DE69231519T2 - Polypeptide aus micobakterium paratuberculosis - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft Polypeptide und Peptide, insbesondere rekombinante Polypeptide und Peptide, die zur Diagnose von Paratuberkulose bei Vieh und möglicherweise der Crohn-Krankheit bei Menschen verwendet werden können. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Polypeptide und Peptide, die einen solchen biologischen Reinheitsgrad aufweisen, dass sie als Teil des Wirkstoftrinzips bei der Herstellung von Impfstoffen gegen Paratuberkulose verwendet werden können.[0001]
• Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, die für diese Polypeptide und Peptide kodieren.[0002]
• Ferner betrifft die Erfindung in vitro-diagnostische Verfahren und Testpackungen (Kits) unter Verwendung der vorgenannten Polypeptide und Peptide sowie Impfstoffe mit einem Gehalt an den vorgenannten Polypeptiden und Peptiden als Wirkstoffprinzipien gegen Paratuberkulose.[0003]
• Der Ausdruck "rekombinante Polypeptide" ist so zu verstehen, dass er sich auf beliebige Moleküle bezieht, die eine Polypeptidkette aufweisen, die leicht durch gentechnische Maßnahmen unter Transkription und Translation einer entsprechenden DNA-Sequenz unter der Kontrolle geeigneter Regulationselemente in einem effizienten zellulären Wirt hergestellt werden können. Infolgedessen schließt der hier verwendete Ausdruck "rekombinante Polypeptide" nicht die Möglichkeit aus, dass die Polypeptide zusätzliche Gruppen, wie glycosylierte Gruppen, umfassen.[0004]
• Der Ausdruck "rekombinant" beinhaltet die Tatsache, dass das Polypeptid durch gentechnische Maßnahmen erzeugt worden ist, da es insbesondere in einem zellulären Wirt das Ergebnis der Expression der entsprechenden Nucleinsäuresequenzen, die vorher in einen in diesem Wirt verwendeten Expressionsvektor eingeführt worden sind, darstellt.[0005]
• Trotzdem ist darauf hinzuweisen, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Peptide auch durch ein anderes Verfahren hergestellt werden können, z. B. durch klassische chemische Synthese gemäß den bei der Proteinsynthese herangezogenen Verfahren oder durch proteolytische Spaltung von größeren Molekülen.[0006]
• Der Ausdruck "biologisch rein" oder "biologische Reinheit" bedeutet einerseits einen solchen Reinheitsgrad, dass die Polypeptide für die Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden können, und andererseits die Abwesenheit von Verunreinigungen, insbesondere von natürlichen Verunreinigungen.[0007]
• Paratuberkulose (Johne-Krankheit) wird als eine der ernstesten Erkrankungen der weltweiten Viehzucht beschrieben. Diese durch M. paratuberculosis ausgelöste Mycobacteriose ist durch eine ileozäkale Enteritis gekennzeichnet, die nacheinander zu Abmagerung, Dysenterie, Cachexie und zum Tod führt (R. J. Chiodini et al., 1984, "Ruminant paratuberculosis (Johne's disease): the current status and future prospects", Cronell Vet., Bd. 74, S. 218-262). Histologische Untersuchungen ergeben Ödeme, Infiltrationen und Verdickungen der Ileumschleimhaut sowie Hypertrophie und Nekrose von intestinalen Lymphknoten. Nicht selten ist daher ein miliares Syndrom mit diffusem Parenchymgranulom in Leber, Milz und Lunge. Die hohe Ansteckungsgefahr dieser Krankheit ist auf die Ausscheidung einer großen Anzahl von Bakterien aus dem intestinalen Trakt zurückzuführen: kontaminierte Weiden führen zur Ausbreitung der Infektion, was rasch zur Bildung von Viehbeständen führt, bei denen ein Großteil der Tiere infiziert ist. Chronische Dysenterie ist ein fortgeschrittenes Stadium der Krankheit, da epidemiologische Daten darauf hinweisen, dass subklinische Fälle mit geringen Anzeichen einer intestinalen Veränderung die Mehrzahl der infizierten Tiere und häufig einen großen Anteil des Viehbestands ausmachen.[0008]
• Die Diagnose von Paratuberkulose ist insbesondere in Abwesenheit von klinischen Symptomen wichtig: sie führt zur Identifizierung verborgener bakterieller Nester und verhindert die Ausbreitung von Infektionen. Ungünstigerweise gibt es keine diagnostischen Indikatoren für frühe Stadien der Krankheit. Tatsächlich stellt die Identifizierung des ätiologischen Agens (mit langsamem Wachstum) einen langwierigen Prozess dar, und die histologische Untersuchung von Biopsiematerial ist schwierig und teuer. Von größerem Interesse sind offensichtlich die immunologischen Verfahren zur Analyse von humoralen Immunreaktionen (J. Brugere-Picoux, 1987, "Le diagnostic de 1a paratuberculose chez les ruminants", Rec. Med. Vet., Bd. 163, S. 539- 546; J. S. Colgrave et al., 1989, "Paratuberculosis in cattle: a comparison of three serologic tests with results of fecal culture", Veterinary Microbiology, Bd. 19, S. 183-187). Obgleich es Tests unter Komplementfixierung und Hämagglutination offensichtlich sowohl an Empfindlichkeit als auch an Spezifität fehlt, sind immunoenzymatische Messverfahren zur Bewertung von antimykobakteriellen Antikörpern anscheinend vielversprechender (B. Abbas et al., 1983, "Isolation of specific peptides from Mycobacterium paratuberculosis protoplasm and their use in an enzyme linked immunosorbent assay for the detection of paratuberculosis (Johne's disease) in cattle", Am. J. Vet. Res., Bd. 44, S. 2229-2236; J. S. Colgrave et al., 1989, "Paratuberculosis in cattle: a comparison of three serologic tests with results of fecal culture", Veterinary Microbiology, Bd. 19, S. 183-187); Y. Yokomizo et al., 1983, "Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine Immunoglobulin G1 antibody to a protoplasmic antigen of Mycobacterium paratuberculosis", Am. J. Vet. Res., Bd. 44, S. 2205-2207; Y. Yokomizo et al., 1985, "A method for avoiding false-positive reactions in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the diagnosis of bovine paratuberculosis", Japan, J. Vet. Sci., Bd. 47, S. 111-119).[0009]
• Da außerdem in westlichen Ländern die Schlachtung von Vieh, das von Tuberkulose (durch M. bovis oder M. tuberculosis hervorgerufen) befallen ist, aber nicht von Vieh, das von Paratuberkulose befallen ist, zwingend vorgeschrieben ist, ist eine Unterscheidung zwischen diesen beiden mycobakteriellen Krankheiten auf immunologischem Niveau wesentlich. Außerdem ist bekannt, dass M. paratuberculosis genetisch eng mit M. avium verwandt ist (R. J. Chiodini et al., 1999, "The genetic relationship between Mycobacterium paratuberculosis and the M. avium complex", Acta Leprol., Bd. 7, S. 249-251; S. S. Hurley et al., 1988, "Deoxyribonucleic acidrelatedness of Mycobacterium paratuberculosis to other members of the family Mycobacteriaceae", Int. J. Syst. Bacteriol., Bd. 38, S. 143-146), für das der Darmtrakt von Wiederkäuern einen möglichen Wirt darstellt.[0010]
• Bei Berücksichtigung der Kreuzreaktivität zwischen M. paratuberculosis und zahlreichen anderen Mycobakterien stellte es von vorneherein eine schwierige Aufgabe dar, ein Antigen mit einem Gehalt an spezifischen Epitopen zu finden, die leicht als Reagenzien für die Diagnose von Paratuberkulose verwendet werden können, wobei diese Reagenzien keine Kreuzreaktivität mit anderen, nahe verwandten Mycobakterien aufweisen sollen.[0011]
• Neben den vorerwähnten Aspekten in bezug auf Paratuberkulose bei Rindern wurde für M. paratuberculosis festgestellt, dass es eine ätiologische Rolle zumindest bei einigen Fällen der Crohn-Krankheit beim Menschen spielt.[0012]
• Die ursprünglich von Crohn und Mitarbeitern beschriebene Krankheit stellte eine chronische Ileitis unter Bildung von hyperplastischen Granulomen des Darms und der Lymphknoten dar. Das derzeit als Crohn-Krankheit bekannte Syndrom bringt entzündliche Veränderungen verschiedener Organe des Verdauungstrakts (Mund, Kehlkopf, Speiseröhre, Magen, Ileum und Kolon) mit sich. Abschnitte des Bewegungsapparats (Gelenke, Muskeln und Knochen) können ebenfalls betroffen sein. Über eine Isolierung von Mycobakterien aus Patienten mit Crohn- Krankheit wurde wiederholt berichtet: in mehreren Fällen wurden die Isolate als M. paratuberculosis identifiziert. Mit diesen Isolaten konnte erfolgreich bei Laboratoriumstieren und Primaten ein Syndrom, das der Crohn-Krankheit ähnlich ist, herbeigeführt werden. In einem vor kurzem erschienenen Übersichtsartikel (R. J. Chiodini, 1989, "Crohn's disease and the mycobacterioses: a review and comparison of two disease entities", Clin. Microbiol., Rev., Bd. 2, S. 90-117) stellt Chiodini die These auf, dass dieses Syndrom der Ausdruck mehrerer pathologischer Verursacher ist und zieht den Schluss, dass für den Fall, dass die Crohn-Krankheit eine mycobakterielle Ätiologie aufweist, M. paratuberculosis das wahrscheinlichste Agens darstellt.[0013]
• Derzeit wird erwartet, dass eine größere epidemiologische Untersuchung mit einem ELISA-Test auf der Grundlage eines spezifischen Proteins von M. paratuberculosis dazu beiträgt, das Problem der Ätiologie dieser Enteritis, die in zahlreichen Aspekten Ähnlichkeit mit der Johne- Krankheit von Vieh zeigt, zu lösen.[0014]
• Der Ausdruck "Vieh" bedeutet Wiederkäuer, wie Rinder, Schafe, Ziegen und Hirsche, schließt aber auch einige nicht wiederkäuende Tiere ein, die ebenfalls einer Infektion durch die Johne-Krankheit unterliegen können, wie Affen und Pferde.[0015]
• Ein Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von rekombinanten Polypeptiden, die als gereinigte Antigene für den Nachweis und die Bekämpfung von Paratuberkulose verwendet werden können.[0016]
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Nucleinsäuren, die für die Peptidketten von biologisch reinen rekombinanten Polypeptiden kodieren und deren Herstellung im Großmaßstab ermöglichen.[0017]
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Antigenen, die in serologischen Tests für eine rasche in vitro-Diagnose von Paratuberkulose sowie bei Hauttests für die in vivo-Diagnose von Paratuberkulose verwendet werden können.[0018]
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von rasch arbeitenden diagnostischen in vitro-Mitteln für Paratuberkulose, die es ermöglichen, zwischen an Tuberkulose leidendem Vieh und an Paratuberkulose leidendem Vieh zu unterscheiden.[0019]
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von rasch arbeitenden diagnostischen in vitro-Mitteln für Paratuberkulose, die es ermöglichen, zwischen Vieh, das an Paratuberkulose leidet, und Vieh, das mit M. avium, M. bovis oder M. tuberculosis oder M. phlei infiziert oder damit kolonisiert ist, zu unterscheiden.[0020]
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung von diagnostischen in vitro-Mitteln für Patienten, die an der Crohn-Krankheit leiden.[0021]
• Die Erfindung betrifft einen Antigenkomplex aus M. paratuberculosis, der nachstehend als "Antigen A36" bezeichnet wird und der auf folgende Weise erhalten werden kann:[0022]
• - Ultraschallbehandlung von bakteriellen Suspensionen von M. paratuberculosis unter Bildung eines Homogenisats (nachstehend auch als Sonicat bezeichnet),
• - Zentrifugation des vorerwähnten Homogenisats unter Bildung eines Überstands (der dem Cytoplasma der Bakterien entspricht),
• - RNAase-Verdau des vorerwähnten Überstands,
• - Fraktionierung des verdauten Überstands, beispielsweise durch Gelausschlußchromatographie, z. B. an Sepharose 6B-Säulen, und
• - Gewinnung des Antigenkomplexes (A36), bei dem es sich um die ausgeschlossene Fraktion der Fraktionierung handelt.
• [0023] Es ist darauf hinzuweisen, dass der vorstehend definierte Antigenkomplex dem TMA- Komplex (thermostabile makromolekulare Antigene) entspricht, der zur Familie von Komplexen gehört, die in sämtlichen Mycobakterien vorhanden sind und aus Lipid-, Polysaccharid- und Proteinresten bestehen oder diese enthalten.
• [0024] Der Proteinteil des erfindungsgemäßen Antigenkomplexes kann auf folgende Weise fraktioniert und sichtbar gemacht werden:
• - Fraktionierung der Proteine des vorerwähnten Antigenkomplexes durch Elektrophorese in einem Gel, z. B. in 10% Polyacrylamidgelen, wodurch man die Proteine in Bandenform erhält, und
• - Nachweis der Proteine durch Färbung, beispielsweise mit Coomassie-Blau.
• [0025] Die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten in ihrer Polypeptidkette:
• - die 101 Aminosäuren lange Aminosäuresequenz von Fig. 8,
• - oder ein Fragment dieser Sequenz, wobei das Fragment so beschaffen ist, dass es - von Antikörpern erkannt werden kann, die auch die vorgenannte 101 Aminosäuren lange Sequenz erkennen, jedoch nicht von Antikörpern gegen M bovis, M. avium, M. phlei und M tuberculosis erkannt wird,
• - Antikörper hervorrufen kann, die ebenfalls die vorgenannte 101 Aminosäuren lange Sequenz erkennen, jedoch nicht M. bovis, M. avium, M. phlel und M. tuberculosis erkennen und
• - mit Seren von Rindern, die an der Johne-Krankheit leiden, reagiert,
• - oder die durch Modifikation mittels Substitution und/oder Addition und/oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren entstandenen Polypeptidsequenzen, so lange diese Modifikation die vorgenannten Eigenschaften nicht ändert.
• [0026] Unter einer Erkennung von einer der vorerwähnten Fragmente durch die vorerwähnten Antikörper oder einer Erkennung der vorgenannten Sequenz von 101 Aminosäuren durch die vorerwähnten Antikörper ist zu verstehen, dass das vorerwähnte Fragment einen Komplex mit einem der vorgenannten Antikörper bilden kann.
• [0027] Die Bildung des Komplexes aus Antigen (d. h. die Sequenz von 101 Aminosäuren oder des vorgenannten Fragments) und Antikörper sowie der Nachweis des Vorliegens eines gebildeten Komplexes kann nach herkömmlichen Techniken durchgeführt werden, beispielsweise nach Techniken, die sich eines mit radioaktiven Isotopen oder mit einem Enzym markierten Markers bedienen.
• [0028] Nachstehend wird auch in nicht-beschränkender Weise ein Test zum Nachweis der Tatsache angegeben, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide selektiv vom Großteil der Seren von Vieh, das an der Johne-Krankheit leidet (immunodominante Polypeptide), z. B. von Rindern, erkannt werden.
• [0029] Bei diesem Test handelt es sich um eine Immunoblotting (Western-Blotting)-Analyse für den Fall, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide durch rekombinante Techniken erhalten werden. Dieser Test kann auch für die erfindungsgemäßen Polypeptide, die durch ein abweichendes Herstellungsverfahren erhalten worden sind, herangezogen werden. Nach Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden die erfindungsgemäßen Polypeptide auf Nitrocellulosemembranen (Hybond C. (Amersham)) gemäß den Angaben von H. Towbin et al., 1979, "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 76, S. 4350-4354, übertragen. Die Expression von erfindungsgemäßen Polypeptiden, die mit β-Galactosidase in E. coli Y1089 fusioniert sind, wird durch Bindung eines polyklonalen Kaninchen-anti-A36-Antiserums (oder eines polyklonalen Kaninchen-anti-Homogenisat-Antiserums gemäß der nachstehenden Definition in den Beispielen oder eines polyklonalen Kaninchen-anti-β-gal-p362-Antiserums gemäß der nachstehenden Definition in den Beispielen) (1 : 1000) oder unter Verwendung eines monoklonalen anti-β-Galactosidase-Antikörpers (Promega) sichtbar gemacht. Der sekundäre Antikörper (anti- Kaninchen-Immunoglobulin G bzw. anti-Mäuse-Immunoglobulin G, beide mit alkalischer Phosphatase konjugiert) wird gemäß den Angaben der Lieferfirma (Promega) verdünnt. Eine Farbreaktion entwickelt sich durch Zugabe von NBT/BCIP (Nitroblau-tetrazolium-5-brom-4-chlor- 3-indolylphosphat [Promega]) unter Anwendung der von der Lieferfirma empfohlenen Bedingungen.
