ist, als Arzneistoffkomponente zur Therapie oder Prophylaxe der Lyme-Krankheit eignen.
Geeignete Testverfahren lassen sich leicht vom Fachmann bestimmen. Gegebenenfalls und in Abhängigkeit vom gewählten Test können das oder die gewählten Antigene, z. B. P39.5, direkt oder indirekt (z. B. über einen anti-P39.5-Antikörper) an einer geeigneten Oberfläche immobilisiert werden, z. B. in einem ELISA-Format. Derartige Immobilisierungsoberflächen sind bekannt. Beispielsweise kann eine benetzbare, inerte Perle verwendet werden. Alternativ kann das gewählte Antigen, z. B. P39.5 bei Screening-Tests verwendet werden, die keine Immobilisierung erfordern, z. B. beim Screening von Kombinationsbibliotheken. Es existieren Tests und Techniken zum Screening und zur Entwicklung von Arzneistoffen, die zur Bindung an ein erfindungsgemäßes Antigen, z. B. P39.5 befähigt sind. Hierzu gehören die Verwendung eines Phagen-Displaysystems zur Expression des oder der antigenen Proteine und die Verwendung einer Kultur von transfiziertem E. coli oder anderen Mikroorganismen zur Herstellung der Proteine für Bindungsstudien von potentiell bindenden Verbindungen; vergl. beispielsweise die von G. Cesarini beschriebenen Techniken, FEBS Letters, Bd. 307(1) (Juli 1992), S. 66-70; H. Gram et al., J. Immunol. Meth., Bd. 161 (1993), S. 169-176; C. Summer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89 (Mai 1992), S. 3756-3760; diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Weitere herkömmliche Arzneistoff-Screeningtechniken können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine, Antikörper oder Polynucleotidsequenzen eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein, z. B. P39.5, binden, in einfacher Weise die Stufen des Kontaktierens eines gewählten P39.5-Proteins mit einer Testverbindung an P39.5 ermöglichen, und die Bestimmung der Menge der Testverbindung, soweit vorhanden, die an das P39.5-Protein gebunden ist, umfassen. Ein derartiges Verfahren kann die Inkubation der Testverbindung und des an einem festen Träger immobilisierten P39.5-Proteins beinhalten. Ähnliche Verfahren können für ein oder mehr Kassetten-String-Proteine eingesetzt werden.
Typischerweise bringt man die Oberfläche, die den immobilisierten Liganden enthält, in Kontakt mit einer Lösung, die das Protein enthält, und die Bindung wird unter Verwendung eines geeigneten Nachweissystems gemessen. Zu geeigneten Nachweissystemen gehören das Streptavidin-Meerrettich-peroxidase-Konjugat, eine direkte Konjugation mit einer Markierung, z. B. Fluorescein. Weitere Systeme sind dem Fachmann geläufig. Die Erfindung wird nicht durch das angewandte Nachweissystem beschränkt.
Ein weiteres Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die spezifisch an P39.5 oder ein anderes erfindungsgemäßes Protein binden, kann die Stufen des Kontaktierens des Proteins, z. B. P39.5, das an einem festen Träger immobilisiert ist, sowohl mit einer Testverbindung als auch mit der Proteinsequenz, die einen Rezeptor für P39.5 darstellt, um eine Bindung des Rezeptors an das P39.5-Protein zu ermöglichen; und des Bestimmens der Menge des Rezeptors, die an das P39.5-Protein gebunden ist, umfassen. Die Hemmung der Bindung des normalen Proteins durch die Testverbindung stellt daher einen Hinweis auf die Bindung der Testverbindung an das P39.5-Protein dar. Ähnliche Verfahren können für ein oder mehr der Kassetten-String-Proteine angewandt werden.
Somit können unter Anwendung derartiger Verfahren Verbindungen bereitgestellt werden, die dazu befähigt sind, in Wechselwirkung mit P39.5 oder Teilen davon und/oder mit den Kassetten-String-Proteinen oder Teilen davon zu treten und je nach Wunsch entweder die biologische Aktivität des Proteins zu verstärken oder zu verringern. Derartige Verbindungen fallen unter den Umfang der Erfindung. Ferner kann das P39.5-Protein gemäß den vorstehenden oder nachstehenden Ausführungen mit P7-1 oder einem oder mehreren der übrigen Kassetten-String-Proteine substituiert sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die bevorzugten Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Protein-Antigene und zur Vorbereitung bzw. Herstellung der erfindungsgemäßen Tests und Zusammensetzungen. In signifikanter Weise zeigen diese Beispiele, dass das erfindungsgemäße P39.5-Antigen sich zur Diagnose und Prophylaxe der Lyme-Krankheit eignet und die Lyme-Serologie bessern kann. Diese Beispiele dienen nur Erläuterungszwecken und beschränken den Schutzumfang der Erfindung nicht.
Beispiel 1 – Bakterielle Borrelia-Stämme und Antikörper
A. Bakterielle Stämme
Der JD1-Stamm von B. burgdorferi sensu stricto (J. Piesman et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 25 (1987), S. 557-558, und T. G. Schwan et al., J. Clin. Microbiol., Bd. 27 (1989), S. 1734-1738) wurde vom Center for Disease Control and Prevention erhalten und in Form von eingefrorenen Vorratsprodukten mit geringer Passagierung (< 7) aufbewahrt. B31 ist ebenfalls ein Stamm von B. burgdorferi sensu stricto, der vom CDC erhalten und auf die vorstehend angegebene Weise aufbewahrt wurde. IP90 ist ein Stamm von B. garinii, der ebenfalls vom CDC geliefert wurde.
B. burgdorferi-Organismen wurden bei 34 °C in einem BSK-H-Kulturmedium (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) gezüchtet.
B. Affen-Antikörper
Lebende Spirochäten wurden mit Serum-Antikörper aus Rhesus-Affen, die mit B. burgdorferi Stamm JD 1 durch den Biss von I. scapularis-Nymphen infiziert worden waren, inkubiert. Nicht-gebundene Antikörper wurden von den Spirochäten abgewaschen und gebundene Antikörper wurden mit Puffer von geringem pH-Wert entfernt. Affen-Antikörper wurden aus drei Quellen erhalten:

a) von Rhesus-Affen, die durch Nadelinokulation mit B. burgdorferi Stamm JD1 infiziert worden waren,
b) von Rhesus-Affen, die mit B. burgdorferi Stamm JD1 durch Belastung der Tiere mit JD1-infizierten Nymphen von Ixodes scapularis infiziert worden waren, und
c) durch Affinitätsreinigung an lebenden Spirochäten unter Verwendung eines Ausgangsmaterial-Antiserums, das von mit Zecken inokulierten Tieren folgendermaßen gewonnen worden war: Ein Volumen von 800 μl verdünnten (1/40 in BSK-H-M), hitzeinaktivierten Serumproben, die aus drei mit Zecken inokulierten Tieren gepoolt worden waren, wurden mit 1 × 10⁹ gesamten lebenden Bakterien 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben 15 Minuten bei 4 °C mit 13 000 × g zentrifugiert. Sodann wurde der Überstand weitere 2-mal auf die vorstehend beschriebene Weise readsorbiert. Das bakterielle Pellet, das nach der ersten Adsorption gewonnen worden war, wurde 3-mal mit BSK-H gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Nach dem letzten Waschvorgang wurde das Pellet in 400-500 μl 0,2 M Glycin-HCl, pH-Wert 2,2, 0,5 M NaCl, resuspendiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und der pH-Wert wurde durch Zugabe von 2,0 M Tris-Base auf 7,00 gebracht.

