DE68926856T2

DE68926856T2 - Diagnose der infektion mit mycobacterium bovis

Info

Publication number: DE68926856T2
Application number: DE68926856T
Authority: DE
Inventors: Theodora Fifis; Anthony Radford; Paul Wood
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2009-04-01
Also published as: EP0408625B1; NZ228529A; HK24797A; WO1989009261A1; EP0408625A1; IE891022L; IE62428B1; AR241937A1; EP0408625A4; DE68926856D1; ATE140481T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von Rindertuberkulose und insbesondere die Verwendung eines speziellen Spezies-spezifischen Antigens zur Diagnose einer Mycobacterium bovis-Infektion, wie Rindertuberkulose, mittels sowohl eines Antikörpertests als auch eines Zelltests.
Rindertuberkulose (BTB) ist weltweit die Haupterkrankung bei Rindern. Auf dem amerikanischen Kontinent alleine schätzt man, daß im Jahre 1977 dadurch der Rinderindustrie 83 Million $ an Kosten entstanden sind (Weltgesundheitsorganisation, 1983). Verschiedene Nationen haben sich aufgeschwungen oder führen Kampagnen, um BTB zu eliminieren. Obwohl diese Kampagnen das Auftreten der Erkrankung drastisch verringert haben, war keine Kampagne vollständig erfolgreich. In vielen Teilen der Welt gibt es keine konzertierten Anstrengungen, um diese Krankheit, die Gesundheitsrisiken für Menschen sowie für Tiere mit sich bringt, zu bekämpfen. Der Verursacher der Rindertuberkulose, das Mycobacterium bovis, ist eng verwandt mit M. tuberculosis.
Die Ausrottung der Erkrankung bei Rindern wurde durch das Fehlen der Empfindlichkeit und Spezifität des gegenwärtig zum Nachweis infizierter Tiere verwendeten Rinderhauttests behindert. Ein einfacher serologischer Test auf BTB wäre das bevorzugte Mittel der Wahl. Es gibt jedoch zwei fundamentale Probleme bei jedem beliebigen Test auf M. bovis-spezifische Antikörper. Infizierte Tiere besitzen im allgemeinen niedrige Spiegel der Antikörper gegen M. bovis. Viele der gebildeten Antikörper gehen mit Antigenen anderer Umweltmycobakterienspezies oder Nocardienspezies Kreuzreaktionen ein (Daniel und Mitarbeiter, 1978). Enzymimmunoassays unter Verwendung von M. bovis-Proteinextrakten als Antigenen wurden zum Nachweis infizierter Rinder (Ritacco und Mitarbeiter, 1987; Theon und Mitarbeiter, 1983) verwendet. Diesen Tests unter Verwendung roher Antigene scheint es jedoch an einer ausreichenden Spezifität oder Empfindlichkeit zu fehlen, um zur Verwendung bei einer Ausrottungskampagne akzeptabel zu sein (Auer, 1987). Diese Probleme sind für die serologische Diagnose aller Mycobakterieninfektionen üblich.
Das MPB-70-Protein ist das Hauptantigen des Mycobacteriumbovis-Stamms und des M. bovis/BCG-Stamms. Es kann mehr als 10% des in Kulturfiltratzubereitungen von diesen Organismen vorhandenen Gesamtproteins ausmachen (Nagai und Mitarbeiter, 1981; Harboe und Nagai, 1984). Es wurde gezeigt, daß dieses Protein bei mit M.bovis/BCG immunisierten Meerschweinchen eine starke verzögerte Hauttestreaktion induziert und mit anderen Mycobakterienspezies eine beschränkte Fähigkeit zur Kreuzreaktion besitzt (Harboe und Mitarbeiter, 1986; Haslov und Mitarbeiter, 1987).
Bei den zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten wurde die Eignung dieses Antigens in Antikörpertests und Zelltests zur Diagnose von M.bovis-Infektionen bei Rindern untersucht. Es wurde festgestellt, daß das MPB-70-Protein von allen Rinderfeldisolaten der getesteten M.bovis-Stämme (151 getrennte Feldisolate, Tabelle 1) exprimiert wurde und in verschiedenen anderen üblicherweise in der Umgebung gefundenen Mycobakterien nicht vorhanden war.
Die vorliegende Erfindung liefert das MPB-70-Protein von M.bovis mit der in Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz 1 bis 163, die, wie im folgenden ausgeführt, deutlich von bisher veröffentlichten Sequenzen abweicht. Dieses MPB-70-Protein von M.bovis eignet sich zur Diagnose einer Mycobactenum-bovis-Infektion bei empfänglichen Tieren durch Nachweis von Antikörpern hiergegen in diesen Tieren und/oder zum Nachweis einer zellvermittelten Immunantwort des Tiers auf das MPB-70-Protein.
Erfindungsgemäß wird das MPB-70-Protein als spezifisches Antigen zur Diagnose einer M.bovis-Infektion verwendet. MPB-70 kann als Antigen in einem Test auf Antikörper gegen M.bovis entsprechend einem der allgemein bekannten Antikörpertests, wie ELISA-, RIA-, CFT-Verfahren und dergl., verwendet werden. MPB-70 kann ferner als Antigen beim Kaudalfaltenhauttest in vivo sowie als Antigen bei in-vitro-Tests bezüglich einer zellvermittelten Immunantwort, beispielsweise Proliferationstests oder Tests auf der Basis der Freisetzung von Gammainterferon oder Interleukin 2, verwendet werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung insbesondere auf die Diagnose einer M. bovis-Infektion bei Rindern, die Rindertuberkulose hervorruft, gerichtet ist, erstreckt sich das erfindungsgemäße Verfahren (auch) auf den Nachweis einer M.bovis- Infektion bei beliebigen anderen empfänglichen Tierspezies, einschließlich beispielsweise Hirschen, Dachsen, Beutelratten, Schweinen und Kamelen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf ein Verfahren zur Reinigung des MPB-70-Proteins aus einem M.bovis- Kulturfiltratmaterial sowie auf die Herstellung von rekombinantem MPB-70-Protein durch Klonieren und Exprimieren in einer Wirtzelle, wie E. coli.
Es ist selbstverständlich, daß die Bezugnahmen auf MPB-70- Protein hier und im folgenden nicht nur das vollständige Protein, sondern auch beliebige Polypeptidteile hiervon, die die Antigenität von MPB-70 aufweisen und folglich in den hier beschriebenen Assays entsprechend dem MPB-70-Protein selbst verwendet werden können, umfassen.
Das MPB-70-Protein wurde aus einem M.bovis-Kulturfiltrat durch Farbfokussieren auf einer Mono-P-Säule gereinigt. Fig.1 zeigt ein typisches Eluierprofil mit den mit Pfeilen versehenen Peaks, die den Hauptteil des MPB-70-Antigens enthalten. Wenn die Fraktionen in jedem Peak gesammelt und auf Westernblots mit einem monoklonalen Antikörper, der für MPB-70 spezifisch ist, sondiert werden, wurde ein Protein mit einem Molekulargewicht von 22 kd nachgewiesen (Fig.2)