• [0030] Um eine selektive Erkennung von erfindungsgemäßen Polypeptiden und von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen durch Seren von an der Johne-Krankheit leidenden Rindern zu identifizieren, werden Nitrocellulosefolien über Nacht mit jedem dieser Seren (1 : 50) (nach Blockierung von unspezifischen Proteinbindungsstellen) inkubiert.
• [0031] Reaktive Bereiche auf den Nitrocellulosefolien zeigen sich durch Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Rind-Immunoglobulin G-Antikörper (Dakopatts, Kopenhagen, Dänemark) (1 : 200) bei 4-stündiger Inkubationszeit und nach wiederholtem Waschen, wobei die Farbreaktion durch Zugabe von α-Chlornaphthol (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid entwickelt wird.
• [0032] Die Nichterkennung von Antikörpern gegen die vorerwähnten erfindungsgemäßen Fragmente durch M. bovis, M. avium, M. phlei und M. tuberculosis und durch andere Mycobakterien kann nach einem Verfahren, das in den Beispielen ausführlich erläutert wird, gezeigt werden.
• [0033] Was die Nichterkennung der vorerwähnten erfindungsgemäßen Fragmente durch Antikörper gegen M. bovis, M. avium, M. phlei und M. tuberculosis oder andere Mycobakterien betrifft, so kann dies ebenfalls nach einem Verfahren, das ausführlich in den Beispielen erläutert wird, gezeigt werden.
• [0034] Der Hinweis erübrigt sich, dass die freien reaktiven Funktionen, die an einigen der Aminosäuren, die Bestandteil der erfindungsgemäßen Polypeptide sind, insbesondere die freien Carboxylgruppen, die sich an den Gruppen Glu und Asp oder an der C-terminalen Aminosäure befinden, und/oder die freien NH&sub2;-Gruppen, die sich an der N-terminalen Aminosäure oder an den Aminosäuren im Innern der Peptidkette, z. B. Lys, befinden, modifiziert werden können, so lange diese Modifikation nicht die vorerwähnten Eigenschaften des Polypeptids ändert.
• [0035] Selbstverständlich sind auch die auf diese Weise modifizierten Moleküle Gegenstand der Erfindung. Die vorerwähnten Carboxylgruppen können acyliert oder verestert sein. [0036] Weitere Modifikationen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Insbesondere können die Amin- und/oder Carboxylfunktionen von terminalen Aminosäuren selbst an der Bindung mit anderen Aminosäuren beteiligt sein. Beispielsweise kann die N-terminale Aminosäure mit der C-terminalen Aminosäure eines weiteren Peptids, das 1 bis mehrere Aminosäuren umfasst, verknüpft sein.
• [0037] Ferner sind beliebige Peptidsequenzen, die sich aufgrund der Modifikation durch Substitution und/oder Addition und/oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren der erfindungsgemäßen Polypeptide ergeben, Teil der Erfindung, so lange diese Modifikation nicht die vorerwähnten Eigenschaften der Polypeptide ändert.
• [0038] Die erfindungsgemäßen Polypeptide können glycosyliert sein oder nicht, insbesondere an einigen ihrer Glycosylierungsstellen des Typs Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr, wobei X eine beliebige Aminosäure bedeutet.
• [0039] Ein vorteilhaftes rekombinantes Polypeptid der Erfindung ist aus der in Fig. 8 dargestellten Sequenz zusammengesetzt, die sich von dem durch die Aminosäure an der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem von der Aminosäure an der 101-Stellung gebildeten Ende erstreckt, oder sich aus den folgenden Peptiden zusammensetzt:
• (Stellung 1 bis 11 in Fig. 8)
• (Stellung 85 bis 101 in Fig. 8).
• [0040] Es ist darauf hinzuweisen, dass sich dieses Polypeptid vom Expressionsprodukt einer DNA ableitet, die sich wiederum von der Nucleotidsequenz ableitet, die für ein Polypeptid mit 10 kDa kodiert, bei dem es sich um den carboxyterminalen Teil eines 34 kDa-Proteins von M. paratuberculosis gemäß der nachstehenden Definition handelt.
• [0041] Ein vorteilhaftes rekombinantes Polypeptid der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es:
• - die 101 Aminosäuren lange Sequenz von Fig. 8 als C-terminalen Teil enthält,
• - über ein Molekulargewicht von ungefähr 34 kDa in der SDS-PAGE verfügt,
• - von einer Nucleotidsequenz kodiert wird, die mit dem Komplementärstrang der Nucleotidsequenz von Fig. 11 hybridisieren kann,
• - mit Seren von Vieh, das an der Johne-Krankheit leidet, reagiert und
• - bei sensibilisierten Subjekten eine Zellimmunreaktion hervorrufen kann.
• [0042] Bei den "Subjekten" kann es sich entweder um Testtiere, wie Mäuse oder Meerschweinchen, oder um Rinder oder um Menschen handeln.
• [0043] "Sensibilisiert" bedeutet, dass diese Subjekte vorher in Kontakt mit M. paratuberculosis gekommen sind, was zu einer Anregung des Zellimmunsystems führt.
• [0044] Eine Sensibilisierung kann durch Impfen der Subjekte mit abgetötetem oder abgeschwächtem M. paratuberculosis herbeigeführt werden oder sie kann sich aus einer natürlichen Infektion mit M. paratuberculosis ergeben.
• [0045] Eine positive Zellimmunreaktion auf die erfindungsgemäßen Polypeptide kann beispielsweise in vivo durch eine verzögerte Hypersensibilitätsreaktion beim Hauttest mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden oder in vitro durch eine Vermehrung von peripheren Blutlymphozyten, die aus sensibilisierten Subjekten isoliert worden sind, in Reaktion auf die zugesetzten Polypeptide nachgewiesen werden.
• [0046] Ein vorteilhaftes rekombinantes Polypeptid der Erfindung enthält die Aminosäuresequenz von Fig. 11 oder ist aus dieser zusammengesetzt.
• [0047] Ein weiteres vorteilhaftes rekombinantes Polypeptid der Erfindung enthält die Aminosäuresequenz, die sich von der 1-Stellung bis zur 199-Stellung von Fig. 11 erstreckt, oder besteht aus dieser.
• [0048] Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei diesem Polypeptid um ein 34 kDa-Protein handelt, das im Proteinteil des TMA-Komplexes von M. paratuberculosis (A36) vorhanden ist.
• [0049] Nachstehend wird in nicht-beschränkenden Weise ein Verfahren zur Herstellung dieses 34 kDa-Proteins der Erfindung angegeben.
• [0050] Die DNA-Sequenz (306 bp), die für p362, bei dem es sich um das carboxyterminale Ende des 34 kDa-Proteins handelt, kodiert, wurde bestimmt (vergl. Fig. 8). Es enthält eine einzige Apal (GGGCCC)-Stelle in der 141-Stellung.
• [0051] Unter Verwendung dieser Information lässt sich das vollständige Gen, das für das 34 kDa-Protein kodiert, auf folgende Weise isolieren:
• [0052] Ein Oligonucleotid, das für eine Folge von mindestens 30 bp innerhalb der Region EcoRI-ApaI (1-141 bp) der bekannten Sequenz kodiert, wird synthetisiert.
• [0053] Dieses Oligonucleotid wird markiert und als Sonde zur Hybridisierung der DNA von M paratuberculosis (Stamm ATCC 19698) verwendet, wobei diese DNA vorher mit Apal geschnitten, durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt, denaturiert und auf eine Nylonmembran übertragen worden ist.
• [0054] Diese Hybridisierung zeigt eine Bande auf der Nylonmembran mit etwa 1500 bp, die den kodierenden Teil des Restes des 34 kDa-Proteins enthält. Nach Lokalisierung dieses 1500 bp- Fragments, das von 2 Apal-Stellen flankiert ist, im Agarosegel, wird es aus dem Gel isoliert, gereinigt und in die Apal-Stelle des Sequenzierungsvektors pBluescript SK&spplus; subkloniert.
• [0055] Nach Sequenzierung dieses Fragments wird die Kodierungsregion, beginnend mit dem Initiationscodon ATG oder GTG, skizziert. Unter Verwendung einer Restriktionsstelle in der Nähe des Initiationscodons (5'-Ende), die natürlicherweise vorhanden ist oder durch positionsgerichtete Mutagenese geschaffen worden ist, und der ApaI-Stelle am 3'-Ende wird das DNA-Fragment, das für den N-terminalen Teil des Proteins (etwa 750 bp) kodiert, aus pBluescript SK&spplus; geschnitten und gereinigt. Es wird mit der Apal-Stelle des Fragments verknüpft, das für den C-terminalen Teil von p362 (142-306, Fig. 8) kodiert, das beispielsweise synthetisch hergestellt worden ist.
• [0056] Das vollständige Gen, das für das 34 kDa-Protein (etwa 910 bp) kodiert, wird in einen Expressionsvektor subkloniert und in E. coli exprimiert. Das rekombinante 34 kDa-Protein wird sodann gereinigt.
• [0057] Die Erfindung betrifft auch die Aminosäuresequenzen, die sich aus den vorerwähnten Polypeptiden und einem Protein oder einer zu diesem Polypeptid heterologen Sequenz zusammensetzen, wobei das Protein oder die heterologe Sequenz z. B. ungefähr 1 bis ungefähr 1100 Aminosäuren umfasst. Diese Aminosäuresequenzen werden nachstehend als Fusionsproteine bezeichnet.
• [0058] In einem vorteilhaften Fusionsprotein der Erfindung handelt es sich bei dem heterologen Protein um β-Galactosidase.
• [0059] Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie folgendes enthält oder aus folgendem zusammengesetzt ist:
• - eine Nucleotidkette, die mit der für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden Nucleotidkette hybridisieren kann und die selbst für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, oder
• - eine Nucleotidkette, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, oder
• - die zu den vorstehenden Nucleotidketten komplementären Sequenzen.
• [0060] Die vorerwähnte Hybridisierung kann unter den folgenden Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden:
• - Hybridisierungs- und Waschmedium:
• - ein bevorzugtes Hybridisierungsmedium enthält etwa 3 · SSC [SSC = 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7], etwa 25 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,1, und 20% entionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, 0,02% Polyvinylpyrrolidon und etwa 0,1 mg/ml einer scherbehandelten denaturierten Lachssperma-DNA,
• - ein bevorzugtes Waschmedium enthält etwa 3 · SSC, etwa 25 mM Phosphatpuffer, pH- Wert 7,1, und 20% entionisiertes Formamid;
• - die Hybridisierungstemperatur (HT) und die Waschtemperatur (WT) für die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren sind definiert durch x - y, d. h. durch die Sequenz, die sich von dem durch das Nucleotid in x-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in y- Stellung gebildeten Ende gemäß der Darstellung in den Figg. 7A, 7B oder 7C erstreckt:
• 1-306 (für Figg. 7B und 7C)
• HT = WT = 65ºC
• 1-307 (für Fig. 7A)
• 1-507 (für Figg. 7B und 7C)
• HT = WT = 65ºC
• 1-508 (für Fig. 7A)
• [0061] Die vorerwähnten Temperaturen gelten mit einer Genauigkeit von etwa ±5ºC.
• [0062] Es ist darauf hinzuweisen, dass in den vorstehend definierten Nucleinsäuren sowie in den nachstehend definierten Nucleinsäuren die betroffenen Nucleotidsequenzen so beschaffen sind, dass T durch U ersetzt werden kann.
• [0063] Eine Gruppe von bevorzugten Nucleinsäuren der Erfindung umfasst mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen:
• - die Sequenz, die sich von dem durch das Nucleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in der 307-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7A erstreckt,
• - die Sequenz, die sich von dem durch das Nucleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in der 508-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7A erstreckt, wobei
• - X und E Phosphodiesterbindungen darstellen,
• - Y und F G bzw. C darstellen,
• - Z und H C bzw. G darstellen, oder
• - X und E G bzw. C darstellen,
• - Y und F C bzw. G darstellen und
• Z und H Phosphodiesterbindungen darstellen.
• [0064] Eine Gruppe von bevorzugten Nucleinsäuren der Erfindung umfasst mindestens eine der folgenden Nucleotidsequenzen:
• - die Sequenz, die sich von dem durch das Nucleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in der 306-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7B erstreckt,
• - die Sequenz, die sich von dem durch das Nucleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in der 507-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7B erstreckt.
• [0065] Die Nucleotidsequenz gemäß der Darstellung in Fig. 7B entspricht der in Fig. 7A wiedergegebenen Struktur, wobei
• - X und E Phosphodiesterbindungen darstellen,
• - Y und F G bzw. C darstellen und
• - Z und H C bzw. G darstellen.
• [0066] Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie folgendes enthält bzw. aus folgendem besteht:
• - eine Nucleotidkette,
• - die sich von dem durch das Nucleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in der 306-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7C erstreckt oder
• - die sich von dem durch das Nucleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nucleotid in der 507-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7C erstreckt.
• [0067] Die in Fig. 7C dargestellte Nucleotidsequenz entspricht der in Fig. 7A wiedergegebenen Sequenz, wobei
• - X und E G bzw. C darstellen,
• - Y und F C bzw. G darstellen und
• - Z und H Phosphodiesterbindungen darstellen.
• [0068] Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäure, die folgendes enthält bzw. aus folgendem zusammengesetzt ist:
• eine Nucleotidsequenz, die leicht einer Hybridisierung mit dem komplementären Strang der Nucleotidsequenz von Fig. 11 oder mit dem komplementären Strang der Nucleotidsequenz, die sich vom Nucleotid in der 742-Stellung bis zum Nucleotid in der 1338-Stellung von Fig. 1 l erstreckt, unterliegt,
• - die Nucleotidsequenz von Fig. 11 oder die Nucleotidsequenz, die sich vom Nucleotid in der 742-Stellung bis zum Nucleotid in der 1338-Stellung von Fig. 11 erstreckt,
• - die komplementären Sequenzen der vorstehend definierten Nucleotidsequenzen.
• [0069] Aus den erfindungsgemäßen Nucleinsäuren lassen sich Sonden (d. h. klonierte oder synthetische Oligonucleotide) ableiten.
• [0070] Diese Sonden könne eine Anzahl von 15 Nucleotiden bis zur maximalen Anzahl der Nucleotide der ausgewählten Nucleinsäuren aufweisen. Die Oligonucleotide können auch als Amplifikationsprimer bei der PCR-Technik (PCR, Mullis und Faloona, Methods in Enzymology, Bd. 155 (1987), S. 335) zur Erzeugung von spezifischen, enzymatisch amplifizierten Fragmenten und/oder als Sonden zum Nachweis von Fragmenten, die zwischen eine Klammer bildenden Oligonucleotidprimern amplifiziert sind, verwendet werden.
• [0071] Die Spezifität eines PCR-unterstützten Hybridisierungstests lässt sich auf verschiedenen Niveaus steuern.
• [0072] Das Amplifikationsverfahren oder das Nachweisverfahren oder beide können spezifisch sein. Der letztgenannte Fall, der eine höhere Spezifität ergibt, wird bevorzugt.
• [0073] Die Erfindung betrifft auch beliebige rekombinante Nucleinsäuren, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren enthalten, die mit einer heterologen Nucleinsäure kombiniert oder in eine heterologe Nucleinsäure inseriert sind.
• [0074] Die Erfindung betrifft insbesondere eine rekombinante Nucleinsäure gemäß der gegebenen Definition, in der der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz ein Promotor (insbesondere ein induzierbarer Promotor) vorausgeht, unter dessen Kontrolle die Transkription dieser Sequenz leicht abläuft, wonach gegebenenfalls eine Sequenz, die für Transkriptionsterminationssignale kodiert, folgt.
• [0075] Die Erfindung betrifft auch die rekombinanten Nucleinsäuren, bei denen die Nucleinsäuresequenzen, die für das erfindungsgemäße Polypeptid und gegebenenfalls das Signalpeptid kodieren, mit Kontrollelementen rekombiniert sind, die in bezug zu den Sequenzen, mit denen sie normalerweise im mycobakteriellen Genom assoziiert sind, heterolog sind, und insbesondere mit den Regulationselementen, die zur Steuerung ihrer Expression im zellulären Wirt, der für ihre Bildung gewählt worden ist, geeignet ist.
• [0076] Die Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren, insbesondere für Klonierungs- und/oder Expressionszwecke, mit einer Vektorsequenz, insbesondere vom Plasmid-, Cosmid-, Phagen- oder Virus-DNA-Typ, sowie einer rekombinanten Nucleinsäure der Erfindung, die in eine der für ihre Replikation nicht wesentlichen Stellen inseriert ist.