Beispiel 2 – Vorläufige Identifizierung von P39.5 von IP90
Die Antikörper von Beispiel 1, Abschnitt B, wurden mit Western-Blots von vollständigen Extrakten von JD1-, B31- und IP90-Spirochäten umgesetzt. Western-Blots wurden folgendermaßen durchgeführt: Antigen-Präparate wurden der Elektrophorese in 15 % Acrylamid-Minigelen (10 × 10 × 0,1 cm) mit einem 5%igen Acrylamid-Stapelgel unterworfen. 20 μl Lysat mit einem Gehalt an 7 × 10⁸ solubilisierten Bakterien oder 25 μg Protein (gemessen durch OD bei 280 nm) wurden pro Bahn (die gesamte präparative Bahn entspricht 16 einzelnen Bahnen; daher wurden 400 μg Protein auf jedes präparative Gel aufgesetzt) verteilt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung einer Minigel-Vorrichtung (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) bei einem konstanten Strom von 23 mA mit den Puffern von U. Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680-685, durchgeführt. Für das Immunoblotting wurden die Proteine von den Polyacrylamidgelen durch Elektrotransfer auf Nitrocellulose-Papier (Schleicher und Schuell, Keene, NH) über Nacht bei einer konstanten Spannung von 22 V in einer Mighty Small-Transfereinheit (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA) gemäß den Angaben von H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76 (1979), S. 4350-4354, übertragen. Der Wirkungsgrad der Übertragung wurde durch Färben eines Teils der Nitrocellulose mit kolloidalem Gold (Integrated Separation Systems) bestimmt. Die Nitrocellulose-Membranen wurden mit 3 % Magermilchpulver (Carnation), das in PBS mit einem Gehalt an 0,05 % Tween-20 (Integrated Separation Systems) (PBS-T) zubereitet worden war, 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert.
Nach der Blockierungsstufe wurden die Membranen in einer Miniblotter 45-Vorrichtung (Immunetics, Cambridge, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers montiert und 110 μl der einzelnen Serumproben wurden in einer 1/50-Verdünnung mit PBS-T in die Miniblotter-Kanäle gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform mit der Nitrocellulose-Membran in Wechselwirkung gebracht. Nach der Inkubation wurde das Verteilersystem zum Waschen der Membranen mit PBS-T verwendet. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Miniblotter zerlegt und das Blot wurde entnommen. Die restlichen Inkubationsstufen wurden in kleinen Schalen durchgeführt. Nach dem Waschvorgang wurden die Membranen 1 Stunde mit biotinylierten antihumanen IgM- (μ-Ketten-spezifisch) und IgG (γ-Ketten-spezifisch) Antikörpern (Vector Laboratories, Burlingame, CA), bei 1/200-Verdünnung in PBS-T inkubiert. Biotinylierte Antikörper wurden einer Sondenbehandlung mit Avidin/biotinyliertem Meerrettich-peroxidase-Komplex (Vektor), der gemäß den Angaben des Herstellers zubereitet worden war, unterzogen. Das Reagenz 4-Chlor-1-naphthol (Sigma) wurde als ein Chromogen verwendet. Die Farbreaktion wurde durch Waschen der Membranen mit destilliertem Wasser gestoppt.
Ein Western-Blot (6) wurde von Lysaten aus Spirochäten der Stämme B. burgdorferi JD1 und B31 und B. garinii Stamm IP90 durchgeführt, die mit Serum von Affen entwickelt worden waren, die mit den JD1-Spirochäten mit der Nadel und mit Zecken inokuliert worden waren. Ferner wurden Western-Blots mit Antikörpern aus dem letztgenannten Serum nach Entfernung von vollständigen lebenden JD1-Spirochäten durch Affinitätsreinigung durchgeführt. Der affinitätsgereinigte Antikörper erkannte auf Western-Blots von vollständigen Lysaten von Spirochäten von B. burgdorferi JD1 vier Antigene. Die Antigene erhielten die Bezeichnungen P1 (relative Molekülmasse (Mr) 39 000-40 000), P2 (Mr 35 000-37 000, P3 (Mr 22 000-24 000) und P4 (Mr 18 000-19 000). Diese Antigene wurden ferner erwartungsgemäß durch Serumproben von mit der Nadel inokulierten Tieren und durch Serum von mit Zecken inokulierten Affen erkannt. Ferner zeigte dieser Western-Blot, dass die affinitätsgereinigten Antikörper die Produkte erkannten, bei denen es sich offensichtlich um P1, P2 und P4 an B31-Spirochäten und offensichtlich um P1 (jedoch mit einer geringfügig höheren relativen Molekülmasse) in B. garinii handelte sowie um ein zusätzliches Antigen mit einer höheren relativen Molekülmasse. Die beiden letztgenannten Antigene wurden ferner ausschließlich durch die Seren von mit der Nadel und mit Zecken inokulierten Tieren erkannt. P1 wurde schließlich als P39, das auch als BmpA bekannt ist, identifiziert. Das ähnliche Antigen, das an IP90-Spirochäten vorliegt, wurde provisorisch als P39.5 identifiziert. Es wurde beim vorstehend erörterten Western-Blot nachgewiesen.
Beispiel 3 – Antikörperabhängiges, komplementvermitteltes Abtöten von JD1-, B31- und IP90-Spirochäten
Serum aus mit Zecken inokulierten Affen wurde folgendermaßen in einem ADCK-Test verwendet. Eingefrorene Proben von B. burgdorferi wurden rasch bei 37 °C aufgetaut, bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet (etwa 3 Tage, 1-2 × 10⁷ Spirochäten/ml), 20 Minuten mit 8 000 × g zentrifugiert, in BSK-H-Medium resuspendiert und gezählt. Der ADCK-Test wurde im Doppelversuch auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar) durchgeführt. Insgesamt 5-6 × 10⁵ Spirochäten in 25 μl BSK-H-Medium wurden in jede Vertiefung mit einem Gehalt an 50 μl hitzeinaktivierten (56 °C, 30 Minuten) Serumproben, die im gleichen Medium 1:10 verdünnt worden waren, gegeben. Die Platten wurden unter einem Gasgemisch aus 3 % CO₂, 5 % O₂ und Rest N₂ 20 Minuten bei 34 °C inkubiert, wonach 25 μl Komplement (normales Affenserum) zugegeben wurden. Nach 18- bis 24-stündiger Inkubation unter den gleichen Bedingungen wurde die Gesamtzahl an toten (nicht beweglichen) und lebenden (beweglichen) Bakterien quantitativ unter einem Dunkelfeldmikroskop bestimmt. Die Äquivalenz zwischen Unbeweglichkeit und Tod in einem ähnlichen Test war vorher bestimmt worden (M. Aydintug et al., a.a.O.). Die Abtötung wurde als signifikant angesehen, wenn der prozentuale Mittelwert von toten Spirochäten das 3-fache des Werts des prozentualen Mittelwerts der Abtötung, die in Gegenwart von normalem Serum beobachtet wurde, überstieg.
