DE69232956T2

DE69232956T2 - Verbesserungen der diagnose und der prophylaxe von borrelia burgdorferi

Info

Publication number: DE69232956T2
Application number: DE69232956T
Authority: DE
Inventors: George Barbour; Sven Bergstrom; Lennart Hansson
Original assignee: Symbicom AB
Current assignee: Symbicom AB
Priority date: 1991-10-22
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 2003-10-02
Anticipated expiration: 2012-10-23
Also published as: EP0650527A1; ES2194010T3; EP0650527B1; WO1993008306A1; DE69232956D1; AU2903892A; ATE234365T1; DK0650527T3; EP0540457A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf wertvolle und nützliche Entwicklungen bei der Diagnose von Borrelia burgdorferi und Impfstoffen gegen Borrelia burgdorferi (im Folgenden B. burgdorferi), die auf neuen Erkenntnissen über neue Klassen von Borrelia burgdorferi, und speziell über DNA- und Peptidsequenzen aus den B. burgdorferi-Stämmen ACA1 und Ip90 (entspricht Iper90) und ihre Beziehung zu B. burgdorferi-Stamm B31, einschließlich spezieller Sequenzen aus den drei verschiedenen Stämmen von B. burgdorferi, die als Primer in der PCR- DNA-Detektion von B. burgdorferi in Proben von Tieren, einschließlich Menschen, verwendbar sind, basieren; einen diagnostischen Kit zum Diagnostizieren der Lyme-Borreliose bei Tieren, einschließlich des Menschen; DNA-Sequenzen aus den B. burgdorferi-Stämmen ACA1 und Ip90, die für Polypeptide codieren, die mit dem Protein OspA und OspB der äußeren Membran verwandt sind; ein Polypeptid, das von ACA1 und Ip90 codiert wird, Epitope aus OspA und OspB, und einen Impfstoff gegen die Lyme-Borreliose, der ein Epitop oder mehrere Epitope von OspA und OspB umfasst.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Lyme-Borreliose ist eine Zoonose, die durch die von Zecken übertragene Spirochäte B. burgdorferi verursacht wird. Wenn ein empfindlicher Wirt von einer Ixodes-Zecke gebissen wird, treten B. burgdorferi-Organismen in die Haut ein. Beim Menschen wird die Hauterstmanifestation Erythema chronicum migrans (ECM) bezeichnet, während eine langandauernde Infektion der Haut Acrodermatitis chronica atrophicans verursacht. Die Borrelia-Organismen treten auch in das Kreislaufsystem des Wirts ein und verteilen sich auf verschiedene Organe, einschließlich des Gehirns und der Gelenke. Eine Sekundärausbreitung der Pathogene erzeugt eine Reihe klinischer Syndrome, einschließlich lymphozytischer Meningoradikulitis, Myocarditis und chronischer Arthritis. Bei vielen Patienten hält die Infektion einiger Gewebe, insbesondere des Gehirns und der Gelenke, über Jahre an und kann äußerst unangenehm sein. Diese Formen der chronischen Lyme-Borreliose sind eine Folge der Unfähigkeit des Wirts, sich selbst von dem infektiösen Mittel zu befreien, und vielleicht der Entwicklung einer Autoimmunreaktion.
Die Diagnose der Lyme-Borreliose basierte hauptsächlich auf klinischen Anzeichen. Der beste Marker während der ersten Stufe der Infektion war herkömmlicherweise das Auftreten von Erythema chronicum migrans (ECM), allerdings entwickeln sich diese Hautläsionen nicht immer oder sie zeigen sich atypisch. Darüber hinaus kann die Lyme-Borreliose durch andere Krankheiten, die durch neurologische oder arthritische Krankheitsbilder gekennzeichnet sind, undeutlich Werden. Wenn die klinischen Historien unvollständig sind, ist eine serologische Untersuchung mit Bestimmung der Antikörpertiter das beste herkömmliche Laborverfahren zur Diagnose. Indirekte fluoreszierende Antikörper(IFC)-Färbetests und Enzym-gekoppelte Immunoassays (ELISA) werden verwendet um die gesamten Immunglobuline oder Klassen spezifischer IgM- und IgG-Antikörper auf B. buradorferi nachzuweisen. ELISA wird üblicherweise bevorzugt, da diese Verfahren einfacher standardisiert und automatisiert werden, und da Extinktionswerte statistisch analysiert werden können um objektivere Resultate zu erhalten.
B. burgdorferi-Spirochäten sind helikal geformte, bewegliche Zellen mit einer äußeren Zellmembran, die einen protoplasmischen Zylinderkomplex umgibt, der aus dem Zytoplasma, der Zellwand, der inneren Zellmembran und den Flagellen besteht, welche nicht an der Zelloberfläche, sondern im periplasmatischen Raum zwischen der äußeren Zellmembran und dem protoplasmatischen Zylinder lokalisiert sind. Es wird angenommen, dass die äußere Zellmembran und die Flagellen eine wichtige Rolle bei den Wirt-Parasit-Wechselwirkungen während der Erkrankung spielen; sie wurden verschiedenen Untersuchungen unterworfen, wobei die meisten an der Oberfläche freiliegenden Proteine als bedeutende Immunogene identifiziert wurden.
Es wurde gezeigt, dass die frühsten IgM-Antikörper, die gegen Antigene von B. buradorferi, Stamm B31, der bei der American Type Culture Collection 1983 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 35210 hinterlegt wurde, gebildet werden, gegen ein Gattungs-spezifisches flagellares Polypeptid, das Flagellin genannt wird und ein Molekulargewicht von 41 kd (18) hat, und das mit dem monoclonalen Antikörper H9724 reagiert, gerichtet sind. IgG-Antikörper werden also zuerst gegen das 41 kd-Flagellin gerichtet, allerdings werden mit Fortschreiten der Krankheit IgG-Antikörper gegen andere Immunogene, speziell gegen zwei reichlich vorkommende Proteine mit Molekulargewichten von 31 kd und 34 kd, gebildet. Von diesen zwei Proteinen, die als OspA (31 kd) und OspB (34 kd) bezeichnet werden, wurde festgestellt, dass sie an der B. burgdorferi-Oberfläche lokalisiert und in seiner äußeren Fluidzellmembran eingebettet sind. Es wurde festgestellt, dass das OspA-Protein in seinem Molekulargewicht und seiner Reaktivität mit dem monoclonalen Antikörper H5332 weniger variabel ist (10), wohingegen das Molekulargewicht der OspB-Proteine aus verschiedenen B. burgdorferi-Stämmen variiert und die OspB-Proteine verschiedener Stämme auch variierende Reaktivität mit zwei monoclonalen Antikörpern gegen OspB (H6831 und H5TS) zeigen (9). Die Hauptvariation unter OspA- Proteinen wird zwischen Isolaten aus Europa und den Vereinigten Staaten gefunden.
Herkömmliche diagnostische Tests auf Lyme-Borreliose haben Ultraschallextrakte von ganzen Spirochäten als Testantigene in ELISA verwendet um Antikörper gegen B. burgdorferi nachzuweisen; allerdings liefert dieser Test während des frühen Infektionsstadiums eine unbefriedigend niedrige Diagnoseempfindlichkeit (20 bis 60%); der Grund ist möglicherweise eine langsame und spät auftretende Antikörperreaktion und der Einschluss von irrelevanten kreuzreagierenden Antigenen in den Präparaten ganzer Zellen. Außerdem kann die Verwendung von ganzen Zellen als Testantigene im Auftreten von falsch positiven Reaktion resultieren. Zum Beispiel ist es bei Patienten mit Syphilis und in Gegenden, in denen die eng verwandte Borrelia spp. mit wiederkehrendem Fieber zusammen mit B. burgdorferi auftritt, schwierig, eine serologische Unterscheidung zwischen Lyme-Borreliose und wiederkehrendem Fieber durch Zecken durchzuführen. Eine Detektion von IgG-Antikörper gegen B. buradorferi in späteren Infektionsstadien kann bei der Unterscheidung der Lyme-Borreliose von aseptischer Meningitis, Multipler Sklerose, serum-negativer rheumatoider Arthritis, juveniler rheumatoider Arthritis und Reiter-Syndrom helfen.
Es wurde festgestellt, dass das Antigen-Antikörper-Diagnoseverfahren im Zusammenhang mit Lyme-Borreliose, wie im Zusammenhang mit vielen anderen Infektionskrankheiten, nicht gut funktioniert.
Einer der Gründe dafür besteht darin, dass nur eine geringe Zahl an Spirochäten vorliegt, und dass die Antigene in der äußeren Membran der Spirochäten für das Immunsystem des infizierten Organismus schwer nachzuweisen sind.
Ein weiterer Grund ist der, dass die Antikörperreaktion gegen die B. burgdorferi- Infektion erstmals Wochen nach dem Biss der Zecke und in vielen Fällen erstmals, nachdem der Patient klinische Anzeichen der Krankheit gezeigt hat, auftritt.
Es wäre wünschenswert, ein diagnostisches Werkzeug bereitzustellen, das fähig ist, eine B. burgdorferi-Infektion in allen Stadien, auch in sehr frühen Stadien, selbst bevor die klinischen Anzeichen von Infektionen auftreten, bereitzustellen; dabei sollte das diagnostische Werkzeug unabhängig von dem verursachenden infektiösen B. burgdorferi-Stamm sein.
Ein vielversprechendes und empfindliches Verfahren zur Diagnose des Lyme- Borreliose-Agenzes besteht darin, einen einzelnen B. burgdorferi-Organismus durch PCR- Amplifikation nachzuweisen.
Nielsen, S. L. et al. Molecular and Cellular Probes (1990) 4, 73-79, Detection of Borrelia burgdorferi DNA by the polymerase chain reaction, und Malloy, D. C. et al., Journal of Clinical Microbiology, Juni 1990, S. 1089-1093, Detection of Borrelia burgdorferi Using the Polymerase Chain Reaction, beschreiben beide die Verwendung von DNA-Sequenzen nur aus dem B. burdgdorferi-Stamm B31 bei der Herstellung von Primern, die bei der PCR-DNA-Diagnose der Lyme-Borreliose nützlich sind.
WO91/06676 beschreibt die Verwendung von DNA-Primern, die mit dem SC-Plasmid verbunden sind, bei der Diagnose der Lyme-Borreliose allerdings wird die Sequenz der Primer nicht offenbart.
EP 421 725 A1 beschreibt Nukleinsäure-Sonden, die zur Identifizierung von B. burgdorferi in Proben nützlich sind. Die Proben werden aus B. burgdorferi-Stämmen in den Vereinigten Staaten und Europa genommen.
EP 445 135 beschreibt die Verwendung eines DNA-Fragments aus dem OspA-Gen des Stamms B31 in der PCR-DNA-Diagnose einer B. burgdorferi-Infektion bei Säugern, einschließlich Menschen, sowie die Verwendung von immunogenen Polypeptiden, von denen gefunden wurde, dass sie antigen sind; dies wurde mit monoclonalen Antikörpern, die gegen OspA gerichtet sind, bei der Herstellung eines Vakzins, der Säuger, einschließlich Menschen, gegen Lyme-Borreliose immunisiert, untersucht. EP 445 135 offenbart unter anderem drei ins Auge gefasste Epitope, die kleine Fragmente von B31-OspA sind: Lys-Glu-Lys-Asn-Lys-Asp, Ser-Lys-Lys-Thr-Lys-Asp und Lys-Ala-Asp-Lys-Ser-Lys. Soweit dies relevant ist, werden diese Fragmente und ihre Nützlichkeit und Verwendung als Epitope in der vorliegenden Erfindung nicht beansprucht.
Rosa, P. A. et al., Journal of Clinical Microbiology, März. 1991, S. 524-532, Polymerase Chain Reaction Analyses Identify Two Distinct Classes of Borrelia burgdorferi, offenbart PCR- Primer, die bei der Identifizierung eingesetzt werden.
Debue et al., Research in Microbiology 142, S. 565-572 (1991), offenbaren zwei Sätze an PCR-Primern, wobei einer von OspA und der andere von OspB vom B. burgdorferi-Stamm B31 abgeleitet ist. Die OspB-Primer waren fähig, die erwartete DNA in fünf der sechs untersuchten Stämme zu amplifizieren, allerdings waren die OspA-Primer nur fähig, die erwartete DNA in drei der sechs untersuchten Stämme zu amplifizieren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von nichtimmunologischen Assays durch Bereitstellung von Nukleotidsequenzen, die mit unterschiedlichen Stämmen von B. burgdorferi aus verschiedenen geographischen Regionen hybridisieren können, so dass ein diagnostisches Werkzeug zum Nachweis von B. burgdorferi-Spirochäten unabhängig von dem verursachenden infektiösen Stamm von B. burgdorferi erhalten wird. Eine andere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von neuen DNA-Fragmenten, die mit B. burgdorferi in Beziehung stehen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von antigenen Polypeptiden, einer antigenen Zusammensetzung und eines Impfstoffs zur Immunisierung von Tieren, einschließlich Menschen, gegen Lyme-Borreliose, und zwar unabhängig von dem infektiösen B. burgdorferi-Stamm, der die Krankheit verursacht.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nach einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines B. burgdorferi-Organismus in Tieren, einschließlich Menschen, bereit, wobei das Verfahren Unterwerfen einer Probe von dem Tier, z. B. eine Körperflüssigkeit, wie z. B. Blut, Serum, Liquor cerebrospinalis, Synovia, Herzbeutelflüssigkeit oder Urin, oder eine Gewebebiopsie oder, wenn das Tier ein Arthropode ist, des ganzen Tiers einer PCR-DNA-Analyse umfasst, welche umfasst:
A) Verwendung einer Nukleotid-Primersequenz, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Primersequenz mit einer Subsequenz von mindestens zwei von drei OspA- und OspB-DNA-Sequenzen, die von den B: burgdorferi-Stämmen B31, Ip90 beziehungsweise ACA1 stammen, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, und bei Abschluss der PCR-DNA-Analyse Identifizierung des nachgewiesenen B. burgdorferi- Organismus dahingehend, ob er zu einer der Klassen 1, II und III von B. burgdorferi gehört, wobei die Stämme B31, Ip90 und ACA1 Referenzstämme sind, oder
B) Verwendung einer Kombination aus mindestens zwei Nukleotid-Primersequenzen, von denen jede mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei eine Sequenz mit einer Untersequenz der OspA- und OspB-DNA aus einem ersten B. burgdorferi-Stamm, B31, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, eine andere Sequenz mit einer Untersequenz der OspA- und OspB-DNA aus einem anderen B. burgdorferi-Stamm, Ip90, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, und gegebenenfalls einer dritten Sequenz, die mit einer Untersequenz aus dem dritten B. burgdorferi-Stamm, ACA1, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, und bei Abschluss der PCR-DNA-Analyse Identifizierung des nachgewiesenen B. burgdorferi-Organismus dahingehend, ob er zu einer der Klassen I, II und III von B. burgdorferi gehört, wobei die Stämme B31, Ip90 und ACA1 Referenzstämme sind,
wobei die wesentliche Identität so ist, dass die Primersequenz unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen (Referenz Sam Brooks) oder unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung bei 67ºC in 2 · SSC und ein abschließendes Waschen bei 67ºC in 1 · SSC umfassen, oder unter mittel-hochstringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung bei 67ºC in 3 · SSC und ein abschließendes Waschen bei 67ºC in 1 · SSC umfassen, an die Untersequenz hybridisieren wird.
Es war bereits früher bekannt, dass B. burgdorferi-Stämme verschiedenen georgraphischen Ursprungs sich in den DNA-Sequenzprofilen unterscheiden, und bis jetzt wurden zwei Klassen von B. burgdorferi beschrieben (36).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die OspA- und OspB-Gene aus den zwei B. burgdorferi-Stämmen ACA1 und Ip90 sequenziert und mit der OspA- und OspB-Gensequenz aus Stamm B31, die früher sequenziert worden war (14), verglichen. Die Differenzen, die beim Vergleich der Sequenzen aus den B. burgdorferi-Stämmen B31, ACAI und Ip90 zu erkennen sind, zeigen, dass B. burgdorferi unter Verwendung von B31, Ip90 und ACA1 als Referenzstämme in drei Klassen oder Spezies I, II und III eingeteilt werden kann, anstatt B. burgdorferi nur in zwei Klassen einzuteilen.
Das Verfahren liefert ein diagnostisches Werkzeug, das zur Diagnose einer B. burodorferi-Infektion in allen Stadien verwendet werden kann, selbst bevor der Patient klinische Anzeichen der Lyme-Borreliose zeigt, da die B. burgdorferi-Spirochäten anstelle der Antikörper gegen die Spirochäten nachgewiesen werden. Das Verfahren ist auch fähig, sogar eine einzelne B. burgdorferi-Spirochäte nachzuweisen, und somit ist die Empfindlichkeit des Verfahrens sehr hoch.
Ferner ist das Verfahren einsetzbar um zu diagnostizieren, ob eine Ixodes-Zecke ein Vektor für B. burgdorferi ist; der in Gebieten mit endemischen B. burgdorferi-Infektionen besonders interessant ist.
Der B. burgdorferi-Stamm ACA1 ist ein schwedisches Isolat aus dem Zecken-Vektor I. ricinus, und der B. burgdorferi-Stamm Ip90 ist ein Isolat aus einer Region der Sowjetunion, in dem der Zecken-Vektor I. persulcatus ist. Der bekannte B. burgdorferi-Stamm B31 ist ein Isolat des Zecken-Vektors I. damminii aus Nordamerika.
Ein Vergleich zwischen der bekannten B31-Sequenz und den zwei neuen Sequenzen aus ACA1 beziehungsweise Ip90 zeigt, dass es mehrere Regionen gibt, die konservierte Sequenzen enthalten, die entweder vollständig konserviert sind oder einige Fehlpaarungen von Nukleotiden in den Regionen aufweisen, Fig. 3.
Wie oben erwähnt wurde, stammen die hier diskutierten Stämme aus verschiedenen geographischen Regionen. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Primer bereitgestellt, die B. burgdorferi aller Klassen durch das PCR-Amplifikationsverfahren nachweisen können, indem Nukleotidsequenzen aus Regionen verwendet werden, die dieselbe oder die im Wesentlichen dieselbe DNA-Sequenz in allen drei Stämmen haben; daher bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei dem die PCR-Analyse umfasst:
A) Verwendung einer Nukleotid-Primersequenz, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Primersequenz mit einer Untersequenz von mindestens zwei der drei OspA- und OspB-DNA-Sequenzen, die von den B. burgdorferi-Stämmen B31, Ip90 beziehungsweise ACA1 stammen, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, mit der Maßgabe, dass die Primersequenz sich von 5'-CTCCGGCAAATATGATTTAAGAGCA-3' und 5'-GGTTGCTGGCATCAAATGCTTCTA-3' unterscheidet, oder
B) Verwendung einer Kombination aus mindestens zwei Nukleotid-Primersequenzen, von denen jede mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei eine Sequenz mit einer Untersequenz der OspA- und OspB-DNA aus einem ersten B. burgdorferi-Stamm, B31, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, eine andere Sequenz mit einer Untersequenz der OspA- und OspB-DNA aus einem anderen B. burgdorferi-Stamm, Ip90, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, und gegebenenfalls einer dritten Sequenz, die mit einer Untersequenz des dritten B. burgdorferi-Stamms, ACA1, identisch oder im Wesentlichen identisch ist,
wobei die wesentliche Identität wie oben definiert ist.
Im vorliegenden Kontext soll der Ausdruck "wesentliche Identität" angeben, dass die Sequenzen nur eine Fehlpaarung oder wenige Fehlpaarungen aufweisen, und dass diese Fehlpaarungen die Anlagerung der fraglichen Primersequenz an ihre Zielsequenz mit ausreichender Spezifität nicht stören. Eine genauere Definition basiert auf der Hybridisierung: Eine Primersequenz, die im Wesentlichen mit einer besonderen Untersequenz im Kontext der vorliegenden Erfindung identisch ist, wird unter definierten Hybridisierungsbedingungen an die Untersequenz hybridisieren. Verschiedene Sätze herkömmlicher Hybridisierungsbedingungen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung relevant sind, werden in der Literaturstelle (52) beschrieben. Für einen Primer wird allerdings oft eher ein hoher Grad an Spezifität gefordert, und dies wird in der obigen Beschreibung der hochstringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung bei 67ºC in 2 · SSC und abschließendes Waschen bei 67ºC in 1 · SSC umfassen, oder unter mittel-hochstringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung bei 67ºC in 3 · SSC und abschließendes Waschen bei 67ºC in 1 · SSC umfassen, wiedergegeben.
Die Primer können im Prinzip kürzer als die oben genannten 11 Nukleotide sein, allerdings ist dies normalerweise aus Gründen der Spezifität nicht bevorzugt. Dagegen ist es normalerweise bevorzugt, dass die Primer etwas länger sind, z. B. mindestens 12 oder 13 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide, und in vielen Fällen etwa 18 Nukleotide oder sogar mehr, umfassen.