Das gereinigte MPB-70 wurde sowohl mit Hilfe von in-vivo- als auch mit Hilfe in-vitro-Zellassays untersucht. Die in-vivo-Tests wurden unter Verwendung des herkömmlichen Hauttests sowohl bei mit abgetöteten M.bovis-Zellen sensibilisierten Meerschweinchen als auch bei mit lebenden M.bovis- Zellen infizierten Rindern durchgeführt. MPB-70 induzierte sowohl bei immunisierten Meerschweinchen (Tabelle 2) als auch bei infizierten Rindern (Tabelle 3) eine positive Reaktion, auch wenn diese nicht so stark war, wie die, die durch gereinigte Rindertuberkulinproteinderivate (PPD) in ähnlichen Konzentrationen induziert wurde. MPB-70 wurde ferner in vitro auf seine Fähigkeit, die Proliferation von peripheren Blutlymphocyten aus mit M.bovis infizierten Rindern zu stimulieren, getestet. Das Niveau der Reaktivität mit MPB-70 war bei allen mit M.bovis infizierten Tieren ähnlich. Mit Lymphocyten aus nichtinfizierten Vergleichsrindern gab es keine Reaktivität (Tabelle 4).
Um seine Eignung als spezifisches Antigen zum Nachweis von mit M.bovis infizierten Rindern sicherzustellen, wurde MPB-70 in einem Antikörperassay (ELISA) getestet. Als Vergleich wurde in dem Antikörperassay rohes Kulturfiltratantigen verwendet. Die Antikörperergebnisse wurden mit dem herkömmlichen in-vivo-Kaudalfaltenhauttest verglichen. Obwohl die Empfindlichkeit des MPB-70-ELISA niedriger war als die, die sowohl bei dem mit rohem Antigen durchgeführten ELISA als auch dem Kaudalfaltentest erreicht wurde, war die Spezifität dieses Assays weit besser bei lediglich einigen falschen positiven Ergebnissen (Tabelle 5). Die niedrige Empfindlichkeit des Antikörperassays war höchstwahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Mycobakterien vorzugsweise ein T-Zellen-Ansprechen anstatt eines humoralen Ansprechens induzieren (Thorns und Morris, 1983).
In weiteren Untersuchungen wurde das MPB-70-Gen aus M.bovis in den λgt11-Expressionsvektor kloniert und seine DNA- Sequenz bestimmt. Die so bestimmte MPB-70-Sequenz unterscheidet sich deutlich von der, die von Patarroyo und Mitarbeitern (1986; 1986a) unter Verwendung von Proteinsequenzierverfahren abgeleitet wurde (Fig. 3). Wenn Serumproben von mit M.bovis infizierten Rindern durch Westernbiotten mit verschiedenen rekombinanten M.bovis-Fusionsproteinen gescreent wurden, zeigte sich, daß MPB-70 das dominierende, erkannte Antigen ist (Tabelle 6). Es wurde ferner festgestellt, daß das rekombinante MPB-70-Protein bei mit M.bovis immunisierten Meerschweinchen und Rindern eine gute Zellantwort induziert.
Die Bestimmung der DNA-Sequenz des MPB-70-Gens ermöglicht die Herstellung von der gesamten DNA-Sequenz oder einen Teil dieser DNA-Sequenz entsprechenden DNA-Sonden und die Verwendung einer derartigen Sonde zum Nachweis von M.bovisoder M.bovis/BCG-Organismen in Proben, wie Kulturen, Sputum oder Gewebeproben. Folglich liefert die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren zum Nachweis von M.bovis- oder M.bovis/BCG-Organismen in einer Probe durch Inberührungbringen der Probe mit einer der gesamten DNA- Sequenz des MPB-70-Gens oder einem Teil dieser Sequenz entsprechenden DNA-Sonde und Nachweisen eines Bindens der Sonde, um die Anwesenheit der Organismen in der Probe nachzuweisen. Tabelle 1 Immunoperoxidase-Anfärben von Mycobacterium bovis und anderen Bakterien unter Verwendung von für MPB-70 spezifischen monoklonalen Antikörpern Tabelle 2 Verzögertes Hautansprechen auf Rinder-PPD(1) und auf gereinigtes MPB-70 bei mit dem abgetöteten M.bovis-Stamm AN5 sensibilierten Meerschweinchen(3)
1. Die PFD-Konzentration basiert auf der bekannten biologischen Aktivität.
2. Die Konzentration der gereinigten Antigene basiert auf dem gefriergetrockneten Gewicht.
3. Vergleichstiere zeigten keinerlei Ansprechen. Tabelle 3 Verzögertes Hautansprechen auf Rinder-PFD und gereinigtes MPB-70 bei mit lebendem M.bovis infizierten Rindern
Rinder-PFD 0,1 mg, MPB-70 0,08 mg,
+ 10&sup6; M. bovis in Form einer intravenösen (I.V.) oder intratrachealen (lT) Injektion. Tabelle 4 Proliferierendes Ansprechen der Rinderlymphocyten von mit M.bovis infizierten Rindern auf Rinder-PPD und gereinigtes MPB 70
M.bovis-FFD 20 µg/ml.
gereinigtes MPB-70 50 µg/ml.
Die Tiere wurden 8 Wochen nach der Infektion getestet.
* Die Ergebnisse sind in Form der Stimulationsindices aus zwei getrennten Experimenten angegeben.
+ i.t. = intratracheal, i.v. = intravenös. Tabelle 5 Vergleich eines Antikörperassays unter Verwendung von MPB-70 oder rohem Antigen mit dem Kaudalfaltentest.
Der Infektionsstatus aller Rinder wurde durch eine ausgiebige Kultur von Lymphknotenmaterial und Läsionsmaterial bestimmt. Tabelle 6 Westernblotanalyse von M . bovis-Fusionsproteinen mit Seren von mit M.bovis infizierten Rindern
* Zahl der ein Positivsignal liefernden Seren MPB-70 = 22k-Protein.
Die 19-, 65- und 70k-Proteine wurden bereits früher kloniert und beschrieben (Shinnick und Mitarbeiter, 1987).
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den folgenden detaillierten Beispielen und den begleitenden Zeichnungen.
Es zeigen:
Figur 1 die Trennung von M.bovis-Antigenen auf einer Mono-P-Säule durch Farbfokussieren. Etwa 15 mg eines gefriergetrockneten Kulturfiltrats wurden in 0,5 ml 1:10 Polypuffer PB-74 eines pH-Werts von 4,0 gelöst und die Lösung auf die Säule aufgetragen. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Westernblotten bezüglich der Reaktivität mit monoklonalen Antikörpern analysiert. Die mit Pfeilen versehenen Peaks enthalten reaktive(s) Antigen(e). Die Fraktionen für einen jeden dieser Peaks wurden vereinigt;
Figur 2 eine SDS-PAGE- und Westernblottanalyse gesammelter Antigene aus der Mono-F-Säule. 30 µl eines jeden Pools wurden aufgetragen bzw. aufgegeben.
(a) Mit Silberfärbung angefärbtes Gel,
(b) Westerntransfer eines ähnlichen, mit M.bovisspezifischen, monoklonalen Antikörpern (SB10) sondierten Gels.
Spur (1) Molekulargewichtsmarker, Spur (2) Kulturfiltrat, Spur (3) Pool a, Spur (4) Pool b, Spur (5) Pool c und Spur (6) Pool d;
Figur 3 die M.bovis AN5-Sequenz des MPB-70-Gens und die translatierte Proteinsequenz hiervon und
Figur 4 das Sondieren verschiedener Mycobacterium-DNA mit einer MPB-70-Gensonde.

