DE69737125T3

DE69737125T3 - Streptococcus pneumoniae-Antigene und Impfstoffe

Info

Publication number: DE69737125T3
Application number: DE69737125.5T
Authority: DE
Inventors: Charles Kunsch; Gil Choi; L. Johnson; Alex Hromockyj
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-30
Publication date: 2015-02-26
Anticipated expiration: 2017-10-31
Also published as: DK0942983T4; US7056510B1; EP1400592A1; US20100221287A1; ES2277362T3; CA2271720A1; AU3140701A; JP2008178407A; AU2011200622A1; DE69739981D1; PT942983E; DK0942983T3; WO1998018930A3; EP0942983B1; US8168205B2; US20020032323A1; US20050181439A1; EP1770164A3; EP0941335A2; ES2350491T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Streptococcus pneumoniae-Antigene für den Nachweis von Streptococcus und für die Vorbeugung oder Abmilderung von Erkrankungen, die durch Streptococcus verursacht werden. Die Erfindung betrifft weiterhin isolierte Nucleinsäuremoleküle, die antigene Polypeptide von S. pneumoniae codieren. Die antigenen Polypeptide werden ebenfalls bereitgestellt ebenso wie Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Verfahren für ihre Herstellung. Die Erfindung betrifft zusätzlich diagnostische Verfahren zum Nachweis der Genexpression in Streptococcus.
Hintergrund der Erfindung
Streptococcus pneumoniae ist einer der am intensivsten untersuchten Mikroorganismen seit seiner ersten Isolierung im Jahr 1881. Er war Gegenstand vieler Untersuchungen, die zu wichtigen wissenschaftlichen Entdeckungen führten. Im Jahr 1928 beobachtete Griffith, dass, wenn durch Hitze abgetötete, Kapseln bildende Pneumokokken und lebende Stämme, denen eine Kapsel konstitutiv fehlte, zusammen in Mäuse injiziert wurden, die keine Kapsel bildenden (Stämme) zu Kapsel bildenden Pneumokokken mit dem gleichen Kapseltyp wie der durch Hitze abgetötete Stamm umgewandelt werden konnten. Jahre später wurde gezeigt, dass es sich bei diesem „transformierenden Prinzip” oder bei dem Träger der genetischen Information um DNA handelt (Avery, O.T. et al., J. Exp. Med. 79:137–157 (1944).
Trotz der riesigen Zahl an Veröffentlichungen über S. pneumoniae sind viele Fragen über seine Virulenz immer noch nicht beantwortet, und dieses Pathogen bleibt eine Hauptursache für ernsthafte menschliche Krankheiten, insbesondere für die in der Öffentlichkeit erworbene Lungenentzündung. (Johnston, R.B. et al., Rev. Infect. Dis. 13(Ergänz. 6):S509–517 (1991)). In Entwicklungsländern sind die Pneumokokken darüber hinaus für den Tod einer hohen Zahl an Kindern im Alter von unter 5 Jahren aufgrund einer durch Pneumokokken (verursachten) Lungenentzündung verantwortlich. Das Auftreten einer durch Pneumokokken (verursachten) Erkrankung ist bei Kleinkindern unter 2 Jahren und bei Menschen über 60 Jahren am höchsten. Pneumokokken sind die zweithäufigste Ursache (nach Haemophilus influenzae Typ b) für die bakterielle Meningitis und die Mittelohrentzündung bei Kindern. Durch die kürzlich erfolgte Einführung von Konjugat-Impfstoffen gegen H. influenzae Typ b wird die Pneumokokken-Meningitis wahrscheinlich noch stärker zunehmen. S. pneumoniae ist das wichtigste ätiologische Agens der in der Öffentlichkeit erworbenen Lungenentzündung bei Erwachsenen und die zweithäufigste Ursache für die bakterielle Meningitis nach Neisseria meningitidis.
Das Antibiotikum, das im Allgemeinen verschrieben wird, um S. pneumoniae zu behandeln, ist Benzylpenicillin, obwohl gelegentlich dagegen sowie auch gegen andere Antibiotika Resistenzen auftreten. Die Resistenz der Pneumokokken gegenüber Penicillin entsteht aus Mutationen in ihren Penicillin-bindenden Proteinen. Bei der Pneumokokken-Lungenentzündung ohne Komplikationen, die durch einen empfindlichen Stamm verursacht wird, ist die Behandlung mit Penicillin in der Regel erfolgreich, sofern mit ihr nicht zu spät begonnen wird. Erythromycin oder Clindamycin können ebenfalls verwendet werden, um eine Lungenentzündung in Patienten zu behandeln, die gegenüber Penicillin hypersensitiv sind, aber es gibt Stämme, die für diese Arzneimittel resistent sind. Breitband-Antibiotika (z. B. die Tetracycline) können ebenfalls wirksam sein, obwohl Tetracyclin-resistente Stämme nicht selten sind. Trotz der Verfügbarkeit von Antibiotika lag die Sterblichkeit aufgrund von Pneumokokken-Bakteriämien in den letzten vier Jahrzehnten stabil zwischen 25 und 29% (Gillespie, S.H. et al., J. Med. Microbiol. 28:237–248 (1989).
S. pneumoniae kommt in den oberen Atemwegen bei vielen gesunden Individuen vor. Es wurde vormutet, dass die Anheftung der Pneumokokken durch einen Disaccharid-Rezeptor auf Fibronectin vermittelt wird, der auf den menschlichen Rachen-Epithelzellen vorhanden ist. (Anderson, B.J. et al., J. Immunol. 142:2464–2468 (1989). Die Mechanismen, durch die sich die Pneumokokken von dem Nasenrachen in die Lunge verlagern, wodurch eine Lungenentzündung verursacht wird, oder durch die sie in das Blut einwandern, was eine Bakteriämie oder eine Sepsis verursacht, sind kaum verstanden (Johnston R.B. et al., Rev. Infect. Dis. 13(Ergänz. 6):S509–517 (1991)).
Von verschiedenen Proteinen wurde vermutet, dass sie an der Pathogenität von S. pneumoniae beteiligt sind, jedoch wurde nur von einigen von ihnen tatschsächlich bestätigt, dass sie Virulenzfaktoren darstellen. Pneumokokken produzieren eine IgA1-Protease, die die Abwehr des Wirts auf den Schleimhaut-Oberflächen beeinträchtigt. (Kornfield, S.J. et al., Rev. Inf. Dis. 3:521–534 (1981). S. pneumoniae produziert ebenfalls Neuraminidase, ein Enzym, das die Anheftung an Epithelzellen durch die Abspaltung von Sialinsäure von den Glycolipiden und Gangliosiden des Wirts erleichtern kann. Es wurde beobachtet, dass eine teilweise gereinigte Neuraminidase Meningitis-ähnliche Symptome in Mäusen induzieren kann; die Zuverlässigkeit dieses Befundes wurde jedoch in Frage gestellt, da die verwendeten Neuraminidase-Präparate wahrscheinlich mit Zellwandprodukten verunreinigt waren. Neben der Neuraminidase sind auch andere Proteine aus Pneumokokken an der Adhäsion der Pneumokokken an Epithel- und Endothel-Zellen beteiligt. Diese Pneumokokken-Proteine sind bis jetzt noch nicht identifiziert worden. Vor kurzem berichteten Cundell et al., dass Peptid-Permeasen die Anheftung von Pneumokokken an Epithel- und Endothel-Zellen modulieren können. Es blieb jedoch unklar, ob diese Permeasen direkt als Adhäsionsstellen fungieren, oder ob sie die Anheftung durch eine Modulierung der Expression von Pneumokokken-Adhäsionsstellen steigern. (DeVelasco, E.A. et al., Micro. Rev. 59:591–603 (1995). Man wird ein besseres Verständnis der Virulenzfaktoren, die die Pathogenität bestimmen, entwickeln müssen, um die verheerenden Wirkungen einer Erkrankung durch Pneumokokken beim Menschen bewältigen zu können.
Ironischerweise ist trotz der bedeutenden Rolle, die S. pneumoniae bei der Entdeckung der DNA gespielt hat, wenig über die Molekulargenetik dieses Organismus bekannt. Das Genom von S. pneumoniae besteht aus einer zirkulären, kovalent geschlossenen, doppelsträngigen DNA und einer Reihe so genannter variabler akzessorischer Elemente wie Prophagen, Plasmide, Transposons und ähnlichem. Die meisten physikalischen Eigenschaften und fast alle Gene von S. pneumoniae sind unbekannt. Unter den wenigen, die identifiziert wurden, wurden die meisten nicht physikalisch kartiert oder im Detail charakterisiert. Nur einige wenige Gene dieses Organismus wurden sequenziert. (Vergleiche zum Beispiel mit den aktuellen Versionen von GENBANK und anderen Nucleinsäure-Datenbanken sowie mit Referenzen, die das Genom von S. pneumoniae betreffen, wie z. B. mit denjenigen, die an anderer Stelle hierin angeführt werden). Die Identifizierung von in vivo exprimierten und in breitem Umfang schützenden Antigenen von S. pneumoniae blieb schwer durchführbar.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die ein Polynucleotid umfassen, welches das S. pneumoniae-Polypeptid codiert, das in der Tabelle 1 beschrieben wird und das eine Aminosäuresequenz aufweist, die in der SEQ ID NO:66 gezeigt wird. Somit werden in einem Aspekt der Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, die Polynucleotide umfassen, welche eine Nucleotidsequenz aufweisen, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz des in Tabelle 1 gezeigten Polypeptids codiert; und (b) der Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz von (a) komplementär ist.
Weiter hierin offenbart werden Nucleinsäuremoleküle, die ein Polynucleotid umfassen, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die zu mindestens 90% und noch bevorzugter zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% zur einer der unter (a) oder (b) vorstehend aufgeführten Nucleotidsequenzen identisch ist, oder ein Polynucleotid, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem der Polynucleotide nach (a) oder (b), vorstehend, hybridisiert. Dieses Polynucleotid, das hybridisiert, hybridisiert unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die nur aus A-Resten oder nur aus T-Resten besteht. Weitere Nucleinsäuren betreffende Ausführungsformen der Erfindung betreffen isolierte Nucleinsäuremoleküle, die Polynucleotide umfassen, die die Aminosäuresequenzen von Epitop-tragenden Teilen eines S. pneumoniae-Polypeptids codieren, das eine Aminosäuresequenz nach (a), vorstehend, aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren, die die isolierten Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen, und Wirtszellen, die die rekombinanten Vektoren enthalten, sowie Verfahren zur Herstellung solcher Vektoren und Wirtszellen, und die Verwendung dieser Vektoren für die Herstellung von S. pneumoniae-Polypeptiden oder -Peptiden durch rekombinante Verfahren.
Die Erfindung stellt weiterhin isolierte S. pneumoniae-Polypeptide bereit, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, welche aus der Aminosäuresequenz des in Tabelle 1 beschriebenen Polypeptids besteht.
Die Polypeptide der vorliegenden Offenbarung umfassen auch Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die mindestens 70% Ähnlichkeit und bevorzugter mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Ähnlichkeit zu der in Tabelle 1 beschriebenen (Sequenz) aufweisen, sowie Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die mindestens zu 70% identisch, bevorzugter mindestens zu 75% identisch und noch stärker bevorzugt zu 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder zu 99% identisch mit den vorstehenden (Sequenzen) ist; sowie isolierte Nucleinsäuremoleküle, die solche Polypeptide codieren.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin einen Impfstoff bereit, bevorzugt einen Multi-Komponenten-Impfstoff, der das in Tabelle 1 beschriebene Polynucleotid oder Polypeptid aus S. pneumoniae oder Fragmente davon zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Exzipienten umfasst, wobei das/die S. pneumoniae-Polypeptid(e) in einer Menge vorliegen, die ausreicht, um eine Immunantwort gegen Mitglieder der Gattung Streptococcus in einem Tier hervorzurufen. Die S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können weiterhin mit einem oder mit mehreren Immunogenen aus einem oder mehreren anderen Organismen, bei dem/denen es sich um Streptokokken oder nicht um Streptokokken handeln kann, kombiniert werden, um einen Multi-Komponenten-Impfstoff herzustellen, mit dem man beabsichtigt, eine immunologische Antwortreaktion gegen Mitglieder der Gattung Streptococcus und wahlweise gegen einen oder mehrere Organismen hervorzurufen, bei denen es sich nicht um Streptokokken handelt.
Die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung können in Form von DNA, z. B. als „nackte” DNA verabreicht werden, wobei die DNA ein oder mehrere Streptokokken-Polypeptid(e) und wahlweise ein oder mehrere Polypeptid(e) eines Organismus codiert, bei dem sich nicht um einen Streptococcus handelt. Die DNA, die ein oder mehrere Polypeptid(e) codiert, kann so konstruiert werden, dass diese Polypeptide exprimierte Fusionsproteine darstellen.
Die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung können auch als Bestandteil eines gentechnisch veränderten Organismus verabreicht werden. Somit kann ein gentechnisch veränderter Organismus, der ein oder mehrere S. pneumoniae-Polypeptid exprimiert, einem Tier verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein solcher gentechnisch veränderter Organismus ein oder mehrere S. pneumoniae-Polypeptid(e) der vorliegenden Erfindung intrazellulär, auf seiner Zelloberfläche oder in seinem periplasmatischen Raum enthalten. Des Weiteren kann ein solcher gentechnisch veränderter Organismus ein oder mehrere S. pneumoniae-Polypeptid(e) sekretieren.
Die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung können einem Tier zusammen mit einem Modulator des Immunsystems (z. B. CD86 und GM-CSF) verabreicht werden.
Die Offenbarung betrifft auch die Verwendung des in Tabelle 1 beschriebenen Polynucleotids oder Polypeptids oder von Fragmenten davon zur Herstellung eines Impfstoffs für die Induktion einer immunologischen Antwortreaktion in einem Tier, die gegen ein oder mehrere Mitglied der Gattung Streptococcus, bevorzugt gegen ein oder mehrere Isolat(e) der Art (Gattung) S. pneumoniae (gerichtet ist).
Die Offenbarung betrifft die Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Polynucleotide oder Polypeptide oder von Fragmenten davon zur Herstellung eines Impfstoffs für die Induktion einer schützenden Immunantwort in einem Tier, die ausreicht, um eine Infektion durch Mitglieder der Gattung Streptococcus, bevorzugt zumindest gegen S. pneumoniae, zu verhindern oder abzumildern. Des Weiteren können diese Polypeptide oder Fragmente davon mit einem anderen Immunogen konjugiert werden und/oder in einem Gemisch mit einem Adjuvanz verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die in einem Tier durch die Verabreichung eines oder mehrerer der S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung hervorgerufen werden. Verfahren für die Herstellung solcher Antikörper werden hierin ebenfalls offenbart.
Die Erfindung stellt ebenfalls diagnostische Verfahren für den Nachweis der Expression von Genen von Mitgliedern der Gattung Streptococcus in einem Tier bereit. Ein solches Verfahren umfasst die Untersuchung der Expression eines Gens, das ein S. pneumoniae-Polypeptid codiert, in einer Probe aus einem Tier. Die Expression kann entweder direkt (z. B. durch eine Untersuchung des Peptid-Spiegels unter Verwendung von Antikörpern, die als Antwortreaktion auf die in Tabelle 1 beschriebene Aminosäuresequenz erzeugt wurden), oder indirekt (z. B. durch die Untersuchung auf Antikörper, die eine Spezifität für die in Tabelle 1 beschriebenen Aminosäuren aufweisen) untersucht werden. Ein Beispiel für ein solches Verfahren umfasst die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Amplifikation und den Nachweis von Streptococcus-Nucleinsäuresequenzen.
Hierin werden Nucleinsäure-Sonden offenbart, die die vollständige oder einen Teil der Nucleotidsequenz aufweisen, die in Tabelle 1 beschrieben wird (gezeigt als SEQ ID NO:65), wobei die Sonden in der Lage sind, unter stringenten Bedingungen mit Streptococcus-Nucleinsäuren zu hybridisieren. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer Streptococcus-Nucleinsäure in einer biologischen Probe, die aus einem Tier erhalten wird, wobei diese eine oder die mehrere Nucleinsäure Streptococcus-Polypeptide codieren, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Probe mit einer oder mehreren der vorstehend beschriebenen Nucleinsäure-Sonde(n) unter Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung stattfindet, und (b) den Nachweis der Hybridisierung dieser einen oder mehreren Sonde mit den Streptococcus-Nucleinsäuren, die in der biologischen Proben vorhanden sind.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Immuntests einschließlich eines Immuntests für den Nachweis von Streptococcus, bevorzugt zumindest von Isolaten der Gattung S. pneumoniae, umfassend die Inkubation einer Probe (die im Verdacht steht, mit Streptococcus infiziert zu sein) mit einem Sonden-Antikörper, der gegen ein Antigen/Epitop von S. pneumoniae gerichtet ist, das nachgewiesen werden soll; dies erfolgt unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben; sowie den Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes, der den Sonden-Antikörper enthält. Ein Immuntest für den Nachweis von Antikörpern, die gegen ein Streptococcus-Antigen gerichtet sind, umfassend die Inkubation einer Probe (die Antikörper aus einem Säuger enthält, der im Verdacht steht, mit Streptococcus infiziert zu sein) mit einem Sonden-Polypeptid, das ein Epitop aus S. pneumoniae enthält, unter Bedingungen, die die Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes erlauben, der das Sonden-Epitop-tragende Antigen enthält, wird ebenfalls beschrieben.
Einige Aspekte der Erfindung, die Kits betreffen, sind z. B. solche wie: die Untersuchung von Proben auf die Anwesenheit von Polynucleotiden, die aus Streptococcus stammen, wobei der Kit eine Polynucleotid-Sonde, die eine Nucleotidsequenz aufweist, welche aus Tabelle 1 ausgewählt wird, oder ein Fragment davon mit etwa 15 oder mehr Nucleotiden in einem geeigneten Behälter umfasst; die Untersuchung von Proben auf die Anwesenheit von Antikörpern, die gegen ein Streptococcus-Antigen gerichtet sind, (wobei der Kit) aus einem Polypeptid besteht, welches ein S. pneumoniae-Epitop enthält, das in dem Polypeptid vorliegt, und wobei das Polypeptid in einem geeigneten Behälter vorliegt; und die Analyse der Proben auf die Anwesenheit von Streptococcus-Antigenen, wobei der Kit aus einem anti-S. pneumoniae-Antikörper besteht, der in einem geeigneten Behälter vorliegt.
Genaue Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante antigene Polypeptide aus S. pneumoniae und Fragmente davon. Die Offenbarung betrifft auch Verfahren für die Verwendung dieser Polypeptide zum Hervorrufen von immunologischen Antwortreaktionen und zur Verleihung eines immunologischen Schutzes gegen Erkrankungen, die durch Mitglieder der Gattung Streptococcus verursacht werden, zumindest durch Isolate der Gattung S. pneumoniae. Die Erfindung betrifft weiterhin Nucleinsäuresequenzen, die antigene S. pneumoniae-Polypeptide codieren, und Verfahren zum Nachweis von S. pneumoniae-Nucleinsäuren und -Polypeptiden in biologischen Proben. Des Weiteren betrifft die Erfindung S. pneumoniae-spezifische Antikörper und Verfahren für den Nachweis solcher Antikörper, die in einem Wirtstier produziert werden.
Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung die folgenden Ausführungsformen:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynucleotid, das ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus

(a) Polynucleotiden, die das Polypeptid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:66 gezeigt, codieren;
(b) Polynucleotiden mit der wie in SEQ ID NO:65 gezeigten codierenden Sequenz, die das Polypeptid codiert;
(c) Polynucleotiden, die zu mindestens 95% identisch mit der in SEQ ID NO:65 gezeigten codierenden Sequenz sind, oder mit der Sequenz, die die in SEQ ID NO:66 gezeigte Aminosäuresequenz codiert;
(d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codieren, die zu mindestens 95% identisch ist mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:66 gezeigt wird, oder mit der codierenden Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:65 gezeigt wird;
(e) Polynucleotiden, die einen Epitop-tragenden Bereich eines Polypeptids codieren, der eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Ile-486 bis Ala-497, Asp-524 bis Ala-535 und His-662 bis Gly-674; und
(f) Polynucleotiden, die Fragmente codieren, die mindestens 50 zusammenhängende Aminosäuren eines Polypeptids codieren, das durch eines der Polynucleotide von (a) oder (b) codiert wird, wobei die Fragmente ein Antigenepitop tragen,

Bei den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung handelt es sich um DNA oder um RNA.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, umfassend das Einfügen eines Polynucleotids der vorliegenden Erfindung in einen Vektor.
Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin ein rekombinanter Vektor bereitgestellt, der das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung enthält oder der durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wird, wobei der vorstehend beschriebene Vektor, in dem das Polynucleotid mit einer Expressions-Kontrollsequenz funktionell verknüpft ist, die Expression in prokaryontischen oder in eukaryontischen Wirtszellen ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren für die Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend das Einbringen des vorstehend beschriebenen Vektors in eine Wirtszelle.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle bereit, die mit dem vorstehend beschriebenen Vektor transformiert oder durch das vorstehende Verfahren hergestellt wurde.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das durch das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert wird, umfassend: Züchten der vorstehend beschriebenen Wirtszelle und Gewinnen des durch das Polynucleotid codierten Polypeptids aus der Kultur.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung codiert wird oder das durch das Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das vorstehend beschrieben wurde, erhalten werden kann; sowie ein Polypeptid-Antigen, umfassend die Aminosäuresequenz eines Epitop-tragenden Bereichs, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Ile-486 bis Ala-497, Asp-524 bis Ala-535 und His-662 bis Gly-674.
Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin ein Protein bereitgestellt, das durch ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung codiert wird und dem das N-terminale Methionin fehlt; sowie ein Fusionsprotein, das das Polypeptid nach Anspruch 11 und eine heterologe Polypeptidsequenz umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Antikörper bereit, der an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch bindet, sowie ein Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 15 erzeugt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel, das das Polynucleotid zu dem Polypeptid oder eine DNA, die das Polypeptid codiert und die in der Lage ist, das Polypeptid in vivo zu exprimieren, oder den Antikörper der vorliegenden Erfindung und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Exzipienten sowie eine diagnostische Zusammensetzung, die das Polynucleotid oder den Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls die Verwendung des Polynucleotids zu dem Polypeptid oder des Antikörpers der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Abmilderung einer Infektion, die durch ein Mitglied der Gattung Streptococcus verursacht wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein diagnostisches Verfahren, umfassend die Untersuchung einer von einem Wirt stammenden Probe auf die Anwesenheit des Polypeptids der vorliegenden Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung ist das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung ein Impfstoff, der bevorzugt umfasst: (a) ein S. pneumoniae-Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon; und (b) ein/en pharmazeutisch verträgliches/n Verdünnungsmittel, Träger oder Exzipienten, wobei das Polypeptid in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um schützende Antikörper gegen ein Mitglied der Gattung Streptococcus in einem Tier hervorrufen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für den Nachweis von Streptococcus-Nucleinsäuren in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend: (a) das Inkontaktbringen der Probe mit einer oder mehreren Nucleinsäuresonde(n), die das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung umfassen, unter Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung erfolgt; und (b) den Nachweis der Hybridisierung der einen oder der mehreren Sonden an die eine oder mehreren der Streptococcus-Nucleinsäuresequenzen, die in der biologischen Probe vorhanden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für den Nachweis von Streptococcus-Nucleinsäuren in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend: (a) das Amplifizieren einer oder mehrer Streptococcus-Nucleinsäuresequenzen in der Probe unter Verwendung des Polynucleotids der vorliegenden Erfindung und der Polymerase-Kettenreaktion; und (b) den Nachweis der amplifizierten Streptococcus-Nucleinsäure.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit für den Nachweis von Streptococcus-Antikörpern in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend (a) ein Mittel zum Nachweis.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin den Nachweis von Streptococcus-Antikörpern in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend (a) das Inkontaktbringen der Probe mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung; und (b) den Nachweis von Antigen-Antikörper-Komplexen.
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um den Gegenstand zu erklären, den die Erfinder als die vorliegende Erfindung ansehen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „pathogenes Agens” ein Agens, das einen Krankheitszustand oder ein Leiden in einem Tier verursacht. In diese Definition mit eingeschlossen sind zum Beispiel Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren und metazoische Parasiten, die entweder einen Krankheitszustand hervorrufen oder die ein Tier, das mit einem solchen Organismus infiziert ist, gegenüber einem Krankheitszustand empfänglich machen (wie z. B. einer sekundären Infektion). Weiterhin mit eingeschlossen sind Arten und Stämme der Gattung Streptococcus, die Krankheitszustände in Tieren hervorrufen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Organismus” jedes beliebige lebende biologische System, einschließlich Viren, und unabhängig davon, ob es sich dabei um ein pathogenes Agens handelt.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Streptococcus” jede/n beliebige/n Bakterienart oder -stamm, die/der Mitglied der Gattung Streptococcus ist. Solche Arten und Stämme sind den Fachleuten bekannt und umfassen solche, die pathogen sind und solche, die dies nicht sind.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung” Polypeptide, die die Aminosäuresequenz der S. pneumoniae-Polypeptide umfassen, die in Tabelle 1 beschrieben und als SEQ ID NO:66 offenbart werden. Diese Polypeptide können als Fusionsproteine exprimiert werden, wobei die S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen verknüpft sind, die aus Streptokokken oder auch nicht aus Streptokokken stammen können. Der Ausdruck umfasst weiterhin Fragmente der S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung.
Weitere Definitionen werden im Verlauf der Beschreibung bereitgestellt.
Erklärung der Tabelle 1
Die nachstehende Tabelle 1 stellt eine Information bereit, die einen von 113 offenen Leserastern (ORFs) beschreibt, welche potenziell antigene Polypeptide des S. pneumoniae der vorliegenden Erfindung codieren. Die Tabelle gibt die ORF-Identitätsbezeichnung an, die aus den Buchstaben SP besteht, welche S. pneumoniae bezeichnen, diesen folgt direkt anschließend ein numerischer Code aus drei Zahlen, der in willkürlicher Weise die potenziell antigenen Polypeptide des S. pneumoniae der vorliegenden Erfindung nummeriert, sowie die Nucleotid- oder die Aminosäuresequenz jedes ORFs und das codierte Polypeptid. Weiterhin setzt die Tabelle die ORF-Identitätsbezeichnung mit einer Sequenz-Identifikations-Nummer (SEQ ID NO:) in Beziehung. Die eigentliche Nucleotid- oder Aminosäuresequenz zu jeder ORF-Identitätsbezeichnung wird auch im Sequenzprotokoll und unter der entsprechenden SEQ ID NO gezeigt.
Somit bezieht sich zum Beispiel die Bezeichnung „SP126” sowohl auf die Nucleotid- als auch auf die Aminosäuresequenz des S. pneumoniae-Polypeptids Nummer 126 der vorliegenden Erfindung. Des Weiteren korreliert „SP126” mit der Nucleotidsequenz, die als SEQ ID NO:65 gezeigt wird, sowie mit der Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO.66 gezeigt und in der Tabelle 1 beschrieben wird.
Das offene Leseraster innerhalb des „ORF” beginnt mit dem zweiten angegebenen Nucleotid. Daher umfasst das erste Codon jeder gezeigten Nucleotidsequenz die Basen 2–4, das zweite Codon die Basen 5–7, das dritte Codon die Basen 8–10 usw.
Erklärung der Tabelle 2
Die Tabelle 2 listet die antigenen Epitope auf, die in dem in Tabelle 1 beschriebenen Polypeptid von S. pneumoniae vorhanden sind und wie sie von den Erfindern vorhergesagt werden. Das in Tabelle 1 gezeigte S. pneumoniae-Polypeptid besitzt ein oder mehrere antigene Epitope, die in Tabelle 2 beschrieben werden. Man wird erkennen, dass, in Abhängigkeit von den analytischen Kriterien, die verwendet wurden, um die antigenen Determinanten vorherzusagen, die exakten Begrenzungen der Determinanten leicht variieren können. Die genaue Lokalisierung einer antigenen Determinante kann in Abhängigkeit von den verwendeten Kriterien um etwa 1 bis 5 Reste verschoben sein, wahrscheinlicher um 1 bis 2 Reste. Es wird auch erkannt werden, dass, allgemein gesprochen, Aminosäuren an jedes Ende eines Peptids oder eines Polypeptids, das ein antigenes Epitop enthält, angefügt werden können, ohne dabei seine Aktivität zu beeinflussen, wohingegen die Entfernung von Resten aus einem Peptid oder einem Polypeptid, das nur eine antigene Determinante enthält sehr viel wahrscheinlicher seine Aktivität zerstört. Man wird erkennen, dass die gezeigten Reste und die Stellen, die in Tabelle 2 beschrieben werden, der Aminosäuresequenz für das in Tabelle 1 und im Sequenzprotokoll gezeigte ORF entsprechen.
Erklärung der Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt PCR-Primer, die von den Erfindern entsprechend des Verfahrens in Beispiel 1 für die Amplifikation von Polynucleotiden entworfen wurden, die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren. Das Entwerfen von PCR-Primern ist im Fachgebiet Routine und die in Tabelle 3 gezeigten Primer werden nur aus Gründen der Bequemlichkeit für die erfahrenden Fachleute gezeigt. Man wird erkennen, dass andere Primer mit gleichem Erfolg verwendet werden können. Für jeden Primer gibt die Tabelle die entsprechende Bezeichnung des ORFs aus Tabelle 1 an, der entweder ein „A” oder ein „B” folgt. Die „A”-Primer sind die 5'-Primer und die „B”-Primer sind die 3'-Primer. In jeden Primer wurde eine Restriktionsenzym-Schnittstelle eingebaut, um die Clonierung zu erleichtern. Das Restriktionsenzym, das eine Sequenz innerhalb eines jeden Primers erkennt und spaltet, ist unter der Überschrift „RE” für Restriktionsenzym ebenfalls in Tabelle 3 angegeben. Schließlich wird auch die Sequenz-Identitätsbezeichnung in Tabelle 3 für jeden Primer angegeben, damit er leichter mit dem Sequenzprotokoll korreliert werden kann.
Auswahl der Nucleinsäuresequenzen, die antigene S. pneumoniae-Polypeptide codieren
Die vorliegende Erfindung stellt eine ausgewählte Zahl an ORFs bereit, die in den Fragmenten des S. pneumoniae-Genoms vorliegen, und die sich als nützlich für die Erzeugung einer schützenden Immunantwort erweisen könnten. Die sequenzierte genomische DNA von S. pneumoniae wurde aus einem subkultivierten Isolat des S. pneumoniae-Stammes 7/87 14.8.91 erhalten, der bei der American Type Culture Collection aus Gründen der Bequemlichkeit für Fachleute hinterlegt worden war. Dieses S. pneumoniae-Isolat wurde am 10. Oktober 1996 bei der ATCC, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungs-Nummer 55840. Eine genomische Genbank, die aus der DNA konstruiert wurde, welche aus dem S. pneumoniae-Isolat isoliert worden war, wurde bei der ATCC am 11. Oktober 1996 ebenfalls hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungs-Nummer 97755. Eine vollständigere Auflistung der Sequenzen, die von dem S. pneumoniae-Genom erhalten wurden, befindet sich in der ebenfalls anhängigen vorläufigen U.S.-Anmeldung mit der Serien-Nr. 60/029,960, die am 31.10.96 eingereicht wurde, und die hierin durch Bezugnahme vollständig mit eingeschlossen ist. Einige ORFs, die in der Untergruppe von Fragmenten des S. pneumoniae-Genoms enthalten sind, welche hierin offenbart wird, wurden unter Verwendung einer Reihe an Durchmusterungskriterien abgeleitet, die in Einzelheiten nachstehend angegeben werden.
Die ausgewählten ORFs bestehen nicht aus vollständigen ORFs. Obwohl ein Polypeptid, das einen vollständigen ORF repräsentiert, die bestmöglichste Annäherung an ein Protein sein kann, das in einem Organismus natürlich vorliegt, wird es nicht immer bevorzugt, den vollständigen ORF in einem heterologen System zu exprimieren. Es kann es eine Herausforderung sein, ein stark hydrophobes Protein mit Hilfe der üblichen Laborverfahren zu exprimieren und zu reinigen. Daher können die Kandidaten für einen Polypeptid-Impfstoff, wie er hierin beschrieben wird, leicht modifiziert sein, um die Herstellung des rekombinanten Proteins zu vereinfachen. So wurden zum Beispiel Nucleotidsequenzen, die stark hydrophobe Domänen codieren, wie z. B. solche, die sich in der aminoterminalen Signal-Sequenz befinden, bei einigen Konstrukten ausgeschlossen, die für die in vitro-Expression der Polypeptide verwendet wurden. Des Weiteren wurden alle stark hydrophoben Aminosäuresequenzen, die an den Carboxy-Termini vorhanden sind, ebenfalls von den rekombinanten Expressionskonstrukten ausgeschlossen. Daher kann in einer Ausführungsform ein Polypeptid, das einen verkürzten oder einen modifizierten ORF repräsentiert, als Antigen verwendet werden.
Obwohl im Fachgebiet zahlreiche Verfahren für die Auswahl potenziell immunogener Polypeptide bekannt sind, wurden viele der hierin offenbarten ORFs auf der Grundlage einer Durchmusterung aller theoretischen ORFs von S. pneumoniae ausgewählt, um verschiedene Aspekte einer potenziellen Immunogenität (abzudecken). Eine Reihe an Auswahlkriterien ist wie folgt:

1. Typ I-Signalsequenz: Eine aminoterminale Signalsequenz des Typs I steuert ein neu gebildetes Protein im Allgemeinen durch die Plasma- und die äußere Membran zu der äußeren Umgebung der Bakterienzelle. Experimentelle Hinweise, die aus Untersuchungen an Escherichia coli erhalten wurden, legen nahe, dass die typische Typ I-Signalsequenz die folgenden biochemischen und physikalischen Eigenschaften aufweist (Izard, J.W. und Kendall, D.A., Mol. Microbiol. 13:765–773 (1994)). Die Länge der Typ I-Signalsequenz beträgt etwa 15 bis 25 vorwiegend hydrophobe Aminosäurereste mit einer positiven Nettoladung am äußersten Aminoterminus. Darüber hinaus nimmt die zentrale Region der Signalsequenz eine alpha-helikale Konformation in einer hydrophoben Umgebung an. Schließlich umfasst die Region, die die eigentliche Spaltstelle umgibt, idealerweise sechs Reste mit kurzen Aminosäure-Seitenketten an den Positionen –1 und –3.
2. Typ IV-Signalsequenz: Die Signalsequenz des Typs IV ist ein Beispiel für die verschiedenen Arten an funktionellen Signalsequenzen, die neben der vorstehend in Einzelheiten beschriebenen Typ I-Signalsequenz vorkommen. Obwohl funktionell verwandt, besitzt die Typ IV-Signalsequenz eine einzigartige Reihe an biochemischen und physikalischen Eigenschaften (Strom, M.S. und Lory, S., J. Bacteriol. 174:7345–7351 (1992)). Diese umfassen typischerweise sechs bis acht Aminosäuren mit einer basischen Netto-Ladung, gefolgt von weiteren 16 bis 30 vorwiegend hydrophoben Resten. Die Spaltstelle einer Typ IV-Signalsequenz befindet sich in der Regel hinter den anfänglichen sechs bis acht Aminosäuren am äußersten Aminoterminus. Darüber hinaus enthalten Typ IV-Signalsequenzen im Allgemeinen einen Phenylalanin-Rest an Position +1 relativ zu der Spaltstelle.
3. Lipoprotein: Eine Untersuchung der Spaltstellen von 26 bakteriellen Lipoprotein-Vorläufern erlaubte die Definition einer Konsensus-Aminosäuresequenz für die Spaltung von Lipoproteinen. Fast drei Viertel der untersuchten bakteriellen Lipoprotein-Vorläufer enthielten die Sequenz: L-(A,S)-(G,A)-C an den Positionen –3 bis +1 relativ zu der Spaltstelle (Hayashi, S. und Wu, H.C., J. Bioenerg. Biomembr. 22:451–471 (1990)).
4. LPXTG-Motiv: Experimentell wurde bestimmt, dass die meisten verankerten Proteine, die sich an der Oberfläche von Gram-positiven Bakterien befinden, eine hoch konservierte carboxyterminale Sequenz besitzen. Mehr als 50 solcher Proteine aus Organismen wie z. B. S. pyogenes, S. mutans, E. faecalis, S. pneumoniae und anderen wurden aufgrund ihrer extrazellulären Lokalisierung und ihrer carboxyterminalen Aminosäuresequenz identifiziert (Fischetti, V.A., ASM News 62:405–410 (1996)). Die konservierte Region besteht aus sechs geladenen Aminosäuren am äußersten Carboxyterminus, die an 15–20 hydrophobe Aminosäuren gekoppelt sind, welche vermutlich als eine transmembrane Domäne fungieren. Der transmembranen Domäne direkt benachbart ist eine Aminosäuresequenz aus sechs Aminosäuren, die in fast allen untersuchten Proteinen konserviert ist. Die Aminosäuresequenz dieser Region ist: L-P-X-T-G-X, wobei X eine beliebige Aminosäure sein kann.

Es wurde ein Algorithmus entwickelt, der die vorstehenden Kriterien umfasst, um antigene und immunogene Polypeptide aus S. pneumoniae auszuwählen. Die Verwendung dieses Algorithmus durch die Erfinder für die Auswahl immunologisch nützlicher S. pneumoniae-Polypeptide führte zur Auswahl einer Reihe der offenbarten ORFs. Polypeptide, die die Polypeptide umfassen, welche in dieser Gruppe identifiziert wurden, können über Verfahren hergestellt werden, die im Fachgebiet Standard sind und wie sie hierin nachstehend weiter beschrieben werden.
Nucleinsäuremoleküle
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die Polynucleotide umfassen, welche die S. pneumoniae-Polypeptide codieren, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die in Tabelle 1 beschrieben und als SEQ ID NO:66 gezeigt werden, und die durch Sequenzierung des Genoms von S. pneumoniae bestimmt und als potenzielle Immunogene ausgewählt wurden.