Die interessantesten Primer zur Verwendung in einer allgemeinen PCR-DNA-Detektion von B. burgdorferi sind natürlich Primer, die in spezifischer Weise fähig sind, DNA aus einer B. burgdorferi zu amplifizieren, und zwar ungeachtet des besonderen Stamms oder der Spezies von B. burgdorferi. Primersequenzen, die in diesem Zusammenhang von besonderem Interesse sind, sind Primer, die Sequenzen entsprechen, welche in allen drei der Spezies I, II und III, z. B. in allen drei Stämmen B31, Ip90 und ACA1 identisch oder im Wesentlichen identisch sind. Primer, die diesen Anforderungen genügen, sind z. B. Primer, die Fragmente sind, welche eine Sequenz umfassen, die mit einer der folgenden Sequenzen (oder einer ihrer komplementären Sequenzen) identisch oder im Wesentlichen identisch ist:
5'-GTATTAAGTTATATTAATAT-3' (SEQ. ID. NO.: 1, bp 123-142)
5'-AAAAGGAGAATATATTATGA-3' (SEQ. ID. NO.: 1, bp 584-607)
S'-AAAAATATTTATTGGGAATA-3' (SEQ. ID. NO.: 1, bp 776-794)
5'-GGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAA-3' (SEQ. ID. NO.: I, bp 806-817)
5'-ACTTCAACTTTAACAATTA-3' (SEQ. ID. NO.: 4, bp 85-104)
5'-AATAAGGAGAATTTATGA-3' (SEQ. ID. NO.: 4, bp 111-130)
5'-AAAAAAACTAAA-3' (SEQ. ID. NO.: 4, bp 948-963)
Wie aus Fig. 3, welche die DNA-Sequenzen (gezeigt ist ein einzelner Strang der doppelsträngigen DNA) der B. burgdgdorferi-Stämme B31, ACA1 und Ip90 zeigt, zu ersehen ist, stellen die obigen spezifischen DNA-Fragmente Regionen dar, die eine völlige oder fast völlige Identität zwischen den drei Stämmen zeigen.
Obgleich eine PCR-Analyse unter Verwendung eines einzelnen Primers durchgeführt werden kann, ist es natürlich normalerweise vorteilhaft, die exponentielle Amplifikation auszunützen, die erreicht wird, wenn ein Satz von Primern verwendet wird, die komplementäre Stränge amplifizieren, wie es in der PCR normal ist. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ein Satz an Primern verwendet, wobei der erste Primer des Satzes ein Primer ist, wie er oben definiert ist, der zweite Primer eine Sequenz umfasst, die identisch oder im Wesentlichen identisch zu einer Sequenz eines Stranges, komplementär zu OspA- oder OspB-DNA aus mindestens einem der B. burgdorferi-Stämme B31, Ip90 und ACA1, wie sie in Fig. 3 dargestellt ist, ist, wobei die Untersequenz des komplementären Strangs stromabwärts zu dem ersten Primer bezüglich der Expressionsrichtung des ersten Primers ist, und die wesentliche Identität wie oben definiert ist. Wenn ein Satz an Primern verwendet wird, ist es normalerweise bevorzugt, dass diese im Wesentlichen denselben Grad der Identität mit ihren Zielsequenzen haben. Der Abstand zwischen den Primern im Satz kann 25 bis 300 bp, z. B. 50 bis 200 bp, sein.
Obgleich sich die oben diskutierten Ausführungsformen auf die Entwicklung einer PCR- Analyse konzentrieren, die DNA aus einer B. burgdorferi-Spirochäte, ungeachtet zu welchem Stamm sie gehört, nachweisen wird, besteht ein anderer interessanter Aspekt der vorliegenden Erfindung in einer PCR-Analyse, die es möglich macht, das Vorliegen einer B. burgdorferi- Spirochäte in einer Probe mit Stammspezifität nachzuweisen, mit anderen Worten, spezifisch eine B. burgdorferi als eine der oben identifizierten drei Hauptklassen oder Spezies zu identifizieren.
Es ist von Interesse, fähig zu sein, die Klasse, und möglicherweise auch den Stamm, zu kennen, die/der für eine Infektion verantwortlich ist, da es den Anschein hat, dass verschiedene Klassen von B. burgdorferi mit verschiedenen Symptomkomplexen in Beziehung stehen. In Skandinavien, wo B. burgdorferi der Klasse III, dargestellt durch ACAI, gängig ist, sind die Symptome, die aus B. burgdorferi-Infektionen herrühren, öfter neurologische Symptome als dies in anderen Gegenden der Fall ist. Dagegen tritt Arthritis, die aus einer B. burgdorferi- Infektion herrührt, öfter in den USA auf, wo B. burgdorferi Klasse I, dargestellt durch B31, gängiger ist als anderswo.
Nach diesem Aspekt wird die Probe einer PCR-DNA-Analyse unterworfen, wobei als Primer eine DNA-Sequenz verwendet wird, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Sequenz mit der Untersequenz von OspA- und OspB-DNA aus einer der B. burgdorferi-Spezies I, II und III identisch oder im Wesentlichen identisch ist, die Sequenz sich von irgendeiner Untersequenz der zwei anderen Spezies unterscheidet, die Differenz so ist, dass die Sequenz sich nicht an DNA aus den anderen zwei Spezies anlagern wird, und wobei die wesentliche Identität wie oben definiert ist.
Auch bezüglich des Spezies- oder Stamm-spezifischen Nachweises von B. burgdorferi ist es vorteilhaft, einen Satz an Primern zu verwenden, wobei der erste Primer des Satzes ein Primer, wie er oben definiert ist, ist, der zweite Primer eine Sequenz umfasst, die zu einer Untersequenz eines Strangs, komplementär zu OspA- oder OspB-DNA aus derselben B. buradorferi-Spezies, vorzugsweise demselben Stamm wie der erste Primer, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, die Untersequenz des komplementären Strangs stromabwärts zum ersten Primer, bezogen auf die Expressionsrichtung des ersten Primers, ist, und wobei die wesentliche Identität wie oben definiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Untersequenz des ersten Primers zu einer Untersequenz von OspA oder OspB aus einem der B. burgdorferi-Stämme B31, ACA1 und Ip90, wie in Fig. 3 dargestellt, identisch oder im Wesentlichen identisch und ist der zweite Primer wie oben definiert.
Wiederum ist die Länge des Primers vorzugsweise mindestens 12, bevorzugter mindestens 13 oder 15, und oft etwa 18, wie es oben erläutert wurde.
Die Differenz in den Sequenzen, die bei diesem PCR-Typ gemäß der Erfindung entscheidend ist, kann direkt aus Fig. 3 identifiziert werden und durch einfache Experimente bestätigt werden.
Der erste Primer ist speziell eine DNA-Sequenz aus 15 bis 25 Nukleotiden, die sich von irgendeiner Untersequenz der zwei anderen Stämme in mindestens 4 Nukleotiden pro 20 Nukleotide des Primers unterscheiden. Vorzugsweise sind die Differenzen 5 Nukleotide pro 20 Nukleotide.
Wenn Unterschiede in 4 oder mehr Nukleotiden pro 20 Nukleotide eines Primers vorliegen, wird ein Minimum an Kreuzreaktion zwischen dem Primer und einem B. burgdorferi- Stamm aus einer anderen Spezies, ungeachtet der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, möglich.
Um eine genaue B. burgdorferi-Spezies oder einen genauen B. burudorferi-Stamm nachzuweisen, ohne die Spezies vorher zu kennen, ist es bevorzugt, einen Satz an Primern zu verwenden, wobei jeder Primer aus einer anderen Spezies oder einem anderen Stamm kommt und sich in mindestens 4 Nukleotiden pro 20 Nukleotide des Primers von irgendwelchen Untersequenzen der anderen Spezies und Stämme unterscheidet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden drei Sätze an Primern verwendet, wobei die Sätze umfassen:
- einen ersten Primer des ersten Satzes, der eine DNA-Sequenz aus 15 bis 25 Nukleotiden ist, die zu einer Untersequenz der DNA aus B. burgdorferi-Stamm B31, die in Fig. 3 dargestellt ist, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, die sich von einer Sequenz der DNA-Sequenz aus den zwei anderen B. burgdorferi-Stämmen, die in Fig. 3 dargestellt ist, in mindestens 4 Nukleotiden pro 20 Nukleotide des Primers, vorzugsweise in mindestens 5 Nukleotiden pro 20 Nukleotide, unterscheidet;
- einen ersten Primer des zweiten Satzes, der eine DNA-Sequenz aus 15 bis 25 Nukleotiden ist, die mit einer Untersequenz der DNA aus B. burgdorferi-Stamm ACA1, die in Fig. 3 dargestellt ist, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, die sich von einer Sequenz der DNA-Sequenz aus den zwei anderen B. burgdorferi-Stämmen, die in Fig. 3 dargestellt sind, in mindestens 4 Nukleotiden pro 20 Nukleotide des Primers, vorzugsweise in 5 Nukleotiden pro 20 Nukleotide, unterscheidet;
- einen ersten Primer des dritten Satzes, der eine DNA-Sequenz aus 15 bis 25 Nukleotiden ist, die mit einer Untersequenz der DNA aus B. burgdorferi-Stamm Ip90, die in Fig. 3 dargestellt ist, identisch oder im Wesentlichen identisch ist, die sich von einer Untersequenz der DNA-Sequenz aus den zwei anderen B. burgdorferi-Stämmen, die in Fig. 3 dargestellt sind, in mindestens 4 Nukleotiden pro 20 Nukleotide des Primers, vorzugsweise in 5 Nukleotiden pro 20 Nukleotiden, unterscheidet,
und für jeden Satz einen zweiten Primer, der eine Untersequenz der DNA-Sequenz des komplementären Strangs desselben Strangs wie der erste Primer des Satzes ist, wobei die Untersequenz des komplementären Strangs bezüglich der Expressionsrichtung des ersten Primers stromabwärts des ersten Primers ist, sich der zweite Primer vorzugsweise von irgendwelchen Untersequenzen der DNA-Sequenz der zwei anderen Stämme unterscheidet.
Wieder ist es bevorzugt, einen Satz von zwei Primern für jeden oben definierten Primer zu verwenden, wobei die zweiten Primer aus dem komplementären Strang derselben B. burgdorferi-Spezies oder demselben B, burgdorferi-Stamm stammen.
Eine Spezies-spezifische Diagnose ist von besonderem Interesse, wenn alle Stämme einer besonderen B. buradorferi-Spezies nachgewiesen werden und gleichzeitig keine anderen Stämme nachgewiesen werden, d. h., wenn sowohl Empfindlichkeit wie auch Spezifität hoch sind. Dies wird am wahrscheinlichsten der Fall sein, wenn die Primer Untersequenzen sind, die innerhalb einer Spezies gut konserviert sind, sich aber von Untersequenzen aus irgendwelchen anderen Stämmen unterscheiden. OspA-Sequenzen sind im Allgemeinen innerhalb einer Spezies besser konserviert als OspB; daher ist es bevorzugt, Primer zu verwenden, die Untersequenzen sind, die zu Untersequenzen auf den DNA-Sequenzen, die für OspA codieren, z. B. die, die in Fig. 3 dargestellt sind und für OspA codieren, identisch oder im Wesentlichen identisch sind.
Vorzugsweise werden die ersten Primer von Sätzen für einen Spezies- oder Stammspezifischen Nachweis von B. burgdorferi ausgewählt aus:
AACAATGGATCTGGAGTA (SEQ. ID. NO.: 1, bp 326-343)
AACAACGGTTCTGGAACA (SEQ. ID. NO.: 7, bp 332-349)
GTCAAGAAAAGTAAGTTCTA (SEQ. ID. NO.: 4, bp 456-475)
und
CTCTAACTGCTGAAAAAAC (SEQ. ID. NO.: 1, bp 627-645)
AAGTAGCTAATGATAAAGT (SEQ. ID. NO.: 4, bp 635-653)
CTCTAGCTGCTGACGGCAAAAC (SEQ. ID. NO.: 7, bp 633-654)
Die PCR-Analyse unter Verwendung der speziellen Primer, die hier diskutiert werden, wird nach der üblichen PCR-Technik durchgeführt, wie sie in der Literatur beschrieben ist, siehe z. B. (51). So kann der Primer für die Detektion markiert werden, z. B. mit radioaktiven Markierungen, Fluoreszenzfarbstoffen und Biotin; oder es können markierte Nukleotidtriphosphate (z. B. markiert mit Thymidin) in die PCR-Reaktion eingeschlossen werden um das PCR- Amplifikationsprodukt zu markieren.
Die PCR-Primer, die erfindungsgemäße eingesetzt werden, können nach gut bekannten Verfahren hergestellt werden. So können sie durch Oligonukleotidsynthese hergestellt werden oder sie können durch Fragmentierung einer größeren Nukleotidsequenz unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme hergestellt werden. Die Markierung der Primer kann durch per se bekannte Verfahren erfolgen.
Die PCR-Reagentien können, wie es herkömmlicherweise der Fall ist, in geeigneten PCR-Kits enthalten sein.
Obgleich die obige Diskussion die Verwendung einer einzelnen Primerart, die fähig ist, alle Stämme von B. burgdorferi in einem universellen Test nachzuweisen, betont, kann ein derartiger Test natürlich auch durch Verwendung einer Kombination verschiedener Primer, die für jeden der Stämme von B. burgdorferi, der nachzuweisen ist, einen einzelnen Primertyp für den Stamm umfasst, entwickelt werden. Zur spezifischen Detektion sollte der PCR-Kit vorzugsweise einen Satz aus zwei Primern für jede nachzuweisende Spezies enthalten, z. B. einen Kit mit drei Sätzen aus zwei Primern in geeigneten Mengen zusammen mit anderen PCR-Reagentien.
Unter Verwendung des oben beschriebenen PCR-Analyseverfahrens oder -Kits ist es möglich, die Lyme-Borreliose, wie auch eine vorklinische Borreliose, bei Säugern, einschließlich Menschen, unabhängig von dem B. burgdorferi-Stamm, der die Krankheit verursacht hat, zu diagnostizieren.
In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf wichtige neue DNA-Fragmente und ihre Verwendung.
DNA-Fragmente der Erfindung sind Fragmente, die für OspA und OspB von B. burgdorferi des schwedischen Stamms ACA1 und des sowjetischen Stamms Ip90 codieren, oder Modifikationen der Sequenz, die für ein Polypeptid codiert, das funktionell mit OspA und OspB aus ACA1 beziehungsweise Ip90 äquivalent ist.
Der Ausdruck "funktionell äquivalent" soll alle immunogen aktiven Substanzen mit der Fähigkeit, bei Tieren, einschließlich Menschen, denen das äquivalente Polypeptid verabreicht wurde, z. B. als Bestandteil eines Impfstoffs, eine Immunantwort hervorzurufen, wobei die Immunantwort der Immunantwort entspricht, die durch OspA und OspB hervorgerufen wird. Diese äquivalenten Polypeptide sind Polypeptide, die geeignet sind, Immunität gegen die Lyme- Borreliose zu verleihen.
OspA und OspB sind äußere Oberflächenproteine in B. burgdorferi, die durch DNA- Sequenzen codiert werden, die innerhalb desselben Operons gefunden werden. Die Gene, die für OspA und OspB codieren, sind in einem doppelsträngigen linearen Plasmid lokalisiert.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein DNA-Fragment, das eine Nukleotidsequenz umfasst, wie sie in Fig. 3 für ACA1 oder für Ip90 dargestellt ist, wobei eine Untersequenz davon mindestens 15 Nukleotide umfasst und unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung bei 67ºC in 2 · SSC und ein abschließendes Waschen bei 67ºC in 1 · SSC umfassen, oder unter mittelstark stringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung bei 67ºC in 3 · SSC und ein Endwaschen bei 67ºC in 1 · SSC umfassen, oder unter gering stringenten Bedingungen, wie z. B. 6 · SSC und 67ºC und anschließendes Waschen mit 4 · SSC und 67ºC, an diese Nukleotidsequenz hybridisieren, oder ein Homologes dieser Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das mit einem Polypeptid identisch oder im Wesentlichen identisch ist, das durch die Nukleotidsequenz codiert wird, und die unter hochstringenten oder mittelhochstringenten oder niedrigstringenten Hybridisierungsbedingungen, wie sie oben definiert sind, an diese Nukleotidsequenz hybridisiert.
Ein Beispiel eines Hybridisierungsverfahrens wird in Verbindung mit den Beispielen beschrieben.
In Verbindung mit dem DNA-Fragment, das Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, wird der Ausdruck "Untersequenz" verwendet um eine Nukleotidsequenz zu bezeichnen, die von der dargestellten Nukleotidsequenz durch Modifikationen, z. B. der Typen, die unten beschrieben werden, abgeleitet ist, und die eine charakteristische Nukleotidsequenz davon beibehalten hat, wobei die charakteristische Nukleotidsequenz eine Sequenz ist, die fähig ist; an die fragliche Nukleotidsequenz unter den Bedingungen, wie sie hier erläutert wurden, zu hybridisieren. Typischerweise ist die Untersequenz ein Teil des DNA-Fragments, d. h., die Untersequenz ist eine Anzahl von Nukleotiden kürzer als das DNA-Fragment.
Nach den obigen Erläuterungen kann das erfindungsgemäße DNA-Fragment eins sein, dass durch Substitution, Addition, Insertion, Deletion, Transposons oder Umlagerungen eines oder mehrerer Nukleotide in der Sequenz modifiziert worden sein, z. B. zum Zweck der Entwicklung einer Sequenz, die, wenn sie in einem geeigneten Wirtsorganismus exprimiert wird, zur Produktion eines Polypeptids führt, das eine wesentliche Ähnlichkeit mit dem OspA- oder OspB-Protein oder einem Fragment davon hat, und das die immunologische Aktivität des Proteins oder des Fragments beibehalten hat.
Das komplette Fragment, das in Fig. 3 dargestellt ist, umfasst Fragmente, die für das OspA-Protein und für das OspB-Protein codieren. Ein besonderer Aspekt der Erfindung ist ein DNA-Fragment, wie es oben definiert ist, das eine Nukleotidsequenz, beginnend am Nukleotid 37 und endend am Nukleotid 859 der in Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz, die für ein Zellmembranprotein aus B. burgdorferi, Stamm ACAl (entsprechend SEQ. ID. NO.: 4, bp 127-948) oder aus B. burgdorferi, Stamm Ip90 (entsprechend SEQ. ID. NO.: 7, bp 125-949), wobei das Protein OspA genannt wird, codiert, oder eine Untersequenz oder ein Homologes der Nukleotidsequenz umfasst, wobei die Nukleotidnummerierung in der in Fig. 3 angegebenen Weise auf der B31-Nummerierung basiert. Ein weiterer besonderer Aspekt der Erfindung ist ein DNA- Fragment, das eine Nukleotidsequenz, beginnend bei Nukleotid 865 und endend bei Nukleotid 185 der in Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz, die für ein Zellmembranprotein aus B. buradorferi, Stamm ACA1 (entsprechend SEQ. ID. NO.: 4, bp 962-1861) oder aus B. burgdorferi, Stamm Ip90 (entsprechend SEQ. ID. NO.: 7, bp 959-1843), wobei das Protein OspB genannt wird, oder eine Sequenz oder ein Homologes der Nukleotidsequenz umfasst, wobei die Nukleotidnummerierung auf der B31-Nummerierung basiert, wie sie in Fig. 3 angegeben ist.
Die Modifikationen oder die Homologen der DNA-Fragmente, die für OspA, OspB oder einen Teil davon codieren und in die oben gegebenen Definitionen fallen, können hergestellt werden, indem z. B. die nativen DNA-Fragmente einer Mutagenisierung, z. B. durch Behandlung mit ultravioletter Strahlung, ionisierender Strahlung oder mit einem chemischen Mutagen, wie z. B. Mitomycin C, 5-Bromuracil, Methylmethansulphonat, Stickstoffmustard oder einem Nitrofuran, unterworfen werden um so einige der Eigenschaften des Genproduktes, das aus der mutagenisierten Sequenz exprimiert wird, zu verändern, ohne die immunologische Aktivität des Genproduktes wesentlich zu verändern. Eine ortspezifische oder eine spezifische Mutagenese sind besonders nützlich. All diese Techniken sind in Lehrbüchern auf diesem Gebiet, z. B. in (52) und (53), beschrieben.
Die in Fig. 3 dargestellten DNA-Sequenzen werden im Beispiel 1 detaillierter diskutiert. Besonders interessante DNA-Fragmente sind Fragmente aus mindestens 15 Nukleotiden, die für immunologisch aktive Teile von OspA oder OspB codieren, d. h., die antigenen Determinanten oder Epitope von OspA, das sind insbesondere Polypeptide, die fähig sind, mit immunkompetenten Zellen in Wechselwirkung zu treten um eine Immunantwort gegen B. burgdorferi zu zeigen, wie auch lipidiertes OspA und OspB oder lipidierte antigene Determinanten oder Epitope von OspA oder OspB. Für Impfstoffzwecke hat sich die Verwendung von lipidierten Polypeptiden als sehr interessante Alternative zur Verwendung von nicht-lipidierten Polypeptiden zusammen mit Adjuvantien erwiesen.
In WO 90/04414 derselben Anmelderin wie die vorliegende Erfindung wird DNA, die für OspA und OspB codiert und auch für eine Spaltungsstelle einer Lipoprotein-Signalpeptidase codiert, offenbart. Es wurde nun durch Markierung mit 3H-Palmitinsäure bewiesen, dass natürlich auftretendes OspA und OspB Lipoproteine sind.
Es wird als vorteilhaft angesehen, Säuger mit lipidiertem OspA oder OspB oder einer immunogenen Determinante davon zu immunisieren, da auch in Fällen, wo kein Adjuvans im Impfstoff verwendet wird, eine Antikörperreaktion beobachtet wird. Wenn nicht-lipidierte Polypeptide sowohl zum Immunstimulieren, als auch zur Verstärkung verwendet werden, tritt eine sehr geringe und manchmal nicht erkennbare Antikörperreaktion auf. Wenn lipidierte Polypeptide zum Stimulieren einer Immunantwort verwendet werden, können nicht-lipidierte Polypeptide zum Boosting (zur Verstärkung) verwendet werden und sind in der Tat sehr wirksame Boosting-Antigene. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Immunstimulation" die anfängliche Immunisierung, wohingegen der Ausdruck "Boosting" die fakultativen zusätzlichen Immunisierungen bezeichnet, die in bestimmten Intervallen nach der immunstimulierenden Dosis verabreicht wurden um die Immunantwort auf das Antigen zu verlängern. Die Boosting-Dosis ist oft geringer als die immunstimulierende Dosis.