• [0077] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der rekombinante Vektor die erforderlichen Elemente zur Förderung der Expression von Polypeptiden in einer Wirtszelle, die von in diesen Vektor inserierten erfindungsgemäßen Nucleinsäuren kodiert werden, und insbesondere einen Promotor, der durch die RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannt wird, speziell einen induzierbaren Promotor, und gegebenenfalls eine für Transkriptionsterminationssignale kodierende Sequenz und gegebenenfalls eine Signalsequenz und/oder eine Ankersequenz.
• [0078] Gemäß einer weiteren zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung enthält der rekombinante Vektor die Elemente, die die Expression eines Fusionsproteins, das aus dem Polypeptid von β-Galactosidase oder einem Teil hiervon besteht, das mit einem von einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure kodierten Polypeptid verbunden ist, durch E. coli gestattet.
• [0079] Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die aus Bakterien, wie E. coli, oder aus Eukaryonten, wie CHO-Zellen oder Insektenzellen ausgewählt ist und mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert ist und die Regulationselemente, die die Expression der für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierenden Nucleotidsequenz in diesem Wirt gestatten, enthält.
• [0080] Die Erfindung betrifft auch ein Expressionsprodukt einer von einer erfindungsgemäßen transformierten Wirtszelle exprimierten Nucleinsäure.
• [0081] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Polypeptids, das die folgenden Schritte umfasst:
• - Züchtung einer Wirtszelle, die zuvor mit einem geeigneten Vektor, der eine erfindungsgemäße Nucleinsäure enthält, transformiert worden ist, in einem geeigneten Medium,
• - Gewinnung des durch die vorgenannte transformierte Wirtszelle gebildeten Polypeptids aus dem vorgenannten Kulturmedium oder aus der Wirtszelle und
• - gegebenenfalls Reinigung des gebildeten Polypeptids, gegebenenfalls mittels immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC).
• [0082] Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich nach klassischen Verfahren auf dem Gebiet der Polypeptidsynthese herstellen.
• [0083] Die Synthese kann in homogener Lösung oder in fester Phase durchgeführt werden.
• [0084] Beispielsweise handelt es sich bei der Synthesetechnik in homogener Lösung, die herangezogen werden kann, um die von Houben-Weyl in "Methoden der Organischen Chemie", Hrsg. E. Wünsch, Bd. 15-I und II, THIEME-Verlag, Stuttgart 1974, beschriebene Technik.
• [0085] Die erfindungsgemäßen Polypeptide lassen sich auch in fester Phase gemäß dem von Atherton & Shepard in "Solid phase peptide synthesis" (Hrsg. IRL Press, Oxford, NY, Tokyo, 1989) beschriebenen Verfahren herstellen.
• [0086] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren.
• [0087] Ein geeignetes Verfahren zur chemischen Herstellung der einzelsträngigen Nucleinsäuren (mit einem Gehalt an mindestens 100 erfindungsgemäßen Nucleotiden) umfasst den folgenden Schritt:
• - DNA-Synthese unter Anwendung des automatisierten β-Cyanoethylphosphoramidit- Verfahrens gemäß Bioorganic Chemistry, Bd. 4 (1986), S. 274-325.
• [0088] Im Fall von einzelsträngiger DNA kann das Material, das am Ende der DNA-Synthese erhalten wird, direkt als solches verwendet werden.
• [0089] Ein geeignetes Verfahren zur chemischen Herstellung der doppelsträngigen Nucleinsäuren (mit einem Gehalt an mindestens 100 bp der Erfindung) umfasst die folgenden Schritte:
• - DNA-Synthese eines sense-Oligonucleotids unter Anwendung des in Bioorganic Chemistry, Bd. 4 (1986), S. 274-325, beschriebenen automatisierten β-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahrens und DNA-Synthese eines antisense-Oligonucleotids unter Anwendung des vorerwähnten automatisierten β-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahrens,
• - Vereinigen der sense- und antisense-Oligonucleotide durch Hybridisierung unter Bildung eines DNA-Duplex und
• Klonieren des erhaltenen DNA-Duplex in einen geeigneten Plasmidvektor und Gewinnen der DNA nach herkömmlichen Verfahren, wie Restriktionsenzymverdau und Agarosegel- Elektrophorese.
• [0090] Ein Verfahren zur chemischen Herstellung von Nucleinsäuren mit einer Länge von mehr als 100 Nucleotiden - oder bp im Fall von doppelsträngigen Nucleinsäuren - umfasst die folgenden Stufen:
• - Zusammensetzen von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden, die an ihren Enden mit verschiedenen Restriktionsstellen versehen sind, wobei die Sequenzen mit der Folge von Aminosäuren im natürlichen Peptid übereinstimmen, gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80 (1983), S. 7461-7465, beschriebenen Prinzip und
• - Klonieren der dadurch erhaltenen DNA in einen geeigneten Plasmidvektor und Gewinnen der gewünschten Nucleinsäure nach herkömmlichen Verfahren, wie Restriktionsenzymverdau und Agarosegel-Elektrophorese.
• [0091] Die Erfindung betrifft auch die gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide gebildeten Antikörper selbst, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie weder M. bovis noch M avium noch M. phlei noch M tuberculosis erkennen.
• [0092] Selbstverständlich ist diese Herstellung nicht auf polyklonale Antikörper beschränkt.
• [0093] Die Erfindung betrifft auch beliebige monoklonale, durch beliebige Hybridome erzeugte Antikörper wobei die Hybridome nach herkömmlichen Verfahren aus Milzzellen eines Tiers, insbesondere von Mäusen oder Ratten, das mit dem erfindungsgemäßen gereinigten Polypeptid immunisiert worden ist, einerseits und aus einer Myelom-Zelllinie andererseits gebildet worden sind und aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erzeugung der monoklonalen Antikörper, die das ursprünglich zur Immunisierung der Tiere herangezogene Polypeptid erkennen, ausgewählt sind.
• [0094] Die Erfindung betrifft auch beliebige erfindungsgemäße Antikörper, die mit einer geeigneten Markierung vom enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Typ markiert sind.
• [0095] Beim Polypeptid, das vorteilhafterweise zur Erzeugung von Antikörpern und insbesondere von monoklonalen Antikörpern verwendet wird, handelt es sich um das Peptid (oder einen Teil davon), das sich von dem durch die Aminosäure in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch die Aminosäure in der 101-Stellung gebildeten Ende von Fig. 8 erstreckt.
• [0096] Variationen dieses Peptids sind ferner je nach dem vorgesehenen Anwendungszweck möglich. Wenn beispielsweise das Peptid zur Erzeugung von Antiseren verwendet werden soll, kann das Peptid unter Hinzufügung eines zusätzlichen Cysteinrestes synthetisiert werden. Dieser zusätzliche Cysteinrest wird vorzugsweise am Aminoende hinzugefügt und erleichtert die Kupplung des Peptids an ein Trägerprotein, das erforderlich ist, um dem kleinen Peptid eine immunogene Beschaffenheit zu verleihen. Wenn das Peptid zur Verwendung in Radioimmunoassays markiert werden soll, kann es vorteilhaft sein, das Protein so zu synthetisieren, dass ein Tyrosin entweder am Amino- oder am Carboxylende gebunden ist, um die Iodierung zu erleichtern. Dieses Peptid besitzt somit die primäre Sequenz des vorerwähnten Peptids, wobei aber zusätzliche Aminosäuren vorhanden sind, die in der primären Sequenz des Proteins nicht auftauchen und deren einzige Funktion darin besteht, dem Peptid die gewünschten chemischen Eigenschaften zu verleihen.
• [0097] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum in vitro-Nachweis von mit Paratuberkulose in Zusammenhang stehenden Antikörpern in einer biologischen Probe eines Tiers, wobei die Probe möglicherweise diese Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
• - Kontaktieren der biologischen Probe mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Peptid oder dem erfindungsgemäßen Expressionsprodukt unter Bedingungen, die eine immunologische in vitro-Reaktion zwischen dem Polypeptid und den Antikörpern, die möglicherweise in der biologischen Probe vorhanden sind, ermöglichen und
• - in vitro-Nachweis des Antigen/Antikörper-Komplexes, der möglicherweise gebildet worden ist.
• [0098] Vorzugsweise besteht das biologische Medium aus einem tierischen Serum und insbesondere aus Rinderserum.
• [0099] Der Nachweis kann nach beliebigen herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden.
• [0100] Eine bevorzugte Methode bedient sich beispielsweise eines immunoenzymatischen Verfahrens gemäß der ELISA-Technik oder eines immunofluoreszierenden oder radioimmunologischen (RIA)-Verfahrens oder äquivalenter Verfahren.
• [0101] Somit betrifft die Erfindung auch beliebige erfindungsgemäße Polypeptide, die mit einer geeigneten Markierung des enzymatischen, fluoreszierenden, radioaktiven oder ähnlichen Typs markiert sind.
• [0102] Ein derartiges Verfahren zum in vitro-Nachweis von mit Paratuberkulose in Zusammenhang stehenden Antikörpern umfasst beispielsweise die folgenden Schritte:
• - Einbringen vorbestimmter Mengen einer erfindungsgemäßen Polypeptidzusammensetzung in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte,
• - Zuführen steigender Verdünnungen des zu diagnostizierenden Serums in die Vertiefungen,
• - Inkubieren der Mikrotiterplatte,
• - wiederholtes Spülen der Mikrotiterplatte,
• - Zuführen von markierten Antikörpern gegen die Blut-Immunoglobuline in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte,
• - wobei die Markierung dieser Antikörper auf der Aktivität eines Enzyms beruht, das unter Enzymen ausgewählt ist, die zur Hydrolyse eines Substrats unter Modifikation der Strahlungsabsorption dieses Substrats bei mindestens einer gegebenen Wellenlänge befähigt sind, und
• - Nachweisen der Menge des hydrolysierten Substrats durch Vergleich mit einem Kontrollstandard.
• [0103] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum in vitro-Nachweisen und Identifizieren von M. paratuberculosis in einer biologischen Probe, die möglicherweise diese Antigene enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
• - Kontaktieren der biologischen Probe mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die eine immunologische in vitro-Reaktion zwischen dem Antikörper und den Antigenen von M. paratuberculosis, die möglicherweise in der biologischen Probe enthalten sind, gestatten und
• - in vitro-Nachweis des möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes.
• [0104] Vorzugsweise besteht das biologische Medium aus Serum, Faeces, Milch oder Urin, vorzugsweise bovinen Ursprungs.
• [0105] Bei geeigneten Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um monoklonale Antikörper gegen das vorerwähnte Peptid.
• [0106] Die Erfindung betrifft auch ein weiteres Verfahren für die in vitro-Diagnose von Paratuberkulose in einem Tier, das möglicherweise mit Mycobacterium paratuberculosis infiziert ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
• - Kontaktieren einer dem Tier entnommenen biologischen Probe mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Peptid oder dem erfindungsgemäßen Expressionsprodukt unter Bedingungen, die eine immunologische in vitro-Reaktion zwischen dem Polypeptid oder Peptid und den Antikörpern, die möglicherweise in der biologischen Probe vorhanden sind, gestatten, und
• - in vitro-Nachweis des möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes.
• [0107] Zur Durchführung des diagnostischen in vitro-Verfahrens für Paratuberkulose in einem Tier, das möglicherweise mit Mycobacterium paratuberculosis infiziert ist, kann das folgende Bedarfsmaterial oder Kit (Testpackung) verwendet werden, das folgendes umfasst:
• - ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Peptid oder das erfindungsgemäße Expressionsprodukt,
• - Reagenzien zur Herstellung eines Mediums, das sich für den Ablauf der immunologischen Reaktion eignet,
• - Reagenzien, die den Nachweis des Antigen/Antikörper-Komplexes, der durch die immunologische Reaktion gebildet worden ist, ermöglicht, wobei die Reagenzien möglicherweise eine Markierung aufweisen oder von einem markierten Reagenz erkannt werden können, insbesondere dann, wenn das vorerwähnte Polypeptid oder Peptid nicht markiert ist.
• [0108] Die Erfindung betrifft auch ein weiteres Verfahren für die in vitro-Diagnose von Paratuberkulose bei einem Tier, das möglicherweise durch M. paratuberculosis infiziert ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
• - Kontaktieren einer biologischen Probe des Tiers mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die eine immunologische in vitro-Reaktion zwischen dem Antikörper und den Antigenen von M. paratuberculosis, die möglicherweise in der biologischen Probe vorhanden sind, gestatten, und
• - in vitro-Nachweis des möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes.
• [0109] Zur Durchführung des diagnostischen in vitro-Verfahrens für Paratuberkulose in einem möglicherweise mit Mycobacterium paratuberculosis infizierten Tier kann das folgende Bedarfsmaterial oder Kit verwendet werden, das folgendes umfasst:
• - einen erfindungsgemäßen Antikörper,
• - Reagenzien zur Herstellung eines fir den Ablauf der immunologischen Reaktion geeigneten Mediums und
• - Reagenzien, die den Nachweis der Antigen/Antikörper-Komplexe, die durch die immunologische Reaktion gebildet worden sind, gestatten, wobei das Reagenz möglicherweise eine Markierung aufweist oder durch ein markiertes Reagenz erkannt werden kann, insbesondere dann, wenn der vorerwähnte Antikörper nicht markiert ist.
• [0110] Ein vorteilhaftes Kit für die in vitro-Diagnose von Paratuberkulose umfasst folgendes:
• - mindestens ein geeignetes Festphasensystem, z. B. eine Mikrotiterplatte, worauf die der in vitro-Diagnose zu unterziehende biologische Probe aufgebracht werden kann,
• - ein Präparat, das einen der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper enthält,
• - ein spezifisches Nachweissystem für diesen monoklonalen Antikörper und
• - geeignete Pufferlösungen zur Durchführung der immunologischen Reaktion zwischen einer Testprobe und dem monoklonalen Antikörper einerseits sowie den gebundenen monoklonalen Antikörpern und dem Nachweissystem andererseits.
• [0111] Die Erfindung betrifft auch ein Kit gemäß den vorstehenden Angaben, das ferner ein Präparat eines der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Peptide enthält, wobei es sich beim erfindungsgemäßen Antigen entweder um einen Standard (für die quantitative Bestimmung des gesuchten Antigens von M. paratuberculosis) oder um einen Konkurrenten in bezug auf das gesuchte Antigen für die Verwendung des Kits in einem kompetitiven Dosierungsverfahren handelt.
• [0112] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die in vitro-Diagnose der Crohn- Krankheit bei einem möglicherweise durch Mycobacterium paratuberculosis infizierten Patienten, das die folgenden Schritte umfasst:
• - Kontaktieren der biologischen Probe mit einem geeigneten erfindungsgemäßen Antikörper unter Bedingungen, die eine immunologische in vitro-Reaktion zwischen dem Antikörper und den Antigenen von M paratuberculosis, die möglicherweise in der biologischen Probe vorhanden sind, gestatten und
• - in vitro-Nachweis des möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes.
• [0113] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die in vitro-Diagnose der Crohn- Krankheit bei einem möglicherweise durch M. paratuberculosis infizierten Patienten, das die folgenden Schritte umfasst:
• - Kontaktieren einer dem Patienten entnommenen biologischen Probe mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Peptid oder dem erfindungsgemäßen Expressionsprodukt unter Bedingungen, die eine immunologische in vitro-Reaktion zwischen dem Polypeptid und den Antikörpern, die möglicherweise in der biologischen Probe vorhanden sind, gestatten und
• - in vitro-Nachweis des möglicherweise gebildeten Antigen/Antikörper-Komplexes.
• [0114] Die Erfindung betrifft auch ein Bedarfsmaterial oder Kit (Testpackung) für ein in vitro-Diagnoseverfahren der Crohn-Krankheit bei einem möglicherweise durch Mycobacterium paratuberculosis infizierten Patienten, wobei das Kit folgendes umfasst:
• - einen erfindungsgemäßen Antikörper,
• - Reagenzien zur Herstellung eines für den Ablauf der immunologischen Reaktion geeigneten Mediums und
• - Reagenzien, die den Nachweis der Antigen/Antikörper-Komplexe, die durch die immunologische Reaktion gebildet worden sind, gestatten, wobei diese Reagenzien möglicherweise eine Markierung aufweisen oder durch ein markiertes Reagenz erkannt werden können, insbesondere dann, wenn der vorerwähnte Antikörper nicht markiert ist.
• [0115] Die Erfindung betrifft auch ein Bedarfsmaterial oder Kit für ein in vitro- Diagnoseverfahren der Crohn-Krankheit bei einem Patienten, der möglicherweise durch Mycobacterium paratuberculosis infiziert ist, wobei das Kit folgendes umfasst:
• - ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Peptid oder das erfindungsgemäße Expressionsprodukt,
• - Reagenzien zur Herstellung eines zum Ablauf der immunologischen Reaktion geeigneten Mediums und
• - Reagenzien, die den Nachweis des Antigen/Antikörper-Komplexes, der durch die immunologische Reaktion gebildet worden ist, gestatten, wobei die Reagenzien möglicherweise eine Markierung aufweisen oder durch ein markiertes Reagenz erkannt werden können, insbesondere dann, wenn das vorerwähnte Polypeptid nicht markiert ist.
• [0116] Die Erfindung betrifft auch eine immunogene Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Peptid oder das erfindungsgemäße Expressionsprodukt zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
• [0117] Die Erfindung betrifft auch ein Bedarfsmaterial oder Kit (Testpackung) für die Diagnose einer früheren Belastung eines Tiers mit M. paratuberculosis, wobei das Bedarfsmaterial oder Kit ein Präparat mindestens eines der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Peptide oder des erfindungsgemäßen Expressionsprodukts enthält, wobei das Präparat befähigt ist, nach intradermaler Injektion in ein Tier an der Injektionsstelle eine Spättyp- Überempfindlichkeitsreaktion in vivo hervorzurufen, falls das Tier zuvor mit M. paratuberculosis in Berührung gekommen ist.
• [0118] Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen und Figuren, die die Erfindung erläutern.
Erläuterung der Figuren
• [0119]
• - Fig. 1(1) zeigt die zweidimensionale Kreuzimmunoelektrophorese (CIE) von Gesamtcytoplasma (die nach Zentrifugation des Sonicats erhaltene Überstandsfraktion) von M. paratuberculosis und Fig. 1(2) zeigt die zweidimensionale Kreuzimmunoelektrophorese der durch Gelausschlußchromatographie des gleichen Cytoplasmas erhaltenen Ausschlussfraktion.
• In der zweiten Dimension (in der Figur in Aufwärtsrichtung) erfolgte die Wanderung in einem Gel mit einem Gehalt an Kaninchen-Antiserum gegen das mycobakterielle Sonicat. Die Präparationen in 1 und 2 enthielten 10 ug Proteine. Diese Figur identifiziert den TMA-Komplex von M. paratuberculosis (A36), der in der Ausschlussfraktion vorhanden ist.
• Fig. 2 zeigt die serologische Analyse von mit Polypeptid p362 infizierten Tieren. Platten mit zahlreichen Vertiefungen wurden mit 4 ug Protein/Vertiefung E. coli-a362-Gesamtcytoplasma (weiß) oder E. coli-Kontroll-Gesamtcytoplasma (schwarz) beschichtet. Proben von verdünnten (1/400) Rinderseren, die vorher durch Inkubation mit E coli-Kontrollhomogenisat (dieses Homogenisat und das Gesamtcytoplasma wurden auf die gleiche Weise wie das M. paratuberculosis-Homogenisat und -Gesamtcytoplasma, wie vorstehend beschrieben, erhalten) erschöpft worden waren, wurden zugegeben, wonach sich ein Waschvorgang, die Inkubation mit markiertem anti-Rinder-Ig und Peroxidasereagenzien und die spektrophotometrische Ablesung bei 450 nm anschlossen.
• Die folgenden Seren wurden verwendet: asymptomatische, nicht-exkretorische (Probe 1), asymptomatische, exkretorische (Proben 2 bis 13), symptomatische, exkretorische (Proben 14 bis 24) und gesunde Rinder (Proben 26 bis 32).
• Fig. 3 zeigt die serologische Analyse von infizierten Tieren mit einem Immunoassay auf der Basis von A36.
• Platten mit zahlreichen Vertiefungen wurden mit vergleichbaren Mengen (0,5 ug Gesamtprotein/Vertiefung) M. paratuberculosis-Gesamtcytoplasma (schwarz), A36 (weiß) und B. subtilis-Gesamtcytoplasma (Kontrolle: schraffiert) beschichtet. Proben von verdünnten (1/400) Rinderseren; die vorher durch Inkubation mit B. subtilis-Homogenisat (dieses Homogenisat und das Gesamtcytoplasma wurden auf die gleiche Weise wie das M. paratuberculosis-Homogenisat und -Gesamtcytoplasma, wie vorstehend beschrieben, erhalten) erschöpft worden waren, wurden zugegeben, wonach sich ein Waschvorgang, die Inkubation mit markiertem anti-Rinder-Ig und Peroxidasereagenzien und die spektrophotometrische Ablesung bei 450 nm anschlossen. Die folgenden Rinderseren wurden verwendet: a) symptomatisch-exkretorische Formen von Paratuberkulose (Proben 1 bis 7); b) asymptomatisch-exkretorische Formen (Proben 8 bis 12); und c) gesunde Rinder (Proben 13 bis 15). Die Mittelwerte der Absorption und die Standardabweichungen stellen die Ergebnisse von vier Wiederholungsversuchen dar.
• - Fig. 4 zeigt die Erkennung von verschiedenen A36-Proteinen durch Seren von infizierten Rindern. A36-Proteine aus M. paratuberculosis wurden durch Gelelektrophorese fraktioniert und auf Nitrocellulose übertragen. Die Membranen wurden mit Seren von nicht-infizierten (Bahn 8) oder infizierten Tieren (Bahnen 4 bis 7) inkubiert, entweder nach vorheriger Absorption (Bahn 7) oder fehlender Absorption (Bahnen 4, 5 und 6) mit einem Gemisch von Homogenisaten von M avium, M. bovis und M. phlei. Membrangebundenes, primäres Ig wurde durch markiertes sekundäres Ig nachgewiesen. Die Seren von infizierten Tieren verteilten sich folgendermaßen: asymptomatisch-nicht-exkretorischer Fall (Bahn 4), asymptomatisch-exkretorischer Fall (Bahn 5) und symptomatisch-exkretorische Fälle (Bahnen 6 und 7) von Paratuberkulose. Die Molekulargewichts-Referenzstandards (Bahn 1) und A36-Proteine (Bahn 2) wurden mit Zeichentusche gefärbt. Referenz: A36-Proteine nach Immunoblotting mit anti-A36-Kaninchen- Antiserum (Bahn 3).
• [0120] Fig. 5 zeigt die Analyse der Größe des mit β-Galactosidase fusionierten Polypeptids (p362), das durch den rekombinanten Klon a362 (gemäß der nachstehenden Definition) exprimiert ist. Dieses Fusionsprotein wird mit βgal-p362 bezeichnet.
• [0121] Lysatproteine von E. coli Y1089, das einer Lysogenierung entweder mit Standard- λgt11 (Spuren C und E) oder durch den gleichen Phagen, der das für p362 (Klon a362) kodierende Insert trägt (Spuren D und F), unterworfen worden waren, wurden durch 7,5% Polyacrylamid- Gelelektrophorese fraktioniert. Die Spuren C und D und Molekulargewichtstandards (Spuren A und B) wurden mit Coomassie-Brillantblau gefärbt, während die Spuren E und F mit Kaninchen-anti- A36-Antiserum behandelt und mit peroxidasemarkiertem anti-Kaninchen-Antiserum gefärbt wurden.
• [0122] Fig. 6 zeigt den Nachweis, dass das rekombinante Polypeptid p362 zum 34 kD-Protein des A36-Komplexes gehört.
• [0123] Der TMA-Komplex von M. paratuberculosis wurde dissozüert. Seine Proteinkomponenten wurden durch 10% Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die fraktionierten Proteine wurden entweder mit Ausziehtusche (Spur b) gefärbt oder mit Kaninchen-anti-ßgal-p362-Antiserum inkubiert (Spur c). Spur a: Molekulargewichtstandard.
• [0124] Fig. 7A zeigt die Nucleinsäuresequenz, die die Nucleinsäuresequenz von Fig. 7B und die von Fig. 7C umfasst.
• [0125] Fig. 7B zeigt eine Sequenz, die zu der von Fig. 7C homolog ist.
• [0126] Fig. 7C zeigt die Basensequenz des M. paratuberculosis-Genomfragments, das im Klon a362 vorliegt und für p362 kodiert.
• [0127] Es ist darauf hinzuweisen, dass die beiden EcoRI-Stellen [GAATTC], die an beiden Enden der Sequenz vorhanden sind, das Ergebnis der Klonierungsstrategie sind und nicht natürlicherweise in der Genomsequenz vorhanden sind.
• [0128] Fig. 8 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende Nucleotidsequenz des rekombinanten Polypeptids p362.
• [0129] Es ist darauf hinzuweisen, dass die ersten beiden Aminosäuren, die den EcoRI-Stellen in der DNA-Sequenz entsprechen, nicht von Natur aus im nativen Protein vorhanden sind, sondern das Ergebnis der Klonierung darstellen.
• [0130] Fig. 9a zeigt die Restriktionskarte und genetische Karte des pmTNF-MPH-Plasmids, das in Beispiel II für die Expression des erfindungsgemäßen p362 in E. coli verwendet wird.
• [0131] Fig. 9b zeigt die pmTNF-MPH-Nucleinsäuresequenz.
• [0132] Für diese Figur wird die Herkunft der Nucleotidabschnitte, die zur Konstruktion des Plasmids pmTNF-MPH verwendet werden, nachstehend aufgeführt.
Stellung
• [0133]
• 1-208: lambda-PL mit einem EcoRI-stumpfes Ende MboII-stumpfes Ende-Fragment von pPL(λ) (Pharmacia)
• 209-436: synthetisches DNA-Fragment
• 230-232: Initiationscodon (ATG) des mTNF-Fusionsproteins
• 236-307: Sequenz, die für die Aminosäuren 2 bis 25 von reifem Mäuse-TNF kodiert
• 308-384: Mehrfachklonierungsstelle mit einem Gehalt an der His&sub6;-Kodierungssequenz in Stellung 315-332
• 385-436: HindIII-Fragment mit einem Gehalt an dem E. coli-trp-Terminator
• 437-943: rmBT&sub1;T&sub2; mit einem Gehalt an dem HindIII-SspI-Fragment aus pKK223 (Pharmacia)
• 944-3474: DraI-EcoRI-stumpfes Ende-Fragment von pAT&sub1;&sub5;&sub3; (Bioexcellence) mit einem Gehalt an dem Tetracyclin-Resistenzgen und der Replikationsursprungsstelle.
• [0134] Fig. 10 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des rekombinanten Polypeptids mTNF-H6-p362. Die Aminosäuren 1-26 stellen den mTNF-Teil dar, die Aminosäuren 27-46 entsprechen dem Polylinkerteil (H6) und die restlichen Aminosäuren (47-147) stellen das M. paratuberculosis-10 kDa-Polypeptid (p362) dar.
• [0135] Fig. 11 zeigt die DNA-Sequenz mit einem Gehalt an der Nucleinsäure, die für das nachstehend definierte Protein mit 34 kDa kodiert, und die entsprechende Aminosäuresequenz. Die Nucleotide sind am rechten Rand nummeriert. Die Nummerierung der Aminosäuren findet sich unterhalb der Proteinsequenz.
• [0136] Es ist darauf hinzuweisen, dass der Pfeil vor der Aminosäure 200 der dritten Aminosäure von Fig. 8 entspricht, da die ersten beiden Aminosäuren von Fig. 8 künstlich sind und der klonierungsbedingten EcoRI-Stelle entsprechen.
• [0137] Die nachstehende Tabelle 5 zeigt die vollständige Restriktionsstellenanalyse von pm TNF-MPH. Tabelle 5 Tabelle 5 (Forts.) Tabelle 5 (Forts.) Tabelle 5 (Forts.) Tabelle 5 (Forts.) Tabelle 5 (Forts.) Tabelle 5 (Forts.) · Auflistung der nicht-schneidenden ausgewählten Enzyme
Beispiel I Reinigung des TMA-Komplexes von M. paratuberculosis (A36), Charakterisierung des Proteinteils von A36, Identifizierung des 34 kDa-Proteins und Entwicklung eines Immunoassays auf der Basis von A36: Materialien und Methoden Bakterien
• [0138] Die folgenden Mycobakterien wurden verwendet: M. paratuberculosis Stamm 2E und 316F (von Dr. F. Saxegaard, National Veterinary Institute, Oslo, Norwegen; F. Saregaard et al., 1985, "Control ofparatuberculosis (Johne's disease) in goats by vaccination", Bd. 116, S. 439-441); M avium Serotyp 4 (von Dr. F. Portaels, Institute of Tropical Medicine, Antwerpen, Belgien) (W: B. Shaefer, 1965, "Serologic identification and classification of the atypical mycobacteria by their agglutination", Am. Rev. Resp. Dis. suppl., Bd. 92, S. 85-93); M. bovis Stamm BCG GL2 (von Dr. Weckx, Pasteur Institute, Brüssel, Belgien) und M. phlei Stamm AM76 (von Dr. M. Desmecht, National Institute for Veterinary Research, Brüssel, Belgien). Der Stamm 168 von B. subtilis wurde als Kontrolle verwendet, ATCC Nr. 33234.
Herstellung von bakteriellen Cytoplasmen
• [0139] Bakterielle Suspensionen in gepufferter Kochsalzlösung (100 mg (Feuchtgewicht) Zellen/ml, 0,15 M NaCl, 0,02 M K&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 7,5, mit einem Gehalt an 10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) wurden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen (15-minütige Behandlung mit einem 500 W-Ultraschallgerät, Vibra cell der Fa. Sonics and Materials Inc., Danbury, Co, USA (3-minütige Ultraschallbehandlung für B. subtilis). Die Homogenisate wurden zentrifugiert (5000 · g, 10 min. 4ºC). Die Überstände (d h. mycobakterielle Cytoplasmen) wurden bei -20ºC gelagert und als Antigenquellen verwendet.
Reinigung von TMA-Komplexen:
• [0140] Der Überstand (etwa 4,5 mg Proteine/ml) wurde einer RNAase-Verdauung (10 ug Enzym/100 ug Feuchtgewicht Bakterien, 30 min. 37ºC) unterworfen und durch Gelausschlußchromatographie an Sepharose 6B-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die mit gepufferter Kochsalzlösung äquilibriert worden waren, fraktioniert (gemäß den ausführlichen Angaben von Cocito et al., 1986, "Preparation and properties of antigen 60 from Mycobacterium bovis BCG", Clin. Exp. Immunol., Bd. 66, S. 262-272). TMA-Komplexe (thermostabile makromolekulare Antigenkomplexe) wurden innerhalb der ausgeschlossenen Fraktionen (die durchschnittlich 0,5 mg lösliche Proteine/ml enthielten) gefunden. Lösungen von TMA (mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid als Konservierungsmittel) wurden bei -20ºC gelagert.
• [0141] Die Reinheit der TMA-Komplexe wurde durch Kreuzimmunoelektrophorese gemäß Referenzsystem geprüft (O. Closs et al., 1980, "The antigens of Mycobacterium bovis, strain BCG, studied by crossed immunoelectrophoresis: a reference system", Scand. J. Immunol., Bd. 12, S. 249-263; E. Gunnarsson et al., 1979, "Analysis of antigens in Mycobacterium paratuberculosis", Acta Vet. Scand., Bd. 20, S. 200-215).
• [0142] Zu diesem Zweck wurden Agarosegele (1% Typ 2-Agarose der Fa. Sigma, St. Louis, Mo) auf Glasplatten (5 · 7 cm) verwendet, wobei das Deckgel 200 ul Kaninchen-anti- Mycobakterium-Homogenisat enthielt. Mycobakterielles Antigen (10 ul Proben mit einem Gehalt an 0,5 mg TMA/ml) wurde auf eine Eckvertiefung aufgesetzt. Elektrophoretische Ansätze wurden auf die beschriebene Weise durchgeführt (1 h, 8 V/cm, 15ºC in der 1. Dimension; 3 V/cm, 18 h, 15ºC in der 2. Dimension). Schrägkulturen wurden gewaschen, getrocknet, mit Coomassie-Blau gefärbt und fotografiert.
Tierseren
• [0143] Zur Herstellung von polyklonalen Antiseren wurden mycobakterielle Homogenisat- oder TMA-Präparate (10 ug lösliche Proteine/0,5 ml gepufferte Kochsalzlösung, emulgiert mit einem gleichen Volumen an inkomplettem Freund-Adjuvans) wiederholt auf subkutanem Wege Kaninchen injiziert (6 Inokulationen mit einem Abstand von jeweils 1 Woche).
• [0144] Der Antikörpertiter der Seren wurde durch ein immunoenzymometrisches Verfahren (vergl. die nachstehenden Angaben) bewertet.
• [0145] Auf diese Weise erhielt man ein polyklonales anti-TMA-Komplex-Antiserum, insbesondere anti-A36-Antiserum und ein polyklonales anti-Homogenisat-Antiserum, die im Western-Blotting-Test erwähnt werden.