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Nucleotidsequenzen, die hierin durch die Sequenzierung eines DNA-Moleküls bestimmt wurden, unter Verwendung eines automatisierten DNA-Sequenziergeräts bestimmt (wie z. B. dem Modell 373 von Applied Biosystems, Inc.), und alle Aminosäuresequenzen der Polypeptide, die durch DNA-Moleküle codiert werden, die hierin bestimmt wurden, wurden durch Translation der DNA-Sequenzen vorhergesagt, die wie vorstehend bestimmt wurden. Daher kann, wie im Fachgebiet für alle DNA-Sequenzen bekannt ist, die durch diesen automatisierten Ansatz bestimmt wurden, jede hierin bestimmte Nucleotidsequenz einige Fehler enthalten. Nucleotidsequenzen, die durch automatisierte Verfahren bestimmt wurden, sind typischerweise mindestens zu etwa 90% identisch, noch typischer mindestens zu etwa 95% bis mindestens zu etwa 99,9% identisch mit der tatsächlichen Nucleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls. Die tatsächliche Sequenz kann noch genauer durch andere Ansätze bestimmt werden, einschließlich manueller DNA-Sequenzierungsverfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind. Wie im Fachgebiet ebenfalls bekannt ist, wird eine einzige Insertion oder Deletion in einer bestimmten Nucleotidsequenz im Vergleich zu der tatsächlichen Sequenz bei der Translation der Nucleotidsequenz eine Leserasterverschiebung verursachen, so dass die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die durch eine bestimmte Nucleotidsequenz codiert wird, sich von der Aminosäuresequenz, die tatsächlich durch das sequenzierte DNA-Molekül codiert wird, vollständig unterscheidet, und zwar beginnend an dem Punkt einer solchen Insertion oder Deletion.
Sofern nicht anders angegeben, wird jede hierin angeführte „Nucleotidsequenz” als eine Sequenz von Desoxyribonucleotiden (abgekürzt als A, G, C und T) dargestellt. Eine „Nucleotidsequenz” eines Nucleinsäuremoleküls oder eines Polynucleotids bedeutet jedoch für ein DNA-Molekül oder -Polynucleotid eine Sequenz von Desoxyribonucleotiden und für ein RNA-Molekül oder -Polynucleotid die entsprechende Sequenz an Ribonucleotiden (A, G, C und U), wobei jedes Thymidin-Desoxyribonucleotid (T) in der spezifizierten Desoxyribonucleotidsequenz durch das Ribonucleotid Uridin (U) ersetzt ist. Zum Beispiel wird beabsichtigt, dass ein Bezug auf ein RNA-Molekül, das eine Sequenz aufweist, wie sie in der Tabelle 1 unter Verwendung der Abkürzungen für Desoxyribonucleotide dargestellt wird, ein RNA-Molekül bedeutet, das eine Sequenz besitzt, in der jedes Desoxyribonucleotid A, G oder C, das in der Tabelle 1 beschrieben wird, durch das entsprechende Ribonucleotid A, G oder C ersetzt wurde und in der jedes Desoxyribonucleotid T durch das Ribonucleotid U ersetzt wurde.
Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können in Form von RNA wie z. B. als mRNA oder in Form von DNA vorliegen, einschließlich zum Beispiel cDNA und genomische DNA, die durch Clonierung erhalten wurden oder synthetisch hergestellt wurden. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Bei einzelsträngiger DNA oder RNA kann es sich um den codierenden Strang handeln, der auch als der Sinn-Strang bekannt ist, oder um den nicht codierenden Strang handeln, der auch als Antisense-Strang bezeichnet wird.
Mit „isoliertem(n)” Nucleinsäuremolekül(en) ist(sind) ein Nucleinsäuremolekül(e) gemeint, DNA oder RNA, das(die) aus seiner(ihrer) natürlichen Umgebung entfernt wurde(n). Zum Beispiel werden rekombinante DNA-Moleküle, die in einem Vektor enthalten sind, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert angesehen. Weitere Beispiele für isolierte DNA-Moleküle umfassen rekombinante DNA-Moleküle, die in heterologen Wirtszellen aufrechterhalten werden, oder (teilweise oder im Wesentlichen) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle umfassen in vivo oder in vitro (hergestellte) RNA-Transkripte der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung. Isolierte Nucleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen weiterhin solche Moleküle, die synthetisch hergestellt wurden.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen DNA-Moleküle, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, wie sie in Tabelle 1 beschrieben und als SEQ ID NO:65 gezeigt wird; DNA-Moleküle, die die codierenden Sequenzen der Polypeptide umfassen, die in der Tabelle 1 beschrieben und als SEQ ID NO:66 gezeigt werden; und DNA-Moleküle, die Sequenzen umfassen, die sich von denjenigen, die vorstehend beschrieben wurden, wesentlich unterscheiden, die aber aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch die in Tabelle 1 beschriebenen S. pneumoniae-Polypeptide codieren. Der genetische Code ist selbstverständlich im Fachgebiet wohlbekannt. Daher wäre es für Fachleute Routine, solche degenerierten Varianten zu erzeugen.
Die Erfindung stellt auch Nucleinsäuremoleküle bereit, die Sequenzen besitzen, welche zu einer beliebigen in Tabelle 1 beschriebenen Sequenz komplementär sind. Solche isolierten Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, sind als Sonden für den Nachweis der Expression von Streptococcus-Genen nützlich, zum Beispiel durch Northern-Blot-Analyse oder durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Die vorliegende Offenbarung richtet sich weiterhin auf Fragmente der hierin beschriebenen isolierten Nucleinsäuremoleküle. Mit einem Fragment eines isolierten Nucleinsäuremoleküls, das die in Tabelle 1 beschriebene Nucleotidsequenz aufweist, ist ein Fragment mit einer Länge von mindestens etwa 15 nt und bevorzugter von mindestens etwa 17 nt, noch bevorzugter von mindestens etwa 20 nt und sogar noch stärker bevorzugt von mindestens etwa 25 nt gemeint, das als diagnostische Sonde und als Primer nützlich ist, wie hierin diskutiert wird. Natürlich sind gemäß der vorliegenden Erfindung noch größere Fragmente mit einer Länge von 50–100 nt ebenfalls nützlich, ebenso wie Fragmente, die dem größten Teil, wenn nicht sogar der vollständigen Nucleotidsequenz entsprechen, die in Tabelle 1 beschrieben wird. Mit einem Fragment mit einer Länge von mindestens 20 nt ist zum Beispiel ein Fragment gemeint, das 20 oder mehr unmittelbar aufeinanderfolgende Basen der Nucleotidsequenz umfasst, wie sie in Tabelle 1 beschrieben wird. Da die in Tabelle 1 identifizierte Nucleotidsequenz als SEQ ID NO:65 bereitgestellt wird, ist die Erzeugung solcher DNA-Fragmente für Fachleute Routine. Solche Fragmente können zum Beispiel synthetisch hergestellt werden.
Bevorzugte Nucleinsäurefragmente umfassen auch Nucleinsäuremoleküle, die Nucleotidsequenzen enthalten, welche die Epitop-tragenden Teile des in Tabelle 1 identifizierten S. pneumoniae-Polypeptids codieren. Solche Nucleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel Nucleotidsequenzen, die Polypeptidfragmente codieren, die etwa von dem aminoterminalen Rest bis zu etwa dem carboxyterminalen Rest jedes Fragments reichen, das in Tabelle 2 gezeigt wird. Das Vorstehende bezog sich auf Polypeptidfragmente, die antigene Regionen der S. pneumoniae-Polypeptide darstellen, die in Tabelle 1 identifiziert wurden.
Des Weiteren werden hierin isolierte Nucleinsäuremoleküle offenbart, die Polynucleotide umfassen, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einem Teil eines Polynucleotids in einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung, das vorstehend beschrieben wurde, hybridisieren, wie zum Beispiel mit der Nucleinsäuresequenz, die in Tabelle I identifiziert wurde. Mit „stringenten Hybridisierungsbedingungen” ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung gemeint, welche umfasst: 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH-Wert 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA, gefolgt von einer Waschung der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65°C.
Mit Polynucleotiden, die mit einem „Teil” eines Polynucleotids hybridisieren, sind Polynucleotide gemeint (entweder DNA oder RNA), die mit mindestens etwa 15 Nucleotiden (nt) hybridisieren, bevorzugter mit mindestens etwa 17 nt, noch bevorzugter mit mindestens etwa 20 nt und sogar noch bevorzugter mit etwa 25–70 nt des Referenz-Polynucleotids. Diese sind als diagnostische Sonden und Primer nützlich, wie vorstehend und in mehr Einzelheiten nachstehend diskutiert.
Natürlich sind Polynucleotide, die mit einem größeren Teil des Referenz-Polynucleotids hybridisieren, zum Beispiel mit einem Teil mit einer Länge von 50–100 nt oder sogar mit der gesamten Länge des Referenz-Polynucleotids, ebenfalls als Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich, ebenso wie Polynucleotide, die dem größten Teil, und eventuell sogar der gesamten Nucleotidsequenz entsprechen, wie sie in Tabelle 1 identifiziert wurde. Mit einem Teil eines Polynucleotids „mit einer Länge von mindestens 20 nt” sind zum Beispiel 20 oder mehr zusammenhängende Nucleotide der Nucleotidsequenz des Referenz-Polynucleotids (z. B. der Nucleotidsequenz, wie sie in Tabelle I beschrieben wird) gemeint. Wie vorstehend bemerkt, sind solche Teile diagnostisch nützlich, entweder als Sonden gemäß den üblichen DNA-Hybridisierungsverfahren oder als Primer zur Amplifikation einer Zielsequenz mit Hilfe der PCR, wie in der Literatur beschrieben wird (zum Beispiel in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), dessen vollständige Offenlegung hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist).
Da die Nucleinsäuresequenz, die das S. pneumoniae-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, in Tabelle 1 identifiziert und als SEQ ID NO:65 bereitgestellt wird, ist die Erzeugung von Polynucleotiden, die mit Teilen dieser Sequenzen hybridisieren, für Fachleute Routine. Die hybridisierenden Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel gemäß bekannten Verfahren synthetisch hergestellt werden.
Wie angezeigt, können Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, die S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, solche umfassen, die die Aminosäuresequenzen der Polypeptide selber codieren; sowie zusätzliche codierende Sequenzen, die zusätzliche Aminosäuren codieren, wie z. B. solche, die weitere Funktionen bereitstellen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Daher können die Sequenzen, die diese Polypeptide codieren, mit einer Markersequenz fusioniert sein, wie z. B. einer Sequenz, die ein Peptid codiert, das die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung besteht die Marker-Aminosäuresequenz aus einem Hexa-Histidin-Peptid wie z. B. bei der Markierungssequenz, die in einem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt wird, daneben gibt es andere, von denen viele kommerziell erhältlich sind. Wie durch Gentz und Kollegen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821–824 (1989)) beschrieben wurde, ermöglicht die Hexa-Histidin-Sequenz zum Beispiel eine bequeme Reinigung des resultierenden Fusionsproteins.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch genetische Fusionen, in denen die codierenden Sequenzen der S. pneumoniae-Nucleinsäuresequenz, die in Tabelle 1 identifiziert wurde, mit zusätzlichen Nucleinsäuresequenzen verknüpft sind, um Fusionsproteine herzustellen. Diese Fusionsproteine können Epitope enthalten, die aus Streptokokken oder auch nicht aus Streptokokken stammen, und werden so entworfen, dass Proteine hergestellt werden, die eine erhöhte Immunogenität aufweisen. Weiterhin können die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung antigene Determinanten, von denen bekannt ist, dass sie eine Stimulierung durch T-Helferzellen bereitstellen, sowie Peptide, die Stellen für posttranslationelle Modifikationen codieren, welche die Immunogenität steigern (z. B. durch Acylierung), und auch Peptide, die die Reinigung erleichtern (z. B. die Histidin-„Markierungssequenz”) oder Aminosäuresequenzen enthalten, die das Fusionsprotein an einen gewünschten Ort anliefern (z. B. eine heterologe Leader-Sequenz).
In allen Fällen, in denen die Expression in Bakterien erfolgt, wird ein N-terminaler Methionin-Rest angefügt. In vielen Fällen werden diese N-terminalen Methionin-Reste jedoch posttranslationell abgespalten. Daher umfasst die Erfindung die Polypeptide, die in Tabelle 1 gezeigt werden, mit und ohne N-terminales Methionin.
Die vorliegende Erfindung umfasst somit Nucleinsäuremoleküle und Sequenzen, die Fusionsproteine codieren, welche ein oder mehrere S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen, die mit einer Aminosäuresequenz fusioniert sind, die eine posttranslationelle Modifizierung erlaubt, um die Immunogenität zu steigern. Diese posttranslationelle Modifikation kann entweder in vitro erfolgen oder wenn das Fusionsprotein in vivo in einer Wirtszelle exprimiert wird. Ein Beispiel für eine solche Modifizierung ist die Einfügung einer Aminosäuresequenz, die zur Anheftung einer Lipid-Einheit führt.
Wie vorstehend angemerkt, umfasst die vorliegende Erfindung daher genetische Fusionen, in denen die in Tabelle 1 identifizierte S. pneumoniae-Nucleinsäuresequenz mit einer Nucleotidsequenz fusioniert ist, die eine andere Aminosäuresequenz codiert. Diese andere Aminosäuresequenz kann aus Streptokokken stammen (z. B. eine andere Sequenz, die aus Tabelle 1 ausgewählt wird) oder auch nicht aus Streptokokken stammen.
Hierin weiterhin offenbart werden Varianten der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, die Teile, Analoga oder Derivate der in Tabelle 1 beschriebenen S. pneumoniae-Polypeptide codieren. Die Varianten können natürlich vorkommen, wie z. B. als natürliche allelische Varianten. Eine „allelische Variante” bedeutet eine der mehreren alternativen Formen eines Gens, die einen bestimmten Locus auf einem Chromosom eines Organismus einnehmen (Genes II, Lewin, B., Hrsg., John Wiley & Sons, New York (1985)). Nicht natürlich vorkommende Varianten können unter Verwendung der im Fachgebiet bekannten Mutageneseverfahren hergestellt werden.
Solche Varianten umfassen diejenigen, die durch Nucleotidaustausche, -Deletionen oder -Hinzufügungen hergestellt wurden. Die Austausche, Deletionen oder Hinzufügungen können ein oder mehrere Nucleotide umfassen. Die Varianten können in den codierenden Regionen, in den nicht codierenden Regionen oder in beiden verändert sein. Veränderungen in den codierenden Regionen können zu konservativen oder zu nicht konservativen Aminosäureaustauschen, -Deletionen oder -Hinzufügungen führen. Besonders bevorzugt unter diesen sind stille Austausche, Hinzufügungen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten der hierin offenbarten S. pneumoniae-Polypeptide oder von Teilen davon nicht verändern. Stille Austausche werden am wahrscheinlichsten in den Regionen vorgenommen, die keine Epitope enthalten. Leitlinien, die diese Epitope enthaltenden Regionen betreffen, werden hierin bereitgestellt wie zum Beispiel in Tabelle 2. In dieser Hinsicht besonders bevorzugt werden konservative Austausche.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen isolierte Nucleinsäuremoleküle, die ein Polynucleotid enthalten, das eine Nucleotidsequenz besitzt, die mindestens zu 95% identisch ist mit: (a) der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz des in Tabelle 1 identifizierten Polypeptids besitzt; und (b) der Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz in (a), vorstehend, komplementär ist.
Mit einem Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz besitzt, die mindestens zu 95% „identisch” mit einer Referenz-Nucleotidsequenz ist, die ein in Tabelle 1 beschriebenes S. pneumoniae-Polypeptid codiert, ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz des Polynucleotids mit der Referenzsequenz identisch ist, mit der Ausnahme, dass die Polynucleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro 100 Nucleotide der Referenz-Nucleotidsequenz enthalten kann, die das gegenständliche S. pneumoniae-Polypeptid codiert. Mit anderen Worten, um ein Polynucleotid zu erhalten, das eine Nucleotidsequenz besitzt, die mindestens zu 95% mit einer Referenz-Nucleotidsequenz identisch ist, können bis zu 5% der Nucleotide in der Referenzsequenz deletiert oder durch andere Nucleotide ausgetauscht werden oder es kann eine Zahl an Nucleotiden, die bis zu 5% der gesamten Nucleotide der Referenzsequenz (ausmachen), in die Referenzsequenz inseriert werden. Diese Mutationen der Referenzsequenz können an den 5'- oder den 3'-terminalen Positionen der Referenz-Nucleotidsequenz oder an beliebigen Stellen zwischen diesen endständigen Positionen auftreten, entweder zwischen den Nucleotiden in der Referenzsequenz individuell eingestreut oder in einer oder in mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz.
Bestimmte Nucleotide in einigen der in Tabelle 1 gezeigten Nucleinsäuresequenzen konnten bei der Sequenzierung nicht eindeutig bestimmt werden. Vollständig unbekannte Sequenzen werden als „N” gezeigt. Von anderen nicht aufgelösten Nucleotiden ist bekannt, dass es sich entweder um ein Purin, das als „R” gezeigt wird, oder um ein Pyrimidin, das als „Y” gezeigt wird, handelt. Wenn die Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen bestimmt wird, liegt dementsprechend dann Identität vor, wenn ein beliebiges Nucleotid einschließlich eines „R”, „Y” oder „N” in einer Test-Sequenz und an der entsprechenden Position in der Referenz-Sequenz (aus Tabelle 1) gefunden wird. Ebenso ist ein A, G oder „R” in einer Testsequenz identisch mit einem „R” in der Referenzsequenz; und ein T, C oder „Y” in einer Testsequenz ist mit einem „Y” in der Referenzsequenz identisch.
Ob ein bestimmtes Nucleinsäuremolekül mindestens zu 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder zu 99% zum Beispiel mit der Nucleotidsequenz, die in Tabelle 1 beschrieben wird, identisch ist, kann in der Praxis in der üblichen Weise bestimmt werden, und zwar durch die Verwendung bekannter Computerprogramme wie z. B. dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit verwendet den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482–489 (1981)), um das beste Segment an Homologie zwischen zwei Sequenzen zu finden. Wenn man Bestfit oder irgendein anderes Sequenzalignment-Programm verwendet, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel zu 95% mit einer Referenzsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung identisch ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass der Prozentsatz an Identität über die gesamte Länge der Referenz-Nucleotidsequenz berechnet wird, und so, dass Lücken in der Homologie von bis zu 5% der Gesamtanzahl der Nucleotide in der Referenzsequenz erlaubt werden.
Die vorliegende Anwendung zielt auf Nucleinsäuremoleküle, die mindestens zu 95% mit der Nucleinsäuresequenz identisch sind, die in Tabelle 1 beschrieben wird. Fachleute werden jedoch immer noch wissen, wie sie das Nucleinsäuremolekül nutzen können, und zwar zum Beispiel als Hybridisierungssonde oder als Primer bei einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Anwendungen der Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen unter anderem (1) die Isolierung von Streptococcus-Genen oder allelischen Varianten davon, entweder aus einer genomischen oder aus einer cDNA-Genbank und (2) eine Northern-Blot- oder eine PCR-Analyse zum Nachweis der Expression von Streptococcus-mRNA.