Beispiel 1: Isolation und Reinigung des MFB-70-Antigens aus M.bovis AN5-Kulturen

1. Mycobacteriumkulturen wurden 12 Wochen bei 37ºC in BAI-Medium in 5 % CO&sub2; enthaltender Luft gezüchtet.
2. Die Kulturmedien wurden gesammelt und zentrifugiert, um Zellen und Zellbruchstücke zu entfernen. Anschließend erfolgte ein Futrieren in der angegebenen Reihenfolge durch eine 0,45 µm Millipore-Membran und zweimal durch eine 0,22 µm Millipore-Membran.
3. Das Kulturfiltrat (CF) wurde durch Ultrafiltration (Amicon YM-5) oder durch Umkehrosmose gegen Aquacide II (Calbiochern) zehnfach aufkonzentriert. Der Puffer wurde gegen destilliertes Wasser ausgetauscht, worauf die Antigene lyophilisiert wurden&sub5;
4. Das lyophilisierte Material wurde in einem kleinen Volumen einer zehnfachen Verdünnung von Polypuffer PB-74 (Pharmacia), der mit Iminodiessigsäure (IMDAA) auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt worden war, gelöst. Ausgefallene Antigene wurden durch Zentrifugation entfernt, worauf der Überstand auf eine farbfokussierende Säule (Pharmacia Mono-P, 0,5 x 20 cm oder eine mit Pharmacia PBE-94-Gel gepackte Säule einer Größe von 1,5 x 60 cm), die mit 0,025 M Piperazin, das mit IMDAA auf einen pH Wert von 5,6 eingestellt worden war, äquilibriert worden war, aufgetragen wurde. Die Antigene wurden mit ungefähr 14 Säulenvolumina an zehnfach verdünntem und mit IMDAA auf einen pH-Wert von 4,0 eingestelltem PB-74 eluiert. Das Eluieren wurde mittels Absorption bei 280 nm überwacht.
5. MPB-70 enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und durch Gelfiltration weiter gereinigt. Wenn geringfügige Verunreinigungen vorhanden waren, wurde die Zubereitung weiter gereinigt, indem sie durch eine Sepharose-Con-A-Säule und/oder eine Superose-12 (Pharmacia)-Säule geleitet wurde.

Beispiel 2: Verwendung des gereinigten MFB-70-Antigens in Assays

(a) Materialien und Methoden

Antiseren und monoklonale Antikörper: Es wurden Seren von immunisierten Tieren, von natürlich oder experimentell mit M.bovis infizierten Tieren und von nichtinfizierten Vergleichstieren verwendet.
Die Rinder wurden durch wiederholte subkutane Injektion von 10 mg abgetötetem M.bovis (AN5-Stamm) in 1 ml Kochsalzlösung immunisiert. Die Rinder wurden ferner mit lebendem M.bovis (AN5) entweder durch intravenöse (i.v.) oder intratracheale (i.t.) Injektion von 10&sup6; Bakterien infiziert.
Monoklonale Antikörper gegen ein bestrahltes M.bovis- Sonikat wurden von Agen Biomedical Ltd. hergestellt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Sie wurden charakterisiert und mit SB1-SB10 bezeichnet (Wood und Mitarbeiter, 1988).
ELISA: Polystyrolmikrotiterplatten (Nunc Immuno Plate) wurden mit 100 µl eines 3 µg/ml M.bovis-Kulturfiltrats oder 10 µg/ml gereinigten Antigens in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH-Wert 7,2) über Nacht bei 400 beschichtet. Anschließend wurden die Platten viermal in PBS mit Tween 20 (PBST) gewaschen, mit 0,1% Natriumcasein blockiert, worauf die in FSBT verdünnten Seren zugegeben wurden. Die Schalen wurden 90 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend gewaschen und mit einem an Meerrettichperoxidase (HRP:Miles) konjugierten Antirinder-IgG-Antikörper reinkubiert.
Nach 90 min wurden die Schalen gewaschen und 30 min mit Substrat [(2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolinsulfonat)] (ABTS) inkubiert. Die Ergebnisse wurden bei 405 nm in einer Titertek-Multiskan-Vorrichtung abgelesen.
Immunisierung und Hauttests bei Meerschweinchen: Meerschweinchen wurden mit einer Suspension des abgetöteten und getrockneten M.bovis-Stamms AN5 in einem Paraffinöl in einer Konzentration von 0,5 mg/ml sensibilisiert. Sie erhielten eine anfängliche Dosis von 0,4 ml durch subkutanes Injizieren von 0,1 ml an je einer von vier Stellen. Ferner erhielten sie 37 Tage später an zwei Stellen eine Auffrischungsinjektion von 0,2 ml intradermal. Das Testen der Haut erfolgte 40 Tage nach der zweiten Impfung.
Für jedes Antigen wurden zwei Gruppen aus fünf Meerschweinchen verwendet. Eine Gruppe bestand aus sensibilisierten Tieren, die andere aus nichtsensibilisierten Vergleichstieren. Jedes Meerschweinchen wurde intradermal mit 50 µl einer jeden von drei Zehnfachverdünnungen von lediglich einem Antigen geimpft. Das Ansprechen auf dieses Antigen wurde nach 48 Stunden durch Messen des Durchmessers und der Fläche des Erythems bestimmt.
Das Ansprechen auf die gereinigten Antigene wurde mit dem auf ein gleiches Gewicht von Rindertuberculin PPD (Commonwealth Serum Laboratories, Australien) verglichen.
Herstellung peripherer Blutlymphocyten (PBL): 10 bis 20 ml Blut wurden in Heparin (20 Einheiten/ml) oder Natriumcitrat (3,8%) enthaltenden Vakuumbehältern (vacutainers, Becton-Dickinson) gesammelt. Das Blut wurde anschließend 20 min bei 800 g zentrifugiert, die Leukocytenmanschette entfernt, mit Hanks (GIBCO:Ca&spplus;&spplus;-, Mg&spplus;&spplus;-frei) auf 10 ml verdünnt, worauf 10 ml Lymphopaque (BDH: 1,086 g/ml) mit der Lösung überschichtet wurden.
Nach 25-minütigem Zentrifugieren bei 800 g wurde die Zwischenphasenzellschicht gesammelt und zweimal mit 20 ml Hanks gewaschen (450 g, 10 min). Die Zellen wurden schließlich in 5 ml RPMI 1640 (GIBCO) resuspendiert, worauf ein Zählen der lebensfähigen Zellen mittels Eosin (0,2%)-Ausschluß erfolgte.
Lymphocytenproliferationstest: Isolierte Lymphocyten wurden in 96 Ausnehmungen aufweisenden Schalen mit flachem Boden (Nunc) in einer Menge von 2,5 x 10&sup5; Zellen/Ausnehmung in 5% fötales Kalbsserum, L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol und Antibiotika enthaltendem RPMI kultiviert. Nach 48-stündiger Inkubation mit Antigen (25 µl/Ausnehmung) wurden die Kulturen mit trituertem Thymidin (Amersham, 0,5 µCi/Ausnehmung) gepulst und 24 Stunden später mittels einer automatischen Zellerntevorrichtung (automatic cell harvester (Skatron)) geerntet. Die Menge an eingebautem tritiiertem Thymidin wurde mittels einer geeigneten Szintillationssubstanz durch Zählen in einem Flüssig-β-Szintillationszähler gemessen. Die Ergebnisse wurden als mittlere counts per minute (CPM) von Dreifachkulturen ausgedrückt, wobei der Stimulationsindex wie folgt berechnet wurde:
Stimulationsindex (S.I.) = mittlere CPM mit Antigen/mittlere CPM ohne Antigen
SDS-Folyacrylamidgelelektrophorese: Die Antigene wurden durch ihre elektrophoretische Mobilität auf einen 15% Polyacrylamidgel, das auf eine Bio-Rad Protean II-Vorrichtung gegossen worden war, charakterisiert. Es wurden 3 cm eines 4% Polyacrylamidstapelgels verwendet. Das Puffersystem war das von Laemmli (1970). Die Elektrophorese wurde bei Raumtemperatur bei 20 mA pro Gel durch das Stapelgel und anschließend bei 25 mA pro Gel durch das Trenngel durchgeführt. In einigen Experimenten wurde eine Bio-Rad-Minigelvorrichtung verwendet. Die Puffer und Gelkonzentrationen waren die obigen. Die Elektrophorese wurde während etwa 1,5 h bei 150 V durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Brilliant-Blau (CBB) und/oder mit Silberfärbung (Bio-Rad) angefärbt.
Immunoblotten: Die Antigene aus SDS-PAGE-Gelen wurden elektrophoretisch nach dem Verfahren von Towbin und Mitarbeitern (1979) auf Nitrocellulosemembranen überführt. Die Membranen wurden zwei Stunden mit Antiseren oder monoklonalen Antikörpern, die in PBST verdünnt waren, sondiert. Anschließend wurden sie mit an HRP konjugiertem Schaf-Antirind- oder -Antimaus-IgG (Silenus) und anschließend mit dem HRF-Substrat (4-Chlor-1-naphthol) inkubiert, bis die reaktiven Banden sichtbar waren.