Es ist gut bekannt, dass gewisse Antigene fähig sind, in einigen Individuen eine Autoimmunantwort auszulösen, allerdings geschieht dies nicht notwendigerweise in allen Individuen, wenn ihr Immunsystem einem Antigen ausgesetzt wird. Bei der Herstellung eines Polypeptids zur Verwendung als Antigen in einem Impfstoff ist es vorteilhaft, Sequenzen zu deletieren, von denen erwartet wird oder von denen bewiesen wurde, dass sie autoimmune Epitope sind. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Fragment, ein Polypeptid, worin Epitope, die für das Hervorrufen von Autoimmunität bei Tieren, einschließlich Menschen, wenn sie dem Tier verabreicht werden, verantwortlich sind, deletiert wurden.
In den Polypeptiden OspA und OspB, die durch das erfindungsgemäße DNA-Fragment codiert werden, wurden Polypeptidfragmente, die Sequenzen umfassen, ausgewählt aus den folgenden:
LVSKEKNKDGKYDL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 41-54),
LVSKEKDKDGKYSL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 41-54),
KGTSDKNNGSGV (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 64-75),
KGTSDKTNGSGV (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 64-75),
KGTSDKNNGSGT (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 64-75),
LEGVKADKSKVKL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 76-88),
LEGTKDDKSKAKL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 76-88),
LEGEKTDKSKAKL (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 76-88),
KKVTSKDKSSTEEK (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 11-125),
RKVSSKDKTSTDEM (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 112-125),
KKVTLKDKSSTEEK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 112-125),
KKTKDLVFTKEN (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 230-241),
KKTTQLVFTKQD (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 230-241),
RKTKNLVFTKED (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 231-242),
QYDSNGTKLEGS (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 247-258),
KYDSAGTNLEGT (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 247-258),
KYDSAGTNLEGK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 248-259),
AVEITKLDEIKNALK (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 259-273),
AVEIKTLDELKNALK (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 259-273),
AVEITTLKELKDALK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 260-274),
DLNLEDSSKKSHQNAK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 31-46),
DQEIINSDNTPICDSKK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 33-48),
DQDVEDLKKDQKDDSK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 28-43),
KIFVSKEKNSSGK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 64-76),
KIFVSKEKNSAGK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 66-78),
EIFISKEKNEDDK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 61-73),
KPDKSKVKLTVSAD (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 105-118),
KADKTKVAMTIADD (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 107-120),
KADKSKVTMLVSDD (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 102-115),
KKTGKWEDSTSTL (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 234-246),
KKTATWNETTNTL (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 237-249),
KKTAVWNDTSSTL (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 232-244),
KNLSELKNALK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 286-296),
KDLAALKAALK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 289-299),
KDLEALKAALK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 284-294)
durch Computeranalyse als potentielle Epitope identifiziert. Somit werden solche Fragmente und Polypeptidfragmente, die Sequenzen umfassen, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, und bevorzugter mindestens 90%, zu einer der obigen Sequenzen homolog sind, und die fähig sind, mit immunkompetenten Zellen in Wechselwirkung zu treten um eine Immunreaktion gegen B. burgdorferi zu zeigen, wobei das Polypeptidfragment oder die Polypeptidfragmente eine kleinere Größe als natürlich vorkommendes OspA oder OspB haben, als besonders wichtige antigene/immunogene Polypeptidfragmente angesehen, die wertvoll sein werden um Immunreaktionen (beziehungsweise Immunantworten) gegen B. burgdorferi zu zeigen. Dementsprechend sind DNA-Fragmente, die für diese Polypeptidfragmente codieren, besonders interessante DNA-Fragmente gemäß der Erfindung.
Die DNA-Fragmente gemäß der Erfindung, einschließlich der in Fig. 3 dargestellten DNA-Fragmente oder einer Untersequenz dieses Fragments, können abgeleitet werden, indem B. burgdorferi auf Nukleotidsequenzen durchgemustert wird, die an eine DNA-Sonde hybridisieren, die auf der Basis der vollständigen oder partiellen Nukleotidsequenz, die in Fig. 3 dargestellt ist, hergestellt wurde. Darüber hinaus kann die DNA-Fragmentsequenz eine synthetische Sequenz sein, d. h. eine Sequenz, die nach Standardverfahren, z. B. wie sie bei Matthes et al., 1984 (29), beschrieben sind, hergestellt wird.
Das DNA-Fragment der Erfindung kann zur Herstellung von OspA, OspB oder Teilen davon, speziell immunologisch aktiven Teilen davon, verwendet werden. Zu diesem Zweck können herkömmliche DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden. So werden Techniken, die Insertieren des DNA-Fragments der Erfindung oder eines Teils oder mehrerer Teile davon in einen geeigneten Expressionsvektor, Transformieren eines Wirtsorganismus mit dem Vektor, Kultivieren des Organismus unter Bedingungen, die eine Expression der insertierten Sequenz zulassen, und Ernten des resultierenden Genprodukts, OspA oder eines Teils davon, umfassen, einsetzbar sein. Ein beliebiges dieser Verfahren kann nach Standardmethoden durchgeführt werden, z. B. die, die bei Maniatis et al., 1982 (30), beschrieben sind.
Um lipidierte Polypeptide herzustellen, ist es notwendig, ein DNA-Fragment zu verwenden, das für ein Polypeptid codiert, welches ein Lipoprotein-Signalpeptid umfasst, das durch Signalpeptidase erkannt wird.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein DNA-Fragment, das ein Lipoprotein-Signalpeptid umfasst, das durch Signalpeptidase erkannt wird, z. B. speziell Lipoprotein- Signalpeptid II (SPaseII), solche DNA-Fragmente, in denen das Lipoprotein-Signalpeptid eine Sequenz in der C-terminalen Region umfasst, welche durch Signalpeptidase II erkannt wird, z. B. die Sequenzen, die von Heijne, 1989 (63), beschrieben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein DNA-Fragment gemäß der Erfindung ein DNA-Fragment, das für ein Lipoprotein-Signalpeptid codiert, welches die folgende Sequenz L- y-x-C in der C-terminalen Region umfasst, worin y und x unabhängig sein können und jeweils eine kleine, neutrale Aminosäure, wie z. B. Isoleucin, Alanin und Glycin, bezeichnen.
Das Lipoprotein-Signalpeptid umfasst vorzugsweise mindestens 10, z. B. mindestens 13, Aminosäuren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Lipoprotein-Signalpeptid 16 bis 35 Aminosäuren, z. B. 16 bis 29 Aminosäuren.
Geeignete Expressionsvektoren für die Herstellung von OspA, OspB oder einem Teil davon, sind Vektoren, die zur Replikation in einem Wirtsorganismus fähig sind, wenn sie dort transformiert sind. Der Vektor kann entweder ein Vektor, der zur autonomen Replikation fähig ist, wie z. B. ein Plasmid, oder ein Vektor sein, der mit dem Wirtschromosom repliziert wird, wie z. B. ein Bakteriophage. Beispiele für geeignete Vektoren, die in großem Umfang verwendet wurden, sind pBR322 und verwandte Vektoren, wie auch pUC-Vektoren, und dergleichen. Beispiele für geeignete Bakteriophagen umfassen M 13 und Lambda.
Der Organismus, der den Vektor beherbergt, welcher das in Fig. 3 dargestellte DNA- Fragment oder einen Teil davon trägt, kann ein beliebiger Organismus sein, der fähig ist, das DNA-Fragment zu exprimieren. Der Organismus ist vorzugsweise ein Mikroorganismus, wie z. B. ein Bakterium. Es können gram-positive wie auch gram-negative Bakterien verwendet werden. Speziell ein gram-negatives Bakterium, wie z. B. E. coli, ist einsetzbar, allerdings können auch gram-positive Bakterien, wie B. subtilis, und andere Typen an Mikroorganismen, wie Hefen oder Pilze, oder andere Organismen, die herkömmlicherweise zur Produktion von rekombinanten DNA-Produkten verwendet werden, eingesetzt werden.
Um lipidierte Polypeptide herzustellen, sollte der Wirt, der den Vektor beherbergt, ein Wirt sein, der fähig ist, lipidierte Polypeptide zu exprimieren, z. B. E. coli.
Ein anderer Typ eines Organismus, der zur Expression von OspA, OspB oder einem Teil davon verwendet werden kann, ist ein höherer eukaryotischer Organismus oder eine Zelle, einschließlich einer Pflanzen- und Säuger-Zelle. Allerdings sind auch höhere Organismen, wie z. B. Tiere, wie z. B. Schaf, Rind, Ziege, Schweine, Pferde und Haustiere, einschließlich Katzen und Hunde, als Wirtsorganismen zur Herstellung von OspA oder einem Teil davon ins Auge zu fassen. Wenn ein höherer Organismus, z. B. ein Tier, für die Produktion von OspA oder einem Teil davon verwendet wird, können herkömmliche transgene Techniken eingesetzt werden. Diese Techniken umfassen Insertieren des in Fig. 5 dargestellten DNA-Fragments oder eines Teils oder mehrerer Teile davon in das Genom des Tiers in einer solchen Position, dass OspA oder ein Teil davon zusammen mit einem Polypeptid, das durch das Tier von Haus aus exprimiert wird, exprimiert wird, vorzugsweise mit einem Polypeptid, das leicht aus dem Tier isoliert werden kann, z. B. ein Polypeptid, das von dem Tier ausgeschieden wird, z. B. ein Milchprotein oder dergleichen. Alternativ könnte das erfindungsgemäße DNA-Fragment in das Genom des Tiers in eine Position insertiert werden, die es erlaubt, dass das Genprodukt der exprimierten DNA- Sequenz im Tierkörper zurückgehalten wird, so dass eine wesentliche stabile Immunisierung des Tiers erfolgt.
Wenn ein Mikroorganismus zur Expression des erfindungsgemäßen DNA-Fragments verwendet wird, werden die Kultivierungsbedingungen typischerweise vom eingesetzten Mikroorganismustyp abhängen, und der Fachmann wird wissen, welches Kultivierungsverfahren zu wählen ist und wie das Verfahren zu optimieren ist.
Die Produktion von OspA oder OspB oder einem Teil davon durch Rekombinationstechniken hat eine Reihe von Vorteilen: Es ist möglich, OspA oder OspB oder einen Teil davon herzustellen, indem nicht-pathogene Organismen oder andere Organismen, die die immunologischen Eigenschaften von OspA oder OspB oder einem Teil davon nicht beeinträchtigen, herzustellen, und es ist möglich, Teile von OspA oder OspB zu produzieren, die aus B. burgdorferi- Stämmen nicht isoliert werden können. Hohe Mengen an OspA oder OspB oder Teilen davon können z. B. erhalten werden, indem Vektoren mit hoher Kopienzahl zum Clonieren des erfindungsgemäßen DNA-Fragments verwendet werden oder indem ein starker Promotor eingesetzt wird um höhere Expressionslevel als den Expressionslevel, der mit den Promotoren P1 und P2, die an dem DNA-Fragment der Erfindung vorliegen, erhalten werden, zu induzieren. Durch Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken zur Herstellung von OspA oder OspB oder Teilen davon können unbegrenzte Mengen eines im Wesentlichen reinen Proteins oder Polypeptids, das nicht mit anderen Komponenten, die normalerweise in B. burgdorferi-Isolaten vorliegen, "kontaminiert" ist, erhalten werden. Somit ist es möglich, im Wesentlichen reines OspA- oder OspB-Protein zu erhalten, d. h., OspA oder OspB, das nicht mit anderen B. burgdorferi- Proteinen vermischt ist, welche eine nachteilige Wirkung haben, wenn sie in einem Impfstoff oder einem diagnostischen Mittel vorliegen, in dem OspA oder OspB ein erwünschter Bestandteil ist. Ein im Wesentlichen reines OspA- oder OspB-Protein oder ein Polypeptidteil davon hat den zusätzlichen Vorteil, dass die genaue Konzentration davon in einem gegebenen Impfstoffpräparat bekannt ist, so dass dem zu immunisierenden Individuum eine genaue Dosierung verabreicht werden kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die nicht-natürlich vorkommenden Polypeptide, die durch die DNA-Sequenzen in Fig. 3 (entsprechend SEQ. ID. NO.: 4 und 7) für ACA1 und Ip90 codiert werden. Solche Polypeptide werden im Wesentlichen frei von Peptiden, mit denen ihre natürlichen Gegenstücke zusammen auftreten würden, auftreten. Diesbezüglich sind insbesondere lipidierte Polypeptide von Interesse.
Somit bezieht sich eine Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung auf ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, wie sie für ACA1 oder Ip90 in Fig. 5 dargestellt ist (entsprechend SEQ. ID. NO.: 5, 6, 8 beziehungsweise 9), eine antigene Untersequenz der Aminosäuresequenz, die mindestens ein Epitop umfasst, das fähig ist, mit immunkompetenten Zellen in Wechselwirkung zu treten um eine Immunantwort gegen B. burgdorferi zu zeigen, umfasst, oder auf ein Polypeptid, das eine Homologie von mindestens etwa 70% mit der Aminosäuresequenz, vorzugsweise eine Homologie von mindestens 80%, und insbesondere eine Homologie von mindestens etwa 90% hat. Beispiele für solche im Wesentlichen reine Polypeptide sind die Aminosäuresequenzen OspA und OspB, wie sie für ACA1 beziehungsweise Ip90 dargestellt sind (entsprechend SEQ. ID. NO.: 5, 6, 8 beziehungsweise 9) und antigene Untersequenzen davon. Die Untersequenzen werden vorzugsweise eine Länge zwischen 5 und 100 Aminosäuren haben. Die Untersequenzen und die Homologen werden typischerweise durch Rekombinationstechniken, wie sie oben beschrieben wurden, hergestellt, wobei Modifikationen im Vergleich zu den in Fig. 5 dargestellten Sequenzen geeigneterweise nach einer der oben beschriebenen DNA-modifizierenden Techniken, z. B. Mutagenese, eingeführt werden. Kurze synthetische Polypeptidsequenzen gemäß der Erfindung können auch unter Verwendung von DNA, die durch Oligonukleotidsynthese hergestellt worden war, hergestellt werden oder sie können durch Peptidsynthese in fester oder flüssiger Phase hergestellt werden.
In der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Polypeptid" in seiner herkömmlichen Bedeutung, d. h. als Sequenz von Aminosäuren, verwendet. Die Aminosäuren der Sequenz können gegebenenfalls nach der Herstellung des Polypeptids, z. B. durch chemische, enzymatische Behandlung oder Behandlung eines anderen Typs, die die immunologische Aktivität des Polypeptids nicht in wesentlichem Ausmaß verändert oder zerstört, modifiziert worden sein. Das Polypeptid kann ein ganzes Protein oder eine Untersequenz davon sein. Speziellerweise sind interessierende Polypeptide Aminosäuresequenzen, die Epitope, d. h. antigene Eigenschaften des Polypeptids, umfassen und fähig sind, eine Immunantwort hervorzurufen. Die minimale Aminosäuresequenz ist eine, die mindestens ein relevantes Epitop des Polypeptids umfasst.
Von besonderem Interesse ist ein im Wesentlichen reines Polypeptid, das immunogene Fragmente umfasst, die fähig sind, gegen alle drei B. burgdorferi-Spezies I, II und III, eine Immunantwort zu zeigen, vorzugsweise gegen die B. burgdorferi-Stämme B31, ACA1 und Ip90.
Die Antigenität oder Immunogenität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch übliche Immunisierungsexperimente, in denen z. B. Nager, wie Mäuse oder Ratten, als immunisiertes Tier verwendet werden, oder unter Verwendung von Assays, z. B. ELISA, mit polyklonalen oder monoclonalen Antikörpern, die im Voraus gegen B. burgdorferi oder ein Immunogenes mit B. burgdorferi verwandtes Protein oder Polypeptid gebildet wurden, beurteilt werden.
Verfahren um spezifische Antikörper gegen kurze definierte Peptide zu erhalten und deren Immunogenität zu beurteilen, wurden bereits früher beschrieben. Eine üblicherweise angewandte Strategie besteht darin, das Peptid als Fusionsprotein zu exprimieren. Es gibt mehrere Vorteile, ein Fusionssystem für die Herstellung von rekombinanten Peptiden zu verwenden. Erstens, heterologe Proteine und Peptide werden oft durch Wirtsproteasen abgebaut; dies kann speziell bei kleinen Peptiden durch Verwendung eines Genfusions-Expressionssystems vermieden werden. Zweitens, allgemeine und effiziente Reinigungsschemata werden für verschiedene Fusionspartner entwickelt. Die Verwendung eines Fusionspartners als eine Affinitätshandhabe gestattet die schnelle Gewinnung des rekombinanten Peptids. Drittens, durch Verwendung unterschiedlicher Fusionspartner kann das rekombinante Produkt in verschiedenen Compartimenten der Wirtszelle lokalisiert werden oder in das Kulturmedium sekretiert werden.
Es gibt auch mehrere Verfahren, die zur chemischen oder enzymatischen Spaltung des Fusionsproteins beschrieben wurden und die effiziente Strategien liefern um das gewünschte Peptid zu erhalten. Häufig verwendete Fusionssysteme sind das Staphylokokken-Protein-A- Fusionssystem und die synthetische ZZ-Variante, die IgG-Affinität hat; diese wurden zur Erzeugung von Antikörpern gegen kurze Peptide verwendet (Löwenadler et al., 1986 [EMBO J.] 55; 1987 [Gene] 56; 1990 [Eur. J. Immunol.] 57; 1991 [FEMS] 58); das Glutathion-S- Transferase-Fusionssystem (Smith und Johnson, 1988 [Gene] 60); das β-Galactosidase- Fusionssystem (Gray et al., 1982, 54); das trpE-Fusionssystem (Yansura: 1990 [Methods Enzym. Band 185] 61). Verschiedene dieser Systeme sind im Handel als Kits, die Vektoren, Reinigungskomponenten und detaillierte Instruktionen enthalten, verfügbar. Kurz ausgedrückt, das Verfahren zum Erhalt kurzer definierter Epitope beinhaltet die Synthese des entsprechenden Oligodesoxynukleotids mit entsprechenden Termini um die Einführung im Translationsraster mit dem Fusionspartner in den gewünschten Expressionsvektor zu erleichtern.
Ein im Wesentliches reines Polypeptid, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, in dem Epitope, die für das Hervorrufen einer Autoimmunität bei Tieren, einschließlich Menschen, verantwortlich sind, wenn sie dem Tier verabreicht werden, deletiert wurden, ist ein für Impfstoffzwecke sehr interessantes Polypeptid.
Ein besonderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft synthetische Polypeptidfragmente mindestens einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus:
LVSKEKNKDGKYDL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 41-54),
LVSKEKDKDGKYSL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 41-54),
KGTSDKNNGSGV (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 64-75),
KGTSDKTNGSGV (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 64-75),
KGTSDKNNGSGT (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 64-75),
LEGVKADKSKVKL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 76-88),.
LEGTKDDKSKAKL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 76-88),
LEGEKTDKSKAKL (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 76-88),
KKVTSKDKSSTEEK (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 11-125),
RKVSSKDKTSTDEM (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 112-125),
KKVTLKDKSSTEEK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 112-125),
KKTKDLVFTKEN (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 230-241),
KKTTQLVFTKQD (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 230-241),
RKTKNLVFTKED (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 231-242),
QYDSNGTKLEGS (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 247-258),
KYDSAGTNLEGT (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 247-258),
KYDSAGTNLEGK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 248-259),
AVEITKLDEIKNALK (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 259-273),
AVEIKTLDELKNALK (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 259-273),
AVEITTLKELKDALK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 260-274),
DLNLEDSSKKSHQNAK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 31-46),
DQEIINSDNTPKDSKK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 33-48),