Natürlich werden aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes Fachleute sofort erkennen, dass eine große Zahl an Nucleinsäuremolekülen, die eine Sequenz besitzen, die mindestens zu 95% mit der Nucleinsäuresequenz, die in Tabelle 1 identifiziert wird, identisch ist, das gleiche Polypeptid codieren. Da degenerierte Varianten dieser Nucleotidsequenzen tatsächlich alle das gleiche Polypeptid codieren, wird dies den Fachleuten sogar ohne die Durchführung des vorstehend beschriebenen Vergleichstest deutlich sein.
Im Fachgebiet wird weiterhin erkannt werden, dass für solche Nucleinsäuremoleküle, die keine degenerierten Varianten darstellen, eine vernünftige Zahl ebenfalls Proteine codieren, die antigene Epitope der S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung enthalten. Dies ist deshalb der Fall, weil Fachleuten Aminosäureaustausche bekannt sind, die die Antigenität eines Polypeptids entweder wenig wahrscheinlich oder wahrscheinlich nicht signifikant beeinflussen (wie z. B. der Ersatz einer Aminosäure in einer Region, von der man nicht annimmt, dass sie ein antigenes Epitop bildet). Da zum Beispiel antigene Epitope identifiziert wurden, die nur sechs Aminosäuren umfassen (vergleiche mit Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2. Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988), Seite 76) erwartet man in den Fällen, in denen ein Polypeptid mehrere antigene Epitope enthält, oft nicht, dass eine Veränderung mehrerer Aminosäurereste alle antigenen Epitope dieses Polypeptids eliminiert. Dies gilt besonders dann, wenn die Veränderungen in Regionen vorgenommen werden, von denen man nicht annimmt, dass sie antigene Epitope darstellen.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die die isolierten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung enthalten, Wirtszellen, die mit den rekombinanten Vektoren gentechnisch verändert wurden, sowie die Herstellung der S. pneumoniae-Polypeptide oder Fragmente davon durch rekombinante Verfahren.
Die rekombinanten Konstrukte können in die Wirtszellen unter Verwendung wohlbekannter Verfahren wie z. B. Infektion, Transduktion, Transfektion, Transvektion, Elektroporation und Transformation eingebracht werden. Bei dem Vektor kann es sich zum Beispiel um einen Phagen-, einen Plasmid-, einen viralen oder einen retroviralen Vektor handeln. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefekt sein. Im letzteren Fall wird die Vermehrung des Virus im Allgemeinen nur in den komplementierenden Wirtszellen stattfinden.
Die Polynucleotide können mit einem Vektor verbunden werden, der einen selektierbaren Marker zur Vermehrung in einem Wirt enthält. Im Allgemeinen wird ein Plasmidvektor in einem Präzipitat wie z. B. als Calciumphosphat-Präzipitat oder in einem Komplex mit einem geladenen Lipid eingebracht. Wenn es sich bei dem Vektor um einen Virus handelt, kann er unter Verwendung einer geeigneten Verpackungs-Zelllinie in vitro verpackt und dann in die Wirtszellen transduziert werden.
Bevorzugt werden Vektoren, die cis-wirkende Kontrollregionen für das Polynucleotid von Interesse enthalten. Geeignete trans-wirkende Faktoren können durch den Wirt bereitgestellt werden, durch einen komplementierenden Vektor bereitgestellt werden oder nach dem Einbringen in den Wirt durch den Vektor selbst bereitgestellt werden.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen in dieser Hinsicht stellen die Vektoren die spezifische Expression bereit, die induzierbar und/oder zelltypspezifisch sein kann. Besonders bevorzugt unter solchen Vektoren sind diejenigen, die durch Umgebungsfaktoren induziert werden können, welche leicht zu manipulieren sind, d. h. z. B. durch Temperatur und Nährstoffzusätze.
Expressionsvektoren, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen chromosomale, episomale und von Viren abgeleitete Vektoren wie z. B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, Bakteriophagen, Hefe-Episomen, chromosomalen Elementen der Hefe, Viren wie z. B. Baculoviren, Papovaviren, Vacciniaviren, Adenoviren, dem Geflügelpest-Virus, Pseudorabies-Viren und Retroviren abgeleitet sind, sowie Vektoren, die aus Kombinationen davon abgeleitet sind, wie z. B. Cosmide und Phagemide.
Die DNA-Insertion sollte mit einem geeigneten Promotor funktionell verknüpft sein, wie z. B. dem PL-Promotor des Phagen Lambda, den lac-, trp- und tac-Promotoren aus E. coli, dem frühen und dem späten Promotor von SV40 und Promotoren von retroviralen LTRs, um nur einige zu nennen. Andere geeignete Vektoren werden den Fachleuten bekannt sein. Die Expressionskonstrukte werden weiterhin Stellen für die Transkriptions-Initiation und -Termination sowie in der transkribierten Region eine Ribosomen-Bindestelle für die Translation enthalten. Der codierende Teil der reifen Transkripte, die durch die Konstrukte exprimiert werden, wird bevorzugt einen Translationsstart am Beginn und ein Terminations-Codon (UAA, UGA, UAG) enthalten, das in geeigneter Weise am Ende des Polypeptids, das translatiert werden soll, positioniert ist.
Wie angegeben, werden die Expressionsvektoren bevorzugt mindestens einen selektierbaren Marker umfassen. Solche Marker umfassen die Dihydrofolat-Reduktase oder die Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur und das Tetracyclin- oder das Ampicillin-Resistenzgen für die Kultur in E. coli und anderen Bakterien. Repräsentative Beispiele für geeignete Wirtszellen umfassen Bakterienzellen wie z. B. E. coli-, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen wie z. B. Hefezellen; Insektenzellen wie z. B. Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen wie z. B. CHO-, COS- und Bowes-Melanom-Zellen und Pflanzenzellen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Geeignete Kulturmedien und -bedingungen für die vorstehend beschriebenen Wirtszellen sind im Fachgebiet bekannt.
Unter den Vektoren, die zur Verwendung in Bakterien bevorzugt werden, befinden sich pQE70, pQE60 und pQE-9, die von Qiagen erhältlich sind; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, die von Stratagene erhältlich sind, die pET-Vektorenreihe, die von Novagen erhältlich ist, und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, die von Pharmacia bezogen werden können. Unter den bevorzugten eukaryontischen Vektoren befinden sich pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, die von Stratagene erhältlich sind; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, die von Pharmacia erhältlich sind. Andere geeignete Vektoren werden Fachleute rasch erkennen.
Unter den bekannten bakteriellen Promotoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, befinden sich der lacI- und der lacZ-Promotor aus E. coli, der T3- und der T7-Promotor, der gpt-Promotor, der PR- und der PL-Promotor aus Lambda und der trp-Promotor. Geeignete eukaryontische Promotoren umfassen den sehr frühen Promotor des CMV, den HSV-Thymidinkinase-Promotor, den frühen und den späten SV40-Promotor, die Promotoren retroviraler LTRs wie z. B. diejenigen des Rous-Sarkom-Virus (RSV) und Metallothionein-Promotoren wie z. B. den Metallothionein-I-Promotor aus der Maus.
Die Einbringung des Konstrukts in die Wirtszellen kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, durch kationische Lipide vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder durch andere Verfahren bewirkt werden. Solche Verfahren werden in vielen Standard-Laborhandbüchern beschrieben (zum Beispiel in: Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986)).
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, in höheren Eukaryonten kann durch den Einbau einer Enhancer-Sequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die gewöhnlich 10 bis 300 Bp lang sind und so wirken, dass sie die Transkriptionsaktivität eines Promotors in einer bestimmten Wirtszellart erhöhen.
Beispiele für Enhancer umfassen den SV40-Enhancer, der auf der späten Seite des Replikationsursprungs von den Basenpaaren 100 bis 270 lokalisiert ist, den Enhancer des frühen Promotors des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Zur Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingebaut werden. Die Signale können endogen in dem Peptid (vorhanden) sein oder es können heterologe Signale sein.
Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form exprimiert werden, wie z. B. als Fusionsprotein, und es kann nicht nur Sekretionssignale umfassen, sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen. Zum Beispiel kann eine Region zusätzlicher Aminosäuren, insbesondere geladener Aminosäuren, dem N-Terminus des Polypeptids hinzugefügt werden, um die Stabilität und die Persistenz in der Wirtszelle während der Reinigung oder während der anschließenden Handhabung und Lagerung zu verbessern. Es können ebenfalls Peptid-Einheiten dem Polypeptid hinzugefügt werden, um die Reinigung zu erleichtern. Solche Regionen können vor der abschließenden Reinigung des Polypeptids entfernt werden. Die Hinzufügung von Peptid-Einheiten an Polypeptide, um die Sekretion oder die Exkretion zu bewirken, um die Stabilität zu verbessern und um die Reinigung zu erleichtern, sind neben anderen bekannte und Routineverfahren im Fachgebiet. Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfasst eine heterologe Region aus einem Immunglobulin, die nützlich ist, um Proteine zu solubilisieren. Zum Beispiel offenbart EP-A-0 464 533 (entsprechende kanadische Anmeldung 2045869 ) Fusionsproteine, die verschiedene Teile der konstanten Region von Immunglobulin-Molekülen zusammen mit einem anderen menschlichen Protein oder einem Teil davon umfassen. In vielen Fällen ist der Fc-Anteil in einem Fusionsprotein zur Verwendung bei einer Therapie und der Diagnose durchgängig vorteilhaft und führt daher zum Beispiel zu verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften ( EP-A 0232 262 ). Andererseits wäre es für einige Verwendungszwecke wünschenswert, wenn man in der Lage wäre, den Fc-Anteil zu entfernen, nachdem das Fusionsprotein exprimiert, nachgewiesen und in der beschriebenen vorteilhaften Weise gereinigt wurde. Dies ist der Fall, wenn sich der Fc-Anteil als Hindernis bei der Verwendung in der Therapie und der Diagnose herausstellt, wie zum Beispiel dann, wenn das Fusionsprotein als Antigen für Immunisierungen verwendet werden soll. Bei der Entdeckung von Arzneistoffen wurden zum Beispiel menschliche Proteine wie z. B. der hIL-5-Rezeptor mit dem Fc-Teil zum Zweck von Durchmusterungsansätzen mit hohem Durchsatz fusioniert, um Antagonisten von hIL-5 zu identifizieren. Vergleiche mit Bennett, D. et al., J. Molec. Recogn. 8:52–58 (1995) und mit Johanson, K. et al., J. Biol. Chem. 270 (16):9459–9471 (1995).
Die S. pneumoniae-Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch wohlbekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanol-Präzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophober Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie, Lektin-Chromatographie und Hochleistungflüssigchromatographie („HPLC”), wird zur Reinigung verwendet. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen natürlich vorkommende, gereinigte Produkte, Produkte chemischer Syntheseverfahren und Produkte, die durch rekombinante Verfahren aus einer prokaryontischen oder einer eukaryontischen Wirtszelle hergestellt wurden, einschließlich zum Beispiel Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säuger-Zellen.
Polypeptide und Fragmente
Die Erfindung stellt weiterhin isolierte Polypeptide bereit, die die Aminosäuresequenz besitzen, die in Tabelle 1 beschrieben wird und als SEQ ID NO:66 und so weiter bis SEQ ID NO:226 gezeigt wird, und Peptide oder Polypeptide, die Teile der vorstehenden Polypeptide umfassen. Die Begriffe „Peptid” und „Oligopeptid” werden als synonym angesehen (wie allgemein anerkannt ist), und jeder Begriff kann, je nach dem wie es der Kontext erfordert, austauschbar verwendet werden, um eine Kette von mindestens zwei Aminosäuren anzuzeigen, die durch Peptidyl-Bindungen verbunden sind. Das Wort „Polypeptid” wird hierin für Ketten verwendet, die mehr als zehn Aminosäurereste enthalten. Alle Oligopeptid- und Polypeptid-Formeln oder Sequenzen hierin sind von links nach rechts geschrieben und in Richtung von dem Aminoterminus hin zu dem Carboxyterminus.
Die Aminosäuresequenz des in Tabelle 1 beschriebenen S. pneumoniae-Polypeptids kann variiert werden, ohne dabei die Antigenität des Polypeptids signifikant zu beeinflussen. Wenn solche Unterschiede in der Sequenz in Betracht gezogen werden, sollte man sich daran erinnern, dass es in dem Polypeptid kritische Bereiche gibt, die die Antigenität bestimmen. Im Allgemeinen ist es möglich, Reste auszutauschen, die nicht Teil eines antigenen Epitops sind, ohne dass dabei die Antigenität des Polypeptids signifikant beeinflusst wird. Leitlinien für solche Veränderungen werden in Tabelle 2 angeführt, in der die Epitope für jedes Polypeptid angegeben sind.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in einer isolierten Form bereitgestellt. Der Begriff „isoliertes Polypeptid” bedeutet ein Polypeptid, das aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde. Daher wird ein hergestelltes Polypeptid und/oder ein Polypeptid, das in einer rekombinanten Wirtszelle enthalten ist, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als isoliert angesehen. Ebenso als „isoliertes Polypeptid” angesehen wird ein Polypeptid, das aus einer rekombinanten Wirtszelle teilweise oder im Wesentlichen gereinigt wurde. So können zum Beispiel durch rekombinante Verfahren hergestellte Versionen des in Tabelle 1 beschriebenen S. pneumoniae-Polypeptids durch das Ein-Schritt-Verfahren, das in Smith und Johnson (Gene 67:31–40 (1988)) beschrieben wird, im Wesentlichen gereinigt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen (a) eine Aminosäuresequenz des in Tabelle 1 beschriebenen Polypeptids; und (b) eine Aminosäuresequenz eines Epitop-tragenden Teils des Polypeptide aus (a); sowie Polypeptide, die mindestens 95% Ähnlichkeit mit dem Polypeptid aus (a) oder (b), vorstehend, aufweisen; sowie Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens 95% Identität mit den Vorstehenden aufweist.
Mit „% Ähnlichkeit” zweier Polypeptide ist ein Ähnlichkeitswert gemeint, der durch einen Vergleich der Aminosäuresequenzen der beiden Polypeptide unter Verwendung des Bestfit-Programms (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) und den Standardeinstellungen für die Bestimmung der Ähnlichkeit erhalten wurde. Bestfit verwendet den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482–489, 1981)), um das beste Segment an Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu finden.
Mit einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens zu 95% „identisch” mit einer Referenz-Aminosäuresequenz eines S. pneumoniae-Polypeptids ist, ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit der Referenzsequenz identisch ist, mit der Ausnahme, dass die Polypeptidsequenz bis zu fünf Aminosäureveränderungen pro 100 Aminosäuren der Referenz-Aminosäuresequenz umfassen kann. Mit anderen Worten, um ein Polypeptid zu erhalten, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die mindestens zu 95% mit einer Referenz-Aminosäuresequenz identisch ist, können bis zu 5% der Aminosäurereste der Referenzsequenz deletiert oder durch andere Aminosäuren ausgetauscht worden sein, oder eine Anzahl Aminosäuren, die bis zu 5% der gesamten Aminosäurereste in der Referenzsequenz ausmacht, kann in die Referenzsequenz inseriert worden sein. Diese Veränderungen der Referenzsequenz können an den amino- oder an den carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Aminosäuresequenz oder an beliebigen Stellen zwischen diesen terminalen Positionen auftreten, entweder individuell zwischen den Resten der Referenzsequenz eingestreut oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz.
Die in Tabelle 1 gezeigte Aminosäuresequenz kann einen oder mehrere „X”-Reste enthalten. „X” steht für eine unbekannte Aminosäure. Wenn daher eine beliebige Aminosäure an der gleichen Position in einer Referenz-Aminosäuresequenz vorliegt (wie sie in Tabelle 1 gezeigt wird), gilt für Zwecke der Definition der Identität, dass, wenn ein X angegeben ist, die beiden Sequenzen an dieser Position identisch sind.
In der Praxis gilt, ob irgendein bestimmtes Polypeptid mindestens zu 95% mit der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist, kann auf herkömmliche Weise unter Verwendung bekannter Computerprogramme bestimmt werden, wie z. B. des Bestfit-Programms (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Wenn Bestfit oder irgendein anderes Sequenzalignmentprogramm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel zu 95% mit einer Referenzsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung identisch ist, werden die Parameter natürlich so eingestellt, dass der Prozentsatz an Identität über die gesamte Länge der Referenz-Aminosäuresequenz berechnet wird, und so, dass Lücken in der Homologie von bis zu 5% der Gesamtzahl der Aminosäurereste in der Referenzsequenz erlaubt sind.
Wie nachstehend beschrieben wird, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um polyclonale und monoclonale Antikörper zu erzeugen, die bei Testansätzen zum Nachweis der Expression von Streptococcus-Proteinen nützlich sind.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Peptide und Polypeptide bereit, die Epitop-tragenden Teile der S. pneumoniae-Polypeptide der Erfindung umfassen, wie in Anspruch 1 dargelegt. Diese Epitope sind immunogene oder antigene Epitope der Polypeptide der Erfindung. Ein „immunogenes Epitop” ist als Teil eines Proteins definiert, der eine Antikörper-Antwortreaktion hervorruft, wenn das ganze Protein oder Polypeptid das Immunogen darstellt. Man nimmt an, dass diese immunogenen Epitope auf wenige Stellen auf dem Molekül beschränkt sind. Andererseits ist eine Region eines Proteinmoleküls, an die ein Antikörper binden kann, als „antigene Determinante” oder als „antigenes Epitop” definiert. Die Zahl an immunogenen Epitopen eines Proteins ist im Allgemeinen geringer als die Zahl an antigenen Epitopen (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998–4002 (1983)). Vorhergesagte antigene Epitope werden in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.
Hinsichtlich der Auswahl der Peptide oder der Polypeptide, die ein antigenes Epitop tragen (d. h. eines, das eine Region eines Proteinmoleküls enthält, an die ein Antikörper binden kann), ist im Fachgebiet wohlbekannt, dass relativ kurze, synthetische Peptide, die einen Teil einer Proteinsequenz nachbilden, in der Regel in der Lage sind, die Bildung eines Antiserums zu bewirken, das mit dem teilweise nachgebildeten Protein reagiert (vergleiche z. B. mit Sutcliffe et al., Science 219:660–666 (1983)). Peptide, die in der Lage sind, Protein-reaktive Seren hervorzurufen, sind häufig in der Primärsequenz eines Proteins repräsentiert, können durch eine Reihe einfacher chemischer Regeln charakterisiert werden und sind weder auf die immundominanten Regionen intakter Proteine (d. h. die imunogenen Epitope) noch auf die amino- oder carboxyterminalen Enden beschränkt. Peptide, die extrem hydrophob sind, und solche mit sechs oder weniger Resten sind im Allgemeinen nicht wirksam bei der Induktion von Antikörpern, die an das nachgebildete Protein binden; längere Peptide, insbesondere solche, die Prolin-Reste enthalten, sind in der Regel wirksam (Sutcliffe et al., vorstehend, S. 661). So induzierten zum Beispiel 18 von 20 Peptiden, die entsprechend diesen Richtlinien entworfen wurden und die 8–39 Reste enthielten, welche 75% der Sequenz der Hämagglutinin-HA1-Polypeptidkette des Influenzavirus abdeckten, Antikörper, die mit dem HA1-Protein oder mit dem intakten Virus reagierten; und 12 von 12 Peptiden der MuLV-Polymerase ebenso wie 18 von 18 Peptiden des Rabies-Glycoproteins induzierten Antikörper, die die entsprechenden Proteine präzipitierten.