Ein ADCK-Test wurde mit Spirochäten von den Stämmen B. burgdorferi JD1 und B31 und B. garinii Stamm IP90 unter Verwendung von Serum von Tieren, die durch Zecken mit JD1-Spirochäten inokuliert worden waren, durchgeführt. Wie in Beispiel 2 dargelegt, erkannte dieses Serum nur zwei Antigene auf IP90-Blots, eines mit einer relativen Molekülmasse, die ähnlich der von P1 war, und eines mit einer höheren relativen Molekülmasse. Wie in 1 gezeigt, wurden alle drei Spirochätenstämme durch das Serum abgetötet, was darauf hinweist, dass mindestens eines der im IP90-Western-Blot gezeigten Antigene das Ziel von ADCK war.
Beispiel 4 – Identifizierung von P39.5
Die Identität der mutmaßlichen BmpA (P39)-Bande, die auf den IP90-Western-Blots sichtbar ist, wurde untersucht. Ein Western-Blot von Lysaten aus JD1 und IP90 wurde entwickelt mit monoklonalem anti-Flagellin-Antikörper (Mab); anti-P39-Mab; polyklonalem anti-P39-Antikörper; anti-P35-Mab; polyklonalem anti-BmpD; und Seren von zwei von Zecken mit JD1-Spirochäten inokulierten Affen. Bei der Western-Blot-Vergleichsanalyse von JD1- und IP90-Antigenen, die auf dem gleichen Gel gelaufen waren, reagierten beide Antigenextrakte mit dem anti-Flagellin-Mab H9724. Jedoch reagierte ein anti-BmpA-Mab nur mit JD1-BmpA, und Serum des Affen, der mit dem rekombinanten BmpA aus JD1 immunisiert worden war, reagierte erwartungsgemäß stark mit dem JD1-Blot, jedoch schwach mit dem BmpA-Antigen aus IP90. Außerdem reagierten Serumproben, die aus zwei JD1-infizierten Affen mit den gleichen beiden Antigenen wie vorher erhalten worden waren, am IP90-Blot und ergaben gelegentlich zusätzliche (schwächere) Banden mit einer höheren Molekülmasse. Die Bande mit der geringsten Molekülmasse der beiden entspricht tatsächlich einem größeren Molekül als das BmpA aus IP90, gemäß Identifikation mit polyklonalem anti-BmpA-Antikörper. Die Bande mit höherer Molekülmasse entspricht vermutlich Flagellin, da dieses die gleiche Molekülmasse wie die Bande von IP90, das mit MAb H9724 reagiert hat, aufweist.
Ein monoklonaler Antikörper gegen P35 aus JD1 reagierte mit diesem Molekül am JD1-Blot, jedoch nicht am IP90-Blot, während ein polyklonales Mäuse-Antiserum gegen JD1-BmpD mit BmpD sowohl von JD1 als auch IP90 reagierte, obgleich die BmpD-Bande von IP90 sehr schwach war. Somit war die Identität des IP90-Antigens, das das Ziel der ADCK darstellen konnte, nicht BmpA, BmpD oder P35. Es wurde anschließend als P39.5 bezeichnet.
Sodann wurde ein Western-Blot von Lysaten von JD1- und IP90-Spirochäten entwickelt, die mit folgenden Produkten inkubiert worden waren: Serum eines durch eine Zecke mit JD1 inokulierten Affen; polyklonales Affen-Antiserum gegen P39; Mäuse-Mab H9724 gegen Flagellin; Affen-anti-P39.5-Antikörper, erhalten durch Affinitätsreinigung aus einer Serumprobe eines durch eine Zecke mit JD1 inokulierten Affen; und antirekombinantes Mäuse-P7-1 (rP7-1). Zur Identifizierung von P39.5 auf Western-Blots von JD1-Lysaten wurde der anti-P39.5-Antikörper, der in JD1-infizierten Affen hervorgerufen worden war, unter Verwendung von Nitrocellulosestreifen, an denen P39.5 aus IP90 haftete, der Affinitätsreinigung unterzogen. Erwartungsgemäß reagierte dieser Antikörper mit dem P39.5-Antigen auf einem Western-Blot von IP90-Lysat, reagierte aber überraschenderweise nicht mit dem JD1-Blot. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass P39.5 von JD1 entweder in vitro nicht exprimiert wurde, so schwach exprimiert wurde, dass er durch den affinitätsgereinigten anti-P39.5-Antikörper auf den JD1-Blots nicht nachweisbar war, oder in vitro durch JD1 so exprimiert wurde, dass er keine Antigen-Kreuzreaktion mit dem aus P39.5 von IP90 affinitätsgereinigtem Antikörper zeigte.
Offensichtlich mussten JD1-Spirochäten P39.5 in vivo und in zur Erzielung einer immunogenen Wirkung ausreichenden Mengen exprimieren, da ansonsten der anti-P39.5-Antikörper, der affinitätsgereinigt worden war, nicht an erster Stelle hervorgerufen worden wäre. Beim vorstehend beschriebenen Western-Blot wurde die Position von BmpA durch dessen Reaktion mit dem polyklonalen anti-BmpA-Antiserum und die von Flagellin durch die Reaktion dieses Moleküls mit Mab H9724 angezeigt.
Ein neues Borrelia-Antigen, das in vitro reichlich durch den B. garinii-Stamm IP90 und in vivo durch den B. burgdorferi sensu stricto-Stamm JD1 exprimiert wurde, wurde somit identifiziert. Dieses Antigen; P39.5, war das Ziel bei der ADCK von IP90-Spirochäten.
Beispiel 5 – Klonierung von P39.5
A. Klonierung in Bacteriophagen
Eine Bibliothek von einer willkürlichen Scherbehandlung unterzogener gesamter DNA aus B. garinii IP90 wurde im λZAPII-Bacteriophagenvektor (Stratagene, La Jolla, CA) konstruiert und einem Screening mit einem Plasmapool unterworfen, das aus mit dem JD1-Stamm von B. burgdorferi infizierten Rhesus-Affen gewonnen worden war. Die für den Pool verwendeten Plasmaproben wurden so ausgewählt, dass sie Antikörper enthielten, der nur P39.5, das mutmaßliche Flagellin und die 1 oder 2 zusätzlichen, nicht-identifizierten schwachen Banden von höherer Molekülmasse, die auf einigen IP90-Western-Blots sichtbar sind, erkannten.