(b) Ergebnisse

Die Reinigung der die speziellen Determinanten enthaltenden einzelnen Komponenten erfolgte durch Farbfokussieren auf einer in Beispiel 1 beschriebenen Mono-P-Säule. Fig.1 zeigt ein typisches Eluierprofil dieser Stufe. Die mit Pfeilen versehenen Peaks enthalten das meiste Antigen, das an M.bovis-spezifische monoklonale Antikörper bindet, alle nach dem ersten, mit einem Pfeil versehenen Peak (a) eluierten Peaks enthalten jedoch Material, das mit den monoklonalen Antikörpern reagiert. Das Molekulargewicht des reaktiven Antigens im Feak (a) beträgt etwa 20 K, während die Antigene in allen folgenden Peaks ein Molekulargewicht von 22 K aufwiesen. Die Fraktionen in einem jeden, mit einem Pfeil versehenen Peak wurden gesammelt. Fig. 2(a) zeigt die SDS-PAGE-Muster dieser Pools. Fig. 2(b) zeigt die Reaktion der Antigene mit dem monoklonalen Antikörper (SB10), nachdem sie auf Nitrocellulose übertragen worden waren. Die Westernblots der mit Serum von einem mit M.bovis infizierten Tier sondierten, gereinigten Antigene zeigen auch einzelne reaktive Banden (Daten nicht dargestellt).
Das Eluiermuster variierte etwas für unterschiedliche CF-Chargen, wobei deutliche Schwankungen in ihrem Antigengehalt, bezogen auf das Gesamtprotein, sichtbar waren (Fig. 2 (a)). Die Mengen der ein höheres Molekulargewicht aufweisenden vorhandenen Spezies, die die reaktiven Epitope enthielt, schwankten ebenfalls. In einigen Fällen waren sie lediglich minimal (Fig 2 (a)), in anderen Fällen ziemlich beträchtlich. Je niedriger die relativen Mengen dieser größeren Spezies waren, desto besser war eine Gewinnung des 22K-Proteins möglich. Wenn die größere Spezies relativ reichlich vorlag, konnten kleine Mengen beim Reinigen mittels Farbfokussieren gewonnen werden, wobei häufig eine Coreinigung mit den 22K-Banden erfolgte. Diese wurden entfernt, wenn das CF zuerst durch eine Con-A-Sepharosesäule geleitet wurde. Dies legt die Vermutung nahe, daß die größeren Moleküle eine Zuckereinheit enthalten. Die Con-A-Sepharosestufe verbesserte die Gewinnung des 22K-Proteins.
Zur Entfernung weiterer Verunreinigungen wurde, wenn nötig, eine Gelfiltration durchgeführt.
Die Antigene aus den Pools a, b und c wurden in einem ELISA-SYSTEM auf ihre Eignung für diagnostische Zwecke getestet. Rohes CF wurde als Vergleich verwendet. Eine Gruppe (panel) von Seren von mit M.bovis infizierten und nichtinfizierten Tieren wurde ebenso wie einige Seren von mit verwandten Mycobakterien und anderen Bakterien infizierten Tieren getestet.
Die hohe ELISA-Werte mit dem CF liefernden Seren von mit M.bovis infizierten Tieren wurden gegen die gereinigten Antigene getestet. Bei diesem Experiment wurden lediglich die Antigene b und c untersucht. In früheren Experimenten war jedoch festgestellt worden, daß das Antigen a ähnliche ELISA-Skalenwerte wie b (Daten nicht dargestellt) liefert.
MPB-70 wurde ferner sowohl in vivo als auch in vitro im Rahmen von CMI-Tests untersucht. Die in-vivo-Tests wurden mittels des herkömmlichen Hauttests bei Meerschweinchen, die mit M.bovis-Zellen sensibilisiert worden waren, durchgeführt. MPB-70 führte zu positiven Reaktionen, obwohl es bei den niedrigeren getesteten Konzentrationen nicht so aktiv wie FPD war (Tabelle 2).
MPB-70 wurde ferner in vitro auf seine Fähigkeit zur Induktion einer Proliferation von peripheren Blutlymphocyten aus mit M.bovis infizierten Rindern getestet. Das Protein induzierte bei allen mit M.bovis infizierten Tieren ähnliche Reaktivitätsniveaus und zeigte keine Aktivität gegenüber Lymphocyten von nichtinfizierten Vergleichstieren. Das absolute Niveau der Reaktivität von MPB-70 war niedriger als das bei dem M.bovis PFD-Antigen und schwankte beträchtlich zwischen einzelnen Tieren.