Antigene Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung sind daher nützlich, um Antikörper zu erzeugen, einschließlich monoclonaler Antikörper, die an ein Polypeptid der Erfindung spezifisch binden. Ein großer Teil der Hybridome, die durch die Fusion von Milzzellen aus Spendern erhalten werden, welche mit einem antigenen Epitop-tragenden Peptid immunisiert wurden, sekretieren daher in der Regel Antikörper, die mit dem nativen Protein reagieren (Sutcliffe et al., vorstehend, S. 663). Die Antikörper, die durch antigene, Epitop-tragende Peptide oder Polypeptide erzeugt wurden, sind nützlich, um das nachgebildete Protein nachzuweisen, und Antikörper gegen unterschiedliche Peptide können verwendet werden, um das Schicksal verschiedener Regionen eines Proteinvorläufers zu verfolgen, der einer posttranslationellen Prozessierung unterworfen wird. Die Peptide und die anti-Peptid-Antikörper können in einer Vielzahl von qualitativen oder quantitativen Testansätzen für das nachgebildete Protein verwendet werden, wie zum Beispiel bei Kompetitions-Testansätzen, da gezeigt wurde, dass sogar kurze Peptide (z. B. etwa 9 Aminosäuren lang) binden und die längeren Peptide bei Immunpräzipitations-Testansätzen verdrängen können (vergleiche zum Beispiel mit Wilson et al., Cell 37:767–778 (1984) auf S. 777). Die anti-Peptid-Antikörper der Erfindung sind auch zur Reinigung des nachgebildeten Proteins nützlich, zum Beispiel durch Adsorptions-Chromatographie, und zwar unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind.
Antigene, Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Offenbarung, die nach den vorstehenden Richtlinien entworfen wurden, enthalten bevorzugt eine Sequenz von mindestens sieben, bevorzugter von mindestens neun und am stärksten bevorzugt von etwa 15 bis etwa 30 Aminosäuren, die innerhalb der Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung enthalten sind. Peptide und Polypeptide, die einen größeren Teil der Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung umfassen, der mindestens 50 Aminosäuren enthält, oder jede beliebige Länge bis zu und einschließlich der vollständigen Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung werden jedoch ebenfalls als Epitop-tragende Peptide oder Polypeptide der Erfindung angesehen und sind ebenfalls nützlich, um Antikörper zu induzieren, die mit dem nachgebildeten Protein reagieren. Vorzugsweise wird die Aminosäuresequenz des Epitop-tragenden Peptids so gewählt, dass sie in wässrigen Lösemitteln eine deutliche Lösungsfähigkeit aufweist (d. h. die Sequenz umfasst relativ hydrophile Reste und stark hydrophobe Reste werden vorzugsweise vermieden); und Sequenzen, die Prolin-Reste enthalten, werden besonders bevorzugt.
Nicht einschränkende Beispiele für antigene Polypeptide oder Peptide, die verwendet werden können, um Streptococcus-spezifische Antikörper zu erzeugen, umfassen Teile der in Tabelle 1 identifizierten Aminosäuresequenz. Noch spezifischer offenbart Tabelle 2 antigene Fragmente des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wobei die antigenen Fragmente Aminosäuresequenzen von etwa dem ersten angegebenen Aminosäurerest bis hin zu etwa dem letzten Aminosäurerest umfassen, der für jedes Fragment angegeben ist. Von den in Tabelle 2 offenbarten Polypeptidfragmenten wird angenommen, dass sie die antigenen Regionen des in Tabelle 1 beschriebenen S. pneumoniae-Polypeptids darstellen. Somit umfasst die Erfindung weiterhin isolierte Peptide und Polypeptide, die die Aminosäuresequenz eines in Tabelle 2 gezeigten Epitops umfassen, sowie Polynucleotide, die diese Polypeptide codieren.
Die Epitop-tragenden Peptide und Polypeptide der Erfindung können durch beliebige herkömmliche Mittel zur Herstellung von Peptiden oder Polypeptiden hergestellt werden, einschließlich rekombinanter Mittel, und zwar unter Verwendung der Nucleinsäuremoleküle der Erfindung. Zum Beispiel kann eine Epitop-tragende Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung mit einem größeren Polypeptid fusioniert werden, das als Träger im Verlauf der rekombinanten Produktion und Reinigung sowie während der Immunisierung zur Herstellung von anti-Peptid-Antikörpern fungiert. Epitop-tragende Peptide können ebenfalls unter Verwendung bekannter Verfahren der chemischen Synthese synthetisiert werden. Zum Beispiel beschrieb Houghten ein einfaches Verfahren für die Synthese einer großen Zahl an Peptiden wie z. B. 10–20 mg von 248 unterschiedlichen Peptiden mit 13 Resten, die einzelne Aminosäurevarianten eines Segments des HA1-Polypetids darstellten und die (durch Bindungsuntersuchungen auf ELISA-Basis) in weniger als vier Wochen hergestellt und charakterisiert wurden (Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131–5135 (1985)). Dieses „Simultaneous multiple Peptide Synthesis (SMPS)”-Verfahren wird in dem US-Patent Nr. 4,631,211 an Houghten und Mitarbeiter (1986) näher beschrieben. Bei diesem Verfahren sind die individuellen Harze für die Festphasensynthese verschiedener Peptide in getrennten, für das Lösemittel durchlässigen Packungen enthalten, die eine optimale Anwendung der vielen identischen und sich wiederholenden Schritte ermöglichen, die bei Festphasenverfahren beteiligt sind. Ein vollständig manuelles Verfahren ermöglicht es, dass 500–1000 oder mehr Synthesen gleichzeitig durchgeführt werden können (Houghten et al., vorstehend, S. 5134).
Epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung werden verwendet, um Antikörper gemäß Verfahren zu induzieren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind (vergleiche zum Beispiel mit Sutcliffe et al., vorstehend; Wilson et al., vorstehend; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910–914 (1985) und Bittle, F.J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347–2354 (1985)). Im Allgemeinen können Tiere mit dem freien Peptid immunisiert werden; der anti-Peptid-Antikörper-Titer kann jedoch durch eine Kopplung des Peptids an einen makromolekularen Träger wie z. B. an KLH („Keyhole Limpet Hemocyanin”) oder an Tetanus-Toxoid gesteigert werden. Zum Beispiel können Peptide, die Cystein enthalten, unter Verwendung eines Linkers wie z. B. m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) an einen Träger gekoppelt werden, während andere Peptide unter Verwendung eines eher allgemeinen Vernetzmittels wie z. B. Glutaraldehyd an einen Träger gekoppelt werden können. Die Tiere wie z. B. Kaninchen, Ratten und Mäuse werden entweder mit den freien oder mit den an den Träger gebundenen Peptiden immunisiert, zum Beispiel durch intraperitoneale und/oder durch intradermale Injektion von Emulsionen, die etwa 100 μg Peptid oder Trägerprotein und Freundsches Adjuvans enthalten. Es können mehrere Auffrischungsinjektionen nötig sein, zum Beispiel in Intervallen von etwa zwei Wochen, um einen brauchbaren Titer des anti-Peptid-Antikörpers bereitzustellen, der zum Beispiel durch einen ELISA-Testansatz unter Verwendung des freien Peptids, das an eine feste Oberfläche adsorbiert ist, nachgewiesen werden kann. Der Titer der anti-Peptid-Antikörper im Serum eines immunisierten Tieres, kann durch Auswahl der anti-Peptid-Antikörper erhöht werden, wie zum Beispiel durch die Adsorption an das Peptid auf einer festen Unterlage und Elution der ausgewählten Antikörper gemäß Verfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind.
Immunogene, Epitop-tragende Peptide der Erfindung, d. h. derjenigen Teile eines Proteins, die eine Antikörper-Antwortreaktion hervorrufen, wenn das ganze Protein das Immunogen darstellt, werden gemäß den im Fachgebiet bekannten Verfahren identifiziert. Zum Beispiel offenbaren Geysen et al., vorstehend, ein Verfahren für die schnelle, gleichzeitige Synthese auf festen Unterlagen von Hunderten von Peptiden mit ausreichender Reinheit für eine Reaktion in einem Enzym-gekoppelten Immunadsorptionstestansatz. Die Wechselwirkung der synthetisierten Peptide mit den Antikörpern kann anschließend ohne ihre Entfernung von der Unterlage leicht nachgewiesen werden. Auf diese Weise kann ein Peptid, das ein immunogenes Epitop eines gewünschten Proteins trägt, durch Fachleute routinemäßig identifiziert werden. Zum Beispiel wurde das immunologisch wichtige Epitop des Hüllproteins des Maul-und-Klauenseuche-Virus durch Geysen et al., vorstehend, mit einer Auflösung von sieben Aminosäuren lokalisiert, dies erfolgte durch die Synthese einer überlappenden Reihe aller 208 möglichen Hexapeptide, die die vollständige, 213 Aminosäuren lange Sequenz des Proteins überdeckten. Dann wurde eine vollständige Austauschreihe an Peptiden synthetisiert, in der alle 20 Aminosäuren nacheinander an jeder Position innerhalb des Epitops ausgetauscht wurden, und die bestimmten Aminosäuren, die eine Spezifität für eine Reaktion mit dem Antikörper verliehen, wurden bestimmt. Somit können Peptidanaloga der Epitop-tragenden Peptide der Erfindung durch dieses Verfahren routinemäßig hergestellt werden. Das US-Patent Nr. 4,708,781 an Geysen (1987) beschreibt dieses Verfahren zur Identifizierung eines Peptids, das ein immunogenes Epitop eines gewünschten Proteins trägt, näher.
Des Weiteren beschreibt das US-Patent Nr. 5,194,392 an Geysen (1990) noch ein allgemeines Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung einer Sequenz von Monomeren (Aminosäuren oder anderen Verbindungen), die ein topologisches Äquivalent eines Epitops darstellt (d. h. ein „Mimotop”), das zu einem bestimmten Paratop (der Antigen-Bindestelle) eines Antikörpers von Interesse komplementär ist. Noch allgemeiner beschreibt das U.S.-Patent Nr. 4,433,092 auch an Geysen (1989) ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung einer Sequenz von Monomeren, die ein topographisches Äquivalent eines Liganden darstellt, der zu der Liganden-Bindestelle eines bestimmten Rezeptors von Interesse komplementär ist. In ähnlicher Weise offenbart das US-Patent Nr. 5,480,971 an Houghten, R.A. et al., (1996) lineare peralkylierte C₁-C₇-Alkyl-Oligopeptide und Sammlungen und Banken solcher Peptide sowie Verfahren zur Verwendung solcher Oligopeptid-Sammlungen und -Banken zur Bestimmung der Sequenz eines peralkylierten Oligopeptids, das an ein Akzeptor-Molekül von Interesse bevorzugt bindet. Somit können auch Analoga der Epitop-tragenden Peptide der Erfindung, die keine Peptide darstellen, durch diese Verfahren routinemäßig hergestellt werden.
Wie Fachleute erkennen werden, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung und die Epitop-tragenden Fragmente davon, die vorstehend beschrieben wurden, mit Teilen der konstanten Domäne von Immunglobulinen (IgG) kombiniert werden, woraus sich chimäre Polypeptide ergeben. Diese Fusionsproteine erleichtern die Reinigung und weisen in vivo eine erhöhte Halbwertszeit auf. Dies wurde z. B. für chimäre Proteine gezeigt, die aus den ersten beiden Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Regionen der schweren oder der leichten Kette von Säuger-Immunglobulinen bestehen (EPA 0,394,827; Traunecker et al., Nature 331:84–86 (1988)). Fusionsproteine, die aufgrund des IgG-Anteils eine durch Disulfidbrücken verbundene dimere Struktur besitzen, können darüber hinaus andere Moleküle wirksamer binden und neutralisieren als das monomere S. pneumoniae-Polypeptid oder ein Proteinfragment davon alleine (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958–3964 (1995)).
Diagnostische Testansätze
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren für die Untersuchung einer Streptokokken-Infektion in einem Tier; dies erfolgt über den Nachweis der Expression von Genen, die Streptokokken-Polypeptide (z. B. das in Tabelle 1 beschriebene Polypeptid) codieren. Dieses Verfahren umfasst die Analyse von Gewebe oder von Körperflüssigkeiten des Tieres auf Streptococcus-spezifische Antikörper oder auf Streptokokken-Nucleinsäuren oder -Proteine. Die Analyse der Nucleinsäuren, die für Streptococcus spezifisch sind, kann über eine PCR oder über Hybridisierungsverfahren durchgeführt werden, wobei Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung entweder als Hybridisierungssonden oder als Primer verwendet werden (vergl. mit Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, herausgegeben von Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Eremeeva et al., J. Clin. Microbiol. 32:803–810 (1994), das die Unterscheidung zwischen Fleckfieber-Rickettsiae-Arten durch die Analyse von Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen der durch eine PCR amplifizierten DNA beschreibt). Verfahren für den Nachweis von B. burgdorferi-Nucleinsäuren mit Hilfe der PCR werden zum Beispiel in Chen et al., J. Clin. Microbiol. 32:589–595 (1994) beschrieben.
Wenn die Diagnose eines Krankheitszustandes, der mit einer Streptococcus-Infektion in Zusammenhang steht, bereits vorgenommen wurde, ist die vorliegende Erfindung nützlich für die Überwachung des Voranschreitens oder des Rückgangs des Krankheitszustandes, wobei die Patienten, die eine erhöhte Expression von Streptococcus-Genen aufweisen, einen schlechteren klinischen Ausgang erfahren, als Patienten, die diese(s) Gen(e) in einem geringeren Spiegel exprimieren.
Mit „Untersuchung auf eine Streptokokken-Infektion in einem Tier durch einen Nachweis von Genen, die Streptokokken-Polypeptide codieren,” ist die quantitative oder qualitative Messung oder Abschätzung der Spiegel eines oder mehrerer Streptococcus-Polypeptide oder des Spiegels der Nucleinsäuren, die Streptococcus-Polypeptide codieren, in einer ersten biologischen Probe gemeint, dies erfolgt entweder direkt (z. B. durch Bestimmung oder Abschätzung des absoluten Protein- oder Nucleinsäure-Spiegels) oder relativ (z. B. durch einen Vergleich des Streptococcus-Polypeptid-Spiegels oder des mRNA-Spiegels in einer zweiten biologischen Probe). Der Streptococcus-Polypeptid-Spiegel oder der -Nucleinsäure-Spiegel in der zweiten Probe, die für einen relativen Vergleich verwendet wird, kann nicht nachweisbar sein, wenn (die Probe) von einem Tier erhalten wurde, das nicht mit Streptococcus infiziert ist. Wenn das Voranschreiten oder der Rückgang eines Krankheitszustandes überwacht wird, können der Streptococcus-Polypeptid-Spiegel oder der Nucleinsäure-Spiegel mit einer zweiten Probe verglichen werden, die entweder aus einem mit Streptococcus infizierten Tier, oder aus dem gleichen Tier stammt, aus dem die erste Probe erhalten wurde, aus diesem Tier aber zu einem unterschiedlichen Zeitpunkt als die erste Probe entnommen wurde. Wie man im Fachgebiet wissen wird, kann, nachdem erst einmal ein Standard-Spiegel für die Streptococcus-Polypeptide oder -Nucleinsäuren, der einem bestimmten Stadium einer Streptokokken-Infektion entspricht, bekannt ist, dieser wiederholt als Standard für einen Vergleich verwendet werden.
Mit „biologischer Probe” ist eine beliebige biologische Probe gemeint, die aus einem Tier, einer Zelllinie, einer Gewebekultur oder aus einer anderen Quelle erhalten wird, die das/die Streptococcus-Polypeptid, -mRNA oder -DNA enthält. Biologische Proben umfassen Körperflüssigkeiten (wie z. B. Plasma und Gelenksflüssigkeit), die Streptococcus-Polypeptide enthalten, sowie Muskel-, Haut- und Knorpelgewebe. Verfahren zur Gewinnung von Gewebebiopsien und Körperflüssigkeiten sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Die vorliegende Erfindung ist zum Nachweis von Krankheiten nützlich, die mit Streptococcus-Infektionen in Tieren in Beziehung stehen. Bevorzugte Tiere umfassen Affen, Menschenaffen, Katzen, Hunde, Kühe, Schweine, Mäuse, Pferde, Kaninchen und Menschen. Besonders bevorzugt werden Menschen.
Die Gesamt-RNA kann aus einer biologischen Probe unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens isoliert werden, wie z. B. des einen Schritt umfassenden Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahrens, das in Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162:156–159 (1987) beschrieben wurde.. Die mRNA, die Streptococus-Polypeptide codiert und die eine ausreichende Homologie zur der in Tabelle 1 identifizierten Nucleinsäuresequenz aufweist, um eine Hybridisierung zwischen den komplementären Sequenzen zu ermöglichen, wird dann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens untersucht. Diese umfassen die Northern-Blot-Analyse, die S1-Nuclease-Kartierung, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die reverse Transkription in Verbindung mit der Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und die reverse Transkription in Verbindung mit der Ligase-Kettenreaktion (RT-LCR).
Die Northern-Blot-Analyse kann, wie in Harada et al., Cell 63:303–312 (1990) beschrieben, durchgeführt werden. Kurzgefasst wird die Gesamt-RNA aus einer biologischen Probe, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Für den Northern-Blot wird die RNA in einem geeigneten Puffer (wie z. B. Glyoxal/Dimethylsulfoxid/Natriumphosphat-Puffer) denaturiert, dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen. Nachdem die RNAs mit dem Filter durch eine UV-Vernetzung verbunden wurden, wird der Filter in einer Lösung vorhybridisiert, die Formamid, SSC, Denhardt-Lösung, denaturierte Lachssperma-DNA, SDS und Natriumphosphat-Puffer enthält. Die in Tabelle 1 gezeigte, S. pneumoniae-Polypeptid (codierende) DNA-Sequenz, die gemäß einem beliebigen geeigneten Verfahren markiert wurde (wie z. B. mit Hilfe des ³²P-mehrfach geprimten-DNA-Markierungssystems (Amersham)), wird als Sonde verwendet. Nach der Hybridisierung über Nacht wird der Filter gewaschen und gegenüber einem Röntgenfilm exponiert. Die DNA, die als Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wurde in den vorstehenden Abschnitten beschrieben und besitzt bevorzugt mindestens eine Länge von 15 bp.