Nach mehreren Screening-Runden wurden 11 Klone in das pBluescript-Phagemid (Stratagene) aufgenommen und die rekombinanten Plasmide wurden gereinigt und zur Transformation von Zellen des SURE-Stammes von E. coli verwendet. Mehrere Transformanten wurden aus jedem ursprünglichen Klon ausgewählt, die Anwesenheit des Inserts wurde bestätigt, und von jedem Klon wurde eine derartige Transformante gezüchtet, zur Expression induziert, lysiert und durch Western-Blot mit dem ursprünglichen Plasmapool analysiert. Die 11 klonierten Fragmente hybridisierten miteinander durch Dot-Blot-Hybridisierung.
Einer der 11 Klone (mit der Bezeichnung 7-1) wurde für eine Überexpression und Reinigung auf der Basis der starken Reaktivität des exprimierten Proteins mit den Plasma-Antikörpern ausgewählt. Das 7-1-Insert wies eine Länge von 950 bp auf.
Die Identität des exprimierten Proteins wurde als antigenmäßig identisch oder kreuzreaktiv mit P39.5 bestätigt, indem gezeigt wurde, dass Antikörper aus der ursprünglichen Plasmaprobe, der einer Affinitätsreinigung unter Verwendung des Klons als Immunoabsorbens unterzogen worden war, mit P39.5 an einem Western-Blot von B. garinii-Lysat reagierte. Ein Western-Blot wurde von folgenden Produkten entwickelt: Lysate aus IP90-Spirochäten, die mit Plasma aus einem mit JD1-Spirochäten infizierten Affen umgesetzt worden waren; Antikörper aus dem gleichen Plasma nach Affinitätsreinigung mit rekombinanten Antigenen gemäß Expression durch B. garinii Klon 1-1 und Klon 7-1. Die Reaktivität des IP90-Lysats mit dem Affen-Plasmapool wurde im Blot nachgewiesen. Die Reaktivität des IP90-Lysats mit dem Antikörper, der mit dem rekombinanten 1-1-Protein affinitätsgereinigt worden war, wurde gezeigt, sowie mit dem Antikörper, der mit dem rekombinanten 7-1-Protein affinitätsgereinigt worden war.
Eine partielle DNA-Sequenz für P7-1 wurde erhalten (SEQ ID NO:1). Etwa 950 bp wurden vom Klon 7-1 abgeleitet. Ferner wurden etwa 140 kb der strangaufwärtigen Regionen von Klon 14 erhalten (SEQ ID NO:13). Das DNA-Fragment, das durch die 5'-SEQ ID NO:13-Sequenz und die SEQ ID NO:1-Sequenz gebildet wurde, wies eine Länge von 1189 bp auf, wie in 2 dargestellt ist. Es umfasst einen einzigen offenen Leseraster, der für ein abgeleitetes Protein von 37,7 kDa kodiert. Sein hoher Alaningehalt führt zu dieser relativ niedrigen Molekülmasse. Da die durchschnittliche Molekülmasse der Aminosäuren dieses Proteins 95 beträgt, fehlen etwa 57 bp der vollständigen Kodierungsregion. Da keine hydrophobe Leadersequenz festgestellt wurde und das P39.5 Löslichkeitseigenschaften von Lipoproteinen aufweist (vergl. die nachstehenden Ausführungen), ergibt sich, dass P7-1 antigenmäßig kreuzreaktiv mit P39.5 ist, jedoch nicht das vollständige P39.5 selbst darstellt.
Daten, die sich von der abgeleiteten Aminosäuresequenz von P7-1 (SEQ ID NOS:14 und 2) unterscheiden, lassen darauf schließen, dass P39.5 ein Lipoprotein ist. Erstens war die native Form von P39.5, die in Gesamtzellextrakten von IP90-Spirochäten vorhanden war, vollständig extrahierbar, d. h. es wird bei einem Phasentrennungsexperiment mit Triton-X114 in die Detergenzphase ausgeschüttelt. Zweitens besteht der Großteil seiner Sequenz aus hydrophilen Domänen, höchstwahrscheinlich OspA, muss jedoch an der äußeren Oberfläche exprimiert werden, da es vom Antikörper als Ziel erreicht wird. Drittens ist seine prozentuale Identität mit mehreren Mitgliedern der Vmp-Familie von Borrelia hermsii-Lipoproteinen erheblich, z. B. 22 % mit Vmp4, 19 % mit Vmp23, 18 % mit Vmp17 und 17 % mit Vmp21. Diese Sequenzen sind bei der GENBANK-Datenbank erhältlich.
Ein interessantes Merkmal seiner Nucleotidsequenz ist die Anwesenheit von mehreren internen Wiederholungsregionen, die in 2 dargestellt sind. Die Blöcke IA und IB sind zu 70 % identisch. Der Block IIA weist eine hohe 91%ige Identität mit IIB auf und die Blöcke A, B und C zeigen eine Identität von 84 und 90 %. Das einzige interne besondere Fragment ist das mit dem schwarzen Kästchen markierte Fragment. Klarerweise neigt ein derartiges Molekül zu homologen Rekombinationen der gleichen Art, wie sie zwischen und innerhalb der OspA- und OspB-Gene auftreten, die Homologieregionen aufweisen (P. Rosa et al., a.a.O.). Jedoch können derartige potentielle Fluchtmutanten nicht der kombinierten Wirkung von Antikörper und Komplement entkommen, wie durch die Bezugnahme auf den Fall von OspA gezeigt worden ist (Sole et al., a.a.O.).
B. Expression und Reinigung von rekombinantem P7-1 mit dem QIAEXPRESS^R-System
Das Qiaexpress^R-System von Qiagen, Inc. (Chatsworth, CA) nützt die hohe Affinität von 6 aufeinanderfolgenden Histidinresten in Bezug auf zweiwertige Kationen, wie Ni, aus. Dieses Kation wird mit Nitrilotriessigsäure (NTA) konjugiert, das wiederum an Agarose gebunden ist. Da die Affinitätsmarkierung sehr klein ist (minimal 6 Reste) kann sie im Fusionsprotein ohne ernste Auswirkungen auf die antigenen Eigenschaften des Proteins verbleiben. Die 6 × His-Affinitätsmarkierung kann entweder am N- oder am C-Terminus eingebaut werden. Zahlreiche Vektoren (pQE-Vektoren) sind für die Konstruktion beider Fusionstypen verfügbar.