Beispiel 3 Klonieren von M.bovis-AN5-DNA in λgt 11 und Nachweis der spezielle Antigene von M.bovis exprimierenden Klone

(a) Materialien und Methoden

Phagen und Bakterien: λgt 11, Escherichia coli Y1089 und E.coli Y1090 sind bereits früher beschrieben worden (Young & Davis, 1983). Dasselbe gilt für den pEX-Expressionsvektor (Stanley & Luzio, 1984). M.bovis-AN5 wurde von den Commonwealth Serum Laboratorien, Parkville, Australien, erhalten. Die Commonwealth Serum Laboratorien erhielten den Stamm vom "Ministry of Agriculture Weybridge Laboratories", England, im Jahre 1973. Danach wurde er in gefriergetrockneten Ampullen aufbewahrt.
Enzyme: Alle Enzyme wurden von Promega Biotec bezogen. Sofern nicht speziell ausgeführt, waren alle verwendeten DNA-Techniken die bei Maniatis und Mitarbeitern (1982) beschriebenen.
Monoklonale Antiköroer (MAbs): Die MAbs gegen M.bovis waren eine freundliche Spende von Agen Biomedical Australia Ltd.. Die Eigenschaften der MAbs SB1 bis SB10 sind an anderer Stelle veröffentlicht (Wood und Mitarbeiter, 1988).
Isolierung der M.bovis-DNA: M.bovis-AN5 wurde sechs Wochen auf BAI-Medium (Paterson und Mitarbeiter, 1958) gezüchtet, worauf die Zellen durch Zentrifugation geerntet wurden. Die DNA-Extraktion erfolgte im wesentlichen nach dem Verfahren von Shoemaker und Mitarbeitern (1986).
Konstruktion der M.bovis-Bibliothek in λgt11: M.bovis DNA wurde kurz (ungefähr 3 sec) bei niedriger Leistung beschallt, wobei DNA-Fragmente in einem Größenbereich von 2 Kilobasenpaaren bis 200 Basenpaaren (bp) (bestimmt durch Agarosegelelektrophorese) erhalten wurden. Die DNA-Methylierung, das Stumpfendigmachen mit T4-DNA-Polymerase und das Addieren von EcoRI-Linkern erfolgten gemäß dem Protokoll von Young und Mitarbeitern (1985). Das Eliminieren von überschüssigen EcoRI-Linkern nach der Linkerligation und EcoRI-Verdauung erfolgte durch Gelfiltration (Superose-12-Säule; Pharmacia), wobei das Eluat durch UV-Absorption überwacht wurde. Die DNA wurde anschließend mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer suspendiert, worauf 0,5 µg mit einem 1 µg von dephosphoryliertem, mit EcoRI verdautem λgt 11 (Promega) über Nacht bei 4ºC ligiert wurden. Das Phagenabpacken erfolgte in Stratagene-Gigapackextrakten.
Herstellung affinitätsgereinigter Antikörper gegen M.bovis: Eine Emulsion von etwa 2 x 10&sup9; von durch Erwärmen abgetöteten Mycobakterienzellen in unvollständigen Freund'schen Adjuvans wurde für die Hyperimmunisierung von Kaninchen verwendet. Die Kaninchen wurden im Abstand von 35 Tagen zweimal geimpft. 10 Tage nach der zweiten Impfung wurde jedem Kaninchen aus dem Ohr Blut entnommen. Die Seren wurden gesammelt, worauf der Titer gegen M.bovis-PPD (Commonwealth Serum Laboratories) durch ELISA bestimmt wurde. Die bei der Affinitätsreinigung verwendeten Kaninchenseren lieferten gemäß Bestimmung durch ELISA Titer von 1:40.960. Eine M.bovis-Affinitätssäule wurde durch Kuppeln von M.bovis-FPD an Sepharose 48 nach dem Verfahren von March und Mitarbeitern (1974) hergestellt. Die Säule (20 ml) wurde mit 3 Volumina Affinitätspuffer (0,1 M Tris, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 20) äquilibriert. Nach Durchpumpen von 5 ml Kaninchenserum wurde die Säule mit 3 Volumina Affinitätspuffer zum Eluieren von nichtgebundenem Material gewaschen. Die gebundenen Substanzen wurden anschließend mit 2 M Glycinhydrochlorid (pH-Wert 2,5) in 2 M Tris eluiert, wobei das Eluat durch UV-Absorption überwacht wurde. Eluiertes Protein wurde mittels einer Amicon-Konzentrationsvorrichtung aufkonzentriert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Anschließend wurde die Protein-Konzentration nach dem Verfahren von Bradford (1976) bestimmt.
Sichten der λgt11-Bibliothek: Die Filter wurden von gemäß der Beschreibung von Young und Mitarbeitern (1985) hergestellten Phagenüberschichtungsplatten mit einem Durchmesser von 85 mm genommen. Unmittelbar nach der Entfernung von den Platten wurden die Filter 10 min in PBST gewaschen und anschließend 1 h in PBS-S% Rinderlacto- Transfertechnikoptimator (Magermilch) blockiert. Nach Zugabe von affinitätsgereinigten Antikörpern gegen M.bovis bis zu einer Menge von 3,5 µg/ml wurden die Filter über Nacht bei 4ºC vorsichtig geschüttelt. Die Filter wurden anschließend nacheinander 10 min in PBS, PBST und PBS gewaschen, worauf Schweine-Antikaninchen-Meerrettichperoxidasekonjugat in PBST (Daiko, 1/300) zugegeben und die Filter anschließend 2 h unter vorsichtigem Schütteln inkubiert wurden. Nach Wiederholen des Waschens wurde 4-Chlor-1-naphthol-Substrat zugegeben. Die Farbentwicklung war nach 15 min vollständig. Die Filter wurden anschließend in destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Reaktiven Flecken auf den Filtern entsprechende Plaques wurden aussortiert und in 1,0 ml SM-Medium überführt. Die Reinigung erfolgte durch "Spotten" von 5 µl-Proben aus seriellen Verdünnungen der ursprünglichen Phagensuspensionen auf E.coli Y1090-Rasen für ein weiteres Antikörpersondieren, worauf einzelne reaktive Plaques ausgelesen, suspendiert und auf E.coli Y1090-Rasen ausgestreift wurden.
Wenn MAbs für die Analyse isolierter Klone verwendet wurden, entsprach die Filterherstellung dem beschriebenen Verfahren. Das affinitätsgereinigte Serum wurde durch MAbs ersetzt (1/2.000 Ascites), wobei zum Nachweis Antimaus-alkalische Phosphatase-Konjugat (Promega, 1/5.000) verwendet wurde. Die Filter wurden in einem 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-phosphat-Nitro-Blue-Terazoliumsubstrat entwickelt.
Proteinelektrophorese und Westernblotten (Immunoblotten): Die Proteinproben wurden durch 5-minütiges Erwärmen auf 100ºC in Tris-hydrochlond (pH-Wert 6,8), das 2% Natriumdodecylsulfat, 5% (v/v) Glycerin und 0,002% (g/v) Bromphenol-Blau enthielt, gelöst. Die auf vertikalen Platten durchgeführte Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektrophorese erfolgte im wesentlichen gemäß der Beschreibung von Laemmli (1970) in 12% Acrylamidgelen. Die Proteine wurden durch Elektroblotten über Nacht auf Nitrocellulose übertragen. Das Sondieren mit MAbs (1/2000) erfolgte nach dem bei den Phagenspots verwendeten Protokoll. Das Sondieren mit Rinderseren erfolgte während 2 h in einer 1/50-Verdünnung in PBST, wobei die Seren 1 h vor Verwendung mit von pEX abgeleitetem Protein, das an Nitrocellulose gebunden war, absorbiert wurden. Die Rinderantikörper wurden mittels an Peroxidase konjugierten Antirind-Immunoglobulin-MAbs (Australian Monodonal Developments) nachgewiesen.
Sepuenzieren: Die Sequenzanalyse erfolgte nach dem Primer-Verlängerungsdidesoxyterminationsverfahren von Sanger und Mitarbeitern (1980) nach einem Subklonieren in M13tg130 (Amersham Corp.). Die Produkte der Sequenzierungsreaktion wurden auf 6% Folyacrylamid-8 M Harnstoff-Gelen analysiert.