Die S1-Kartierung kann, wie in Fujita et al., Cell 49:357–367 (1987) beschrieben, durchgeführt werden. Um die Sonden-DNA für die Verwendung bei der S1-Kartierung herzustellen, wird der Sinn-Strang der vorstehend beschriebenen S. pneumoniae-DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung als Matrize verwendet, um markierte Antisense-DNA zu synthetisieren. Diese Antisense-DNA kann dann unter Verwendung einer geeigneten Restriktionsendonuclease verdaut werden, um weitere DNA-Sonden mit einer gewünschten Länge herzustellen. Solche Antisense-Sonden sind zur Sichtbarmachung geschützter Banden nützlich, die der Ziel-mRNA entsprechen (d. h. der mRNA, die Streptococcus-Polypeptide codiert).
Die Spiegel der mRNAs, die Streptococcus-Polypeptide codieren, werden bevorzugt unter Verwendung des RT-PCR-Verfahrens untersucht, das in Makino et al., Technique 2:295–301 (1990) beschrieben wird. Bei diesem Verfahren steht die Radioaktivität in den „Amplicons” in den Polyacrylamid-Gelbanden mit der zu Beginn vorhandenen Konzentration an Ziel-mRNA in linearer Beziehung. Kurzgefasst umfasst dieses Verfahren die Zugabe der Gesamt-RNA, die aus einer biologischen Probe isoliert wurde, zu einem Reaktionsgemisch, das einen RT-Primer und einen geeigneten Puffer enthält. Nach einer Inkubation zur Anelierung des Primers kann das Gemisch mit dem RT-Puffer, dNTPs, DTT, einem RNAse-Inhibitor und der reversen Transkriptase ergänzt werden. Nach einer Inkubation zur Durchführung der reversen Transkription der RNA werden die RT-Produkte dann der PCR unter Verwendung von markierten Primern unterworfen. Alternativ kann statt der Markierung der Primer ein markiertes dNTP in das PCR-Reaktionsgemisch mit einbezogen werden. Die PCR-Amplifikation kann in einem DNA-Thermalcycler gemäß einem üblichen Verfahren durchgeführt werden. Nach einer geeigneten Anzahl von Runden, um eine Amplifikation zu erreichen, wird das PCR-Reaktionsgemisch in einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach dem Trocknen des Gels wird die Radioaktivität in den passenden Banden (die der mRNA entsprechen, die die Streptococcus-Polypeptide codiert) unter Verwendung eines bildgebenden Analysegeräts quantifiziert. RT- und PCR-Reaktionsbestandteile und -Bedingungen, Reagenz- und Gelkonzentrationen sowie Verfahren zur Markierung sind im Fachgebiet wohlbekannt. Variationen des RT-PCR-Verfahrens sind den Fachleuten ebenfalls bekannt.
Die Untersuchung des Spiegel des Streptococcus-Polypeptids in einer biologischen Probe kann unter Verwendung jedes beliebigen, im Fachgebiet bekannten Verfahrens durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Streptococcus-Polypeptid-Spiegel in einer biologischen Probe werden Verfahren bevorzugt, die auf Antikörpern basieren. Die Expression des Streptococcus-Polypeptids in Geweben kann zum Beispiel mit klassischen immunhistologischen Verfahren untersucht werden. Bei diesen wird die spezifische Erkennung durch den primären Antikörper (polyclonal oder monoclonal) bereitgestellt, aber das sekundäre Nachweissystem kann Fluoreszenz-, Enzym- oder andere konjugierte sekundäre Antikörper verwenden. Als Ergebnis wird eine immunhistologische Anfärbung von Gewebsschnitten für eine pathologischen Untersuchung erhalten. Die Gewebe können auch extrahiert werden, z. B. mit Harnstoff und einem neutralen Detergenz, um das Streptococcus-Polypeptid für einen Western-Blot- oder einen Dot/Slot-Testansatz freizusetzen (Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101:976–985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087–3096 (1987)). Bei diesem Verfahren, das auf der Verwendung kationischer Festphasen basiert, kann die Quantifizierung des Streptococcus-Polypeptids unter Verwendung eines isolierten Streptococcus-Polypeptids als Standard durchgeführt werden. Das Verfahren kann auch auf Körperflüssigkeiten angewendet werden.
Andere auf Antikörpern basierende Verfahren, die zum Nachweis der Genexpression des Streptococcus-Polypeptids nützlich sind, umfassen Immun-Testansätze wie z. B. den enzymverbundenen Immunadsorptionstestansatz (ELISA) und den Radioimmun-Testansatz (RIA). Zum Beispiel können für das Streptococcus-Polypeptid spezifische monoclonale Antikörper sowohl als Immunadsorptionsmittel als auch als Enzym-markierte Sonde verwendet werden, um das Streptococcus-Polypeptid nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Menge des Streptococcus-Polypeptids, die in der Probe vorliegt, kann durch Bezug auf die Menge, die in einem Standard-Präparat vorhanden ist, unter Verwendung eines linearen Regressions-Algorithmus im Computer berechnet werden. Ein solcher ELISA für den Nachweis eines Tumorantigens wird z. B. in Iacobelli et al., Breast Cancer Research and Treatment 11:19–30 (1988) beschrieben. Bei einem anderen ELISA-Testansatz können zwei unterschiedliche spezifische monoclonale Antikörper dazu verwendet werden, um die Streptococcus-Polypeptide in einer Körperflüssigkeit nachzuweisen. Bei diesem Testansatz wird einer der Antikörper als Immunadsorptionsmittel und der andere als Enzym-markierte Sonde verwendet.
Die vorstehenden Verfahren können im Wesentlichen als ein „Ein-Schritt-” oder als ein „Zwei-Schritte”-Verfahren durchgeführt werden. Der „Ein-Schritt”-Testansatz umfasst das Inkontaktbringen des Streptococcus-Polypeptids mit einem immobilisierten Antikörper und, ohne Waschung, das Inkontaktbringen des Gemisches mit dem markierten Antikörper. Der „Zwei-Schritte”-Testansatz umfasst eine Waschung, bevor das Gemisch mit dem markierten Antikörper in Kontakt gebracht wird. Es können auch andere übliche Verfahren je nach Eignung verwendet werden. In der Regel ist es wünschenswert, einen Bestandteil des Testansatzsystems auf einer Unterlage zu immobilisieren, was es ermöglicht, die anderen Bestandteile des Systems in Kontakt mit dem Bestandteil zu bringen und dann rasch aus der Probe zu entfernen.
Streptococcus-Polypeptid-spezifische Antikörper für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung können gegen ein intaktes S. pneumoniae-Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder gegen ein Fragment davon erzeugt werden. Diese Polypeptide und Fragmente können einem Tier (z. B. einem Kaninchen oder einer Maus) entweder mit einem Trägerprotein (z. B. Albumin) oder, wenn lang genug (z. B. mindestens etwa 25 Aminosäuren), ohne einen Träger verabreicht werden.
So wie sie hierin verwendet werden, bedeuten die Begriffe „Antikörper” (Ak) oder „monoclonaler Antikörper” (Mak), dass sie intakte Moleküle umfassen, sowie Antikörperfragmente (wie zum Beispiel Fab- und F(ab')₂-Fragmente), die in der Lage sind, an ein Streptococus-Polypeptid spezifisch zu binden. Fab- und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers, sie werden rascher aus dem Kreislauf ausgeschieden, und sie können eine geringe, unspezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316–325 (1983)). Daher werden diese Fragmente bevorzugt.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können durch ein beliebiges aus einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann das in Tabelle 1 identifizierte S. pneumoniae-Polypeptid oder Fragmente davon einem Tier verabreicht werden, um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyclonale Antikörper enthalten. Bei einem bevorzugten Verfahren wird ein Präparat des S. pneumoniae-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hergestellt und gereinigt, um es im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen zu machen. Ein solches Präparat wird dann in ein Tier eingebracht, um ein polyclonales Antiserum mit einer hohen spezifischen Aktivität herzustellen.
Bei dem am stärksten bevorzugten Verfahren sind die Antikörper der vorliegenden Erfindung monoclonale Antikörper. Solche monoclonalen Antikörper können unter Verwendung der Hybridom-Technologie hergestellt werden (Köhler et al., Nature 256:495 (1975); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier N.Y., (1981) S. 563–681). Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren die Immunisierung eines Tieres (bevorzugt einer Maus) mit dem S. pneumoniae-Polypeptid-Antigen der vorliegenden Erfindung. Geeignete Zellen können durch ihre Fähigkeit zur Bindung an den anti-Streptococcus-Polypeptid-Antikörper erkannt werden. Solche Zellen können in einem beliebigen geeigneten Gewebekulturmedium angezogen werden; es wird jedoch bevorzugt, die Zellen in Earle-modifiziertem Eagle-Medium zu kultivieren, das mit 10% fötalem Kälberserum (bei etwa 56°C inaktiviert), sowie mit etwa 10 g/l nicht essentiellen Aminosäuren, etwa 1.000 E/ml Penicillin und etwa 100 μg/ml Streptomycin ergänzt wurde. Die Milzzellen solcher Mäuse werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelom-Zelllinie fusioniert. Es kann jede beliebige geeignete Myelom-Zelllinie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden; es wird jedoch bevorzugt, die Eltern-Myelom-Zelllinie (SP₂O) zu verwenden, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich ist. Nach der Fusion werden die so erhaltenen Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium aufrecht erhalten und dann durch begrenzte Verdünnung cloniert, wie durch Wands et al., (Gastroenterology 80:225–232 (1981)) beschrieben wurde. Die Hybridomzellen, die durch eine solche Selektion erhalten werden, werden dann untersucht, um Clone zu identifizieren, die Antikörper sekretieren, welche in der Lage sind, das Streptococcus-Polypeptid-Antigen zu binden, das dem immunisierten Tier verabreicht worden war.
Alternativ können weitere Antikörper, die in der Lage sind, an Streptococcus-Polypeptid-Antigene zu binden, in einem zwei Schritte umfassenden Verfahren durch die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern hergestellt werden. Ein solches Verfahren nutzt die Tatsache aus, dass Antikörper selber Antigene darstellen und dass es daher möglich ist, einen Antikörper zu erhalten, der an einen zweiten Antikörper bindet. Gemäß diesem Verfahren werden spezifische Antikörper gegen ein Streptococcus-Polypeptid dazu verwendet, ein Tier zu immunisieren, vorzugsweise eine Maus. Die Milzzellen eines solchen Tieres werden dann verwendet, um Hybridomzellen herzustellen, und die Hybridomzellen werden durchmustert, um Clone zu identifizieren, die einen Antikörper herstellen, dessen Fähigkeit, an den spezifischen Antikörper gegen das Streptococcus-Polypeptid zu binden, durch das Streptococcus-Polypeptid-Antigen blockiert werden kann. Solche Antikörper umfassen anti-idiotypische Antikörper für gegen den Streptococcus-Polypeptid-spezifischen Antikörper, und sie können dazu verwendet werden, ein Tier zu immunisieren, um die Bildung weiterer spezifischer Antikörper gegen das Streptococcus-Polypeptid zu induzieren.
Es wird erkannt werden, dass Fab- und F(ab')₂- sowie andere Fragmente der Antikörper der vorliegenden Erfindung gemäß den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung unter Verwendung von Enzymen wie Papain (um Fab-Fragmente herzustellen) oder Pepsin (um F(ab')₂-Fragmente herzustellen) hergestellt. Alternativ können die an das Streptococcus-Polypeptid bindenden Fragmente durch die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie oder durch die synthetische Chemie hergestellt werden.
Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung sind Antiköper gegen Streptococcus-Polypeptid-Antigene, die in Menschen hergestellt werden oder die durch rekombinante oder andere Verfahren „humanisiert” werden (d. h. in einem Menschen nicht-immunogen wirken). Humanisierte Antikörper können zum Beispiel durch den Austausch des immunogenen Teils eines Antikörpers durch einen entsprechenden, aber nicht-immunogenen Teil hergestellt werden (d. h. chimäre Antikörper) (Robinson, R.R. et al., Internationale Patent-Veröffentlichung PCT/US86/02269 ); Akira, K. et al., Europäische Patentanmeldung 184,187 ; Taniguchi, M., Europäische Patentanmeldung 171,496 ; Morrison, S.L. et al., Europäische Patentanmeldung 173,494 ; Neuberger, M.S. et al., PCT-Anmeldung WO 86/01533 ; Cabilly, S. et al., Europäische Patentanmeldung 125,023 ; Better M. et al., Science 240:1041–1043 (1988); Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439–3443 (1987); Liu, A.Y. et al., J. Immunol. 139:3521–3526 (1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218 (1987); Nishimura, Y. et al., Canc. Res. 47:999–1005 (1987); Wood, C.R. et al., Nature 314:446–449 (1985); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553–1559 (1988). Allgemeine Übersichtsartikel über „humanisierte” chimäre Antikörper werden durch Morrison, S.L. (Science 229:1202–1207 (1985)) und Oji, V.T. et al., BioTechniques 4:214 (1986)) bereitgestellt. Geeignete „humanisierte” Antikörper können alternativ durch CDR- oder CEA-Austausch hergestellt werden (Jones, P.T. et al., Nature 321:552–525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239:1534 (1988); Beidler, C.B. et al., J. Immunol. 141:4053–4060 (1988)).
Geeignete Enzymmarkierungen umfassen zum Beispiel diejenigen der Oxidase-Gruppe, die die Produktion von Wasserstoffperoxid durch Reaktion mit einem Substrat katalysieren. Die Glucose-Oxidase wird besonders bevorzugt, da sie eine gute Stabilität aufweist und ihr Substrat (Glucose) leicht verfügbar ist. Die Aktivität einer Oxidase-Markierung kann durch die Messung der Konzentration an Wasserstoffperoxid untersucht werden, das durch die Reaktion des Enzymmarkierten Antikörpers mit dem Substrat gebildet wird. Neben Enzymen umfassen andere geeignete Markierungen Radioisotope wie z. B. Iod (¹²⁵I, ¹³¹I), Kohlenstoff (¹⁴C), Schwefel (³⁵S), Tritium (³H), Indium (¹¹²I) und Technetium (^99mTc) sowie Fluoreszenz-Markierungen wie z. B. Fluorescein und Rhodamin sowie Biotin.
Weitere geeignete Markierungen für die spezifischen Antikörper gegen das Streptococcus-Polypeptid der vorliegenden Erfindung werden nachstehend bereitgestellt. Beispiele für geeignete Enzymmarkierungen umfassen Malat-Dehydrogenase, Staphylococcus-Nuclease, Delta-5-steroid-Isomerase, Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe, Alpha-Glycerinphosphat-Dehydrogenase, Triosephosphat-Isomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucose-Oxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholin-Esterase.
Beispiele für geeignete Radioisotop-Markierungen umfassen ³H, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷To, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd usw. ¹¹¹In ist ein bevorzugtes Isotop, wenn die in vivo-Bildgebung verwendet wird, da es das Problem der Dehalogenierung eines mit ¹²⁵I oder ¹³¹I markierten monoclonalen Antiköpers durch die Leber vermeidet. Darüber hinaus besitzt dieses Radionucleotid eine günstigere Gamma-Emissionsenergie zur Bildgebung (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 10:296–301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 28:281–287 (1987). Zum Beispiel zeigte ¹¹¹In, das mit 1-(P-Isothiocyanatbenzyl)-DPTA an monoclonale Antikörper gekoppelt wurde, eine geringe Aufnahme in nicht tumorösen Geweben, insbesondere der Leber, und daher steigert es die Spezifität bei der Lokalisierung des Tumors (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861–870 (1987)).
Beispiele für geeignete nicht-radioaktive Isotop-Markierungen umfassen ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Tr und ⁵⁶Fe.
Beispiele für geeignete Fluoreszenz-Markierungen umfassen die ¹⁵²Eu-Markierung, die Fluorescein-Markierung, die Isothiocyanat-Markierung, die Rhodamin-Markierung, die Phycoerythrin-Markierung, die Phycocyanin-Markierung, die Allophycocyanin-Markierung, die o-Phthaldehyd-Markierung und die Fluorescamin-Markierung.
Beispiele für geeignete Toxin-Markierungen umfassen Diphtherie-Toxin, Ricin und Cholera-Toxin.
Beispiele für chemilumineszente Markierungen umfassen die Luminal-Markierung, die Isoluminal-Markierung, die Markierung mit einem aromatischen Acridiniumester, die Imidazol-Markierung, die Markierung mit einem Acridiniumsalz, die Oxalatester-Markierung, die Luciferin-Markierung, die Luciferase-Markierung und die Aequorin-Markierung.
Beispiele für kernmagnetische Resonanz-Kontrastmittel umfassen Schwermetallkerne wie z. B. die von Gd, Mn und Eisen.
Typische Verfahren für die Bindung der vorstehend beschriebenen Markierungen an Antikörper werden in Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1–31 (1976) und in Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1–40 (1977) bereitgestellt. Die Kopplungsverfahren, die in der letzten Veröffentlichung erwähnt werden, sind das Glutaraldehyd-Verfahren, das Periodat-Verfahren, das Dimaleimid-Verfahren und das m-Maleimidbenzyl-N-hydroxy-succinimidester-Verfahren; diese Verfahren sind alle durch Bezugnahme hierin mit eingeschlossen.
In einem verwandten Aspekt umfasst die Erfindung einen diagnostischen Kit für die Verwendung zur Durchmusterung von Serum, das spezifische Antikörper gegen eine S. pneumoniae-Infektion enthält. Ein solcher Kit kann ein isoliertes S. pneumoniae-Antigen umfassen, das ein Epitop enthält, welches mit mindestens einem anti-S. pneumoniae-Antikörper spezifisch immunreaktiv ist. Ein solcher Kit umfasst auch Mittel für den Nachweis der Bindung dieses Antikörpers an das Antigen. In spezifischen Ausführungsformen kann der Kit ein durch rekombinante Verfahren hergestelltes oder chemisch synthetisiertes Peptid- oder Polypeptid-Antigen umfassen. Das Peptid- oder das Polypeptid-Antigen kann an eine feste Unterlage gebunden sein.
In einer spezifischeren Ausführungsform umfasst das Mittel zum Nachweis in dem vorstehend beschriebenen Kit eine feste Unterlage, an die das Peptid- oder das Polypeptid-Antigen angeheftet ist. Ein solcher Kit kann auch einen nicht angehefteten, mit einem Reporter markierten anti-Mensch-Antikörper umfassen. Bei dieser Ausführungsform kann die Bindung des Antikörpers an das S. pneumoniae-Antigen durch die Bindung des mit einem Reporter markierten Antikörpers an den anti-S. pneumoniae-Antikörper nachgewiesen werden.
In einem verwandten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren für den Nachweis einer S. pneumoniae-Infektion in einem Individuum. Dieses Nachweisverfahren umfasst die Reaktion einer Körperflüssigkeit, vorzugsweise Serum, aus dem Individuum mit einem isolierten S. pneumoniae-Antigen und die Untersuchung des Antigens auf die Anwesenheit des gebundenen Antikörpers. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren ein Polypeptid-Antigen, das an eine feste Unterlage angeheftet ist, wobei das Serum mit der Unterlage zur Reaktion gebracht wird. Anschließend wird die Unterlage mit einem markierten anti-Mensch-Reporter-Antikörper zur Reaktion gebracht. Dann wird die Unterlage auf die Anwesenheit des mit einem Reporter markierten Antikörpers hin untersucht.