Rekombinanten wurden zunächst auf die Anwesenheit der erwarteten Inserts in den Plasmiden einem Screening unterworfen. Darauf folgte ein Western-Blot, um die Proteinexpression in diesen Rekombinanten zu bestätigen. Western-Blots wurden entweder mit Serum aus Kontrollmäusen, die mit Spirochäten des entsprechenden Stammes infiziert worden waren, oder mit einem Mäuse-Antikörper entwickelt, der spezifisch das MRGS (His)6-Epitop (Qiagen) nachweist, bei dem es sich um die Affinitätsmarkierungssequenz, die in einigen der pQE-Vektoren vorhanden ist (4 N-terminale Fusionen) handelt. Eine gleichermaßen empfindliche Alternative bestand in der Verwendung eines Konjugats von Ni-NTA und alkalischer Phosphatase, das ebenfalls von der Fa. Qiagen bezogen werden kann.
Die E. coli-Zellen, die ein Fusionskonstrukt enthielten, wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, mit 0,3 mM IPTG für einen Zeitraum von 3 Stunden induziert, pelletisiert, 1-mal mit Ultraschallbehandlungspuffer gewaschen (50 mM NaPO₄, pH-Wert 8,0, 300 mM NaCl) und über Nacht bei –20 °C aufbewahrt. Am nächsten Tag wurden die Zellen in Ultraschallbehandlungspuffer resuspendiert und auf Eis unter Anwendung von Impulsen von 15 Sekunden insgesamt 2 Minuten mit Ultraschall behandelt. Unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung wurde der Serin-protease-Inhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) zugesetzt, um einen Abbau durch derartige Proteasen zu verhindern. Die Zellbruchstücke wurden abzentrifugiert und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen übertragen. Zwischenzeitlich wurde das Ni-NTA-Harz 1-mal mit 10 Säulenvolumina (cv) des Ultraschallbehandlungspuffers gewaschen. Man ließ das Fusionsprotein an das Ni-NTA-Harz in einem Röhrchen 1 Stunde binden. Sodann wurde das Harz abzentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Harz wurde in 10 cv Ultraschallbehandlungspuffer resuspendiert, in eine Säule gegossen und 3-mal mit 10 cv des gleichen Puffers und anschließend 3-mal mit 10 cv Waschpuffer (50 mM NaPO₄, pH-Wert 6,3, 300 mM NaCl) gewaschen. Schließlich wurde das Fusionsprotein mit 10 cv Elutionspuffer (50 mM NaPO₄, pH-Wert 4,5, 300 mM NaCl) eluiert und Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden auf den Proteingehalt getestet. Die Fraktionen mit der höchsten Proteinkonzentration wurden vereinigt und mit dibasischem NaPO₄ auf den pH-Wert 7,0 neutralisiert. Die Proteinkonzentration in der vereinigten Probe wurde berechnet. Man ließ einen Aliquotanteil an einem SDS-PA-Gel laufen und führte zur Prüfung der Reinheit eine Färbung mit Silber durch. Typische Ausbeuten betrugen. etwa 4-5 mg/Liter Kultur.
Beispiel 6 – In vitro-Schutzpotenzial von P7-1 in Affen
Anti-P7-1-Antikörper wurde aus dem gleichen Affen-Plasmapool, der zum Screening der DNA-Bibliothek verwendet worden war, gereinigt, indem eine Adsorption und eine ELution mit Säure an Nitrocellulosestreifen durchgeführt wurde, die das rekombinante P7-1-Protein (rP7-1) gemäß Expression aus dem Klon 7-1 enthielten. Die Monospezifität des Antikörpers wurden an einem Western-Blot gemäß der Beschreibung in den Beispielen 2 und 4 bestätigt. Der Antikörper wurde gemäß Beispiel 3 beim ADCK-Test verwendet.
Die Fraktion von toten IP90-Spirochäten nach 24-stündiger Inkubation mit dem affinitätsgereinigten anti-P7-1-Antikörper betrug 55 % (3, Balken 2). Der Antikörper wurde in einer Konzentration, die einer 1:1-Verdünnung seiner Konzentration im Plasma entsprach, rekonstituiert. Die Abtötungsrate war vergleichbar mit der, die bei einer 1:10-Verdünnung des gleichen Plasmas beobachtet wurde (67 %, 3, Balken 1). Komplement war zur Herbeiführung der Abtötung wesentlich, da nur 12 % der Spirochäten in dessen Abwesenheit abgetötet wurden (3, Balken 3). Die Abtötung in Gegenwart von Affen-Komplement allein war geringfügig höher als üblich, da der Wert 25 % betrug (3, Balken 4), während der am häufigsten auftretende Wert 10-15 % betrug, obgleich mit JD1-Spirochäten (M. Aydintug et al., Infect. Immun., Bd. 62 (1994), S. 4929-4937). In BSK-H-Medium allein starben 12 % der Spirochäten (Balken 5).
Diese Ergebnisse zeigten, dass Antikörper gegen rekombinantes P7-1 (ein Fragment von P39.5)-Antigen von IP90, die in Affen im Verlauf einer natürlichen Infektion mit JD1-Spirochäten hervorgerufen worden waren, IP90-Spirochäten durch ADCK abtöten konnten.
Diese Experimente belegten das Schutzpotenzial von P7-1 und bildeten die Basis einer Auswahl dieses Antigens als Impfstoffkandidat.
Beispiel 7 – Schutzpotenzial von P7-1 in Mäusen
Dieses Beispiel zeigt, dass Mäuse direkt mit dem rekombinanten P7-1 immunisiert werden können. Die Mäuse-Antikörper, die durch Immunisierung mit rP7-1 und Ribi-Adjuvans erzeugt worden waren, waren in vitro zu einer bis zu 60%igen Abtötung von IP90-Spirochäten in der Lage, und zwar durch ein antikörperabhängiges, komplementvermitteltes Abtöten (ADCK). Zur direkteren Bestimmung des Schutzpotenzials von P7-1 wurde das DNA-Fragment von Klon 7-1 in pQE gemäß den Angaben in Beispiel 5 subkloniert, und das exprimierte Protein wurde in Milligrammmengen gereinigt und zur Immunisierung von C3H/HeJ-Mäusen verwendet. Mäuse erhielten 4 Injektionen von jeweils 30 μg des rekombinanten P7-1 in 0,2 ml Ribi R-700-Adjuvans (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT). Die R-700-Zubereitung bestand aus 0,25 mg/ml MPL^R, 0,25 mg/ml synthetischem Trehalose- Dicorynomycolat, 20 μl/ml Squalen (Hexamethyltetracosahexan) und 2 μl/ml Monooleat (Tween 80). Injektionen wurden intraperitoneal im Abstand von 3 Wochen verabreicht. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde den Mäusen Blut entnommen. Die Spezifität des erzeugten Antikörpers wurde durch Western-Blot unter Verwendung von Gesamtzellextrakten von IP90-Spirochäten als Antigen bestätigt. Serumproben wurden vereinigt.