DQDVEDLKKDQKDDSK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 28-43),
KIFVSKEKNSSGK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 64-76),
KIFVSKEKNSAGK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 66-78),
EIFISKEKNEDDK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 61-73),
KPDKSKVKLTVSAD (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 105-118),
KADKTKVAMTIADD (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 107-120),
KADKSKVTMLVSDD (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 102-115),
KKTGKWEDSTSTL (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 234-246),
KKTATWNETTNTL (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 237-249),
KKTAVWNDTSSTL (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 232-244),
KNLSELKNALK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 286-296),
KDLAALKAALK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 289-299) und
KDLEALKAALK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 284-294)
und Polypeptidfragmente, die Sequenzen umfassen, die zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, und insbesondere mindestens 90%, zu einer der obigen Sequenzen homolog sind, und die fähig sind; mit immunkompetenten Zellen in Wechselwirkung zu treten um eine Immunreaktion gegen B. burgdorferi hervorzurufen, wobei das Polypeptidfragment oder die Polypeptidfragmente eine kleinere Größe als natürlich auftretendes OspA oder OspB haben. Wie oben beschrieben, hat eine Computeranalyse angezeigt, dass diese Sequenzen als Epitope von besonderem Wert sind. Die obigen Sequenzen umfassen Sequenzen, die aus den Proteinen OspA und OspB von B31 zusätzlich zu den Proteinen aus ACA und Ip90 stammen, wobei die erste in jeder Gruppe aus zwei oder drei Sequenzen von B31 stammt, die zweite aus ACA1 stammt und die dritte aus Ip90 stammt (im Fall der ersten Gruppe gibt es keine vollständige Identität zwischen der Sequenz (der zweiten Sequenz der Gruppe), die von ACA1 stammt, und der entsprechenden Sequenz, die von Ip90 stammt).
Die Abkürzungen für die Aminosäuren, die hier verwendet werden, sollten wie folgt interpretiert werden:
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine antigene Zusammensetzung, die als antigene Komponente ein Polypeptid, das durch das DNA-Fragment codiert wird, wie es oben definiert ist, oder ein Polypeptid, wie es oben definiert ist, umfasst.
Die antigene Zusammensetzung kann eine Kombination von Polypeptiden, die von mindestens einem der OspA-Gene aus B31, ACA1 und Ip90 codiert werden, und/oder eine Kombination von Polypeptiden, die durch mindestens zwei der OspB-Gene aus B31, ACA1 und Ip90 codiert werden, z. B. eine Kombination von Polypeptiden, die durch alle drei der OspA-Gene aus den drei genannten Stämmen codiert werden, gegebenenfalls kombiniert mit Polypeptiden, die durch ein, zwei oder drei der OspB-Gene aus den drei in Frage kommenden Stämmen codiert werden, umfassen. Eine derartige Zusammensetzung kann nützlich sein um eine Immunantwort gegen B. burgdorferi hervorzurufen, und zwar ungeachtet des Stamms der B. burgdorferi-Spirochäte.
Ein Beispiel für eine solche Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, die eine Kombination von Polypeptiden enthält, welche mindestens ein Polypeptidfragment, ausgewählt aus
LVSKEKNKDGKYDL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 41-54),
KGTSDKNNGSGV (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 64-75),
LEGVKADKSKVKL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 76-88),
KKVTSKDKSSTEEK (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 11-125),
KKTKDLVFTKEN(SEQ. ID. NO.: 2, Reste 230-241),
QYDSNGTKLEGS (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 247-258),
AVEITKLDEIKNALK (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 259-273),
DLNLEDSSKKSHQNAK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 31-46),
KIFVSKEKNSSGK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 64-76),
KPDKSKVKLTVSAD (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 105-118),
KKTGKWEDSTSTL (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 234-246),
KNLSELKNALK (SEQ. ID. NO.: 3, Reste 286-296),
mindestens ein Polypeptidfragment, ausgewählt aus
LVSKEKDKDGKYSL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 41-54),
KGTSDKTNGSGV (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 64-75),
LEGTKDDKSKAKL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 76-88),
RKVSSKDKTSTDEM (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 112-125),
KKTTQLVFTKQD (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 230-241),
KYDSAGTNLEGT (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 247-258),
AVEIKTLDELKNALK (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 259-273),
DQEIINSDNTPKDSKK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 33-48),
KIFVSKEKNSAGK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 66-78),
KADKTKVAMTIADD (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 107-120),
KKTATWNETTNTL (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 237-249),
KDLAALKAALK (SEQ. ID. NO.: 6, Reste 289-299),
und mindestens ein Polypeptidfragment, ausgewählt aus
KGTSDKNNGSGT (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 64-75),
LEGEKTDKSKAKL (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 76-88),
KKVTLKDKSSTEEK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 112-125),
RKTKNLVFTKED (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 231-242),
KYDSAGTNLEGK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 248-259),
AVEITTLKELKDALK (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 260-274),
DQDVEDLKKDQKDDSK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 28-43),
EIFISKEKNEDDK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 61-73),
KADKSKVTMLVSDD (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 102-115),
KKTAVWNDTSSTL (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 232-244),
KDLEALKAALK (SEQ. ID. NO.: 9, Reste 284-294)
oder Polypeptidfragmente, welche Sequenzen umfassen, die zumindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, und insbesondere mindestens 90%, mit einer der obigen Sequenzen homolog sind, umfasst, wobei die Kombination fähig ist, mit immunkompetenten Zellen in Wechselwirkung zu treten um eine Immunantwort gegen B. burgdorferi eines der Stämme B31, ACAI und Ip90 hervorzurufen, wobei das Polypeptidfragment oder die Polypeptidfragmente eine kleinere Größe als natürlich auftretendes OspA oder OspB hat/haben, und wobei die Größe hier und in dem oben diskutierten Kontext typischerweise nur den Aminosäuresequenzen der Größen entspricht, wie sie dargestellt ist, oder in der Größenordnung dieser Größen liegt.
Während die Strategie der oben beschriebenen Zusammensetzung ein Epitop bereitstellen soll, das für jeden der Stämme von B. burgdorferi charakteristisch ist, wird durch die vorliegende Erfindung eine andere wichtige Strategie möglich, nämlich eine antigene Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptidfragment, ausgewählt aus
LVSKEKNKDGKYDL (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 41-54),
LVSKEKDKDGKYSL (SEQ. ID. NO.: 5, Reste 41-54),
KGTSDKNNGSGV (SEQ. ID. NO.: 2, Reste 64-75),
KGTSDKTNGSGV (SEQ. ID. NO.: S. Reste 64-75) und
KGTSDKNNGSGT. (SEQ. ID. NO.: 8, Reste 64-75),
oder Polypeptidfragmente, die Sequenzen umfassen, welche zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, und insbesondere mindestens 90%, zu einer der obigen Sequenzen homolog sind, und die zur Wechselwirkung mit immunkompetenten Zellen fähig sind um eine Immuneaktion gegen B. burgdorferi eines der Stämme B31, ACA1 und Ip90 hervorzurufen, wobei das Polypeptidfragment oder die Polypeptidfragmente eine kleinere Größe als natürlich auftretendes OspA oder OspB haben, vie sie oben diskutiert wurden.
Wie aus Fig. 5 hervorgeht, gibt es einen sehr hohen Grad der Identität/Homologie zwischen den oben dargestellten Sequenzen in den drei Stämmen; es können auch leicht andere Regionen identifiziert werden, in denen es einen hohen Grad an Homologie gibt; z. B. Regionen, in denen es einen hohen Grad an Homologie, z. B. eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, und insbesondere mindestens 90%, gibt, und wobei die homologen Peptide gleichzeitig immunogen sind, was z. B. wie oben beurteilt werden kann; diese sind Kandidaten zur Bereitstellung einzelner Polypeptide, die fähig sind, eine Stamm-unabhängige Immunreaktion gegen B. burgdorferi zu zeigen.
Die Fähigkeit, eine Immunantwort gegen OspA oder OspB, und möglicherweise auch gegen immunogene Determinanten davon, hervorzurufen, ist, wie es oben beschrieben wurde, bekanntermaßen größer, wenn das Polypeptid lipidiert ist. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, dass die Polypeptide in einer antigenen Zusammensetzung für immunisierende Zwecke lipidierte Polypeptide umfassen, insbesondere wenn die Zusammensetzung zum Auslösen einer Immunantwort verwendet werden soll. In Fällen, bei denen die antigene Zusammensetzung zur Verstärkung einer vorher ausgelösten Immunantwort verwendet werden soll, können auch nicht-lipidierte Polypeptide eingesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff zur Immunisierung von Säugern, einschließlich Menschen, gegen Lyme-Borreliose, wobei, der Impfstoff eine antigene Zusammensetzung, wie sie oben diskutiert wurde, und gegebenenfalls einen immunologisch annehmbaren Träger oder ein immunologisch annehmbares Vehikel umfasst.
Der Träger oder das Vehikel können aus makromolekularen Träger, wie z. B. einem Polymer, z. B. einem Polysaccharid oder einem Polypeptid, ausgewählt werden. Zusätzlich zu dem Träger oder Vehikel kann der Impfstoff ein Adjuvans, z. B. Freunds vollständiges oder unvollständiges Adjuvans, Aluminiumhydroxid, ein Saponin, ein Muramyldipeptid, einen Iscom und ein Öl, z. B. ein pflanzliches Öl, wie Erdnussöl, oder ein Mineralöl, wie Siliconöl, enthalten. Im Impfstoff kann die immunogene Komponente/können die immunogenen Komponenten an einen Träger, insbesondere an einen makromolekularen Träger; gekoppelt sein. Der Träger ist üblicherweise ein Polymer, an den die immunogene Komponente(n) durch hydrophobe, nicht-covalente Wechselwirkung gebunden ist/sind, z. B. ein Kunststoff, wie Polystyrol; oder der Träger ist ein Polymer, an das die immunogene Komponente(n) covalent gebunden ist/sind, z. B. ein Polysaccharid oder ein Polypeptid, wie Rinderserumalbumin, Ovalbumin oder Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin. Der Träger sollte vorzugsweise nicht-toxisch und nichtallergen sein. Die immunogene Komponente (die immunogenen Komponenten) können multivalent an den makromolekularen Träger gekoppelt sein, da dies eine verstärkte Immunogenität des Impfstoffpräparats liefert. Es wird auch davon ausgegangen, dass die immunogene Komponente/die immunogenen Komponenten in mehrwertiger Form präsentiert werden kann/können, indem die immunogene Komponente/die immunogenen Komponenten mit sich selbst polymerisiert wird/werden.
In dieser Hinsicht kann es vorteilhaft sein, die immunogene Komponente zusammen mit einem oder mehreren immunologisch aktiven Molekülen, die aus anderen Organismen als B. burgdorferi erhalten wurden, zu koppeln um so einen Impfstoff zu erhalten, der eine Vielzahl von verschiedenen immunogenen Determinanten umfasst und ein Impfstoff-Cocktail ist, der zur Immunisierung gegen Krankheiten verwendet werden kann, welche durch andere Organismen verursacht werden, z. B. durch Organismen, die für wiederkehrendes Fieber oder Syphilis verantwortlich sind.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Gemisch aus zwei oder mehreren einzelnen Impfstoffen verwendet werden.
Es ist bekannt, dass Antikörper, die gegen B. burgdorferi oder Teile davon, die eine Immunantwort hervorrufen, gebildet werden, im Serum von Tieren und Menschen eine eher kurze Lebensdauer besitzen. So besteht eine geeignete Strategie zur Immunisierung von Tieren und Menschen gegen die Lyme-Borreliose darin, periodisch den oben beschriebenen Impfstoff an Individuen zu verabreichen, die einem Kontakt mit Zecken, die B. burgdorferi tragen, in Kontakt kommen, d. h. in regelmäßigen Intervallen die Impfung zu verstärken. Es wird davon ausgegangen, dass eine Impfung einmal im Jahr, z. B. im Frühling, einen geeigneten Schutz von Individuen gegen das Risiko einer B. burgdorferi-Infektion liefern wird. Eine geeignete Dosis der immunogenen Komponenten für eine solche Impfung ist 5 bis 500 ug. Allerdings können auch unregelmäßigere Immunisierungen vorteilhaft sein, und erfindungsgemäß kann ein beliebiger Immunisierungsweg, von dem angenommen wird oder gezeigt wurde, dass er eine geeignete Immunantwort erzeugt, angewendet werden. Geeignete Verabreichungsformen für den Impfstoff der Erfindung sind orale Verabreichungsformen, z. B. Tabletten, Granulat oder Kapseln, subcutane, intracutane oder intramuskuläre Verabreichungsformen, oder Formen, die für eine nasale oder rektale Verabreichung geeignet sind.
Obgleich die oben diskutierten Impfstoffe und Zusammensetzungen eine humorale Immunantwort zeigen werden, ist es zusätzlich möglich, eine zelluläre Antwort hervorzurufen, indem zusammen mit dem Polypeptid, dem Träger und dem fakultativen Adjuvans ein Peptid, das ein T-Zellenepitop exprimiert, eingearbeitet wird. Wenn es gewünscht wird, kann ein solches T-Zellenepitop-Peptid durch Peptidbindungen an das oben diskutierte Polypeptid gebunden werden und kann durch dasselbe DNA-Fragment codiert werden, das für das oben diskutierte Peptid codiert, wobei das DNA-Fragment mit einer Nukleotidsequenz ergänzt ist, die für das T-Zellenepitop-Peptid codiert.
Ein interessantes Verfahren zum Selektieren oder Entwickeln von Epitopen, die Immunantworten auf B. burgdorferi zeigen, besteht in der Verwendung eines Selektionsdrucks, der durch Inkubation mit monoclonalen Antikörpern angewendet wird, und Untersuchen der Sequenzen der Proteine OspA und OspB der überlebenden Varianten von B. burgdorferi. Dieses Verfahren wird in Beispiel 6 erläutert. Epitope, die nach diesem Verfahren nachgewiesen werden, werden als im Rahmen der vorliegenden Erfindung angesehen.
Wie oben erläutert wurde, sind DNA-Rekombinationstechniken für die Herstellung von diagnostischen Reagentien und Impfstoffen nützlich. Routineverfahren zur Impfstoffproduktion beinhalten die Risiken, dass unerwünschte Nebenwirkungen erzielt werden, z. B. weil der Impfstoff unerwünschte (oder sogar nicht identifizierte) Kontaminanten enthält. Ein alternatives Vorgehen bei der Produktion von neuen Impfstoffen involviert die Insertion einer oder mehrerer DNA-Sequenzen, die einen Teil oder mehrere Teile der in Fig. 5 gezeigten DNA-Sequenz bilden, oder Teile davon in ein Virusgenom, z. B. in ein Retrovirus-, Vacciniavirus- oder Epstein- Barr-Virus-Genom um einen polyvalenten Impfstoff zu produzieren. Für die erfindungsgemäßen Zwecke ist Vaccinia ein besonders interessantes Virus. Auch synthetische Polypeptide, die durch herkömmliche Verfahren hergestellt wurden, z. B. durch Peptidsynthese in fester oder flüssiger Phase, sind für Impfstoffe geeignet.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen nicht-pathogenen Mikroorganismus, der eine insertierte Nukleotidsequenz trägt und fähig ist, diese zu exprimieren, wobei diese die Nukleotidsequenz, die in Fig. 5 gezeigt ist, oder ein Teil davon ist, zur Verwendung in einem Lebendimpfstoff für die Immunisierung eines Tiers gegen Lyme- Borreliose. Beispielsweise könnte die Verwendung eines Lebendimpfstoffs vorteilhaft sein, da angenommen wird, dass Vakzine auf der Basis von lebenden Organismen eine ausgezeichnete Immunigenität zeigen; außerdem wird davon ausgegangen, dass die Verwendung eines Lebendimpfstoffs eine langandauernde Immunität gegen Lyme-Borreliose verleihen wird, so dass keine wiederholte Impfung notwendig sein wird.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des Lebendimpfstoffs der Erfindung wird das DNA-Fragment der Erfindung an der äußeren Oberfläche des Wirtsmikroorganismus exprimiert. Dies liefert eine günstige Präsentation des immunologisch aktiven Teils (der immunologisch aktiven Teile) von OspA, der (die) von den Immunabwehrmechanismen des Tiers, dem der Lebendimpfstoff verabreicht wird, erkannt wird (werden); auf diese Weise wird eine geeignete Immunreaktion hervorgerufen. Ein Weg zur Bereitstellung der Expression von OspA oder einem immunologisch aktiven Teil davon (immunologisch aktiven Teilen davon) (den Epitopen) an der Zelloberfläche besteht darin, das DNA-Fragment der Erfindung an eine andere Nukleotidsequenz, die für ein Oberflächenprotein oder eine Untersequenz davon (z. B. ein Signalpeptid) codiert, zu fusionieren, was bewirkt, dass die B. burgdorferi-Epitope an der äußeren Oberfläche der Wirtszelle, gegebenenfalls als fusioniertes Polypeptid, exprimiert werden. Beispiele für nützliche Oberflächenproteine sind Adhesine, Fimbrienproteine oder andere extrazelluläre Proteine.
Der Mikroorganismus, der für Lebendimpfstoffe eingesetzt wird, sollte ein nichtpathogener Mikroorganismus sein, z. B. ein nicht-pathogenes E. coli, der fähig ist, sich selbst im Tierkörper zu entwickeln. Ein Mikroorganismus, der sich als Lebendimpfstoff besonders nützlich erweisen kann, kann B. burgdorferi selbst sein, der, wie es oben erläutert wurde, von sich aus OspA an der Oberfläche der Zelle exprimiert. Die Verwendung von B. burgdorferi für einen Lebendimpfstoff erfordert allerdings, dass B. burgdorferi so verändert wurde, dass er keine Krankheit hervorruft, wenn er als Lebenimpfstoff eingesetzt wird. Diese Veränderung oder Modifikation kann in beliebiger Weise durchgeführt werden, z. B. durch Mutagenisierung, chemische, enzymatische Behandlung oder Wärmebehandlung, oder durch eine andere äquivalente Behandlung, die zu einer geschwächten B. burgdorferi-Zelle führt.
Um die Produktion von lipidiertem Protein der äußeren Oberfläche von rekombinanter B. burgdorferi, OspA, in E. coli zu erhöhen, wurde ein speziell konzipiertes Expressionssystem entwickelt.
Die Resultate, die durch Verwendung des ursprünglichen OspA-Signalpeptids in verschiedenen E. coli-Expressionsvektoren erhalten wurden, haben gezeigt, dass die Signalpeptid- Spaltungsstelle erkannt wird. Darüber hinaus werden die bearbeiteten OspA-Moleküle auch lipidiert, was durch ³H-Palmitinsäure-Markierung und Proteincharakterisierung bewiesen wurde. Allerdings ist der Prdouktionslevel relativ niedrig.
Um die Produktivität zu verbessern und die Signalpeptidspaltung und -lipidierung zu erleichtern, wird die Sequenz, die für das OspA-Protein voller Länge codiert, mit dem aminoterminalen Cysteinrest einer von E. coli stammenden Signalsequenz kombiniert. Da es bekannt ist, dass die Signalpeptidase II bestimmte Signalpeptide erkennt und auch für die Lipidierung von Präproteinen, die eine solche Sequenz beherbergen, verantwortlich ist, ist es vernünftig, anzunehmen, dass die Verwendung einer homologen Sequenz vorteilhaft ist. Das resultierende rekombinante offene Leseraster wird dann unter der Kontrolle eines starken Promotors insertiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie es oben definiert ist, umfassend:
- Insertieren eines DNA-Fragments, wie es oben definiert ist, in einen Vektor, der zur Replikation in einer spezifischen Wirtszelle fähig ist;
- Einführen des resultierenden rekombinanten Vektors in die spezifische Wirtszelle;
- Wachsenlassen der Wirtszelle unter geeigneten Kulturbedingungen zur Expression des Polypeptids und
Isolieren des Polypeptids
gegebenenfalls mit anschließender Reinigung.
Vorzugsweise ist die Wirtszelle fähig, lipidierte Polypeptide zu exprimieren, wie dies der Fall ist, wenn die Wirtszelle E. coli ist:

DNA-Hybridisierung

DNA, z. B. auf Nitrocellulosefiltern vorhanden, wird in 2 · SSC [1 · SSC: 0,15 M NaCl, 0,0015 M Na3-Citrat, pH 7,0] angefeuchtet und in einen heiß-versiegelten Plastikbeutel mit vorerwärmter Vorhybridisierungslösung mit 67ºC gegeben. Eine Vorhybridisierung erfolgt 2 h bei 67ºC, wobei der Beutel leicht geschüttelt wird. Die Lösung wird durch vorerwärmte (67ºC) Hybridisierungslösung ersetzt, die radioaktive Sonde wird zugesetzt, und die Hybridisierung wird über 18 h bei 67ºC durchgeführt. Der Beutel wird leicht geschüttelt um eine konstante Bewegung der Flüssigkeit über die Nitrocellulosefilter sicherzustellen. Nach der Hybridisierung wird ein Waschvorgang durchgeführt.
Die radioaktive Sonde wird durch Verwendung bekannter Verfahren, z. B. wie sie durch Sambrook et al. beschrieben werden, auf der Basis der in der Sequenzliste 1 dargestellten DNA- Sequenz oder eines Teils davon, speziell eines codierenden Teils, z. B. der Nukleotide, die den Aminosäuren 1-210 entsprechen, oder einer wirksamen Untersequenz der oben definierten DNA-Sequenz, hergestellt.
Die Vorhybridisierungs- und Hybridisierungs-Lösungen, die verwendet wurden, sind: 10 · Denhardt, 4 · SSC, 0,1% SDS, 10 ug/ml polyA, 50 ug/ml denaturierte DNA, die analysiert werden soll, und die denaturierte (durch Wärme) radioaktive Sonde. Die Filter werden in vorerwärmten (67ºC) Lösungen gewaschen: 10 · Denhardt, 2 · SSC, 0,1% SDS für 2 · 15 min. und 1 · SSC, 0,1% SDS für 4 · 15 min. Die Filter werden luftgetrocknet und mit Vita-Wrap überdeckt, dann wird ein Röntgenfilm für 3 h bis 3 Wochen mit und ohne intensivierende Schirme den Filtern ausgesetzt.

BEISPIEL 1

Isolierung und Sequenzanalyse der OspA- und OspB-Gene

Bakterienstämme

Die verwendeten Borrelia burgdorferi-Stämme waren der amerikanische Referenzstamm B31 (ATCC 35210), das schwedische Isolat ACAI, isoliert von einem Patienten mit Acrodermatitis chronicum migrans (1), und der Ip90-Stamm, der aus I. persulcatus aus der Sowjetunion isoliert wurde und freundlicherweise von E. I. Korenberg und V. N. Kryuchechnikov vorn Gamaleya-Institut, Moskau (27), zur Verfügung gestellt wurde.

Medien und Kulturbedingungen

Die B. burgdorferi-Stämme wurden in BSK II-Medium, wie es früher beschrieben wurde (2), kultiviert.
Die Escherichia coli-Stämme DHSct (BRL, Gaithersburg, Md., USA) und Y1090 (24) wurden für die Vermehrung von rekombinanten Plasmiden beziehungsweise zum Wachstum der λgt11-Phagen-Genbibliothek eingesetzt.