• [0146] Vier Arten von Seren von Rindern, die entweder gesund waren oder sich in unterschiedlichen Stadien der Johne-Krankheit befanden, wurden herangezogen: a) gesunde Kontrolltiere ohne Anzeichen einer mycobakteriellen Infektion und mit negativen Tests in bezug auf Coprokultur und Komplementfixierung; b) asymptomatisches, nicht-exkretorisches Stadium I der Krankheit (ein Fall, der sich zum Zeitpunkt der Probennahme negativ darstellte, aber später positiv wurde); c) asymptomatisches, exkretorisches Stadium II der Krankheit (positive Coprokultur ohne klinische Anzeichen der Krankheit); und d) symptomatisches, exkretorisches Stadium III der Krankheit (mit positivem Komplementfixierungstest). Diese Seren wurden vom National Institute of Veterinary Research (Dr. M. Desmecht, Brüssel, Belgien) und vom Center of Veterinary Medicine (Dr. B. Limbourg, Erpent, Belgien) bereitgestellt.
Elektrophoretische Fraktionierung und Western-Blotting von TMA-Proteinen
• [0147] Der Proteinteil von TMA-Komplexen wurde durch Elektrophorese an 10% Polyacrylamidgelen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat fraktioniert (SDS-PAGE-Verfahren) (U. K. Laemmli, 1970, "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, Bd. 227, S. 680-695). Proteinproben (25 ug lösliche Polypeptide in 50 ul 0,125 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8, mit einem Gehalt an 5% (Gew./Vol.) SDS, 20% (Vol./Vol.) Glycerin, 10% (Vol./Vol.) β-Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau) wurden 5 Minuten gekocht und sodann auf senkrechte Gelplatten aufgesetzt.
• Molekulargewichtsproteinmarker (Fa. Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo) waren:
• Rinderserumalbumin (66 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (36 kDa), Carboanhydrase (29 kDa), Trypsinogen (24 kDa), Trypsininhibitor (20,1 kDa) und α- Lactalbumin (14,2 kDa). Die elektrophoretischen Ansätze (4 h, 50 V, 20ºC) wurden in einer senkrechten Anlage durchgeführt (Fa. LKB, Bromma, Schweden). Die Proteinbanden wurden durch Färbung mit Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht. Kontrollen mit cytoplasmatischen Gesamtproteinen wurden parallel mit TMA-Proben mitgeführt.
• [0148] Die der Elektrophorese unterworfenen Proteine wurden von Polyacrylamidgelen auf Nitrocellulosemembranen (BA 85, Macherey-Nagel, Deutschland) unter Verwendung einer Transblot-Einheit (217 Multiphor 2, Fa. LKB, Bramma, Schweden) übertragen.
• [0149] Der Übertragungspuffer enthielt 20% Methanol, 0,039 M Glycin und 0,048 M Tris- Base, pH-Wert 8, 8. Die Ansätze wurden 2 h bei 10 V durchgeführt. Die dem Transblotting unterworfenen Proteine wurden durch Umsetzung mit einem primären Antikörper (entweder polyklonales Kaninchen-Antiserum [1/1500] oder Rinderserum [1/100]) und sodann mit einem markierten sekundären Antikörper identifiziert.
• [0150] Dem Transblotting unterworfene Nitrocellulosefolien wurden zunächst 30 Minuten mit TBS-Puffer (0,5 M NaCl, 0,023 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5) mit einem Gehalt an 3% (Gew./Vol.) Gelatine und sodann 3 Stunden mit den primären Antikörpern in Verdünnung mit TBST-Puffer (TBS mit einem Gehalt an 0,05% (Vol./Vol.) Tween 20) und 1% (Gew./Vol.) Gelatine inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit TBST wurden die Folien 2 Stunden mit sekundärem IgG (1/400-verdünnte Präparate von peroxidasemarkiertem anti-Kaninchen- oder anti- Mäuse- oder anti-Kuh-IgG, Fa. Dako, Kopenhagen, Dänemark) inkubiert, wonach sich Waschvorgänge mit TBST- und TBS-Puffern anschlossen. Eine Farbreaktion wurde durch Zugabe von α-Chlornaphthol (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Cal.) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid entwickelt. Die Farbreaktion wurde durch Waschen der Folien mit destilliertem Wasser gestoppt. Eine ähnliche Vorgehensweise wurde für direkt auf Nitrocellulosemembranen aufgesetzte Antigene herangezogen (Δot-Blot-Analyse). Referenzproben von dem Transblotting unterworfenen Gesamtproteinen und Molekulargewichtsmarker wurden durch Färben mit Ausziehtusche (10% Lösung von Ausziehtusche, Fa Pelikan, Deutschland, in 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH-Wert 7,4, mit einem Gehalt an 0,3% (Vol./Vol.) Tween 20) für eine Zeitspanne von 30 Minuten sichtbar gemacht (K. Hancoc et al., 1983, "India ink staining of proteins on nitrocellulose paper", Anal. Biochem., Bd. 133, S. 157-162.
Immunoassay zur Bestimmung von antimycobakteriellem Ig
• [0151] Mikrotiterplatten mit zahlreichen Vertiefungen (Microwell Module, Nung, Dänemark) wurden entweder mit gereinigtem A36 oder mit M. paratuberculosis-Gesamtcytoplasma (d. h. Überstand) beschichtet (0,5 ug lösliche Proteine/50 ul 0,05 M Natriumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,6/Vertiefung). Lufttrockene Vertiefungen wurden mit Rinderserumalbumin (0,1% (Gew./Vol.) BSA in 0,15 M NaCl, 1 h. 37ºC) gesättigt. Ansteigende Verdünnungen des zu testenden Serums in 0,15 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2, 0,005% Tween 80 (PBST-Puffer) wurden zugegeben (50 ul/Vertiefung, 1 h, 37ºC), wobei optimale Verdünnungen durch Kontrollplattentitration identifiziert wurden. Mit Meerrettich-peroxidase markiertes Schweine-anti- Kaninchen- oder Kaninchen-anti-Kuh-Antiserum (Dako, Kopenhagen, Dänemark) wurde zugegeben (50 ul 1/400 IgG-Verdünnung in PBST/Vertiefung, 1 h 37ºC). Überschüssiges Reagenz wurde durch 5-maliges Waschen mit Puffer entfernt. Nach Inkubation mit Peroxidase-Reagenz (50 ul pro Vertiefung eines 17 mM Natriumcitratpuffers vom pH-Wert 6,3 mit einem Gehalt an 0,2% O-Phenylendiamin und 0,015% H&sub2;O&sub2;, 30 min. 37ºC im Dunkeln) wurde die Reaktion gestoppt (50 ul 2 M H&sub2;SO&sub4;). Proben wurden spektrometrisch gemessen (Plattenlesegerät SLT 210 der Fa. Kontron Analytical, UK). Die Ergebnisse wurden als ELISA-Absorptionswerte (A450 nm) aufgezeichnet.
• [0152] Bei einigen Versuchen wurde kreuzreaktives Ig durch Inkubation (18 h, 4ºC) entweder mit gereinigten TMA-Präparaten (0,2 mg Protein/ml Serum) oder bakteriellen Homogenisaten oder intakten Mycobakterien (Äquivalente von 2 mg Trockengewicht Bakterien/ml Serum) entfernt. Absorbierte Präparate wurden durch Dot-Blot-Versuche vor dem Auftragen im Immunoblot oder Immunoassay geprüft.
Immunelektronenmikroskopie
• [0153] Suspensionen von Mycobakterien in Wasser (5 · 10&sup7; Zellen/5 ul) wurden auf Kohlenstoff-Formvar 200 mesh-Kupfergitter gebracht und an der Luft getrocknet. Die Gitter wurden nacheinander inkubiert mit: a) Rinderserumalbumin (3% Lösung in gepufferter Kochsalzlösung, 30 min. 37ºC); b) anti-TMA-Komplex-Kaninchen-Antiserum (eine 10&supmin;³ Verdünnung von Ig in gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20, 2 h, 37ºC); c) biotinyliertes Schaf-anti-Kaninchen-Ig (Verdünnung 1/200 von Ig der Fa. Amersham, UK, in gepufferter Kochsalzlösung - Tween, 1 h, 20ºC); d) mit Gold markiertes Streptavidin (Verdünnung 1/20 eines Präparats der Fa. Amersham, UK) (A. Cloeckaert et al., 1990, "Identification of seven surface-exposed Brucella outer membrane proteins by use of monoclonal antibodies: immunogold labelling for electron microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay", Infect. Immun., Bd. 58, S. 000-000). Die Gitter wurden in einem Transmissionselektronenmikroskop (Philips cm 10) analysiert.
Ergebnisse Reinigung von TMA-Komplexen und Herstellung von anti-TMA-Antiseren
• [0154] Der TMA-Komplex von M. paratuberculosis (A36) wurde aus dem Gesamthomogenisat hergestellt. Die Cytoplasmafraktionierung durch Gelausschlußchromatographie ergab den TMA-Komplex innerhalb der Ausschlussfraktion. Die immunoelektrophoretischen Muster der Gesamtcytoplasma-Antigene (Uberstand) (Fig. 1(1)) und der Ausschlussfraktion (Fig. 1 (2)) wurden verglichen. Aus diesen Darstellungen, die mit polyklonalen Antiseren erhalten wurden, deren Bildung durch Inokulation von Kaninchen mit mycobakteriellem Gesamthomogenisat angeregt worden war, ließ sich die Reinheit des A36- Präparats ableiten.
• [0155] Eine ähnliche Vorgehensweise wurde für die Präparation von anderen Antigenen der TMA-Gruppe aus M. avium, M. bovis und M. phlei, die für eine Vergleichsanalyse herangezogen wurden, angewandt. Die den TMA-Komplexen entsprechenden polyklonalen Antiseren wurden ebenfalls hergestellt. Die Reinheit dieser Ig-Präparate wurde durch Kreuzimmunoelektrophorese geprüft: in jedem Fall wurden Gesamtzellhomogenisate als Antigene verwendet, wobei man eine einzige Immunopräzipitogenlinie, die dem TMA-Komplex entsprach, erhielt (Muster nicht abgebildet, ähnlich dem von Fig. 1(2)). Es ist festzustellen, dass eine subkutane Injektion von TMA-Komplexpräparaten in unveränderlicher Weise die Synthese von Antiseren mit hohem Titer induzierte (ELISA-Absorption höher als 2,5 für Verdünnungen von 10&supmin;&sup5;), ein Ergebnis, das auf die hohe Immunogenizität dieser Antigenkomplexe hinweist.
Entwicklung eines serologischen Tests auf der Basis von A36 für Paratuberkulose
• [0156] Die Verfügbarkeit von A36 war Anlass für die Entwicklung eines enzymometrischen Immunoassays vom ELISA-Typ für Paratuberkulose. Demgemäß wurden Platten mit Mehrfachvertiefungen mit A36 beschichtet und mit Seren von infizierten Tieren inkubiert. Peroxidasemarkiertes Kaninchen-anti-Rind-IgG wurde mit einem zweiten Antikörper versetzt. Die Farbentwicklung nach Zugabe von Peroxidase-Reagenz wurde gemäß den Angaben in Materialien und Methoden spektrophotometrisch gemessen. Parallel wurde ein Vergleich mit A36 und mit Gesamtcytoplasma (Überstand) von M. paratuberculosis durchgeführt (gleiche Proteinmengen wurden für die beiden Tests verwendet).
• [0157] Sämtliche Seren der infizierten Tiere (Stadien II und III der Johne-Krankheit) ergaben eine positive Reaktion (Werte von 0,84 bis 2,25 Einheiten) bei beiden Typen des ELISA-Tests (Fig. 3). Dagegen waren nicht-infizierte Tiere in unveränderlicher Weise negativ (Werte unter 0,38 Einheiten). Mit A36-ELISA wurden erheblich höhere Absorptionswerte (1,44 bis 2,25 Einheiten) als mit Gesamtcytoplasma-ELISA (0,84 bis 1,65) erhalten.
• [0158] Diese Ergebnisse lassen auf die Immunodominanz des A36-Antigens bei der Johne- Krankheit und auf die Eignung des ELISA-Tests auf der Basis von A36 als diagnostischer Test schließen.
Periphere Position des TMA-Komplexes in Mycobakterien
• [0159] Die beobachtete Immunodominanz von A36 passt besser zu einer Oberflächenkomponente als zu einem im Cytoplasma befindlichen Antigenkomplex. Jedoch ist eine Übertragung eines TMA-Komplexes durch die Hülle und dessen Vorstehen an der Zelloberfläche denkbar.
• [0160] Die Anwendung der Immunoelektronenmikroskopie-Methodik ermöglicht eine direkte Behandlung dieses Problems. Sich vermehrende Zellen von M. paratuberculosis wurden mit anti- A36-Ig aus immunisierten Kaninchen inkubiert. Zellgebundene primäre Antikörper wurden durch sekundäres Schweine-anti-Kaninchen-IgG, das mit kolloidalem Gold markiert war, nachgewiesen. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen die Anwesenheit von reaktiven Antigenflecken auf der Oberfläche von Mycobakterien (Ergebnisse nicht dargestellt).
• [0161] Diese Daten zeigen, dass ein Teil der TMA-Komplexe tatsächlich innerhalb der Zellwand auftritt und sich auf der Zelloberfläche präsentiert.
Immunologische Kreuzreaktivität von A36 und anderen TMA-Antigenen
• [0162] Im vorstehenden Abschnitt wurde die Entwicklung eines ELISA-Tests auf der Basis von A36 zur Titration von antimycobakteriellen Antikörpern beschrieben. Die mögliche Anwendung dieses Tests in der Veterinärmedizin beruht auf seiner Spezifität in bezug auf: a) andere Mycobakterien, die Gäste des Intestinaltrakts von Wiederkäuern sind; und b) M. bovis und M. tuberculosis, die Tuberkulose bei Vieh verursachen können (Zwangsschlachtung von PPDpositivem Vieh). Diesem Problem begegnet man durch Bewertung der Kreuzreaktivität von TMA- Komplexen unterschiedlicher Mycobakterien mit zwei Verfahrensweisen (vergl. Tabelle 1).
• [0163] Eine erste Reihe von Tests wurde mit Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit TMA- Komplex aus M. avium, M. bovis, M. paratuberculosis und M. phlei beschichtet waren. Alle diese Platten wurden zur Titration eines einzigen anti-A36-Antiserums verwendet, ein Verfahren das zur Bewertung des prozentualen Anteils gemeinsamer TMA-Epitope führt. Setzt man die autologe Reaktion (A36-anti-A36-IgG) mit 100 fest, so war der prozentuale Anteil der Homologie von M. paratuberculosis-TMA-Komplex mit dem TMA-Komplex von M. avium und M. bovis sehr hoch. Für den M. phlei-TMA-Komplex war er wesentlich niedriger.
• [0164] Bei Wiederholung des ELISA-Tests auf der Basis von A36 mit anti-A36-Antiserum das vorher von verschiedenen mycobakteriellen TMA-Komplexen absorbiert worden war, wurde eine Bewertung der A36-spezifischen Epitope erhalten. Aus Tabelle 1 ergibt sich, dass der prozentuale Anteil der spezifischen Epitope nieder war, wenn A36 mit TMA von M, avium und M. bovis verglichen wurde, dagegen beim Vergleich mit TMA von M. phlei hoch war. Tabelle 1 Kreuzreaktion und Spezies-spezifische Epitope in den TMA-Komplexen von vier Mycobakterien TMA in ELISA
• a TMA-Präparate aus verschiedenen Mycobakterien (0,5 ug/Vertiefung) wurden zur Beschichtung von Mikrotiterplatten verwendet
• b anti-A36-Antiserum wurde einer Vorabsorption mit TMA-Komplexen unterschiedlicher Mycobakterien unterzogen (Proben B) oder nicht (Proben A)
• c Platten, die mit A36 (Proben B) oder mit verschiedenen TMAs (Proben A) beschichtet waren, wurden mit anti-A36-Antiserum (Verdünnung 1/150 000) versetzt und gebundenes Ig wurde durch einen zweiten markierten Antikörper nachgewiesen.
• d Der prozentuale Anteil von kreuzreagierenden oder spezifischen Epitopen wurde in logarithmischem Maßstab berechnet.
• [0165] Diese Ergebnisse zeigen die mangelnde Spezies-Spezifität des A36-ELISA als diagnostisches Reagenz für die Johne-Krankheit. sie lassen jedoch auf das mögliche Auftreten von A36-Komponenten, die mit einer derartigen Spezifität ausgestattet sind, schließen.
Immunodominanz und Spezifität der A36-Proteine
• [0166] Die Spezies-Spezifität, die auf dem Niveau des vollständigen A36-Antigenkomplexes fehlte, wurde bezüglich seiner Proteinkomponenten untersucht. Die TMA-Komplexe von M. avium, M. bovis, M. paratuberculosis und M. phlei wurden isoliert. Ihre Proteinkomponenten wurden durch Polyacrylamid-Elektrophorese fraktioniert. Eine Ähnlichkeit der Spuren von M. avium und M. paratuberculosis ist offensichtlich, während die von M. bovis- und M. phlei-TMA sich deutlich von der Spur von M. paratuberculosis unterschieden.
• [0167] Beim Immunoblotting von fraktionierten A36-Proteinen mit anti-A36-Antiserum wurden ein Dutzend größere Polypeptide gefärbt, die meisten im 28-42 kDa-Bereich. Ein Immunoblotting mit anti-A36-Antiserum, das einer Vorabsorption mit einem Lysat von M. phlei unterzogen worden war, ergab 5 Polypeptidbanden. Die Anzahl dieser Banden betrug im Fall von M. bovis 3 und im Fall von M. avium 1. Tabelle 2 zeigt eine vergleichende Bewertung der Hauptkomponenten von A36 nach zwei Eigenschaften: Immunogenizitätsgrad (Färbungsintensität mit gepoolten Seren von infizierten Rindern) und Spezies-Spezifität (mangelnde Kreuzreaktivität mit den anderen Mycobakterien). Elf Hauptkomponenten von 22 bis 74 kDa sind aufgeführt: 2 davon (mit 23 und 31 kDa) mit einem Gehalt an spezifischen Epitopen in bezug auf die getesteten Organismen, ausgenommen M. avium, und eine mit 34 kDa mit einem Gehalt an spezifischen Epitopen in bezug auf sämtliche getesteten Organismen, einschließlich M avium. Tabelle 2 Immunologische Eigenschaften einiger Proteine des TMA-Komplexes von Mycobacterium paratuberculosis (A36)
• a A36 wurde dissozüert. Proteinkomponenten wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese fraktioniert und durch Immunoblotting identifiziert.
• b Der Grad der Immunogenizität für Kaninchen und Kühe wurde aus der Intensität der Immunoblot-Färbung mit den entsprechenden Seren bewertet.