Serum aus Mäusen, die mit dem Ribi-Adjuvans allein immunisiert worden waren, erkannten auf IP90-Blots keine Antigene. Serum von Mäusen, die mit rP7-1 und Ribi immunisiert worden waren, erkannten erwartungsgemäß die P39.5-Bande auf IP90-Lysaten, jedoch auch eine schwächere Bande, die sich geringfügig oberhalb der 41 kDa-Flagellin-Bande befand, sowie eine Bande mit höherer Molekülmasse. Interessanterweise erkannte dieser gleiche Mäuse-Antikörper eine 41 kDa-Bande an Western Blots von JD1-Lysaten und auch ein Antigen von geringfügig höherer Molekülmasse.
Dieses Ergebnis unterschied sich vom Ergebnis mit affinitätsgereinigtem anti-rP7-1-Antikörper aus Affen im vorhergehenden Beispiel und war vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Affinität des Mäuse-Antikörpers wesentlich mehr Zeit zur Reifung hatte (12 Wochen) als der Affen-Antikörper (4-5 Wochen). Infolgedessen war seine Bindungsaffinität höher, jedoch war seine Spezifität geringer und er konnte eine Kreuzreaktion mit nicht-identischen Epitopen eingehen.
Nach einer zusätzlichen Auffrischungsinjektion lieferten die Mäuse, die den anti-P7-1-Antikörper, der 60 % der IP90-Spirochäten durch ADCK in vitro abtötete, erzeugten, ein Antiserum, das 100 % derartiger Spirochäten in einem Experiment der gleichen Art abtötete. Ferner war dieses gleiche Antiserum zur Abtötung von 50 % von Spirochäten aus dem Stamm NTI befähigt (ein Stamm, der bisher noch nicht typisiert worden ist, aber vermutlich zu sensu stricto gehört, da er aus der zerebrospinalen Flüssigkeit eines Patienten im Nordosten der Vereinigten Staaten isoliert worden war). Im Gegensatz dazu konnten keine Spirochäten des JD1-Stammes entweder in vitro (durch ADCK) oder in vivo bei einem Experiment mit Zeckenbelastung an Mäusen, die mit rP7-1 und Ribi-Adjuvans immunisiert worden waren, abgetötet werden.
Der ADCK-Wert wurde sowohl mit Affen- als auch mit Meerschweinchen-Komplement bestimmt. Normales Meerschweinchenserum (von der Fa. Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde im letztgenannten Fall als Komplementquelle verwendet. Der gleiche Affen-Plasmapool von mit B. burgdorferi JD1 infizierten Tieren wurde als positive Kontrolle verwendet. In einer Verdünnung von 1:10 tötete dieser Plasmapool 57 % der IP90-Spirochäten nach 24-stündiger Inkubation ab (3, Balken 1). Mäuse-Antiserum gegen rP39.5 tötete 73,5 % der Spirochäten in einer Verdünnung von 1:10 und 60,5 % in einer Verdünnung von 1:50 ab (Balken 2 bzw. 3). Serum von Mäusen, die mit Ribi-Adjuvans allein immunisiert worden waren, tötete 21 % der Spirochäten ab (Balken 4). Meerschweinchen-Komplement war beim ADCK-Test weniger wirksam. Eine Fraktion von 37 % der Spirochäten wurde mit dem positiven Kontrollplasma in einer Verdünnung von 1:10 abgetötet (Balken 5), während das Mäuse-anti-P39.5-Antiserum in der gleichen Verdünnung 48 % der Spirochäten in Gegenwart von Meerschweinchen-Komplement abtötete (Balken 6). Eine Fraktion von 12 % der Spirochäten wurde in Gegenwart einer 1:10-Verdünnung von Serum aus Mäusen, die Ribi allein erhalten hatten, abgetötet (Balken 7). Interessanterweise wurden nur 6 % der JD1-Spirochäten abgetötet, wenn eine Inkubation mit einer 1:10-Verdünnung des Mäuse-anti-r39.5-Antiserums vorgenommen wurde, wobei die Fraktion sich nicht von der Fraktion unterschied, die nur mit dem Kontrollserum abgetötet wurde (nicht dargestellt). Somit geben die Banden, die auf dem JD1-Blot erkannt werden, vermutlich eine unechte Kreuzreaktivität wieder, jedoch nicht das JD1-P39.5.
Beispiel 8 – Diagnostische Verwendung von P7-1 bei Menschen
19 humane Serumproben wurden vom Center for Disease Control and Prevention (CDC) erhalten. 4 dieser Proben stammten von Spendern, die keine Vorgeschichte in Bezug auf die Lyme-Krankheit hatten und sich nie in einer Gegend aufgehalten hatten, in dem diese Krankheit endemisch ist. Die übrigen 15 Proben stammten von Patienten, die in Gegenden lebten, in denen die Lyme-Krankheit endemisch war, wiesen Anzeichen und/oder Symptome für diese Krankheit auf und waren (mit Ausnahme eines Patienten) gemäß dem vom CDC empfohlenem Kriterium serologisch positiv. Dieses Kriterium sieht vor, dass Patienten bei einem empfindlichen Lyme-ELISA-Test positiv sind und auch bei einem IgM- oder einem IgG-Western Blot positiv sind, so dass mindestens 2 der folgenden 3 Banden in positiven IgM-Blots (24, 39 oder 41 kDa) und 5 der folgenden 10 Banden in positiven IgG-Blots (18, 21, 28, 30, 39, 41, 45, 58, 66 und 93 kDa) vorhanden sind.
Der Test, der auf dem Nachweis von IgG-Antikörper durch Inkubation von Serumproben in einer Verdünnung von 1:200 mit Nitrocellulose-Streifen, auf die durch Elektroblotting gereinigtes P39.5-Antigen aufgetragen worden ist, und auf dem anschließenden Nachweis von gebundenem Antikörper durch die in Beispiel 2 beschriebenen immunoenzymatischen Verfahren beruht, führte zu folgenden Ergebnissen. Die 4 Serumproben von Spendern, die keine Vorgeschichte in Bezug auf die Lyme-Krankheit hatten und sich nie in einer Gegend, in der die Krankheit endemisch ist, aufgehalten, wiesen keinen nachweisbaren anti-P39.5-Antikörper auf. Von den 15 restlichen Proben waren 14 positiv. Bei der einzigen negativen Probe handelte es sich um die Probe, bei der es nicht gelang, gemäß dem vom CDC empfohlenen Kriterium, Antikörper nachzuweisen. Somit ist das hier beschriebene einfache Verfahren, das auf dem P39.5-Antigen als diagnostische Sonde für anti-B. burgdorferi-Antikörper beruht, aufgrund dieser anfänglichen Einschätzung ebenso empfindlich und spezifisch wie das kompliziertere, zweistufige Verfahren, das derzeit vom CDC empfohlen wird.