Konstruktion und Durchmusterung der λgt11- und pUC18-Plasmid-B. burgdorferi- Genbibliotheken

B. burgdorferi-Stämme wurden in 400 ml modifiziertem BSKII-Medium (2) bei 34ºC modifiziert und in der späten mittleren 10 g-Phase geerntet. Die DNA wurde extrahiert und gereinigt, wie es früher beschrieben wurde (23). Die ACAI-DNA wurde teilweise durch Sau3AI abgebaut und Fragmente mit 4-8 kb in der Größe wurden aus einem 0,7% Agarosegel isoliert. Die Fragmente wurden dann in BamHI-geschnittene λ-gtll-Arme ligiert und in Phagenköpfe gepackt, wie es vom Lieferanten beschrieben wurde (SDS-Promega, Falkenberg, Schweden). Die λ-Phagen wurden in E. coli Y 1090 vermehrt, und dann wurde eine Durchmusterung durch DNA-Hybridisierung der λ-Bibliothek nach Standardmethoden (24) durchgeführt. Die zur Durchmusterung verwendeten Oligonukleotide, J1, J2 und J3, wurden aus der früher veröffentlichten B. burgdorferi-B31-Osp-Operon-Nukleotidsequenz (14) synthetisiert. Alle Nukleotide, die zur Durchmusterung der Phagen- und Plasmid-Bibliotheken verwendet wurden, und die Primer zur Nukleotidsequenzierung sind in Tabelle 1 angegeben. Die Oligonukleotide wurden am Ende mit 32P-γ-dATP markiert, wie es früher beschrieben wurde (31), und wurden an einer Sephadex-G-50 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Spinsäule gereinigt. Die Hybridisierung wurde bei 37ºC, d. h. mit mittlerer Stringens, durchgeführt, da einige Unterschiede in der Nukleotidsequenz zwischen den verschiedenen Stämmen erwartet werden konnten. Die Phagen-DNA wurde extrahiert, wie es vorher beschrieben wurde (28). Gereinigte λ-DNA wurde außerdem in die EcoRI-Stelle von pUC 18 nach Standardverfahren (30) subcloniert.
Eine Plasmid-Genbibliothek der B. burgdorferi-Ip90-DNA wurde durch partiellen HindIII-Abbau der gesamten DNA aufgebaut, wobei 1 E Enzym mit 100 ng DNA bei 37ºC für 15 min. inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch eine Phenol : Chloroform(1 : 1)-Extraktion beendet. Nach der Ethanol-Präzipitation wurden die Fragmente mit 30 ng HindIII-abgebauter pUC18-Plasmid-DNA bei 16ºC für 4 h ligiert. Das Plasmid wurde in kompetente E. coli- DH5α-Zellen transformiert. Es wurde eine zusätzliche Plasmid-Genbibliothek durch kompletten EcoRI-Abbau von Ip90-DNA und Clonierung in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC18 aufgebaut.
Die B. burgdorferi-Ip90-Plasmid-Genbibliothek wurde mit einem 259 bp osp-Fragment durchgemustert. Dieses ospA-Fragment wurde durch PCR-Amplifikation eines DNA-Segments, das am Ende des ospA-Gens lokalisiert war, unter Verwendung der Oligonukleotide J1 und K1 als Primer erhalten (Tabelle 1). Dieses Fragment entspricht einem Fragment zwischen den Nukleotidpositionen 529 und 788 des B. burgdorferi-B31-ospA-Gens. Die Bedingungen für die PCR-Amplikation waren wie folgt: 16,6 mM (NH&sub4;)SO&sub4;, 67 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25ºC), 6, 7 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, je 200 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP pro 170 ug Rinderserumalbumin, 5 umol jedes Primers, etwa 10 pg Gesamt-Ip90-DNA und 1 E BioLabs-Taq-Polymerase. Die Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 ml, überschichtet mit 40 ml Mineralöl, durchgeführt. Während der ersten 5 Zyklen wurde eine Denaturierung bei 94ºC für 2 min., ein Anlagern bei 45ºC für 1 min. und eine Verlängerung bei 72ºC für 1 min. durchgeführt. In den nächsten 30 Zyklen wurde die Denaturierungszeit auf 39 s verkürzt und die Anlagerungszeit auf 55ºC erhöht; ansonsten waren die Bedingungen dieselben. Die PCR- Fragmente wurden mit 32P-α-dATP unter Verwendung eines Oligo-Markierungs-Kits (Amersham, Buckinghamshire, GB) markiert und verwendet um die HindIII-Bibliothek auf osp- Gen-enthaltende Clone durchzumustern. Die Durchmusterung wurde durchgeführt, wie es in (30) beschrieben ist, und die Hybridisierung wurde bei hoher Stringens (60ºC) durchgeführt.

Nukleotidsequenz-Analyse

Deletionsbibliotheken in einer Richtung wurden für den Clon von ACAI mit voller Länge und die kürzeren oder die Ip90-Clone, wie früher beschrieben (21), aufgebaut. Miniplasmid- Präparationen wurden entweder nach dem Siedeverfahren (30) oder durch ein früher beschriebenes CsCI-Verfahren (39) durchgeführt. Die Nukleotidsequenzierung wurde nach dem Didesoxy-Kettenterminierungs-Verfahren, das von Sanger et al. beschrieben wurde, unter Verwendung eines Pharmacia T7-SequencingTM-Kits (Pharmacia, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Es wurde die vollständige Sequenz für beide Stränge bestimmt. Aus den erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden die internen Primer synthetisiert um eine Sequenzierung des anderen Strangs plus Beginn des Ip90-osp-Operons durchführen zu können. Die aus der DNA- Deletions-Sequenzierungsmethode erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung der GENEUS (20)-Software für VAX-Computer (Digital Equipment Corporation) zusammengestellt. Es wurden zusätzliche Nukleotidsequenz-Analysen durchgeführt, wobei die University of Wisconsin-GCG-Sequence-Analysis-Software für den VAX-Computer und PC-Gene (Genofit) für die Personal Computer verwendet wurden.

In vitro-Transkriptionsanalyse

An dem Gesamt-mRNA-Isolat aus B. burgdorferi B31 wurde unter Verwendung eines früher beschriebenen Verfahrens (31) eine Transkriptionsanalyse durchgeführt. Die isolierte und gereinigte mRNA wurde einer Primerextension in einer in vitro-Reaktion unter Verwendung einer reversen Transkriptase aus Geflügel-Myeloblastose-Virus (Lief Sciences, Fla. USA), wie sie früher bereits beschrieben wurde, allerdings mit geringeren Modifikationen (13, 17, 48), unterworfen. Die Primerextensionsreaktion mit RNA wurde mit [α-³²P]-dATP durchgeführt. Der in der Primerextensionsreaktion verwendete Primer war das reverse Komplement der Nukleotide 128-160 in Figur (3). Es wurde nur ein mRNA-Polymer voller Länge synthetisiert, die Größe des Transkripts wurde mit einer regulären Sanger-Didesoxy-DNA-Sequenz an Plasmid pTHR44 verglichen, das unter Verwendung desselben Oligonukleotid-Primers erhalten worden war. In den DNA-Sequenzierungsreaktionen wurde [α³&sup5;S]-dATP verwendet.

BEISPIEL 2

Clonierung und Nukleotidseguenz-Analyse von osp-Operonen aus B. burgdorferi- Isolaten ACAI und Ip90

Sequenzanalyse

Die osp-Operone aus dem schwedischen B. burgdorferi-Stamm ACAI wurden aus einer λgt11-Bibliothek isoliert. Die Isolierung des ACAI-osp-Operons wurde durchgeführt, indem mit einem Gemisch der drei Oligonukleotide J1, J2 und J3, welche aus der Nukleotidsequenz des früher veröffentlichten B. burgdorferi-B31-osp-Operons synthetisiert worden war, durchgemustert wurde. Ein positiver λ-Clon, der die ACAI-ospA- und ospB-Gene enthielt, wurde isoliert und durch Restriktionsendonuklease-Kartierung charakterisiert. Das isolierte P- Operon wurde in pUC 18 subcloniert, und die genetische Organisation der Gene wurde durch dieselben drei Oligonukleotide J1, J2 und J3 bestätigt. Das osp-Operon des Stamms Ip90 wurde für eine pUC1 8-Plasmid-Bibliothek unter Verwendung von Hindill cloniert, wobei mit Hindill partiell abgebaute Gesamt-DNA von Ip90-B. burgdorferi verwendet wurde. Es wurde ein positiver Clon, der fast das gesamte Ip90-osp-Operon, außer den ersten 175 bp von ospA enthielt, erhalten. Ein Oligonukleotid, J4, wurde vom Beginn dieses HindIII-Clons aufgebaut. Dieses Oligonukleotid, J4, wurde verwendet um einen Clon, der das gesamte Ip90-osv-Operon enthielt, aus einer pUC 18-Plasmidbibiliothek vollständig EcoRI-abgebauter Ip90-DNA aufzunehmen.
Die osp-Operone wurden sequenziert, und ihre Nukleotidsequenzen der osp-Operone der Stämme ACAI und Ip90 sind in Fig. 3 gezeigt. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen sind in der Figur angeordnet und mit den früher veröffentlichten Nukleotidsequenzen der ospA- und ospB- Gene von Stamm B31 (14) und den ospA-Sequenzen aus den Stämmen 257 (45) und N40 (19) verglichen. Die prozentuale DNA-Identität der entsprechenden ospA- und ospB-Gene sind in Tabelle 2 und 3 dargestellt. Die Resultate des Nukleotidsequenzvergleichs zeigten, dass die ospA-Gene aus den Stämmen ACAI und Ip90 eine Sequenzidentität von 85% mit den osyA- Genen des Stamms B31 aufwiesen. Ein Vergleich untereinander zeigte, dass die ospA-Gene von ACAI und Ip90 auch eine 85%ige Ähnlichkeit zeigten. Dagegen waren die zwei früher veröffentlichten ospA-Sequenzen aus den Stämmen 257 und N40 mit der ospA-Sequenz von Stamm B31 fast identisch (> 99%). Die ospB-Sequenzen von Stamm ACAI und Ip90 waren mit dem ospB-Gen von Stamm B31 zu 79% identisch und zeigten im Vergleich miteinander eine 81%ige Identität. Eine weitere Analyse der ospB-Gene des Stamms ACAI und Ip90 zeigte, dass die ospA- und ospB-Gene in einem Operon, getrennt durch einige wenige Basenpaare, angeordnet sind. Den osp-Operonen in diesen zwei Stämmen geht eine Kontrollregion, die aus einem σ-70- Promotor und einer Shine- und Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle besteht, voraus, wie es in Fig. 3 (37) dargestellt ist. Um den genauen transkriptionalen Startpunkt des osp-Operons zu bestimmen, wurde eine in vitro-Primerextension an isolierter Gesamt-Messenger-RNA aus B. burgdorferi B31 (Fig. 4) durchgeführt. Die in vitro-Transkriptionsänalyse identifizierte die transkriptioniale Startstelle als G in Position +1 (Fig. 3). Diese transkriptionale Startstelle liegt 36 bp stromaufwärts zu dem AUG-Translations-Startcodon.

BEISPIEL 3

Sequenzanalyse der translatierten OspA- und OspB-Proteine der Stämme ACAI und Ip90

Die translatierten Produkte der ospA-Gene von ACAI und Ip90 wurden mit den abgeleiteten Translationsprodukten der Stämme B31, ZS7 und N40 verglichen. Der Vergleich der verschiedenen OspA-Proteine in einer optimalen Anordnung ist in Fig. 5A dargestellt. Das abgeleitete OspA-Protein für ACAI ist 273 Aminosäuren lang und hat ein theoretisches Molekulargewicht von 29.629 und ist für Ip90 274 Aminosäuren lang, was ein Protein mit einem Molekulargewicht von 29.673 voraussagt. Die drei verschiedenen ospB-Genprodukte sind in Fig. 5B verglichen. Die abgeleiteten OspB-Proteine haben ein Molekulargewicht von 32.432, das durch 299 Aminosäuren codiert wird für ACAI, und von 32.105, das durch 294 Aminosäuren codiert wird, für Ip90. Aus dem Aminosäuresequenzen-Vergleich für die OspA- und OspB-Proteine wird klar, dass der Start des OspA zwischen den verschiedenen Stämmen stark konserviert wird, während die mittleren und die C-terminalen Teile der Proteine einen höheren Variationsgrad zeigen. Im OspB-Protein ist dieselbe Gesamtvariabilität in der Sequenz zu erkennen. Aus der abgeleiteten Aminosequenz für die Proteine OspA und OspB von B. burgdorferi, Stamm B31, wurde die Sequenzähnlichkeit mit einem prokariotischen Lipoprotein gezeigt (14). Die abgeleiteten OspA- und OspB-Proteine der B. burgdorferi-Stämme ACAI und Ip90 enthalten auch das typische Konsensus-Tetrapeptid (LXYC) in ihren Peptiden. Die möglichen Signalpeptidase II-Erkennungsstellen der Proteine OspA und OspB sind in den Figuren (5A und 5B) gekennzeichnet.

BEISPIEL 4

Extraktion der B. burgdorferi-Proteine, SDS-PAGE und Western-Blotting

Die Zellen wurden in 200 ml bei 34ºC wachsen gelassen und in der mittleren 10 g-Phase (etwa 2 bis 4 · 10&sup8; Zellen pro ml) durch Zentrifugation bei 8.000 g für 20 min. geerntet. Die Zellen wurden zweimal in PBS-5 mM MgCl&sub2; gewaschen, und die Pellets wurden in 2 ml PBS resuspendiert. Um lösliche Proteine herzustellen, wurden die Zellen 4 Mal 30 s in einem Eisbad mit Ultraschall behandelt, wobei ein Branson Sonifer-Zellbrechgerät B 15 bei der Einstellung 3 verwendet wurde. Nach Zentrifugation mit 10.000 g für 30 min. wurde der Überstand gesammelt, und die Proteinmenge wurde bestimmt, indem der Bio-Rad-Proteinassay verwendet wurde (Bio-Rad, München, Deutschland).
SDS-PAGE wurde im Wesentlichen so durchgeführt, wie es früher beschrieben wurde (10), wobei entweder 12,5%- oder 15%-Acrylamid-Laufgele und 4% Acrylamid-Stapelgele verwendet wurden. In jeder Bahn wurden 10 bis 15 ug Protein zugegeben. Die Gele wurden entweder fixiert und mit Coomassie-Brilliant Blau (Sigma Chemical, Samt Louis, Mo, USA) gefärbt oder zum Immunblotting bearbeitet.
Von Pharmacia (Uppsala, Schweden) wurden Molekulargewichtsstandards erhalten und umfassten Proteine im Bereich von 14,4 bis 94 kDa. Die Proteine wurden durch Elektroblotting mit 0,8 mA über cm² für 45 min. auf Immobilonfiltern (Millipore Corporation, Bedford, Ca, USA) übertragen. Die nicht-spezifische Bindung an die Filter wurde durch Inkubation mit S% Milchpulver in PBS über Nacht blockiert. Die Filter wurden dann mit Antikörpern (Verdünnung 1 : 20 oder 1 : 25 in 2,5% Milchpulver in PBS) inkubiert, 3 Mal S min. in PBS-0,05% Tween 20 gewaschen und dann mit einem geeigneten Peroxidase-markierten monoclonalen Antikörper, Mab (Verdünnung 1 : 500 in 2,5% Milch/PBS) 1 Stunde lang inkubiert. Gebundene Antikörper wurden dann durch Zusatz von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat als Peroxidasesubstrat sichtbar gemacht. Alle Inkubationen wurden unter kontinuierlichem Schütteln durchgeführt. Die verwendeten Mab waren die Anti-OspA-Antikörper H5332 (10) und der H3TS (7) und der Anti-OspB-Antikörper H6831 (9). Ein polyklonales Antiserum gegen Gesamtzelllysate aus dem schwedischen B. burgdorferi-Zeckenisolat GIS2 (44), ein Geschenk von Mats Karlsson, Danderyd Hospital, Stockholm, Schweden, wurde beim Westernblotting verwendet um das Vorliegen von Hauptproteinen der äußeren Oberfläche von B. burgdorferi zu zeigen.

BEISPIEL 5

Biochemische und immunchemische Charakterisierung der OspA- und OspB-Proteine der B. burgdorferi-Stämme ACAI und Ip90

Die Ganzzellen-Proteinextrakte, hergestellt von den B. burgdorferi-Stämmen B31, ACAI und Ip90, getrennt durch 12,5% SDS-PAGE, sind in Fig. 1 dargestellt. Diese drei unterschiedlichen B. bur dg orferi-Isolate wurden aus verschiedenen geographischen Gegenden erhalten. Die drei Stämme zeigen verschiedene scheinbare Molekulargewichte für die beiden Hauptproteine der äußeren Oberfläche OspA und OspB. Dieses Resultat wurde auch früher beim Vergleich der Stämme B31 und ACAI gefunden (8). Die Molekulargewichte der entsprechenden OspA- und OspB-Proteine, bestimmt durch SDS-PAGE, sind wie folgt: für B31 : 31 kD und 34 kD; für ACA1 : 32 kD und 36 kD, und für Ip90 : 33,5 kD und 34 kD. Die Osp-Proteine aus den drei unterschiedlichen Isolaten wurden weiter durch Westemblot-Analyse unter Verwendung verschiedener monoclonaler Antikörper, die gegen die Proteine OspA und OspB von B. burgdorferi B31 gerichtet waren, charakterisiert. In einem Westernblot unter Verwendung des OspA-spezifischen Mab HS332 (Fig. 2A) bindet ein Proteinextrakt aus dem Stamm B31 stark an diesen Antikörper, wohingegen das OspA-Protein von ACA1 nur schwach reagiert. Vom Stamm Ip90 reagiert kein Protein mit dem Mab H5332. Wenn der OspA-spezifische. Mab H3TS (Fig. 2B) oder der OspB-spezifische Mab H6831 (Fig. 2C) verwendet wurde, reagierten nur die OspA- und OspB-Proteine von Stamm B31, die Osp-Proteine von ACAI und Ip90 reagierten mit diesen zwei monoclonalen Antikörpern nicht, was eine Variabilität der OspA- und OspB- Proteine in diesen drei Stämmen anzeigt. Bei Verwendung eines polyvalenten polyclonalen Antiserums gegen die ganzen Zellen von B. burgdorferi (Fig. 2D) reagierten alle drei Stämme mit 10 bis 15 unterschiedlichen Proteinen. Bei allen Stämmen trat das stärkste Hybridisierungssignal gegen ein Protein der Größe des OspA-Proteins auf. Die scheinbaren Molekulargewichte dieser angenommenen OspA-Proteine sind, errechnet aus dem Westernblot, 31 kD (B31), 32 kD (ACAI) beziehungsweise 33,5 kD (Ip90).

BEISPIEL 6

Identifizierung von Epitopen

Materialien

B. buradorferi-Organismen der Stämme B31, ACAI und Ip90
Monoclonale Antikörper, die gegen OspA und OspB gerichtet sind, H5332 beziehungsweise H3TS.