(b) Ergebnisse

Konstruktion einer λgt11-Bibliothek von M.bovis:

M.bovis-AN5-DNA wurde extrahiert, beschallt und in λgt11 kloniert. Australisches PFD zur Verwendung beim Rinderkaudalfaltenhauttest wurde aus M.bovis-AN5 isoliert. Da PFD erwiesenermaßen ein diagnostisches Reagens ist, war dies der zur Extraktion von DNA zur Klonierung ausgewählte Stamm. Die AN5-Bibliothek enthielt 2,5 x 106 unabhängige PFU, wovon 90% gemäß Bestimmung durch β-Galactosidaseinaktivierung rekombinant waren. Die Größen der Inserte gemäß Bestimmung durch Restriktionsverdauung und Agarosegelanalyse der Bibliothek lagen in einem Bereich von 200 bis 900 bp.
Sondieren der M.bovis-AN5-Bibliothek mit polyklonalen Seren: 20 Filter entsprechend 5 x 10&sup4; PFU pro Filter (insgesamt 10&sup6; PFU) wurden mit affinitätsgereinigtem, polyklonalem Anti-M.bovis-AN5-Serum sondiert. Auf jedem Filter wurden zwischen zwei und acht reaktive Phagenplaques gefunden. Diese wurden auf den Platten ausgelesen und weiter gereinigt. Die Signalstärke eines jeden Plaques schwankte stark in einem Bereich von kaum wahrnehmbaren Punkten bis zu auffälligen Flecken. Nicht alle Filterflecken zeigten weitere Reaktionen bei der Phagenreinigung. Von den 88 auf den ursprünglichen Filtern gefundenen Flecken lieferten 32 Phagen übereinstimmende Signale und durchliefen die erste und zweite Reinigungsstufe. Durch Verwendung der affiriitätsgereinigten Antikörper wurde im Gegensatz zu der Situation, wenn nichtgereinigte Seren von entweder Kaninchen oder Rindern verwendet wurden, sehr wenig Hintergrund infolge von kreuzreaktiven E.coli-Antikörpern festgestellt. Die Absorption mit entweder an Nitrocellulose gebundenem oder direkt dem Serum zugesetztem E.coli-Lysat war weit weniger wirksam bei der Verringerung von Hintergrundsignalen als die Verwendung von affinitätsgereinigtem Antiserum.
Analyse rekombinanter Klone mit MAbs: Gereinigte Phagenzubereitungen und Lysogene der mit polyklonalen Antikörpern reagierenden λgt11-Klone wurden mit den M.bovis- M.tuberculosis-spezifischen MAbs SB1 bis SB10 in Phagenspottests und Kolonietests sondiert, um zu untersuchen, ob spezielle Epitope vorhanden sind.
Von den 32 rekombinanten Phagen exprimierten 5 Antigene, die durch mindestens einen der MAbs bei Sondieren der Phagenspots bzw. Phagenflecken erkannt wurden, obwohl, wie von Antigenen, die von einer willkürlich klonierten Bibliothek abgeleitet sind, erwartet werden kann, nicht alle diese fünf Klone von allen MAbs erkannt wurden (Tabelle 7). Da bekannt ist, daß die MAbs SB1 bis SB10 drei getrennte Epitope auf dem Proteinantigen MPB70 (Wood und Mitarbeiter, 1988) erkennen, ist dies ein Anzeichen, daß die durch die MAbs erkannten rekombinanten Antigene durch Klone kodiert werden, die von getrennten Ligationsvorgängen, die unterschiedliche Bereiche des MPB70-Gens darstellende Inserte tragen, herstammen.
Von den durch die MAbs erkannten fünf λgt11 Klonen zeigten zwei mit der Bezeichnung pB3C und C4a eine Affinität für alle MAbs in der Gruppe (panel), ausgenommen MAb SB9, den das Klon pB3C nicht erkannte. Die Agarosegelanalyse zeigte, daß das Klon C4a ein Insert in Form eines EcoRI-Fragments einer Länge von ungefähr 250 bp aufwies. Dies ist das kleinste insertierte Fragment, das gefunden wurde und das alle spezifischen Epitope trägt und dazu in der Lage war, für weniger als die Hälfte von MPB70 (Molekulargewicht 22.000) zu kodieren. Als solches war es möglich, daß dieses Klon keines der kreuzreaktiven Epitope trug, von denen angenommen wurde, daß sie auf MFB70 vorhanden sind (Harboe & Nagai, 1984), und sich als geeignet erweisen könnte, als Antigen bei einer serologischen Diagnose von BTB verwendet zu werden. Tabelle 7 Erkennung von M.bovis-Klonen durch SB-Mabs*
* Die Reaktivität wurde durch Sondieren von Phagenspots bzw. -flecken bestimmt. -10³ Phagen enthaltende Tropfen (5 µl) wurden auf E.coli Y1090-Rasen "gespottet", worauf Filter hergestellt und in der im Text beschriebenen Weise sondiert wurden. Das Symbol ± bedeutet eine schwache Reaktion.
Zur Erleichterung der serologischen Analyse wurde das C4a- Insert in den eine hohe Expression aufweisenden pEX-Vektor (Shoemaker und Mitarbeiter, 1986) kloniert, wobei die Expression durch Immunoblotten von Kolonien mit dem SB10-MAb bestätigt wurde. Die pEX-Vektoren exprimieren klonierte Proteine in Form eines cro-β-gal-Fusionsproteins, das in den meisten wäßrigen Lösungen unlöslich ist und eine relativ einfache anfängliche Reinigung, wobei die meisten löslichen Proteine durch Waschen in 1% Nonidet-P-40-1% Deoxycholat in PBS entfernt werden, gestattet. Nach Auflösen des gewaschenen pEX- C4a-Fusionsproteins in Natriumdodecylsulfat-Auftragungspuffer wurde das Gemisch vor Übertragung auf Nitrocellulose auf einem Acrylamidgel laufen gelassen. Die Seren von sowohl mit M.bovis infizierten als auch gesunden Rindern wurden zum Sondieren der Westernblots verwendet. Diese Blots zeigten, daß mit dem Fusionsprotein reagierende Antikörper auf infizierte Tiere beschränkt waren. Jedoch nicht alle Tiere mit der Erkrankung zeigten ein nachweisbares Antikörperansprechen auf das klonierte Protein. Weder gepoolte Seren von BTB-freien Herden noch sechs Seren von nichtinfizierten Rindem in einer mit BTB infizierten Herde zeigten Reaktionen mit dem klonierten Protein, obwohl es notwendig war, Anti- E.coli-Aktivität in den Seren herauszuabsorbieren und ein spezifisches monoklonales Antirinderimmunoglobulinkonjugat zur Verringerung der Kreuzreaktivität zu verwenden.
Sequenz des MPB-70-Gens: Die spezifischen Epitope von MPB70 enthaltende synthetische Peptide weisen ein diagnostisches Potential auf und sollen vollständig frei von endogenen Kreuzreaktionen sein. Zur Gewinnung der DNA-Sequenz des MPB-70-Gens und folglich der Peptidsequenz des MPB-70-Gens wurde ein Klon des MPB-70-Gens isoliert. Das Insert aus dem λgt11-Klon C4a wurde zum Sondieren einer lange Fragmente aufweisenden Bibliothek von in den Vektor EMBL3 konstruiertern M.bovis-AN5 verwendet. Nach dem Reinigen eines durch DNA-Hybridisierung mit dem λgt11-C4a-Insert reagierenden EMBL3-Klon wurde die DNA aus dem EMBL3-Klon extrahiert und durch Restriktionsenzymverdauung und Agarosegelelektrophorese analysiert. Eine Southern-Blot-Analyse abermals unter Verwendung des λgt11-Inserts als Sonde zeigte, daß sich das MPB-70-Gen auf einem 1,85 Kbp Pst1-Restriktionsfragment befindet. Ein Subklonieren des 1,85 Kbp Pst1-Fragments in den Bakteriophagen M13 erlaubte die Erkennung der Sequenz des MPB-70-Gens. Fig. 3 zeigt die DNA-Sequenz und die abgeleitete Proteinsequenz des reifen Proteins MPB-70. Dieses Protein wird intrazellulär mit einer Signalsequenz, die von dem reifen Molekül weggeräumt wird, gebildet.
Fatarroyo und Mitarbeiter (1986, 1986a) veröffentlichten zwei ziemlich unterschiedliche Peptidsequenzen für MPB-70, die durch Proteinsequenziertechniken erhalten worden waren. Die in Fig. 3 beschriebene Sequenz läßt sich mit der Sequenz von Pattaroyo (1986a) bis zur Aminosäure 112 bei 13 Variationen ausrichten. Von den Aminosäuren 112 bis 163 gibt es keine Ähnlichkeit. Eine ähnliche Situation gibt es mit der Sequenz von MPB-70, die bei Pattaroyo (1986) angegeben ist. In diesem Fall endet die Ähnlichkeit mit unserer translatierten DNA-Sequenz (Fig. 3) bei der Aminosäure 78. Davor gibt es sieben Variationen. Von der Aminosäure 80 ab, wobei eine 17 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz von Pattaroyo (1986), die in der translatierten DNA-Sequenz (Fig. 3) nicht vorhanden ist, nicht gezählt wird, fallen diese Sequenzen bei acht Variationen bis zur Aminosäure 130 zusammen. Von der Aminosäure 130 bis 163 sind sie vollständig verschieden.