Bei einem weiteren diagnostischen Test wurde das antigene Protein, das vom 7-1-DNA-Fragment exprimiert wird, nämlich rP7-1, als Sonde für die frühe serologische Diagnose der Lyme-Krankheit in Rhesus-Affen getestet. Serumproben, die von 3 Paaren von Rhesus-Affen, die mit verschiedenen Stämmen von B. burgdorferi, nämlich B31, JD1 bzw. NTI, infiziert worden waren, erhalten wurden, enthielten nach 2-wöchiger Infektion bei Nachweis durch Western-Blot nachweisbaren Antikörper gegen gereinigtes rP7-1. Sowohl IgM- als auch IgG-Antikörper wurden gleichzeitig getestet. Das Ergebnis zeigt, dass Antikörper gegen P7-1 in einem frühen Stadium im Infektionsverlauf auftritt, unabhängig vom Stamm von B. burgdorferi, der die Antikörper-Antwort hervorruft.
Die Empfindlichkeit des Antikörpernachweises wurde erneut durch Western-Blot gemäß den vorstehenden Ausführungen mit einer Reihe von 43 humanen Serumproben, die vom CDC erhalten worden waren, bestimmt. Das Experiment wurde als Blindversuch durchgeführt. Die CDC-Proben stammten von Patienten mit einer klinischen Diagnose der Lyme-Krankheit, wobei die Diagnose die strengen CDC-Kriterien für die Falldefinition erfüllte. Von den 43 Proben von klinisch positiven Patienten wurden von der CDC 34 als positiv gemäß Beurteilung durch die Dressler-Kriterien (F. Dressler et al., J. Infect. Dis., Bd. 167 (1993), S. 392-440) unter Anwendung des Western Blot-Tests von MarDx Diagnostics, Inc. (Lyme-Krankheit-MarBlot) bezeichnet. Mit dem diagnostischen Western-Blot auf der Basis des P7-1-Antigens erwies sich eine gleiche Anzahl an Proben als positiv (34), obgleich negative oder positive Ergebnisse bei beiden Tests nicht immer zusammenfielen. Somit führte der Western-Test auf der Basis von P7-1, bei dem eine einzige Bande nachgewiesen wird (oder nicht) und der daher einfach zu interpretieren ist, zur gleichen Empfindlichkeit wie die derzeit auf dem Markt verfügbaren, perfektesten, jedoch schwierig zu interpretierenden diagnostischen Tests der Lyme-Krankheit.
Bei Tests auf antigene Spezifität waren bisher von 12 Serumproben von syphilitischen Patienten 11 bei dem Test negativ, trotz der Tatsache, dass sämtliche Proben Antikörper enthielten, die mit Mehrfachantigenen an einem Western-Blot von vollständigen B. burgdorferi-Antigenen eine Kreuzreaktion eingingen. Die einzige Serumprobe, die zu einem positiven Ergebnis führte, stammte von einem Patienten, der auch eine HIV-Infektion und mehrere AIDS-verwandte Infektionen aufwies.
Beispiel 9 – Die Kassetten-String-Proteine
Wie vorstehend ausgeführt, ist die Aminosäuresequenz, die aus der Nucleotidsequenz des 7-1-Fragments vorhergesagt wird, zu etwa 50 % identisch mit dem VlsE des B31-Stammes von B. burgdorferi, das Bestandteil eines Antigens von B. burgdorferi ist, das über einen Rekombinationsmechanismus einer antigenen Variation unterliegt, wobei ein zentrales Fragment der exprimierten Kopie (VlsE) mit Fragmenten aus einem String von 15 "Kassetten", die sich strangaufwärts von der exprimierten Kopie befinden, rekombiniert wird (J. Zhang, a.a.O.).
Es wurden mehrere DNA-Fragmente kloniert, die Bestandteil des Kassetten-Strings von B. garinii IP90 zu sein scheinen. Zusätzlich zu 7-1 weisen diese Fragmente mit den Bezeichnungen 1-1, 3-1, 6-1, 9-1 und 12-1 eine Länge zwischen 1 und 2 kb auf. Bei Expression in rekombinanter Form, im wesentlichen gemäß den vorstehenden Angaben für P7-1 (weg vom lacZ-Promotor von pBluescript) exprimiert jedes dieser Kassetten-String-Fragmente ein Peptid, das in der Größe mit der Größe des Inserts übereinstimmt und mit Antikörper von infizierten Affen reagiert. Keines der 5'-Enden dieser Fragmente enthält eine hydrophobe Leadersequenz oder eine Signal-peptidase II-Konsensussequenz des Typs, der für bakterielle Lipoproteine typisch ist. Diese Fragmente müssen daher Bestandteil des Kassetten-Strings von IP90 sein, und wie der Kassetten-String von B31 befinden sie sich im Raster. DNA-Sequenzen der 5'- und 3'-Termini (zwischen etwa 100 und 500 bp) der einzelnen Fragmente sind in SEQ ID NOS:3 bis 12 dargestellt. Es ist darauf hinzuweisen, dass in SEQ ID NO:10 nur das 5'-Ende des Fragments 9-1 dargestellt ist.
Die Antigenizität dieser Fragmente wurde auf zwei Wegen analysiert. Erstens wurde die Reaktivität der Western-Blots der Fragmente mit Serumproben, die longitudinal von Rhesus-Affen gewonnen worden waren, über einen Zeitraum von 48 Wochen nach Zecken-Inokulation mit B. burgdorferi JD1 untersucht. Durch die Fragmente 9-1 und 7-1 exprimierte Proteine reagierten vorwiegend mit Serumproben, die zwischen 2 und 24 Wochen nach der Infektion (PI) (frühe Reaktoren) gewonnen worden waren; durch die Fragmente 3-1 und 6-1 exprimierte Proteine reagierten hauptsächlich mit Serumproben, die zwischen den Wochen 24 und 48 PI gewonnen worden waren (späte Reaktoren); und Proteine aus den Fragmenten 1-1 und 12-1 zeigten eine weitgehend gleichmäßige Reaktivität über die untersuchte Zeitspanne von 48 Wochen. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass jedes der klonierten Fragmente einzigartige Epitope enthält.
Zur Bestätigung dieser Vermutung wurde ein Serumpool mit den Proben, die bei der vorstehend beschriebenen Western-Blot-Analyse verwendet worden waren, gebildet und eine Aliquotmenge dieses "Zeit"-Pools wurde mit einem Überschuss des aus 7-1 gereinigten Antigens (rP7-1) vorinkubiert. Auf diese Weise war der anti-P7-1-Antikörper im Serumpool nicht länger für die Umsetzung mit dem P7-1-Antigen auf Western-Blots verfügbar. Dennoch war dieser Serumpool noch dazu in der Lage, mit dem aus den übrigen DNA-Fragmenten (ausgenommen 12-1) exprimierten Proteinen zu reagieren. Da es sich beim letztgenannten Produkt um einen "späten" Reaktor handelt, ist es möglich, dass Antikörper gegen die mutmaßlich einzigartigen Epitope von 12-1 im Serumpool herausverdünnt worden sind. Alle vorstehenden Fragmente wurden in den pQE-Vektor für die Expression unter Anwendung herkömmlicher Methoden subkloniert, wie es vorstehend für P7-1 beschrieben wurde.