Verfahren

Inkubieren von B. burgdorferi in Gegenwart eines der monoclonalen Antikörper bei 34ºC in BSKII-Kulturbrühe-Medium inhibiert das Wachstum der Spirochäten. Nach 1 bis 7 Tagen beginnen Varianten, die durch den Antikörper nicht inhibiert werden, zu wachsen. Diese Antikörper-resistenten Organismen weisen Änderungen im OspA- oder OspB-Protein auf. Sie sind Mutanten, die mit monoclonalen Antikörpern selektiert werden.
Die Epitope, gegen die die wachstumsinhibierenden Antikörper gerichtet sind, werden identifiziert werden, indem die abgeleitete Aminosäuresequenz des ursprünglichen Stamms mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Mutante verglichen wird.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz der mutanten OspA-Proteine wird durch DNA- Sequenzierung von amplifizierter DNA aus der Polymerasekettenreaktion bestimmt.

BEISPIEL 7

Herstellung und Beurteilung von Epitopen

Epitope werden als Fusionsproteine hergestellt, indem ein Genfusions-Expressionssystem verwendet wird, das Fusionspartner erzeugt. Ein Fusionspartner kann als Fusionswerkzeug eingesetzt werden, das die schnelle Gewinnung des rekombinanten Peptids erlaubt. Durch Verwendung verschiedener Fusionspartner kann das rekombinante Produkt in verschiedenen Kompartimenten der Wirtszelle lokalisiert werden oder in das Kulturmedium sekretiert werden.
Das folgende Epitop wird hergestellt: LVSKEKNKDGKYDL (SEQ. ID. NO. 2, Reste 41-54); indem die folgenden Oligodesoxynukleotidsequenzen verwendet werden: 5'- AATTCGTTAGTATCTAAAGAAAAAAACAAAGATGGAAAATATGATTGA-3' (SEQ. ID. NO. 14) und 5'-AGCTTCAATCATATTTTCCA TCTTTGTTTTTTTCTTTAGATACTAACG- 3'(SEQ. ID. NO. 15). Die Oligodesoxynukleotidsequenzen werden maschinell synthetisiert und angelagert. Die Addition von Nukleotiden an beide Enden unter Erhalt von EcoRI- und HindIII- kompatiblen Enden erleichtert die Clonierung des Fragments im Translationsrahmen in einen Fusionssystem-Expressionsvektor. In diesem Experiment wird das im Handel verfügbare System pEZZ18, das auf dem synthetischen Dimeren der Staphylococcus-Protein-A-IgG- Bindungsdomäne, ZZ (Löwenadler et al., 1987 [Gene]) basiert, unter Kontrolle des Protein A- Promotors und der entsprechenden Signalsequenz (Pharmacia) verwendet. Das Vektorplasmid pEZZ18, das eine Mehrfach-Clonierungsstelle stromabwärts des ZZ-Fragments enthält, wird mit EcoRI und Hindill abgebaut, und das 4,6 kb-Fragment wird isoliert. Das linearisierte pEZZ18-Plasmidelement wird dann mit den angelagerten synthetischen Oligonukleotiden, die oben beschrieben wurden, ligiert. E. coli, Stamm TG2, wird transformiert, einzelne Kolonien werden isoliert, und Plasmide werden zur Sequenzanalyse hergestellt. Plasmide, die die gewünschte Sequenz enthalten, werden dann für Expressionsuntersuchungen in TG2 und DHSct transformiert. Bakterienkulturen werden in Standard-LB-Medium, das 50 ug/ml Ampicillin oder Carbenicillin enthält, wachsen gelassen. Über-Nacht-Kulturen werden durch Zentrifugation geerntet, und die Lokalisierung des rekombinanten Peptids im Kulturmedium, Periplasma oder Cytoplasma wird durch Fraktionierungs- und Westernblot-Experimente analysiert. Die Fraktion (die Fraktionen), die das rekombinante Fusionsprotein, das das gewünschte Peptid enthält, enthält/enthalten, wird/werden dann über eine IgG-Sepharose, 6FF, Säule (Pharmacia) zur Bindung des Fusionsproteins geleitet. Die Säule wird dann ausgiebig gewaschen, und das rekombinante Fusionsprotein wird nach den Angaben des Lieferanten (Pharmacia) eluiert. Die Säule wird mit 2-3 Bettvolumina von 0,5 M HAc, pH 3, 4, und mit SO mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (TST) äquilibriert. Der neutrale pH wird vor Auftragen der Probe untersucht. Die Probe wird aufgetragen, und die Säule wird mit 10 Bettvolumina TST und Bettvolumina 5 mM NH4Ac, pH 5,0, gewaschen. Das Fusionsprotein wird dann mit 0,5 HAc, pH 3,4, eluiert.
Es gibt verfügbare Alternativen um den Fusionspartner entweder am Aminoende oder am Carboxyende oder an beiden zu lokalisieren. Dies kann von Vorteil sein, wenn spezifische Modifikationen gewünscht werden, z. B. eine Lipidierung eines Cysteins, das am Aminoende lokalisiert ist.
Das rekombinante Peptid wird dann im Allgemeinen durch Affinitätschromatographie gereinigt, wobei der Fusionspartner als Werkzeug verwendet wird (siehe die oben angegebenen Referenzen).
Geeignete Tiere werden dann mit dem Peptid, gegebenenfalls zusammen mit einem Adjuvans, immunisiert. Seren werden gesammelt und auf ihre Reaktivität gegenüber dem nativen Protein in einem Immunoassay, z. B. Westernblot, oder in einem in vitro-Assay, z. B. Wachstumsinhibierungs-Untersuchungen, beurteilt.

BEISPIEL 8

Expression von rekombinantem OspA-Lipoprotein in Escherichia coli

Um die Produktion an lipidiertem rekombinantem Protein der äußeren Oberfläche von Borrelia burgdorferi, OspA, in E. coli zu erhöhen, wurde ein speziell konzipiertes Expressionssystem entwickelt, das lipidiertes OspA in E. coli produziert.

Verfahren

Zwei PCR-Primer, SYM 2692 (5'-GCGAATTCGCGGCCGCTGGCTCTGCAGAGC AATCTG-3', SEQ. ID. NO. 16) und SYM 2693 (5'-GCGGATCCGCTAGCAGAGTAGAA CCCAGGATTAC-3', SEQ. ID. NO. 17) wurden synthetisiert. Diese Primer wurden verwendet um ein Fragment, das das Hybrid-LPP und den Lac-Promotor zusammen mit dem Hauptteil der LPP-Signalsequenz aus dem Plasmid pKEN195 enthält, zu amplifizieren; siehe Nakamura et a1., 1979 (64). LLP ist das Gen, das für das Lipoprotein der äußeren Membran von E. coli codiert (Nakamura et al., 1982) (63). Das resultierende PCR-Fragment wurde mit PstI und NheI abgebaut und durch Agarose-Elektrophorese isoliert.
Um den Rest der LPP-Singalsequenz im Raster mit dem 5'-Ende der OspA-Sequenz zu amplifizieren, wurde eine andere PCR durchgeführt. Der in dieser Reaktion verwendete Primersatz war: SYM 269 (5'-GCGAATTCGCTAGCAGGTTGTAAGCAAAATGTTAGCAG-3', SEQ. ID. NO. 18) und SYM 1983 (5'-TCAAGCTTGTCTACTGTTGC-3', SEQ. ID. NO. 19), siehe Nakamura et al., 1979 (64). Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI und HindIII abgebaut und wie oben isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit einem 645 bp langen HindIII- und BamHI-Fragment, das den Rest der OspA-codierenden Sequenz enthielt, und mit BamHI- und EcoRI-abgebautem pUC19 ligiert; das resultierende Plasmid wurde sequenziert und als pS324 bezeichnet.
Das Plasmid pS324 wurde dann mit NheI und BamHI abgebaut, und es wurde ein 784 bp-Fragment, das die gesamte OspA-codierende Sequenz und die Sequenz, die die drei Aminosäuren aus der LPP-Signalsequenz, lokalisiert benachbart zu der OspA-Sequenz, codiert, enthält, durch Agarose-Elektrophorese isoliert. Im nächsten Schritt wurde dieses 784 bp-Fragment mit dem PstI- und NheI-PCR-Fragment, das die Promotorsequenz und den 5'-Teil der Signalsequenz enthält, ligiert und in PstI- und BamHI-abgebautes pUC19 cloniert. Dieses Expressionskonstrukt wurde pS420 genannt.

Expression

Um eine Expression, die durch dieses Konstrukt pS420 gesteuert wurde, zu analysieren, wurden zwei E. coli-Stämme untersucht, DH5a und TG2.
DHSα

Genotyp

supE44 ΔlacU169(Φ80lacZΔM15)
hsd R17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
Φ80lacZΔM15 erlaubt eine α-Komplementierung mit dem Amino-Ende von β- Galactosidase, das in pUC-Vektoren codiert ist. DHSα ist von Bethesda Research Laboratories Inc. (Hanahan D. (1983), J. Mol. Biol. 166 : 557, erhältlich.
TG2

Genotyp

supE hsdΔ5 thi Δ(lac-proAB)
Δ(srl-recA)306 Tn10 (tetr)
F [traD36 proAB+lac 19 lacZΔM15
Ein Rekombinations-defizientes Derivat von TG1. (Sambrook (1989)).
Beide Stämme wurden vom Department of Microbiology, University of Umea, erhalten.
Wie für in vivo-Markierungsuntersuchungen typisch, wurden die Expressionsexperimente wie folgt durchgeführt. Flüssige Kulturen von mit pS420-transformierten DHSα und TG2 in LB, das 50 ug/ml Carbenicillin enthielt, wurden beimpft und für etwa 7 Stunden bei 37ºC inkubiert. Aus diesen Kulturen wurden 100 ul Kultur in 1 ml LB, enthaltend 50 ug/ml Carbenicillin, 50 ul [9,10(n)-3H]-Palmitinsäure (Amersham) mit einer spezifischen Aktivität von 54,6 mCi/ml und einer radioaktiven Konzentration von 1 mCi/ml und 2 mM IPTG, geimpft. Diese Kultur wurde über Nacht bei 37ºC wachsen gelassen. Als Kontrolle wurden die E. coli- Wirtsstämme ohne Expressionsvektor und dieselben Stämme mit dem pS151-Vektor verwendet. Die Kulturbedingungen waren identisch, außer dass Carbenicillin bei den kein Plasmidenthaltenden Kulturen weggelassen wurde. pS151 ist identisch mit pTRH144 (Bergström et al., 1989, (13). Die Resultate sind in Fig. 6A und B dargestellt.
Zur Expressionsanalyse wurde 1 ml Bakterienkultur geerntet, und die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert. Die resultierenden Pellets wurden durch 10-minütiges Kochen in 50 ul Probenpuffer (Laemmli, 1970) gelöst. Proben wurden durch SDS-PAGE und Immunoblotting beziehungsweise Autoradiographie analysiert. Um größere Volumina zu kultivieren, wurde dasselbe Verfahren durchgeführt, außer dass der radioaktive Marker weggelassen wurde.

Schlussfolgerung

Die Analyse durch SDS-PAGE und Immunoblotting mit dem OspA-monoclonalen Antikörper H5332, in vivo-Markierungsstudien mit ³H-Palmitinsäure und Reinigung von rekombinantem OspA haben eine hocheffiziente Expression von lipidiertem OspA in E. coli bewiesen. Tabelle 1. Oligonukleotide, die zur Durchmusterung von Phagen- und Plasmid- Genbibliotheken, Nukleotidsequenzierung der osp-Operone und Primerextensionsanalyse verwendet wurden.
* Alle Positionen sind von den B. burgdorferi-B31-ospA- und ospB-Sequenzen in Fig. 3 abgeleitet, ausgenommen die pUC19-Sequenzen, die von der EMBL-Daten-Basissequenz des Plasmids pUC19 stammen.
K = komplementär zu Tabelle 2. DNA-Sequenzidentität (in Prozent) zwischen den ospA-Genen aus verschiedenen Borrelia burgdorferi-Isolaten. Tabelle 3. DNA-Sequenzidentität (in Prozent) zwischen den oSpB-Genen aus verschiedenen Borrelia burgdorferi-Isolaten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1: Coomassie Blau-gefärbte 12,5% SDS-PAGE der Lysate ganzer Zellen von B. burgdorferi. Bahn A: Extrakt ganzer Zellen von B. burgdorferi, Stamm B31; Bahn B: Stamm ACA1, und Bahn C: Stamm Ip90. Bahn S. Sowohl links als auch rechts in der Figur zeigen die Größen der Molekulargewichtsstandards (x 103).
Fig. 2a und b: Westernblot-Analyse unter Verwendung verschiedener monoclonaler oder polyclonaler Seren, die mit unterschiedlichen Epitopen von B. burgdorferi reagieren. Die Immunoblots wurden aus demselben SDS-PAGE-Typ wie in Fig. 1 hergestellt, wobei Bahn A ein Präparat aus ganzen Zellen von B31 war, Bahn B von ACAl und Bahn C von Ip90 war. Die verschiedenen verwendeten Seren waren wie folgt: In 2A H5332, ein monoclonaler Antikörper, der mit einem Epitop des OspA-Proteins reagiert; 2B) H3TS, ein OspA-monoclonaler Antikörper, der mit einem anderen Epitop als H5332 reagiert; 2C) H6831, ein monoclonaler Antikörper, der gegen das OspB-Protein von B. burgdorferi B31 gerichtet ist; 2D) ein polyvalentes polyclonales Antiserum, das gegen Lysate ganzer Zellen aus dem schwedischen B. burgdorferi-Zeckenstamm G152 gerichtet ist.
Fig. 3a1-3b5: Vergleich der Nukleotidsequenzen der osp-Operone aus den B. burgdorferi-Stämmen B31, ACAl und Ip90. die OspA-Sequenzen aus 257 und N40 sind ebenfalls enthalten. Die OspA- und OspB-Sequenzen des B. burgdorferi-Stamms B31 sind in der obersten Reihe dargestellt (14). Bindestriche zeigen Homologie zwischen den OspA- und OspB-Genen der verschiedenen Stämme an, Großbuchstaben zeigen Unterschiede zwischen den Osp-Genen an, und Abstände zeigen fehlende (oder insertierte) Basen an. Die -10- und -35- Regionen des Promotors sind fettgedruckt, und die Ribosomenbindungsstellen (Shine Dalgarno- Sequenzen) sind unterstrichen.
Fig. 4: Bestimmung des Transkriptionsstarts des B. burgdorferi-B31-osp- Operon. Die Figur zeigt die Primerausdehnung der osp-mRNA zusammen mit der entsprechenden Sequenzleiter der osp-DNA. Die -10-Region, die Transkriptionstartbase (+1), die Ribosomenbindungsstelle (RBS) und die zwei ersten Aminosäure-Kodons (Met und Lys) sind auf der rechten Seite in der Figur angegeben.
Fig. 5: Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der B. burgdorferi-OspA- und OspB-Proteine. a1-a2) Vergleich der OspA-Proteine der Stämme B31, ZS7, N40, ACA1 und Ip90. Alle Sequenzen werden mit der B. burgdorferi-B31-Sequenz verglichen und angeordnet (14). Großbuchstaben zeigen Unterschiede zwischen den Stämmen an, Bindestriche zeigen Homologien an, und Leerräume zeigen fehlende Aminosäuren an. Die mögliche Signalpeptidase-Spaltstelle wird mit fettgedruckten Buchstaben in der Figur angegeben. b 1-b2) Die abgeleitete Aminosäuresequenz der OspB-Proteine der B. burgdorferi-Stämme ACA1 und Ip90 im Vergleich zu dem OspB-Protein von B. burgdorferi B31.
Fig. 6 A und B:
A) Analyse von ³H-Palmitinsäure-markierten Proteinen durch SDS-PAGE
B) Analyse durch SDS-PAGE und Immunoblotting mit OspA-monoclonalem Antikörper H5332.
Bahn 1: E. coli-Stamm DH5α ohne Expressionsvektor, Bahn 2: Derselbe Stamm mit dem PS 151-Vektor; Bahn 3: derselbe Stamm mit dem p5420-Vektor; Bahn 4: Molekulargewichtsmarker, 18,5, 27,5, 32,5, 49,5, 80 und 106 kD; Bahn 5: E. coli-Stamm TG2a ohne Expressionsvektor; Bahn 6: derselbe Stamm mit dem sP151-Vektor; Bahn 7: derselbe Stamm mit dem p5420-Vektor.