• c Seren von Vieh, das in verschiedenen Stadien von der Johne-Krankheit befallen war: I asymptomatisch, nicht-exkretorisch; II asymptomatisch, exkretorisch; und III symptomatisch, exkretorisch.
• d Kreuzreaktivität wurde durch "nein" und Spezifität durch "ja" ausgedrückt.
• [0168] Die immunologische Bedeutung des letztgenannten Proteins wurde durch Immunoblot-Analyse von A36-Proteinen mit infizierten Rinderseren geprüft: eine Hauptbande auf der Höhe des 34 kDa-Markers wurde beobachtet (Fig. 4, Bahnen 4, 5, 6 und 7). Diese Bande fehlte bei der Kontrolle (Bahn 8 mit gesundem Rinderserum).
• [0169] Es ist ersichtlich, dass die 34 kDa-Proteinkomponente des TMA-Komplexes bei Vieh immunodominant ist, für die Johne-Krankheit relevant ist und Spezies-spezifische Epitope in bezug auf verwandte Mycobakterien enthält.
• [0170] Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Entwicklung eines ELISA-Tests auf der Basis von A36 für Paratuberkulose. Die Möglichkeit zum Nachweis des Vorliegens einer mycobakteriellen Infektion bei Vieh wurde in Fig. 3 gezeigt. Die Grunderfordernisse für die Verwendung eines gegebenen Antigens als Reagenz für Immunoassays von medizinischem Interesse sind: 1) seine Immunodominanz; 2) seine Relevanz für die Zielkrankheit; und 3) seine Spezifität. Die Anforderungen 1 und 2 wurden vom ELISA-Test auf der Basis von A36 somit erfüllt. Die Anforderungen 1 bis 3 wurden vom p362-Polypeptid vollständig erfüllt, das, wie nachstehend beschrieben, Bestandteil des zu A36 gehörenden 34 kDa-Proteins ist.
Beispiel II Isolierung des Klons a362, der ein 10 kDa-Polypeptid (p362) exprimiert, DNA- Sequenzierung des Inserts des Klons a362 und Testen von p362 in einem ELISA-Test für die Johne-Krankheit Materialien und Methoden Klonierungsvektoren
• [0171] Die folgenden Typen wurden verwendet: λgt11 (R. A. Young und R. W. Davis, 1983, "Yeast RNA polymerase II genes: isolation with antibody probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80, S. 1195-1198) und pUEX2 (G. M. Brennan et al., 1987, "pUEX, a bacterial expression vector related to pEX with universal host specifity", Nucl. Acids Res., Bd. 15, S. 10056) und pmTNF- MPH (vergl. Fig. 9a, 9b und Tabelle 5) als Expressionsvektoren und Blue-Script SK&spplus; als Sequenzierungsvektor (Stratagene).
Bakterien
• [0172] Mycobacterium paratuberculosis 19698 (American Typ Culture Collection), M paratuberculosis Stamm 2887 (Crohn): ATCC Nr. 4301 S. M. avium Serotyp 4, M. avium Serotyp 2, M. avium Serotyp 8 (W. B. Schaefer, 1965, "Serologic identification and classification of the atypical mycobacteria by their agglutination", Am. Rev. Resp. Dis. suppl., Bd. 92, S. 85-93), M. tuberculosis H37rv: ATCC Nr. 25618. M. gordonae: ATCC Nr. 14470. Brucella abortus B3 (A. Cloeckaent et al., 1990, Infect. Immun., Bd. 58, S. 3980-3987). Stämme von Escherichia coli: Y1089 (Δ(lacU169), Δ(lon, hflA150 (chr::Tn10), (pMC9), (rK&supmin;, mK&spplus;)), Y1090 (Δ(lacU169), Δ(lon, sup F, (trC22::Tn10), (pMC9), (rK&supmin;, mK&spplus;), MC1061 (Δ(lacX74), galU&supmin;, galK&supmin;, (rK&supmin;, mK&spplus;)) und DH5αF' (F', (rK&supmin;, mK&spplus;), supE44, lacZΔM15, Δ(lacZYA argF) U169), K12ΔH, ATCC 33767 (λacZ(am)Δ(bio uvr B) (λ Nam7 am53 ci857 ΔH1) rpsL20).
Antiseren
• [0173] Kaninchen-anti-M. paratuberculosis-Antiserum stammte von der Fa. Dako (Kopenhagen, Dänemark, Charge Nr. 014). Seren von mit Paratuberkulose infiziertem Vieh wurden von Dr. M. Desmecht (National Institute for Veterinary Research, Brüssel, Belgien) und Dr. B. Limbourg (Erpent, Center of Veterinary Medicine, Belgien) zur Verfügung gestellt.
• [0174] Polyklonale Antiseren gegen Vollhomogenisat von M avium Serotyp 4, M. bovis BCG und M. phlei sowie gegen den TMA-Komplex und βgal-p362 (erfindungsgemäßes rekombinantes Polypeptid, fusioniert mit β-Galactosidase gemäß den nachstehenden Angaben) wurden durch wiederholte subkutane Inokulation von Kaninchen (10 ug Protein/0,5 ml gepufferte Kochsalzlösung, emulgiert mit dem gleichen Volumen an inkomplettem Freund-Adjuvans, 6 Inokulationen mit einem Abstand von jeweils 1 Woche) erzeugt.
Reinigung von M. paratuberculosis-DNA
• [0175] Suspensionen von Bakterien (10 mg in 0,5 ml 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4) wurden nacheinander mit Lysozym (25 ul mit 20 mg/ml, 14 h, 50ºC), Pronase (25 ul mit 20 mg/ml, 1 h; 37ºC) und SDS (25 ul mit 20%, 1 h 37ºC) inkubiert. Die Gemische wurden mit Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1, Vol./Vol.), mit wassergesättigtem Phenol und Ether extrahiert. Nach Inkubation mit Ribonuclease (5 ul mit 2 mg/ml, 1 h, 37ºC) wurde die DNA an Säulen mit Sephadex G50 (äquilibriert mit 4,8 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8) und Hydroxylapatit (gewaschen mit 8 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,8, mit einem Gehalt an 1% SDS und anschließend mit 4,8 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8, und eluiert mit 480 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,8) gereinigt.
Konstruktion einer λgt11-Bank von M. paratuberculosis
• [0176] M paratuberculosis-DNA wurde zu Segmenten mit einer durchschnittlichen Länge von 0,5 bis 1,5 kb abgeschoren (Vibra Cell Ultraschallgerät 60 W, 2 sec). Die Scherbehandlung wurde durch Agarose-Gelelektrophorese überwacht. EcoRI-Stellen wurden mit EcoRI-Methylase methyliert (5 ug scherbehandelte DNA in 50 ul Puffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM Na&sub3;EDTA, 5 mM Dithiothreit, 50 uM S-Adenosyl-L-methionin und 10 Einheiten EcoRI- Methylase). Die Methylierung wurde 30 min bei 37ºC durchgeführt und durch 10-minütige Inkubation bei 70ºC gestoppt. Stumpfendige DNA-Fragmente wurden durch Inkubation mit T4- DNA-Polymerase (5 ul 0,1 M MgCl&sub2;, 2,5 ul 1 mM dTNPs, 1 ul 1 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und 20 Einheiten T4-DNA-Polymerase pro 40 ul Methylierungsreaktionsmedium; 20 min Inkubation bei 37ºC) erhalten. EDTA (15 mM Endkonzentration) wurde zugegeben. Sodann wurde das Reaktionsgemisch 2 mal mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit Ether extrahiert. Nach Zugabe von Natriumacetat in einer Endkonzentration von 0,3 M wurde die DNA mit 2 Volumenteilen EtOH bei -20ºC gefällt und mit 70% EtOH gewaschen. Das DNA-Pellet wurde in Puffer (10 ul 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 20 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreit) gelöst. Phosphorylierte EcoRI-Linker (200 ug/ml) wurden zugegeben, wonach sich die Zugabe von PEG 6000 (Endkonzentration 15%), 1 mM ATP (Endkonzentration) und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase anschloss. Sodann wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei 12ºC inkubiert. Dieses Gemisch wurde mit überschüssigem EcoRI bei 37ºC inkubiert. Die DNA-Fragmente wurden von überschüssigem Linker an Sephadex G25 gereinigt. Die erhaltene DNA-Lösung wurde nacheinander mit Phenol/Chloroform und Ether extrahiert, gefällt und mit Ethanol gewaschen. Das DNA-Pellet (0,5 ug) wurde in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,1 mM EDTA) gelöst und einer Ligation (18 h, 4ºC) mit 1 ug dephosphorylierter, EcoRI-verdauter λgt11-DNA (Promega) unterzogen. Die Stufen der Methylierung, Ligation und Verdauung wurden durch Agarose-Gelelektrophorese überwacht. Eine Phagenverpackung von klonierter DNA wurde mit dem Stratagene-Gigapack-Extrakt erhalten.
Screening der λgt11-Bank und Dot-Blot-Technik
• [0177] Nach Infektion von E. coli Y1090 mit dem rekombinanten Phagengemisch und Ausstreichen auf der Platte erfolgte eine 3- bis 4-stündige Inkubation bei 42ºC.
• [0178] Zur Identifikation von rekombinanten Phagen wurden mit IPTG (Isopropylthio-β- galactopyranosid) (10 mM) gesättigte Nitrocellulosefilter direkt auf die Oberfläche der die Plaques enthaltenden Deckplatten gelegt und 18 h bei 37ºC inkubiert (R. A. Young und R. W. Davis, 1983, "Yeast RNA polymerase II genes: isolation with antibody probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 80, S. 1195-1198). Nach Aufsetzen von Kontrollantigenen (1 ug) und 10-minütigem Waschen mit TBS-Puffer (0,5 M NaCl, 0,023 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5) wurden die Filter 30 min mit dem gleichen Puffer mit einem Gehalt an 3% (Gew./Vol.) Gelatine und sodann mit Kaninchen-anti-M. paratuberculosis-Antiserum (Dako), das vorher mit TBST-Puffer (TBS-Puffer mit einem Gehalt an 0,05% (Vol./Vol.) Tween 20), der 1% (Gew./Vol.) Gelatine enthielt, verdünnt worden war, inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Filter 1 h mit 1/400-Verdünnungen von peroxidasemarkiertem anti-Kaninchen-Ig inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit TBST und TBS wurden das Peroxidase-Substrat α-Chlornaphthol (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) und Wasserstoffperoxid zugegeben. Die Reaktion wurde durch Waschen mit destilliertem Wasser gestoppt. Plaques, die den reaktiven Flecken auf dem Filter entsprachen, wurden entnommen, auf SM-Medium (100 mM NaCl, 10 mM MgSO&sub4;, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4) übertragen und durch wiederholte Passagen in E. coli Y1090 gereinigt. Rekombinante Klone wurden sodann einer weiteren Charakterisierung bezüglich ihrer Antigenizität (Inkubation mit Rinderseren und anti-A36) und ihrer Spezifität (Inkubation mit Antikörpern gegen Homogenisat von M. avium, M. bovis und M. phlei) unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen charakterisiert.
• [0179] Eine ähnliche Technik wurde für Dot-Blot-Versuche herangezogen, bei denen die Spezifität des rekombinanten Polypeptids p362 in bezug auf verschiedene Mycobakterien getestet wurde: Flecken von mycobakteriellen Homogenisaten auf Nitrocellulosemembranen wurden mit anti-β-gal-p362-Ig inkubiert.
Hochgradige Expression des Fusionsproteins in E. coli
• [0180] Kolonien von E. coli Y1089, die mit geeigneten λgt11-Rekombinanten lysogenisiert worden waren, wurden bei 30ºC in Luria-Bertani-Medium vermehrt (A&sub6;&sub0;&sub0; nm = 0,5). Nach Wärmeschock (20 min bei 45ºC) wurde die Erzeugung von erfindungsgemäßen β-Galactosidase- Fusionsproteinen durch Zugabe von 10 mM IPTG (Endkonzentration) und eine weitere Inkubation (60 min bei 37ºC) induziert. Durch Zentrifugation geerntete Zellen wurden in Puffer (10 mM Tris- HCl, pH-Wert 8,2, 2 mM EDTA) suspendiert und rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren.
• [0181] Für eine verstärkte Expression wurden λgt11-Inserts in den Expressionsvektor pUEX2 (G. M. Brennan et al., 1987, "pUEX, a bacterial expression vector related to pEX with universal host specificity", Nucl. Acids Res., Bd. 15, S. 10056), erhältlich von der Fa. Amersham, subkloniert und zur Transformation von E. coli MC1061 verwendet (Maniatis, Molecular Cloning). Einzelne Kolonien von transformiertem E. coli wurden bei 30ºC bis zu = 0,3 gezüchtet und einem Wärmeschock unterworfen (90 min bei 42ºC). Geerntete Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Proteinfraktionierung und Immunoblotting
• [0182] Der TMA-Komplex und rekombinante Proteine wurden durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter Denaturierungsbedingungen (SDS-PAGE) (Laemmli, UK 1970, "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, Bd. 227, S. 680-695) analysiert.
• [0183] Die Fraktionierung von 7,5 oder 10%-Acrylamidgelen wurde in einer vertikalen 2001-Elektrophoreseanlage (LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden) (4 h, 50 V, 20ºC) durchgeführt. Als Protein-Molekulargewichtsmarker (Sigma, St. Louis, Mo) wurden verwendet: Myosin (205 kDa), β-Galactosidase (116 kDa), Phosphorylase B (97,4 kDa), Rinderserumalbumin (66 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (36 kDa), Carboanhydrase (29 kDa), Trypsinogen (24 kDa), Trypsin-Inhibitor (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,2 kDa). Die Proteinbanden wurden mit Coomassie-Brillantblau gefärbt. Der Elektrophorese unterzogene Proteine wurden dem Transblotting (LKB 217 Multiphor 2 Electrophoresis System, 10 V, 2 h, mit Puffer aus 20% Methanol, 0,039 M Glycin und 0,048 M Tris-Base, pH-Wert 8, 8) auf Nitrocellulosemembranen unterzogen. Mycobakterielle Antigene wurden durch aufeinanderfolgende Inkubation mit polyklonalen Kaninchen-Antiseren (anti-A36 für rekombinante mycobakterielle Antigene unter Fusion an β-Galactosidase oder anti-ßgal-p362 für TMA-Proteine) und mit peroxidasemarkiertem anti-Kaninchen-Ig (Δako, Kopenhagen, Dänemark) (Verdünnung 1/400) sichtbar gemacht. Das auf die Membran durch Blotting übertragene Gesamtprotein wurde durch Färben mit Ausziehtusche sichtbar gemacht.
DNA-Sequenzierung
• [0184] Die Sequenzanalyse des DNA-Inserts des rekombinanten Klons a362 wurde durch das Primererweiterungs- und Didesoxyterminationsverfahren (F. Sanger et al., 1977, "DNA sequencing with chain terminating inhibitors", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74, S. 5463-5467) nach Subklonierung des λgt11-Inserts in den Sequenzierungsvektor pBluescript SK&spplus; (Stratagene) durchgeführt. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit T7-DNA-Polymerase und verschiedenen Primern (Universal-, Revers-, SK- und KS-Primer aus Deaza Kit, Pharmacia, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Eine computergestützte Analyse von Nucleinsäure- und Polypeptidsequenzen wurde mit dem Programm COD-FICK (PC-GENE, Intelligenetics, USA) durchgeführt.
• Homologieuntersuchungen wurden auf dem DNA-Niveau in der EMBL-Bank (Release 29) und UGEN-Bank (Release 70-29) (Intelligenetics Inc., CA, USA) und auf dem Proteinniveau in der PIR-Bank (Release 31) und Swiss Prot (Release 20) durchgeführt. Es wurden keine homologen Sequenzen gefunden.
Serologische Analyse (ELISA) mit rekombinanten Polypeptiden
• [0185] Mikrotiterplatten mit Mehrfachvertiefungen (Microwell Module, High binding Capacity, Nung, Dänemark) wurden mit Gesamtcytoplasma von E. coli a362 und mit Gesamtcytoplasma von E. coli als Kontrolle beschichtet. 4 ug lösliche Proteine/50 ul 0,05 M Natriumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,6) wurden pro Vertiefung aufgetragen. Die Platten wurden über Nacht an der Luft getrocknet und gesättigt (0,1% Serumalbumin in 0,1 S M NaCl, 1 h bei 37ºC). Verdünnungen von Rinder-Ig in PBST (0,15 M NaCl, 0,02 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2, mit einem Gehalt an 0,005% Tween 80) wurden in die Plattenvertiefungen gegeben (50 ul, 1 h bei 37ºC). Mit Peroxidase markiertes Kaninchen-anti-Kuh Ig (Dako) (50 ul, Verdünnung 1/400 in PBST/pro Vertiefung) wurden zugegeben (1 h bei 37ºC). Überschüssiges Reagenz wurde durch 5- maliges Waschen mit PBST entfernt. Nach Inkubation mit Peroxidase-Reagenz (50 ul/Vertiefung 0,2% O-Phenylendiamin mit 0,015% Wasserstoffperoxid in 0,017 M Natriumcitratpuffer, pH- Wert 6,3, 30 min. 37ºC im Dunkeln) wurde die Reaktion mit 50 ul 2 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt. Der A&sub4;&sub5;&sub0; nm-Wert wurde mit einem kolorimetrischen Plattenlesegerät (SLT 210, Kontron Analytical, UK) gemessen. Die Ergebnisse wurden als ELISA-Absorptionswerte aufgezeichnet. Bei einigen Versuchen wurde kreuzreaktives Ig durch Inkubation (18 h bei 4ºC) mit bakteriellem Homogenisat entfernt. Absorbierte Präparate wurden durch Dot-Blot-Versuche vor dem Einsatz in Immunoblots oder Immunoassays geprüft.
Immunelektronenmikroskopie