Der Erfinder hat die Theorie aufgestellt, dass der Mechanismus der antigenen Variation, der das IP90-P39.5-Antigen unterworfen wird, aufgrund seiner Homologie zu den vlsE-Antigenen von B31 einen Hinweis dafür darstellt, dass dieses Antigen von entscheidender Bedeutung für das Überleben von Spirochäten im Wirbeltierwirt ist. Somit sind die Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung so konzipiert, dass dieser Abwehrmechanismus von Spirochäten umgangen wird, indem ein Wirt mit einer großen Fraktion der Epitope immunisiert wird, die am Kassetten-String, das die tatsächliche Quelle der Variation darstellt, exprimiert werden. Dies wird durch die besondere Tatsache ermöglicht, dass der Großteil dieses Kassetten-Strings sich im Raster befindet. Daher beinhaltet, wie vorstehend ausgeführt, ein Impfverfahren die Verabreichung von mehreren oder sämtlichen der vorstehend beschriebenen klonierten und gereinigten Proteine an den Wirt, wobei sich diese Proteine von antigenmäßig verschiedenen Abschnitten des IP90-Kassetten-Strings ableiten; vergl. beispielsweise die Ergebnisse bei Einführung von P7-1 in einen Wirt unter Induktion von Antikörpern, die Spirochäten abtöteten.
Sämtliche vorstehend aufgeführten Druckschriften und das Prioritätsdokument werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht. Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung fallen unter die vorstehende Beschreibung und werden für den Fachmann als offensichtlich angesehen. Derartige Modifikationen und Abänderungen an den Zusammensetzungen und den Verfahren der vorliegenden Erfindung sollen unter den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuresequenz, die ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, die eine Bindung mit Antikörpern gegen den die Lyme-Krankheit bei einem Säuger verursachenden Erreger eingehen, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus: (a) SEQ ID NO:1 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (b) SEQ ID NO:3 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (c) SEQ ID NO:4 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (d) SEQ ID NO:5 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (e) SEQ ID NO:6 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (f) SEQ ID NO:7 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (g) SEQ ID NO:8 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (h) SEQ ID NO:9 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (i) SEQ ID NO:10 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (j) SEQ ID NO:11 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (k) SEQ ID NO:12 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; (l) SEQ ID NO:13 oder eine hierzu komplementäre Sequenz; und (m) eine Sequenz, die ein Protein kodiert, das ein Fragment von mindestens 8 Aminosäuren von SEQ ID NO:2 umfasst, wobei das Fragment an einen Antikörper bindet, der gegen das Protein von SEQ ID NO:2 erzeugt worden ist.
Protein oder ein Fragment davon, die eine Bindung mit Antikörpern gegen den die Lyme-Krankheit bei einem Säuger verursachenden Erreger eingehen, wobei das Protein oder Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus: (a) SEQ ID NO:2; (b) SEQ ID NO:14; (c) eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:13 kodiert wird; (d) eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:7 kodiert wird; (e) eine Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO:11 kodiert wird; und (f) eine Aminosäuresequenz von (a) bis (e), in der ein konservativer Aminosäureaustausch vorliegt; (g) eine Aminosäuresequenz, die ein Fragment von mindestens 8 Aminosäuren von (a) oder (b) umfasst, wobei das Fragment an einen Antikörper bindet, der gegen ein Protein von SEQ ID NO:2 erzeugt worden ist.
Protein oder Fragment nach Anspruch 2, das mit einem zweiten Protein fusioniert ist, wobei es sich beim zweiten Protein um ein Protein oder Fragment von Anspruch 2 handelt.
Protein oder Fragment nach Anspruch 2, wobei das Protein oder Fragment an Nitrocellulose, Latex-Kügelchen oder eine Mikrotiter-Vertiefung oder -Platte oder an einen Filter gekuppelt ist.
Protein oder Fragment nach Anspruch 2, wobei das Protein oder Fragment an eine nachweisbare Markierung oder ein Signalerzeugungsreagenz gekoppelt ist.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen.
Wirtszelle, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 6.
Verfahren zum rekombinanten Exprimieren des Proteins oder Fragments nach Anspruch 2 oder 3, umfassend das Züchten einer rekombinanten Wirtszelle, die mit einer Nucleinsäuresequenz transformiert ist, die das Protein oder Fragment unter Bedingungen kodiert, die die Expression des Proteins oder Peptids erlauben.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Fragments nach Anspruch 2 oder 3, umfassend die chemische Synthese des Proteins oder Fragments.
Diagnostisches Reagenz, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, eine Sequenz, die ein Protein oder ein Fragment nach Anspruch 2 kodiert oder eine Sequenz, die ein Protein oder ein Fragment nach Anspruch 2 kodiert, das mit einer Sequenz, die ein zweites Protein kodiert, fusioniert ist; und eine nachweisbare Markierung, die mit dieser Sequenz assoziiert ist.
Isolierter Antikörper, der gegen ein Protein oder Fragment nach Anspruch 2 gerichtet ist.
Antikörper nach Anspruch 11, der in vitro zur Abtötung von IP90-Spirochäten durch einen antikörperabhängigen, komplementvermittelten Abtötungsvorgang befähigt ist.
Antikörper nach Anspruch 11, bei dem es sich um einen chimären Antikörper, einen humanisierten Antikörper, einen monoklonalen Antikörper oder einen polyklonalen Antikörper handelt.
Antikörper, isoliert durch Affinitätsreinigung von Antiserum, das während einer Infektion von Rhesus-Affen mit JDI-Spirochäten unter Verwendung des Proteins oder Fragments nach Anspruch 2 als Immunoabsorptionsmittel erzeugt worden ist.
Anti-idiotyp-Antikörper, der spezifisch für den Antikörper von Anspruch 11 ist.
Diagnostisches Reagenz, umfassend den Antikörper nach Anspruch 11 und eine nachweisbare Markierung.
Verfahren zur Diagnose von Lyme-Borreliose bei einem Menschen oder Tier, umfassend die in vitro-Inkubation eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 11 bis 15 oder eines Proteins nach Anspruch 2 oder 3 mit einer Probe von biologischen Flüssigkeiten eines der Diagnose zu unterziehenden Menschen oder Tiers, wobei in Gegenwart von B. burgdorferi ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird, und die anschließende Analyse der Flüssigkeitsprobe auf die Anwesenheit dieses Komplexes.
Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, ein Protein nach Anspruch 2 bis 4, ein Antikörper nach Anspruch 11 bis 15 oder ein diagnostisches Reagenz nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Diagnose von Lyme-Borreliose bei einem Menschen oder Tier.
Kit zur Diagnose der Lyme-Krankheit bei einem Menschen oder Tier, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, ein Protein oder Fragment nach Anspruch 2 oder 3 oder einen Antikörper nach Anspruch 11.
Kit nach Anspruch 19, ferner umfassend eine nachweisbare Markierung oder ein Signalerzeugungsmittel.