Beispiel 4: Diagnose von M.bovis-Infektionen bei Hirschen

Seren von mit M.bovis infizierten Hirschen wurden in einem ELISA mittels des MPB-70-Proteins als Antigen getestet. Ein Pool von Seren von nichtinfizierten Hirschen wurde als negativer Vergleich verwendet, wobei Serum von einer bekanntermaßen mit M.bovis infizierten Kuh als positiver Vergleich verwendet wurde. Es wurde festgestellt, daß ein an Meerrettichperoxidase konjugierter, im Handel erhältlicher monoklonaler Antikörper gegen Rinder-IgG (Bi2, Australian Monodonal Development, Sydney) auch Hirschantikörper bindet, so daß er als Konjugat in diesem System verwendet wurde.
Bei diesem MPB-70-ELISA wiesen alle sechs infizierten Hirsche Antikörperspiegel auf, die deutlich über denen des Vergleichsserums lagen (Tabelle 8). 32 einzelne Seren von keine Tuberkulose aufweisenden Hirschen wurden ferner in diesem System getestet und als negativ ermittelt.

(a) Verfahren

Das zu untersuchende Hirschseren verwendete ELISA-System war dasjenige, das zum Testen der Rinder verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß zwei Stufen in dem Vorgehen verändert wurden: (1) die Blockierstufe vor dem Antikörperbinden wurde weggelassen und (2) ein monoklonales Antirinder-IgG-Konjugat wurde anstelle eines polyklonalen Konjugats verwendet. Tabelle 8 MPB-70-ELISA mit mit M.bovis infizierten Hirschseren
Alle Seren von infizierten Hirschen wurden aus Neuseeland erhalten. Die M.bovis-Infektion wurde durch Histologie und bakteriologische Kulturen von Geweben der Tiere bestätigt.

Beispiel 5 Verwendung der M.bovis-DNA-Sequenz als Hybridisierungssonden

(a) Verfahren

Die angegebenen Mycobakterien wurden in 50 ml Dubos- Brühe-Medium gezüchtet und durch Zentrifugation geerntet. Die Zellpellets wurden durch Erwärmen auf 70ºC abgetötet und in gefrorenem Zustand bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert. Die Nudeinsäure wurde wie folgt aus den Zellen extrahiert. Jedes der Zellpellets wurde in TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 1 ml resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden 5 sec auf Eis beschallt. Nach Zugabe von Proteinase K auf eine Endkonzentration von 60 µg/ml wurden die Suspensionen 1 h bei 65ºC inkubiert. Die Proben wurden einmal mit 1 Volumen Phenol, das mit TE gesättigt war, dann einmal mit Leder-Phenol (50% Phenol, 50% CIA [Chloroform:Isoamylalkohol, 24:1]), einmal mit dem gleichen Volumen CIA und schließlich mit 1 Volumen wassergesättigtern Ether extrahiert. Die Nucleinsäure wurde mit Ethanol präzipitiert und in 25 µl Wasser resuspendiert. Die Konzentration an DNA und RNA in den Extrakten wurde spektroskopisch bestimmt. Aliquote von etwa 200 ng wurden unter Verwendung einer Dot-Blot-Vorrichtung auf eine Hybond-N-Membran appliziert. Die DNA wurde denaturiert und in der vom Hersteller beschriebenen Weise an Hybond-N fixiert. Der Blot wurde vorhybridisiert und in einer Standardlösung, die Blotto und geschnittene Heringssperma-DNA enthielt, hybridisiert. Die verwendete Sonde war das 1,85 kb große, das Gen für MPB-70 enthaltende Pst1-Fragment, das mit Hilfe eines Oligonucleotidpriming-Standardverfahrens mit ³²P markiert worden war. Die Hybridisierung erfolgte bei 37ºC über Nacht. Der Blot wurde in 1,0 SSC, 0,1% SDS bei 65ºC vor der Autoradiographie gewaschen.