• [0186] Suspensionen von Mycobakterien in Wasser (S · 107 Zellen/5 ul) wurden auf Kohlenstoff-Formvar-200 mesh-Kupfergitter gebracht und an der Luft getrocknet. Die Gitter wurden nacheinander inkubiert mit: a) Rinderserumalbumin (3% Lösung in gepufferter Kochsalzlösung, 30 min. 37ºC); b) anti-βgal-p362-Kaninchen-Antiserum (eine 10&supmin;³ Verdünnung von Ig in gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,05% Tween 20, 2 h, 37ºC); c) biotinyliertes Schaf-anti-Kaninchen-Ig (Verdünnung 1/200 von Ig der Fa. Amersham UK, in gepufferter Kochsalzlösung - Tween, 1 h, 20ºC); d) mit Gold markiertes Streptavidin (Verdünnung 1/20 eines Präparats der Fa. Amersham, UK) (A. Cloeckaert et al., 1990, "Identification of seven surface-exposed Brucella outer membrane proteins by use of monoclonal antibodies: immunogold labelling for electron microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay", Infec. Immun., Bd. 58, S. 3980-3987).
• [0187] Die Gitter wurden in einem Transmissionselektronenmikroskop analysiert (Philips cm 10).
Ergebnisse 1. Herstellung einer Genombank von M. paratuberculosis und Isolierung von rekombinanten Klonen
• [0188] Eine Genombank von M. paratuberculosis wurde unter Verwendung des Expressionsvektors λgt11 hergestellt. Zu diesem Zweck wurde gereinigte mycobakterielle DNA einer Ultraschallbehandlung unter kontrollierten Bedingungen unterzogen, wodurch man Segmente mit durchschnittlich 103 bp (0,5 bis 2 · 103) erhielt. Diese Frqagmente wurden mit EcoRI-DNA- Methylase methyliert (der Wirkungsgrad der Methylierung wurde durch Inkubation mit EcoRI kontrolliert), mit T4-DNA-Polymerase unter Bildung von stumpfendiger DNA inkubiert und durch Inkubation mit T4-DNA-Ligase mit EcoRI-Linkern versehen. Nach EcoRI-Verdau wurden die DNA-Segmente von überschüssigem Linker gereinigt und in mit EcoRI-gespaltenes λgt11 durch Inkubation mit T4-DNA-Ligase inseriert (diese Stufe wurde durch Gelelektrophorese geprüft). Nach Packung und Infektion von E. coli Y1090 wurden 7,5 · 10&sup5; rekombinante Klone (75% der Gesamtklone) erhalten, wovon ein Drittel einem Screening mit Kaninchen-anti-M. paratuberculosis-Antiserum (Dako) unterzogen wurde. Nach wiederholten Reinigungsschritten wurden 10 rekombinante Klone ausgewählt: drei davon exprimierten TMA-Komplexproteine und sieben bildeten Epitope von Proteinen, die innerhalb des TMA-Komplexes nicht vorhanden sind.
2. Analyse der Antigenizität und Spezifität von durch rekombinante Klone gebildeten Polypeptiden
• [0189] Da die Klonierung von M. paratuberculosis-Genen bei der Erzeugung von Polypeptiden zur Verwendung als diagnostische Reagenzien angestrebt ist, erschien es als wesentlich, die Reaktivität von rekombinanten Klonen gegen Seren von Vieh, das von der Johne- Krankheit befallen war, zu testen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, reagierten alle ausgewählten Klone mit Seren von Tieren, die eine der klinischen Formen der Krankheit zeigten. Die stärksten Reaktionen wurden durch die Klone a4 und a362 erreicht. Dagegen wurde keine Reaktivität mit Seren von gesunden Rindern beobachtet. Tabelle 3 Eigenschaften von Klonen, die ein antigenes Polypeptid von M. paratuberculosis exprimieren
• * Nur die Klone a361 und a363 exprimieren Polypeptide, die zum TMA-Komplex gehören.
• ** Nachgewiesen durch Seren von asymptomatischen und nicht-exkretorischen Rindern (1), asymptomatischen und exkretorischen Rindern (2) und symptomatischen und exkretorischen Rindern (3); quantitativ eingestuft als geringe Reaktion "(+)", gute Reaktion "+" und sehr gute Reaktion "++".
• *** Die Kreuzreaktivität wurde durch "nein" und die Spezifität durch "ja" angegeben. [0190] Ein weiteres Erfordernis von herausragender Bedeutung war die Spezifität in bezug auf Mycobakterien, die zur saprophytischen und pathogenen Flora von Vieh gehören.
• Rekombinante Klone wurden auf Reaktivität mit Antiseren gegen Homogenisate von M. avium, M. bovis und M. phlei getestet. Früher wurde gezeigt, dass die DNA-Gesamthomologiegrade dieser drei Mycobakterien in bezug auf M paratuberculosis 94, 52 bzw. 19% betrugen (5. S. Hurley et a1., 1988, "DNA relatedness ofM paratuberculosis to other members of the family of mycobacteriaceae", Int. Journal Syst. Bact., Bd. 38, S. 143-146). Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass zwar alle Klone mit Ausnahme von einem gegen M. phlei spezifisch waren, jedoch nur fünf davon spezifisch gegen M. bovis und zwei spezifisch gegen M. avium.
• [0191] Zusammenfassend ist festzustellen, dass nur zwei der ausgewählten Klone, a2 und a362, beide Anforderungen in bezug auf Spezies-Spezifität und Relevanz für die Johne-Krankheit erfüllten. Außerdem reagierte nur der letztgenannte Klon mit anti-A36-Antiserum und entsprach daher einem A36-Protein, vermutlich dem 34 kDa-Protein, das früher als eine TMA- Komplexkomponente mit Spezies-spezifischen Epitopen identifiziert worden war. Der restliche Teil dieses Beispiels bezieht sich auf die Charakterisierung und Verwendung des Klons a362.
3. Größe des Klon a362-Inserts und seines exprimierten Polypeptids p362
• [0192] Die EcoRI-Spaltung der DNA des Klons a362 ergab ein Insert von etwa 500 bp, das frei von internen EcoRI-Restriktionsstellen war (nicht abgebildet).
• [0193] E. coli Y1089 wurde mit dem rekombinanten Phagen lysogeniert. Die Synthese eines chimären Proteins, das mit β-Galactosidase fusioniert war, wurde durch IPTG induziert. Es wurde ein Fusionsprotein von etwa 125 kDa (β-gal-p362) gebildet (Fig. 5). Da in λgt11 der β- Galactosidase (116 kDa) 2 kDa fehlen, ist zu erwarten, dass das rekombinante Polypeptid, für das das Insert des Klons a362 kodiert (p362), eine Größe von etwa 11 kDa aufweist. Infolgedessen kodierte nur ein Teil von etwa 300 bp des 500 bp-Inserts für ein derartiges 11 kDa-Polypeptid. Dies wurde durch Sequenzierung und Bestimmung der Orientierung der Insert-DNA gemäß den nachstehenden Angaben bestätigt.
4. Herstellung eines rekombinanten p362-Polypeptids und Nachweis dafür, dass dieses zu einem 34 kDa-Protein von A36 gehört
• [0194] Da die Bildung von β-gal-p362 durch E. coli Y1089, das den rekombinanten λgt11- Phagen enthielt, nur 2% der Gesamtproteine betrug, wurde das entsprechende Insert in einem günstigeren Expressionsvektor rekloniert. Zu diesem Zweck wurde das λgt11-Insert des rekombinanten a362-Klons durch Inkubation mit EcoRI freigesetzt, durch Elektroelution aus einem Agarosegel gereinigt (Ausbeute 75%) und in die EcoRI-Stelle des Expressionsvektors pUEX2 (Amersham) rekloniert. In diesem Fall betrug die Bildung des ßgal-p362-Fusionsproteins im transformierten MC1061-Stamm von E. coli (6 · 105 Transformanten/ug DNA) etwa 25% der Gesamtproteine.
• [0195] Nachdem das Lysat der transformierten Stämme einer SDS-PAGE unterworfen worden war, wurde das rekombinante Fusionsprotein aus dem Polyacrylamidgel eluiert und zur Erzeugung von Antikörpern in Kaninchen verwendet (anti-βgal-p362).
• [0196] Die Proteinkomponenten des TMA-Komplexes aus M. paratuberculosis wurden durch Elektrophorese an Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE) fraktioniert. Nach Übertragung auf Nitrocellulosefolien wurden TMA-Proteine mit anti-ßgal-p362 inkubiert. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurde eine Hauptbande, die dem 34 kDa-Protein des TMA-Komplexes entsprach, immunomarkiert: dies war das einzige TMA-Protein, das Spezies-spezifische Epitope enthielt, wie vorstehend angegeben wurde. Eine zweite Bande von etwa 31 kDa wurde in untergeordnetem Maße gefärbt. Sie trat auch in den Immunoblots von TMA-Proteinen mit Seren von infiziertem Vieh auf.
5. Lokalisierung des p362 Polypeptids an der Bakterienoberfläche
• [0197] Da früher gezeigt wurde, dass der A36-Antigenkomplex an der Zelloberfläche vorliegt, würde eine periphere Position des rekombinanten p362-Polypeptids eine weitere Bestätigung erbringen, dass dieses rekombinante p362-Polypeptid ein Protein des A36-Komplexes ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen tatsächlich das Vorliegen des p362-Polypeptids innerhalb der Zellwand und dessen Freisetzung während der abnehmenden Wachstumsphase (Ergebnisse nicht abgebildet).
6. Ermittlung der Spezies-Spezifität des rekombinanten Polypeptids p362
• [0198] Aus den vorstehenden Ausführungen zeigt sich, dass die 34 kDa-Proteinkomponente des TMA-Komplexes von M. paratuberculosis Epitope enthält, die frei von Kreuzreaktivität gegen M. bovis, M. avium und M phlel sind. Obgleich das rekombinante p362-Polypeptid, das offensichtlich einen Teil des 34 kDa-Proteins darstellt, vermutlich mit Spezies-Spezifität ausgestattet ist, ist eine zwingendere Bestätigung für die Vorhersage bezüglich der Eignung eines Polypeptids als Reagenz für serologische Tests erforderlich. Infolgedessen wurde die Spezifität von p362 gegen zwei Serien von M. paratuberculosis- und M. avium-Isolaten aus Vieh sowie gegen bestimmte gram-positive und gram-negative Bakterien, die üblicherweise in Rindereingeweiden vorkommen, getestet (Tabelle 4).
• [0199] Das Dot-Blot-Experiment wurde durchgeführt, indem 2 ug-Proben von verschiedenen bakteriellen Homogenisaten auf eine Nitrocellulosemembran aufgesetzt wurden. Die Membranen wurden sodann nacheinander mit Kaninchen-anti-β-gal-p362-Antiserum und nach Waschen mit peroxidasemarkiertem Schweine-anti-Kaninchen-IgG inkubiert. Die Flecken wurden durch die Peroxidase-Reaktion nachgewiesen. Sämtliche acht M. paratuberculosis-Isolate waren positiv, während die eng verwandten Organismen der MAIS-Gruppe negativ waren. Keines der getesteten übrigen Mycobakterien ergab eine positive Reaktion, was auch bei Nocardia- und Brucella-Spezies nicht der Fall war (vergl. Tabelle 4). Tabelle 4 Spezifität von p362 gegen andere [Mycol-Bakterien
• (+) Positive immunologische Reaktion
• (-) Fehlen einer Reaktion
• (1) Portaels IMTA (Institut de Medecine Tropicale, Antwerpen, Belgien)
• (2) Kaeckenbeck, DBUL (Departement de Bacteriologie, Universität Lüttich, Belgien)
• (3) LIMET ICP (Institute of Cellular Pathology, Belgien)
• (4) Defoe IPB (Institut Pasteur, Brabant, Belgien)
• (5) Saxegaard NVIN (National Veterinary Institute, Norwegen)
• (6) ATCC 25618
• 7. Sequenzierung des für das Polypeptid p362 kodierenden klonierten Inserts [0200] Zur Sequenzierung des 500 bp-DNA-Segments, das für das Polypeptid p362 kodiert, wurde das Insert des Klons a362 durch EcoRI-Spaltung aus dem chimären Vektor λgt11 isoliert und in den Bluescript-Vektor SK&spplus; rekloniert. Nach Transformation von E. coli DH5αF' wurden Klone, die die für p362 kodierenden Inserts trugen, ausgewählt.
• [0201] Die Sequenz des Inserts ergab das Vorliegen eines 507 bp-DNA-Segments, flankiert von zwei EcoRI-Enden (Fig. 7C). Der G+C-Gehalt dieses Segments betrug 70%, was mit dem Wert von 64% G+C des gesamten M. paratuberculosis-Genoms übereinstimmt. Die Sequenz in Fig. 7C ergab zwei offene Leseraster in Phase mit den EcoRI-Stellen: eine 306 bp-Region (1 bis 306) in einer Richtung und eine 185 bp-Region (507 bis 322) mit entgegengesetzter Orientierung. Das Programm COD-FICK (PC-GENE), das die Codon-Anwendung berücksichtigt, bestätigte die Kodierungsfähigkeit der beiden offenen Leseraster. Sie kodierten für Polypeptide mit 10 kDa bzw. 7 kDa. Das Insert wurde in einen Expressionsvektor in E. coli in beiden Orientierungen subkloniert.
• Nur eine Orientierung ergab ein Expressionsprodukt, das mit dem Kaninchen-anti-β-gal-p362- Antiserum reagierte. Eine Restriktionsanalyse führte zur Auswahl des offenen Leserasters mit 306 bp, der für das p362-Polypeptid (10 kDa) kodierte. Die ausgewählte Kodierungsregion und die Aminosäuresequenz des Polypeptids p362, entsprechend dem carboxyterminalen Ende des 34 kDa- Proteins, sind in Fig. 8 dargestellt.
8. Testen von p362 in einem ELISA-Test für die Johne-Krankheit
• [0202] Das 10 kDa-Polypeptid (p362), das mit Spezies-Spezifität ausgestattet ist und ein Teil des 34 kDa-Proteins von A36 ist, kann in einem spezifischen Test für Paratuberkulose eingesetzt werden.
• [0203] Ein Vorversuch wurde unter Verwendung von Platten, auf die Gesamtcytoplasma von E. coli a362 mit einem Gehalt an p362 aufgebracht war, durchgeführt. Rinderseren wurden einer Vorabsorption mit E. coli-Kontrollhomogenisat unterzogen. Fig. 2 zeigt, dass sämtliche Seren von infizierten Rindern in signifikanter Weise mit p362 reagieren. Dagegen lieferten gesunde Rinder (Proben 26-32) kein Signal, das signifikant höher als das mit E. coli-Kontrollcytoplasma beobachtete Signal ist.
• [0204] Gegen p362 gerichtete Antikörper sind bereits in den frühen Krankheitsstadien vorhanden (Proben 1-13). p362 kann somit als sehr geeignetes Antigen für die spezifische und empfindliche Diagnose von Paratuberkulose angesehen werden.
• [0205] Zur Verringerung des Hintergrundausmaßes aufgrund von Kreuzreaktion mit dem β- Galactosidase-Teil des Fusionsproteins wurde das für p362 kodierende Insert in einen weiteren Expressionsvektor (pmTNF-MPH, Innogenetics) rekloniert (Figg. 9a und 9b).
• [0206] Dieser Vektor enthält das Tetracyclin-Resistenzgen und die Replikationsursprungsstelle von pAT153 (erhältlich von Bioexcellence, Biores B. V., Woerden, Niederlande), den lambda-PL-Promotor bis zur MboII-Stelle in der N-Gen-5'-untranslatierten Region (aus pPL(λ) stammend; Pharmacia), gefolgt von einer synthetischen Ribosomenbindungsstelle (vergl. die Sequenzdaten) und der für die ersten 25 Aminosäuren von mTNF (mit Ausnahme des anfänglichen Leu, das in Val umgewandelt ist) kodierenden Information. Dieser Sequenz folgen wiederum eine synthetische Polylinkersequenz, die für sechs aufeinanderfolgende Histidinreste kodiert, und mehrere proteolytische Stellen (eine gegenüber Ameisensäure, CNBr, Kallikrein bzw. E coli-Protease VII empfindliche Stelle), die jeweils über verschiedene Restriktionsenzyme, die für das Plasmid eindeutig sind (SmaI, NcoI, BspMII bzw. Stul; vergl. die Restriktionskarte und genetische Karte, Fig. 9a), zugänglich sind. Stromabwärts vom Polylinker befinden sich mehrere Transkriptionsterminatoren, einschließlich der E coli-trp- Terminator (synthetisch) und der rmBTIT2-Terminator (stammend aus pKK223-3; Pharmacia). Die gesamte Nucleinsäuresequenz dieses Plasmids ist in Fig. 9b dargestellt.
• [0207] Tabelle 5 zeigt die gesamte Restriktionsstellenanalyse von pmTNF-MPH.
• [0208] Das Vorliegen von sechs aufeinanderfolgenden Histidinresten ermöglicht die Reinigung des Fusionsproteins durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC).
• [0209] Zur Subklonierung des für p362 kodierenden Inserts in pmTNF-MPH, wurde es aus dem Konstrukt im Vektor pUEX2 durch EcoRI-Verdau freigesetzt. Das EcoRI-Fragment (507 bp) wurde aus dem Gel eluiert, gereinigt, stumpfendig gemacht und in die stumpfendig gemachte XbaI- Stelle von pmTNF-MPH inseriert. Das erhaltene rekombinante Plasmid, pmTNF-MPH-a362 wurde durch Transformation in den E coli-Stamm K12ΔH (ATCC 33767) gebracht. Nach Züchtung bei 28ºC wurde die Expression des rekombinanten Proteins durch eine Temperaturverschiebung auf 42ºC induziert, wonach diese Temperatur 2 Stunden aufrechterhalten wird. Die Zellen wurden geerntet, zentrifugiert und in einer French-Presse lysiert.
• [0210] Das exprimierte Fusionsprotein mTNF-H6-p362, das in der (Zytoplasmafraktion des rekombinanten E coli vorhanden ist, wurde durch immobilisierte Metallionen- Affinitätschromatographie (IMAC) unter dem Fachmann geläufigen Bedingungen gereinigt. Die Aminosäuresequenz dieses vollständigen Fusionsproteins ist in Fig. 10 dargestellt.
• [0211] Das gereinigte Fusionsprotein wurde zur Beschichtung von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verwendet. Anschließend wurde eine Inkubation mit seriellen Verdünnungen von Seren von nicht-infizierten (Kontrolle) und infizierten Tieren durchgeführt. Das an die Platte gebundene IgG wurde mit peroxydasemarkiertem Kaninchen-anti-Rinder-IgG gemäß den Angaben in Materialien und Methoden titriert.