Das Reagenz mit der festen Oberfläche, das bei den vorstehenden Testansätzen und in den Kits verwendet wird, wird durch bekannte Verfahren für die Anheftung von Proteinmaterial an festes Unterlagenmaterial hergestellt, wie z. B. an polymere Kügelchen, Eintauch-Stäbchen, Platten mit 96 Vertiefungen oder Filtermaterial. Diese Anheftungsverfahren umfassen im Allgemeinen die unspezifische Adsorption des Proteins an die Unterlage oder die kovalente Anheftung des Proteins, dies erfolgt typischerweise über eine freie Amin-Gruppe an eine chemisch reaktionsfähige Gruppe auf der festen Unterlage wie z. B. eine aktivierte Carboxyl- Hydroxyl- oder Aldehyd-Gruppe. Alternativ können mit Streptavidin beschichtete Platten in Verbindung mit (einem) biotinylierten Antigen(en) verwendet werden.
Therapeutika und Arten der Verabreichung
Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls Impfstoffe, die eines oder mehrere Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen. Heterogenität der Zusammensetzung eines Impfstoffs kann durch eine Kombination der S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Multi-Komponenten-Impfstoffe dieses Typs sind wünschenswert, da sie wahrscheinlich bei der Erzeugung einer schützenden Immunantwort gegen die vielen Arten und Stämme der Gattung Streptococcus wirksamer sind als Impfstoffe, die ein einzelnes Polypeptid enthalten. Daher kann, wie nachstehend in Einzelheiten diskutiert wird, ein Multi-Komponenten-Impfstoff der vorliegenden Offenbarung eines oder mehrere, bevorzugt 2 bis etwa 20, noch bevorzugter 2 bis etwa 15 und am stärksten bevorzugt 3 bis etwa 8 der in Tabelle 1 identifizierten S. pneumoniae-Polypeptide oder Fragmente davon enthalten.
Von Multi-Komponenten-Impfstoffen ist im Fachgebiet bekannt, dass sie die Produktion von Antikörpern gegen zahlreiche immunogene Bestandteile hervorrufen. Decker, M. und Edwards, K., J. Infect. Dis. 174:S270–275 (1996). Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass ein tetravalenter Hepatitis B-, Diphtherie-, Tetanus- und Keuchhusten-Impfstoff schützende Spiegel an Antikörpern in menschlichen Kleinkindern gegen alle vier pathogenen Agenzien hervorrufen kann. Aristegui, J. et al., Vaccine 15:7–9 (1997).
Somit umfasst die vorliegende Offenbarung auch Multi-Komponenten-Impfstoffe. Diese Impfstoffe umfassen mehr als ein Polypeptid, Immunogen oder Antigen. Ein Beispiel für einen Multi-Komponenten-Impfstoff ist ein Impfstoff, der mehr als eines der S. pneumoniae-Polypeptide umfasst, die in Tabelle 1 beschrieben werden.
Wie vorstehend angemerkt, erwartet man von den Impfstoffen der vorliegenden Offenbarung, dass sie eine schützende Immunantwort gegen Infektionen hervorrufen, die durch andere Arten und Stämme von Streptococcus als denjenigen S. pneumoniae-Stamm verursacht wurden, der bei der ATCC hinterlegt wurde.
Im Rahmen der vorliegenden Offenbarung befinden sich auch Impfstoffe aus ganzen Zellen und ganzen Viren. Solche Impfstoffe können über rekombinante Verfahren hergestellt werden und umfassen die Expression eines oder mehrerer der S. pneumoniae-Polypeptide, die in Tabelle 1 beschrieben wurden. So können zum Beispiel die S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung entweder sekretiert werden oder intrazellulär sowie auf der Zelloberfläche oder im periplasmatischen Raum lokalisiert sein. Weiterhin können, wenn ein rekombinantes Virus verwendet wird, die S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zum Beispiel in der viralen Hülle, sowie auf der Oberfläche des Capsids oder intern innerhalb des Capsids lokalisiert sein. Impfstoffe aus ganzen Zellen, die Zellen verwenden, welche heterologe Proteine exprimieren, sind im Fachgebiet bekannt. Vergleiche z. B. mit Robinson K. et al., Nature Biotech. 15:653–657 (1997); Sirard, J. et al., Infect. Immun. 65:2029–2033 (1997); Chabalgoity, J. et al., Infect. Immun. 65:2402–2412 (1997). Diese Zellen können lebend verabreicht werden oder sie können vor der Verabreichung abgetötet werden. Zum Beispiel berichten Chabalgoity, J. et al., vorstehend, über die erfolgreiche Verwendung eines lebenden, attenuierten Salmonella-Impfstoff-Stammes in Mäusen, der einen Teil eines Fettsäure-bindenden Proteins aus Platyhelminthes (Plattwürmer) als Fusionprotein auf seiner Zelloberfläche exprimiert.
Ein Multi-Komponenten-Impfstoff kann auch unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, dies erfolgt durch die Kombination der S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder von Fragmenten davon mit weiteren, nicht aus Streptokokken stammenden Bestandteilen (z. B. Diphtherie-Toxin oder Tetanus-Toxin und/oder anderen Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie eine Immunantwort hervorrufen). Solche Impfstoffe sind nützlich, um schützende Immunantworten sowohl gegen Mitglieder der Gattung Streptococcus als auch gegen nicht-streptokokkale pathogene Agenzien hervorzurufen.
Die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung umfassen auch DNA-Impfstoffe. DNA-Impfstoffe werden derzeit gegen eine Reihe an infektiösen Erkrankungen entwickelt. Boyer, J. et al., Nat. Med. 3:526–532 (1997); Übersichtsartikel in Spier, R., Vaccine 14:1285–1288 (1996). Solche DNA-Impfstoffe enthalten Nucleotidsequenzen, die ein oder mehrere S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, wobei die Nucleotidsequenzen in einer Weise orientiert sind, welche die Expression des/der gegenständlichen Polypeptides/Polypeptide erlaubt. So wurde z. B. gezeigt, dass die direkte Verabreichung von Plasmid-DNA, die OspA aus B. burgdorferi codiert, eine schützende Immunität in Mäusen gegen einen Angriff von Borrelien-Bakterien hervorruft. Luke, C. et al., J. Infect. Dis. 175:91–97 (1997).
Die vorliegende Offenbarung betrifft auch die Verabreichung eines Impfstoffs, der gleichzeitig mit einem Molekül verabreicht wird, das in der Lage ist, Immunantworten zu modulieren. Zum Beispiel berichten Kim, J. et al., Nature Biotech. 15:641–646 (1997) über die Steigerung von Immunantworten, die durch Immunisierungen mit DNA erzeugt wurden, wenn DNA-Sequenzen, die Moleküle codieren, welche die Immunantwort stimulieren, gleichzeitig verabreicht werden. Auf ähnliche Weise können die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung entweder mit Nucleinsäuren, die Immun-Modulatoren codieren, oder mit den Immun-Modulatoren selbst verabreicht werden. Diese Immun-Modulatoren umfassen den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und CD86.
Die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung können auch verwendet werden, um Resistenz gegen eine Streptokokken-Infektion zu verleihen; dies erfolgt entweder durch eine passive oder durch eine aktive Immunisierung. Wenn die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, um eine Resistenz gegenüber einer Streptokokken-Infektion durch eine aktive Immunisierung zu verleihen, wird ein Impfstoff der vorliegenden Offenbarung einem Tier verabreicht, um eine schützende Immunantwort hervorzurufen, die eine Infektion mit Streptokokken entweder verhindert oder abmildert. Wenn die Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, um eine Resistenz gegenüber einer Streptokokken-Infektion durch eine passive Immunisierung zu verleihen, wird der Impfstoff einem Wirtstier (z. B. einem Menschen, einem Hund oder einer Maus) verabreicht, und das Antiserum, das durch dieses Antiserum hervorgerufen wird, wird gewonnen und dann einem Empfänger direkt bereitgestellt, der im Verdacht steht, eine Infektion aufzuweisen, die durch ein Mitglied der Gattung Streptococcus verursacht wurde.
Die Möglichkeit, Antikörper oder Fragmente von Antikörpern mit Toxin-Molekülen zu markieren, stellt ein weiteres Verfahren für die Behandlung von Streptokokken-Infektionen bereit, wenn eine passive Immunisierung durchgeführt wird. Bei dieser Ausführungsform werden Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die in der Lage sind, die hierin offenbarten S. pneumoniae-Polypeptide oder Fragmente davon sowie andere Streptococcus-Proteine zu erkennen, mit Toxin-Molekülen markiert, bevor sie einem Patienten verabreicht werden. Wenn solche mit Toxinen derivatisierten Antikörper an Streptococcus-Zellen binden, werden die Toxin-Einheiten an diesen Zellen lokalisiert und ihren Tod verursachen.
Die vorliegende Offenbarung betrifft daher und stellt Mittel bereit für die Verhinderung oder die Abmilderung einer Streptokokken-Infektion, die von Organismen herrührt, welche Antigene besitzen, die durch die Antiseren erkannt und gebunden werden, welche als Antwortreaktion auf die Polypeptide der vorliegenden Erfindung produziert wurden. Wie hierin verwendet, wird von einem Impfstoff gesagt, dass er eine Krankheit verhindern oder abmildern kann, wenn seine Verabreichung an ein Tier entweder zu einer vollständigen oder zu einer teilweisen Abschwächung (d. h. Unterdrückung) eines Symptoms oder eines Zustands der Erkrankung oder zu einer vollständigen oder einer teilweisen Immunität des Tieres gegenüber der Krankheit, führt.
Die Verabreichung des Impfstoffs (oder des Antiserums, das durch ihn hervorgerufen wird) kann entweder für einen „vorbeugenden” oder für einen „therapeutischen” Zweck erfolgen. Wenn die Verbindung(en) vorbeugend verabreicht wird/werden, wird/werden die Verbindung(en) vor irgendwelchen Symptomen für eine Streptokokken-Infektion bereitgestellt. Die vorbeugende Verabreichung der Verbindung(en) dient dazu, eine anschließende Infektion zu verhindern oder abzuschwächen. Wenn sie therapeutisch verabreicht werden, wird/werden die Verbindung(en) bei oder nach der Entdeckung von Symptomen verabreicht, die anzeigen, dass ein Tier mit einem Mitglied der Gattung Streptococcus infiziert sein könnte. Die therapeutische Verabreichung der Verbindung(en) dient dazu, eine vorhandene Infektion abzumildern. Daher können die S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung und Fragmente davon entweder vor dem Beginn der Infektion bereitgestellt werden (um eine erwartete Infektion zu verhindern oder abzumildern) oder auch erst nach dem Beginn der eigentlichen Infektion.
Die Polypeptide der Erfindung können unabhängig davon, ob sie einen Teil eines nativen Proteins oder ein funktionelles Derivat davon codieren, in reiner Form verabreicht werden oder an einen makromolekularen Träger gebunden werden. Beispiele für solche Träger sind Proteine und Kohlenhydrate. Geeignete Proteine, die als makromolekulare Träger zur Steigerung der Immunogenität der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen KLH („Keyhole Limpet Hemocyanin”), Tetanus-Toxoid, Pertussis-Toxin, Rinderserumalbumin und Ovalbumin. Verfahren für die Kopplung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung an solche makromolekularen Träger werden in Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988) offenbart, dessen vollständige Offenbarung hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Eine Zusammensetzung bezeichnet man als „pharmazeutisch verträglich,” wenn ihre Verabreichung von einem Empfänger-Tier toleriert wird und auch ansonsten für eine Verabreichung an das Tier geeignet ist. Von einem solchen Agens sagt man, dass es in einer „therapeutisch wirksamen Menge” verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Agens ist dann physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit zur einer nachweisbaren Veränderung in der Physiologie des es empfangenden Patienten führt.
Obwohl in allen Fällen der Impfstoff der vorliegenden Offenbarung als eine pharmakologisch verträgliche Verbindung verabreicht wird, werden Fachleute erkennen, dass die Zusammensetzung einer pharmakologisch verträglichen Verbindung je nach dem Tier, an das sie verabreicht wird, variieren kann. So wird zum Beispiel ein Impfstoff, der für eine Anwendung am Menschen gedacht ist, im Allgemeinen nicht zusammen mit Freundschem Adjuvanz verabreicht. Des Weiteren wird der Reinheitsgrad der S. pneumoniae-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in der Regel höher sein, wenn sie einem Menschen verabreicht werden als wenn sie einem nicht-menschlichen Tier verabreicht werden.
Wenn der Impfstoff der vorliegenden Offenbarung einem Tier verabreicht wird, werden Fachleute wissen, dass er in einer Zusammensetzung vorliegen kann, die Salze, Puffer, Adjuvanzien oder andere Stoffe enthalten kann, mit denen man wünscht, die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu verbessern. Adjuvanzien sind Stoffe, die verwendet werden können, um eine spezifische Immunantwort spezifisch zu verbessern. Diese Stoffe erfüllen im Allgemeinen zwei Funktionen: (1) sie schützen das/die Antigen(e) vor einem raschen metabolischen Abbau nach der Verabreichung und (2) sie stimulieren die Immunantwort unspezifisch.
Normalerweise werden das Adjuvanz und die Zusammensetzung vor der Präsentation gegenüber dem Immunsystem gemischt, oder sie werden getrennt, aber an der gleichen Stelle des Tiers präsentiert, das immunisiert wird. Adjuvanzien können aufgrund ihrer Zusammensetzung grob in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Diese Gruppen umfassen Öl-Adjuvanzien (zum Beispiel komplettes und inkomplettes Freundsches Adjuvanz), Mineralsalze (zum Beispiel AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄), Silika (Kieselgel), Kaolin und Kohle), Polynucleotide (zum Beispiel polyIC- und polyAU-Säuren) und bestimmte natürliche Stoffe (zum Beispiel das Wachs D aus Mycobacterium tuberculosis) sowie Stoffe, die sich in Corynebacterium parvum oder Bordetella pertussis und in Mitgliedern der Gattung Brucella finden. Andere Stoffe, die als Adjuvanzien nützlich sind, sind Saponine wie zum Beispiel Quil A (Superfos A/S, Dänemark). Bevorzugte Adjuvanzien für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Aluminiumsalze wie AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄). Beispiele für Materialien, die für eine Verwendung in Impfstoff-Zusammensetzungen geeignet sind, werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A., Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA, S. 1324–1341 (1980) bereitgestellt, dessen Referenz hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung können parenteral durch Injektion, rasche Infusion, Absorption im Nasen-Rachen-Raum (intranasopharangeal), Absorption über die Haut oder oral verabreicht werden. Alternativ können die Zusammensetzungen intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Die Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösemittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle wie z. B. Olivenöl und injizierbare organische Ester wie z. B. Ethyloleat. Es können Träger oder Okklusivverbände verwendet werden, um die Durchlässigkeit der Haut zu erhöhen und die Absorption des Antigens zu steigern. Flüssige Dosierungsformen für eine orale Verabreichung können im Allgemeinen eine Liposomen-Lösung umfassen, welche die flüssige Dosierungsform enthält. Geeignete Formen für die Suspendierung von Liposomen umfassen Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Sirupe und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die im Fachgebiet üblicherweise verwendet werden, wie z. B. gereinigtes Wasser. Neben inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Adjuvanzien, Befeuchtungsmittel, Emulsionen-bildende Mittel und Suspensionsmittel oder Süßstoffe, Geschmacksstoffe oder Parfüme umfassen.
Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung können auch in verkapselter Form verabreicht werden. So wurde zum Beispiel gezeigt, dass die intranasale Immunisierung von Mäusen gegen eine Bordetella pertussis-Infektion unter Verwendung von Impfstoffen, die in biologisch abbaubaren Mikrosphären aus Poly-(DL-lactid-co-glycolid) verkapselt sind, eine schützende Immunantwort stimuliert. Shahin, R. et al., Infect. Immun. 63:1195–1200 (1995). Ebenso wurde von oral verabreichten und verkapselten Salmonella typhimurium-Antigenen gezeigt, dass sie eine schützende Immunität in Mäusen hervorrufen. Allaoui-Attarki, K. et al., Infect. Immun. 65:853–857 (1997). Verkapselte Impfstoffe der vorliegenden Offenbarung können über eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich denjenigen, die das Inkontaktbringen des Impfstoffs mit Schleimhautmembranen umfassen (z. B. intranasal, intracolisch, intraduodenal).
Es gibt viele unterschiedliche Verfahren für die Wahl der richtigen Zeitpunkte der Immunisierungen, wenn ein Verabreichungsprotokoll mit mehreren Verabreichungen verwendet wird. Es ist möglich, die Zusammensetzungen der Erfindung mehr als einmal zu verwenden, um die Spiegel und die Unterschiede in der Expression des Immunglobulin-Repertoires, das durch das immunisierte Tier exprimiert wird, zu steigern. Wenn mehrere Immunisierungen verabreicht werden, werden sie typischerweise in Abständen von ein bis zwei Monaten vorgenommen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine „wirksame Menge” einer therapeutischen Zusammensetzung diejenige, die ausreicht, eine gewünschte biologische Wirkung zu erreichen. Im Allgemeinen wird die Dosis, die nötig ist, um eine wirksame Menge der Zusammensetzung bereitzustellen, von solchen Faktoren wie z. B. dem Alter des Tieres oder des Menschen, dem Zustand, dem Geschlecht und dem Ausmaß der Erkrankung, sofern vorhanden, und anderen Variablen abhängen, und sie kann durch Fachleute eingestellt werden.
Die antigenen Präparate der Erfindung können entweder durch eine einzelne oder durch mehrere Dosen mit einer wirksamen Menge verabreicht werden.
Wirksame Mengen der Zusammensetzungen der Erfindung können von 0,01–1.000 μg/ml pro Dosis, bevorzugter von 0,1–500 μg/ml pro Dosis und am stärksten bevorzugt von 10–300 μg/ml pro Dosis variieren.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden, die nur der Erläuterung dienen und von denen nicht beabsichtigt wird, dass sie den Rahmen der Erfindung einschränken, sofern dies nicht spezifiziert wird.
Beispiele
Beispiel 1: Expression und Reinigung der S. pneumoniae-Polypeptide in E. coli
In diesem Beispiel wird der bakterielle Expressionsvektor pQE10 (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, KA 91311) verwendet, um die in Tabelle 1 gezeigte Nucleotidsequenz zu clonieren und um das in Tabelle 1 gezeigte Polypeptid zu exprimieren. Die Komponenten des pQE10-Plasmids sind so angeordnet, dass eine inserierte DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, das Polypeptid mit sechs His-Resten (d. h. der „6 × His-Markierungssequenz”) exprimiert, die mit dem Aminoterminus kovalent verknüpft sind.