LITERATURLISTE:

1. Åsbrink, E. & A. Hovmark. 1985. Successful cultivation of spirochetes from skin lesions of patients with erythema chronicum migrans Afzelius and acrodermatitis chronica atrophicans. Acta. Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B, 93: 161-163.
2. Barbour, A. G. 1984. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J. Biol. Med. 57: 71-75.
3. Barbour, A. G. 1984. Immunochenical analysis of Lyme disease spirochetes. Yale J. Biol. Med. 57: 581-586.
4. Barbaur, A. G. 1988. Plasmid Analysis of Borrelia burgdorferi, the Lyme Disease Agent. Journal of Clinical Microbiology 26: 475-478.
5. Barbour, A. G. 1989. Antigenic variation in relapsing fever Borrelia species: genetic aspects. In Berg, D. E. & Howe,M. M. (eds): Mobile DNA, Washington, D. C. American Society for Microbiology, pp. 783-789.
6. Barbour, A. G. & C. F. Garon. 1987. Linear plasmids of the bacterium Borrelia burgdorferi have covalently closed ends. Science 237: 409-411.
7. BarboUr, A. G., R. A. Heiland & T. R. Howe. 1985. Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borreliae: a mMolecular analysis of North American and European isolates. J. Infect. Dis. 152: 478-484.
8. Barbour, A. G. & M. E. Schrumpf. 1986. Polynorphism of major surface proteins of Borrelia burgdorferi. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. Reihe A. 263: 83-91.
9. Barbour, A. G., S. L. Tessier & S. F. Hayes. 1984. Variation in a major surface protein of Lyme disease spirochetes. Infect. Immun. 45: 94-100.
10. Sarbour, A. G., S. L. Tessier & W. J. Todd. 1983. Lyme disease spirochetes and Ixodes ticks share a common surface antigenic deterninant defined by a monoclonal antibody. Infect. Immun. 41: 795-804.
11. Barbour, A. G., N. Burman, C. J. Carter, T. Kitten & S. Besgström. 1991. Variable antigen genes of the relagsing fever agent Borrelia hermsii are activated by promoter addition. Mol. Microbiol. 5: 489-493.
12. Barbour, A. G., C. J. Carter, N. Burman, C. S. Freitag, C. F. Garon & S. Bergström. 1991. Tandem insertion seguence-like elements define the expression site for variable antigen genes of Borrelia hermsii. Infect. Immun. 59: 390-397.
13. Bergström, S., K. Robbins, M. Koomey & J. Swanson. 1986. Piliation control mechanisms in Neissaria gonorrhoeae. Proc. Natt. Acad. Sci. USA 83: 479-486.
14. Bergström, 5., V. G. Bundoc & A. G. Barbour. 1989. Molecular analysis of linear plasmid-encoded major surface proteins, OspA and OspB, of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol. Microbiol. 3: 479-486.
15. Brandt, M. E., B. S. Riley, J. D. Radolf & M. V. Norgard. 1990. Immunogenic integral membrane proteine of Borrelia burgdorferi are lipoproteins. Infect. Immun. 58: 983-991.
16. Bundoc, V. G. & A. G. Barbour. 1989. Clonal polymorphism of outer membrane protein DspB of Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. 57: 2733-2741.
17. Bunnan, N., S. Bergström, B. I. Restrepo & A. G. Barbour. 1990. The variable antigens Vmp7 and Vmp21 of the relapsing fever bacterium Borrelia hermsii are structurally analogous to the VSG proteins of the African trypanosome. Mol. Microbiol. 4: 1715-1726.
18. Craft, J. E., D. K. Fischer, G. T. Shimamoto & A. C. Steere. 1986. Antigens of Borrelis burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a new IgM response and expansion of the IgG response late in illness. J. Clin. Invest. 78: 934-939.
19. Fikrig, E., S. W. Barthold, F. S. Kantor & R. A. Flavell. 1990. Protection of mice against the Lyme disease agent by immunizing with recombinant OspA. Science 250: 553-556.
20. Harr, R., P. Fälinan, M. Häggström, L. Wahlström & P. Gustafsson. 1986. GENEUS, a computer System for DNA and protein sequence analysis containing an information retrieval system for the EMBL data library. Nucl. Acids Res. 11: 273-284.
21. Hoheisel, J. & F. M. Pohl. 1986. Simplified preparation of unidirectional deletion clones. Nucl. Acids Res. 14: 3605.
22. Howe, T. R., F. W. LaQuier & A. G. Barbour. 1986. Organization of genes encoding two outer membrane proteins of the Lyme disease agent within a single transcriptional unit. Infect. Immun. 54: 207-212.
23. Howe, T. R., L. W. Mayer & A. G. Barbour. 1985. A single recombinant plasmid expressing two major outer surface proteins of the Lyme disease spirochete. Science 227: 645-646.
24. Huynh, T. U., R. A. Young & R. W. Davis. 1985. Construction and screening cDNA libraries in λgt10 and Agtil. In DNA Cloning, Volume 1, ed. Glover, D. M. IRL Press Limited, Oxford, England, pp. 56-110.
25. Inouye, M. & S. Halegoua. 1980. Secretion and membrane localization of proteins in Escherichia coli. Crit. Rev. Biochem. 7: 339-371.
26. Jameson, B. A. & H. Wolf. 1988. The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput. Appl. Biosci. 4: 181-186.
27. Kyruchechnikov, V. N., E. I. Korenberg, S. V. Scherbakov, Yu. V. Yovalevsky & M. L. Levin. 1988. Identification of Borrelia isolated in the USSR from Ixodes persulcatus schulze ticks. J. Microbiol. Epideniol. Immunobiol. 12: 41-44.
28. Loenen, W. A. M. & W. J. Brammer. 1980. A bacteriophage lambda vector for cloning large DNA fragments made with several restriction enzynes. Gene 20: 249-259.
29. Malloy, D. C., R. K. Nauman & II. Paxton. 1990. Detection of Borrelia buradorferi using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 28: 1089-1093.
30. Maniatis, T. E., E. F. Fritsch & 3. Sambrook. 1982. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, Laboratory press.
31. Meier, J. T., M. I. Simon & A. G. Barbour. 1985. Antigenic variation is associated with DNA rearrangements in a relapsing fever borrelia. Cell 41: 403-409.
32. Nielsen, S. L., K. K. Y. Young & A. G. Barbour. 1990. Detection of Borrelia burgdorferi DNA by the polymerase chain reaction. Mol. Cell. Probes. 4: 73-79.
33. Plasterk, R. H. A., M. I. Simon & A. G. Barbour. 1985, Transposition of structural genes to an expression sequence on a linear plasinid causes antigenic variation in the bacterium Borrelia hermsii. Nature 318: 257-263.
34. Postic, D., C. Edlinger, C. Richaud, F. Grimont, Y. Dufresne, P. Perolat, G. Baranton & P. A. D. Grimont. 199. Two genomic species in Borrelia burgdorferi. Res. Microbiol. 141: 465-475.
35. Rosa, P. A. & T. G. Schwan. 1989. A specific and sensitive assay for the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi using the polymerase chain reaction. J. Infect. Dis. 160: 1018-1029.
36. Rosa, P. A., D. Hogan & T. G. Schwan. 1991. Polymerase chain reaction analyses identify two distinct classes of Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. 29: 524- 532.
37. Rosenberg, M. & 0. Court. 1979. Regulatory sequences involved in the promotion and termination of transcription. Ann. Rev. Genet. 13: 256-275.
38. Sanger, F., S. Nicklen & A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 545??3-5467.
39. Saunders, S. E. & J. F. Burke. 1990. Rapid isolation of miniprep. DNA for double strand sequencing. Nucl. Acids Res. 18: 4948.
40. Schalble, U. E., M. D. Kramer, K. Eichnan, M. Modolell, C. Museteanu & M. M. Simon. 1990. Monoclonal antibodies specific for the outer surface protein A (OspA) of Borrelia burgadorferi prevent Lyme borreliosis in severe combined immunodeficiency (seid) mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3768-3772.
41. Schubach, W. H., S. Mudri, R. J. Dattwyler & B. J. Luft. 1991. Mapping antibody-binding domains of the major outer surface membrane protein (OspA) of Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. 59: 1911-1915.
42. Schwan, T. G. & W. Burgdorfer. 1987. Antigenic changes of Borrelia burgdorferi as a result of in vitro cultivation. J. Infect. Dis. 156: 852-853.
43. Schwan, T. G., W. Burgdorfer & C. F. Garon. 1988. Changes in infectivity and glasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infect. Immun. 56: 1831-1836.
44. Stiernstedt, G. 1985. Tick-borne Borrelia infection in Sweden. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 45: 1-70.
45. Wallich. R., U. E. Schalble, M. M. Simon, A. Heiberger & M. D. Kramer. 1989. Cloning and seguencing of the gene encoding the outer surface protein A (OspA) of a European Borrelia burgdorferi isolate. Hucl. Acids Res. 17: 8864.
46. Williams, J. G. & P. J. Mason. 1985. Hybridization in the analysis of RNA. In Nucleic acid hybridization. Hames, B. D. & S. J. Higgins (eds), Oxford: IRL Press, pp. 139-160.
47. Wilske, B., v. Preac-Mursic, G. Schierz, R. Kuhbeck, A. G. Barbour & M. Kramer. 1988. Antigenic variability of Borrelia burqdorferi. Ann. N. Y. Acad. Sci. 539: 126-143.
48. von Gabain, A., J. G. Belasco, J. L. Schottel, A. C. Y. Chang & S. N. Cohen. 1983. Decay of mRNA in Escherichia coli: investigation of the fate of specific segments of transcripts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 653- 657.
49. von Heijne, G. 1983. Patterns of amino acids near signal sequence cleavage sites. Eur. J. Biochem. 133: 17-21.
50. Wu, H. C. & M. Tokunaga. 1986. Biogenesis of lipoproteins in bacteria. In Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 125, pp. 127-157.
51. Arnhem, N. & Levenson, C. H. 36, October 1, 1990 C&EN special report. Polymerase Chain Reaction.
52. Sambrook, J. et al. Molecular Cloning, a laboratory manual.
53. Old, R. W. and Priinrose, S. B. Principles of Gene Manipulation, a textbook.
54. Gray, M. R., Colot, H. V., Guarente, L. and Rosbach, M. 1982. Open reading frame cloning: identification, cloning and expression of open reading frame DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 6598-6602.
55. Löwenadler, B., Nilsson, H., Abrahmsén, L., Moks, T., Ljungquist, L., Holmgren, E., Paleus, S., Josephson, S., Philipson, L. and Uhlén, M. 1986. Production of specific antibodies against protein A fusions. EMBO J. 5: 2393-2398.
56. Löwenadler, B., Jansson, B., Paleus, S., Holmgren, s., Nilsson, B., Moks, T., Palm, G., Josephson, 5., Philipson, L. and Uhlén, M. 1987. A gene fusion system for generating antibodies against short peptides. Gene 58: 87-97.
57. Löwenadler, B., Svennerholm, A.-M., Gidlund, M., Holmgren, E., Krook, K., Svanholm, C., Ulff, S. and Josephson, S. 1990. Enhanced immunogenicity of recombinant peptide fusions containing multiple copies of a. heterologous T helper epitope. Eur. J. Immunol. 20: 1541-1545.
58. Löwenadler, B., Lake, M., Elmblad, A., Holmgren, E., Holmgren, J., Karlström, A. and Svennerhobn, A.-M. 1991. A recombinant Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STa) fusion protein eliciting anti-STa neutralizing antibodies. FEMS Microbiol. Lett. 82: 271-278.
59. Nakamura, K., Masui, Y. and Inouye, M. 1982. Use of a lac promoter-operator fragment as a transcriptional control switch for expression of the constitutive lpp gene in Escherichia coli. J. Mol. Appl. Gen. 1: 289- 299.
60. Smith, D. B. and Johnson, K. S. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione 5-transferase. Gene 67: 31-40.
61. Yansura, D. G. 1990. Expression as trpe fusion. In Methods in Enzymology. Ed. Goeddel, D. V. Vol 185: 161-166.
62. Hanahan D. (1983) J. Mol. Biol. 166: 557.
63. von Heijne, G. The structure of signal peptides from bacterial lipoproteins. Protein Engineering vol. 2, no. 7 pp. 531-534, 299.
64. Nakamura K., Ihouye M. DNA sequence of the gene for the outer membrane lipoprotein of E. coli: an extremely AT-rich promoter. Cell 1979; 18: 1109-17.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines B. burgdorferi-Organismus in Tieren, einschließlich Menschen, wobei das Verfahren Unterwerfen einer Probe von dem Tier, z. B. eine Körperflüssigkeit wie z. B. Blut, Serum, IJiquor cerebrospinalis, Synovia, Herzbeutelflüssigkeit oder Urin, oder eine Gewebebiopsie einer PCR-DNA-Analyse umfasst, welche umfasst:

A) Verwendung einer Nukleotidprimersequenz, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Primersequenz mit einem Teil einer Sequenz der OspA- und OspB-DNA von einem der B. burgdorferi-Stämme 831, Ip90 und ACA1 identisch ist, dieser Teil der Sequenz zu einem beliebigen Teil der Sequenz der zwei anderen Spezies unterschiedlich ist, der Unterschied so ist, dass die Sequenz sich nicht an DNA aus den zwei anderen Spezies anlagern wird, und bei Abschluss der PCR-DNA-Analyse Identifizierung des nachgewiesenen B. burgdorferi-Organismus dahingehend, ob er zu einer der Klassen I, II und III von B. burgdorferi gehört, wobei B31, Ip90 und ACA1 Referenzstämme für diese Klassen sind, oder

B) Verwendung einer Kombination aus mindestens zwei Nukleotidprimersequenzen, von denen jede mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei eine Sequenz mit einem Teil einer Sequenz aus der OspA- und OspB-DNA aus einem ersten B. burgdorferi-Stamm, B31, identisch ist, eine andere Sequenz mit einem Teil einer Sequenz aus der OspA- und OspB-DNA aus einem anderen B. burgdorferi-Stamm, Ip90, und gegebenenfalls einer dritten Sequenz, die mit einem Teil einer Sequenz aus dem dritten B. burgdorferi-Stamm Spezies ACA1 identisch ist und bei Abschluss der PCR-DNA- Analyse Identifizierung des nachgewiesenen B. burgdorferi-Organismus dahingehend, ob er zu einer der Klassen I, II und III von B. burgdorferi gehört, wobei die Stämme B31, Ip90 und ACA1 Referenzstämme für diese Klassen sind, oder

C) Verwendung einer Nukleotidprimersequenz, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Primersequenz mit einem Teil einer Sequenz von mindestens zwei von drei OspA- und OspB-DNA-Sequenzen, die von den B. burgdorferi-Stämmen B31, Ip90 und ACA1 stammen, identisch ist, und bei Abschluss der PCR-DNA- Analyse Identifizierung des nachgewiesenen B. burgdorferi-Organismus dahingehend, ob er zu einer Gruppe bestehend aus mindestens zwei der Klassen I, II und III von B. burgdorferi gehört, wobei die Stämme B31, Ip90 und ACA1 Referenzstämme für diese Klassen sind.

2. Diagnostischer PCR-Kit zum Nachweisen des Vorhandenseins eines B. burgdorferi-Organismus in einer Probe aus einem Tier, einschließlich eines Menschen, im Wesentlichen unabhängig von dem individuellen Stamm B. burgdorferi, der möglicherweise in der Probe vorliegt, und zur Identifizierung des nachgewiesenen B. burgdorferi- Organismus dahingehend, ob er zu einer der Klassen I, II und III von B. bufgdorferi gehört, wobei B31, Ip90 und ACA1 Referenzstämme für diese Klassen sind, wobei der Kit die folgenden Primer oder Primerkombinationen umfasst:

A) eine Nukleotidprimersequenz, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Primersequenz mit einem Teil einer Sequenz von OspA- und OspB-DNA aus einem der B. burgdorferi-Stämme B31, Ip90 und ACA1 identisch ist, dieser Teil der Sequenz zu einem beliebigen Teil der Sequenz der zwei anderen Spezies unterschiedlich ist, der Unterschied so ist, dass die Sequenz sich nicht an DNA aus den zwei anderen Spezies anlagern wird, oder

B) eine Kombination aus mindestens zwei Nukleotidprimersequenzen, von denen jede mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei eine Sequenz mit einem Teil einer Sequenz aus der OspA- und OspB-DNA aus einem ersten B. burgdorferi- Stamm, B31, identisch ist, eine andere Sequenz mit einem Teil einer Sequenz aus der OspA- und OspB-DNA aus einem anderen B. burgdorferi-Stamm, Ip90, identisch ist, und fakultativ einer dritten Sequenz, die mit einem Teil einer Sequenz aus dem dritten 3. burgdorferi-Stamm Spezies, ACA1, identisch ist, oder

C) eine Nukleötidprimersequenz, die mindestens 11 Nukleotide umfasst, wobei die Primersequenz mit einem Teil einer Sequenz aus mindestens zwei von drei OspA- und OspB- DNA-Sequenzen, die von den B. burgdorferi-Stämmen B31, Ip90 und ACA1 stammen, identisch ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1C), wobei der Primer eine Sequenz umfasst, die mit einer der folgenden Sequenzen (oder einer ihrer komplementären Sequenzen) identisch ist:

5'-GTATTMGITAAGTTAITAATAT-3' (SEQ ID NO: 1, bp 123-142)

5-AAAAGGAGAATATATTATGA-3' (SEQ ID NO: 1, bp 584-607)

5'-AAAAATATTTATTGGGAATA 3' (SEQ ID NO: 1, hp. 776-796)

5'-GGAAAAGCTAAAGAGGTTAAAA-3' (SEQ ID NO: 1, bp. 806-817)

5'-ACTTCAACTTTAACAATTA-3' (SEQ ID NO: 1, bp, 85-104)

5'-AATAAGGAGAATTTATGA 3' (SEQ ID NO: 1, bp, 111-130)

5'-AAAAAAACTAAA-3' (SEQ ID NO: 1, bp. 948-965)

4. PCR-Kit nach Anspruch 2C), wobei der Primer eine Sequenz umfasst, die mit einer der folgenden Sequenzen (oder einer ihrer komplementären Sequenzen) identisch ist:

5'-GTATTAAGTTATATTAATAT-3' (SEQ ID NO: 1, bp 584-142)

5'-AAAAGGAGAATATATTATGA-3' (SEQ ID NO: 1, bp 584-607)

5'-AAAMTATTTATTGGGAATA-3' (SEQ ID NO: 1, bp. 776-796)

5'-GGAMAGCTAAAGAGGTTTTAAAA-3' (SEQ ID NO: 1, bp. 806-417)

5'-ACTTCAACTTTAACAATTA-3' (SEQ ID NO: 1, bp. 85-104)

5'-AATAAGGAGAATTTATGA-3' (SEQ ID: 1, bp. 111-130)

5'-AAAAAAACTAAA-3' (SEQ ID NO: 1, bp. 948-965)