Claims (27)

PATENTANSPRÜCHE FÜR DIE VERTRAGSSTAATEN AT, BE, CH. LI, DE. DK, FR, GB, IT, LU, MC NL SE

1. Polypeptid, das in seiner Polypeptidkette folgendes enthält:

- die 101 Aminosäuren lange Aminosäuresequenz von Fig. 8,

- oder ein Fragment dieser Sequenz, wobei dieses Fragment dergestalt ist, daß es von Antikörpern erkannt werden kann, die auch die obengenannte 101 Aminosäuren lange Sequenz erkennen, jedoch nicht von Antikörpern gegen M. bovis, M. avium, M. phlei und M. tuberculosis erkannt wird,

Antikörper hervorrufen kann, die ebenfalls die obengenannte 101 Aminosäuren lange Sequenz erkennen, jedoch nicht M. bovis, M. avium, M. phlei und M. tuberculosis erkennen, mit Seren von Rindern, die an der Johne-Krankheit leiden, reagiert,

- oder die durch Modifikation mittels Substitution und/oder Addition und/oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren entstandenen Polypeptidsequenzen, solange diese Modifikation die obengenannten Eigenschaften nicht ändert.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich aus der in Fig. 8 dargestellten Sequenz zusammensetzt, die sich von dem durch die Aminosäure an der 1- Stellung gebildeten Ende bis zu dem von der Aminosäure an der 101-Stellung gebildeten Ende erstreckt, oder sich aus den folgenden Peptiden zusammensetzt:

3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es:

- die 101 Aminosäuren lange Aminosäuresequenz von Fig. 8 als C-terminalen Teil enthält,

- über ein Molekulargewicht von ungefähr 34 kDa in der SDS-PAGE verfügt,

- von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die mit dem Komplementärstrang der Nukleotidsequenz von Fig. 11 hybridisieren kann,

- mit Seren von Rindern, die an der Johne-Krankheit leiden, reagiert,

- bei sensibilisierten Patienten eine Zellimmunreaktion hervorrufen kann.

4. Polypeptide nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthalten bzw. aus folgendem bestehen:

- die bzw. der Aminosäuresequenz von Fig. 11 oder

- die bzw. der Aminosäuresequenz, die sich von der Aminosäure an der 1-Stellung bis zu der Aminosäure an der 199-Stellung von Fig. 11 erstreckt.

5. Aminosäuresequenzen, die sich aus einem beliebigen der Polypeptide nach den Ansprüchen 1 bis 4 und einem Protein oder einer zu diesem Polypeptid heterologen Sequenz zusammensetzen, wobei das Protein bzw. die heterologe Sequenz zum Beispiel ungefähr 1 bis ungefähr 1100 Aminosäuren umfaßt.

6. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält oder aus folgendem zusammengesetzt ist:

- eine bzw. einer Nukleotidkette, die mit der für die Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codierenden Nukleotidkette hybridisieren kann und die selbst ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert, oder

- eine bzw. einer Nukleotidkette, die für die Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert,

oder

- die bzw. den Sequenzen, die zu den obengenannten Nukleotidketten komplementär sind.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält oder sich aus folgendem zusammensetzt: eine bzw. einer Nukleotidkette,

- die sich von dem durch das Nukleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nukleotid in der 307-Stellung gebildete Ende in Fig. 7A erstreckt, oder

- die sich von dem durch das Nukleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem von dem Nukleotid in der 508-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7A erstreckt, wobei

- X und E Phosphodiesterbrücken darstellen, Y und F G bzw. C darstellen, und Z und H C bzw. G darstellen,

oder

- X und E G bzw. C darstellen, Y und F C bzw. G darstellen, und Z und H Phosphodiesterbrücken darstellen.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes enthält bzw. aus folgendem besteht: eine bzw. einer Nukleotidkette, die sich von dem durch das Nukleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nukleotid in der 306-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7C erstreckt, oder

- die sich von dem durch das Nukleotid in der 1-Stellung gebildeten Ende bis zu dem durch das Nukleotid in der 507-Stellung gebildeten Ende in Fig. 7C erstreckt.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 6, die folgendes enthält bzw. aus folgendem zusammengesetzt ist:

die bzw. der Nukleotidsequenz von Fig. 11 oder die bzw. der Nukleotidsequenz, die sich von dem Nukleotid in der 742-Stellung bis zu dem Nukleotid in der 1338-Stellung von Fig. 11 erstreckt,

- die bzw. den Sequenzen, die zu den obendefinierten Sequenzen komplementär sind.

10. Rekombinante Nukleinsäure mit mindestens einer der Nukleotidsequenzen nach einem der Ansprüche 6 bis 9, die mit einer heterologen Nukleinsäure kombiniert oder in eine heterologe Nukleinsäure insertiert ist.

11. Rekombinanter Vektor, insbesondere für Klonier- und/oder

Expressionszwecke, mit einer Vektorsequenz, vor allem des Plasmid-, Kosmid-, Phagen-, oder Virus-DNA-Typs, sowie einer rekombinanten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9, die in eine der für ihre Replikation nicht wesentlichen Stellen insertiert ist.

12. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11 mit erforderlichen Elementen zur Förderung der Expression von Polypeptiden, die von in diesen Vektor insertierten Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 6 bis 9 und vor allem einem von der RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannten Promoter, insbesondere einem induzierbaren Promoter, und gegebenenfalls einer für die Transkriptionstermination codierenden Sequenz und gegebenenfalls einer Signalsequenz und/oder einer Ankersequenz codiert werden, in einer Wirtszelle.

13. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 11 mit den Elementen, die die Expression eines Fusionsproteins bestehend aus dem Polypeptid der β-Galactosidase oder einem Teil hiervon, das mit einem von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9 codierten Polypeptid verbunden ist, durch E. coli gestattet.

14. Wirtszelle, ausgewählt aus Bakterien wie E. coli oder ausgewählt aus Eukaryonten, wie CHO-Zellen oder Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 10 bis 13 transformiert ist und die die Regulationselemente, die die Expression der für das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codierenden Nukleotidsequenz in diesem Wirt gestatten, enthält.

15. Expressionsprodukt einer von einer transformierten Wirtszelle nach Anspruch 14 exprimierten Nukleinsäure.

16. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 gerichtet ist, und vorzugsweise dadurch, daß er weder M. bovis noch M. avium noch M. phlei noch M. tuberculosis erkennt.

17. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit den folgenden Schritten:

- Kultur einer Wirtszelle, die zuvor mit einem geeigneten Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9 transformiert wurde, in einem geeigneten Medium, sowie

- Gewinnung des durch die genannte transformierte Wirtszelle produzierten Polypeptids aus dem genannten Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.

18. Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Paratuberkulose an einem Tier, das gegebenenfalls mit Mycobacterium paratuberculosis infiziert ist, wobei man

- eine von einem Tier gewonnene biologische Probe mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Expressionsprodukt nach Anspruch 15 unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine in-vitro-Immunreaktion zwischen dem Polypeptid und den gegebenenfalls in der biologischen Probe vorhandenen Antikörpern gestattet, sowie

- den gegebenenfalls gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex in vitro nachweist.

19. Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Paratuberkulose bei einem gegebenenfalls mit M. paratuberculosis infizierten Tier, umfassend die folgenden Schritte:

- In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit einem geeigneten Antikörper nach Anspruch 16 unter Bedingungen, die eine in-vitro-Immunreaktion zwischen dem Antikörper und den Antigenen von M. paratuberculosis, die gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegen, gestatten, sowie

- in-vitro-Nachweis des gegebenenfalls gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

20. Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Morbus Crohn bei einem gegebenenfalls mit Mycobacterium paratuberculosis infizierten Patienten, umfassend die folgenden Schritte:

- In-Kontakt-Bringen einer biologischen Probe mit einem geeigneten Antikörper nach Anspruch 16 unter Bedingungen, die eine in-vitro-Immunreaktion zwischen dem Antikörper und den Antigenen von M. paratuberculosis, die gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegen, gestatten, sowie

- in-vitro-Nachweis des gegebenenfalls gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

21. Verfahren zur in-vitro-Diagnose von Morbus Crohn bei einem gegebenenfalls mit M. paratuberculosis infizierten Patienten, umfassend die folgenden Schritte:

- In-Kontakt-Bringen einer von einem Patienten stammenden biologischen Probe mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Expressionsprodukt nach Anspruch 15 unter Bedingungen, die eine in-vitro-Immunreaktion zwischen dem Polypeptid und den gegebenenfalls in der biologischen Probe vorliegenden Antikörpern gestatten, sowie

- in-vitro-Nachweis des gegebenenfalls gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes.

22. Besteck oder Kit für ein in-vitro-Diagnoseverfahren für Paratuberkulose an einem gegebenenfalls mit Mycobacterium paratuberculosis infizierten Tier nach Anspruch 18 mit:

- einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Expressionsprodukt von Anspruch 15,

- Reagenzien zur Herstellung eines Mediums, das sich für das Ablaufen der Immunreaktion eignet,

- Reagenzien, die den Nachweis des durch die Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes gestatten, wobei diese Reagenzien möglicherweise markiert sind oder von einem markierten Reagens erkannt werden können, insbesondere dann, wenn das oben genannte Polypeptid nicht markiert ist.

23. Besteck oder Kit für ein in-vitro-Diagnoseverfahren für Paratuberkulose an einem gegebenenfalls mit Mycobacterium paratuberculosis infizierten Tier nach Anspruch 19 mit:

- einem Antikörper nach Anspruch 16,

- Reagenzien zur Herstellung eines Mediums, das sich für das Ablaufen der Immunreaktion eignet,

- Reagenzien, die den Nachweis des durch die Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes gestatten, wobei diese Reagenzien möglicherweise markiert sind oder von einem markierten Reagens erkannt werden können, insbesondere dann, wenn der oben genannte Antikörper nicht markiert ist.

24. Besteck oder Kit für ein in-vitro-Diagnoseverfahren für Morbus Crohn bei einem gegebenenfalls mit Mycobacterium paratuberculosis infizierten Patienten nach Anspruch 20 mit:

- einem Antikörper nach Anspruch 16,

- Reagenzien zur Herstellung eines Mediums, das sich für das Ablaufen der Immunreaktion eignet,

- Reagenzien, die den Nachweis des durch die Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes gestatten, wobei diese Reagenzien möglicherweise markiert sind oder von einem markierten Reagens erkannt werden können, insbesondere dann, wenn der oben genannte Antikörper nicht markiert ist.

25. Besteck oder Kit für ein in-vitro-Diagnoseverfahren für Morbus Crohn bei einem gegebenenfalls mit Mycobacterium paratuberculosis infizierten Patienten nach Anspruch 21 mit:

- einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Expressionsprodukt von Anspruch 15,

- Reagenzien zur Herstellung eines Mediums, das sich für das Ablaufen der Immunreaktion eignet,

- Reagenzien, die den Nachweis des durch die Immunreaktion gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes gestatten, wobei diese Reagenzien möglicherweise markiert sind oder von einem markierten Reagens erkannt werden können, insbesondere dann, wenn das oben genannte Polypeptid nicht markiert ist.

26. Immunogene Zusammensetzung mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder dem Expressionsprodukt nach Anspruch 15 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Vehikel.

27. Besteck oder Kit zur Diagnose dafür, ob ein Tier mit M. paratuberculosis in Berührung gekommen ist, wobei dieses Besteck oder Kit ein Präparat von mindestens einem der Polypeptide oder Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Expressionsprodukt nach Anspruch 15 enthält, wobei das Präparat fähig ist, nach intradermaler Injektion in ein Tier an der Injektionsstelle in vivo eine Spättyp-Überempfindlichkeitsreaktion hervorzurufen, falls das Tier zuvor mit M. paratuberculosis in Berührung gekommen ist.