Die DNA-Sequenzen, die die gewünschten Teile des Polypeptids aus Tabelle 1 codieren, werden unter Verwendung von PCR-Oligonucleotid-Primern entweder aus einer DNA-Genbank die von S. pneumoniae konstruiert wurde, wie z. B. derjenigen, die durch die Erfinder aus praktischen Gründen als ATCC-Hinterlegung Nr. 97755 hinterlegt wurde, oder aus der DNA (stammen), die aus dem gleichen Organismus isoliert wurde, demjenigen S. pneumoniae-Stamm, der bei der ATCC als Hinterlegung Nr. 55840 hinterlegt wurde, amplifiziert. Eine Liste der PCR-Primer, die für diesen Zweck verwendet werden können, wird nachstehend in Tabelle 3 bereitgestellt. Die PCR-Primer anelieren an die Nucleotidsequenzen, die sowohl die aminoterminalen als auch die carboxyterminalen Aminosäuresequenzen des gewünschten Teils des Polypeptids aus Tabelle 1 codieren. Um die Clonierung in dem pQE10-Vektor zu erleichtern, wurden zusätzliche Nucleotide, die Restriktions-Schnittstellen enthalten, an die 5' beziehungsweise an die 3'-Primersequenz angefügt. Solche Restriktions-Schnittstellen sind in der Tabelle 3 für jeden Primer angegeben. In jedem Fall enthält ein Primer vom 5'-Ende ausgehend 4 zufällige Nucleotide, um ein „Atmen” während des Anelierungsprozesses zu verhindern, eine Restriktions-Schnittstelle (gezeigt in Tabelle 3) und etwa 15 Nucleotide der S. pneumoniae-ORF-Sequenz (die vollständige Sequenz jedes Primers für die Clonierung wird als SEQ ID NO:291 und als SEQ ID NO:292 gezeigt).
Für die Clonierung des Polypeptids in Tabelle 1 wurden der 5'- und der 3'-Primer ausgewählt, um die entsprechende codierende Nucleotidsequenz zu amplifizieren. Fachleute werden wissen, dass der Punkt in der das Protein codierenden Sequenz, an dem der 5'-Primer beginnt, variiert werden kann, um ein DNA-Segment zu amplifizieren, das jeden beliebigen gewünschten Teil der in Tabelle 1 beschriebenen vollständigen Aminosäuresequenz codiert. Fachleute werden ebenso wissen, dass der Punkt in der das Protein codierenden Sequenz, an dem der 3'-Primer beginnt, ebenfalls variiert werden kann, um ein DNA-Segment zu amplifizieren, das jeden beliebigen gewünschten Teil der in Tabelle 1 beschriebenen vollständigen Aminosäuresequenz codiert.
Das amplifizierte DNA-Fragment und der pQE10-Vektor werden mit dem/den geeigneten Restriktionsenzym(en) verdaut und die verdauten DNAs werden dann zusammen ligiert. Das Ligierungsgemisch wird in kompetente E. coli-Zellen unter Verwendung von Standardverfahren transformiert, wie z. B. denjenigen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschrieben werden. Die Transformanten werden auf ihre Fähigkeit, unter Selektionsdruck auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert. Aus resistenten Kolonien wird die Plasmid-DNA isoliert und die Identität der clonierten DNA wird durch Restriktionsanalyse, PCR und DNA-Sequenzierung bestätigt.
Clone, die die gewünschten Konstrukte enthalten, werden über Nacht („O/N”) in Flüssigkultur unter Selektions(druck) angezogen. Die O/N-Kultur wird verwendet, um eine Großkultur in einer Verdünnung von etwa 1:25 bis 1:250 anzuimpfen. Die Zellen werden bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm („OD600”) zwischen 0,4 und 0,6 angezogen. Dann wird Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) („IPTG”) zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, um die Transkription von dem lac-Repressor-sensitiven Promotor durch Inaktivierung des lacI-Repressors zu induzieren. Anschließend werden die Zellen weitere 3 bis 4 Stunden inkubiert. Dann werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Die Zellen werden 3–4 Stunden bei 4°C in 6 M Guanidin-HCl, pH 8, gerührt. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand, der das Protein von Interesse enthält, wird auf eine Nickel-nitrilo-tri-essigsäure-(„NiNTA”)Affinitätsharzsäule (erhältlich von QIAGEN, Inc., vorstehend) aufgetragen. Proteine mit einer 6 × His-Markierungssequenz binden an das Ni-NTA-Harz mit hoher Affinität und können durch ein einfaches Ein-Schritt-Verfahren gereinigt werden (für Einzelheiten vergleiche mit: The QIAexpressionist, 1995, QIAGEN Inc., vorstehend).
Kurzgefaßt wird der Überstand auf die Säule in 6 M Guanidin-HCl, pH 8, aufgetragen, und die Säule wird zuerst mit 10 Volumina 6 M Guanidin-HCl, pH 8, und dann mit 10 Volumina 6 M Guanidin-HCl, pH 6, gewaschen, und schließlich wird das Polypeptid mit 6 M Guanidin-HCl, pH 5,0 eluiert.
Dann wird das gereinigte Protein durch Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder gegen 50 mM Na-acetat-Puffer, pH 6, plus 200 mM NaCl renaturiert. Alternativ kann das Protein auch erfolgreich gefaltet werden, während es noch an die Ni-NTA-Säule gebunden ist. Die empfohlenen Bedingungen sind wie folgt: Renaturierung unter Verwendung eines linearen 6 M-1 M Harnstoff-Gradienten in 500 mM NaCl, 20% Glycerin, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4, der Protease-Inhibitoren enthält. Die Renaturierung sollte über einen Zeitraum von 1,5 Stunden oder länger durchgeführt werden. Nach der Renaturierung können die Proteine durch Zugabe von 250 mM Imidazol eluiert werden. Imidazol wird durch einen abschließenden Dialyseschritt gegen PBS oder gegen 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 6, plus 200 mM NaCl entfernt, Das gereinigte Protein wird bei 4°C gelagert oder bei –80°C eingefroren.
Die DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz in Tabelle 1 codiert, kann auch als Fusionsprotein cloniert und exprimiert werden; dies erfolgt nach einer Vorschrift ähnlich derjenigen, die gerade vorstehend beschrieben wurde, in der aber der Vektor pET-32b(+) (Novagen, 601 Science Drive, Madison, WI 53711) anstelle von pQE10 bevorzugt verwendet wird.
Das in Tabelle 1 gezeigte Polynucleotid wurde unter Verwendung der in Tabelle 3 gezeigten PCR-Primer erfolgreich amplifiziert und in pQE10 subcloniert, wie vorstehend beschrieben wurde. Fachleute werden wissen, dass die Isolierung eines individuellen Plasmids aus der zu einem Pool vereinigten Hinterlegung trivial ist, vorausgesetzt, dass die hierin beschriebenen Informationen und Reagenzien verwendet werden. Jeder der hinterlegten Clone ist in der Lage, das durch ihn codierte S. pneumoniae-Polypeptid zu exprimieren.
Beispiel 2: Immunisierung und Nachweis von Immunantwortreaktionen
Verfahren
Anzucht eines bakteriellen Inokulums, Immunisierung von Mäusen und Challenge mit S. pneumoniae
Die Vermehrung und Aufbewahrung von sowie die Aussetzung gegenüber S. pneumoniae werden, im Wesentlichen wie in der folgenden Referenz beschrieben, durchgeführt: Aaberge, I.S. et al., Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: a standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum, Microbial Pathogenesis 18:141 (1995), das hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Kurzgefaßt werden Todd Hewitt-(TH)Nährmedium (Difco Laboratories, Detroit, MI) mit 17% FKS und Pferdeblut-Agarplatten für die Kultur der Bakterien verwendet. Sowohl das Nährmedium als auch die Blut-Platten werden bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Die Blut-Platten werden 18 Stunden inkubiert. Das Nährmedium für die Kultur wird regelmäßig 10-fach mit TH-Nährmedium seriell verdünnt, das bei Zimmertemperatur aufbewahrt wird, und die Bakteriensuspensionen werden bei Zimmertemperatur aufbewahrt, bis die Mäuse ihnen ausgesetzt werden.
Für die aktive Immunisierung werden in C3H/HeJ-Mäuse (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) intraperitoneal (i. p.) in Woche 0 20 g des rekombinanten Streptokokken-Proteins oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung injiziert, die mit komplettem Freundschen Adjuvanz (CFA) emulgiert worden waren, dann wurde eine ähnliche Booster-Injektion mit inkomplettem Freundschen Adjuvanz (IFA) in Woche 4 verabreicht, und die Challenge erfolgte in Woche 6. Für die Challenge wird S. pneumoniae aus exponentiell wachsenden Kulturen mit TH-Nährmedium verdünnt, und den Mäusen werden subcutan (s. c.) an der Schwanzbasis 0,1 ml dieser Verdünnungen injiziert (es werden serielle Verdünnungen verwendet, um eine mittlere Infektionsdosis herauszufinden). Die für die Challenge verwendeten Streptokokken hatten weniger als sechs in vitro-Passagen durchlaufen. Um die Infektion zu bewerten, werden Blutproben aus dem distalen Teil der seitlichen Oberschenkelvene in Kapillarröhrchen mit Heparin entnommen. Eine 25 μl-Blutprobe wird 10-fach mit TH-Nährmedium seriell verdünnt, und 25 μl des verdünnten und des unverdünnten Blutes werden auf Blutagar-Platten ausplattiert. Die Platten werden 18 Stunden inkubiert und die Kolonien werden gezählt.
Im Fachgebiet sind auch andere Verfahren bekannt, vergleiche zum Beispiel mit Langermann, S. et al., J. Exp. Med. 180:2277 (1994), das hierin durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Immun-Testansätze
Es werden verschiedene Immun-Testansatz-Formate verwendet, um die Spiegel an Streptokokken-spezifischen Antikörpern zu quantifizieren (ELISA und Immun-Blot) sowie um die funktionellen Eigenschaften dieser Antikörper zu bewerten (Wachstumshemmung-Testansatz). Der ELISA und die Immun-Blot-Testansätze werden auch verwendet, um Antikörper nachzuweisen und zu quantifizieren, die als Antwortreaktion auf eine Streptokokken-Infektion hervorgerufen wurden und die mit spezifischen Streptokokken-Antigenen reagieren. Wenn durch die Infektion Antikörper gegen bestimmte Streptokokken-Antigene hervorgerufen werden, wird dies als Beweis dafür angesehen, dass die in Frage stehenden Streptokokken-Proteine in vivo exprimiert werden. Eine Abwesenheit von aus der Infektion stammenden Antikörpern (Serokonversion) nach der Challenge mit Streptokokken ist ein Beweis dafür, dass die Infektion verhindert oder unterdrückt wurde. Der Immun-Blot-Testansatz wird auch verwendet, um festzustellen, ob die gegen die rekombinanten Streptokokken-Antigene erzeugten Antikörper ein Protein mit ähnlicher Größe in Extrakten aus ganzen Streptokokken erkennen. Wenn das natürliche Protein bei dem Immun-Blot-Testansatz eine ähnliche oder eine identische Größe wie die rekombinante Version des gleichen Proteins aufweist, wird dies als Beweis dafür angesehen, dass das rekombinante Protein das Produkt eines Volllängen-Clons des entsprechenden Gens ist.
Enzymverbundener Immunadsorptions-Testansatz (ELISA)
Der ELISA wird verwendet, um die Spiegel der Antikörper zu quantifizieren, die mit Streptococcus-Antigenen reagieren, welche als Antwortreaktion auf eine Immunisierung mit diesen Streptokokken-Antigenen hervorgerufen wurden. Die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Immunlon 4, Dynatech, Chantilly, Virginia, oder äquivalente Mikrotiterplatten) werden mit dem Antigen durch Inkubation mit 50 l einer 1 g/ml Protein-Antigen-Lösung in einem geeigneten Puffer, typischerweise 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,6, beschichtet. Nachdem das ungebundene Antigen abgegossen worden war, werden die noch vorhandenen Bindestellen durch Inkubation mit 100 l 3% fettfreier Milch in Waschpuffer (PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4) blockiert. Nach dem Waschen werden doppelte zweifache Serienverdünnungen des Serums in PBS, Tween 20, 1% fötalem Rinderserumalbumin 1 Stunde inkubiert und dann entfernt, dann werden die Vertiefungen dreimal gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem anti-Maus-IgG aus Ziegen inkubiert. Nach drei Waschungen werden die gebundenen Antikörper mit H₂O₂ und 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonat) (Schwan, T.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2909–2913 (1985)) (ABTS^®, Kirkegaard & Perry Labs., Gaithersburg, MD) nachgewiesen, und die A₄₀₅ wird mit dem Vmax^TM-Platten-Lesegerät von Molecular Devices, Corp. (Menlo Park, Kalifornien) quantifiziert. IgG-Spiegel, die zweifach über dem Hintergrundspiegel des Serums aus unbehandelten Mäusen liegen, werden als Minimum-Titer von 1:100 angesehen.
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Anfertigung von Immunblots
Unter Verwendung eines Formats von einzelnen Vertiefungen wurden die Gesamt-Streptokokken-Proteinextrakte oder die rekombinanten Streptokokken-Antigene in SDS/2-ME-Probenpuffer aufgekocht, dies erfolgte vor der Elektrophorese durch ein 3%-iges Acrylamid-Sammelgel und ein Trenngel mit höherer Acrylamid-Konzentration, das typischerweise 10–15% des Acrylamid-Monomers enthielt. Die Gele wurden einem Elektro-Blot-Verfahren auf Nitrocellulose-Membranen unterworfen und die Bahnen wurden mit Verdünnungen des Antikörpers, der auf Reaktionsfähigkeit mit spezifischen Streptokokken-Antigenen hin untersucht werden sollte, ausgetestet, danach erfolgte eine Anwendung mit einem geeigneten sekundären Antiköper-Enzym-(Meerrettich-Peroxidase)Konjugat. Wenn man zu kontrollieren wünscht, ob die Proteine nach dem Elektro-Blot-Verfahren übertragen wurden, werden die Membranen mit Ponceau S angefärbt. Die Immun-Blot-Signale der gebundenen Antikörper werden auf Röntgenfilmen als Chemilumineszenz unter Verwendung der ECL^TM-Reagenzien (Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois) nachgewiesen.
Beispiel 3: Nachweis der Streptococcus-mRNA-Expression
Die Northern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von Verfahren durchgeführt, die unter anderem von Sambrook et al., vorstehend, beschrieben wurden; sie erfolgte zum Nachweis der Expression der S. pneumoniae-Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung in tierischen Geweben. Es wird eine cDNA-Sonde, die die vollständige, in Tabelle 1 gezeigte Nucleotidsequenz enthält, mit ³²P unter Verwendung des rediprime^TM-DNA-Markierungssystems (Amersham Life Sciences) gemäß den Angaben des Herstellers markiert. Nach der Markierung wird die Sonde unter Verwendung einer CHROMA SPIN-100^TM-Säule (Clontech Laboratories, Inc.) gemäß der Vorschrift Nummer PT1200-1 des Herstellers gereinigt. Die gereinigte markierte Sonde wird dann dazu verwendet, die Expression der Streptococcus-mRNA in einer tierischen Gewebeprobe nachzuweisen.
Tierische Gewebe wie z. B. Blut oder Rückenmarksflüssigkeit werden mit der markierten Sonde unter Verwendung der ExpressHyb^TM-Hybridisierungslösung (Clontech) gemäß der Vorschrift Nummer PT1190-1 des Herstellers untersucht. Nach der Hybridisierung und den Waschungen werden die Blots aufgezogen und gegenüber einem Film bei –70°C exponiert, und die Filme werden entsprechend Standardverfahren entwickelt.
Es ist verständlich, dass die Erfindung auch anders, als in der vorstehenden Beschreibung und in den vorstehenden Beispielen im Besonderen beschrieben, durchgeführt werden kann.
Im Hinblick auf die vorstehenden Lehren sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich und daher befinden sich diese im Rahmen der angehängten Ansprüche. Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3

Claims

Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) Polynucleotiden, die das Polypetid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:66 gezeigt codieren; (b) Polynucleotiden mit der wie in SEQ ID NO:65 gezeigten codierenden Sequenz, die das Polypeptid codiert; (c) Polynucleotiden, die zu mindestens 95% identisch sind zu der wie in SEQ ID NO:65 gezeigten codierenden Sequenz; (d) Polynucleotiden, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codieren, die zu mindestens 95% identisch ist zu der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:66 gezeigt ist; (e) Polynucleotiden, die einen Epitop-tragenden Bereich eines Polypeptids codieren, der eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ile-486 bis Ala-497; Asp-524 bis Ala-535 und His-662 bis Gly-674 der abgeleiteten Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:66 gezeigt; und (f) Polynucleotiden, die Fragmente codieren, die mindestens 50 zusammenhängende Aminosäuren eines Polypeptids codieren, das durch ein Polynucleotid von (a) oder (b) codiert wird, wobei die Fragmente ein Antigeneptitop tragen; oder dem komplementären Strang eines solchen Polynucleotids.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das RNA ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Vektors, umfassend das Einfügen eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einen Vektor.
Rekombinanter Vektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält oder mit dem Verfahren nach Anspruch 4 hergestellt ist.
Vektor nach Anspruch 5, in dem das Polynucleotid funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen ermöglicht.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, die das Einführen des Vektors nach Anspruch 5 oder 6 in eine Wirtszelle umfasst.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 transformiert ist oder mit dem Verfahren nach Anspruch 7 hergestellt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das von dem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, umfassend: Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 und Gewinnen des durch das Polynucleotid codierten Polypeptids aus der Kultur.
Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 9.
Polypeptid-Antigen, umfassend die Aminosäuresequenz eines Epitoptragenden Bereichs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Ile-486 bis Ala-497; Asp-524 bis Ala-535; His-662 bis Gly-674 der abgeleiteten Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:66 gezeigt.
Protein, das durch ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert wird, dem das N-terminale Methionin fehlt.
Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 10 und eine heterologe Polypeptidsequenz.
Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 10 bindet.
Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 14 erzeugt.
Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das Polypeptid nach Anspruch 10 oder eine DNA, die das Polypeptid codiert und in der Lage ist, dieses in vivo zu exprimieren, oder den Antikörper nach Anspruch 14 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel oder einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder den Antikörper nach Anspruch 14.
Diagnoseverfahren, umfassend das Untersuchen einer von einem Wirt stammenden Probe auf die Anwesenheit des Polypeptids nach Anspruch 10.
Verfahren zum Nachweis von Streptococcus-Nucleinsäuren in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einer oder mehreren Nucleinsäuresonde(n), die das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen, unter Bedingungen, bei denen Hybridisierung auftritt; und (b) Nachweis der Hybridisierung der einen oder mehreren Sonden an die eine oder mehreren Streptococcus-Nucleinsäuresequenzen, die in der biologischen Probe vorhanden ist.
Verfahren zum Nachweis von Streptococcus-Nucleinsäuren in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend: (a) Amplifizieren einer oder mehrerer Streptococcus-Nucleinsäuresequenzen in der Probe unter Verwendung des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und der Polymerasekettenreaktion; und (b) Nachweis der amplifizierten Streptococcus-Nucleinsäure.
Kit für den Nachweis von Streptococcus-Antikörpern in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend: (a) ein Polypeptid nach Anspruch 10 gebunden an einen festen Träger; und (b) Mittel zum Nachweis.
Verfahren zum Nachweis von Streptococcus-Antikörpern in einer biologischen Probe, die von einem Tier erhalten wurde, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Polypeptid nach Anspruch 10; und (b) Nachweis von Antikörper-Antigen-Komplexen.