(b) Ergebnisse

Die verschiedenen DNA-Präparationen der im folgenden angegebenen Mycobakterien wurden in Dot-Blots mit einer radioaktiven DNA-Sonde des MPB-70-Gens sondiert. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, zeigten alle und nur die M.bovis-Isolate das Binden der Sonde. Dies zeigt die Anwesenheit eines homologen MPB-70-Gens und eines umgebenden Bereichs:

Reihe (a)

1. M.bovis-AN5
2. M.bovis-AN5
3. Feldisolat a, Nth.Terr. M.bovis
4. Feldisolat b, Nth.Terr. M.bovis
5. Isolat eines wildlebenden Schweins, M.bovis
6. Victorian abattoir Isolat, M.bovis
7. Isolat eines neuseeländischen Opossums, M.bovis
8. M.bovis-BCG

Reihe (b)

1. MAIS 2
2. MAIS 2
3. M.phlei
4. M.phlei
5. M.kansasii
6. M.kansasii
7. MAIS 8
8. MAIS 8

Literaturstellen

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Claims

1. MPE-70-Protein von M. bovis mit der in Figur 3 dargestellten Aminosäuresequenz 1 bis 163 in praktisch reiner Form.

2. Verfahren zur Gewinnung des MPB-70-Proteins gemäß Anspruch 1 durch Reinigen eines M. bovis-Kulturfiltrats durch Chromatofokussieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Chromatofokussierung eine weitere Reinigung durch Gelfiltration nachgeschaltet wird.

4. Rekombinantes DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz mit Codierung für das MPB-70-Protein von M. bovis mit der in Figur 3 dargestellten Aminosäuresequenz 1 bis 163 oder für eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität des MPB-70- Proteins.

5. Rekombinantes Klonungsvehikel bzw. Vektor mit einem DNA- Molekül nach Anspruch 4.

6. Transformierte Wirtzelle bzw. Organismus mit der Fähigkeit zur Expression des MPE-70-Proteins von M. bovis oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität des MPB-70-Proteins, enthaltend ein DNA-Molekül nach Anspruch 4.

7. Rekombinantes MPB-70-Protein mit der in Figur 3 dargestellten Aminosäuresequenz 1 bis 163 oder eine rekombinante Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität des MPB-70- Proteins.

8. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein nach Anspruch 7, wobei eine transformierte Wirtzelle bzw. ein Organismus nach Anspruch 6 unter geeigneten Bedingungen gezüchtet und das expremierte Protein bzw. Polypeptid gewonnen und gereinigt werden.

9. Verfahren zur Diagnose einer Mycobacterium bovis-Infektion bei einem dafür anfälligen Tier durch in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen das MPB-70-Protein von M. bovis gemäß Anspruch 1 und/oder einer zellvermittelten Immunantwort des Tiers auf das MPB-70-Protein in einer dem Tier entnommenen Probe unter Verwendung des MPB-70-Proteins nach Anspruch 1 oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein als Antigen.

10. Verfahren nach Anspruch 91 wobei es sich bei dem Tier um Rinder, Hirsche, Dachse bzw. Wombats, Beutelratten, Schweine und Kamele handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Nachweis der Immunantwort durch Kontaktieren einer Serumprobe des (betreffenden) Tiers mit dem MPB-70-Protein oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein und Bestimmen der Bindung von Antikörpern in der Probe an das Protein oder Fragmente oder Konkurrenzbindung von markiertem Antikörper für das MPB-70-Protein zum Hinweis auf das Vorhandensein der Antikörper in der Probe erfolgt, wobei das MPB-70-Protein oder dessen Portion in praktisch reiner Form vorliegt.

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die zellvermittelte Immunantwort des Tiers durch einen in-vitro-Test unter Verwendung des MPB-70-Proteins oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein als Antigen erfolgt und das MPB-70-Protein oder dessen Portion in praktisch reiner Form vorliegt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem in- vitro-Test um einen Lymphozytenproliferationstest oder einen auf der Freigabe von gamma-Interferon oder Interleukin² basierenden Test handelt.

14. MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70- Protein zur Verwendung bei der Diagnose einer Mycobacterium bovis-Infektion bei einem dafür anfälligen Tier mittels einer Antikörpertestmethode oder einer zellvermittelten Immunantworttestmethode.

15. MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70- Protein zur Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei es sich bei dem Tier um Rinder, Hirsche, Dachse bzw; Wombats, Beutelratten, Schweine und Kamele handelt.

16. MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70- Protein zur Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei der Nächweis der Immunantwort durch Kontaktieren einer Serumprobe des (betreffenden) Tiers mit dem MPB-70-Protein oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein und Bestimmen der Bindung von Antikörpern in der Probe an das Protein oder dessen Polypeptidportion oder Konkurrenzbindung von markiertem Antikörper für das MPB-70- Protein zum Hinweis auf das Vorhandensein der Antikörper in der Probe erfolgt, wobei das HPB-70-Protein oder dessen Polypeptidportion in praktisch reiner Form vorliegt.

17. MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70- Protein zur Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei eine zellvermittelte Immunantwort des Tieres durch einen in-vivo durchgeführten Schwanzfalte-Hauttest unter Verwendung des MPB-70- Proteins oder einer Polypeptidportion desselben als Antigen nachgewiesen wird und das MPB-70-Protein oder eine Polypeptidportion desselben in praktisch reiner Form vorliegt.

18. MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70- Protein zur Verwendung nach Anspruch 14, wobei eine zellvermittelte Immunantwort des Tieres durch einen in-vitro-Test unter Verwendung des MPB-70-Proteins oder einer Polypeptid portion desselben als Antigen nachgewiesen wird und das MPB- 70-Protein oder die Polypeptidportion desselben in praktisch reiner Form vorliegt.

19. MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70- Protein zur Verwendung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem in-vitro-Test um einen Lymphozytenproliferationstest oder einen auf der Freigabe von gamma-Interferon oder Interleukin² basierenden Test handelt.

20. Besteck zur Diagnose einer Mycobacterium bovis-Infektion bei einem dafür anfälligen Tier, umfassend Mittel zum Nachweis von Antikörpern gegen das MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1 in den betreffenden Tieren und/oder einer zellvermittelten Immunantwort des Tieres auf das MPB-70-Protein unter Verwendung des MPB-70-Proteins nach Anspruch 1 oder einer Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein als Antigen.

21. Besteck nach Anspruch 20, umfassend das MPB-70-Protein oder eine Polypeptidportion desselben mit der Antigenizität von MPB-70-Protein als Antigen, wobei das MPB-70-Protein oder die Polypeptidportion desselben in praktisch reiner Form vorliegt.

22. Verfahren zum Nachweis von M. bovis-Organismen in einer Probe durch Kontaktieren der Probe mit einer DNA-Sonde entsprechend der gesamten oder einem Teil der DNA-Sequenz mit Codierung für das MPB-70-Protein von M. bovis gemäß Anspruch 1 und Bestimmen der Hybridisierung der Sonde zum Nachweis der Anwesenheit der Organismen in der Probe.

23. Testbesteck zum Nachweis von M. bovis-Organismen in einer Probe, enthaltend eine DNA-Sonde entsprechend der gesamten oder einem Teil der DNA-Sequenz mit Codierung für das MPB-70-Protein von M. bovis nach Anspruch 1.